TW200401829A - Improved viral purification methods - Google Patents

Description

200401829 玖、發明說明： 相關申請案 本申請案主張美國臨時申請案系列號第60/377, 273 ( 2002年4月30日申請）及系列號第60/443, 1 76 ( 2003年 1月29曰申請）的優惠（benefit)。這些先前案之揭示 係以其全文併入本文作為參考文獻。 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於從細胞培養物萃取病毒的方法。特別地 ，該方法有益於萃取適合臨床施給哺乳動物（包括人類） 之有感染力的病毒。 參考資料 美國專利申請公開案第20020037576號，2002年3月 28日公開。 WO99/08692A1，1999 年 2 月 25 日公開。 日本專利第63044532A號，1988年2月25日公開。 Berry 等人，Biotechnology and Bioengineering ， n Production of Reovirus Type-1 and Type-3 from Vero Cells Grown on Solid and Macroporous Microcarriers丨丨 ，Biotechnology and Bioengineering 62 : 12-19 ( 1999)。

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Strong等人，1 993;Strong等人，1 996 )。所以，呼腸病 毒可以選擇性的在具有活化《Ras路徑的細胞中感染及複 製。 有很大比例的哺乳動物腫瘤係因為ras致癌基因。活 化ras基因本身的突變發生在約3〇%的所有人類腫瘤（ ，1 989 )，主要在胰臟癌（9〇%)、突發性大腸直腸癌（ 50/g )及肺癌（4〇% )、還有骨髓性白血病（30% )。活化 ras路徑中ras上游或下游因子亦與腫瘤有關。舉例來說 HER2/Neu/ErbB2過度表現或表皮生長因子（E(JF)受體 係在礼癌中吊見（25-30% )，源、自血小板的生長因子（ i菔从EGF受體的過度表現在神經膠細胞瘤及神經 膠母、、田胞瘤很音遍（4G-5G% )。當結合到其各自的配體， EGF受體及PDGF受體兩者已知可活化ras，及[erbB編碼 缺> 細胞外區域之持續（eQnstitutively)活化受體。 為有大塁人類腫瘤係因為原致癌基因（ oncogene ) ras的基因改變或高的活性，在此狀況下 ’呼腸病毒治療是新的、有前景的治療（Coffey等人， 1 998 )。呼腸病毒治療對Ras —相關的腫瘤細胞係具高度選 200401829 擇性的，不會感染正常細胞。此治療具有廣泛的應用且可 以用於人類及非人類動物。 為了生產適合臨床投藥的呼腸病毒，能快速及有效的 在培養的細胞中生產呼腸病毒的方法是需要的。此外，傳 統從培養的細胞純化病毒的方法係冗長且耗時的，使生產 病毒的成本太高。所以，需要一種改善的病毒純化方法。 【發明内容】 發明概述 本發明係關於一種改善的從細胞培養物萃取及純化病 毒的方法，可以用於小規模及大規模的病毒生產。該方法 涉及簡單的萃取步驟，係將清潔劑直接加到細胞培養物中 後，以（舉例來說）過濾或離心把細胞碎片從萃取混 合物中移除。得到的病毒懸浮液可用層析法進一步濃縮及 /或致濃（enriched)。根據本發明製備的病毒可以用於任 何目的，包括純化病毒蛋白質、疫苗接種、感染宿主細胞 及臨床投藥υ 因此，本發明之一方面提供從細胞培養物生產病毒的 方法，包括步驟： (a) 提供一種已被病毒感染的細胞培養物； (b) 彳文細胞卒取病毒，其係藉由加清潔劑到培養物中 並培養一段時間，得到細胞溶解物； (c )移除細胞碎片；及 (d)收集病毒。 200401829 步驟（C)中可以使用任何方法來移除細胞碎片（即淨 化細胞洛解物）。該方法較佳是一種依據病毒和其他細胞 溶解物内組成間大小或密度差異的簡單方法，諸如過濾或 離心。更佳者，使用過濾，尤其是逐步過濾。一種合適的 逐步過濾包括一具有較大孔洞的預過濾器，然後是具有較 戎預過濾器孔洞小的至少另一種過濾器。在較佳的具體實 例中，移除細胞碎片係藉由逐步過濾過濾，其包括： (1 )以具有孔洞大小5 μΜ或8 μΜ的預過濾器過濾 ，及 (2 )經步驟（丄）過濾之後，以具有孔洞大小3⑽ 及〇· 8 μΜ的組合式過濾器過濾。 細胞溶解物可以視需要以核酸酵素（benz〇nase )或其 他DNA-切割酵素處理，以破碎長而黏的細胞而a。 過濾移除細胞碎片之後，濾液可視需要濃縮以減少病 毒懸浮液的體積。任何適合病毒濃縮的方法都可使用，較 佳是超過濾或透析過濾，包括切向流式過濾（tangentiai iiow filtration)。示範的方法包括板框式（piate and Frame )糸統和空心纖維（H〇 11 〇w F i ber )系統。較佳的， 使用空心纖維系統。 本方法可用於生產任何病毒，較佳是不具封套（⑽η 一 enveloped)的病毒，最佳是呼腸病毒。呼腸病毒較佳是哺 乳動物呼腸病毒，更佳是人類呼腸病毒，又更佳是血清型 3呼腸病毒，最佳是Dearing株呼腸病毒。呼腸病毒可以 是重組呼腸病毒。重組呼腸病毒可以藉由以不同亞型的呼 200401829 腸病t共感染細胞（諸如哺乳動物細胞或鳥類細胞）產生 。重組呼腸病毒可以是天然產生的或非天然產生的。重組 呼腸病毒可來自二或更多呼腸病毒株，尤其二或更多選自 包括Dearing株、Abney株、J〇nes株及“叫株所組成群 組之呼腸病毒。重組呼腸病毒亦可能來自從不同血清型呼 腸病毋之再分類，諸如選自由血清型丨呼腸病毒、血清型 2呼腸病毒及血清型3呼腸病毒所組成的群組。重組呼腸 病毒可以包括天然產生的變異被膜蛋白質編碼序列或突變 被膜蛋白質編碼序列。 本發明所用的細胞培養物可以包括任何適於生產想要 之病毒的細胞。對呼腸病毒而言，該細胞較佳為人類：腎 293 (祖293 )細胞或源自其之細胞，尤其是已經適應 於生長在懸浮培養的HEK 293細胞。 該方法可視需要包括離子交換層析法的步驟，其中病 毒係在適當結合與條件下經結合到離子交換樹脂而致濃（ nr iched )。病,然後用合適的溶析溶液從離子交換器溶 析…離子交換及結合/溶析條件的選擇依純化的病毒 而，。以呼腸病毒而言’陰離子交換管柱及約7 〇-9.〇邱 值最有效’ PH值較佳為約7.5到約85，最佳為約8 〇。 病毒可以利用大小排除層析法純化。尤其，合併使用 離子交換及大小排_料。 、 、本發明之方面，提供包括根據在此描述之任何 方法純化的病毒^] έ ^ 、 的、、且成物。该組成物較佳適合臨床投藥， 尤其臨床投藥給人_。 ’、 員更佳的，該組成物包括醫藥上可接 12 200401829 义之賦形劑及/或載劑。 另—項本發明之方面，提供生產有感染力之呼腸病毒 的方法，包括： (a) 提供已被呼腸病毒感染的HEK 293細胞培養物； (b) 藉由加Triton χ_1〇〇到培養物中並在約25吒到 約370C培養，從細胞中萃取病毒； (c) 用核酸酵素（benz〇nase)處理步驟（b)的混合 物； °

(d )過渡移除細胞碎片； (e )用超過濾或透析過濾濃縮濾出液； (f )用離子乂換及大小排除層析法的組合來純化呼腸 病毒；及 (g )收集呼腸病毒。 亦提供包括根據此方法收集之啤腸病毒的組成物，尤 其進-步包括醫藥上可接受之賦形劑及/或載劑的組成物。 發明詳述 本發明係關於-種改善的從細胞培養物萃取及純化病 毒的方法，可以用於小規模及大規模的病毒生產。該方法 涉及簡單的萃取步驟，纟中清潔劑係直接加到細胞^養物 中。然後，細胞碎片可以藉自（舉例來說）過遽或離二從 卒取混合物中移除。得到的病毒懸浮可以進—步以層析法 濃縮及/或致濃（enriched)。根據本發明所製備的病毒可 以用於任何目#，包括純化病毒蛋白f，疫苗接種，感染

13 200401829 4百主細胞及ε品床投藥。 本發明所用之術語係 在進一步描述本發明細節之前 如下所定義，除非另有指定。 定義 木係指病毒進入細胞，然後病毒 在此所用的“病毒感 接著在細胞内複製。 時 在此所用的“病毒感染劑量 ，病毒數對細胞數的比例。 係指當病毒用來接觸細胞 在此所用的“細胞溶解，，係指 釋放所有或部分細胞内容物。 細胞細胞膜的崩解及接著

在此所用的“培養條件”係指用於細胞培養物的條件， 包括但不限於溫度，培養容器的種類，溼度，c〇2濃度或 任何其他用於培養容器的氣體，培養基種類，培養的細胞 之初始密度，以及初始病毒感染劑量（如果細胞被病毒感 染）〇 在此所周的"細胞培養物’’或”細胞的培養物，，意指一群 _ 如在其培養條件下所見之培養的細胞。尤其，細胞培養物 包括細胞及培養基。已被沉殿（pel letecj )的細胞並不被 認為是細胞培養物，除非他們再被置於培養條件下的培養 基中。 在此所用之“細胞關聯的’’病毒係指附著或陷入（ trapped)部分產病毒之細胞的病毒。所以，在宿主細胞溶 解之前，病毒是細胞關聯的。當細胞開始溶解，病毒仍然 14 200401829 可以附著或陷入部分破到Μ。 刀皮d的細胞，維持細胞關聯的。然而 ’當病毒被釋放到块碁其φ σ蚕基中，其不再是細胞關聯的了。” 無細胞病毒"係指與細胞沒有關聯的病毒。 在此所用的”萃敢”、由主么 个取病毋係指轉換細胞關聯的病毒成為 無細胞病毒的動作。 在此所用的’’清潔為| ”你社 d係心具有親水端及疏水端的物質 。清潔劑較佳是合成的π與几人L 、 珉的化學化合物，更佳是生物可分解的 合成化學化合物。右用W 士又义 有用於本發明的清潔劑增加了細胞膜的

崩解，加速崩解的細胞釋放内容物。 在此所用之在添加清潔劑到細胞培養物之後的"培養" 係指使細胞培養物與清潔劑混合一段時間的動作。 在此所用的“收集，，病毒係指白 ’、才曰自先别已被病毒感染之細 胞培養物中收集產生之病I^ 届t的動作。病毒的收集典型地係 把細胞碎片與病毒分離，收隼含 木各有病常的部分。視需要的 ，病毒可以進—步與可溶性物質分離，例如藉由離心。

在此所用的"周遭溫度，，係指介於肖啊及系勺3代之 間的溫度。周遭溫度較佳是介於約咖及約Μ之叫· 更佳是介於約㈣及約25τ之間，最佳是約咖。^ 在此所料“細胞病變”仙細料形變得膨脹及粒狀 ’細胞團破裂。細胞病變的細胞在活細胞計數亦吸著（ take up)染劑。 在此所用的“附著細胞，，係指在έ 牡、、、田胞培養附著到培養容 器的細胞。附著細胞的例子包括單層細胞，其係在培養容 器表面形成單層細胞的細胞，懸浮的細胞，，或‘‘懸浮二胞： 15 200401829 係指細胞培養不附著到培養容器的細胞。懸浮細胞可以長 在“旋轉培養基”（在培養過程中持續攪拌的培養基）。 在此所用的細胞是“破裂，，的，當細胞膜破裂及至少有 些細胞内容物從細胞釋放出來。細胞可以用，舉例來說， 冷凍-解凍、超音波震盪或清潔劑處理來破裂之。 在此所用的“細胞存活力，，或"細胞維持存活的比例，，係 指族群中沒有細胞病變之細胞比例。 在此所用的”不具封套（non-envei〇ped)的病毒”是# 沒有封套的病毒。舉例來說，不具封套的病毒可以是任何 _ 屬於腺病毒科（例如腺病毒），小核糖核酸病毒科（例如 小兒麻痒病毒），呼腸病毒科（例如呼腸病毒），

Papovarviridae (例如乳突狀病毒），小DNA病毒科（例 如Kilham大鼠病毒）或虹彩病毒科（例如tipula iridescent病毒）的病毒。 在此所用的“呼腸病毒，，係指任何被分類為呼腸病毒屬 的病毋’不論是天然產生的、經修飾的或重組的。呼腸病 毋係兴’雙股分段（segmented) RNA基因組的病毒。病毒 · 粒子直徑60-80奈米，並具有兩個同中心的蛋白殼，各為 一十面體。基因組由10一12個不連接的分段雙股RNA組成 ，全部基因組大小；16 —27 kbp。個別的RNA分段大小不同 。二個不同但相關型的呼腸病毒已從許多種（species)重 ’斤找到此二型具有共同的補體結合（complement-fixing )抗原。

人類呼腸病毒由三種血清型組成··型1 (Lang或T1L 16 200401829 株）、型 2 (J0nes 株，T2J)及型 3 (Dearing 株或 a— 株，T3D)。該三種血清型可容易基於中和及紅血球凝集素 (Hemagglutinin )-抑制分析來鑑認（見，舉例來說， Fields， Β· Ν·等人，！ 996 )。 呼腸病毒可以是天然產生的或經修飾的。當呼腸病毒 :以從天然來源分離得収未被人類纟實驗室中刻意修飾 牯，其疋天然產生的”。舉例來說，呼腸病毒可以來自“田 野來源”，即來自被呼腸病毒感染的人類。 呼腸病毒可以經修飾後仍保有裂性（lytically)感染 具有活化之ras路徑的哺乳動物細胞。呼腸病毒可以在施 給增殖細胞之前經化學或生化預處理（例如用蛋白酶，諸 如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶處理）。用蛋白酶預處理可移 除病毒的外被膜或蛋白殼，可以增加病毒的感染力。呼腸 病毒可以被包覆在脂質體或微胞（micelle) (Chandr〇n 及Nibert，1 998 )。舉例來說，病毒粒子可以在形成微胞 (micelle)之烷基硫酸鹽濃縮清潔劑存在下，用胰凝乳蛋 曰^8爽理以產生新的有感染力的亞病毒粒子顆粒。 呼腸病毒可以是重組呼腸病毒，其來自二或更多基因 上不同的呼腸病毒之基因分段重組/再分類（ ) 呼腸病毋基因分段之重組/再分類（reassortment )可 用至少兩個基因上不同的呼腸病毒感染宿主有機體後自然 產生。重組病毒粒子亦可在細胞培養物中產生，舉例來說 ’藉由以基因上不同的呼腸病毒共感染可容許的（ permissive )宿主細胞（Nibert 等人，1 995 )。 17 200401829 所以’本發明涵嘗决一夕 來自一或更夕基因上不同的呼腸病 毒之基因分段再分患自， , 、 、（reassortment)的重組呼腸病毒， 包括（但不限於）人類啤胳在主 丄 頬呼腸病毋诸如型1 (例如Lang株 )、型2 (例如J〇nes株）及型3 (例如株或

Abney株），非人類哺乳動物呼腸病毒或鳥類呼腸病毒。 本發明進一步涵蓋來白-十φ夕且 一或更夕基因上不同的呼腸病毒之 基因分奴再分類（reass〇rtment )的重組呼腸病毒，其中 至少-個親代病毒是經過基因工程的，包括一或更多化學

合成的基因分段，被化學或物理致突變物質處ί里，或其本 身是重組事件的結果。本發明進—步涵蓋在化學致突變物 質存在下經歷重組的重組呼腸病毒，包括（但不限於） 硫酸二甲酯及溴化乙錠，或物理致突變物質，包括（但 不限於）紫外光及其他形式的輻射線。 本發明進一步涵蓋含有一或更多基因分段缺失或重複 的重組呼腸病毒，其包括與宿主細胞基因體重組得到的額 外基因訊息，或包括合成的基因。

呼腸病毒可以藉由併入突變的被膜（c〇at )蛋白質來 修飾，諸如（舉例來說）將σ1併入病毒粒子外蛋白殼（ capsid)。蛋白質可藉置換、插入或缺失來突變。置換包 括插入不同胺基酸於原有胺基酸。插入包括在一或更多位 置插入額外胺基酸殘基於蛋白質中。缺失包括移除一或更 夕蛋白質的胺基酸殘基。此等突變可以用已知的方法產生 。舉例來說，編碼其中一個被膜蛋白質之基因的募核苦酸 疋點突變可造成想要的突變被膜蛋白質。在呼腸病毒活體 18 200401829 外感染的哺乳動物細胞内（諸如cosi細胞），突變蛋白質 的表現會使得突變蛋白質併入呼腸病毒的病毒粒子顆粒（ Turner 及 Duncan，1 992 ； Duncan 等人，1991 ; Mah 等人， 1990)。 在此所用的“HEK 293細胞，，係指標為293 ( ATCC Number CRL-1 573 )的人類胚腎細胞系或其衍生物。舉例來 說，293/SF細胞（ATCC號碼CRL—1 573el)是已被適應（ adapt)生長於無血清培養基的HEK 293細胞。本發明亦涵 蓋的是適應生長於其他培養條件下的HEK 293細胞，或以 外源DNA轉化之任何種類的HEK 293細胞或衍生物，限制 條件為此轉化不損傷如本發明所述之細胞支持有效之呼腸 病毒生產的能力。 在此所用的物質"臨床投藥”係指使活有機體任何部分 接觸物貝以改善或維持該有機體的健康狀況。 方法 、我們之前已發展了在HEK 293細胞中生長啤腸病毒的 方法（美國專利申請公開案第20020037576號）^呼腸病 毒在腿293、細胞内複製，於病毒感染後在細胞内得到= 的病毒效價，®而提供了—種簡單且有效之生產呼腸病毒 的方法此外，HEK 293細胞已被適應於懸浮生長，可以 大量培養，而且我們發展了大規模生產的方法。從懸浮培 養物分離呼腸病毒’我們—開始使用傳統方法來萃取及純 化病毒顆粒。料的說’細胞係以冷凍-解凍來破裂，並 19 200401829 用Freon萃取三次。病毒顆粒接著以梯度及超離^ 化。然而，此流程（pr〇t〇c〇1)對大規模生產病毒來說太 冗長及耗時。 " 斤乂我們發展了一種簡化的方法來萃取呼腸病毒。已 發現用清潔劑培養HEK 293細胞培養物一段短時間，高濃 度之有感染力的呼腸病毒會釋放到萃取液中。病毒可以接 著用簡單的分離方法（依據大小或濃度差異）從細胞碎片 分離出來，諸如過濾，透析過濾或大小排除法，得到的病 毒可以用於呼腸病毒治療。根據本發明而生產的呼腸病毒 適合施用給人類，此流程符合FDA建議之在清潔劑存在下 破裂細胞。 我們在預備實驗中測試了四種清潔劑，非離子清潔劑 Triton X-1〇〇，NP-40及吐溫20，還有離子清潔劑去氧膽 酸鈉。此四種清潔劑均能溶解細胞並釋放高於背景值之有 感染力的病毒顆粒，Triton X-100是最有效的。其他尤其 是常用來破裂細胞的清潔劑也可以用於本發明。這些其他 清潔劑的例子包括其他Tr i ton清潔劑'其他吐溫清潔劑（ 例如吐溫-80)、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰及氯化 十二烧基三甲基敍。 結果指出，用清潔劑萃取比用冷凍-解凍法（病毒萃取 的標準程序）更有效。此外，已報導從Vero細胞萃取鳥類 呼腸病毒（其中呼腸病毒是細胞高度關聯的），蒸餾的去 離子水比冷床-解床法、freon萃取或胰蛋白處理更有效（ Drastini等人，1992)。本發明提供更快速及方便有效的 20 200401829 方法，因為不需要像蒸餾水法沉澱（pel let)然後再懸浮 細胞。 南濃度的鹽類諸如氣化脈（guanidine chloride )可 以用於本發明來代替清潔劑。然而，較佳係使用清潔劑而 非南濃度的鹽類。 本發明因此提供一種快速而簡單從細胞培養物萃取病 毒的方法。清潔劑可以直接加到懸浮培養物中或加到附著 細胞的培養基中。兩者均不需先移除培養基。此外，不需 其他破裂細胞或萃取病毒的步驟，諸如冷凍—解凍法或超 _ 音波震盪。 本發明的重要特徵係萃取的步驟可以在周遭溫度或高 於周遭溫度進行。習慣上，病毒萃取及純化係在低溫下進 π典型疋0-40C，以確保蛋白質結構及功能。基於同樣 廣:因，^白酶抑制劑通常也包括在萃取液中。所以，令人 駕牙的7C本机私可以在較高溫度進行而不需任 抑，:事實上，|37〇C的高溫可以產生如與抓^ 之屬d杂力的病毒。所U — — 炳毋卒取可以直接加清潔劑到 細见培養物然後持續攪動 -产。另一、登姐曰 脣物；釋放病f，而不需改變 既然病毒萃取根據本發明不需維持定 :不二溫度進行，即使周遭溫度可能因地 而不同或在同一地卻隨時間不同。 萃取之後，病毒可以，舉 中其他成分大小或濃声差里戈β I於病母和萃取液 以用來從病毒移除細料片、來1 屯化。尤其，過濾或離心可 手片。為了最適化過攄條件，我們 21 200401829 在一些不同的萃取清潔劑存在下，測試了各種過渡器（實 施例1)。證明逐步過濾流程是最有效的。所以，先使用 具有較大孔洞大小（如5 μΜ或8 μΜ)的預過濾器來移除 萃取混合物中的大片段，接著用小孔洞過濾器，諸如具有 3 μΜ過濾态及〇· 8 μΜ過濾器的組合過濾單元。不預過淚 ，萃取混合物會快速阻塞過濾器，因而浪費材料及時間广、 依照過濾後收集的體積（如實施例丨所示），較佳係 使用1% Triton Χ-100做病毒萃取。此外，以醋酸纖維素 膜過濾比玻璃膜過遽好’因為醋酸纖維素膜過渡可容許過 濾較大體積的萃取混合物，使其更適合於大規模生產。 依據病毒生產的目的，可以濃縮該含病毒的濾出液。 用超過濾/透析過濾的濃縮步驟示範在實施例2。測試兩種 超過遽/透析過渡系統，Pall FUtr〇n的板框式卡匡（

Plate and Frame Cassette)及 A/G Techn〇1〇gy 的空心纖 維E。結果顯示兩系統在其操作速度或體積的流失是可相 比的，但空心纖維匣較容易操作。

病毒可以根據其表面帶電荷進—步純化。固為不同$ 鲁 毒具有不同的表面蛋白質，其在任何PH下決定了其表面 帶電荷’要依各病毒來決定適當的純化條件。實施例3插 迷了呼腸病毒理想離子交換條件的決定方法。所以，在不 同的PH使用具有不同樹脂的離子交換管柱來純化經如上 迷所卒取、過遽及濃縮的呼腸病毒製備物。結果顯示在pH 7·".5含彳ANX Sepharose的弱陰離子管柱是最有效的 ’ Pfl值較佳是約7.5或8.〇,最佳是約8.卜 22 200401829 病毒也可以基於大小的差異來純化，舉例來說，用大 小排除層析法。以呼腸病毒而言，離子交換及大小排除層 析法的組合是尤其有效的。其他層析方法諸如那些基於親 合力或疏水交互作用適當的話也可以使用。所以，管柱層 析可以用做是CsCl濃度梯度超離心的另一種有效的選擇， 以獲得好的產率，純度及擴充性（scalability)。

本方法可以使用除了 HEK 293細胞之外的細胞來應用 在呼腸病毒的生產上，包括（但不限於）老鼠Lg2 9、 Vero及中國倉鼠卵巢細胞。可預期的是本方法也可以應用 在其他病毒，尤其是其他不具封套（n〇n-enveloped)的病 毒。純化其他病毒的適當條件可以由習於該項技術者依照 此處的揭示所決定。可以使用本方法製備的病毒包括（但

不限於）myoviridae 、 siphoviridae 、 podpviridae 、 teciviridae 、 corticoviridae 、 plasmaviridae 、 lipothrixviridae 、 fuselloviridae 、癌病毒科（ poxviridae)、彩虹病毒科（iridoviridae)、藻類 DNA 病毒科 （pliycodnaviridae )、桿狀病毒科 （ baculoviridae)、癒療病毒科（herpesviridae)、腺病 毒科（adnoviridae )、乳多泡病毒科（papovaviridae ) 、 polydnaviridae 、 inoviridae 、 microviridae 、 geminiviridae、圓環病毒科（circoviridae)、小 DNA 病 毒科（parvoviridae)、嗜肝病毒科（hepadnaviridae) 、反轉錄病毒科（retroviridae) 、 cyctoviridae、呼腸 孤病毒科（reoviridae)、雙 RNA 病毒科（birnaviridae 23 200401829 )、副黏液病毒（paramyxoviridae )、彈狀病毒科（ rhabdoviridae )、線病毒科（f i loviridae )、正黏液病 毒科 （orthomyxoviridae )、布尼亞病毒科 （ bunyavir idae )、沙狀病毒科(arenaviridae )、輕小病 毒科（leviviridae )、小核糖核酸病毒（picornaviridae )、sequiviridae、牛豆嵌紋病毒科（comoviridae )、 馬鈴薯y病毒科（potyviridae )、般杯狀病毒科（ caliciviridae)、星狀病毒科（astroviridae)、野田病 毋科（nodaviridae )、四病毒科（tetraviridae )、 tombusviridae 、冠狀病毒科（c〇r〇naviridae )、 glaviviridae 、彼衣病毒科（t〇gaviridae )及 barnaviridae 科的病毒。 組成物 亦提供的是包含根據本發明方法製備之病毒的組成物 。这些組成物可以用在病毒蛋白質的分離及性質研究（ characterization )上，；i-姦 > 上、々人丄 公 王座仗田，私將含有具感染力病 毒的組成物作為病毒儲存或於臨床施用。 用於臨床施用之日& . 目的，该組成物通常與賦形劑混合， 以賦形劑稀釋或封入於膦蚤，代, 於膠囊、小袋（sachet)、紙張或其 :容器形式的载劑"WO99/08692A1)作為醫藥組成物。 “亥：藥上可接受之賊形劑作為稀釋劑，其可以是固態、 半固恶或液態原料，作兔 二、載/、、載背]或活性物質的培養基 。所以，組成物可以錠月、 Ά 樂片、粉末、錠劑、小袋（

24 200401829 sachet)、藥片（cachet)、漿液（elixir)、懸浮液、 乳劑、溶液、糠漿、氣霧劑（固態或在液態培養基中）， 含有（舉例來說）至多1 〇重量％活性化合物的軟膏、軟及 硬凝膠膠囊、栓劑、無菌之可注射溶液及無菌包裝之粉末 的形式。 有些合適之賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖（ dextrose )、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、 磷酸妈、褐藻膠、山羊刺樹膠（tragacanth )、凝膠、 石夕酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯毗咯酮、纖維素、無菌水、 無菌鹽水、糖漿及甲基纖維素。調配物可以額外包括：潤 滑劑諸如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化劑及 懸浮劑；防腐劑諸如苯甲酸曱酯及苯曱酸丙酯；甜味劑； 及凋未W。使用本領域已知的方法，本發明的組成物可調 配成在投藥給病患後提供快速、持久或延緩釋放活性成分 〇 施用呼腸病毒的方式，還有調配物、載劑或載具，會 因位置及標的細胞的種類而異。有多種的施周方式可以被 採用。舉例來說，對可接近的（accessible)實體 )腫瘤細胞，呼腸病毒可以經由直接注射到腫瘤細胞來施 =。以造血腫瘤細胞而言，舉例來說，呼腸病毒可以通過 靜脈或血管内施S。對不容易在體内接近的腫瘤細胞，諸 如轉移的癌細胞，呼腸病毒可以使用能讓其在哺乳動物全 身運輸而到達腫瘤細胞的方式施用（例如經靜脈或肌内） 。或者，呼腸病毒可以直接施用到單一實體（solid)腫瘤 200401829 細胞，然後經全身運輸被帶到 j评移的癌細胞。呼腸病毒亦 可以經由皮下、腹腔内、 卷 腹腔内㈤含知膜内（例如腦瘤）、局部 (例如黑色素瘤）、口服（例 u 腔或食道癌）、經直腸 結腸直腸癌）、經陰冑（例如子宮頸或陰道癌）、 -士或吸入噴冑（例如肺癌）的方式施用。較佳的，呼腸 病毒係以注射方式施用。

用於口服或注射之本發明醫藥上組成物可以存在的液 態形式包括水溶液，適當的是經調味的糖漿、水或油性懸 洋’及經食用油調味的乳劑，諸如玉米油、棉子油、芝 麻油、椰子油或花生油，以及漿液和相似的醫藥上載具。 至於製備固體組成物，諸如錠片，將主要的活性成分/ 呼腸病毒與醫藥上賦形劑混合，以形成含有本發明化合物 之均質混合物的固體預調配物組成物。當說這些預調配物 成物為均貝時，意指其活性成分在組成物裡均勻分散， 使得組成物可以容易的再分成同樣有效的單位劑量形式， 諸如錠片、藥丸及膠囊。

本發明錠片或藥丸可以被包覆或成為化合物以提俣具 有長效優點的劑量形式。舉例來說，該錠片或藥丸可包括 内劑和外劑組成，後者是以外殼的形式包覆前者。兩組成 可以藉腸層來分隔，其功能為在胃中抵抗瓦解，及使得内 組成完整通過到達十二指腸或使其延遲釋放。多種材料可 以作為此腸層或包覆，此等材料包括一些聚合酸及含有諸 士蛾％ (shellac)、綠壤醇（cetyi alcohol)及醋酸纖 維素材料的聚合酸混合物。 26 200401829 用於吸入或吹氣式的組成物包括溶液及在醫藥上可接 受之水性或有機溶劑中的懸浮液，或其混合物及粉末。液 態或固體組成物可含有如這裡所述之合適的醫藥上可接受 之賦形劑。對於局部或全身性效力，組成物較佳的係以口 服或鼻呼吸途徑施用。在醫藥上可接受之較佳溶劑中的組 成物可以藉由使用鈍氣而霧化。霧化的溶液可以從霧化裝 置直接吸入’或霧化裝置可以附在面具上，或週期性正壓 呼吸器。從以適當方式遞送調配物之裝置施用溶液、懸浮 液或粉末組成物，較佳的是以口服或經鼻。 在本發明之方法使用的另一個較佳的調配物採用皮膚 ，达裝置（"貼片’’）。此皮膚貼片可以用來提供定量的持 績或不連續之本發明呼腸病毒的注入。製造和使用皮膚貼 片來遞送商藥上试劑在本技術中為熟知的。見，舉例來說 ，美國專利第5, 023, 252號，在這裡以參考文獻併入。此 貼片可以製這成連續的、頻率的（叩IsMi )或經需要的 遞送醫藥上試劑。 其他合適用於本發明的調配物可以在Remingt〇n, s Pharmaceutical Sciences 中找到。 【實施方式】 下述實施例係用來敘述本發明，不能以任何方式視為 限制本發明的範圍。 實施例 在下列的實施例中，下列簡寫具有下列意義。沒有定 義的間寫具有其-般所接受之意義。 27 200401829

Cl = 信賴區間 (Confidence Interval) tcid5〇 = 組織培養有感染力的劑量 μΜ = 微莫耳濃度 mM = 毫莫耳濃度 M 二莫耳濃度 ml =毫升 μΐ = 微升 mg = 毫克 = 微克 g/L - 克/升 rpm = 轉/分鐘 FBS 二胎牛血清 DTT = 雙硫蘇醣醇 NP-40 =Nonidet P-40 (辛苯氧基聚乙氧乙醇） 〇 r\ 〇 〇y〇 二 十二貌基硫酸/納 PBS = 構酸鹽緩衝生理食鹽水 β - ME =β-乙基硫醇 (mercaptoethano 1 ) MOI 或 m. o. i.= 病毒感染劑量 PFU = 溶菌斑形成單位 hr = 小時 °C = 攝氏

28 200401829 一般材料及方法 細胞及病毒 人類胚腎293 ( HEK 293 )及老鼠纖維母細胞l-929 細胞係由製造商 BioRel iance Corporation ( Rockvi 1 le， 馬里蘭）所提供。HEK 293細胞係生長在含有i〇%熱失活的 馬血清及90%下列混合物的培養基中：Eagle氏最低必需培 養基（含2 mM L-麩胺醯胺）及Earle氏平衡鹽溶液（調 整到含有1· 5g/L碳酸氫鈉，〇· 1 mM非必需胺基酸，及丨.〇 mM丙酮酸鈉。老鼠l-929細胞在含有1〇% FBS及90%下列籲 混合物的培養基中繁殖：Eag 1 e氏最低必需培養基（含2 mM L-麵胺醯胺）及Earle氏平衡鹽溶液（調整到含有 1· 5g/L碳酸氫鈉，〇.丨mM非必需胺基酸，及h 〇 _丙酮 酸鈉。 293/SF細胞生長在293無血清培養基中（以化 Technologies > R〇ckvi 1 le，馬里蘭），添加 4 ㈣ L一麩

胺醯胺於航±2。(：，6%±2%⑶2及8心5%相對渔度 ，旋式瓶之推動器速度為35_4〇轉/分鐘。 用於這些研究之呼腸病毒血清型"如叫株先於 細胞懸浮培養物中增殖（根據Smith純化（Smith 人’ 1969 )，但是萃取緩衝液中不加卜乙基硫醇（卜服 )。純化之呼腸病毒的顆粒謂&例典型的$ 。 毒效價由對L-929細胞進行溶菌斑測定來決定，並 L〇gl0TCID5。/毫升表示。病毒然後在29謂、細胞大規模 產0 29 200401829 感染懸浮細胞 293/SF細胞生長到1Q6/毫升及μ腸病毒感染之。讓 培養物持續生長直到培養基顏色由紅色變撥色， 胞存活力降到想要的程度（以活細胞計數為憑）。對於那 些沒有細胞病變的細胞（由細胞外表變腫脹及粒狀以及细 胞團分散開來顯現），活細胞計數可以在顯微鏡下: 活細胞計數亦可以如技藝中常用的活體染色來進行。

卒取及純化病毒的傳統方法 當達到了想要的細胞生存力，經離心機沉殿（的以 )細胞並再懸浮s 1G mM Tris，pH 7 4, 25Q mM Naei ^ 。用等體積預冷的 烷）萃取懸浮液 0.1% Triton X-100中、細胞然後用冷康_解;東法溶解並置 於冰上2G-4G分鐘（加以週期性震幻以混合及溶解細游

Freon® (M，2-三氯 _M，2—三氟一乙 (震盪10分鐘），接著2500 rpm 4。(：離 心_1〇分鐘以分離不同相。移除水相（上層）並如上所述

再萃取兩人於4C 25,000 rpra超離心一小時以沉澱（ pellet)病毒。 將沉澱（pellet)再懸浮於PBS中，用氯化鉋步驟梯 度純化病毒。該梯度有兩層CsC1溶液（分別為12〇克/毫 升及1· 4克/¾升）於i〇mM Tris ( ρΗ 7· 4)中製備。將 病母懸浮液置於梯度的最上方，於4〇c的sw 28. 1轉輪、 26,〇〇〇 rpm離心兩小時。收集病毒條帶（band)(兩條條 ▼的下面那條是因為上面條帶含有空的蛋白殼），並與無 菌的PBS做透析。 30 200401829 核酸酵素（benzonase)處理 以清潔劑溶解細胞之後，加50 mM MgCl2溶液到粗細 胞溶解物中，MgCl2終濃度為1 mM。然後加入約10單位/ 毫升的核酸酵素（benzonase ) (250, 000單位/毫升，em Industries目錄編號1〇16979M)。細胞溶解物在36%培 養箱中搖動一小時。 實施例1 淨化：移除細胞碎片 _ 本實％例的目的係發展一合適的淨化程序以適合於用 清潔劑溶解細胞的流程及可配合未來大規模生產時做修改 。在此實施例中，細胞溶解物係經由3微米/〇. 8微米膠囊 式過濾或通過一組合預過濾（5微米或8微米）然後一 3 微米/0.8微米的膠囊式過濾。所有用於本研究之過濾器具 有表：積0.015 ft〗。根據通過〇.〇15 ft2膜過濾的體積 ’決定大規模過濾之膜容量。針對3微米/〇·8微米膠囊式 過濾，亦比較兩不同膜材料（贈酸纖維素及玻璃膜）的過馨 濾效率。 測試三種清潔劑。潛伏了（harb〇ring)呼腸病毒的細 胞被等分成三個無菌的丨公升瓶中’標記作為三種不同溶 解劑的測試：mriton χ-100，0·3% Trit〇n χ_ι〇〇 及 0.1% Na-DOC。加92毫升及28毫升體積的ΐ()% τ_η χ_ 100到瓶1及2,使這些瓶中的操作濃度分別為1%及〇.3% Trit〇n Χ_100。加9.2毫升體積的1〇% Na_D〇(：到第三個瓶 31 200401829 子中，使操作濃度為〇· 1%。所有三個瓶子都放到搖動盤上 ，於160 土 20 rpm室溫搖動30分鐘。溶解後的樣本拿來 作各溶解條件的效價分析。 加約20毫升50mM MgClg到各粗細胞溶解物瓶中，使 操作濃度約ImM MgCh。接著加入4〇微升的核酸酵素（ benzonase) ( 250,000單位/毫升）使操作濃度約1〇單位 /毫升。粗細胞溶解物在36。(；培養箱5號設定搖動一小時 。包括這些步驟是用以移除宿主細胞DNA及減低細胞溶解 物的黏性，使後續的處理較容易。 _ 調整Watson-Marlow幫浦（ 505U)使相關於幫浦速度 的"IL速。根據廠商的建議，在整個淨化研究當中使用幫浦 速度為5 rpm ( 40毫升/分鐘流速）。 將各處理條件的細胞溶解物通過下列過渡之一： 1) 3微米/0.8微米膠囊式過濾； 2) 5微米大小預過濾—3微米/0· 8微米膠囊式過渡（ 連接在一起）；及 3 )膜孔洞大小8微米的預過濾〜3微米/〇· 8微米膠 β 囊式過濾（連接在一起）。 3微米/0· 8微米膠囊式過濾具有雙層相異的膜組成， 容許高雜質的負載容量並增加處理量。第一個過渡具有較 大的孔洞大小（3微米），然後第二個過濾（〇· 8微米）。 預過渡結合了多層進步的細微打褶的非編織的聚丙稀深度 過濾、材料。所有在此研究所用的過濾之表面積為〇 〇15 f t2。兩膜材質，即醋酸纖維素和玻璃，做3微米$微 32 200401829 米膠囊式過濾測試。 最好的溶解劑及過濾條件的組合係根據效價和通過過 濾膜之體積而定。偵測通過膜之壓力減少以決定膜堵塞何 時發生。膜堵塞的指標為壓力下降25 psi，超過過濾可達 到的。當僅使用3微米/〇· 8微米膠囊式過濾，在膜堵塞前 ，通過這些膠囊式過濾的不得超過35毫升。膜大小3/〇8 微米的在5分鐘之内就堵塞，顯示需要使用預過濾以減少 膜因細胞碎片而成塊。在3/0· 8微米膠囊式過濾之前使用 5微米預過濾大大增加所得到之濾出液的量，當以8微米馨 預過濾進行過濾，接著以3微米/〇· 8微米膠囊式過濾，就 通過過慮的體積來說，可以得到最高的膜容量（每〇. 〇15 ft2過濾表面積可平均收集2〇〇毫升）。與其他兩種溶解條 件相較，1 % Tr i ton X-10〇可得到最佳結果。 根據通過這些膜而過濾的體積，結果亦顯示醋酸纖維 素膜材料較玻璃膜為佳。當與集體收集（溶解及過濾之前 的細胞培養物）的感染力相較，在過濾的任何階段沒有觀 带土·』暴只石wv ▲每力損穴y根據本研究的結果，過滤2 〇公 升的集體收集需要1· 5 ft2的膜表面積。 實施例2 濃縮 為了選擇一個合適的系統來濃縮及透析過濾淨化的細 胞溶解物，比較Pal 1 Fi 1 tron ( www. pal 1 · com )的板框式 卡匣（Plate and Frame Cassette)和 A/G Technology ( 33 200401829 WWW· agtech· com )的空心纖維匣。使用相同的聚醚楓（ polyethersul f one )膜材料於兩系統中。選擇的標準是使 用的容易性、所達到的濃縮程度及產物的病毒效價。

用於本研究之板框式卡g ( Plate and Frame Cassette)是Pall’s MINIM系統，其為實驗室工作檯裝 置，以及LV Centramate含有兩個懸掛式濾篩管道300 kD 超過;慮膜（各0 · 2 f t2 )。在濃縮淨化了的細胞溶解物之 前，設備先以2公升逆滲透（R0)水（USP級）潤濕以洗 除儲存膠體。用2公升溫0·1Ν NaOH消毒匣（cassettes) · 。然後排除系統内的液體，用2公升R〇水潤濕，用病毒的 生長培養基調整（conditioned)。排除整個系統的液體， 系統及管線内體積定為6毫升。 本研九所測试之空心纖維係A/G Technology的 QuixStand Benchtop系統，4M大小的管柱超過濾匣（表面 積650平方公分）。而板框式卡g ( piate and Frame Cassette)，先以2公升逆滲透（R〇)水（USP級）沖洗 設備以洗除儲存膠體u周2公升溫〇· IN Na〇H消毒匣（_ Cassettes)。然後排除系統内的液體，用2公升R〇水潤 /燕’用病毋的生長培養基沖洗以調整（c〇nd i t i oned )之。 整個實驗使用固定的供應流速600毫升/分鐘。 在這兩個系統中，會再循環該淨化的細胞溶解物直到 物質濃縮到〜250毫升（ι〇χ濃縮），取一樣本做效價分析 (後-濃縮I)。濃縮物（retentate)以1公升（5透析過 濾體積）的透析過濾緩衝液（20 mM Tris + 0.2M NaCl + 34 200401829 1 mM MgCh ’ pH 8· 0 ± 〇· i )做透析過濾、，取另_樣本做 效價分析（後—透析過濾）。濃縮物進一步濃縮到約120毫 升。在最終濃縮之後，從系統排出產物並收集在單一、盔 菌的容器中（後—終濃縮）。然後用40毫升的透析過濾緩 衝液潤濕系統以確保回收最多產物。 在空心纖維及板框式（Plate and Frame)系統濃縮方 法中監測的私序參數顯不在表1。 表1·比較空心纖維及板框式（Plate and Frame)系統的程序參數 鲁 糸統 程序 時間 (小時） 表面積 (平方公分） 濃縮 係數 平均進料流速 (毫升/分鐘） 滲透流速 毫升/分鐘 W (psi) 開始 結束 開始 結束 開始 結束 空心纖維 3 650 14X 600 600 50 18 8 8— 板框式 4 372 20X 260 450 54 12 9.2 30 TMP =[(進料壓力+濃縮物壓力）/2-滲透壓力] 整個空心纖維程序中的過膜壓力（TMP)維持在少於8 psi，而板框式（Plate and Frame)程序的TMP升$ 如

| u丄 t XJ \J ps i。空心纖維系統使用較大的膜表面積可能使得匣較少堵 塞。 板框式卡 E ( Plate and Frame Cassette) 4 小時可 以達到約2OX倍濃縮，而空心纖維匣3小時可以達到1 倍濃縮，及再30分鐘可得到20Χ濃縮。有45-50%產物損 失（與各系統後-溶解值相較）。裝配空心纖維匣比板框 式卡匣（Plate and Frame Cassette)容易。所以，空心 35 200401829 纖維匣是適合超過濾及透析過濾步驟的系統，因為其易於 操作。 實施例3 離子交換 病毒因為其表面分子而具有不同的表面電荷。所以， 可以利用離子交換層析來純化病毒，條件則依病毒特性而 異。因此，我們為了呼腸病毒而測試離子交換層析的各種 pH條件。如上所述生產，萃取及過濾呼腸病毒，然後在不 同的pH下進行離子交換層析。測定每個步驟的效價並列 在下面0

表2.在各pH之離子交換層析的效果 樣本 效價:t95Q/〇 體積校正2 校正的效價士 95% Cl (Log10 TCI1V Cl (L〇g10Tciiy 毫升） 毫升） Spiking 病毒控制組，10/30/01 8. 05 ± 0.47 - - RE3013101P之證明的效價 8.35 ± 0. 27 - - 陰性控制組 沒有偵測到病毒 - - ONC 101 ， 集體收集 氺氺 - - ONC 102 ， 後過濾 9.18 ± 0.36 - 9.18 ± 0.36 ONC 103 ， 後管柱，強陽離子pH 4.0 5. 93 ± 0. 24 1.02 5. 94 ± 0. 24 ONC 104 ， 後管柱，強陽離子pH 5.0 8. 93 ± 0· 42 1.01 8. 93 ± 0.42 ONC 105 ， 後管柱，強陽離子pH 6.0 9.18 ± 0.40 - 9.18 ± 0.40 ONC 106 ， 後管柱，強陽離子pH 7.0 9. 30 ± 0.37 - 9. 30 ± 0. 37 y 36 200401829

ONC 107，後管柱，強陽離子pH 8.0 9. 55 ± 0. 32 - 9. 55 ± 0. 32 ONC 108，後管柱，弱陽離子pH 4.0 8. 93 ± 0.40 1.01 8. 93 士 0. 40 ONC 109，後管柱，弱陽離子pH 5.0 9.18 ± 0. 36 1.01 9.18 ± 0.36 ONC 110，後管柱，弱陽離子pH 6.0 8. 68 ± 0.40 - 8. 68 ± 0. 40 ONC 111，後管柱，弱陽離子pH 7. 0 9.30 ± 0. 37 - 9. 30 ± 0. 37 ONC 112，後管柱，弱陽離子pH 8. 0 8.18 ± 0. 36 1.02 8.19 ± 0. 36 ONC 113，後管柱，強陰離子pH 5.0 5.30 ± 0. 37 1.01 5. 30 ± 0. 37 ONC 114，後管柱，強陰離子pH 6.0 4. 80 ± 0. 00 - 4. 80 ± 0. 00 ONC 115，後管柱，強陰離子pH 7.0 7.80 ± 0. 35 - 7. 80 ± 0. 35 ONC 116，後管柱，強陰離子pH 8.0 10.18 ± 0.36 1.01 10.18 ± 0.36 ONC 117，後管柱，強陰離子pH 9.0 8. 55 ± 0. 32 - 8. 55 ± 0. 32 ONC 118，後管柱，弱陰離子pH 5.0 7. 93 ± 0. 40 - 7. 93 ± 0. 40 ONC 119，後管柱，弱陰離子pH 6.0 6. 68 ± 0. 40 - 6. 68 ± 0.40 ONC 120，後管柱，弱陰離子pH 7.0 8.30 ± 0. 37 1.02 8. 31 ± 0· 37 ONC 121，後管柱，弱陰離子pH 8.0 10.53 ± 0.36 1.03 10.54 ± 0.36 ONC 122，後管柱，弱陰離子pH 9.0 8. 93 ± 0. 24 1.03 8. 94 ± 0. 24 所以，pH 7. 0-9. 0比其他pH可得到較高的呼腸病毒 產量。用於此步驟的pH較佳為7.5-8.5，尤其是pH 8.0。 儘管陽離子及陰離子交換均可使用，陰離子交換一般較為 有效。 37

Claims (1)

1. 200401829 拾、申請專利範圍·· 1 · 種從細胞培養物生產病毒的方法，包括步驟： (a )提供一被病毒感染的細胞培養物； (b )從細胞萃取病毒，其係藉由加清潔劑到培養物及 培養一段時間以得到細胞溶解物； (c )移除細胞碎片；及 (d )收集病毒。 2 ·根據申請專利範圍第1項的方法，其中細胞碎片 係以過濾移除。 3 ·根據申請專利範圍第1項的方法，其中細胞碎片 係以逐步過濾移除，其包括： (1 )經由具有5微米或8微米孔洞大小的預過濾、來 過渡，及 (2 )步驟（1 )過濾之後，通過具有3微米及〇· 8 微米孔洞大小的組合過濾來過濾。 4. 根據申請專利範圍第！項的方法，其進一步包括 以核酸酵素（benzonase)處理細胞溶解物。 5. 根據申請專利範圍第2項的方法，其進一步包括 濃縮該濾出液。 6·根據申請專利範圍第5項的方法，其中濾出液係 以透析過滤濃縮。 7 ·根據申請專利範圍第1項的方法，其中該病毒係 不具封套（non-enveloped)的病毒。 8·根據申請專利範圍第1項的方法，其中該病毒係 呼腸病毒。 38 200401829 9.根據申請專利範圍第8項的方法，其中該呼腸病 毒係哺乳動物呼腸病毒。 10·根據申請專利範圍第9項的方法，其中該喷乳動 物呼腸病毒係人類呼腸病毒。 11.根據申請專利範圍第10項的方法，其中該人類 呼腸病毒係血清型3病毒。 12·根據申請專利範圍第u項的方法，其中該血清 型3呼腸病毒係Dear ing株。 13. 根據申請專利範圍第！項的方法，其中該呼腸病 毒係重組呼腸病毒。 14. 根據申請專利範圍第！項的方法，其中該細胞係 人類胚腎293 ( HEK 293 )細胞。 15. 根據申請專利範圍第14項的方法，其中該hek 293細胞係懸浮生長。 1 6·根據申请專利範圍第丨項的方法，其進一步包括 以離子交換層析純化病毒。 17·根據申請專利範圍第丨項的方法，其進一步包括 結合離子交換及大小排除層析法來純化病毒。 18· —種包括根據申請專利範圍第1項收集之病毒的 組成物。 19·根據申請專利範圍第18項之組成物，其適合臨 床施用。 20·根據申請專利範圍第19項之組成物，其進一步 包括醫藥上可接受之賦形劑及/或載劑。 200401829 21· 一種生產有感染力之呼腸病毒的方法，其包括： (a) 提供一被呼腸病毒感染的JJEK 293細胞培養物； (b) 從細胞萃取病毒，其係藉由加Trit0I1 X-100到 培養物及培養在約25°C至約37。(：； (c )以核酸酵素（benzonase )處理來自步驟（b)的 混合物； (d )以過濾移除細胞碎片； (e )以超過濾或透析過濾濃縮濾、出液； (f )結合離子交換及大小排除層析法以純化呼腸病毒 •，及 (g )收集呼腸病毒。 22· —種包括根據申請專利範圍第21項之方法製備 之呼*腸病毒的組成物。 23.根據申請專利範圍第22項的組成物，其進一步 包括醫藥上可接受之賦形劑及/或載劑。 拾壹、囷式： 200401829 柒、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 無 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式