TW200913996A - Use of compound I to prevent or treat biofilm formation - Google Patents

Description

200913996 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於式4-[3,5-雙-(2_經苯基 T Ll，2,41-二吨 _】其 1 苯甲酸之化合物（式ί化合物）抑制或破壞 一 土] 化之個體的肺中所遭遇之環‘條:_= ®、#膿;f干函形成生物膜之用途。 【先前技術】

囊腫性纖維化為最常見縮短壽命、兒童期發作之遺傳疾 病之-。在美國’發病率為1000個中1{列。在澳大利亞之 維多利亞，發病率為3繼個中W。在意大利北部發病 率為側個中1例。其在歐洲人及㈣猶太人（Ashkenazi

Jews)中最為常見；歐洲血統每二十二個人中便有一個攜 帶-種囊腫性纖維化（CF)基因，使得其為他們中最常見: 遺傳疾病。 囊腫性纖維化，縮寫為CF，亦稱為膠稠性黏液病 (mucoviscidosis)，為影響整個身體、引起進行性失能及早 期死亡之遺傳疾病。以前稱為胰腺囊腫性纖維化，此實體 已日益地被簡稱為"囊腫性纖維化"。CF係由叫做囊腫性纖 維化跨膜傳導調節因子（CFTR)之基因發生突變所引發。此 基因之產物有助於產生汗液、消化液及黏液。儘管大多數 無CF之人具有CFTR基因之兩個工作複本（working copies)，但僅需要一個以預防囊腫性纖維化。當兩個基因 均不正常工作時發生CF。因此，將CF視為體染色體隱性 疾病（autosomal recessive disease)。名稱囊腫性纖維化係 131369.doc 200913996 指特徵’纖維化’（組織結瘢）及胰腺中囊腫形成，在2〇世紀3〇 年代首次識別。呼吸困難及胰腺中酵素產生不足為最常見 之症狀。稠黏液產生以及低免疫系統導致頻繁肺感染，其 藉由經口及靜脈内抗生素及其他藥物來治療，但並不總能 被治癒。 具有囊腫性纖維化之個體的肺自早年就被細菌拓殖且感 f..'

染。此等經常在具有CF之個體中傳播之細菌在改變之黏液 中旺盛生長，而黏液在肺之小氣管中聚集。此黏液促使形 成細菌微環境，例如生物膜，其使免疫細胞及抗生素難以 穿透。肺藉由逐步重塑下呼吸道（例如支氣管擴張）來回應 黏稠为泌及’)¾性感染所引起的重複損害，從而使得感染更 難以得到消除。隨時間流逝，在具有CF之個體中細菌類型 及其個體特徵均改變。最初，諸如金黃色葡萄球菌 《狀⑽）及流行性感冒嗜血桿菌（价 匀之常見細菌拓殖及感染肺。然而最終，綠膿桿 菌及有時洋蔥伯克霍爾德菌（如，叩此⑷佔優 勢 旦在肺中，此等細菌即適應於環境且對通常所用之 抗生素產生抗性。綠膿桿菌（户所⑽M)可產生允許形 成大菌落之特定特徵，此等菌才朱稱為，，類#占蛋白（mucoid)” 綠膿桿菌且很少見於不具有囊腫性纖維化之人中。 生物膜為具有不同結構 個微小的城市，其中各自 之微生物的聚集體。生物膜像一 僅為1微米或2微米長之微生物細 胞形成可達數百微 流體填充之通道， 米高之塔。各塔之間的，，街道”事實上為 其引入營養素、氧及活生物膜群落之其 131369.doc 200913996 他必需品。 生物膜形成於導管線及隱形眼睛之表面上。其生長於節 律益、心瓣膜置換件、人造關節及其他外科手術植入物 ^。疾病控制中心（CDC)估計65%以上院内（醫院獲得性）感 乐係由生物膜所引發。 生長於生物膜中之細菌對抗生素具有高度抗性，比非生 長於生物膜中之相同細菌之抗性大至多_〇倍。標準抗

生素療法、經常為無用的且唯―幫助可能為移除受污染之植 入物。 綠膿桿菌為具有單極運動性之革蘭氏（Gram)陰性需氧桿 狀細菌。機會性人類病原體綠膿桿菌亦為植物之機會性病 原體。 綠膿桿菌對許多抗生素具有天然抗性且在失敗治療之後 尤其經由孔蛋白（porin)改質可證明額外抗性。可能通常應 根據實驗敏感性而非憑經驗選擇抗生素來指導治療。若憑 經驗起動抗生素，則應盡每份努力以獲得培養物且當培養 結果可得時應評述所用抗生素之選擇。 具有抵抗綠膿桿菌之活性的抗生素包括胺基糖苷，例如 建它黴素（gentamicin)、阿米卡星（amikacin)、妥布黴素 (tobramycin);喹諾酮，例如環丙沙星（ciprof丨oxacin)及左 氧氟沙星（levofloxacin);頭孢菌素，例如頭孢他„定 (ceftazidime)、頭孢。比肟（cefepime)、頭孢匹羅（cefpirome); 脲基盤尼西林(ureidopenicilline)，諸如β底拉西林（piperacimn)、 替卡西林(ticarcillin);碳青黴烯類（carbapenem)，諸如美羅培 131369.doc 200913996 南（meropenem)、亞胺培南（imipenem).夕 / ，夕黏_素 (polymyxin)，諸如多黏菌素B、黏菌素（c〇lisUn);及單環 β-内醯胺類（monobactams)，諸如胺曲南 細囷綠腹桿為人類疾病中之多用途及有疑門^_原體 其在呼吸道中引起社區性及院内肺炎（後者係與支氣管擴 張患者之高死亡率相關）且為患有遺傳病症囊腫性纖維化 (縮寫為CF)之患者中的主要病原體。其亦在灼傷及缺血傷 口中引起感染且常常污染醫學裝置。因為生物體可接受生 物膜存在’所以許多賴桿菌感染對習知療法亦即抗^素 具有抗性。舉例而言’在CF中，綠膿桿菌在肺黏液中生長 為外多醣（ex〇P〇lysaccharide)嵌埋小菌落。在此等條件 下，藉由諸如由生物膜之緩慢擴散造成之局部降低氧張力 之因素，對抗生素之抗性得以增強。此等因素一起又 性生物膜相關感染中之綠腹桿菌幾乎不可能得到治療。又 c=要新賴策略以治療慢性綠膿桿菌感染且消除例如 心者中之生物臈，例如綠膿桿菌生物膜。 :°4勿你j如化合物1可用以例如在囊腫性纖維化Φ 者中消除生物膜，例如絳t 生物㈣成，及/或例 在心者中治療綠膿桿菌之生物膜形成。 在美國專利第6,46 鹽及其結晶形式之如； 呈游離酸形式、其 具有下式 下所述㈣合物，及化合物！，亦即 酸。 ’5>(2-經苯基叫三嗤+基]苯甲 131369.doc 200913996

【發明内容】 本發明因此在一態樣中係關於通式I之鐵螯合劑的用

其中

Ri與R5同時或彼此獨立地為氫、鹵素、經基、低碳燒 基、函-低碳烷基、低碳烷氧基、函-低碳烷氧基、羧基、 胺曱醯基、N-低碳烷基胺曱醯基、n，N-二低碳烷基胺曱醯 基或腈； R2與R4同時或彼此獨立地為氫、未經取代或經取代之低 碳烧醯基或芳酿基，或在生理條件下可移除之基團，例如 保護基團； &為氫、低碳烷基、羥基-低碳烷基、鹵_低碳烷基、羧 基-低破烧基、低碳烧氧基羰基_低碳烷基、r6R7N_c(0)_低 碳烷基、未經取代或經取代之芳基或芳基_低碳烷基或未 131369.doc 200913996 經取代或經取代之雜芳基或雜芳烷基； R6與R7同時或彼此獨立地為氫、低碳烷基、羥基-低碳 烧基、烧氧基-低碳烧基、輕基烧氧基-低碳烧基、胺基-低 碳烷基、N-低碳烷基胺基-低碳烷基、N，N-二低碳烷基胺 基-低碳烧基、Ν-(^基-低碳烧基）胺基-低碳烧基、N，N-二 (羥基-低碳烷基）胺基-低碳烷基，或連同其鍵結之氮原子 一起形成氮雜脂環；或其醫藥學上可接受之鹽；其用於治 療綠膿桿菌之生物膜。 本發明較佳係關於上述用途，其包含至少一種式（I)化合 物，其中

Ri與R5同時或彼此獨立地為氫、鹵素、羥基、低碳烷 基、鹵-低碳烧基、低碳烧乳基或鹵-低碳烧氧基；R~2與R4 同時或彼此獨立地為氫或在生理條件下可移除之基團；r3 為低碳烧基、經基-低破烧基、竣基-低碳烧基、低碳烧氧 基幾基-低碳烧基、R6R7N-C(0)-低碳烧基、經取代芳基、 芳基-低碳烷基、經取代之N-低碳烷基胺基、N，N-二低碳 烧基胺基或N-°比咯。定基（pyrrolidino)，或未經取代或經取 代之雜芳基或雜芳烷基；R6與同時或彼此獨立地為氫、 低碳烧基、經基-低碳炫《基、烧氧基-低碳烧基、經基烧氧 基-低ί炭烧基、胺基-低碳烧基、N-低碳烧基胺基-低礙烧 基、Ν，Ν-二低碳烧基胺基-低碳烧基、Ν-(輕基-低礙炫基） 胺基·低碳烷基、Ν，Ν-二（羥基-低碳烷基）胺基-低碳烷基， 或連同其鍵結之氮一起形成氮雜脂環；及其鹽；及至少一 種醫藥學上可接受之載劑，及其製備方法。 131369.doc -10- 200913996 苯美)π 2 ::用途中’較佳之式1化合物為4-[3,5-雙(2-經 三唾-1·基]苯甲酸或醫⑷ I如⑼如）美國專· 6,596,75QB2 B1«P〇914118令所述來製備式！化合物。 ， 齒素為(例如)氣、演或氟，但亦可為峨。 字：”低碳’，表示具有不多於7個且詳言之不多於 子之基團。 烧基為直鏈或支鏈。例如低碳絲本身或作為例如低碳 烷氧基、低碳烷基胺、低碳烷醯基、低碳烷基胺基羰基之 其他基團的成份時’其可未經取代或經（例如）齒素、羥 基、低石反烧氧基、三氟甲基、環低碳院基、氮雜脂環基或 苯基所取代，其較佳未經取代或經羥基取代。 低碳烧基例如為正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第 一丁基、第二丁基、正戊基、新戊基、正己基或正庚基， 較佳為甲基' 乙基及正丙基。鹵_低碳烷基為經鹵素，較 佳氯或氟，詳言之經至多三個氣或氟原子取代之低碳烷 基。 低碳烷氧基例如為正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異 丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧 基，較佳為甲氧基及乙氧基。函_低碳烷氧基為經齒素， 較佳氣或氟，詳言之經至多三個氯或氟原子取代之低碳烷 氧基。 胺甲醯基為基團H2N-C(0)- ’ N-低碳烷基胺曱醯基為低 碳烷基-HN-C(O)-且N，N-二低碳烷基胺甲醯基為二低碳烧 131369.doc -11 - 200913996 基-N-C(O)-。 低碳烷醯基為HC(O)-及低碳烷基-C(O)-，且例如為乙醯 基、丙醯基、丁醯基或三甲基乙醯基。 低碳烧氧基幾基表不基團低碳烧基-〇 - C (Ο) - 5且例如為 正丙氧羰基、異丙氧羰基、正丁氧羰基、異丁氧羰基、第 二丁氧羰基、第三丁氧羰基、正戊氧羰基、異戊氧羰基， 較佳為曱氧羰基及乙氧羰基。 芳基本身（例如芳基）或作為例如芳基·•低礙烧基或芳醯基 之其他基團的成份例如為苯基或萘基，其經取代或未經取 代。芳基較佳為未經取代或經一或多個、詳言之一或兩個 取代基所取代之苯基，該等取代基例如為低碳烷基、低碳 烧氧基、經基、确基、ifi素、三II甲基、叛基、低碳烧氧 基幾基、胺基、N -低碳烧基胺基、N，N-二低碳烧基胺基、 胺基羰基、低碳烷基胺基羰基、二低碳烷基胺基羰基、雜 環烷基、雜芳基或氰基。芳基主要為未經取代之苯基或萘 基，或經低碳_烧基、低碳烧氧基、經基、鹵素、叛基、低 碳烷氧基羰基、Ν,Ν-二低碳烷基胺基或雜環烷基羰基取代 之苯基。 芳醯基為基團芳基-C(O)-且例如為苄醯基、甲苯甲醯 基、萘曱醯基或對甲氧苄醯基。 芳基-低碳烧基例如為苄基、對氯节基、鄰氟苄基、苯 基乙基、對曱苯基甲基、對二曱基胺基苄基、對二乙基胺 基苄基、對氰基苄基、對。比咯啶基苄基。 雜環烷基表示具有3至8個、詳言之具有5至不多於7個環 131369.doc -12- 200913996 原子之環烧基，環原子中至少 為較佳。氫雜浐产“ 4雜原子’· i '氮及硫 之飽和：為具有3至8個、詳言之5至7個環原子 亦可含者為虱原子。氮雜脂環基 丌了 3有其他％雜原子，例如氧 基，基一。氮::環== 函素或低錢基取代。如已知將經由環氮原 :雜脂環基（其為較佳）指定為心以基⑻㈣一心底 唤基（师erazino)、Ν·嗎琳基（m〇rph〇iin〇)、N“比洛咬基 (Pyrrolidino)等。 土 雜芳基本身（例如雜芳基）或作為例如雜芳基_低碳烧基之 其他取代基的成份為具有3至不多於7個、詳言之5至不多 於7個環原子之芳族基，環原子中至少一者為雜原子例 如口比口各基…米峻基、三唆基、四嗤基…惡。坐基…塞嗤基、 咳"南基、口塞吩基、η比咬基"比嗅基…惡嗔基、嘆嘻基、哌 喃基或嘧啶基。雜芳基可經取代或未經取代。未經取代或 經一或多個、詳言之一或兩個取代基所取代之雜芳基為較 佳，取代基例如為低碳烷基、齒素、三氟甲基、羧基或低 碳烷氧基羰基。 雜^基_低奴烧基表示若院基鏈含有兩個或兩個以上碳 原子，則氫原子中至少一者（較佳在末端c原子上）係經雜 芳基置換之低碳烷基。 正低碳烧基胺基例如為正丙胺基、正丁胺基、異丙胺 基、異丁胺基、羥基乙胺基，較佳為曱胺基及乙胺基。在 ν，ν-二低碳烷基胺基中’烷基取代基可相同或不同。因此 131369.doc •13- 200913996 N，N-二低碳烷基胺基例如為ν,Ν-二甲胺基、Ν,Ν-二乙胺 基、Ν,Ν-甲基乙基胺基、Ν-曱基-Ν-嗎啉基乙胺基、Ν-甲 基-Ν-羥基乙胺基或Ν-曱基-Ν-节基胺基。 例如在McOmie，Protective Groups in Organic Chemistry， Plenum Press, London，New York (1973)中及在 Methoden der organischen Chemie [Methods of organic chemistry],

Houben-Weyl，第 4版，第 1571 卷，Georg Thieme，Stuttgart (1974)以及在 Greene，protectiVe Groups in Organic Synthesis，John Wiley, New York (1981)中描述保護基團、 其引入及移除。保護基團之特徵在於其可易於移除，亦即 無不當副反應例如以溶劑分解、還原、光分解方式或者在 生理條件下發生。羥基可例如以易於分裂酯或醚基團較 it烧醯基或芳基烧醯基酯基或環雜烧基、芳院基或烧氧基 烷基醚基團以及矽烷基酯或矽烷基醚基團，詳言之以乙醯 基或苄醯基酯或四氫哌喃基、苄基或曱氧基曱基醚之形式 存在。 式（I)化合物之鹽為醫藥學上可接受之鹽，尤其與鹼形成 之鹽，諸如適當鹼金屬或鹼土金屬鹽，例如鈉、鉀或鎂 鹽，醫藥學上可接受之過渡金屬鹽，諸如辞鹽，或與有機 胺形成之鹽，諸如環胺，諸如單、二或三低碳烷基胺’諸 如羥基-低碳烷基胺，例如單、二或三羥基_低碳烷基胺、 羥基-低碳烷基-低碳烷基胺或聚羥基_低碳烷基胺鹽。環胺 例如為嗎啉、硫代嗎啉、哌啶或吡咯啶。合適單低碳烷基 胺例如為乙胺及第三丁胺；二低碳烷基胺例如為二乙胺及 131369.doc 14 200913996 二異丙胺·’且三低碳烷基胺例如為三甲胺及三乙胺。適當 經基-低魏基胺例如為單、二及三乙醇胺；經基_低礙烧 基-低碳烧基胺例如為咖二甲胺基乙醇及n，n•二乙胺基 乙醇·’合適聚羥基-低碳烷基胺例如為葡糖胺。在其他情 況下，亦可能形成酸加成鹽，例如用強無機酸，諸如礦 酸’例如硫酸、鱗酸或氫幽酉曼，用強有機叛酸，諸如低碳 烧叛酸，例如乙酸，諸如勸夺σ + 丁 μ < 诺如铯和或不飽和二羧酸，例如丙二

酸、順丁烯二酸或反丁稀：酸，或諸如經隸酸，例如酒 石酸或棒檬酸，或料酸，諸如低钱烴《或經取代或 未經取代之苯4酸，例如酸或對具有例 如缓基之酸性基及例如胺基之驗性基的式⑴化合物亦可以 内鹽之形式’,亦即兩性離子形式存在，或分子之一部分可 以内鹽形式存在，而另一部分以正鹽形式存在。 化合物（包括其鹽）亦可呈水合物或溶劑合物之形式或 其結晶可包括（例如）用於結晶之溶劑。 視起始物質及工作程序之選擇而定，式I化合物及其鹽 可以例如立體異構體或互變異構體之可能異構體之—或其 混合物的形式存在。在此上下文中，可得之純異構體例如 為純對映異構體、純非對映異構體或純互變異構體。相應 地可存在之異構體混合物例如為外消旋體或非對映異構 體扣s物以吊用方式，例如基於成份之物理化學差異， 以已知方式藉由分步結晶、蒸餾及/或層析法，可將呈游 離形式或鹽形式之式1化合物的異構體混合物分成數個組 份。有利的為分離更具活性之異構體。 131369.doc 200913996 因此，本發明之一態樣為治療哺乳動物中生物膜形成之 治療方法。該方法利用上述鐵螯合劑類，該鐵螯合劑類先 岫已製備且經證實適用於治療在人類或動物體内引起過量 鐵或由其引發之疾病’例如’如在US 6,596,750中所提 及。 較佳之式I化合物為式（I)4_[3,5-雙（2-羥苯基Hi，2,4]s 。坐-1 -基]笨甲酸之化合物I或醫藥學上可接受之鹽。例如在 國際專利申請案WO 2004/035026中揭示包含化合物I之藥 物製劑。可根據製造商說明書來投予化合物I。 本發明係關於式I化合物之用途，

R1與R·5同時或彼此獨立地為氫、鹵素、經基、低礙烧 基、鹵-低碳烷基、低碳烷氧基、鹵·低碳烷氧基、羧基、 胺曱醯基、N-低碳烧基胺曱醯基、ν,Ν-二低碳烧基胺曱醯 基或腈； R·2與R4同時或彼此獨立地為氫、未經取代或經取代之低 碳烷醯基或芳醯基，或在生理條件下可移除之基團； R3為氫、低碳烷基、羥基-低碳烷基、鹵-低碳烷基、羧 基-低碳烷基、低碳烷氧基羰基-低碳烷基、r6r7N-C(0)-低 131369.doc 200913996 碳院基、未經取代或經取代之芳基或芳基_低碳烷基或未 經取代或經取代之雜芳基或雜芳烷基；

Re與R?同時或彼此獨立地為氫、低碳烷基、羥基-低碳 烧基、烧氧基低碳烷基、羥基烷氧基-低碳烷基、胺基_低 碳炫基、N-低碳烷基胺基-低碳烷基、N，N_二低碳烷基胺 基低碳院基、N-(羥基-低碳烷基）胺基_低碳烷基、N，N_: (經基-低碳烧基）胺基-低碳烷基，或連同其鍵結之氮原子 一起形成氮雜脂環’較佳為化合物I或其醫藥學上可接受 之鹽； 且其中字首”低碳"表示具有不多於7個碳原子之基團； 例如4-[3,5-雙（2-羥苯基）_[ι，2,4]三唑-1-基]苯曱酸；或者 與選自由以下各物組成之群的抗生素組合：胺基糖苷，例 如建匕黴素、阿米卡星、妥布黴素；喧諾酮，例如環丙沙 星及左氧氟沙星；頭孢菌素，例如頭孢他啶、頭孢吡肟、 頭孢匹羅；脲基盤尼西林，諸如哌拉西林 '替卡西林；碳 青黴烯類，諸如美羅培南、亞胺培南；多黏菌素，諸如多 黏菌素B、黏菌素；及單環p_内醯胺類，諸如胺曲南；例 如呈固定組合之形式； 其用於以下方面： (1) 製備治療慢性綠膿桿菌感染之藥物、 (2) 製備治療生物膜形成之藥物、 (3) 製備治療綠膿桿菌之生物膜形成的藥物、 (4) 製備治療囊腫性纖維化患者之綠膿桿菌生物膜形成 的藥物、 131369.doc 200913996 (5) 製備預防綠贈# I_ 卞版梓囷生物膜形成之藥物、 (6) 製備預防囊腫性總 ^ ^ 腫性纖維化患者之綠膿桿菌生物膜形成 的藥物、 (7) 減少或消除綠膿桿菌生物膜、 W削弱(例如)綠膿桿菌之生物膜形成、 (9)破壞(例如)綠膿桿菌之已建立生物膜。 本發明係關於減，丨、β — 及/或移除例如導管之醫學裝置上生 物膜形H方法’其中將化合物！施用於該醫學裝置上。 — κ施例中，本發明係關於式I化合物與對綠膿桿 囷八有活I·生之抗生素的組合。本發明係關於該組合其中 #生素係、自由以下各物組成之群：胺基糖苷，例如建它 黴：阿米卡星、女布黴素；喹諾酮，例如環丙沙星及左 氧氣沙星；頭孢菌t，例如頭孢他咬、頭孢㈣、頭孢匹 羅，腺基盤尼西林，諸如派拉西林、替卡西林；碳青徽稀 類，諸如美羅培南、亞胺培南；多黏菌素，諸如多黏菌素 B、黏菌素；及單環卜内酿胺類，諸如胺曲南。抗生素較 佳為建它黴素或妥布黴素。 本發明係關於包含⑷如上所述之式Ϊ化合物，較佳4_ [3,5-雙（2’苯基Hl,2,4]三嗤小基]苯甲酸，或醫藥學上 可接又之鹽及（b)選自由胺基糖芽、喧諾_、頭孢菌素、腺 匕西林石反月黴烯類、多黏菌素及單環β _内醯胺類組 成之群的抗生素之組合。 在如上文所提及或定義之包含投予此兩個組份之治療溫 動物之方法、供同時、分開或連續使用之包含此兩個組 131369.doc -18- 200913996 份之醫藥組合物、該組合於延遲病程或 文⑴至⑺下所㈣之用途或料製造可達=或如上 製劑上之用诠，七 達成此專目的之 、或匕3此組份（a)與（b)組合之商σ 份（a)與（b)之任何》〇口中， 女日 在下文中均稱為"本發明之相，

亦即以使此術語係指此等實施例中每一之：S 此適當時可改用此術語。 "此專實施例因 同時投予可(例如)以具有兩種或兩種 固定組合之形式 "生成伤之- 配之…' ^由同時杈予兩種或兩種以上獨立調 一/士伤來進行。連續使用’例如投予，較佳意謂在 一個時點投予組合之一或多 " 點浐+ * 夕個、，且伤’而其他組份在不同時 比獨又奸Γ以長期交錯方式來進行，較佳使得組合顯示 獨立技予之單一化合物具有更大之效率，例如尤其顯示 協同作用。獨立使用，例 ^ 11L 卞敉佳思明在不同時點彼 匕獨立地投予組合之組份， 心杈予組份（a)及（b)使 J . δ物之可量測血液含量不以重疊方式(例如同時） 存在。 【實施方式】 實例1 : 材料及方法： 對綠膿桿菌生長之作用 ^或無例如在周圍血液中所達之濃度下的化合物〗，在 有氧（aerobic)及純（anaer〇bic)條件下，不添加鐵、添加 1〇 μΜ、30 _及50 _載之情況下生長。通常見於π唾液 中之鐵中值濃度為3G _。使用標準方法來測定對細菌生 131369.doc -19- 200913996 含丁二㈣ 法包括接種等分試樣，例如〜L在 璃管(:Γ之最小量培養基中約106個細菌於财酸鹽玻 中，接著在例如听、於有氧及益氧 條件下培育。各實驗係 有二及"，、氧 間隔(例如。、4、8、12、：；: 式進行且每隔一定 6、20及24小時;|移除各硼矽酸鹽 官’且將培養物在57G nm下之光學密度用作生長水平 :曰：。使用AnaerogenTM(〇x〇id)系統產生無氧培養條 :。對於無氧實驗，建立平行培養物以便培養物不短暫暴 路於氧’亦即七個平行培養物以允許在需要時間點取樣。 對綠膿桿菌運動性之作用

Native 20〇2’ 417(6888): 552_5所述，例 如Singh等人 如在額外鐵存在下監測賴桿g之運祕。增大且不協調 之運動性係與綠膿桿菌不能活體内聚集且起始生物膜形成 有關。在瓊脂中，例如不添加鐵或添加3〇 μΜ鐵且接著在 有或無化〇物I之情況下，使用既定方法來進行運動性測

試（例如遊動（swimming)、群集（swarming)及抽動 (twitching))。 對綠膿桿菌生物膜之作用 出於此目的，使用兩個與生物臈形成之早期階段相關之 短期生物膜模型：硼矽酸鹽玻璃管及蓋玻片方法。 在兩個模型中，均在有或無化合物I、在有氧或無氧條 件下及在有或無添加鐵（亦即〇、10、3〇及5〇 ^厘鐵）之情況 下研究生物膜生長。根據標準方法來觀察化合物I之抗生 物膜作用’該等標準方法亦即為光學密度、共焦成像軟 131369.doc -20· 200913996 體，例如coMSTAT程式，從而允許在3維透視圖中分析生 物膜結構。在蓋玻片實驗中成像系統及BacLighh^ /死染色 (Molecular Probes)之使用允許觀察對兩個細菌小菌落及生 物膜結構之作用。 對綠膿桿菌抗生素抗性之作用 在有氧及無氧條件下在不存在添加鐵或存在3〇 鐵 牯在有或無化合物1之情況下，例如且/或在具有變化濃 度之化合物（I)之情況下，測定胺基糖苷建它黴素及妥布黴 素之最小抑制濃度（MIC)。 對綠膿桿菌產生毒力因子之作用 缺鐵（iron starvation)可誘導產生若干毒力因子。如下所 述測定在存在或不存在化合物丨之情況下化合物〗誘導細菌 毒力因子產生之潛力。 利用同時投予之化合物〗及抗生素來研究對削弱自CF個 體之唾液分離之臨床綠膿桿菌菌株引起之生物膜形成之影 響、對破壞已建立生物膜之影響、長期流動池生物膜模型 之使用。 結果： 1·化合物I對生長及生物膜產生之作用 在短期硼矽酸鹽玻璃管生物膜模型中再評估化合物1對 浮游生物生長及生物膜產生之作用。在此模型中，生物膜 生長於玻璃表面上，且隨後將其染色及溶解。溶液之光學 密度（OD : 5 70 nm)相應於生物膜產生水平。 使用此模型，在補充丁二酸鹽（MMS)+l〇 μΜ FeCL之最 131369.doc •21 - 200913996 小量培養基中（有氧及無氧氣氛）培育（24 h，37t：)之後測定 細菌生長及生物膜水平。化合物JSMMS培養基（pH 7〇)中 之低溶解度意謂有必要在〇-1 00 μΜ之低螯合劑濃度下進行 初始實驗。在此等低濃度下，化合物】並不削弱有氧或無 氧生長或生物膜產生（圖丨）。 將化合物I;谷解於界面活性劑PEG 400中，且接著將其稀 釋於MMS培養基中以達成至多6695 化合物〗之濃度。在 獨立實驗中，證實單獨界面活性劑並不影響生長或生物膜 水平（數據未顯示）。較高濃度之化合物I在無氧條件下能夠 顯著削弱綠膿桿菌生長及生物膜水平（ρ<〇 〇5)，但在有氧 條件下不能。藉由直接降低培養基中之鐵含量來研究化合 物I是否削弱無氧生物膜產生，或其是否藉由鐵無關機制 而起作用。測試在1339 μΜ濃度下之化合物〗以查看當培養 基中鐵濃度增大時其是否繼續削弱無氧生物膜產生❶當鐵 含量增大時，化合物〗有效性降低，表明其主作用係經由 鐵螯合介導且此生物膜抑制可藉由高鐵含量（其大概使化 5物I之結合能力餘和）來克服。 2·化合物I增強綠膿桿菌對抗生素之敏感性。 針對綠膿桿菌測試兩種抗生素（通常用以治療CF個體之 抗生素，妥布黴素及黏菌素）之平均抑制濃度（MIC)。此在 MMS+10 μΜ FeCl3中，有或無化合物μΜ)之情況下 在有氧及無氧氣氛下進行（圖4)。化合物I之存在並不改變 MIC。 3·化合物I影饗毒力因子之產生 】3]369,doc -22- 200913996 迄今為止所考查之毒力因子為鱗脂酶c 寧A)。在料獨MMS培養基、b)補充iq_㈣之 画培取終^補充Μ _ 及化合物叩339 _ 中培育之後’考查此等因子在無氧條件下之 產生。在補充鐵存在下’與見於無鐵之相同培養基中之彼 等者相比，存在增大含量之兩個毒力因子。當添加化合物 1時此增大取消’表明化合物1可干擾綠膿桿菌引起之鐵相 關毒力因子產生（圖5)。 證明在CF肺中所遭遇之環境條件種類（亦即低氧張力及 可用鐵）下化合物I針對綠膿桿菌之治療潛力。 L在無氧條件下化合物1顯著削弱綠膿桿菌生長及生物 膜產生此似乎與降低綠膿桿菌可用之鐵含量的化合物工 直接有關。 2.當對浮游生物體測試時，化合物〗不改變抗生素妥布 黴素及黏菌素之]VIIC。 3 ·化合物I不刺激磷脂酶c或ΕΤΑ產生，而相反地，其減 少此等細菌毒力因子在鐵存在下之產生。 【圖式簡單說明】 圓1化合物I對綠膿桿菌生長及生物膜形成之作用 評估不同濃度之化合物I對有氧及無氧（Α)生長及（Β)生物 膜水平之作用。所用培養基為補充〇 μΜ或1〇 μΜ FeCl3之 MMS ’如所指示（37它，24 h)。所示值表示每實驗3隻管之 一代表性實驗之平均值±SD。 圖2高濃度化合物I對綠膿桿菌生長及生物膜形成之作用 131369.doc •23- 200913996 評估不同濃度之化合物I對有氧及無氧（A)生長及（B)生物 膜水平之作用。所用培養基為補充10 μΜ Feci3之 MMS(37°C，24 h)。所示值表示每實驗3隻管之兩個實驗之 平均值士SD。*表示與當無螯合劑存在時所見水平相比顯 著較差之水平（Ρ<〇·〇5)。 圖3化合物I對在不同鐵含量中無氧生物膜產生之作用 在無化合物1(黑色柱）及有化合物丨，1339 μΜ(灰色柱）之 情況下化合物1(1339 μΜ)對在不同鐵濃度中生物膜產生之 作用。所示值表示每實驗3隻管之一代表性實驗之平均值 土SD。*表示與在相同鐵含量下無化合物I之生物膜相比顯 著較差之水平（Ρ<0.05)。 圓4化合物I對抵抗綠膿桿菌菌株pAOiiM)黏菌素及（Β) 妥布黴素之MIC的作用 在補充化合物1(1339 μΜ)(實線）及無化合物1(虛線）之 MMS + 10 μΜ FeCh中測定MIC。所示值表示以一式兩份之 方式測試各條件之代表性實驗之平均值±SD。 囷5化合物I對磷脂酶及外毒素a產生之作用 在無氧條件下（24 h)以如所示之鐵及化合物Ι(ΐ339 μΜ：) 補充物（鐵+ICL)培育培養物。所示值表示磷脂酶脂肪酶產 生水平（實驗1)及外毒素Α產生之平均水平土SD(實驗1，以 一式兩份之方式測試各條件）。 131369.doc -24-

Claims (1)

1. 200913996 十、申請專利範圍： 1. 一種式I化合物之用途，

   (I) 其中 Ri與R·5同時或彼此獨立地為氫、鹵素、羥基、低碳烷 基、ii低碳烷基、低碳烷氧基、鹵-低碳烷氧基、羧基、 胺曱醯基、N-低碳烷基胺甲醯基、n，n-二低碳烷基胺甲 醯基或猜； R2與R4同時或彼此獨立地為氫、未經取代或經取代之 低碳烧醯基或芳醯基’或在生理條件下可移除之基團； Rs為氫、低碳烷基、羥基-低碳烷基、鹵_低碳烷基、 羧基-低碳烷基、低碳烷氧基羰基-低碳烷基、HN— C(O)-低碳烧基、未經取代或經取代之芳基或芳基_低碳 烧基或未經取代或經取代之雜芳基或雜芳烷基； Re與R7同時或彼此獨立地為氫、低碳烷基、羥基_低碳 烷基、烷氧基低碳烷基、羥基烷氧基_低碳烷基、胺基_ 低碳烷基、N-低碳烷基胺基_低碳烷基、N，N_二低碳烷基 胺基低碳烧基、N-(羥基-低碳烷基）胺基-低碳烷基、 N，N-二（羥基-低碳烷基）胺基_低碳烧基，或連同其鍵結 之氮原子一起形成氮雜脂環； 且其中字首"低碳"表示具有不多於7個碳原子之基團； 131369.doc 200913996 其用於製備治療生物膜形成之藥物。 2·如請求項1之用途，其中該式I化合物為4_[3,5_雙（2_羥苯 基）-Π，2,4]三唑-1-基]苯甲酸或醫藥學上可接受之鹽。 士。月求項1或2之用途，其中該生物膜為綠膿桿菌（ρ. aerugin〇sa)之生物膜。 4. 如請求項3之用途’其中該綠膿桿菌生物膜係在囊腫性 纖維化患者中。 5. 一種組合，其包含（a)4-[3,5-雙（2-羥苯基Hu〆]三唑 基]苯甲酸或醫藥學上可接受之鹽及（b)選自由胺基糖 苷、喹諾 _ (quin〇l〇ne)、頭孢菌素（cephal〇sp〇rin)、脲基 盤匕西林（ureid〇peniciiiine)、碳青徽稀類（carbapenem)、 多黏菌素（polymyxin)及單環0_内醯胺類（m〇n〇bactam)組 成之群的抗生素。 6·如請求項5之組合，其中（a)為4-[3,5-雙（2-羥苯基）-[1，2,4] 二°坐-1-基]苯甲酸或醫藥學上可接受之鹽且（b)係選自由 以下各物組成之群：建它黴素（gentamicin)、阿米卡星 (amikacin)、妥布黴素（tobramycin)、環丙沙星（ciprofloxacin)、 左氧氟紗生（levofloxacin) '頭孢他。定（ceftazidime)、頭 抱比躬：（cefepime)、頭孢匹羅（cefpirome)、α底拉西林 (piperacillin)、替卡西林（ticarciiiin)、美羅培南（mer〇penem)、 亞fe培南（imipenem)、多黏菌素B(polymyxin B)、黏菌素 (colistin)及胺曲南（aztre onam) ° 7. 一種如請求項5或6之組合之用途，其用於如請求項1、 2、3或4之用途。 131369.doc