TW201106965A

TW201106965A - Controlled release multidrug formulations for spinal cord injury

Info

Publication number: TW201106965A
Application number: TW099100292A
Authority: TW
Inventors: Chung-Shi Yang; yu-chao Wang; Yi-Ting Wu
Original assignee: Nat Health Research Institutes
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2010-01-07
Publication date: 2011-03-01
Also published as: US8333962B2; TWI415620B; US20110052711A1

Description

201106965 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】而更特別地係關本發明廣義而言係有關於藥物傳遞系統，於一種控制釋放多藥傳遞系統。【先前技術】美國大約有20萬名脊趨損傷（SCI)患者。脊謝員傷通吊疋由於患者料機械外力導致脊簡經軸突或神經纖維中斷。如果該脊趙受到擠壓、斷裂或挫傷，其神經轴突在物理上或生理上可能已經產生斷裂，因而使受到影響的轴突沿線益法再傳導神經電脈衝。事實上，可能有大量神經她及其相關細胞體因損傷而死亡’導致A職末__許多錄傳導喪失功能，造成㈣患者產生㈣程度辭打遂或四肢靡疾。脊髓損傷的典型治射法細神經營翻子與生長因子刺激損傷部位倖存的神經熱突分又。由於錄損傷量神經細胞社，該結果在次級神_傷的中軸關鍵角色。因此採取神經保護措施以抑制細胞死亡及轴突機能不全，可避免脊傷後導致其他侧功能的喪失。*在有關措施當中，神經營養素和抗發炎因子的應用，特別具有提升神經保護功能之成效。致使中樞神經系統（CNS)神經元細胞無法重生的一個原因在於某些生物活性分子抑制神經突觸的再生，因為來自髓鞘 201106965 的若干蛋白質抑制了突觸的增生。N〇g〇A即為第一個在寡突細胞和某些神經軸突表面被發現的蛋白質。其他抑制性蛋^ 還包括_相_蛋白（MAG)'寡突膠細__蛋: (OMgp)及多功能蛋白聚醣。

中框神經受損後所形成的神經膠質症係抑制轴突再生的另-個主因。結苑的過程涉及若干細胞並且由硫酸軟骨素蛋白夕醣（CSPG)的合成與分泌所調控。脊髓損傷後一周内，⑽〇會快速堆積於鶴雜。—般認為cspG批量的葡萄胺聚釀 jGAG)側鏈’阻斷了生長促麵子的作用，成為抑制轴突繼續延伸的主要相。經有關生物體外及體賴驗結果顯示，如果先以軟骨素酶ABC裂解作用移除葡萄胺聚釀，軸突即可於麵請錢白錄（cspG)騎基中生長。由於在脊髓損傷後的不同階段中，多種抑制性分子對神經服抑制作用’顯示出脊髓損傷為人們帶來-系列有待克趙ηΓ、物重生之難題。有效的治療通常需要即時適應脊貝傷後病變部位微環境的動態變化。項技#仍需提$解決前述缺點及*適當性之方物之於損傷部位施予—種可糊連續釋放治療藥【發明内容】相關申請案之引用本申睛案主_正式申細謂，434,申請日細動 201106965 ，其内容係完整地則丨財式納人本文作為參考。於-方面，本發明係關於一控制釋放多藥製劑配方，包括 a) -第-項組成物包含一第一項生物活性劑，其包覆於一第員聚口物粒子中，b)-第二項組成物包含—第二項生物活 f生劑的’其包覆於一第二項聚合物粒子中，該第二項聚合物粒子包覆於第-項聚合物粒子中；〇亦可加上一第三項組成物包含一第三項生物活性劑，其包覆於第一或第二項聚合物粒子中，該第二項組成物之釋放順序須在第一項組成物之後。於再方面’本發明係有關於哺乳動物脊趙損傷（奶）後肢體功能恢復的改善方法，包括對哺乳動物脊椎内施以一有效劑量之控制釋放多藥製劑配方的給藥步驟，其包括：a) 一第-項組成物包含-第—項生物活性劑，其包覆於—第一項聚合物粒子中；b) 一第二項組成物包含-第二項生物活性劑，其包覆於-第二項聚合物粒子中，該第二項聚合物粒子包覆於第一項聚合物粒子中；e)亦可加上—第三項組成物包含一第 -項生物活性劑’其包覆於第—或第二項聚合物粒子中，該第二項組成物之釋放順序須在第—項組成物之後，第—項生物活性劑為-神經#翻子，第二項生物活性綱為—膠原蛋白合成抑制劑，第三項生物活性劑係選自由環腺酶單磷酸、一腺苷酉文％化酶活化劑和一拙〇抑制劑所組成的組群，以改善哺乳動物肢體功能之恢復。於本發明之一項具體態樣，第一項生物活性劑為一神經營 201106965 養因子’第二項生物活性綱為一膠原蛋白合成抑制劑，第三員生物雜舰選自由環腺酶單鱗酸（eA·)、—腺I酸環化酶活化劑和-編抑制劑所組成的組群。於本發明之-項具體態樣，該神經營養因子係選自由神經膠細胞何生神㈣養因子（GDNF)、大腦触神經營養因子 (DNF )釦性纖維母細胞生長因子、神經生長因子（Ngf )、神經營養素3 (NT3)、神經營養素4 (NT4)、祕營養素5 jNT5)所喊敝群。該腺賊環⑽活鋪為垂體腺皆酸環化酶激化纽（PACAp)。_縣自合成抑·可以是軟骨素酶 ABC (ChABC)。於本發明之另-項具體態樣，PACAp係包覆於第一項聚合物粒子中。於本發明之另一項具體態樣，該拙〇激酶抑制劑係選自由C3-二磷酸腺苦_核糖基轉移酶和ba_2i〇 (ce制哟重組蛋白所組成的組群。於本毛明之另-項具體祕，第一項聚合物粒子包覆一個以上的第二項聚合物粒子，該第二項聚合物粒子包覆含第二項生物活性劑之第二項組成物。、於本發明之另-項具體態樣，第一項生物活性劑為神經膠細胞衍生神經營養因子（G卿），第二魅物雜劑為軟骨素酶ABC (C_)，第三項生物活性劑則為垂體腺苦酸環化酶激活多肽（PACAP)。 201106965 聚合物聚合物。於本發明之另—項具體態樣，該第一項聚合物粒子包含一親水性聚合物料二項聚合物粒子包括—疏雜或一親水性於本發明之再另一項具體態樣，該第一項聚合物粒子係由聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA)，錢丁聚醣和硫㈣聚成。、然而於本發明之另一項具體態樣，該第二項聚合物粒子係由聚执乙醇絲物（PLGA)，錢丁雜和硫㈣聚醣所組成。本發明之此等其他方面由下列較佳具體紐，結合下列圖示之說明而侧出’然而在不偏離該揭軸容之新穎概念的精神及範圍下，可於其中進行變更與修改。所提供之圖式列舉說明本發明之—或多項具體態樣，其與下述詳細說明-起’係肋解釋本發明之創作原理。若可能，於圖式中使用相同參考編號，來5丨述實施例中之相同或類似元件0 【實施方式】在本舍明所使用的特殊術語有其原本的意義，如下所用的某些特殊術語是提供熟悉該技藝者能更進一步了解本發明内 201106965 谷為了方便起見些特殊術語將會使用斜體字或引號標示出來’但這些被標示出來的部分並不會影響到特殊術語本身的辄圍或意義’就如同在本文中未被標示的文字一樣，也就是說同樣的事情會有-_上的驗。本發批其他特色及優點將於下列實施範例巾被進-蝴咖㈣，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。除非另有規定，本發明所涉及的科學和技術所用詞彙和一般普通技能所使用的詞彙相同，綠有所衝突的情況下，本發明將會給予名詞新的定義。本發明所使用的“約略，，、“大約，，或“大概，，廣義而言應意指，所給予數值或範圍之上下百分之二十，較佳是百分之十，且更佳地7C百分之五的範圍内，在此所給予之數值數量為大約的意思，表示術語“約略”、“大約，，或“大概”，並沒有明文強制規定。本發明所使脚‘親水性，，，鋪水具有強大的親和力。本發明所使用的“疏水性”，則是指排斥、傾向於不結合、或無法溶解於水中。 ⑯本發明所使用的縮寫如下：SCI為脊髓損傷，CS是幾丁承聽（曱妨）’ Ds為硫㈣糖，GDN7為神娜細胞衍生 _營養奸，⑽C為財素酶ABC，PLGA為聚乳酸乙醇*物’ PVA絲乙觸，GFAp是膠賊雜性蛋白， PE-Rh則為磷脂醯乙醇胺_ (麗斯胺羅丹明⑴。 201106965 實施例無意於限制本發明之範圍，以下將呈現根據本發明各種實施例之例舉_、駭、梅細_。應注意，實施例中為了方便讀者_所她觸朗標題，並不以任何方式限制本發明_。此外，在本文巾所提姊披露的某些理論’無論對錯與否’只要作是根據本發明所實施，不: 慮任何特定的理論或行動計t，其都顧_在本發明之内。實施例1 包覆生物活性劑的親水性奈来粒子之製備選用幾丁《⑽和硫_魏⑽製備―親水性奈米粒子核’該奈米粒子錄―般常見的cs粒子核提供一更牢_實體結構。製備幾丁聚_ (體積百分濃度g.i%)和硫酸葡聚糖（體積百分濃度〇.1%)溶液時，分別將cs溶解於乙酉夂、DS浴於二次备館水。實驗進行當中將乙酸濃度保持為⑵ 的1.75倍’使CS溶於乙酸中。要將軟骨素酶就（ch^) 沒類治療難包覆於-親雜奈綠子巾，縣將5個活性單位的ChABC溶解於CS ( ! ml)或DS (4而）溶液中。把cs (Inil)添加至DS (4ml)溶液中並持續攪拌i5分鐘，包覆 ChABC的奈米粒子即自然成形。然後以3〇〇〇_對溶液混合物進行離'时離5分鐘財雜大簡粒或雜，再以權〇〇 _離心分離30分鐘，取得包覆治療藥物的CSDS奈米粒子。 201106965 再以蒸館及去離子水清洗該包覆治療藥物的csds奈米粒子2 次。以90 P1US雷射粒徑儀分析CSDS的平均粒徑及其粒徑分佈其平均奈米粒子直徑為26〇±1〇〇咖，顯示該粒徑分佈係出自"亥製備過程。有關分析研究曾指出，大多數CSDS奈米粒子直徑皆介於215-350 nm。其他親水性聚合核包括，但不侷限於，幾丁聚醣粒子、明膠粒子、澱粉粒子、瓊脂粒子和水凝勝。實施例2 包覆生物活性劑的疏水性奈米粒子之製備選用一疏水性聚合物_聚乳酸乙醇酸共聚物（pLGA),製備一疏水性粒子。要包覆一個或一個以上的神經膠細胞衍生神經營養因子（GDNF )和垂體腺苷酸環化酶激活多肽（PACAp ) 等治療藥物，須將50 μΐ的GDNF，或GDNF及PACAP水溶液（2 pg/m卜溶於水）緩慢滴入5〇〇 μι的pLGA (4 mg/n^，溶於不帶電的二氣甲烷有機溶劑）溶液内。將該混合溶液在冰浴下超音波震盪1〇秒鐘，以形成第一項乳狀液（油包水，即水/乳化於PLGA的治療藥物分子/有機溶劑）。隨即將第一項（即油包水型態）乳狀液滴入渦旋震盪中之3 ml的嚴糖溶液（水中體積百分濃度10%)或聚乙烯醇（pvA)溶液（水中體積百分濃度0.5%)中。將該混合溶液在冰浴下超音波震盪 2〇秒鐘，以形成第二項乳狀液（水包油包水，即以二次乳化 201106965 法形成.水/乳化於PLGA的治療藥物分子/乳化於PVA或蔗糖溶液的有機溶劑）。以真空減壓旋轉濃縮機去除有機溶劑’形成PLGA奈米粒子懸浮液，該奈米粒子各包覆一個或一個以上的治療藥物（如·· GDNF或GDNF加上PACAP)，並以離心法純化。圖1A之流程圖表示包覆鼠神經膠細胞衍生神經營養因子 (GDNF) 104的PLGA粒子1〇6。包覆於ριχΜ奈米粒子中的GDNF (PLGA_GDNF)(娜細㈣）係以二次乳化法合成。將25微升（25吣）的GDNF 1〇4檸樣酸緩衝液（2吨制， pH= 8)緩慢地滴入 250 吣的 pLGA 1〇2 (pLA pGAu〇，分子質量為40，_·75，_，Sigma)甲基氯（2 mg/mL)溶液然後在冰上以微電腦超音波破碎機進行超音波震盤Μ 秒，即完成第-項乳狀液之製備。將該乳狀液移入Μ址的 10%嚴糖溶液’紐再以微電腦超音波破碎機（micr〇s⑽ XL2〇〇〇，MISOND〇進行超音波震a2G秒，形成第二項乳狀液。然後馬上以真空減魏髓賴（EYELA)去除有機溶劑。最後以高速離心分離！>LGA_G卿粒子1〇6，並將其存放於零下80°C的條件下備用。其他適合的疏水性聚合材料可以使用，但不侷限於，脂肪族聚醋類’如由一種或多種α_經基羧酸類(如乙醇酸、乳酸、 2德丁酸、valinieadd和域酸）所合成之單f聚合物或丘聚物’減二羧酸類（如蘋果酸），三舰類（如摔^ 201106965 或其混合物；聚-α-氰基丙烯酸酯類，如聚（曱基_α_氰基丙稀酸酯），聚（乙基-α-氰基丙烯酸酯），聚（丁基_α_氰基丙烯醆酯）；以及胺基酸聚合物，如聚谷氨酸酯或其混合物。上述生物可降解性聚合物的聚合反應方式可以團聯或接枝技術進行聚合反應。實施例3 包覆親水性粒子之疏水性粒子之製備製備一藥物傳遞系統，該系統含有包埋於疏水性粒子内的親水性奈米粒子。在親水性奈米粒子溶液加入另一疏水性聚合物溶液之前’先讓包覆一個或一個以上治療藥物之親水性奈米粒子溶液與至少另一項治療藥物進行混合。例如，取包覆著

ChABC的CSDS奈米粒子溶液50 pL，先與GDNF或 GDNF/PACAP進行混合，再將其加入内含pLGA (1〇mg/mi) 的一氯甲院500 p,L。將該混合溶液在冰浴下超音波震盡秒鐘’以形成第一項乳狀液（即油包水乳狀液；包覆於CSDS奈米粒子中的ChABC，GDNF或GDNF/PACAP液體懸浮於 PLGA液體中）。隨即將第一項乳狀液滴入3 ml渦旋震盈中的嚴糖溶液（體積百分濃度跳）或〇.5%聚乙稀醇（pVA)溶液中。將該混合溶液在雜下超音波錢2G秒鐘，形成第二項礼狀液（即水包油包水乳狀液；包覆於CSDS奈米粒子中的 ChABC，GDNF或GDNF/PACAp液體懸浮於pL(}A液體中，而PLGA X懸浮於蔗糖或pVA液體中）。以真空減壓旋轉濃縮 201106965 機去除有機溶劑，離心分離後，每一奈米粒子均含包覆於 PLGA核殼中的GDNp或GDNF/pACAp，且圍繞著包覆於 CSDS奈米粒子中的ChABC。以90 plus雷射粒徑儀分析這些粒子的平均直徑及粒徑分佈其粒彳空約分佈於455至625 nm間，該平均直徑約為53〇±1〇〇 nm。根據本發明之實際需求，應用於藥物傳遞系統中的粒徑可在彳政米尺寸範圍内，如介於1至2微米。圖2A為包覆親水性粒子之疏水性微米粒子22〇的製備過鲁矛王。將幾丁聚酶（CS) 210和硫酸葡聚醣（DS) 212加入一帶正電的藥物（如蛋白藥劑）214中，取得一包覆於CSDS奈米粒子中之藥物216。在包覆於CSDS奈米粒子中之藥物216與 PLGA 102結合之前’先將其與另一生物活性劑218進行混。使CSDS被包覆於PLGA微米粒子中220 ’該微米粒子内含包覆於CSDS中的藥物216與另一項生物活性劑218。圖2B_2D係以帶加速電壓8〇 Κν，日本Hitachi生產的 · η-·穿透式電子顯微鏡（TEM)取得的CSDS奈米粒子（圖 2B)成像，包覆CSDS奈米粒子的pLGA粒子成像（圖％)，及未包覆CSDS奈米粒子的PLGA粒子（圖2D)。在穿透式電子顯微鏡觀測下，被包覆於PLGA粒子内部的CSDS奈米粒子成像，如® 2C (箭號標*處）所顯現之一位於内部的白色影像。圖2D中未包覆CSDS奈米粒子的pLGA粒子成像則顯= 為深色。 14 201106965 實施例4 包覆疏水性粒子之疏水性粒子之製備製備一藥物傳遞系統，該系統含有包埋於疏水性粒子内的疏水性奈米粒子，在與另一疏水性聚合物溶液之前，先讓包覆一個或一個以上治療藥物之疏水性聚合奈米粒子溶液與至少另一項治療藥物進行混合。例如，取包覆ChABC的PLGA奈米粒子溶液50队，在將其加入内含PLGA (1〇 mg/ml)的二氣曱烷500队之前，先與GDNF或GDNF/PACAP進行混合。將該混合溶液在冰浴下超音波震盪1〇秒鐘，以形成第一項乳狀液（即油包水乳狀液；包覆於PLGA奈米粒子中的.ChABC：， GDNF或GDNF/PACAP液體懸浮於PLGA液體中）。隨即將第-項乳狀液滴人3 ml渦旋震射的蔗糖溶液（體積百分濃度10%) 4 0.5%聚乙烯醇（PVA)溶液中。將該混合溶液在冰浴下超音波㈣2G秒鐘，形成第二概狀液（即水包油包水乳狀液；包覆於PLGA奈餘子巾的ChABC，gdnf或 GDNF/PACAP㈣懸浮於pLGA液體中，而pLGA又懸浮於蔬糖或PVA㈣巾）。以真线酸賊賴去除有機溶劑，離心分離後’每—粒子均含包覆於PLGA核殼中的GDNF或 GDNF/PACAP’且圍繞著包覆於PLGA奈米粒子中的c咖c。圖3A為包覆疏水性粒子之疏水性微米粒子似的製備過程，位於内部的疏水性奈米粒子324 &覆有一第一項生物活性劑322，外部的微米粒子328則又包覆有一第二項生物活性劑 201106965 為使内部的疏水性奈米粒子似包覆第-項生物活性劑雜PLGA102加入第一項生物活性劑322中。該pLGA 102形成-疏水性粒子324並包覆著第一項生物活性劑如。為使外相疏水性微求粒子328包覆内部的疏水性奈米粒子 324及一第二項生物活性劑概，須將pLGA撤加入内部的水丨生奈米粒子混合物中324中，該奈米粒子包覆第一項生物活! 生劑322及第二項生物活性劑從。該pLGA 1〇2形成一微米粒子328並包覆著第—項生物活性劑Μ2及第二項生物活性鲁劑326，其中第-項生物活性劑322係包覆於疏水性奈米粒子 324中，第二項生物活性齊 1326係包覆於外部的疏水性微米粒子328中。分析該粒子的平均直徑及粒徑分佈。其粒徑約分佈於〇5 至10 μηι間，s亥平均直控約為5 μηι。根據本發明之實際需求，應用於藥物傳遞系統中的粒徑可在微米尺寸範圍内，如約i至 2 μιη ° 癱實施例5 多相藥物包覆將200微升PLGA (100mg/m卜溶於有機溶劑二氣甲院）和PE-Rh (磷脂醯乙醇胺-(麗斯胺羅丹明B)) (5 pg/rd，溶於有機溶劑二氯甲烷）溶液滴入2 ml渦旋震盪中的聚乙烯醇 PVA溶液（水中體積百分濃度0.5%)。該混合溶液在冰浴下超音波震盪30秒鐘’形成一乳狀液（油包水’乳化於PVA溶液 16 201106965 中的PLGA與PE-Rh/有機溶劑）。以真空減壓旋轉濃縮機去除有機溶劑，形成包覆PE—Rh的pLGA奈米粒子懸浮液，並以離心法純化。取包覆PE-Rh的PLGA奈米粒子溶液50微升，加入内含 PLGA ( lOmg/ml)的二氯曱烷和香豆素 6 (5 μ§/ιη1) 5〇〇 #。將該混合溶液在冰浴下超音波震盪3〇秒鐘，以形成第一項乳狀液（即油包水乳狀液；包覆犯处的PLGA奈米粒子液體懸浮於於PLGA/香豆素6液體）。隨即將第一項乳狀液滴入3 ml (體積百分濃度〇.5%)渦旋震盪中的聚乙烯醇（pvA)溶液中。將該混合溶液在冰浴下超音波震盪3〇秒鐘，形成第二項乳狀液（即水包油包水乳狀液；包覆的pLGA奈米粒子液體懸浮於於PLGA/香豆素ό液體，PLGA/香豆素ό 液體又懸浮於PVA液體中）。以真空減壓旋轉濃縮機去除有機溶劑，離心分離後，每一粒子均含包覆於PLGA核殼中的香豆素6 ’且圍繞著包覆於PLGA奈米粒子中的PE-Rh。 PR~Rh紅螢光成像係經532 nm波長的雷射光激發後由共輛焦顯微鏡（SPE，Leica)觀測放射波長580 nm處，而香豆素6綠螢光則係經488 nm波長的雷射光激發後觀測放射波長 580 nm處取得之成像。圖3B-3D顯示包覆香豆素6和PE-Rh兩項螢光物的PLGA 微米粒子，其中只有PE-Rh被包覆於PLGA奈米粒子中。香五素6顯現為綠螢光，PE_Rh則為紅螢光。圖3C及3D為圖 201106965 3B方框範圍的放大圖示。圖3C影像係以激發綠螢光的激光與

放射濾片成像，圖3D圖示則以激發紅營光的濾片成像，圖3B 圖示為圖3C與3D之全景。如圖3B所示，兩種螢光染劑完全分離，紅螢光影像於分離的粒子上，綠螢光則分佈在紅螢光外但被密封於微米粒子中。以綠螢光激發方框中的圖像，除了 4 個分離的小區塊之外，在微米粒子中觀測到綠螢光分子的分佈 (圖3C)。當以紅螢光激發後，即觀測到微米粒子中4個分離的粒子（圖3D)。實施例6 體外釋放實驗與穩定度測試

PLGA-GDNF 進行PLGA粒子中的GDNF體外釋放實驗時，將其置於 37 C條件下，以神經細胞無血清培養液（Life Techn〇i〇gies) 培養。在96孔微量盤中加入100路的pLGA_GDNF奈米粒子，《亥奈米粒子懸浮於2〇 mL的培養液中，並在每個盤孔置入溶液。在預定的時間點上’從盤孔收集8〇 μΙ^的溶液，然後以 ELISA酵素免疫分析儀分析GDNF濃度。

PLGA-BSA 在4°C條件下，以15000 rpm對一定量且包覆BSA的奈米粒子懸浮液進行離，时離3G分鐘。去除上清液後，將取得之包覆BSA的奈米粒子重新懸浮並培養於5111丨的1〇mM磷酸緩衝j谷液（pH 7.4)、1〇〇 mM填酸緩衝溶液或水中，每一實 201106965 驗組均在抓餅下攪拌。在每錢彳博財糾，取含有 1吨/ml BSA濃度的奈米粒子。於特定的時間點當中，以15〇〇〇 rpm對樣品進行離崎離，去除5⑹_絲，再回補同樣體積的乾淨培養液。林同時細較的隐總量則用蛋白質定量分躲默。崎於轉财的购bsa製做其校正曲線。所有的實驗均測量三個樣本。無包覆物的CSM奈米粒子則培養於37 C條件下，絲相同的方式測量崎為實驗控制組樣本。以SDS-政膠電泳分析法測量釋放後的bsa完整性，進行包覆BSA的奈絲子穩定度職。在採行观__電泳分析前先將釋放樣本珠乾以濃縮蛋白質。將康乾的釋放樣本溶解於 5〇 μί含〇.1%漠紛藍試劑和2〇%甘油的恤甘胺酸舰·凝膠電泳緩衝液t。將轉錢分子量鮮值（6 6_2G()kDa)的樣本溶液負.TdS_甘胺_度郷（8%_16%)。從無包覆物 CSDS奈綠子取得職培養液並關_方式測量以做為控制組。凝膠電泳分析時採直立式電泳槽Mini_Pr〇tdn n㈤ (Bio-Rad Laboratories)及電源供應器 P〇wer pAC 3〇〇，以恆定電壓（150 V)作用90分鐘’分轉體缓衝液含25應丁也、 192 mM甘胺酸和01% SDS，其pH值為8 3。以含有ι〇%乙酸和25%異丙醇的〇.1%卡馬西藍R_25〇溶液對樣本條帶染色3〇为釦，再以含50%乙酸的異丙醇溶液脫色一個晚上。凝膠上分 (Kodak Digital Science 1 201106965 D，Rochester，NY)。實施例7 脊锻損傷的治療方法脊趙挫傷與注射包覆治療藥物的疏水性粒子。根據前述之程序在老鼠身上以實驗方式誘發脊髓軸突損傷（Yang过吐， (2008) Sustained intraspinal delivery 〇f neurotrophic factor encapsulated in biodegradable nanoparticles following contusive spinal cord injury” Biomaterials 29, 4546-4553，其内容係完整地以引用方式納入本文作為參考）。實驗過程簡述如下，對成年雌性SD鼠施行麻醉，並以T9/T1〇等級的椎板切除術使其脊髓暴露於外。再使重達l〇_g的棒子分別於25 mm (中度SCI)和 50 mm (重度SCI)處掉落在以椎板切除術處理過的^髓上，° 實驗中使用的裝㈣由_大學觸發。外科手魏行期間，以恆溫器控釋的加熱板使母鼠直腸溫度維持在37〇c。脊髓損傷造成後馬上進行奈米粒子注射。以容量為$此的Exmire毛細管式微量注射器結合31_卿辟針頭，並定位从在 L1的中線，織以腦立_定方式在錄硬膜下轉達〇 7 〇 $ 匪處。PLGA-GDNF (2 _似注射；4㈣母氣；㈣）或疆奈餘子大約被注人損傷部位中心觀的前物和後端404(如圖4Α)。每次_統將針祕置於麵内以避免注射液體外漏至損傷部位外。然後成對放置實軸^ 201106965 每天至少手工排空其膀胱兩次。此外，在動物進行脊髓損傷手術後母天細》以抗生素（氨比西林，每天），择續一周。動物照4¾序係依照成功大學動物實驗管理小組的實驗動物護理和使用指南，符合實驗動物福物法相關規定。評估下肢運動功能。注射PLGA或PLGA_GDNF的動物之運動功能，每周均以雙盲法評估其BBB下肢運動量表。進行運動功能觀測時，將老鼠置於附有壓鑄塑膠板的開放空間中4 分鐘。動物下肢運動恢復計數由〇分（下肢無法運動）到21 分（正常）。組織製備與免疫螢光檢測法。在實驗動物心臟内灌注〇 9% 冷氣化鈉（平均每隻母鼠4〇〇ml)，再灌注含〇.4〇/0多聚曱醛的 0.1 Μ磷酸緩衝液（每隻母鼠5〇〇ml)。移除後的脊髓，以後固定方式置於4%多聚甲醛中一夜，然後以超低溫保護於蔗糖重量百分濃度達30%的PBS中一天。將包括中心部位大約2 cm 的脊髓包埋於組織包埋液Tissue Tek OCT (Miles).中，縱向切除20 μπι的切片。該組織以磷酸緩衝液漂洗3次後，再以 Nuclear Red 或 DAPI 染色。以PBS漂洗組織切片3次後，再將其與含5%正常山羊血清的PBS與0.1% TritonX-100培養30分鐘，增加組織的滲透性及降低非特異性結合。初級兔抗體，抗神經纖維蛋白 (anti-neurofilament，為一神經元標記物）-200 kDa (NF;

Sigma) ’ anti-Iba 1 (抗-微小神經膠細胞’為一微小神經膠細胞 201106965 標記物）（Wako)，和anti-GFAP (抗-膠質纖維酸性蛋白，為一神經膠細胞標記物）（Chemicon)，以1:200倍數稀釋，與切片培養於4GC條件下一夜。再以PBS漂洗後，於室溫下以生物素標定的次級抗體培養切片1小時，漂洗後在室溫下與螢光-抗生物素蛋白培養45分鐘。將經免疫標記的切片以後染色方式加上DAPI染劑’以顯現其細胞核。實驗採裝備冷卻式電荷耦合元件系統的Nikon E-800顯微鏡成像。結果 · PLGA奈米粒子中GDNF的體外釋放圖顯示，該釋放作用可持續超過7天（圖1B)。在重度脊髓損傷發生後於受傷的脊髓注射PLGA以及PLGA-GDNF的運動功能恢復效果則如圖 4B所示。每2-3天均以BBB下肢運動量表評估其下肢運動功能’直到第31天。施以PLGA的母鼠運動功能只有些微進展。第一週時其分數只有1.3±〇.2，第二週時則為2.7土〇.3，最後第 31天時才只有進步到3.9分。然而施行PLGA-GDNF的母鼠分籲數表現則有顯著提升。其第一週分數即改善至3,7士0.9，第二週為8.4±1.1，第31天時則為9.5±0.8。該結果明顯優於只施以 GDNF藥物之表現，且與重量步伐足跡結果相吻合。在免疫螢光檢查法中發現’接受PLGA-GDNF治療的SCI 鼠脊髓損傷部位，有被神經纖維蛋白染色且呈現細長完好的神經纖維束（圖4D箭號標示處）’但在接受PLGA藥物治療的實驗動物身上，只有少數完好的神經纖維片斷（圖箭頭標示 22 201106965 處）。該結果顯示PLGA-GDNF可於脊髓神經元上誘發較好的神經保護作用’對於受到重度SCI的實驗鼠下肢功能恢復而言為一重要因素。然而在形態觀察檢試結果方面，無論施以PLGA 或PLGA-GDNF藥物，SCI鼠的脊髓損傷部位被染色的Iba 1 微小神經膠細胞都呈現了多種型態（圖5A及5B，箭號標示阿米巴樣Iba 1微小神經膠細胞，箭頭則標示呈分歧狀的此广微小神經膠細胞）。此外，在神經末梢區域亦觀測到由GFAp 免疫反應所誘發的星狀細胞堆積（圖5F與5G)。相較於假冒 (亦即無損傷）的脊髓（圖5E)，不管施以PLGA或 PLGA-GDNF藥物，在損傷的脊髓上都出現明顯過度生長的星狀細胞（圖5C與5D，箭號標示處）。據本研究結果指出，在受損脊椎内投以PLGA-GDNA藥物，並無顯著活化神經膠細胞之效果。本研究結果表明，包覆於；PLGA奈米粒中的GDNF對於重度SCI的貝驗性治療具有顯者的成效。此外，經plga負載的 GDNF可以連續性釋放。在SCI受損部位附近注射 PLGA-GDNF可輯存的雜元產生傾糊，並且有助於肢體運動功能的恢復。本發明係有關於一控制釋放多藥，其可改善脊髓損傷 (SCI)後肢體功能的恢復，該製劑配方包括：a) 一第一項組成物包含一第一項生物活性劑，其包覆於—第一項聚合物粒子中；b) -第二項組成物包含—第二項生物活性劑，其包覆於 23 201106965 -第-項聚合物粒子中’該第二項聚合物粒子包覆於第一項聚合物粒子中，C)亦可加上一第三項組成物包含一第三項生物活性劑’其包覆於第一或第二項聚合物粒子中，該第二項組成物之釋放順序須在第一項組成物之後，第一項生物活性劑為一神^營養因子，第二項生物活性劑則為一膠原蛋白合成抑制 dJ第—項生物活性劑係選自由環腺酶單磷酸、一腺苷酸環化酶活化劑和—胸抑制劑所組成的群組（Thuret et al” (2006) Therapeutic interventions after spinal cord · injury Nature Reviews，Neuroscience Vol7: 628-643，其内容係完整地以引用方式納入本文作為參考）。前述對於本發明較佳實施例之描述，僅為用以說明及敘述的目的’而非用用限制本創作。熟悉該技藝者將可體會本創作可月b使用於很多形式、結構和材料的修改。所k擇及描述之具體態樣與實施例，係為解釋本發明之原理及其實際的應用’以使熟悉該項技藝者能夠應用本發明及各鲁種貫Μ態樣，且能依其所預期的特別用途進行各種適合之修改。其他具體實施例在不脫離本發明之精神及範圍下，對於熟悉該項技藝者是顯而易知的。因此，本發明之範圍應由後附申 °月專利範圍所界定，而非受限於前述的說明及實施例。於本發明說明中引用及論述某些參考文獻，其可包括專利案、專利申請案及各種公開文獻。此等參考文獻之引用及論述僅用以闡明本發明之說明’而非認可此類文獻係屬本發明内容 24 201106965 之“先前技藝”。所有於本說明書中引用及論述之參考文獻，係完整地以引用方式納入本文’並且在一定程度上，每個參考資料均各別地被引用至參考文獻中。【圖式簡單說明】圖1A為一概要圖式，說明包覆如神經膠細胞衍生神經營養因子（GDNF)之生物活性劑於PLGA粒子中之製程。 • 圖1B則表示包覆於PLGA中的GDNF長時間釋放圖。圖2A為一概要圖示，說明依據本發明之一項具體態樣如何製備一控制釋放多藥製劑配方。圖2B-2D為穿透式電子顯微鏡（TEM)之成像。圖B : CSDS奈米粒子；圖c :包覆於pLGA粒子中的CSDS奈米粒子（箭號）；圖D: PLGA奈米粒子。圖3A為一概要圖示，說明依據本發明之另一項具體態樣 _ 如何製備一控制釋放多藥製劑配方。圖3B_3D共軛焦顯微鏡成像，顯示依據本發明之另一項具體態樣所說明的控制釋放多藥製劑配方。圖B:圖c與d 之全景，圖C:香豆素6 ;圖D:磷脂醯乙醇胺。比例尺為： 10 μιη。圖4Α為脊髓挫傷後PLGA-GDNF注射位置圖。圖4Β表示SCI鼠在注射PLGA和PLGA-GDNF藥物後運動功能表現分數。 25 201106965 圖4C為SCI鼠注射PLGA後其脊髓神經纖維蛋白染色顯微成像。比例尺：50 μηι。圖4D為SCI鼠注射PLGA-GDNF後其脊髓神經纖維蛋白染色顯微成像。比例尺：50 μιη。圖5Α為SCI鼠注射PLGA後其脊髓微小神經膠細胞iba 1 染色顯微成像。比例尺：50 μιη。圖5Β為SCI鼠注射PLGA-GDNF後其脊髓微小神經膠細胞Iba 1染色顯微成像。比例尺：5〇 μηι。 φ 圖5C為SCI鼠注射PLGA後其脊髓膠質纖維酸性蛋白染色顯微成像。比例尺：50 μηι。圖5D為SCI鼠注射PLGA-GDNF後其脊髓膠質纖維酸性蛋白染色顯微成像。比例尺：50 μιη。圖5Ε為無損傷之SCI鼠脊髓膠質纖維酸性蛋白染色顯微成像。比例尺：50 μιη。圖5F為無損傷之SCI鼠注射PLGA後脊髓膠質纖維酸性鲁蛋白染色顯微成像。比例尺：50 μηι。圖5G為無損傷之SCI鼠注射PLGA-GDNF後脊趙膠質纖維酸性蛋白染色顯微成像。比例尺：50 μηι。 26 201106965 【主要元件符號說明】 102.聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA) 104神經膠細胞衍生神經營養因子（GDNF) 106 PLGA-GDNF 粒子 210幾丁聚醣（CS) 212硫酸葡聚醣（DS) 214帶正電的藥物 216包覆有硫酸葡聚醣的幾丁聚醣粒子 218生物活性劑 220包覆親水性粒子之疏水性微米粒子 322第一項生物活性劑 324内部的疏水性奈米粒子 326第二項生物活性劑 328包覆内部疏水性粒子之外部的疏水性微米粒子 402脊髓軸突損傷部位中心前端 404脊髓軸突損傷部位中心後端 406脊髓軸突損傷部位中心

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Claims

» 4 201106965 七、申請專利範圍： 1.種用於改善哺摘物麵損傷⑽）後肢體功能恢復的醫藥組成物’其包含-有效劑量之包括下列組成物的控制釋放多藥製劑配方： ' a) 第J員組成物包含第一項生物活性劑，其包覆於一第一項聚合物粒子中； ' b) -第二項組成物包含第二項生物活性劑，其包覆於一第二項聚口物粒子中’该第二項聚合物粒子包覆於第一項聚合子中；及胃 c) 視而要地帛二項组成物包含第三項生物活性劑，其包覆於該第一或第二項聚合物粒子中，其中該第二項組成物之釋放順序須在第一項組成物之後，且第一項生物活性劑為-神經營翻子，第二項生物活性劑則為一，原蛋白α成抑制劑’第二項生物活性劑係選自由環腺酶單碟酸、腺普酸環化酶活化劑和咖抑制劑所組成的群組，以及一醫藥上可接受之載劑或賦形劑。鲁 24據申請專利範圍第】項之醫成物，其中該第一項生物活 *生劑係選自由神經膠細胞衍生神經#翻子⑺腳）、大腦衍神經營養因子（BDNF)、纖維母細胞生長因子、神經生 =子⑽F)、神經營養素3(NT3)、神經營養素4(nt4)、及神經營養素5(ΝΤ5)所組成的組群。 3.=物刪丨項之亀絲，其觸—項生物活性刮為神經膠細胞衍生神經營養因子（GDNp)，該第二項生物 28 201106965 活性劑為軟骨素酶ABC (ChABC)，該第三項生物活性劑為垂體腺苷酸環化酶激活多肽（PACAP)。 4.根據申請專利範圍第丨項之醫藥組成物’其中該第一項聚合物粒子包覆一個以上包覆有第二項組成物的第二項聚合物粒子，且該第二項組成物包含第二項生物活性劑。 5·根據申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該第一項聚合物

粒子係由聚乳酸乙_共聚物（PLGA)或幾了聚醣和硫酸葡聚醣所組成。 6. 根據申請專機圍第1項之醫藥組，其巾該第二項聚合物粒子係由PLGA或幾丁聚醣和硫酸葡聚醣所組成。 7. 根據申料纖圍第丨項之㈣組·，其巾鄉—項聚合物粒子包含-疏水性聚合物，且第二項聚合物粒子包含一疏水性或一親水性聚合物。 Μ艮射請專利範圍第丨項之醫藥組成物，其中該第—項聚人物粒子包含一親水性聚合物，且第二項聚合物粒子包含一疏水性或一親水性聚合物。 9. 一種控制釋放多藥製劑配方，其包括： a) -包含第-項生物活性劑之第—顿成物，項聚合物粒子中； &、乐一 b) -包含第二項生物活性劑之第二項組成物，其於_ =:τ中’其中該第二項聚合物粒子包覆於第，一甲。Λ弟一項組成物之釋 29 201106965 放順序須在第—項組成物之後。 10.^艮據申請專利範圍第9項之製劑配方，其中該第—項生物活性兑1為神經營養因子’該第二項生物活性劑為一膠原蛋白合成抑制剎，且该第三項生物活性劑係選自由環腺酶單磷酸 (amp )、一腺苷酸環化酶活化劑和一处〇抑制劑所纟且的会且群。、、’ 根據申δ月專利範圍第1〇項之製劑配方，其中該神經營養因子係選自由神經膠細胞衍生神經營養因子（GDNF)、大腦衍生神經營養因子（BDNF)、驗性纖維母細胞生長因子、神經生長因· 子（NGF)、神經營養素3 (ΝΤ3)、神經營養素4 (ΝΤ4)、神經營養素5 (ΝΤ5)所組成的組群。 12·根據申請專纖圍第1Q項之製雜方，其中轉原蛋白合成抑制劑為軟骨素酶ABC (chABC)。 .根據申明專利範圍第1〇項之製劑配方，其中該腺苷酸環化酶活化劑為垂體腺苷酸環化酶激化多肽（PACAP)。根據申請專利範圍第13項之製劑配方’其中該pACAp係包覆於s亥第一項聚合物粒子中。 I5.根據申請專利範圍第10項之製劑配方，其中該激酶抑制劑係選自由C3-二磷酸腺苷-核糖基轉移酶和BA_21〇重組蛋白所組成的組群。 !6·根據申請專利範圍第9項之製劑配方，其中該第一項聚合物粒子係由PLGA組成，且該第二項聚合物粒子係由pLGA或幾丁聚聽和硫酸葡聚醣所組成。 Π，根據申請專利範圍第9項之製劑配方，其中該第一項聚合物粒 30 201106965 子係由PLGA或幾丁聚釀和硫酸葡聚醣所組成。队根據申請專利範圍第9項之製劑配方’其中該第—項聚合物粒子包覆-個以上包覆有第二項組成物的第二項聚合物粒子，且该第二項組成物包含第二項生物活性劑。 19. 根據申請專利範圍第9項之製劑配方，其中該第一項生物活性劑為神經膠細胞衍生神經營養因子（GDNp)，該第二項生物活性劑為軟骨素酶ABC (ChABC)，且該第三項生物活性劑為垂體腺苷酸環化酶激活多肽（pACAP)。 20. 根據申請專利範圍第9項之製劑配方，其中該第一項聚合物粒子包含一疏水性聚合物，且第二項聚合物粒子包含一疏水性或一親水性聚合物。

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