SU503531A3

SU503531A3 - Способ получени антибиотика

Info

Publication number: SU503531A3
Application number: SU1893231A
Authority: SU
Inventors: Джемс Ханка Ладислав; Гленн Мартин Давид
Original assignee: Те Упджон Кампэни (Фирма)
Priority date: 1972-03-13
Filing date: 1973-03-12
Publication date: 1976-02-15
Also published as: JPS5728268B2; ZA731225B; JPS5623889A; DE2311655A1; HU165465B; BE796680A

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

I

Изобретение относитс к микробнологическим способам получени антибиотиков.

Пред агают способ получени антибиотика путем культивировани Streptomyces в аэробных услови х в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последунхцнм выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и очисткой.

С целью получени антибиотика, именнцего структуру

CJ

v-.

се

U)

NlpCH-CH-C07

,

используют Streptomyces Sviceus.

Фильтрат культуральной жидкости адсорби)уют ионообменной смолой, и далее целевой продукт эпюируют.

Очистку целевого продукта производ т путем хроматографии на колонке из слабоосновной полиаминовой смолы стирольного типа, распределительной хроматографии и кристаллизации.

В качестве ионообменной смолы берут смолу сульфоновой кислоты стирольного типа.

Антибиотик назван AT-125. Установили, что абсолютна конфигураци антибиотика AT-125L- -aS, 5S -«-амино- 3 -хлор - 2- изоксазолйЁ 5- уксусна кислота. .Она вл етс амфотерным соединением и может встречатьс в разных ионных формах в зависимости от значени рН окружающей среды. При низких значени х рН она существует в виде соли с кислотами, при более высоких значени х рН - в виде цвиттериона и при еще более высоких значени х рН - в виде соли с металлом.

AT-125 ингибирует рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, таких, как Racillus subtilis, Escherichia coli. Он также действует на

различные грибы и дрожжи, например Saccharo myces pastorianus, Penicillium oxalicum, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. В св зи с этим новый антибиотик можно примен ть отдельно или в сочетании с другими средствами, предупреждающими развитие или болезнетворное действие микробов, дл предупреждени роста бактерий, дрожжей и грибов или сокращени их числа в различных окружающих средах. Его можно примен ть , например, дл обработки мест разведени

шелкопр да в цел х, предупреждени или умень: еыи до минимума заражений, вызьюаемых Вас I lus subtil IS.

ЯМН - спектр насьпценного раствора AT-125 в D-2 О определ ли с помощью спектрометра типа Varian X-L-100. Спектр, полученный на приборе с частотой 100 Мгц, не бьш первого пор дка и сно показьшал присутствие четырех незамен емых протонов. Протоны метилена у €4 наблюдались в виде типичного мнимого (deceptive) 5-линейного образца АВ с самым сильным сигналом при 350 гц и очевидно с дублетами при 359 и 361 гц. Соседние протоны у Cs наблюдались, как очевидный дублет триплетов, сосредоточенных при 5,36 б с раотределением линий при 3,5-10 гц. Сигналом протона метиновой группы аминокислоты был дублет первого пор дка при 4,12 5 сЛ 3,5 гд. ИК-спектр вещества в ньюеле (Nujol) определ ли с помощью спектрофотометра типа Parkin Elmer 421. Главные пики (за исключением ньюел ) бьти обнаружены при 3030 (цшрокий), 2730, 2620, 1620, 1590,1495, 1425, 1405, 1325, 1307, 1293, 1275, 1145,1127,895 870 см-.

Химическа структура антибиотика AT-125 в кристаллическом виде была точно установлена дифракцией рентгеновских лучей. Кристаллическому антиоиотику AT-125 можно дать химическое назваьше L-/aS, 5S/-a -амино- 3- хлор-2- {3OKca3OJUffl- 5 уксусной кислоты.

Молекул рный вес. Точное исследование рентгеновскило лучами показывало, что антибиотик AT-125 имеет структуру, соответствующую CslbCINjOs с мол. вес. 178,6.

Растворимость. Растворим в воде и легко растворим в метаноле. Сравнительно нерастворим в этилацетате, простом эфире, бензоле и хлороформе. Противомикробные свойства антибиотика AT-125.

Следующие ниже результаты получали вследстие стандартного опыта с пластинчатыми дисками, причем примен ли бумажные диски (размер 13 мм) и концентрацию AT-125 1 мг/мл.

МикроорганизмЗона ингибировани

вокруг буглажных

Bacillus subtilis( 13мм)

(в синтетическом агаре)78

Bacillus subtilis

(в питательном агаре)О

Lactobacillus caseiО

Sarcina lutesО

Staphylococcus aureusО

Mycrobacterium avium0

Escherichia coli

(B питательном агаре)О

Escherichia coli(очертани не (в синтетическом агаре)36 сны)

Salmonella schottmuelferi О

Proteus vutgarisО

Klebsiella pneumoniaeО

Saccharomyces pastorianus 53 Penicif Mum oxalicum32

Candida albicans (ишытано при 100 мкг/мл)20

Saccharomyces cerevisiae (испыхано при 100 мкг/мл) 38 5/ микроорганизм.

Лучистый гриб, используемый дл получени антибиотика АТ-125, Streptomyces Sviceus. Одной из характеристик его щтамма вл етс выделение АТ-125.

0 Пересев живого микроорганизма был депонирован в NRRL 5439. Микроорганизм изучила и охарактеризовала Alma Dietz сотрудник научно-исследовательской лаборатории Research Laboratory.

5 Описание.

Streptomyces sviceus Dietz sp.n. Цветна характеристика. При развитии на воздухе серый. Меланин-положительньш. Цветные изображени на пленках Эктахром приведены в 0 табл. 1 1.

Другие цветные характеристики привод тс в табл. 2. Культуру можно относить к серой (GY) и белой (W) цветным сери м по Треснеру и Бакусу 2.

Микроскопические характеристики. Споры

овальной до пр моугольной формы, редко украшенные выростами или короткими типами, с подсвечникообразными спорофорами. Спорофоры

0 длинные, пр мые с завивающимис концами. Спорофоры можно относить к спиральной группе (S) по Придхаму и др. 3. Поверхность спор можно относить к бородавчатой группе ГЕО 11лц и Мэфьюсу 4.

Культуральные и биохимические характеристики ,см. табл. З.Усвое1ше углерода Рост культуры на углеродных соединени х определ ли методами по Придааму и roTjm6y 5 и Ц1ир;шнгу и Готлибу

0 6. В методах по Придхаму и Готлибу S. sviceus очень хорошо рос на основной аитатепьной среде, дульците. О-сорбите, салицине и оксалате натри ; хорошо на D-ксилозе, L-арабинозе, рамнозе , D-фруктозе, D-галактозе, D-глюкозе,

5 D-машюзе, мальтозе, сахарозе, лактозе, целлоЗиозе , рафинозе, декстрине, инулине, растворимом крахмале, глицерине, D- машште, инозите, ацетате натри , цитрате натри , сукцинате натри ; плохо на феноле, формате и тартрате натри ; он не растет на

0 крезоле и салицилате натри . По методу по Ширлингу и Готлибу культура не растет на отрицательной контрольной среде (только на основной питательной среде). Он хорощо растет на положительной контрольной среде (основна питательна среда

5 плюс глюкоза). Так же хорошо или лучше, чем на контрольной среде с глюкозой, он растет на основной питательной среде плюс it -арабиноза, саха роза, D-ксилоза, инозит, D-маннит, О-фруктоза, рамноза и рафиноза. Рост на целлюлозе точно не

0 установлен.

Температура, Культура растет хорошо при 1828°С ш сахарном агаре по Беннету и Чапеку; при 18-37° С на мальтозноно-триптоновом агаре. (Она не растет при 45 и 55° С на сахарозном ага:ре по Беннету и Чапеку и на малыозно-триптоновом агаре),

Свойства относительно продуцировани антибиотика . Культура выдел ет антиметаболитный антибиотик AT-125.

Источник. Почва Streptomyces sviceus - лучистый гриб с характеристиками пода, как изложено в 7.

Культура, которую изолировали из почвы, вно отличаетс от видов Sjreptomyces, наход щихс в хранилище Vpjohn culture collection, и насколько это можно определить, от видов, отисанных в тштературе 8.

Streptomyces sviceus показьюал некоторое сходство с Streptomyces hawaiiensis 9. АТСС 122236. Обе культуры реагируют положительно ш меланин и имеют сходные свойства усвоени углерода в синтетической питательной среде по Придхаму и ГотлиЗу. Streptomyces hawaiiensis имеет открытые спиральные спорофоры, более короткие и менее выраженные, чем спорофоры новой культуры , которые длинны с завивающимис концами. Как наблюдалось в электронном микроскопе в проход щем свете, споры имеют круглую до овальной формы и покрыты тонкими шипами, что касаетс S. hawaiiensis и овальную до пр моугольной формы с поверхностью, редко покрытой бородавками и щипами. Отличительные характеристики S. Sviceus приведены в табл. 4.

Благодар характерным цветным изображе1ШЯМ и микроскопическим характеристикам s. Sviceus легко отличать от характеризованных видов Streptomyces в хранилище Vpjohn culture collection и, насколько это можно определить, от культур, описанных в литературе. Культуральные характеристики, приведе1шые в таблицах, подчеркивают отличительные черты S. Sviceus. Уникальное свойство этого организма заключаетс в его способности выдел ть антибиотик AT-125. Предлагаетс рассматривать организм, который здесь характеризуетс , как новый вид Streptomyces, называемый Streptomycas sviceus (от чешского слова svice или svicen, означающего свеча или подсвечник - спорофоры культуры подсвечникообразны Dietz, sp.n. Тип вида по зчил название разновидности Streptomyces sviceus var, sviceus в соответствии с Правилом 9d (2) Международного номенклатурного кода дл бактерий ПО.

Предлагаемое соеданение получают выращиванием вырабатьшающего его организма в глубине водной питательной среды в аэробных услови х. Дл получени незначительных количеств соединени можно использовать и культуры на поверхностном слое жидкости. Гриб растет в питательной среде, содержащей источник углерода и усво емое азотистое соединение или белковое вещество. Предпочтительные источники углерода: глюкоза, неочищенный сахар, сахароза, глицерин, крахмал, кукурузньш крахмал, лактоза, декстрин, меласса и т.п. Предпочтительные источники азота - кукурузный экстракт, дрожжи, автолизированные пивоваренные дрожжи с твердыми частицами молока, соева мука, хлопкова мука, кукурузна мука, твердые частицы молока, панкреатический перевар казеина, барда, пептонные жидкости животного происхождени , отходы м са и костей и т.п. Целесообразно использовать углеродистые и азотистые вещества в комбинации. Так как используют водопроводную воду и добавки в неочищенном состо нии , то отпадает необходимость в добавлении мик;роэлементов , таких, как цинк, магний, марганец,

5 кобальт, железо и т.п., к ферментационной среде.

Новое соединение получают при любой температуре , пригодной дл обеспечени роста гриба, например 18-40°С, предпочтительно 20-32°С. Максимум выработки соединени , как правило, достигаетс через приблизительно 2-10 дней. Значе-, ние рН во врем ферментации обычно слабо-кислое .

В случае выращивани в больших сосудах и

5 сборниках целесообразно использовать дл посева скорее вегетативную, чем спороносную форму во избежание выраженного замедлени выработки нового соединени и св занного с ним неэффективного использовани приборов. В св зи с этим

0 желательна выработка вегетативного инокулума в питательной бульонной культуре засевом ее аликвотным количеством почвенной культуры или культуры на скощенном агаре. Полученный таким образом молодой, активный вегетативный ино33 кулум переноситс в асептических услови х в больщие сосуды или сборники. Среда,в которой вырабатьшают вегетативный инокулум, может соответствовать среде, используемой дл получени

0 нового соединени , или отличатьс от нее в зависимости от обеспечени хорошего роста грибка.

Антибиотик AT-125 вл етс амфотерным соединением . Он растворим в воде и малорастворим в СНзОН.

В цел х вьщелени и очистки AT-125 можно

5 пользоватьс различ1Ш1ми способами, например абсорбцией с последующим вымьшанием подход щим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из раст0 ворителей.

AT-125 предпочтительно рекуперируют из питательной среды фильтрацией через кизельгур средней пористости, например. 40 ф-мы Игль Пичер, Другие дл этих целей пригодные сорта кизельгура5 это, например, известные под торговыми названи ми Super Cel (Johns manvilfs fine diatomite), Dicaiife4200 (Great Lakes, Miraflo 40 (ragle PiC herj (5,5-7,0). Конечное значение рН отчасти зависит от наличи буферов, если они вообще при0 сутствуют, отчасти от начального значени рН питательной срецы, которое целесообразно установить перед стерилизацией приблизительно до 7,0.

В случае осуществлени выращивани в больших сосудах и сборниках целесообразно использовать дл посева скорее вегетативную форму, чем спороносную форму, во выраженного замедггени синтеза нового соединени и св занного с ним незффективного использовани приборов. В св зи с этим желательна выработка вегетативного инокулума в питательной бульонной культуре засевом ее аликвотным количеством почвенной культуры или культуры на скошенном агаре. Полученный таким образом молодой, активный вегетативный инокулум переноситс в асептических услови х в большие сосуды или сборники. Среда, в которой вырабатьтают вегетативньш инокулум, может соответствовать среде, используемой дл получени нового соединени , или отличатьс от нее в зависимости от обеспечени хорошего роста грибка.

HoBbDi антибиотик AT-125 вл етс амфотерным соединедаем. Он растворим в воде и малорастворим в СНзОН.

В цел х выделени и очистки AT-125 можно пользоватьс различными способами, например абсорбцией с последую1цим вымьшанием подход щим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из растворителей .

AT-125 предпочтительно рекуперируют из питательной среды фильтрацией через кизельгур средней пористости, например 40 ф-мы Игль Пичер. Другие пригодные дл этих целей сорта кизельгураэто , например, известные под торговыми названи ми Super Cel (Johns Manvills fine diatonnite, Dicalite 4200 (Great Lakes, Niraflo 40 (Eagle Richer,.

Прозрачна исчерпанна питательна среда фильтруетс через хроматографическую колонку с насадкой из стиролыюй смолы с сульфокислотшлми остатками. Предпочитают водородную форму Dowex 50, в частности плотно спштый, например Dowex 50 X 16. Другими пригодными смолами вл ютс известные под торговыми названи ми Атberlite IR 12 Nalcite HCR, Chempro C-20, Permutit Q, Zeokarb 225.

После промьшки колонки антибиотик вымываетс основанием, в частности NN4ОН. Содержащие-антибиотик элюаты собирают, концентрирют.

По предпочтительному способу очистки вышеописанный водный концентратп Г значени11 Д 6,2-7,8 фильтруетс через колонку с насадкой из слабоосновной стирольнополиамидной смолы, причем предпочитают Amberlite tR 45 (ОН. Другие пригодные смолы - это, например,АптаеП ite IR 4В, Nalcite WBR, DeAcidite Е. Duel ite А.2.

Колонку промьшают деионизированной водой, 50%-иым водным раствором МеОН и 90%-ным водным раствором МеОН, а затем вымьшают 0,1 н. уксусной кислотой в 90%-ном растворе МеОН.

Активные элюаты собирают и при уменьшенном давлении вьшаривают досуха. МеОН можно заменить На О,

Полученный остаток подвергают рашределнтельной хроматографии, предварительно растворив его в нижней фазе системы растворителей, состо щей из смеси н-бутанола, бензола, метанола и деионизированной воды (2:1:1:1). Нижнюю фазу, содержащую остаток из колонки с насадкой из слабоосновной стирольнополиамидной смольг, гомогенизируют кизельгуром средней пористости, например, ф-мы Eagle Pichers FW 40, и верхней фазой системы растворителей. Полученный гомогенизированный твердый материал подают на колонку , содержащую кизельгур средней пористости и предварительно приготовленную взвешиванием кизельгура в верхней фазе описанной выше смеш растворителей, тщательно смешанной с нижней фазой , выливанием в хроматографическую колонку и, наконец, тем, что слою дают осесть, пока верхн фаза проходит через колонку. Активные элюаты из колонки собирают, объедин ют и вьшаривают досуха . Кристаллический AT-125 получают кристаллизацией подход щим растворителем, предпочтительно метанолом. Можно примен ть и 95%-ный этанол, водньш бутанол и воду.

Другой способ рекуперации AT-125 из фильтрованной исчерпанной ферментационной среды состоит в абсорбции на подход щей ионообменной смоле, напр. Dowex 1 (ОАС) при рН9-10 или IR 45 (ОН-) при рН 6-7. После промьшки смолы HZ О AT-125 получают вымьшанием водным и)ш метанольным NN4ОН или уксусной кислотой. Далее фильтрованную прозрачную исчерпанную ферментационную среду можно абсорбировать на угле, после чего AT-125 вымьшают соответствующей смесью растворителей, например водным ацетоном. По другому способу очистки можно хрюматографировать на силикагеле метанолом в СНС1э или CH2CI2 или смес ми бензола (и;ш толуола), 95%-кого этанола и уксусной кислоты.

Титр AT-125 в исчерпанной питательной среде в отдельных стади х рекуперации контролируют тестом с культурой Bacillus Subtil is, разведенной в чашках Петри на синтетической среде следующего состава, г:

NajHP04-7H201,7

КН2Р042,0

(NN4)2801,0

MgS040,1

Глюкоза2,0

Bacto Agar формы Difcodaboratorles Detroit, Michigan15,0

Дистиллированна вода1л

Основной расгвор с ионами металлов++1 мл

Основной раствор- с ионами металлов состоит из:

МаМо042Н2О200МКГ/МЛ

CoCljЮОмкг/мл

CuSO ЮОмкг/мл

MnS042 мг/MJi

CaClj25 Ml-/мл

FeClr4H205МГ/МЛ

ZnCl25 МГ/МГ1

ZnClj должет быть растворен отдельно с применением капли 0,1 н. HCI на 10 мл воды. Основной раствор нагреваетс до растворе1ш всех соединений , выдерживаетс сутки и фильтруетс в стерильных услови х.

Эта среда засеваетс суспензией спор в. Subtil is (1, клеток/мл) с концентрацией 0,5мл/л. Пробы исчерпанной питательной среды нанос тс на диски адсорбирующей бумаги диаметром 12,5 мм (0,08 мл/диск), диски инкубируютс в течение ночи при 37° С, а затем измер ютс зоны ингибировани . Соотношение между активностью пробы и диаметром зоны ингибировани вьмисл етс с помощью обычных стандартных кривых.

Засе нную в. Subtil is среду можно также использовать дл обнаружени антибиотика AT-125. Хроматограммы на бумаге про вл ютс верхней фазой смеси растворителей, состо щей из н-бутанола , метанола, бензола и воды (2:1;1:1). После про влени выс}аиивают бумагу и кладут бумажные Хроматограммы на прозрачные тарелки, содержащие засе нную среду и снимают их прилкрно через 20 мин. Тарелки инкубируют в течение ночи, как выше указано, а затем определ ютс зоны ингибировани .

Так как антибиотик AT-125 вл етс амфотерным соединением, он образует соли с кислоталт, щелочными металлами (включа аммоний) щелочноземельными металлами (включа магний и алюминий ) и аминами. Соли с металлами получают растворением AT-125 в воде и добавлением разбавленного основани металла до достижени значени рН раствора -8. Соли AT-125 с металлами включают соли с натрием, калием, кальцием. Аминные соли, включа соли с органическими основани ми, такими как первичнью, вторичные и третичные, моно-, да- и полиамины можно также получать, использу указанный выше или другие общеизвестные спьсобы . Далее, аммониевые соли можно получать общеизвестными способами. Другие соли получают с эффективными с терапевтической точки зрени основани ми, обусловливающими дополнительные терапевтические эффекты. К таким основаг шм относ тс , например, пуриновые основани , такие как теофиллин, теобромин, кофеин или производные таких пуриновых оснований; антишстаминовые основани , способные образовать соли со слабыми кислотами; пиридиновые соединени , такие, как амид никотиновой кислоты, шдразид изокикотиновой кислоты и т.п.; фенилалкиламиены , такие, как адреналин, эфедрин и т.п.; холин и др.

Кислые соли пол чают нейтрализацией AT-125 соответствукнцей кислотой, доводи значение рН

шже 7,0, предпочтительно до 2-6. Подход щими кислотами вл ютс хлористоводородна , серна , фосфорна , сульфаминова , бромистоводородна и т.н. Кислые и основные cojui AT-125 можно примен ть дл тех же самых биологических целей, что и исходное coewiHetme.

AT 125 действует на Escherichia coll и служит т уменьшени , торможени и прекращени вьщелени слизи на цел;полозно-бумажных заводах благодар своей противоЬактериальной активности. AT-125 можно также использовать дл продлени жизни культур Trichomonas foetus, Trichomonas hominis, Trichomonas Vaginalis, так как он освобождает их от Escherichia coli. Ддлее, AT-125 можно использовать в качестве фунгицида дл обработки кожи дл верха обуви по патенту США №3130505. Так как АТ-125 действует на Bacillus subtil is его, кроме того, можно еще ишользовать дл доведени до минимума или предотвращени запаха рыбы или щиков дл рыбы, вызьшаемого этим микроорганизмом. AT-125 можно использовать также дл очистки столов и оборудовани в микологических лаборатори х.

AT-125 действует на L1.210, вызьшаюищй в лаборатори х лейкемию у мышей, и поэтому его можно ишользовать дл их лечени .

Примерь А. Ферментаци . Штамм Strepto.myces sviceus, NRRL 5439, из почвы используют дл засева колб Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл стерильной среды, сосг о щей из следующих компонентов,,г/л:

Декстроза25 г/л

Фармамедиа+ (продукт Щрмы Traders oil Mill Company,

Fort Worth Texas)25 г/л

Водопроводна водадо 1 л

До стерилизации среда, предназначенна дл засева, имеет значение рН 7,2. Инокулум вьфащивают в течение 2 суток при 28° С во вращающемс встр хивателепо Гампу (250 об/мин). Инокулум, приготовленный указанным вьппе образом, примен ют дл засева колб Эрленмейера емкЪстью500мл , содержащих 100мл стерильной ферментационной среды, состо щей из следукнцих компонентов, г/л:

Клрбонат кальци 5

Хлорид натри 2

Крахмал10

Маннит10

Фитон (папаиновый

перевар соевой муки)10

КэйСой (тонко измельченна обезжиренна соева мука)10 Олеомаргарин из свиного

сала1 мл/100 мл

Водопроводна водадо 1 л.

Значение рН до стерилизации доводитс до 7,2

при помощи 4 н. NaOH. Ферментационные колбы

засевают инокулумом в количестве 5 мл/100 мл

ферментационной среды. Ферментадионные колбы выдерживают 2-3 суток при 32° С во вращающемс встр хивателе по Гампу (250 об/мин). Максимальна выработка AT-125 в ферментационной колбе, как правило, достигаетс через день после начала вьщелени по капл м татра антибиошка. Приведенна ниже зависимость типична дл ферментационного процесса в колбе-встр хивателе.

Врем , ч. Бе/мл АТ 125

4S56

7222

9626

12016

Биоединица активности (Бе) определ етс как количество антибиотика, требуемое дл получени двадцатимиллиметровой зоны ингибировани диском диаметром 1,5 дюйма, обработаннь1м 0,08 мл раствора антибиотика. Тест с диском провод т, как вьпле указано.

Б. Рекупераци .

Всю исчерпанную питательную среду (250л), оставщуюс от ферментации AT-125, фильтруют, как выще указано, через кизельгур средней пористости . Образующа с прозрачна исчерпанна питательна среда при значении рН 7-8 фильтруетс «крез хроматографическую колонку с 25 л свежерегенерированного Dowex 50-16 (). Колонку промьтают 50 л деионизированной Hj О и вымывают 120 л I и. NH40H; затем собирают фракции по 6 л. Сама активна фракци (зоны ингибировани SO мм) определ етс нанесением смоченных и высущенных на воздухе дисков на тарелку с Bacillus subtil is, вьфащенным в синтетической среде, как вьпие указано. Активные фракции объедин ют и концентрируют при пониженном давлении в цел х удалени избыткаNH40H, Определение твердого материала показьшает, что сырой водньш концентрат содержит 2950 г, а активные элюаты244г. Тверрьш материал в активных элюатах приблизительно в 13 раз активнее по отнощению к Bacillus subtilis, чем твердый материал, содержащийс в прозрачной исчертнной питательной среде.

В. Очистка.

(1) Колонкой из слабоосновной стирольнополиамидной смолы.

Активньш водный концентрированньш злюат из Dowex - 50, полученный, как вьщ1е описано, при значении рН 7-7,5 фильтруетс через колонку, содержащую 4 л Amberlite IR 45(011). Колонку промьшают 8 л деионизированной Н2 О 4 л 50%-ного водного МеОН и 8 л 90%-ного водного МеОН, а затек вымьшают 0,5 н. уксусной кислотой в 90%-ном МеОН; собирают фракции по двум литрам . Самые активные фракции относительно Bacilr lus suiptilis объедин ют и вьшаривают досуха при пониженном давлении; выход составл ет 9,40 г остатка с активностью относительно Bacillus subtilis, превьппакнцей активность остатка описанного вьцце э юата из Dowex - 50 в 28 раз

(2)Распределительна хроматографи .

Смесь н-бутанола, бензола, метанола и деионизированной воды (2:1:1:1) перемепшвают, затем смеси дают разделитьс на два сло ; слои раздел ют . Кизельгур средней пористости (2340 г) взвепшвают в верхней фазе, тщательно перемепжвают с 900 мл нижней фазы, а затем выливают в хроматографическую колонку и дают слою осесть, пока вер;ш фаза проходит через колонку. Остаток элюата из IR 45, полученного, как вышв указано, раствор ют в 25 мл нижней фазы и гомогенизируют 75 г кизельгура средней пористости и 50 мл верхней фазы. Получаемый гомогенизированный твердый материал тщательно подают на колонку и начинают вымывание верхней фазой; собирают фракции по 500 мл. Самые активные относительно Вас I lus subti I is фракции выпаривают досуха при пониженном давлении, что дает 3,93 г остатка, активность которого относительно Bacillus subtilis превыщает активность описанного вьпш остатка элюата из IR 45 в 2,9 раз.

(3)Кристаллизаци .

Описанный остаток, полученный распределительной хроматографией, кристаллизуют из СНзОН и перекристаллизуют из водного СНзОН 3 раза, что дает 362 мг чистого кристаллического AT- 125, активность которого относительно Bacillus subtilis превьпшет примерно в 4 раза активность высокоактивного остатка, полученного в результате описанной выше распредел1( хроматографии.

Соли антибиотика AT-125 можно получать по описанным способам. Эти соли, как указано вьппе, служат дл тех же целей, что и исходный антибиотик .

Выщеизложенное изобретение было сделано в рамках контракта PH43-NC(-69-1023 с National cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda , Maryland 20014.

Цветные изображени Streptomyces svioeus на пленке

Агарова срер

Лавандово-сера

Не растет на воздухе Светло-лавандово-сера

ТаблицаJ ктахром 11

Обратна сторона

Лицева сторона

Коричнева Красно-коричнева Коричнева Коричнева Красно-коричнева Светло-коричнева

п

й

ТЭ О)

g

og 5fe

1 «

0)3

I.

&

о

«

Я|

Ч-2 О I.

IS

n

О .

i|

S

U о

5

о

CN

тз л

«в -. )9Е 3CN 3

Ir 8

«

S

11

IР §

цэь

ЯГ: ни

iS i9

. «g,

.-

ч-С

СОП

(О ОС

со ОС

X

3 S.

S

ш

и

иэ

о- (Л 0

(Л

SfS

PM04

S

°i

m 2

12

I

Claims

ч w 25 Формула изобретени 1. Способ получени антибиотика путем культивировани St reptomyces в аэробных услови х в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с последующим: вьщелением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и очисткой, отличающийс тем, что, с целью получени антибиотика, имеющего структуру С1 N Ij.CH-CH-COJ , . используют Streptomyces sviceus. 2.Способ по п. 1,отличающийс тем, что фильтрат культуральной жидкости абсорбируют ионообменной смолой и далее злюируют целевой продукт. 3.Способ по п. 1, отличающий с тем, что очистку целевого продукта производ т путем хроматографии на колонке из слабоосновной полиаминовой смолы стирольного типа, распределительной хроматографии и кристаллизации. 4.Способ по п. 2, отличающийс тем, что в качестве ионообменной смолы примен ют смолу сульфоновой кислоты стирольного типа. 1.. А. 1954 Ann, N V Acad. Sci 60:152-154.
2.Тгэзпег, H.D and E.g. Backus 1962. Appl. Microbiol 11:335-338.
3.Pridham, T.G.C.W Hesseltine and R.G. Benedict, 1958 Appl. Microbiol 6:52-79.
4.Dietz A., and John Mathews 1970, Appt. Microbiol 21:527-533.
5.Pridham, T.G. and D. Gottlieb, 1948. g. Bacteriol 56:107:114.
6.Shirling E.B., and D. Gottlieb. 1966. Zni.j.Syr. Bacterio 16:313-340. 5 26
7.Sergeys Manuat of Determinative Bacter riology, 7-e издание (Breed Robert, S., E.G. Murray , and Nathan R Smitz 1957 Bergeys manual of determinative bacteriology, Zth Edition, the Wil.liams and Wilkins Co., Baltimore.
8.Bergeys Manual под именем Гаузе Г,Ф. Преображенска Т.П,, Кудрина Е.С., Блинов Н,О,, Р бова И„Дс и Ивешник М.А, Вопросы классификации антагонистических актиномицет. Госуд. Издательство Медацинской литературы, Москва, 1957 г, Хюггером (Hiitter, R 1967. Systematik der streptomyceter unter besonderer Berucksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika, S, Karger, Basel), Красильниковым H.A., Руководство по onрёДелению бактерий и актиномицет, Акад. Наук СССР, Москва, 1957, Ваксманом (Waksman, S.A. 1961. The actinomycetes, vol 2, Classification, identification, and descriptions of genera and spe cies. The Williams and Wilkins CO., Baltimore), и Ширлингом и Готлибом (Shirling, Е.В., and D. Gottlieb. 1968 Tnt.j.Sus.Bacteriol 18:69:189; 18:279-392; 19:391-512).
9.Cron. M.j.;, OF Whitehead, I.R. Hooper, В., Heinemann and j Lein, 1956 Antibiotics and cremotherapy 60:63:67.
10.Intern, j System Bacteriol 16:459-490.
11.. Dietz, A., Annals of the Nevy Vork Academy of Sciences, 60:152-154, 1954. 12.jacobson, E., W.C. Granville and C.E. Foss. 1948, Container Corporation of Americs, Chicago, gelinois 13.Kelly, K. L., and D.B. judd, 1955, V.S. Dept. Commerce Circ 553. 14. Tresner H.D and E.j. Backus. 1962 Appl. Michobiol. 11:335-338. 15.Pridham, T.C., et. al. 1958. Appl Michobiol 6:52-79. 16.Dietz, A. and John Mathews 1970. Appl Michobiol 21-521-533.