SU865904A1 - Способ определени концентрации ингибиторов биологической активности - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к биохимии и может быть использовано дл  определени  кошдентрации ингибиторов биологической активности (ароматических веществ) - пестицидов, фунгицидов , канцерогенов, веществ,  вл ющихс  компонентами сточных вод промьшшен ных предпри тий. Известен способ количественного определени  ингибиторов биологической активности путем измерени  максимальной интенсивности свечени  при обработке анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей лкщифёразу и ее субстраты l и t2 Однако чувствительность этого мето да недостаточна, так как максимальна  интенсивность свечени  имеет низкую чувствительность к малым концентраци  ингибиторов, а величина зтого параметра варьирует при незначительных колебани х концентраций компонентов реакций. Цель изобретени  - увеличение чувствительности способа.; Поставленна  цель достигаетс  тем, что анализируемую пробу обрабатт вают реакционной смесью, содержащей дополнительно к люциферазе и ее субстратам НАДН:ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты в насьщающих концентраци х , а количество ингибитора определ ют по времени достижени  максимума биолюми«есценции. Пример. Дл  определени  концентрации 2,4-динитрофторбензола в растворе стро т калибровочную кривую. Дл  этого используют препараты лю- циферазы, содержащий активность НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, полученный из бактерий рода Photo bacterium согласно методике, ограничива сь стадией высаливани  сульфатом аммони . Приготавливают раствор, содержащий 0,01 мл препарата люциферазы и НАДН- 1МН-оксидоредуктазы (1,28 мг белка в 1 мл препарата, 0,086 мл 510 раствора

ФМН, 0,08 мл 6,4

суспензии н-дб канап , полученной озвучиванием при 800 кГц в течение 30 с 0,16 мл 1( фосфатного буфера рН 6,8 в общем объеме 1,2 мл. Свечение начинаетс  при добавлении к этому раствору 0,4 МП 4-ld M раствора НАДН. Реакционна  смесь барботируетс  воздухом . Реакцию провод т в термостати- руемой кювете при 20 С, измер ют врем  достижени  максимальной интенсивности свечени  в реакционной смеси без вещества - 80 с. Ошибка при измерении tf al . При внесении

-10

i-10-n

МО

в реакционную смесь

л- 5- 1010 М 2,4-динитрофторбензола t 97,118,204,240 с соответстniQ

венно. По этим данным стро т калибровочную кривую. При добавлении в реакцион ую смесь неизвестного количества 2,4-динитрофторбензола измер ют t. „ и сравнивают измеренную

dX„ „

величину с калибровочной кривой.

Так, если t IfeT с, концентраци  2,4-динитрофторбензола в растворе равна 2,4- 1(.

Аналогичным образом провод т построение калибровочных кривых дл  определени  п бензохинона и толухинона ..

На фиг. изображена динамик интенсивности биолюминесценции в реакционной смеси, содержащей люциферазу и ее субстраты (Б), и в. реакционной смеси, содержащей дополнительно НАДН:ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты (А)5 на фиг.2 - изменение динамики интенсивности свечени  при . действии разных ингибиторов биологической активности,

А. 2,4-Динитрофторбензола в концентраци х 0, 5 10 М, 1, 2 5 - Ш М, у 5-10, 1,25-10 1, 2,510, 4- 10 М (кривые 1-7 соответственно).

Б. П-Бензохинона в концентраци х О, ,., -1,25-10 М, З-Ю, 6,2510 М (кривые 1-5 соответственно ) .

В, Толухинона. в концентраци х О, 1,25-10 М. 1,, 1,2510 М (кривые 1-4 cooTBeiCTBeHHo).

Предложенный способ позвол ет увеличить чувствительность измерений

концентраций веществ по сравнению с известными способами. Предложенный способ  вл етс  экспресс-методом анализа , прост. Не требует сложного оборудовани  и дорогосто щих материалов

5 и реактивов, доступен дл  заводских лабораторий. Способ может быть использован дл  определени  степени загр знени  водоемов и сточных вод сулофатцеллюлогных и других предпри тий.Формула изобретени 

Способ определени  концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты, о т л и .чающийс  тем, что, с цапью повышени  чувствительности анализа, в реакционную смесь добавл ют НАДН: ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты

в насьщенных концентраци х, измер ют врем  достижени  максимума биолюминесценции и по его величине определ ют концентрацию ингибитора.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1.Hastings 1. W. Biochemistry, 1975, 14, № 19, p.4310-4316 (прото0 тип.

2.Hastings 1 .W., Ri Пеу W.H., Massa I. j. Bid. Chem, 1965. 240, p.1473-1481.

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты, о т л ичающийся тем, что, с целью повышения чувствительности анализа, в реакционную смесь добавляют НАДН: ФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты в насыщенных концентрациях, измеряют время достижения максимума биолюминесценции и по его величине определяют концентрацию ингибитора.