UA120034C2 - Біспецифічний білок до baff та b7rp1 - Google Patents

Abstract

Винахід стосується біспецифічного білка, що містить поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має наступну формулу: A-L1-P-L2-P, де А являє собою важкий ланцюг антитіла IgG, L1 являє собою перший пептидний лінкер, який відсутній або довжина якого становить від 3 до 40 амінокислот, Р являє собою BAFF-зв'язуючий пептид, довжина якого становить від 10 до 40 амінокислот, та L2 являє собою другий пептидний лінкер, який відсутній або довжина якого складає від 5 до 50 амінокислот; та легкий ланцюг імуноглобуліну антитіла IgG; причому важкий ланцюг імуноглобуліну та легкий ланцюг імуноглобуліну формують антитіло IgG, яке зв'язується з B7RP1, при цьому даний білок містить дві молекули поліпептиду та дві молекули легкого ланцюга. Також винахід стосується фармацевтичної композиції, нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання біспецифічного білка та застосування біспецифічного білка або фармацевтичної композиції для лікування системного червоного вовчака, вовчакового нефриту або ревматоїдного артриту.

Description

(54) БІСПЕЦИФІЧНИЙ БІЛОК ДО ВАБЕЕ ТА В7ВРІ1 (57) Реферат:

Винахід стосується біспецифічного білка, що містить поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має наступну формулу: А-І1-Р-І2-Р, де А являє собою важкий ланцюг антитіла ДС, 1 являє собою перший пептидний лінкер, який відсутній або довжина якого становить від З до 40 амінокислот, Р являє собою ВАРЕ-зв'язуючий пептид, довжина якого становить від 10 до 40 амінокислот, та 12 являє собою другий пептидний лінкер, який відсутній або довжина якого складає від 5 до 50 амінокислот; та легкий ланцюг імуноглобуліну антитіла

Ід; причому важкий ланцюг імуноглобуліну та легкий ланцюг імуноглобуліну формують антитіло Ідс, яке зв'язується з В7КРІ1, при цьому даний білок містить дві молекули поліпептиду та дві молекули легкого ланцюга. Також винахід стосується фармацевтичної композиції, нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання біспецифічного білка та застосування біспецифічного білка або фармацевтичної композиції для лікування системного червоного вовчака, вовчакового нефриту або ревматоїдного артриту.

Назва конструкції. р7Івї7 | рвтїві8 | РУТВІЗ | РТІвО2О | вт71Б21 0 в71622 |Р?152З

Характеристика: |М-злиття» : щ- зняття | С-злизтя» | С-злиття 5-1 2 Бо-петля ТеЕспетля | СН нонетвунції НС: ! їс КО ообав | | нен 1» залиття

Структура х ї. Ів і. дл ве Кая В дл з да : Сед й ЕЕ

ММ мМ мм М м

БІ ФІ фе

Ж їх і це Х о М

ЩІ дЬІ ль

Фіг

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

У цій заявці заявлений пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 61/780260, поданої 13 березня 2013 року, та Мо 61/942776, поданої 21 лютого 2014 року, кожна з яких включена в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Біспецифічні молекули, описані в цьому документі, відносяться до галузі одержання терапевтичних засобів білкової природи.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Більшість терапевтичних білків зв'язуються з одним о білююом-мішенню з високою специфічністю, тим самим пригнічуючи активність цього одного білка-мішені. Цей білок може брати участь в одному або декількох біологічних шляхах, які опосередковують розвиток захворювання у людини, яке лікують, і, таким чином, терапевтичний білок може пригнічувати прогресування хвороби. Однак, ефективність терапевтичних білків рідко буває достатньою для всіх пацієнтів. Недостатня ефективність терапевтичних білків у деяких випадках може бути обумовлена складністю захворювання. Наприклад, деякі захворювання можуть бути опосередковані багатьма біологічними шляхами, або різні біологічні шляхи можуть відігравати основну роль в активності захворювань у різних пацієнтів, що характеризуються однаковим клінічно визначеним станом. Отже, при деяких захворюваннях перевага може полягати в одночасному інгібуванні щонайменше двох біологічних шляхів.

СУТЬ ВИНАХОДУ

У цьому документі запропонований біспецифічний білок, який може зв'язуватися та інгібувати біологічну активність і В7-спорідненого білка 1 людини (В7ВРІ, також відомий як

СІ 50 та костимулюючий ліганд Т-клітин (ІСОБІ С)), і фактора активації В-клітин людини (ВАЕБЕ, також відомий як представник 1365 (ТМЕ5Е1З3В) надродини факторів некрозу пухлини). ВАЕРЕ відіграє деяку роль у виживаності В-клітин, а В/АРІ1 відіграє деяку роль у костимуляції Т-клітин.

Отже, білок, який інгібує активність обох зазначених білків, пригнічує активність як В-, так і Т- клітин.

У цьому документі описаний біспецифічний білок, причому зазначений білок може інгібувати

ВАРРЕ-опосередковану проліферацію В-клітин людини, та причому зазначений білок може

Зо інгібувати В7ВРІ-опосередковану проліферацію Т-клітин людини. Біспецифічний білок може являти собою антитіло Ід, що містить два важкі ланцюги імуноглобуліну, що мають різні амінокислотні послідовності, і два легкі ланцюги імуноглобуліну, що мають різні амінокислотні послідовності. Антитіло ІДС; може інгібувати ВАРЕ-опосередковану проліферацію В-клітин людини та В7/ВР1-опосередковану проліферацію Т-клітин людини. Антитіло ЇдС може являти собою ІДС1, Ідсе, дз або антитіло ІДСс4 та може являти собою людське або гуманізоване антитіло ІДС. Біспецифічний білок може містити ділянку 1, що визначає комплементарність легкого ланцюга (СОР), яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:8, ділянку 2, що визначає комплементарність, легкого ланцюга (СОВ2), яка має амінокислотну послідовність

ЗЕО ІО МО:9, ділянку 3, що визначає комплементарність, легсого ланцюга (СОВЗ), яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:10, СОВІ важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:11, СОВ2 важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ХЕС

ІО МО:12, та СОВЗ важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:13. Крім того, біспецифічний білок може містити варіабельний домен важкого ланцюга, який має послідовність 5ЕО ІЮО МО:15 або її варіант, та варіабельний домен легкого ланцюга, який містить БЕО ІЮО МО:14 або її варіант. Такі варіанти послідовностей можуть містити не більше 10 делецій, вставок і заміщень однієї амінокислоти на 100 амінокислот у порівнянні із еталонною послідовністю.

В альтернативному варіанті реалізації винаходу біспецифічний білок, який може інгібувати

ВАРЕ-опосередковану проліферацію В-клітин людини та який може інгібувати В7ВРІ1- опосередковану проліферацію Т-клітин людини, може містити: (а) поліпептид, який має амінокислотну послідовність, що має наступну формулу: А-І1-Р-/2-Р, де А являє собою іммуноглобуліновий важкий ланцюг антитіла Ідс, 11 являє собою перший лінкер, який відсутній або довжина якого становить від З до 40 амінокислот, Р являє собою ВАРЕРЕ-зв'язуючий пептид, довжина якого становить від 10 до 40 амінокислот, і 2 являє собою лінкерний пептид, який відсутній або довжина якого становить від 5 до 50 амінокислот; та (б) легкий ланцюг імуноглобуліну. Важкий ланцюг імуноглобуліну (а) та легкий ланцюг імуноглобуліну (б) можуть формувати антитіло Ідс, що містить дві молекули поліпептиду (а) та дві молекули легкого ланцюга (б), які можуть зв'язуватися з В7ВРІ1 та/або можуть інгібувати В7А!РІ1-опосередковану проліферацію Т-клітин людини. У важкому ланцюзі імуноглобуліну може бути відсутній лізин на бо С-кінці відразу перед 1/1. У якості антитіла (ІД може виступати людське або гуманізоване антитіло Ідсі, Іде, ІдшЗ або антитіло Ідсаі. ВАРЕ-зв'язуючий пептид Р може мати амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮ МОМ, 5ЕО ІО МО:2 або 5ЕО ІО МО:3. ЇЇ може мати амінокислотну послідовність 5ЕСО ІО МО:4, 37, 38, 39 або 40. 12 може мати амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:5, 6 або 7. Біспецифічний білок може містити СОВІ1 легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:8 (ВПАБОСІЗМУМІ А), СОВ2 легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:9 (ААБЗБІ 05), СОВЗ легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МОТО (0О0МО5УРАТ), СОВ1 важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МОМл1 (5ММУМ5), СОВ2 важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МОЛ2 (МІКОСОМЕКМУМОБУКО), та СОВЗ важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:1З3 (ЕСП/М/РСОІ РТЕ). Біспецифічний білок може містити варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну, який має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:14, та/або варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність 5ЕС) ІЮО МО: 15. Біспецифічний білок може містити амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:19 або її варіант і амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 17 або 18 або її варіанти. Такі варіанти послідовностей можуть містити не більше 10 делецій, вставок і заміщень однієї амінокислоти на 100 амінокислот у порівнянні із еталонною послідовністю.

У додатковому аспекті в цьому документі описаний біспецифічний білок, що містить: (а) поліпептид, який має амінокислотну послідовність 5ЕО ОО МО:17 або 5ЕО ІЮО МО:18, або її варіанти; та (б) інший поліпептид, який має амінокислотну послідовність ЕС ІЮ МО:19 або її варіант. Такі варіанти послідовностей можуть містити не більше 10 делецій, вставок і заміщень однієї амінокислоти на 100 амінокислот у порівнянні із еталонною послідовністю. Біспецифічний білок може інгібувати ВАЕР-опосередковану проліферацію В-клітин людини та В7ВРІ1- опосередковану проліферацію Т-клітин людини. Біспецифічний білок може являти собою тетрамер, що містить дві молекули поліпептиду (а) та дві молекули поліпептиду (б).

В іншому варіанті реалізації винаходу в цьому документі запропонований білок, що містить лінкер, який має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:б або 5ЕО ІО МО:7. У деяких варіантах реалізації винаходу цей білок може інгібувати ВАЕРЕ-опосередковану проліферацію В-клітин людини та/або В7В!РІ1-опосередковану проліферацію Т-клітин людини. Такий білок може мати

Ко) амінокислотні послідовності 560 ІЮ МО:1, 5ЕО І МО:14 та/або 5ЕО ІЮО МО:15. Такий білок може мати амінокислотну послідовність, що містить щонайменше дві копії 5ЕО 10 МО, розділені ФЕО ІЮО МО:6 або 7. У додатковому варіанті реалізації винаходу такий білок може включати легкий ланцюг імуноглобуліну та важкий ланцюг імуноглобуліну, і ХЕО ІО МО:6 або 7 може розташовуватися за С-кінцем важкого ланцюга. У таких варіантах реалізації винаходу

ЗЕО ІЮО МО:6 або 7 можуть бути фланковані пептидами, які зв'язуються з білком, відмінним від білка, з яким зв'язані важкий та легкий ланцюги.

Крім того, у цьому документі описана фармацевтична композиція, що містить будь-які біспецифічні білки, описані в цьому документі, або білок, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:6 або 7, і фізіологічно прийнятну допоміжну речовину.

Також у цьому документі описана нуклеїнова кислота, що кодує будь-який поліпептид, включений до складу одного з біспецифічних білків, або білки, що містять 5ЕО ІЮ МО:6 або 5ЕО

ІО МО:7, описані в цьому документі. Ілюстративні нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептид, включений до складу біспецифічного білка, включають, у тому числі, наприклад, ЕС ІЮ МО: 55, 56, 60, 61, 62 та 63. Описані вектори, що містять такі нуклеїнові кислоти, та клітини-хазяї, що містять такі вектори та/або нуклеїнові кислоти. Додатково в цьому документі описаний спосіб одержання біспецифічного білка, що включає культивування клітини-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує будь-які біспецифічні білки, описані в цьому документі, у таких умовах, які забезпечують експресію нуклеїнової кислоти, та виділення білка із клітинної маси або культурального середовища. Клітина-хазяїн може являти собою клітину ссавця, наприклад, клітину СНО, або бактеріальну клітину, таку як ЕвсПетгісніа соїї.

В іншому аспекті в цьому документі описаний спосіб лікування системного червоного вовчака, включаючи вовчаковий нефрит, що включає введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості будь-яких біспецифічних білків, описаних у цьому документі, або фармацевтичної композиції, що містить такий біспецифічний білок. Інший терапевтичний засіб можна вводити пацієнтові до, після та одночасно з біспецифічним білком. У якості іншого терапевтичного засобу може бути використаний кортикостероїд, протималярійний засіб, ретиноїва кислота, НІПЗ33, циклофосфамід, дегідроепіандростерон, мофетила мікофенолят, азатіоприн, хлорамбуцил, метотрексат, такролімус, дапсон, талідомід, лефлуномід або циклоспорин.

У додатковому аспекті в цьому документі описаний спосіб лікування, що включає введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості будь-яких біспецифічних білків, описаних у цьому документі, або фармацевтичної композиції, що містить біспецифічний білок, описаний у цьому документі, причому пацієнт має захворювання, вибране із групи, що складається з: АМСА- позитивного васкуліту, ревматоїдного артриту (РА), хвороби Крона, виразкового коліту, целіакії, пухирчатки, пемфігоїда, підгострого шкірного червоного вовчака (ПШЧВ), розсіяного склерозу, хронічної запальної демієлінізуючої полінейропатії (ХЗДП), міастенії гравіс, синдрому

Гудпасчера, гломерулонефриту, автоїмунної гемолітичної анемії (АГА), ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури (ІТП), хронічного активного гепатиту, первинного біліарного цирозу печінки, синдрому Шегрена, системного склерозу, тиреоїдита Хашимото, хвороби Грейвса, хвороби Аддісона та множинної ендокринної неоплазії (МЕН).

В іншому аспекті в цьому документі описана фармацевтична композиція, що містить будь-які біспецифічні білки або білки, що містять 5ЕО 0 МОб або 5ЕО ІЮО МО:7, описані в цьому документі. Фармацевтична композиція може бути призначена, наприклад, для лікування системного червоного вовчака або вовчакового нефриту.

В іншому аспекті описане застосування в якості лікарської речовини будь-яких біспецифічних білків, запропонованих у цьому документі.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Фіг. 1: схематичні зображення біспецифічних білків, які зв'язуються з ВАЕЕ та В7ВРІ1. У верхньому рядку наведені ідентифікатори для кожної конструкції. У другому рядку наведена коротка описова фраза, що відноситься до структури кожної конструкції. У нижньому рядку представлене схематичне зображення структури кожної конструкції. Незаштриховані овали відповідають константним доменам важкого або легкого ланцюга імуноглобуліну. Овали, заштриховані горизонтальними лініями, відповідають варіабельним доменам важкого або легкого ланцюга (МН або МІ) імуноглобуліну. Маленькі, зафарбовані квадрати та петлі відповідають ВАРЕ-зв'язуючим пептидам. Шарнірні області проілюстровані у вигляді жирних вертикальних ліній, тоді як дисульфідні містки проілюстровані у вигляді жирних горизонтальних ліній. Послідовність "45" на фіг. 1 розкрита в БЕО ІЮ МО:72.

Фіг. 2: активність біспецифічних білків в аналізі проліферації В-клітин людини. Дані,

Зо проілюстровані на фіг. 2А (верхня) та 2В (нижня), одержані з аналізів проліферації В-клітин, які здійснювали, як описано в прикладі 1. На обох панелях по осі х зазначена концентрація (оаІнНМіІ) біспецифічного білка, який міститься в суміші, яку аналізують, а по осі у зазначена кількість включеного ЗН-тимідину (число імпульсів у хвилину (сріт)). Позначення кожного маркера зазначене у вигляді ідентифікатора для кожного проаналізованого білка. Позначення кожного ідентифікатора проілюстровано на фіг. 1 та пояснено в прикладі 1.

Фіг 3: активність біспецифічних білків в аналізі проліферації Т-клітин людини.

Проілюстровані дані одержані з аналізів проліферації Т-клітин, які здійснювали, як описано в прикладі 1. На осі х зазначена концентрація (Ісо(нНМІ) біспецифічного антитіла або антитіла аВ7ВРІ у суміші, яку аналізують, і на осі у зазначений відсотковий вміст включеного в Т-клітини

ЗН-тимідину в присутності В7ВРІ1-інгібіторів у зазначених концентраціях у порівнянні зі вмістом включеного в Т-клітини ЗН-тимідину без В7ВРІ-інгібіторів (у відсотках від контролю).

Ідентифікатор зазначений для кожного досліджуваного білка.

Фіг. 4: вивільнення цитокінів клітинами мигдалин людини, стимульованими ентеротоксином

В етарпуїососсиз (ЗЕВ). Способи описані в прикладі 1. На осі у показані рівні сигналу, виявленого для різних цитокінів, виміряні за допомогою наборів Мезо 5саїє Різсомегу (Роквілл,

Меріленд) згідно з інструкціями виробника. На клітини впливали або «В7ВРІ1 (стовпець 1),

Р74293 (стовпець 2), СТІ А4-Ід (стовпець 3), або (ДС людини (стовпець 4). На даній фігурі зазначені проаналізовані цитокіни.

Фіг. 5: фармакокінетичний профіль біспецифічних конструкцій у мишей. Способи оцінки іп мімо фармакокінетичних властивостей Р71617, Р71619, Р71621, Р71622, Р74293 та Р74294 у мишей описані в прикладі 1. Згідно з поясненнями, наведеними в прикладі 1, біспецифічні білки були виявлені за допомогою двох різних аналізів, в одному з яких була виявлена тільки Ес- ділянка білків (точки даних позначені зафарбованими ромбами; аналіз Ес-ділянок), і в другому з яких були виявлені як Ес-, так і ВАРЕ-зв'язуючі ділянки білків (точки даних позначені зафарбованими квадратами; аналіз інтактних білків). На осі х зазначений час після ін'єкції (години), а на осі у зазначена концентрація білка, виявленого в сироватці (нг/мл). Конструкції, використані для введення, зазначені на кожній панелі.

Фіг. бА: інгібування проліферації В-клітин миші проводили з використанням біспецифічної молекули - мишачої гомологічної молекули ("мишача гомологічна молекула"), яка зв'язується з 60 ВАРЕЕ та В7ВРІ. Аналіз здійснювався, як описано в прикладі 2. Мишача гомологічна молекула містить антитіло Їдс до В/ВРІ миші, яке має дві копії ВАЕРЕ-зв'язуючого пептиду, приєднаного до С-кінця важкого ланцюга антитіла, як зазначено в прикладі 2. У якості позитивного контролю слугувало ВАРЕ-зв'язуюче пептидне антитіло ("сВАБЕ"). Дані для мишачої гомологічної молекули та аІВАЕЕ зазначені, відповідно, у вигляді зафарбованих кружечків та квадратів. На осі х зазначена концентрація цих досліджуваних у цьому аналізі білків (од(пМіІ), а на осі у зазначені результати за включенням ЗН-тимідину (срт).

Фіг. 6В: інгібування зв'язування В/ВРІ з Т-клітинами миші з використанням мишачої гомологічної молекули. Аналіз здійснювався, як описано в прикладі 2. Антитіло ДС до В7ВРІ1 миші ("антитіло до тВ7ВРІ1") було використано в якості позитивного контролю. Дані, одержані для мишачої гомологічної молекули та антитіла до тВ7ВРІ, позначені, відповідно, у вигляді зафарбованих кружечків та квадратів. На осі х відображена концентрація цих досліджуваних білків у цьому аналізі (Іоа(пМіІ), а по осі у відображений відсоток В/ВР1-Ес миші, що зв'язався з

Т-клітинами.

Фіг. 7: вплив іп мімо введення мишам еритроцитів барана на їхні імунологічні показники. Всі результати, проілюстровані на цій фігурі, взяті з аналізів, описаних у прикладі 2. Білки, які одержували миші, позначені за допомогою зафарбовування кожного стовпчика в такий спосіб: незафарбований стовпець - антитіло до тВ7РАРІ; вертикальні лінії - «ВАЕЕ; горизонтальні лінії - антитіло до тВ7ВРІ1 на додаток до аВАБЕРЕ; діагональні лінії - мишача гомологічна молекула; шахове штрихування - тідаї; та зафарбований стовпець (тільки в нижній панелі) - миші, яким не вводили ЕБ. Верхня панель - виражена у відсотках кількість В-клітин селезінки в мишей, яким вводили еритроцити барана (ЕБ). На осі у зазначена виражена у відсотках кількість клітин селезінки, які являють собою В-клітини. Середня панель -виражена у відсотках кількість СО4- Т- клітин селезінки, які являють собою Т-клітини пам'яті мишей, яким вводили ЕБ. Нижня панель - рівні антитіл до ЕБ у сироватці мишей, яким вводили ЕБ.

Фіг. А: протеїнурія в мишей лінії МАВ/МАМУ, на яких впливали різними білками. Способи описані в прикладі 2. Для кожної групи мишей вплив зазначений у такий спосіб: зафарбовані кружечки - фосфатно-буферний розчин (РВ5); зафарбовані квадрати - Ід миші (ізотипічний контроль; 5 мг/кг); незафарбовані квадрати - антитіло до тВ7ВРІ (4,68 мг/кг); зафарбовані трикутники вершиною вгору - «ВАЕЕ (1,88 мг/кг); незафарбовані трикутники вершиною вгору -

Зо оВАРЕ (1,88 мг/кг) на додаток до антитіла до тВ7РРІ1 (4,68 мг/кг); та незафарбовані трикутники вершиною вниз - мишача гомологічна молекула (5 мг/кг). На осі х зазначений вік мишей (місяці), а на осі у зазначений відсоток мишей із протеїнурією, тобто 2300 мг/дл білка в сечі.

Фіг. 88: рівні антитіл до дволанцюгової ДНК (длДНК) у мишей лінії МАВ/МАМ/ у віці 8,5 місяців, які одержали різні білки. Способи описані в Прикладі 2. На осі х зазначені ідентифікатори молекули(л), які одержали миші, що наведено нижче: 1, антитіло до тВв7ВР1 (4,68 мг/кг); 2, ЧВАЕЕ (1,88 мг/кг); 3, «ВАЕЕ (1,88 мг/кг) на додаток до антитіла до тВ7РРІ (4,68 мг/кг); 4, біспецифічні мишачі гомологічні молекули (5 мг/кг); та 5, тідаі (ізотипічний контроль; 5 мг/кг). На осі у зазначені рівні антитіл до длдДНК, які були визначені у відсотках від позитивного контролю. Кожна точка слугує для позначення даних для однієї миші.

Фіг. 9А: рівні (ДС до длДНК у мишей лінії МАВ/МАМУ. Способи описані в прикладі 2. Дані для різних груп мишей представлені в такий спосіб: 1, миші, які одержували антитіло до тВ7ВРІ1 (14 мг/кг); 2, миші, які одержували аВАЕБЕ (5,6 мг/кг); 3, миші, які одержували комбінацію антитіла до тВв7ВРІ1 (14 мг/кг) та «ВАК (5,6 мг/кг); 4, миші, які одержували мишачі гомологічні молекули (15 мг/кг); 5, миші, які одержували ізотипічний контроль тідс (15 мг/кг); та 6, миші, які одержували

РВ5. Зірочки вище стовпців 1, З та 4 позначають статистично значимі відмінності (", р«0,05; якхр-0,0001) між даними цих стовпців та даними стовпця 5 (тідс).

Фіг. 98: виражена у відсотках кількість мишей НЕ: лінії МАВЛУ, що мають протеїнурію, у кожній групі. Способи описані в прикладі 2. Дані для різних груп мишей представлені в такий спосіб: незафарбовані квадрати - миші, які одержували антитіло до тВ7ВРІ1 (14 мг/кг); зафарбовані трикутники вершиною вгору - миші, які одержували аВАРЕ (5,6 мг/кг); незафарбовані трикутники вершиною вгору - миші, які одержували комбінацію антитіла до тВ7ВРІ1 (14 мг/кг) та «ВАЕЕ (5,6 мг/кг); незафарбовані трикутники вершиною вниз - миші, які одержували мишачі гомологічні молекули (15 мг/кг); зафарбовані квадрати - миші, які одержували ізотипічний контроль тідс (15 мг/кг); та зафарбовані кружечки - миші, які одержували РВ5. Статистично значимі відмінності були виявлені між результатами для мишачої гомологічної молекули у порівнянні із антитілом тВ7АРІ (р«еб0,01), «ВАРЕ (р«0,0001) та тідбй (р«0,0001). Зазначений інтервал часу, коли здійснювався вплив.

Фіг. 10: показники патоморфологічних змін нирок мишей і лінії МАВ/М. Згідно з поясненнями, наведеними в прикладі 2, нирки одержували після смерті мишей, якщо це 60 відбувалося до кінця дослідження, або наприкінці дослідження. Показники патоморфологічних змін нирок були визначені, як описано в прикладі 2, причому високі показники свідчать про більшу тяжкість захворювання нирок. На додаток до середніх значень для кожної групи мишей показані відповідні планки похибок. Групи мишей одержували наступні антитіла: 1) антитіло до тВ7АРІ (14 мг/кг), стовпець, заштрихований вертикальними лініями; 2) «ВАР (5,6 мг/кг), стовпець, заштрихований горизонтальними лініями; 3) комбінація антитіла до тВ7ВРІ1 (14 мг/кг) та ОВАРЕРЕ (5,6 мг/кг), стовпець зі штрихуванням у клітинку; 4) мишача гомологічна молекула (15 мг/кг), стовпець із шаховим штрихуванням; 5) тідсї (15 мг/кг), стовпець із білими крапками на чорному тлі; і 6) РВ5, зафарбований стовпець.

Зірочками позначені статистично значимі відмінності між даними, одержаними для мишей, що одержували тіда, з р-значенням «0,05 (У або «0,001 (7.

Фіг. 11: вплив інгібування ВАЕЕ та/або В/ВРІ на мишей з колаген-індукованим артритом.

Способи описані в прикладі 4. П'ять груп мишей одержували досліджувані речовини, зазначені нижче: тідс, зафарбовані квадрати, з'єднані жирними лініями; РВ5, зафарбовані квадрати, з'єднані пунктирними лініями; антитіло до тВ7ВРІ, зафарбовані кружечки, з'єднані пунктирними лініями; «ВАЕЕ, незафарбовані кружечки, з'єднані жирними лініями; та комбінація антитіла до тВ7ВАРІ та оВАРЕЕ, зафарбовані кружечки, з'єднані жирними лініями. На верхній панелі показана виражена у відсотках частота випадків розвитку артриту для різних груп та на нижній панелі показані середні показники ступеня тяжкості артриту для цих груп. Вертикальна, спрямована вниз стрілка на кожній панелі, позначає час другої імунізації бичачим колагеном.

КОРОТКИЙ ОПИС ПЕРЕЛІКІВ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

НОМЕР ПЕРЕЛІКУ еонис НИ

ЛеСЛІДОВНОСТЕЙ 5ЕО МОЇ Амінокиспотна постідовність ВАКЕ-зв'язуючого пептиду, й

ЗОВ МО Амінокислотна послідовність ВАЕК: зв 'язуючого пентиду. і

ЗЕОІБВМО:З Амінокиспотна послідовність НАРЕ-зв'язуюючого 07 рвенхиду, пан

ЗО МО Амінокислотна послідовність лійкеза, сн ЕВ НО МОУ, --- «а м | нокислотна послідовність лінкера;

ВЗЕОюЮМО:в Амічокислотна послідовність лінкера.

ЗЕОТО МО: Е Амінекислотна послідовність лінкера.

ОО МОХ Аміноквслотна снюелідовність ОСОКІ легкого

ВИННА НН: дашщюгта; 707 «ЕСНЮ Мого Амінекисткна мослідовність СК легкого ! ланцюга, ШИ

ВОЮ МОНО Амінокислотна поснідовність ОСОКЗ легкого се 0000

ЗЕО ШО щек11 Амінокислотна плосліповність СЯ! важкого : ванцюга.

ЗЕОЛО МекІЗ Амінокислотна тоспідовність СІКО важкого шИщ лавтцнга:

ЗО МО:13 Авінокиснотна лослідовність СЮМЗ важкова но с і ПО 510 МО:14 Амінокислотва послідовність 0 варіабельного домену легкого ланнюга, Ш

БО ОО МО15 Амінокислотна о послілонність варійбельного домену важкого ланцюга. 5ЕСПОМО:І6 Амінокислоїна послідовність важкого ланцюга біспецифічної молекули 71619 ВАКЕ/ВОКРІ.

НОМЕР ПЕРЕЛІКУ | Опис

ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 00000000 2 2 и А.

ЗО МО 17 Амінокислотна поспіловність важкого ланцюга! біспецифічної молекули 274293 ВНАРЕ/ВТКРІ.

ЗЕОТО МО15 Амінокислотна послідовність важкого ланшега. бісневифічної молекуля Р74294 ВАЕР/ВЛЕРІ,

КО НУМО І Амінокиєттниа спослідевність легкого ланцюга! не сіті антитіла 1рб до ВиВТВРІ ш 5ЕОЛО МО Амінокислотна носліловність, що передує СІК

ШИ шо зажкоголанцюта ши ши

ЗО ЦУМО Амінокислотна послідовність, що передує СОКО важкого нанцюга. 5НОЛОЮ МО Амінекиєпоїтна послідовність, що знаходиться за!

Й ші СЕЗ важкого ланцюга. МН п

БОЛЮ МОЗ Амінокнелотна посліювність. нію» знахелиться за

ШИ о о 1СОКолегкосоланиюта. -

ЗЕО ОО КО:24 Щ Лінке

ОО МО Аміокислотна поснловність важкого ланцюга! шани ск ВНІИТіа во до ВК тт

ЗВО МО: 26 Амінокислотна послідовність важкого ланшеога шу конструкції Р71О17, «ВО МОК»? Амінокислотна лоєпідовність важкого ланцюка. п | конструкції РУТбІВ. шк ши

БО ЩО МО:28 ! Амінокислотна поєлідовність важкого ланнюга : сн шин КОВСТВУКЦИ РО дю понят 5016 КО:29 Амінекислотна послідовність важкого ланцюга конструкції Р/ТО21, вка МО:3о Амінокислотна поснзовність важкого ланцюга сш 2 2 КоНФрукЦЙ ЛЮ 0

БОЮ МОХ Аміноквслотна послідовність важкого ланцюга щ конетрукції Р7ТО623, ШО ЩО зво що: | Амінокислотна послідовність пептидного антитіла пи ко: ст Дн

ЗО О МО:33 Амінокислотна послідовність Бе-ділянки рої - дентитня ою

ЗБОЮ МО:34 | Амівокислотна послідовність Ре-ділянки еб пюдину, 501 МО:35. Шо Амінокислетна послідовність Бе-ділянки ТЕО: дюднне. щи шо 5БЕО ПО МО:36 Амінокислюотна. носліловність о Кеслілянки 8 людини.

КО О МО:ЗЕ М інокислотна послідовність лінкера.

Щ ЗО МО і | о Амівокислотна послідовність лінкера; ши 5ЗЕОТОМОЯЮ 00000). амінокислотна послідовність інкера; 0 5ЕО ЛО МОЯ І Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує нн що «ОО МО Песліловність нуклеїнової Жжислотн, яка кодує амінокиспатну послідовність ЗО ТО МОЯ,

НОМЕК ПЕРЕЛІКУ Опис

ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕ МОЗ Нослідовність пПуклеїнової кислоти, Яка кодує

М амінокислоту послідовність БО ТО МО:5.

БЕСНО ха Послідовність снуклейової кислоти, яка кодує вин зе- - | Мінокислотну послідовність ЗО ТО МОЖ

РОЮ МОМ5 Послідовність нуклеїнової Жкролоти, яка колус

Й Шо амінокислоту послідовність БОЮ МО, ши

ВО ТО МОЯ Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує змінокислетну послідовність ЗЕ МОВ.

ЗО МОЯ Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує т подо «З АМіНОКислотну послідовність ЖЕО ТО МОЯ. ! 5ЕО З МОхаВ Ноєлідовність нуклеїнової кнележи; яка кодує тд птн у АМіВОКИсЛотну послідовністьВВО ЮМОМО; за 1 МО:49 Песлідовність нуклезнової кислоти. яка кодує змінохислетну послідовність ХО ПО МОЇ,

ЗБОЮ Ма Нослідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує:

М щи амінокислотну послідовність ЗБОЮ МО.

ЗРОТЮ МО:51 Послідовність нуклейової жислоти, яка кодує

І Що с фамінокисловну послідовність ЗЕО НІ МОКІ3, 5ЕОТО МО:52 Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує акінокислатну ПОСЛІДОВНІСТЬ ЗО ПО МО:

ЗЕОТО МО: 53 НПослідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕОНЮ МО:15.

Послідовність нуклеїнової кислоти. яка колує . амінокислотну послідовність ЗБОЮ МОС16. Ш

ЗО МО:55 Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує кто --КАМіНОКИСНОТНУ Послідовність ЗБОЮ МОНЕТ,

ЗБОЮ МО: Послідовність нукисінової жислоти, яка кодує амінокислотну послідовність БО МС.

БО МОУ Носндовність нуклемнової жислоти. яка колує ! з амінокислотну послідовність ЗХЕО ПО МО. ,

ОО ПО МСкІВ Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує й Й амінокислотну послідовність ЗЕО ТО МО,

ЗБОЮ МО:59 Послідовність нуклеїнової жислети, яка колує

Й Щ Шк щ амінокислотну послідовність БЕО 10 МО:25. І

ЗО ОО МО:во Послідовність нуклеїнової кислоти. яка кодує соток о а менокислотну послідовність БЕЗ ЛО МОСТІВ. я

ЗВО МО: Послідовність нуклеїнової жЖислотни, яка ходує

НИ і | І гамінокислозну послідовність ХО 0 МО.

ЗО МО: Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислоту послідовність 5ЕО І МО:УВ.

БЕО ЦО МО: Послідовність нуклеєвової кислоти, Яка кодує амізоакислотну послідовність ЗБОЇ МОКО9, 5ЕСНО МО: | Послідовність зуклеївової кислот яка кодує о амінокислотну послідовність ЗБО ПО МОЗ, ССС 5ЕО ЩО МО:65 | Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує шини амінокн в К

Й 5БО ЩО МО:66 Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує кни змінокнслотну послідовність ВОЮ МО

ОССНЮеМЕВ ПЕРЕШКУ! ИС 000

ПОСЛІДОВНОСТЕЙ шо 5ЕО10 МО:67 Послідовність НУКЛЕЇНОВОЇ Ккиспеки. яка кодує

БЕОТО МОХ Поспідовність овуклеїнової кислоти, яка кодує вне ЕЕ ок неявх у послідовність ЗЕОЛО МО:34,

БО ще: Послідовність нуклеїнової кислоти, яка колує амінокислоту послідовність ЗО НО МС.

ЗБОЮ МО: Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує ше потр - о | о Мінокиснотну послідовність ЗЕО З МОВ. : ЗО ЦО МО:ті 211 Амінокислотна послідовність лінкера.

ЗБОЮ МОУ лмінокислотна послідовність лінкеря. ши

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ

У цьому документі запропоновані біспецифічні білки, які зв'язуються та інгібують як фактор активації В-клітин людини (ВАЕЕ; також відомий як ВІ 5, ТА 1, ТНАМК або ТМЕ5Е13В), так і

В7-споріднений білок 1 (В7ВРІ1; також відомий як ліганд ІСО5, ІСОБ5І, ГПІСО5, гомолог 2 В7,

В7НЗ2 та СІ 50), нуклеїнові кислоти, що кодують ці біспецифічні білки, та способи одержання та застосування цих білків. Біспецифічні білки можуть інгібувати як ВАРЕРЕ-опосередковану проліферацію В-клітин, так і В/ВР1-опосередковану проліферацію Т-клітин. В іншому аспекті біспецифічні білки можуть інгібувати зв'язування В7ВРІ з Т-клітинами. Такий біспецифічний білок може являти собою антитіло ІдС із двома різними важкими ланцюгами та двома різними легкими ланцюгами, причому одна пара важкого ланцюга/легкого ланцюга зв'язується з ВАЕЕ, а інша зв'язується з В/ВРІ1. В альтернативному варіанті В7/ВРІ1-зв'язуюча ділянка біспецифічного білка може містити антитіло ІДС, що включає два ідентичні важкі ланцюги та два ідентичні легкі ланцюги, та ВАРЕ-зв'язуюча ділянка біспецифічного білка може містити один або декілька

ВАРЕРЕ-зв'язуючих пептидів, які можуть бути злиті з антитілом В/ВРІ, необов'язково через М- кінець важкого або легкого ланцюга імуноглобуліну, карбоксильний кінець важкого ланцюга імуноглобуліну та/або в межах СН2- та/або СНЗ-ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну.

Визначення

У цьому документі мається на увазі, що "антитіло" являє собою білок, що містить варіабельний домен важкого та/або легкого ланцюга імуноглобуліну.

У цьому документі мається на увазі, що "біспецифічний білок" являє собою білок, який може специфічно зв'язуватися із двома різними молекулами, які в деяких варіантах реалізації винаходу являють собою білки. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічний білок може зв'язуватися як з ВАКЕБЕ, так і з В/ВРІ1.

Пацієнт одержує "паралельне" лікування двома або більше терапевтичними засобами, якщо одержує два або більше терапевтичних засобів протягом однакового періоду часу, необов'язково в один і той же час. Наприклад, якщо пацієнт регулярно приймає один терапевтичний засіб щодоби, а також регулярно приймає інший терапевтичний засіб раз на місяць, даний пацієнт одержує ці лікарські засоби паралельно. Аналогічним чином пацієнт, який приймає два різні терапевтичні засоби, кожний з яких вводять кожні два тижні, але не в один і той же день, одержує паралельне лікування двома терапевтичними засобами. Крім того, пацієнт, що регулярно одержує один терапевтичний засіб раз у тиждень та інший терапевтичний засіб раз у добу протягом усього лише трьох діб, одержує лікування цими двома терапевтичними засобами протягом короткого періоду.

У цьому документі мається на увазі, що "Рс-ділянка" являє собою димер, що складається із двох поліпептидних ланцюгів, з'єднаних одним або декількома дисульфідними зв'язками, причому кожний ланцюг містить частину або весь шарнірний домен на додаток до СН2- та СНЗ- домену. Кожен із поліпептидних ланцюгів називається "поліпептидним ланцюгом Ес-ділянки".

Зокрема, Ес-ділянки, які передбачені для застосування в цьому винаході, являють собою Ес- ділянки Ід, які можуть являти собою Ес-ділянки ІДИ, дае, ІдИЗ або Ідс4 ссавців, наприклад, людини. Серед Ес-ділянок ЇД1 людини щонайменше відомі два алельних типи. Амінокислотні послідовності поліпептидного ланцюга Ес-ділянки можуть відрізнятися від амінокислотних послідовностей поліпептиду Ес-ділянки ссавців не більше ніж на 20, 15, 12, 10, 8, 5 або З заміщення, вставки або делеції однієї амінокислоти у порівнянні із амінокислотною послідовністю поліпептиду Ес-ділянки ссавців. В альтернативному варіанті або на додаток до цього, амінокислотна послідовність поліпептидного ланцюга Ес-ділянки може відрізнятися від послідовності відомого або природного поліпептидного ланцюга Ес-ділянки не більше ніж на 10 вставок, делецій або заміщень однієї амінокислоти на кожні 100 амінокислот послідовності. У деяких варіантах реалізації винаходу такі варіації можуть являти собою "зміни, що забезпечують гетеродимеризацію", які сприяють утворенню гетеродимерів у порівнянні із гомодимерами. Посилаючись на певні положення в межах поліпептидного ланцюга Ес-ділянки, використовують систему нумерації ЄШ (Едеїтап еї а!. (1969), Ргос. Маї). Асад. сі. 63: 78-85), що проілюстроване нижче в таблиці 1 у вигляді вирівнювання поліпептидних ланцюгів Ес-ділянки

ЇДа людини.

Жаблицпя 1. Вирівнювавия амінокислотних послідовностей Ке-дівянок о Їрбх людини, їоб5і ж т т жу я тт я Ж ж т ин я кю ттяя кЧОг сяяла хкоюжя ялин янв ненля ння ютнютя ян юки х9353 ЖІКТРІСОТТНТСРИСРЕРКОСОТВРРСВВОРБРЕЗСОТРРЕСЬВСЕ їщша пет оте тотеют еі т т т Ж тт ех еле Ж т теки 225 235 2745 255 255 25

Я х жк ж ж ж

ІФ БРЕБСОКТУТСЯРОРАРБІ ОВО УКОКРРАРКОТМІ ВНІ РУТ ВУВНЕОВЕУКУ іа» БАКССУК ЗСРРОТАРРУАЗОРБУКОКРЕКРКОТЬМІБЕТРЕУТСУМЧЮМОНЕВКЕМОК 5953 ЕРКВСОТЕЕРОРАСУАВВОСКІУВЬЕКРРЕРКОТІМНІЗВІРВУутТеУМУВУНЕНЕВМОЕ їцеаі БВКУЯ---РРОРБСРАРБЕБСЗРОУСЕВРКРКОТЬМІВВТРЕУТСУУ ЧУ ВОВРЕВУЕ 285 295 За5 315 325 535

Й Ж Й Й Кк. ще Кз ж Й Й ж

І9д91 МПЛУЮЗУВУННАКТКРАЕЕОУМиТУВУХ ВУ ТУЬНОрРНЬКСККУКОКУВККАВРАРІВКУХ їце МеУМООМЕБУНИАКТКУКЕКОНОТЕКУиМрТУНОВН ОКХ КсКуУНКОриАВІВКТ вра КНХУурОуВУННАКТЕРАБЕОУНОТРУВУйІУнНОрНЬНОКЕКСКУЄНКАСРАВТВКІ

Її МеуУЧОСУРУНМАКІКРНЕВОВИоТУВУУБЕТЬНОсКЬнеоКевУКАКУВНКСЬКОВІБКУ 345 355 365 379 З85 395 « ж Ж Ж. Ж Ж їобі ІБКАКСОРАЕРОУУТІСУРЯНОВІТКМОУ ВЕ УСТУКОКУРЗОТАУЕНВЗНООРЕННУК ТТ» той ЇБКТКООРВЕРОУХТЬРРЕКЕВМТКМОУВІ СУК авУрООІАМЕНЕОМСОРЕННУКТІВ їщ63 ІБКТКСОРАЕРОИУТЬУвавВЕМІКМНОУУМІСЬУВОКХРУРІАЧУЕНВОЗООКЕННЕНІТЕ їзчба ЇБКАКООРКЕРОУУТЬРООБЕМІКМОУВЬТСІУКОРУРОІАУЕНЕНСОРЕННУКЕ ад 415 425 435 445 й Ко жк й. ж

Іі РУБОБООВЕКЬТЯКОТУЮКОВИООЄНУКВОВУМНЕАНИМНУ ТОК БУРОК (580 30 МО:33)

Іоб2 вМмиОоЗроеккруВКОтУрКеВИисОснуЖсиУМНЕВЬНННУТОКаВБЕОРОК (ЗО 10 МО:34)

ІЧОаЗ СРМІДОВООВЕКНТНКоТМІКВВЮЮЄНІГЗСУМНЕАТННИХТОКВЯІаеоК (БЕО тий МО:35) засрі вЬОЗОаЗКкрУВВІ ТИКИ КОоМУЖсаУМНЕАВАМНУТОКООВІВІА (КО ТО щО:361

У деяких положеннях можуть зустрічатися природні поліморфізми. Наприклад, метіонін у положенні 282 у наведеній вище послідовності (Дс2 частіше являє собою валін у природних послідовностях ІдД(Сег. Аналогічним чином тирозин у положенні 296 у послідовності (ДСЗ також може являти собою фенілаланін.

Термін "зміни, що забезпечують гетеродимеризацію", у цілому, відноситься до змін в СНЗ- ділянках двох різних важких ланцюгів ІдС, які сприяють утворенню гетеродимерних димерів важких ланцюгів, тобто в димеризованих важких ланцюгах відсутні ідентичні амінокислотні послідовності. Зміни, що забезпечують гетеродимеризацію, можуть бути асиметричними, тобто один важкий ланцюг, що містить певну зміну, може утворювати пару з іншим важким ланцюгом, що містить іншу зміну. Ці зміни сприяють гетеродимеризації та заважають гомодимеризації.

Одним із прикладів таких парних змін, що забезпечують гетеродимеризацію, є так звані заміщення по типу "виступи та западини". Див., наприклад, патент США Мо 7695936 та публікацію заявки на патент США 2003/0078385, у фрагментах яких описані такі мутації та які включені в даний документ за допомогою посилання. У цьому документі мається на увазі, що в парі важкий ланцюг/важкий ланцюг, у якій міститься одна пара заміщень по типу виступів та западин, міститься одне заміщення в одному важкому ланцюзі та інше заміщення в іншому важкому ланцюзі. Наприклад, було виявлено, що наступні заміщення по типу виступи та западини збільшують утворення гетеродимерів у порівнянні із тим, що було виявлено для немодифікованих важких ланцюгів. 1) У407Т в одному ланцюзі та ГТЗ366У в іншому; 2) М407А в одному ланцюзі та ТЗ36БМУ в іншому; 3) Е405А в одному ланцюзі та ТЗ9АМУ/ в іншому; 4) Е4ОБМ в одному ланцюзі та 73945 в іншому; 5) У407Т в одному ланцюзі та ТЗ366У в іншому; 6) Т366У та

Е405А в одному ланцюзі та Т394МУ/ та У407Т в іншому; 7) ТЗ6бУУ та Е405БМУ/ в одному ланцюзі та

Т3945 та У407А в іншому; 8) Е4О5МУ та У407А в одному ланцюзі та ТЗ366МУ та Т3945 в іншому; та 9) ТЗ366МУ в одному поліпептиді Ес та Т3665, І З368А, та У407У в іншому. У цьому документі мається на увазі, що мутації в Ес-поліпептиді позначені в такий спосіб. За амінокислотою (позначеною з використанням однобуквеного коду), що звичайно присутня у конкретному положенні в СНЗ-ділянці, позначеній з використанням системи нумерації ЄЮ (яка представлена

Зо в Едеїтап сеї аї. (1969), Ргос. Майї). Асай. 5сі. 63: 78-85), знаходиться амінокислота з номером положення згідно з Є), за якою знаходиться альтернативна амінокислота, яка присутня у цьому положенні. Наприклад, У407Т означає, що тирозин, який звичайно присутній у положенні 407 згідно з Є), заміщений на треонін. Для повної ясності система нумерації ЄЮ проілюстрована нижче в таблиці 1. У якості альтернативи або на додаток до таких змін, заміщення, при яких утворюються нові дисульфидні містки, можуть сприяти утворенню гетеродимерів. Див., наприклад, публікацію заявки на патент США 2003/0078385, у фрагментах якої описані такі мутації та яка включена в даний документ за допомогою посилання. Такі зміни в Ес-ділянці Ід включають, наприклад, наступні заміщення: М349О в одному поліпептгидному ланцюзі Ес- ділянки та 5354С; в іншому; У349С в одному поліпептидному ланцюзі Ес-ділянки та ЕЗ56С в іншому, МУ349СО в одному поліпептгидному ланцюзі Ес-ділянки та ЕЗ357С в іншому; І 3510 в одному поліпептидному ланцюзі Ес-ділянки та 5354 в іншому; Т394С в одному поліпептидному ланцюзі Ес-ділянки та ЕЗ397С в іншому; або 039902 в одному поліпептидному ланцюзі Ес-ділянки та К392С в іншому. Аналогічним чином заміщення, при яких змінюється заряд одного або декількох залишків, наприклад, на місці з'єднання СНЗ-СНЗ можуть підсилювати утворення гетеродимерів згідно з поясненнями, наведеними в МО 2009/089004, у фрагментах якого описані такі заміщення та який включений у даний документ за допомогою посилання. Такі заміщення в цьому документі називаються "парними заміщеннями зі зміною заряду", і Ес- ділянка, яка містить одне парне заміщення зі зміною заряду, містить одне заміщення в одному важкому ланцюзі та інше заміщення в іншому. Загальні приклади парних заміщень зі зміною заряду включають наступні: 1) 4090, В409Е, К4090 або К409Е в одному ланцюзі на додаток до 0399К або 0399А в іншому; 2) М3920, М392Е, КЗ3920 або К392Е в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99К або 0399В в іншому; 3) К4390 або К439Е в одному ланцюзі на додаток до

ЕЗ56К, ЕЗБ56Н, 0ЮЗ356К або 03568 в іншому; та 4) КЗ3700 або КЗ70Е в одному ланцюзі на додаток до ЕЗ57К або ЕЗ57В в іншому. На додаток до цього, заміщення 23550, О355Е, НЗ3550, ВЗ55Е,

КЗ6ОО або КЗбОВ в обох ланцюгах можуть стабілізувати гетеродимери при використанні з іншими змінами, що забезпечують гетеродимеризацію. Такі парні заміщення зі зміною заряду можуть бути використані або окремо, або з іншими парними заміщеннями зі зміною заряду.

Конкретні приклади одиночних парних заміщень зі зміною заряду або їхніх комбінацій включають наступні: 1) К40О9Е в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99К в іншому; 2) К409Е в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99А в іншому; 3) К409О0 в одному ланцюзі на додаток до

ОЗ399К в іншому; 4) К4090 в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99Е в іншому; 5) КЗ92Е в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99А в іншому; 6) КЗ92Е в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99К в іншому; 7) КЗ920 в одному ланцюзі на додаток до ОЗ99Е в іншому; 8) КЗ920 в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99К в іншому; 9) К4090 та КЗ600 в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99К та

ЕЗ56К в іншому; 10) К4090 та КЗ700 в одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99К та ЕЗ57К в іншому; 11) К4090 та КЗ3920 в одному ланцюзі на додаток до ЮОЗ99К, ЕЗ56К та ЕЗ57К в іншому; 12)

К4090 та К3920 на одному ланцюзі та Ю3З99К на іншому; 13) К4090 та КЗ920 на одному ланцюзі на додаток до ЮОЗ99К та ЕЗ56К на іншому; 14) К4090 та К.3920 на одному ланцюзі на додаток до ЮЗ99К та О0357К на іншому; 15) К4090 та КЗ3700 на одному ланцюзі на додаток до 0399К та О0357К на іншому; 16) 0399К на одному ланцюзі на додаток до К4090О0 та КзЗб6О00 на іншому; та 17) К4090 та К4390 на одному ланцюзі на додаток до ЮЗ3З99К та ЕЗ56К на іншому.

Будь-які із цих змін, що забезпечують гетеродимеризацію, можуть стосуватися важкого ланцюга імуноглобуліну ІДС, що описано в цьому документі.

У цьому документі мається на увазі, що "людське" антитіло або білок являє собою антитіло або білок, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти людини. Людське антитіло або білок можуть бути одержані з використанням будь-яких культивованих клітин, крім клітин людини, або іп мімо у трансгенному організмі, у клітини якого була введена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує людське антитіло або білок. В альтернативному варіанті людське антитіло або білок можуть бути одержані з використанням культивованих клітин людини або з організму людини іп мімо.

У цьому документі мається на увазі, що "антитіло ІДС" являє собою антитіло, яке, по суті, складається з доменів імуноглобуліну, присутніх у більшості антитіл ІдСсСи природного походження, тобто з важкого ланцюга імуноглобуліну, який містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН), перший константний домен важкого ланцюга (СНІ), шарнірну область, другий константний домен важкого ланцюга (СН) та третій константний домен важкого ланцюга (СНЗ), та легкого ланцюга, який містить варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) та константний домен легкого ланцюга (СІ). У науковій літературі повідомляється про численні послідовності таких доменів імуноглобуліну, наприклад, бедиепсев ої Іттипоіодіса! Іпіегевзі, Рибіїс Неайн

Зегмісе, М.І.Н., ВешШезаа, МО, 1991. У цьому документі мається на увазі, що антитіло ЇдСї являє собою тетрамер, що, по суті, складається із двох важких ланцюгів та двох легких ланцюгів. У цьому документі мається на увазі, що антитіла природного походження, які містять два важкі ланцюги імуноглобуліну та які не містять легких ланцюгів, як, наприклад, деякі антитіла, характерні для верблюдів і акул (див., наприклад, МиуЇдегтапз вї аї, 2001, 9. Віоїєсппої. 74:277- 302; Оеєзтуїег єї аї, 2001, 9. Віої. Спет. 276:26285-90; 5ігеїї5ом еї аї. (2005), Ргоївіп 5сівепсе 14: 2901-2909), не є антитілами Іда. Антитіло ЇдСї може являти собою антитіло людини або може належати іншому виду. На додаток до цього, антитіло Ідсї може містити не більш ніж 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 або 5 заміщень, вставок та/або делецій однієї амінокислоти у порівнянні із амінокислотною послідовністю важкого або легкого ланцюгів антитіла Ід: природного

Гс10) походження.

"Важкий ланцюг імуноглобуліну" відноситься до важкого ланцюга антитіл Ідс, ІА, ІМ, ЧЕ або ІдО або їхніх варіантів, що містять не більш ніж 40, 30, 25, 20, 15, 10 або 5 вставок, делецій або заміщень однієї амінокислоти у порівнянні із важким ланцюгом імуноглобуліну, що кодується послідовностями нуклеїнової кислоти природного походження. "Важкий ланцюг імуноглобуліну (Д0" обмежується важкими ланцюгами з антитіл ІдСї або їхніх варіантів, що містять не більш ніж 40, 30, 25, 20, 15, 10 або 5 вставок, делецій або заміщень однієї амінокислоти у порівнянні із важким ланцюгом імуноглобуліну ІдС, що кодується послідовностями нуклеїнової кислоти природного походження. Важкий ланцюг імуноглобуліну, по суті, складається з ряду різних ділянок або доменів, включаючи МН-ділянку, СНІ -ділянку, шарнірну область, СН2-ділянку та СНЗ-ділянку. У деяких інших ізотипах, тобто ДМ та ІдЗА, включені додаткові області за СНЗ-ділянку. Важкі ланцюги та ділянки імуноглобулінів, що входять до їхнього складу, у цілому, описані, наприклад, в Сагауаппороціоз апа Сарга,

Іттиподіориїйпе: бігисішге апа Рипсійоп, рр. 283-314 в Гипдатепіа! Іттипо!оду, 39 Ед, Раші, єд.,

Вамеп Ргевзв5, Мем мок, 1993, який включений у даний документ за допомогою посилання. На додаток до цього, у даній галузі техніки відомі численні послідовності підділянок важких ланцюгів імуноглобуліну. Див., наприклад, Кабаї єї аіЇ, 5едиепсевз ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса

Іпієтевзі, Рибіїс Неайй бегуісе М.І.Н., Веїйезаа, МО, 1991. У деяких випадках поліпептидний ланцюг, який включає важкий ланцюг імуноглобуліну на додаток до деяких послідовностей неімуноглобулінової природи, у цьому документі називається "важким ланцюгом".

У цьому документі мається на увазі, що "легкий ланцюг імуноглобуліну" являє собою каппа- або лямбда- ланцюг з людського антитіла або антитіла, одержаного з інших видів. У цьому документі мається на увазі, що серед легких ланцюгів імуноглобуліну також включені білки з не більш ніж 20, 15, 10 або 5 вставками, делеціями та/або заміщеннями однієї амінокислоти у порівнянні із легсим ланцюгом імуноглобуліну, що кодується послідовностями нуклеїнової кислоти природного походження. Легкі ланцюги імуноглобулінів, у цілому, описані, наприклад, в

Сагауаппороціоз апа Сарга, Іттиподіобиїййп5: Бігисіиге апа Рипсійоп, рр. 283-314 в Гипдатепіаї!

Іттипо!оду, З Ед, Раші, єд., Вамеп Ргез5, Мем МоїК, 1993, який включений у даний документ за допомогою посилання. Легкий ланцюг імуноглобуліну містить Мі -ділянку та Сі -ділянку. У даній галузі техніки відомо багато послідовностей цих ділянок. Див., наприклад, Кабраї єї аї.,

Зо Зедиеєпсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодісаї Іпіегевзі, Рибіїс Неайй 5егуісе М.І.Н., Веїпезаа, МО, 1991.

У деяких випадках поліпептидний ланцюг, який включає легкий ланцюг імуноглобуліну на додаток до деяких послідовностей неімуноглобулінової природи, у цьому документі називається "легким ланцюгом".

У цьому документі мається на увазі, що "варіабельний домен імуноглобуліну" являє собою

МН- або Мі -домен, який може бути людського походження або може належати іншому виду.

Варіабельні домени імуноглобулінів, у цілому, описані, наприклад в Сагауаппороціоз апа Сарга,

Іттиподіориїйпе: Бігисіге апа Рипсійп, рр. 283-314 в Рипдатепіа! Іттипоіоду, 39 Ед, Раші, єд.,

Вамеп Ргев55, Мем/ МоїК, 1993, який включений у даний документ за допомогою посилання. У цьому документі мається на увазі, що серед варіабельних доменів імуноглобулінів також включені білки з не більш ніж 20, 15,10 або 5 вставками, делеціями та/або заміщеннями однієї амінокислоти у порівнянні із варіабельним доменом імуноглобулінів, що кодується послідовностями нуклеїнової кислоти природного походження. Варіабельний домен імуноглобулінів містить три гіперваріабельні ділянки, відомі як ділянка 1, що визначає комплементарність (СОРВ1), ділянка 2, що визначає комплементарність (СОВ2), та ділянка 3, що визначає комплементарність (СОНЗ). Ці ділянки формують антигензв'язуючий сайт антитіла.

СО вбудовані в менш варіабельні каркасні ділянки (ЕН1-ЕВ4). Порядок цих підділянок у межах варіабельного домену представлений нижче: ЕВ1-СОВ1-ЕН2-СОВН2-ЕНЗ-СОВЗ3-ЕН4. У даній галузі техніки відомо багато варіабельних доменів імуноглобулінів. Див., наприклад, Кабаї ї аї.,

Зедиеєпсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї! Іпієгеві, Рибіїс Неайй 5егмісе М.І.Н., Веїйезаа, МО, 1991.

СОВ можуть розташовуватися в послідовності МН-ділянки в такий спосіб. СОВ1 починається із близько 31-го залишку зрілої МН-ділянки та зазвичай має довжину близько 5-7 амінокислот та майже завжди їй передує Суб-Ххх-Ххх-Ххх-Ххх-Ххх-Ххх-Ххх-Ххх (5ЕО ІЮ МО:20) (де "Ххх" являє собою будь-яку амінокислоту). Залишок, що знаходиться за СОВІ важкого ланцюга, майже завжди являє собою триптофан, часто Тгр-Маї, Ттр-Пе або Тгр-Аіа. Чотирнадцять амінокислот майже завжди розташовані між останнім залишком в СОВІ1 та першим в СОН2, ії СОВ2 зазвичай містить від 16 до 19 амінокислот. СОВ2 безпосередньо може передувати І еи-Сс1и-Тгр-Пе-спіу (5ЕО ІЮО МО:21) та безпосередньо за нею може знаходиться І увз/Аг9-Іеш/Пе/Ма/РНпе/Тпг/Аїа-

Тиг/зЗетЛівє/АІа. Інші амінокислоти можуть передувати або знаходиться за СОН2. Тридцять дві амінокислоти майже завжди розташовані між останнім залишком в СОН2 та першим в СОУ, і 60 довжина СОВЗ зазвичай становить від близько З до 25 амінокислот. Субз-Ххх-Ххх майже завжди безпосередньо передує СОВЗ, та Ттр-Сіу-Ххх-Сіу (ЗЕО ІО МО: 22) майже завжди знаходиться за СОВЗ.

СОВА легкого ланцюга можуть бути розташовані в Мі-області в такий спосіб. СОВІ1 починається із близько 24-го залишку зрілого антитіла та майже завжди її довжина становить від близько 10 до 17 залишків. Майже завжди їй передує Сузх. Майже завжди між останнім залишком СОВІ та першим залишком СОН2 розташовано 15 амінокислот, та довжина СОВ2 майже завжди становить 7 залишків. ФСОВ2 звичайно передує Іе-Туг, Ма!-Туг, Пе-І уз або Пе-Рне.

Майже завжди між СОВ2 та СОНЗ розташовано 32 залишки, та довжина СОНВЗ зазвичай становить від 7 до 10 амінокислот. Майже завжди СОНЗ передує Суб, та звичайно за нею знаходиться Рпе-Сспіу-Ххх-Спіу (5ЕО 1О МО:23).

У цьому документі мається на увазі, що "лінкер"- являє собою пептид, який зв'язує два поліпептиди. Довжина лінкера може складати 1-80 амінокислот. У деяких варіантах реалізації винаходу довжина лінкера може складати 2-40, 3-30 або 3-20 амінокислот. У деяких варіантах реалізації винаходу лінкер може являти собою пептид, довжина якого становить не більш ніж 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 або 5 амінокислот. В інших варіантах реалізації винаходу довжина лінкера може складати 5-25, 5-15, 10-20 або 20-30 амінокислот. В інших варіантах реалізації винаходу довжина лінкера може складати близько 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 амінокислот. У багатьох випадках у лінкерах відсутні залишки цистеїну (тобто вони, таким чином, не залучені до утворення дисульфідних зв'язків), та також вони не містять сайтів М-глікозилювання (тобто Авп - Хухх - зЗег/ТНг, де Х може являти собою будь-яку амінокислоту, крім проліну).

У цьому документі мається на увазі, що "пептидне антитіло" являє собою один або декілька біологічно активних пептидів, злитих з Ес-ділянкою. ЗпПітатойю єї ан (2012), тАбз 4(5): 586-591, фрагменти якого, де пояснюється структура пептидного антитіла та як його одержати, включені в даний документ за допомогою посилання.

У цьому документі мається на увазі, що "пептид" являє собою поліпептид, який складається з короткої амінокислотної послідовності, яка може бути або не бути глікозильованою та/або містити модифіковані амінокислоти. Довжина пептиду може складати від 2 до 75 амінокислот. У деяких варіантах реалізації винаходу довжина пептиду становить 3-60, 3-50, 3-40, 3-30 або 3-20 амінокислот. В інших варіантах реалізації винаходу довжина пептиду може складати 5-25, 5-15, 10-20 або 20-30 амінокислот. В інших варіантах реалізації винаходу довжина пептиду може складати близько 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 амінокислот. "Терапевтично ефективна кількість" лікарської речовини, що використовується для лікування захворювання - це кількість, яка може забезпечувати зменшення тяжкості захворювання, зменшення тяжкості одного або декількох симптомів, асоційованих із захворюванням або його лікуванням, або затримувати появу більш важких симптомів або більше тяжкого захворювання, яке може виникати з деякою частотою після лікування захворювання. "Лікування" будь-якого захворювання, зазначеного в цьому документі, охоплює полегшення щонайменше одного симптому захворювання, зменшення тяжкості захворювання, затримку або запобігання розвитку захворювання до більш важких симптомів, які в деяких випадках можуть супроводжувати захворювання або призводити щонайменше до появи ще одного захворювання. Під лікуванням не мається на увазі повне вилікування захворювання. Необхідно, щоб придатний до використання терапевтичний засіб зменшував тяжкість захворювання, одного або декількох симптомів, асоційованих із захворюванням або його лікуванням, або затримувати появу більш важких симптомів або більш тяжкого захворювання, які можуть виникати з деякою частотою після лікування захворювання. Наприклад, якщо захворювання являє собою запальне захворювання кишечнику, терапевтичний засіб, який використовується для лікування, може зменшувати кількість окремих вогнищ запалення в кишечнику або загальний ступінь ураження кишечника. Він може зменшувати біль та/або набряк, зменшувати симптоми, як, наприклад, понос, запор або блювоту, та/або запобігати перфорації кишечнику.

Стан пацієнта можна оцінити за допомогою стандартних методів, таких як рентгеноскопія, яка проводиться після барієвої клізми або субаквального промивання кишечнику, ендоскопія, колоноскопія та біопсія. Вибір підходящого методу буде залежати від стану та симптомів пацієнта. Аналогічним чином, якщо захворювання являє собою системний червоний вовчак (СЧВ), активність захворювання можна оцінити з використанням індексу 5ІЕБАЇ для бальної оцінки, що пояснюється нижче.

Біспецифічні білки, які зв'язуються з ВАР», та В7ВР1

У цьому документі розкриті біспецифічні білки, які зв'язуються з В/ВРІ1 та ВАЕЕ та/або які можуть інгібувати В7В!РІ-опосередковану проліферацію Т-клітин та ВАРЕР-опосередковану проліферацію В-клітин іп міїго. Білки ВАЕЕ та В7ВРІ, з якими зв'язується біспецифічний білок, який описаний у цьому документі, можуть являти собою людські білки або належати іншому виду, як, наприклад, у числі інших яванський макак, макак-резус, шимпанзе, миша та/або кролик. У деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічний білок, який описаний у цьому документі, наприклад, може зв'язуватися з білками В/7ВРІ1 та ВАЕЕ як людини (Ното зарієпв), так і яванського макака (Масаса Газсісціагів).

У деяких варіантах реалізації винаходу ці біспецифічні білки можуть являти собою біспецифічні антитіла Ідс, у яких кожна В7ВРІ1 -зв'язуюча ділянка та ВАЕРЕ-зв'язуюча ділянка, по суті, складається з важкого ланцюга імуноглобуліну (ДС та легкого ланцюга імуноглобуліну.

Отже, таке біспецифічне антитіло містить два різні важкі ланцюги імуноглобуліну та два різні легкі ланцюги імуноглобуліну. У цілому, ці дві пари важкого та легкого ланцюгів імуноглобуліну формують повне біспецифічне антитіло ІДС. Біспецифічні антитіла ІЇдс відомі в даній галузі техніки та також відомий цілий ряд інших форм біспецифічних антитіл. Див., наприклад,

Копієеттапп, Вівресіїїс Апіїбодіеєв: ОемеІортепів апа Ситепі Регзресіїмев, рр. 1-28 іп Візресіїїс

Апііродієз, Копієптапп, єд., Зргіпдег-Мепая, Вепіп, НеїдеІрига, 2011, у фрагментах якого описані такі антитіла та який включений у даний документ за допомогою посилання. У цьому винаході передбачене застосування антитіл, які можуть зв'язуватися з ВАЕЕ та В7ВРІ незалежно від форми. Біспецифічні антитіла Їдсї можуть бути людськими, гуманізованими або химерними та можуть належати до ізотипу ІДС, Ід, ІДИЗ або Ідс4. У деяких варіантах реалізації винаходу біспецифічні антитіла ІдСс можуть бути кон'юговані з іншими групами. Амінокислотні послідовності антитіл до ВАЕЕ та В7ВРІ відомі в даній галузі техніки. Дме., наприклад, патент

США 7737111 та публікацію заявки на патент США 2011/0117093. Фрагменти цих документів, у яких описані такі антитіла, включені в даний документ за допомогою посилання. У деяких варіантах реалізації винаходу в таких біспецифічних антитілах можуть відбуватися "зміни, що забезпечують гетеродимеризацію", які були описані вище, включаючи парні заміщення зі зміною заряду, які сприяють утворенню гетеротетрамерного біспецифічного антитіла Ід.

В інших варіантах реалізації винаходу біспецифічні білки, описані в цьому документі, можуть являти собою злиті білки, що містять антитіло, яке зв'язується з В/ВРІ, що містить важкий ланцюг імуноглобуліну Іда і легкий ланцюг імуноглобуліну, та пептид, який зв'язується з ВАЕЕ.

ВАРРЕ-зв'язуючий пептид може бути присутнім в одній або декількох копіях, як, наприклад, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми або аж до 16 копій. ВАРЕ-зв'язуючий пептид може зв'язуватися з ВАЕЕ-білюами, що належать видам, таким як миша, яванський макак та/або людина серед багатьох інших можливих видів. Антитіло може являти собою антитіло ІДС до

В7ВРІ, необов'язково людське або гуманізоване антитіло, яке зв'язується з В/ВР1І людини та/або яванського макака. У деяких варіантах реалізації винаходу до С-кінця важкого ланцюга антитіла Ії до В/ВРІ може бути приєднаний лінкер з наступним першим ВАРЕЕ-зв'язуючим пептидом, іншим лінкером та другим ВАЕРЕ-зв'язуючим пептидом. За цими двома пептидами можуть знаходиться чотири, п'ять, шість, сім, вісім або аж до шістнадцяти ВАЕРЕ-зв'язуючих пептидів, що необов'язково перемежовуються лінкерами. В альтернативному варіанті або на додаток до цього, один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім або вісім ВАРЕ-зв'язуючих пептидів можуть бути вбудовані на іншій ділянці в антитілі до В7/ВРІ, наприклад, на М-кінці важкого ланцюга імуноглобуліну або легкого ланцюга імуноглобуліну, або в петельній області в СН2- або СНЗ-ділянці. Антитіло (ІД може являти собою антитіло ссавців, як, наприклад, антитіло людини або миші. Антитіло до В/АРІ може являти собою людське або гуманизоване антитіло

ЧИ, ІдсСег, ДСЗ або Ідсаі. У таких біспецифічних злитих білках, що містять антитіло ІДС до

В7ВРІ, біспецифічний білок може містити важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮ МО:17 або 5ЕО ІО МО:18, та легкий ланцюг імуноглобуліну, який має амінокислотну

БО послідовність 5ЕСО І МО:19. Передбачені варіанти, що містять важкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, що містить не більш ніж 30, 25, 20, 15, 10, 5 або З вставки, делеції або заміщення однієї амінокислоти у порівнянні із БЕО ІЮО МО: 17 або 18. Аналогічним чином передбачені варіанти, що містять легкий ланцюг імуноглобуліну, який має амінокислотну послідовність, що містить не більше 20, 15, 10, 8, 7, 5 або З вставок, делецій або заміщень однієї амінокислоти у порівнянні із ФЕО ІЮ МО: 19. Такі біспецифічні білки можуть являти собою тетрамери, що містять два поліпептиди, які мають амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО: 17 або 18 або її варіант, та два легкі ланцюги, які мають амінокислотну послідовність ХЕ 1О МО:19 або її варіант.

ВАРРЕ-зв'язуюча ділянка біспецифічного злитого білка, який описаний вище, може мати бо амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮО МО:2 або 5ЕО ІО МО:3. Такі ВАЕР-зв'язуючі пептиди описані в патенті США 7737111, відповідні фрагменти якого включені в даний документ за допомогою посилання. У деяких варіантах реалізації винаходу в біспецифічному білці можуть бути присутні одна, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять або шістнадцять копій такого ВАЕРЕ- зв'язуючого пептиду. ВАЕРЕ-зв'язуючий пептид може бути приєднаний до карбоксильного кінця антитіла до В/ВРІ, наприклад, через лінкер. Наприклад, за карбоксильним кінцем антитіла Ідс до В7ВРІ1 може знаходиться лінкер, який має, наприклад, амінокислотну послідовність Спу-Спу-

Спіу-Сіу (ЗЕО ІО МО:4). Приклади інших підходящих лінкерів серед багатьох інших включають

Сіу-сту, спу-стіу-сту, Спу-сПу-Сту-зег (ЗЕО 10 МО:37), Сіу-Сту-сіу-Рго (5ЕО ІЮ МО:38), Спу-Сс1у- счіу-Сіип (5БО 10 МО:39) та спу-с'ту-сіІу-сіу-сіу (5ЕО 0 МО:40). За цим лінкером може знаходиться ВАЕЕ-зв'язуючий пептид. За ВАРЕ-зв'язуючим пептидом може знаходиться інший лінкер, який має, наприклад, амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:5, 5ЕО І МО:6, 5ЕО І

МО:7 або 5ЕО ІЮ МО:24. Також може бути використаний інший лінкер. За цим лінкером може знаходиться інший ВАЕРЕ-зв'язуючий пептид, який має, наприклад, амінокислотну послідовність

ЗЕО ІЮ МО.

У біспецифічних злитих білках, описаних безпосередньо вище, або в біспецифічних гетеротетрамерних антитілах С, описаних вище, Мі -ділянка може містити СОВІ, СОВ2 та

СОРЗ, які мають амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІЮ МО:9 та 5ЕО ІЮ МО:10, відповідно. СОВІ, СОВ2 та СОВЗ МН-ділянки можуть містити амінокислотні послідовності ФЕС

ІО МО:11, 5ЕО ІО МО:12 та 5ЕО ІО МО:13, відповідно. У деяких варіантах реалізації винаходу

МІ-ділянка антитіла ІД може містити амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:14 або її варіант, і МН-ділянка може містити амінокислотну послідовність 5ЕО І МО:15 або її варіант. Такі варіанти послідовностей можуть містити не більше 10 делецій, вставок і заміщень однієї амінокислоти на 100 амінокислот у порівнянні із еталонною послідовністю.

Білки, що містять лінкер

У цьому винаході запропоновані лінкери, що мають амінокислотні послідовності 5ЕО ІЮ

МО:5, 6 або 7, які надають білку, який їх містить, задовільні фізичні властивості. Як показано в прикладі 1 нижче, застосування двох конкретних лінкерів, тобто лінкерів, що мають амінокислотні послідовності ФЕО ІЮ МО:б та 5ЕО ІО МО;:7, позитивно впливає на властивості,

Зо такі як експресія, стабільність та в'язкість біспецифічної молекули. Отже, цілий ряд білків, що містять ці лінкери, можуть мати задовільні властивості у порівнянні із подібними білками, що містять інші лінкери.

Застосування біспецифічних білків у терапевтичних цілях

Описані в цьому документі біспецифічні білки, що зв'язуються з ВАЕЕ та В7ВРРІ, можуть бути використані в якості терапевтичних засобів для лікування при цілому ряді показань, особливо станів, викликаних аутоантитілами, та/або станів, опосередкованих як Т-клітинами, так і В-клітинами. Такі стани включають, наприклад, СЧВ, вовчаковий нефрит, АМСА- позитивний васкуліт, ревматоїдний артрит (РА), дерматоміозит, поліміозит, захворювання шлунково-кишкового тракту, такі як хвороба Крона, виразковий коліт та целіакія, захворювання шкіри, такі як пухирчатка, пемфігоїд та підгострий шкірний червоний вовчак (ПШЧВ), захворювання нервової системи, такі як розсіяний склероз та хронічна запальна демієлінізуюча полінейропатія (ХЗДП), нервово-м'язові захворювання, такі як міастенія гравіс, захворювання, що вражають нирки, такі як синдром Гудпасчера, гломерулонефрит, гематологічні захворювання, такі як автоїмунна гемолітична анемія (АГА), ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ІТП) та автоїмунна нейтропенія, захворювання печінки, такі як хронічний активний гепатит, первинний біліарний цироз печінки, синдром Шегрена, системний склероз, та захворювання ендокринної системи, такі як тиреоїдит Хашимото, хвороба Грейвса, хвороба

Аддісона та множинна ендокринна неоплазія (МЕН) (що зазвичай включають види цукрового діабету, гіпотиреоз, хворобу Аддісона та гонадну дисфункцію). Пацієнтові, що страждає від кожного із цих захворювань, з лікувальною метою можна вводити терапевтично ефективну кількість описаного в цьому документі біспецифічного білка.

В одному варіанті реалізації винаходу біспецифічний білок, який може інгібувати ВАЕРЕ- опосередковану проліферацію В-клітин та В/АРІ-опосередковану проліферацію Т-клітин, може бути використаний для лікування пацієнта, що страждає від СЧВ. СЧВ являє собою автоіїмунне захворювання невідомої етіології, що відрізняється аутореактивністю на ядерні аутоантигени.

Воно характеризується такими різними клінічними проявами, що виникає питання, чи дійсно це одне захворювання, чи це група споріднених станів. Коїгіп (1996) бЗузієтіс Іпри5 егутетаїйо5ив.

Сеї! 85: 303-306; Вантап апа Ізепрегу (2008), Зузієтіс Іприв егуїпета!йозив. М Епаді У Мед. 358: 929-939. Симптоми можуть включати наступні: системні симптоми, такі як дискомфорт, бо стомлюваність, гарячка, відсутність апетиту та втрата маси тіла; різноманітні шкірні симптоми,

що включають гострий, тимчасовий висип на обличчі у дорослих, бульозне захворювання та хронічний спотворюючий висип на голові та шиї; артрит; м'язовий біль та/або слабкість; сердечно-судинні симптоми, такі як потовщення мітрального клапана серця, вегетації, регургітація, стеноз, перикардит та ішемічна хвороба серця, деякі з яких можуть завершуватися інсультом, емболічним інфарктом, серцевою недостатністю, інфекційним ендокардитом або недостатністю клапанів; нефрит, який є основною причиною смертності при СЧВ; неврологічні симптоми, що включають когнітивну дисфункцію, депресію, психоз, кому, епілептичні припадки, мігрень та інші синдроми, що викликають головний біль, асептичний менінгіт, хорею, інсульт та нейропатію черепних нервів; гематологічні Симптоми, що включають лейкопенію, тромбоцитопенію, серозит, анемію, порушення згортуваності крові, спленомегалію та лімфаденопатію; і різні порушення шлунково-кишкового тракту. Ід; Мгаїзапов еї аї., "Зувієетіс

Гирив Егуїпетаїйозив, " Спарієї 39 в батіег5 Іттипо!іодіса! Оізеазев, б" Еайіоп, А!йвівп 6ї аї., еадв., ГПірріпсой УМ Шіатв 4 УМІКіп5, Рпіаде!рніа, РА, 2001. Тяжкість симптомів широко варіює, як і перебіг захворювання. СЧВ може призводити до летального кінця.

Пацієнта, хворого на СЧВ, можна лікувати за допомогою біспецифічного білка, який інгібує

ВАЕЕ та В7ВРІ, до, після та разом з лікуванням за допомогою існуючої терапії для СЧВ. Такі існуючі препарати для лікування СЧВ включають кортикостероїди, такі як преднізон, преднізолон та метилпреднізолон, протималярійні засоби, такі як гідроксихлорохін, квінакрин та хлорохін, ретиноєва кислота, аспірин та інші нестероїдні протизапальні засоби (НПЗ3), циклофосфамід, дегідроепіандростерон, мофетила мікофенолят, азатіоприн, хлорамбуцил, метотрексат, такролімус, дапсон, талідомід, лефлуномід, циклоспорин, белімумаб, антитіла до

СО20, такі як ритуксимаб, та злиті білки, такі як абатацепт.

Активність захворювання в пацієнтів, хворих на СЧВ, можна розрахувати за допомогою індексу активності системного червоного вовчака (5 ЕСАЇ), який являє собою показник активності захворювання, що враховує наступні симптоми, які зважуються відповідно до тяжкості захворювання: епілептичні припадки, психоз, органічний мозковий синдром, порушення зору, розлад черепно-мозкових нервів, головний біль, викликаний системним червоним вовчаком, васкуліт, артрит, міозит, циліндри в сечі, гематурія, протеїнурія, піурія, новий висип, алопеція, виразки слизової оболонки, плеврит, перикардит, низький вміст комплементу,

Зо підвищене зв'язування ДНК, гарячка, тромбоцитопенія та лейкопенія. Вотбагаїег єї аї. (1992),

Ай. 4 АПпецйт. З35(6): 630-640, відповідні фрагменти якого включені в даний документ за допомогою посилання. Види лікування, описані в цьому документі, можуть бути придатними до використання для ослаблення або усунення симптомів СЧВ, які визначають за 5ІЕБАЇ.

Способи лікування, описані в цьому документі, можуть сприяти поліпшенню показника 5І ЕБАЇ для пацієнта у порівнянні із вихідним значенням, характерним для того ж пацієнта до початку лікування за допомогою біспецифічного білка, який описаний у цьому документі.

Іншим способом оцінки активності захворювання при СЧВ є індекс Британської групи по вивченню системного червоного вовчака (ВІГ АС), який являє собою систему оцінки активності захворювання для пацієнтів, хворих на СЧВ, виходячи з намірів лікаря для проведення лікування. ОЇ єї а). (1996), Апп. АНеит бів. 55: 756-760; Нау еї а. (1993), 0). ). Мед. 86: 447- 458. Фрагменти цих літературних джерел, у яких описаний ВІ! АС, включені в даний документ за допомогою посилання. Показник ВІ Асі визначають шляхом присвоювання окремих числових або буквених балів для визначення активності захворювання в кожній з восьми систем органів, включаючи загальні (як, наприклад, гарячка та стомлюваність), шкірно-слизові (як, наприклад, висип та алопеція, окрім багатьох інших симптомів), неврологічні (як, наприклад, епілептичні припадки, мігренозні головні болі та психоз, окрім багатьох інших симптомів), скелетно-м'язові (як, наприклад, артрит), кардіореспіраторні (як, наприклад, серцева недостатність та ослаблена функція легенів), васкуліт та тромбоз, ниркові (як, наприклад, нефрит) та гематологічні прояви.

Ід. Види лікування, описані в цьому документі, можуть бути придатними до використання для

БО ослаблення або усунення симптомів СЧВ, які визначають за індексом ВІЇАС, або для зменшення показника ВІЇ Ас, одержаного для пацієнта, у порівнянні із вихідним значенням, характерним для того ж пацієнта до початку лікування за допомогою біспецифічного білка, який описаний у цьому документі.

Біспецифічний білок, який описаний у цьому документі, який інгібує ВАЕЕР-опосередковану проліферацію В-клітин людини та В7/ВРІ -опосередковану проліферацію Т-клітин людини, також може бути використаний для лікування ревматоїдного артриту (РА). РА являє собою хронічне захворювання із системними проявами, а також проявами, асоційованими конкретно із суглобами. Прояви звичайно включають синовіт, що призводить до болю в суглобах та припухлості суглобів, і різні відхилення лабораторних показників від норми, як, наприклад, бо підвищення вище норми рівнів ревматоїдного фактора, антитіл до цитрулін-модифікованого білка (антитіла до ССР) та С-реактивного білка (СВР) і підвищення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ). Прояви, що рідше зустрічаються, включають різні несуглобні прояви, при яких уражені, наприклад, сухожилля, зв'язки, кровоносні судини, серце та легені. Активність захворювання часто можна визначити за багатьма показниками. Див., наприклад, Апаегзоп єї а!. (2012), АпНтйі5 саге 8 Вев. 64 (5): 640-647, у фрагментах яких обговорюються такі показники, включені в даний документ за допомогою посилання. Елементами таких оцінювальних індексів є число хворобливих суглобів, число припухлих суглобів, функціональна оцінка та різні дані лабораторних досліджень, як, наприклад, СВР, ШОЕ і т.д.

У деяких варіантах реалізації винаходу пацієнта, що страждає від РА, можна лікувати за допомогою біспецифічного білка, який інгібує ВАЕЕ-опосередковану проліферацію В-клітин та

В7АРІ-опосередковану проліферацію Т-клітин, до, після та разом з лікуванням за допомогою існуючих лікарських речовин, які застосовуються у даний час для лікування РА. Терапевтичні засоби, які застосовуються у даний час для лікування ревматоїдного артриту (РА), включають у числі інших нестероїдні протизапальні засоби (НПЗЗ) (такі як аспірин, інгібітори циклооксигенази-2 (СОХ-2)), хворобо-модифікуючі антиревматичні препарати (ХМАРП, такі як метотрексат, лефлуномід та сульфасалазин), протималярійні засоби (такі як гідроксихлорохін), циклофосфамід, О-пеніциламін, азатіоприн, солі золота, інгібітори фактора некрозу пухлини (такі як етанерцепт, інфліксимаб, адалімумаб, голімумаб та цертолізумаб пегол), інгібітори

СО20, такі як ритуксимаб, антагоністи ІЛ-1, такі як анакінра, інгібітори ІЛ-б, такі як тоцилізумаб, інгібітори Янус-кіназ (АК, такі як тофацитиніб), абатацепт та кортикостероїди.

Терапевтично ефективна кількість біспецифічного білка, який описаний у цьому документі, який інгібує ВАЕР-опосередковану проліферацію В-клітин людини та В7ВРІ1-опосередковану проліферацію Т-клітин людини, також може бути використана для лікування запального захворювання кишечнику, як, наприклад, хвороби Крона або виразкового коліту. Хвороба Крона характеризується хронічним запаленням будь-якої ділянки травного тракту від ротової порожнини до анального отвору, хоча у більшості пацієнтів таке запалення обмежене ілеоцекальною ділянкою, ділянкою тонкої кишки та ділянкою ободової та прямої кишок.

Звичайно запалення - це переривчастий процес. Загальні симптоми включають біль у ділянці живота, відсутність апетиту та втрату маси тіла, гарячку, здуття живота та/або хворобливість у

Зо правій нижній частині черевної порожнини, запор, блювоту та перианальний дискомфорт і виділення. Інші можливі прояви включають у числі інших периферійний артрит, затримку росту, епісклерит, афтозний стоматит, вузлувату еритему, гангренозну пріодермію, камені в нирках, порушення процесів розведення сечі та підлужування сечі, малабсорбцію та камені в жовчному міхурі. Див., наприклад, 5ігобег єї а!., Медіса! Іттипоїоду, 10 Еайіоп, бесійоп ПІ, Сп. 35 (2001);

Мегск Мапиаї! ої Оіадповзіз апа Тнегару, 17" Едйоп, бесійоп З, Сп. 31 (1999). Макрофаги, виділені із крові пацієнтів із хворобою Крона, продукують підвищену кількість ІЛ-12, ІФН-у, ФНП-а та інших прозапальних цитокінів.

Незважаючи на те, що виразковий коліт іноді складно відрізнити від хвороби Крона, він відрізняється від хвороби Крона в декількох відношеннях. По-перше, він, у цілому, обмежується товстою кишкою, тоді як хвороба Крона може вражати весь травний тракт. По-друге, виразковий коліт, в основному, характеризується тільки запаленням поверхневих шарів кишечнику, на відміну від хвороби Крона, при якій запальний процес може вражати всі шари стінки кишечнику або іншу ділянку травного тракту. | нарешті, виразковий коліт звичайно характеризується суцільною ділянкою запалення, а не переривчастими вогнищами запалення, характерними для хвороби Крона. Подібно хвороби Крона виразковий коліт головним чином зустрічається в міській місцевості. Крім того, зрозуміло, що в розвитку виразкового коліту деяку роль відіграють генетичні фактори, оскільки існує сімейне накопичення випадків захворювання. Наявність аутоантитіл спостерігається частіше в пацієнтів з виразковий колітом, ніж в пацієнтів із хворобою Крона. Аутоантитіла часто спрямовані проти компонентів епітеліальних клітин ободової кишки. Найпоширенішими є антитіла до цитоплазми нейтрофілів, що володіють специфічністю до каталази, с-енолази та лактоферину. У деяких випадках такі антитіла перехресно реагують із мікроорганізмами ободової кишки.

У клінічних випробуваннях активність хвороби Крона часто оцінюють із використанням індексу активності хвороби Крона (СОАЇ). СОАЇ являє собою показник активності захворювання, що враховує вісім факторів, включаючи (1) частоту рідкого або кашкоподібного стільця в день, (2) оцінку пацієнтом частоти приступів болю в животі в день, (3) оцінку пацієнтом загального самопочуття, (4) повідомлення пацієнта про інші прояви, включаючи артрит, ірит, увеїт, вузлувату еритему, гангренозну пріодермію, афтозний стоматит, анальну тріщину, свищ або абсцес, інший свищ або гарячку, (5) повідомлення пацієнта про приймання ломотила або інших бо опіатів від поносу, (б) абдомінальну масу, (7) гематокритне число та (8) масу тіла. Див,

наприклад, Везі еї а!. (1976), Савзітоеєпієгої!. 70: 439-444, відповідні фрагменти якого включені в даний документ за допомогою посилання.

Симптоми виразкового коліту різноманітні. До них можуть відноситися блідість, нудота, блювота, діарея, біль у животі, головний біль, запаморочення, біль в очах, погіршення зору, звуження або розширення зіниць, сльозовиділення, слиновиділення, пітливість та сплутаність свідомості. Токсичний мегаколон, потенційний стан, небезпечний для життя, при якому товста кишка розширена на величину близько б сантиметрів та може втратити м'язовий тонус та/або також може трапитися перфорація. Інші симптоми, які можуть супроводжувати виразковий коліт, включають периферійний артрит, анкілозуючий спондиліт, сакроілеїт, передній увеїт, вузлувату еритему, гангренозну пріодермію, епісклерит, автоїмунний гепатит, первинний склерозуючий холангіт, цироз та сповільнений ріст і розвиток у дітей.

У деяких варіантах реалізації винаходу пацієнта, що страждає від запального захворювання кишечнику (З3З3К), як, наприклад, хвороба Крона або виразковий коліт, можна лікувати за допомогою біспецифічного білка, який зв'язується з ВАЕЕ та В7ВРІ, до, після та разом з лікуванням за допомогою існуючої терапії для ЗЗ3К. Існуючі терапевтичні засоби для ЗЗК включають, наприклад, сульфасалазин, 5-аміносаліцилову кислоту та її похідні (такі як олсалазин, балсалазид та месаламін), антитіла до ФНП (включаючи інфліксимаб, адалімумаб, голімумаб, цертолізумаб пегол), кортикостероїди для перорального або парентерального застосування (включаючи преднізон, метилпреднізон, будесонід або гідрокортизон), адренокортикотропний гормон, антибіотики (включаючи метронідазол, ципрофлоксацин або рифаксимін), азатіоприн, б-меркаптопурин, метотрексат, циклоспорин, такролімус та талідомід.

Нуклеїнові кислоти, що кодують біспецифічні білки

У цьому винаході запропоновані нуклеїнові кислоти, що кодують біспецифічний білок, який може інгібувати В7ВРІ -опосередковану проліферацію Т-клітин та ВАЕР-опосередковану проліферацію В-клітин. Наприклад, 5ЕО ІЮ МО:52 кодує МІ -ділянку, яка має амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮ МО:14, та 5ЕО ІЮ МО:53 кодує МН-ділянку, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:15. Аналогічним чином 5ЕО ІЮ МО:55 та 56 кодують амінокислотні послідовності 560 І МО:17 та 18, відповідно, які являють собою поліпептиди, що містять важкий ланцюг антитіла до В7ВРІ, злитий із двома ВАРЕ-зв'язуючими пептидами. 5ЕО І

МО:57 кодує легкий ланцюг антитіла до В7/ВРІ, яке може входити до складу гетеротетрамерного біспецифічного антитіла Ідсї або біспецифічного злитого білка, які описані вище. Передбачена будь-яка амінокислотна послідовність, яка кодує будь-яку амінокислотну послідовність, запропоновану в цьому документі. Аналогічним чином варіанти нуклеотидних послідовностей, що включають мовчазні мутації, у порівнянні із послідовностями, розкритими в цьому документі, або, що кодують варіанти амінокислотних послідовностей, описані вище, також включені в об'єм даного винаходу. Більш конкретно, передбачені нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, які відрізняються не більше ніж на 10 вставок, делецій або заміщень однієї амінокислоти на 100 амінокислот від амінокислотних послідовностей, розкритих у цьому документі.

Послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують біспецифічні білки, розкриті в цьому документі, зможе визначити фахівець у даній галузі техніки на підставі амінокислотних послідовностей, запропонованих у цьому документі, та знань, доступних у даній галузі техніки.

Крім більш традиційних способів одержання сегментів клонованої ДНК, яка кодує конкретну амінокислотну послідовність, компанії, такі як ОМА 2.0 (Менло-Парк, Каліфорнія, США) та

ВінеНеюп (Ботелл, Вашингтон, США) у числі інших у цей час регулярно виробляють одержані шляхом хімічного синтезу ДНК, що мають розмір гена, будь-якої бажаної послідовності під замовлення, отже, оптимізуючи процес виробництва таких ДНК. Частоту використання кодону можна підібрати таким чином, щоб оптимізувати експресію в переважній системі.

Способи одержання біспецифичних білків, які зв'язуються з ВАЕЕта В7ВРІ1

Нуклеїнові кислоти, що кодують біспецифічні білки, описані в цьому документі, можуть бути вбудовані у вектори, що підходять для клітини-хазяїна, у якій нуклеїнова кислота буде експресована. Ці нуклеїнові кислоти можуть бути введені в клітини-хазяї за допомогою будь- яких способів, добре відомих у даній галузі техніки. Клітини-хазяї, які можна використовувати, включають бактерії, включаючи ЕзсНегісніа соїї, дріжджі, включаючи ЗассНаготусев сегемівіа або Рісніа равіогі5, клітини комах, включаючи клітини Зродорієга Ігидірегаа, рослинні клітини та клітини ссавців, включаючи, серед іншого, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини нирок новонародженого хом'ячка (ВНК), клітини нирок мавп, Неїа клітини, клітини гепатоклітинної карциноми людини та клітини 293. Ці клітини-хазяї можна культивувати в умовах, які забезпечують експресію введених нуклеїнових кислот, та біспецифічний білок можна 60 виділити з культурального супернатанта або клітинної маси.

Як правило, вибір методу, який використовують для введення нуклеїнових кислот у клітини- хазяї, може залежати від клітини-хазяїна, у яку необхідно ввести нуклеїнові кислоти. Способи введення нуклеїнових кислот у клітини бактерій добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, широко використовується електропорація або трансформація за допомогою обробки хлоридом кальцію. Способи введення нуклеїнових кислот у клітини дріжджів також добре відомі в даній галузі техніки та включають, наприклад, способи трансформації з використанням ацетату літію та поліетиленгліколю. Способи введення гетерологічних полінуклеотидів у клітини ссавців добре відомі в даній галузі техніки та включають, у тому числі, декстран-опосередковану трансфекцію, осадження фосфатом кальцію, полібрен-опосередковану трансфекцію, злиття протопластів, електропорацію, інкапсуляцію полінуклеотиду (полінуклеотидів) у ліпосоми та безпосередню мікроін'єкцію ДНК у ядра.

Експресуючі вектори, що використовуються в будь-яких клітинах-хазяїнах, можуть містити послідовності, необхідні для реплікації ДНК, селекції клітин-хазяїв, що містять вектор, та експресії екзогенних нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності зазвичай можуть включати одну або декілька із наступних нуклеотидних послідовностей: промотор, одну або декілька послідовностей енхансеру, точку початку реплікації, послідовність для термінації транскрипції, повну послідовність інтрону, що містить донорні та акцепторні сайти сплайсингу, послідовність, яка кодує лідерну послідовність для секреції поліпептидів, сайт зв'язування рибосом, послідовність для поліаденілування, полілінкерну ділянку для вбудовування нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, який необхідно експресувати, та селектуючий маркерний елемент. У даній галузі техніки відомі та комерційно доступні численні експресуючі вектори для експресії в різних клітинах-хазяїнах.

Фармацевтичні композиції, дозування та способи введення

У цьому винаході запропоновані фармацевтичні композиції, що містять біспецифічні білки, описані в цьому документі. Такі композиції можуть містити терапевтично ефективну кількість біспецифічного білка з одним або декількома додатковими компонентами, такими як фізіологічно прийнятний носій, допоміжна речовина або розріджувач. Приклади наповнювачів, які використовуються, також включають консерванти, буферні розчини та інші регулятори рівня рН, регулятори тонічності, поверхнево-активні речовини, антиоксиданти, а також хелатуючі агенти. Багато з таких додаткових компонентів описані, наприклад, в Нетіпдіоп'є Рнаптасешісаї

Зсієпсев, 18" Едйіоп, (А.В. Сеппаго, єд.), 1990, Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, відповідні фрагменти якого включені в даний документ за допомогою посилання.

Дозування описаних у цьому документі біспецифічних білків можна підібрати з метою досягнення бажаного ефекту. У багатьох випадках буде потрібно введення повторної дози через хронічну природу захворювання, з призводу якого проводиться лікування. Наприклад, описаний у цьому документі біспецифічний білок можна вводити два рази в тиждень, один раз у тиждень, один раз у два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або десять тижнів або один раз кожні два, три, чотири, п'ять або шість місяців. Кількість біспецифічного білка для введення щодоби може складати від близько 0,0036 мг до близько 700 мг. В альтернативному варіанті реалізації винаходу дозування можна підібрати відповідно до встановленої площі шкіри пацієнта, та кількість кожного дозування може складати від близько 0,002 мкг/м2? до близько 350 мг/м. В іншому альтернативному варіанті реалізації винаходу дозування можна підібрати відповідно до маси тіла пацієнта, та кількість кожного дозування може складати від 0,000051 мг/кг до близько 10,0 мг/кг.

Біспецифічні білки або фармацевтичні композиції, що містять ці молекули, можна вводити будь-яким підходящим способом. Терапевтичні засоби, які містять білок, звичайно вводять парентеральним шляхом, наприклад, за допомогою ін'єкції, оскільки пероральний прийом за відсутності деяких спеціальних лікарських форм або умов буде призводити до гідролізу білка в кислому середовищі шлунка. Можливими шляхами введення є підшкірна, внутрішньом'язова, внутрішньовенна, внутрішньоартеріальна, внутрішньоосередкова та внутрішньочеревна болюсні ін'єкції. Біспецифічні білюи також можуть вводитися за допомогою інфузії, наприклад, внутрішньовенної або підшкірної інфузії. Також можна використовувати місцеве застосування у випадку захворювань, що вражають шкіру. В альтернативному варіанті реалізації винаходу біспецифічні білки можуть прийматися через контакт зі слизовою оболонкою, наприклад, шляхом інтраназального, сублінгвального або ректального застосування або застосування в якості засобу для інгаляції. В альтернативному варіанті реалізації винаходу певні відповідні фармацевтичні композиції, що містять біспецифічний білок, можуть прийматися перорально.

Після загального опису винаходу, наведеного вище, приклади, що знаходяться нижче, наведені з метою ілюстрації та не призначені для обмеження винаходу. (510) ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Конструювання та випробування біспецифічної молекули ВАЕР/В7ВРІ для терапевтичного використання при лікуванні людей

Метою цієї серії експериментів було виявлення біспецифічної молекули, яка (1) інгібує

ВАРЕР-опосередковану проліферацію В-клітин та В/АРІ1-опосередковану проліферацію Т-клітин, (2) є високоактивною в біологічних аналізах та (3) має задовільні біофізичні властивості. На фіг. 1 проілюстрований цілий ряд схематичних зображень для злиття пептиду, який зв'язує ВАЕЕ людини з антитілом (ДСь до В7ВРІ людини (антитіло до пиВ7ВРІ). Послідовність ВАЕЕ- зв'язуючого пептиду наведена в 5ЕО ІЮО МО:1, та послідовності важкого та легкого ланцюгів антитіла до пПиВ7ВР наведені в 5ЕО 10 МО:25 та 5ЕО І МО.19, відповідно.

Для визначення того, яка структура має найкращі біофізичні властивості зі збереженням біологічної активності, були одержані та досліджені біспецифічні молекули, проілюстровані на фіг. 1. В одній конструкції дві тандемні копії ВАЕРЕ-зв'язуючого пептиду із проміжним лінкером

Слінкер 1К", який має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:24) були злиті з М-кінцем або важкого ланцюга імуноглобуліну (Р71617), або легкого ланцюга (Р71618) антитіла до пиВ7ВРІ1.

Див. фіг. 1. Амінокислотна послідовність важкого ланцюга Р71617 наведена в 5ЕО ІЮ МО:26, і амінокислотна послідовність легкого ланцюга Р7/1617 є такою ж, як і амінокислотна послідовність легкого ланцюга антитіла до пиВ/ВРІ (5ЕО ІЮ МО:19). Амінокислотна послідовність легкого ланцюга Р71618 наведена в 5ЕО ІО МО:27, і амінокислотна послідовність важкого ланцюга Р71618 є такою ж, як і амінокислотна послідовність легкого ланцюга антитіла до пиВ7ВРІ (ЗЕО ІО МО:25). Дві тандемні копії ВАЕЕ-зв'язуючого пептиду також були злиті з С- кінцем важкого ланцюга антитіла до пиВ7ВРІ (який має амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ

МО:25) з використанням або зазначеного вище лінкера ї1К (який має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:24; Р71619), або лінкера 5Х(Сс45) (5ЕО ІЮО МО:71) між двома ВАЕЕ- зв'язуючими пептидами (Р71620). Амінокислотні послідовності важких ланцюгів цих двох злитих конструкцій наведені в 5ЕО ІЮ МО:16 (Р71619) та 5ЕО ІЮ МОС28 (Р71620). У конструкції Р71621 дві тандемні копії ВАЕЕ-зв'язуючого пептиду із проміжним лінкером 1К були вбудовані в СНЗ- домен антитіла між залишками 358 та 359 амінокислотної послідовності 5ЕО 10 МО:25 (амінокислотна послідовність важкого ланцюга антитіла до пиВ7ВРІ). Послідовність важкого ланцюга конструкції Р/1621 наведена в 5ЕО ІЮО МО:29. У конструкції Р/1622 ВАЕР-зв'язуючий пептид був вбудований в СНЗ-домен важкого ланцюга антитіла до пиВ7ВРІ (між залишками 358 та 359 5ЕО ІЮО МО:25, і друга копія ВАЕР-зв'язуючого пептиду була злита з С-кінцем важкого ланцюга. Амінокислотна послідовність важкого ланцюга Р71622 наведена в 5ЕО ІЮО МО:30. У конструкції Р7У1623 один ВАРЕЕ-зв'язуючий пептид був вбудований в СНео-ділянку (між залишками 268 та 269 5ЕО ІЮО МО:25), і другий ВАЕРЕ-зв'язуючий пептид був вбудований в СНЗ- ділянку (між залишками 358 та 359 5ЕО ІЮ МО:25). БЕО ІО МО:31 являє собою амінокислотну послідовність важкого ланцюга Р71623. Усі конструкції Р/1619-Р71623 мають легкий ланцюг антитіла до пиВв7АРІ (ЗЕО 10 МО:19).

У конструкціях Р7/4293 та Р74294 був модифікований лінкер між двома тандемними копіями

ВАРРЕ-зв'язуючого пептиду в конструкції Р71619. Амінокислотні послідовності важких ланцюгів

Р74293 та Р74294 наведені в 5ЕБЕО ІЮО МО:17 і 5ЕО 10 МО: 18, відповідно. Легкі ланцюги цих конструкцій також мають амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:19.

Нуклеїнові кислоти, що кодують описані вище конструкції, були одержані в такий спосіб.

Нуклеїнові кислоти, що кодують М-кінцеву ділянку продуктів М-кінцевого злиття ВАЕРЕ-пептиду (Р71617 і Р71618), включаючи дві копії ВАЕРЕ-зв'язуючого пептиду на додаток до варіабельного домену важкого або легкого ланцюга імуноглобуліну, були одержані синтетично. Вони були ліговані через підходящі сайти ендонуклеаз рестрикції з нуклеїновими кислотами, що кодують константний домен важкого або легкого ланцюгів, у відповідні вектори. Усі нуклеїнові кислоти, що кодують продукти С-кінцевого злиття константного домену важкого ланцюга (Р71619 і

Р71620), ії вставки Ес-петлі (Р/1621 та Р71623), і вставку Ес-петлі/продукт С-кінцевого злиття (Р71622), були одержані синтетично та ліговані у вектор, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, через підходящі сайти зндонуклеаз рестрикції.

Описані вище різні біспецифічні конструкції були експресовані та у тимчасово трансфікованих клітинах 293, і в стабільно трансфікованих клітинах СНО. Злиті білки були виділені та досліджені на біологічну активність. Не спостерігалося ніяких відмінностей в експресії білків, одержаних у цих двох різних видах клітин-хазяїв.

Інгібуюча дія біспецифічних молекул на ВАБЕЕ була досліджено в аналізі ВАЕБЕ- опосередкованої проліферації людських В-клітин первинної культури. Коротко, В-клітини людини були виділені з мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) з використанням набору І для негативної селекції В-клітин людини від Мінепуії Віоїес (Оберн, Каліфорнія). бо Близько 105 виділених В-клітин культивували в 9б-лункових мікротитраційних планшетах у мінімальному живильному середовищі (МЕМ), доповненому 10 95 термоіїнактивованої фетальної бичачої сироватки (ФБС) у присутності 50 нг/мл ВАЕРЕ-білка людини, 2 мкг/мл Р(ар)2-фрагменту козячого антитіла до ІДМ людини (Часкбзоп Іттипогевеєаг!сі) та різних концентрацій одного з описаних вище біспецифічних білків при 37 "С в 5 95 СО: протягом 48 годин. Пептидне антитіло до ВАРЕ було використано в якості позитивного контролю (аВАБЕ", який являє собою гомодимер, що містить два поліпептидні ланцюги, причому кожний ланцюг містить два ВАЕЕ- зв'язуючих пептида, злитих з Ес-поліпептидом). Молекула «ВАЕЕ докладно описана в патенті

США 7259137, та амінокислотна послідовність одного пол і пептидного ланцюга цього гомодимера наведена в 5ЕО ІЮ МО:32. Фрагменти патенту США 7259137, у якому описаний аВАЕРЕ, включені в даний документ за допомогою посилання. Швидкість проліферації визначали за включенням радіоактивного ЗН-тимідину протягом останніх 18 годин інкубації. Результати проілюстровані на фіг. 2А та 28.

Дані, наведені на фіг. 2А, свідчать про те, що дві конструкції, злиті на С-кінці (Р71619 та

Р71620), були зіставними один з одним у відношенні інгібування ВАЕР-опосередкованої проліферації В-клітин та більш ефективними, ніж всі інші злиті конструкції, досліджені в цьому експерименті. Надалі конструкцію Р71620 не використовували, оскільки вона мала тенденцію до агрегації, а ця властивість є дуже небажаною для терапевтичного білка. Дані, наведені на фіг. 2В, свідчать про те, що Р7/1619 зіставна із двома описаними вище незначною мірою модифікованими варіантами цієї конструкції (Р74293 та Р74294) і з позитивним контролем (с«ВАРЕРЕ) у відношенні інгібування ВАЕЕР-опосередкованої проліферації В-клітин. Отже, серед досліджених біспецифічних конструкцій Р71619, Р71620, Р74293 та Р74294 мали зіставну активність у цьому аналізі ВАЕР-опосередкованої проліферації В-клітин та більш високу активність, ніж всі інші досліджені конструкції.

Інгібуючу дію Р71619, Р74293 та Р74294 на В7ВРІ було досліджено з використанням аналізу В7АРІ-Ес-опосередкованої проліферації Т-клітин людини. Первинну культуру Т-клітин людини виділяли із МКПК здорових донорів з використанням набору для виділення Т-клітин (Рап Т сеї! ізоїайоп Кі) від Мінепуї Віоїес (Оберн, Каліфорнія) та стимулювали з використанням зв'язаного з підкладкою антитіла до СОЗ (1 мкг/мл) і злитого білюа В7/ВР1-Е (3 мкг/мл) у присутності різних концентрацій описаних вище біспецифічних білків або антитіла ІДС22 до

Зо В7ВРІ людини (названого у цьому документі "«В7ВРІ1"). Через 48 годин до клітин додавали ЗН- тимідин, і включення "Н-тимідину визначали через 24 години. Усі біспецифічні антитіла, які були досліджені, мали подібні ІСзо, які були подібні з ІСзо для «В7ВРІ1 (фіг. 3). Отже, ці дані вказують на те, що кон'югація ВАЕРРЕ-зв'язуючих пептидів з антитілом пиВ7ВАРІ незначною мірою впливає на здатність даного антитіла інгібувати активність В/ВР'1 або не має ніякого впливу.

Афінність зв'язування гетеродимерних біспецифічних антитіл Р/4293 та Р74294 з ВАЕЕ та

В7ВРІ визначали з використанням аналізу кінетичного виключення (Кіпеха?; бЗаріаупе

Іпвігитепів, Бойсе, Айдахо). Обидва антитіла характеризуються високою афінністю зв'язування з ВАЕРЕ людини (маючи Ка близько 30 пМ) та з В/ВР1 людини (маючи Ка близько 40 пМ). Див. нижче таблицю 2. На додаток до цього, обидві ці біспецифічні молекули характеризуються подібною афінністю зв'язування з ВАЕРЕ яванського макака у порівнянні із ВАЕРЕ людини та з

В7ВРІ яванського макака у порівнянні із В/АР1 людини. Таблиця 2.

Таблиця 2, Афінність зв'язування та активність у відношенні клітни Р7Я293 та

РА и 2ШЗ2-0З2ЗБЗ-ШШШ.АЕ Я ЗА А А - - - -- М 76593 РМ мис нн си СН

ЕЕ вів СС клітин яванського макака ! Щ ї клітин яванського макака " Й коомолнснюеннс влення і ІСт (ВМО для пизбування. ВТК РІ опосередкованої прознферації Т- 146 098 кцІтин людини Й

Сх (ВМ) для інгібування ВУКР іопосередкованої проліферації Т- бло н/увх кліІітнИ яЯвВанського макака Щі

УНА означає «не визначали». і

Для подальшої оцінки активності Р/4293 у системі іп міо з використанням клітин людини оцінювали продукцію цитокінів клітинами мигдалин людини, активованими ентеротоксином В еарпуіососсив (ЕВ), у присутності різних досліджуваних молекул. Коротко, клітини мигдалин людини виділяли із тканини та стимулювали 5ЕВ (1 мкг/мл) у присутності однієї з наступних молекул: (1) аВ7ВРІ, (2) Р74293, (3) СТІ А4-ІД (позитивний контроль) або (4) їдС людини (негативний контроль). Через 72 години культивування збирали клітинний супернатант та оцінювали рівні цитокінів з використанням наборів від Мезо 5саїе Різсомегу згідно з інструкцією виробника. Результати проілюстровані на фіг. 4.

Усі три молекули «В7РРІ, Р74293 та СТІ А4-Ід, стовпці 1, 2 та 3, відповідно, на всіх панелях фіг. 4, інгібували вивільнення ІЛ-17, ІЛ-10, ІЛ-4 та ІФНУ. Вивільнення ІЛ-2 інгібував тільки СТІ Ад-

Ід. Отже, аВ7ВРІ та біспецифічний РУ74293 до ВАЕР/В7ВРІ мали зіставний та специфічний вплив на секрецію цитокінів ЗЕВ-активованими клітинами мигдалин людини.

Були досліджені додаткові властивості трьох гетеродимерних біспецифічних білків, тобто

Р71619, Р74293 та Р74294. Титри білків, виділених з культур клітин-хазяїв, продукуючих ці білки, свідчили про те, що рівні продукції Р74293 та Р74294 були приблизно у два рази вище рівнів продукції Р71619. Р74293 та Р74294 також були більш стабільними, ніж Р71619 після зберігання протягом двох тижнів при 40 С, що було оцінено за допомогою ексклюзіонної хроматографії (ЕС). Р74293 утворював прозорий розчин на початковому етапі зберігання та через 4 тижні зберігання, тоді як розчини, що містили Р/4394, були мутними на всіх етапах зберігання. Розчини Р74293 та Р74294 були менш в'язкими, ніж розчини Р71619. Отже, Р74293 та Р74294 характеризувалися більш високими рівнями експресії, ніж Р71619, а також більшою стабільністю та меншою в'язкістю в діапазоні досліджених концентрацій, ніж Р71619. Найбільш очевидна різниця між цими молекулами полягала в наявності лінкера між двома ВАЕРЕ- зв'язуючими пептидами. Ці дані вказують на те, що лінкери, присутні в Р7/4293 та Р74294 (5ЕО

ІО МО:6 і 7), можуть поліпшувати властивості цих молекул.

Фармакокінетичні властивості описаних біспецифічних молекул були вивчені на мишах.

Самцям мишей лінії ФО-1 внутрішньовенно (ІМ) вводили однократну дозу (5 мг/кг) біспецифічних злитих білків Р71617, Р71619, Р71621, Р71622, Р74293 або Р74294. Зразки сироватки крові збирали перед введенням та через 0,5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 408, 504 години після введення. Концентрацію біспецифічної молекули в сироватці крові визначали за допомогою двох методів ІФА, один з них дозволяє виявити Ес-ділянку, а інший - як Ес-ділянку, так і ділянку

ВАРЕ-зв'язуючого пептиду. Для визначення Ес-ділянки в якості уловлюючого реагенту було використано біотинільоване антитіло до Ес-ділянки, а в якості детектуючого реагенту було використане мічене АГЕХА РІ ШОВ? 647 антитіло до Ес-ділянки. Для виявлення ділянки ВАЕЕ- зв'язуючого пептиду та Ес-ділянки біспецифічної молекули в якості уловлюючого реагенту був використаний біотинільований ВАЕР-білок, а в якості детектуючого реагенту було використане мічене АГЕХА Р ШОВ? 647 антитіло до Ес-ділянки. Біспецифічні білки із двома тандемними копіями ВАРЕ-зв'язуючих пептидів, злитих з Текінцем (Р71617), С-кінцем (Р71619, Р74293 і

Р74294) або СНЗ-доменом (Р71621) важкого ланцюга, характеризуються дуже схожими фармакокінетичними профілями (РК) у мишей. Фіг. 5. Біспецифічний білок з однією копією

ВАРРЕ-зв'язуючого пептиду, вбудованою в СНЗ-домен, та іншою копією, злитою з С-кінцем важкого ланцюга (Р71622), мав менш виражений вплив у порівнянні із іншими біспецифічними білками. Фіг. 5. На додаток до цього, за допомогою двох різних ІФА-аналізів були встановлені подібні концентрації біспецифічних білків у сироватці крові, що вказує на те, що розщеплення біспецифічних білків іп мімо було незначним.

Також були оцінені фармакокінетичні та фармакодинамічні параметри гетеродимерних біспецифічних антитіл Р/4293 та Р74294 у дослідженні однократного введення на яванських макаках. Інтактним самцям яванського макака (п-4) внутрішньовенно або підшкірно вводили однократну дозу Р74293 або підшкірно вводили однократну дозу Р74294 (10 мг/кг).

Фармакокінетичні профілі обох біспецифічних молекул були подібні з такими профілями антитіла (Да. Спостережувані фармакокінетичні параметри для Р74293 та Р74294, а також для антитіла до ПиВ7ВРІ представлені нижче в таблиці 3.

Табляиня 3. Фармакоківетичні параметри в'яванського макака

ГГ РІЮЗ ГР7Я294 | Антитіло яо шШ шо | виВлеРІ ШЕ ! 16 мі/кг,| 10 мг/ку, 16 ме/кг, 10 мг/кг, 10 мг/кг, м ве ве ус

Максимальна 323 90 ЩЕ 74 р 112 Й

Ї концентрація | | | і і лікарської речовини ! (Стах; МКМ | і | !

Єтах Є щвх; гоеодини І І !

Площа оїід о кривою 33800 о 29000 126100 І з73хоо (АК Сочі; мкртгодина/мл) | | І Що | ЩЕ муч удиицучНИИ рр пня учи ит

Середній часутримання | 136 132 148 138 144

Моя гОденНя; : І і

Загальний клірене (ЗК: 003 | 0491 Ода 0,383 07 мли/ке : і | | І

Обсяг 0 розподілу в 455 | 52 рівноважному стані | ЩО | !

Ук; мл/ку ! й и ни

Дані, наведені в таблиці 3, свідчать про те, що фармакокінетичні параметри Р74293 та

Р75294 зіставні один з одним та з параметрами антитіла до пиВ7ВРІ1.

Приклад 2. Конструювання та випробування мишачої біспецифічної гомологічної молекули

Для проведення доклінічних досліджень на мишах були сконструйовані мишачі біспецифічні гомологічні молекули, які можуть зв'язуватися з мишачим В/ВРІ та мишачим ВАЕРЕ (надалі "мишача гомологічна молекула"). Антитіло до пиВ7/АРІ, використане для конструювання біспецифічних конструкцій, описаних у прикладі 1, не зв'язується з В/ВРІ1 миші, тоді як ВАЕЕ- зв'язуючий пептид, використаний у цих конструкціях, все-таки зв'язується з ВАЕЕ як людини, так і миші. Дані не показані. Мишача гомологічна молекула включає антагоністичне антитіло Ідс до

В7ВРІ миші (назване в цьому документі "антитілом до тВ7АРІ1", яке являє собою химерну молекулу, що складається з константних доменів імуноглобуліну миші та варіабельних доменів імуноглобуліну щура до В7ВРІ1 миші. Застосування антитіла до тВ7ВРІ описане в наступному джерелі Ни еї аї. (2009), У. Іттипої. 182: 1421, у якому воно позначено 187-М2. Мишача

Зо гомологічна молекула має дві копії ВАЕРЕ-зв'язуючого пептиду (ЗЕО ІЮО МО:1), злиті через короткий лінкер (довжиною п'ять амінокислот) з С-кінцем важкого ланцюга імуноглобуліну до тВвВ7ВРІ. Дві копії ВАРРЕ-зв'язуючого пептиду розділені іншим лінкером, довжина якого становить 23 амінокислоти. Нуклеїнові кислоти, які кодують важкий ланцюг мишачої гомологічної молекули, були одержані з використанням ПЛР, з праймерами, які перекриваються, для з'єднання нуклеїнових кислот, які кодують ВАРЕ-зв'язуючу ділянку «ВАРЕНЕ, з 5-кінцем нуклеїнових кислот, які кодують важкий ланцюг 187-М2, тобто антитіло до тВ7ВРІ1.

Інгібування ВАБРЕ з використанням мишачої гомологічної молекули оцінювали в аналізі

ВАРЕР-опосередкованої проліферації В-клітин. В-лімфоцити миші виділяли із селезінки мишей лінії С57ВІ /6 шляхом негативної селекції з використанням мікрогранул МАС5 С043 (Ту-48) згідно з інструкціями виробника (Мійепуї Віоїєс, Оберн, Каліфорнія) або із МКПК із використанням набору для виділення В-клітин (Мінепуї Віоїес, Оберн, Каліфорнія). Виділені В- клітини стимулювали з використанням 0,1 мкг/мл антитіла до ІДМ та 200 нг/мл ВАЕЕ у присутності різних концентрацій гомологічної молекули або а«ВАЕЕР. Проліферацію В-клітин визначали за включенням ЗН-тимідину на 4-ту добу. ІСво мишачої гомологічної молекули та оВАРБЕ становила 0,59 нМ та 0,73 нМ, відповідно. Див. фіг. бА. Отже, мишача гомологічна молекула ефективно інгібувала ВАЕБЕ з активністю, зіставною з активністю «ВАЕЕ.

Для визначення ступеня інгібування мишачою гомологічною молекулою зв'язування В7ВРІ з рецептором клітини селезінки миші спочатку активували для підвищення експресії рецептора

В7ВРІ шляхом інкубації їх у лунках мікротитраційного планшета, покритих антитілом до СОЗ (5 мкг/мл) протягом 24 годин. Активовані клітини селезінки промивали фосфатно-сольовим буферним розчином (РВ5) та потім інкубували з 5 мкг/мл біотинільованого тиВ7/ВРІБРс у присутності різних концентрацій мишачої гомологічної молекули при 4 "С протягом 30 хвилин.

Клітини промивали і потім фарбували кон'югованим з алофікоціаніном (АРС) антитілом до СОЗ миші та стрептавідином-фікоеритрином (стрептавідин-ФЕ) ще протягом 20 хвилин. Зв'язування

В7ВРІ-Бс з Т-клітинами аналізували за допомогою проточної цитометрії. ІСсо мишачої гомологічної молекули та антитіла до тВ7ВРІ1 становила 4,01 пМ та 2,8 пМ, відповідно. Див. фіг. 68. Таким чином, у цьому аналізі активність мишачої гомологічної молекули була схожа з активністю антитіла до тВ7/ВР1. Отже, мишача гомологічна молекула інгібує як ВАБКБЕ, так і

В7ВРІ.

Фармакодинамічні ефекти мишачої гомологічної молекули іп мімо оцінювали на мишах, імунізованих еритроцитами барана (ЕБ). Коротко, проводили первинну імунізацію мишей лінії

ВАЇ В;с (у віці 8 тижнів) на 0-у добу та бустер-імунізацію на 28-у добу з використанням 2 х 108

ЕБ в 0,2 мл РВ5 шляхом внутрішньочеревної ін'єкції. Миші (п-5 для кожної молекули) одержували два рази в тиждень з 0-ї доби по 33-ю добу одну з наступних молекул у концентрації 5 мг/кг: мишача гомологічна молекула; ЧВАЕРЕ; антитіло до тВ7ВРІ або Ідсі миші.

Миші, які одержували ЕБ, але не одержували інших речовин, служили в якості позитивних контролів. Мишей умертвляли на 34-у добу та виділяли селезінки.

Зо Для вимірювання співвідношення В-клітин та Т-клітин пам'яті в селезінці клітини селезінки виділяли шляхом подрібнення тканини селезінки через клітинні фільтри. Клітини селезінки попередньо інкубували з неміченим антитілом до СО 16/32 для блокування неспецифічного зв'язування антитіл з Ес-гамма рецепторами (ЕсукК). Частку В-клітин визначали за забарвленим міченим ФЕ антитілом до В220 (який експресований на В-клітинах). Частку Т-клітин пам'яті (Ср44А"СОб6219004 Т-клітин) визначали за забарвленням кон'югованим з РІТС антитілом до

СбО44, конюгованим з ФЕ антитілом до СОб2І, кон'югованим з АРС антитілом до СО4 та кон'югованим з РегСР антитілом до СО3. Усі антитіла для забарвлення були придбані в ВО

Віозсіепсе (Сан-Дієго, Каліфорнія). Для визначення кількості В- та Т-клітин проводили проточну цитометрію з використанням проточного цитометра ЕАСЗСАЇГ ВВ м (ВО Віозсієпсе, Сан-Хосе,

Каліфорнія), і дані аналізували з використанням програмного забезпечення РІГ ОМШО-? (Тгеезіаг

Іпс., Ашленд, Орегон) для аналізу даних проточної цитометрії. Результати проілюстровані на фіг. 7.

Для вимірювання рівнів антитіл до ЕБ у сироватці крові мікротитраційні планшети, покриті 10 мкг/мл розчинного антигену ЕБ, інкубували протягом двох годин при кімнатній температурі з розведеною сироваткою крові мишей, на яких чинився вплив. Рівень Ід, що зв'язався, специфічного по відношенню до ЕБ, визначали в сироватці крові з використанням кон'югованих з пероксидазою хріну (НАР) поліклональних козячих антитіл до дС та (ДМ миші (5ошпет

Віоїесі, Бірмингем, Алабама). Реакцію із субстратом проводили з використанням субстрату пероксидази ЗОВЕВІ ОЕМ ТМВ (КРІ,, Гейтерсберг, Меріленд) згідно з інструкцією виробника, і оптичну щільність вимірювали з використанням планшетного спектрофотометра бресігпит Мах (МоІесшаг Оеємісе5). У якості позитивного контролю в кожний планшет додавали зразки після серійного розведення суміші сироваток мишей, імунізованих ЕБ, за відсутності будь-якого впливу, і будували стандартну криву на основі даних оптичної щільності для цих лунок. Рівні антитіл до ЕБ інших зразків представлені на фіг. 7 у вигляді відсоткового вмісту від позитивного контролю.

Відсотковий вміст клітин селезінки, які являли собою В-клітини, був зниженим у мишей, що одержували мишачу гомологічну молекулу, у порівнянні із відсотковим вмістом, що спостерігався у мишей, що одержували Ідасі миші. Фіг. 7 (верхня панель). Аналогічне зменшення спостерігалося у мишей, що одержували ВАЕЕ або аВАБЕРЕ та антитіло до тВ7РРІ, але не у бо мишей, що одержували тільки антитіло до тВ7АРІ. Фіг. 7 (верхня панель). Що стосується Т-

клітин пам'яті, у мишей, що одержували мишачу гомологічну молекулу, антитіло до тВ7ВРІ1 або антитіло до тВ7ВРІ та ОоВАРЕРЕ, кількісне співвідношення Т-клітин пам'яті у порівнянні із кількісним співвідношенням, що спостерігалося у мишей, які одержували тиїдсі, було зниженим. Фіг. 7 (середня панель). На відміну від цього дія «ВАРЕЕ не впливала на популяцію Т- клітин пам'яті в селезінці у порівнянні із впливом, що спостерігався для тиїда. Фіг. 7 (середня панель). Мишача гомологічна молекула також забезпечувала значне зменшення рівня антитіл до ЕБ у сироватці крові аналогічно зменшенню, що спостерігалося під впливом антитіла до тВ7ВРІ або антитіла до тВ7ВРІ та оВАЕРЕ, або у мишей, яким не вводили ЕБ. Фіг. 7 (нижня панель). У мишей, що одержували тільки «ВАЕРЕ, спостерігалося помірне зниження рівня антитіл до ЕБ у порівнянні із рівнем, що спостерігався під впливом тідаі. Фіг. 7 (нижня панель). Ці дані свідчать про те, що мишача гомологічна молекула чинить подвійну інгібуючу дію на В-клітинний та Т-клітинний компартменти у мишей іп мімо.

Вплив мишачої гомологічної молекули на активність захворювання оцінювали на моделі вовчака на мишах НК; лінії МАВАМ з використанням різних об'ємів доз для кожної досліджуваної молекули. Самкам мишей НЕ; лінії МАВЛМ (у віці 4,5 місяця, п-20) два рази на тиждень шляхом внутрішньочеревної ін'єкції на протязі 18 тижнів вводили речовини з використанням кожного з наступних режимів дозування: 5 або 15 мг/кг мишачої гомологічної молекули (ММУ-160 кДа); 4,68 або 14 мг/кг антитіла до тВ7ВРІ (ММ/-150 кДа); 1,88 або 5,6 мг/кг а«ВАРЕ (МУУ/У-64 кДа); комбінація а«ВАЕЕ (1,88 або 5,6 мг/кг) та антитіла до тВ7РРІ1 (4,68 або 14 мг/кг); Ї4сІ миші (15 мг/кг; ізотипічний контроль); або фосфатно-буферний розчин (РВ5) (негативний контроль).

Протеїнурію визначали в сечі з використанням АЇВИ5ТІХ? (Вауеєг, Елкхарт, Індіана) кожні два тижня, починаючи з віку 5 місяців. Частоту випадків виникнення протеїнурії виражали у вигляді відсоткового співвідношення мишей з білком в сечі в концентрації щонайменше 300 мг/дл з використанням двох послідовних вимірювань. Рівень антитіл до длДНК виміряли за допомогою

ІФА. Бальну оцінку захворювань нирок проводили шляхом дослідження зразків тканини нирок на наявність восьми різних видів ушкоджень, а саме розростання капілярів судинних клубочків, гіперплазія мезангіальних клітин, накопичення мезангіального матрикса, гіперплазія парієтальних епітеліальних клітин, інтерстиціальний нефрит, дилатація канальців/білкові циліндри та атрофія канальців/інтерстиціальний фіброз. Кожному типу пошкодження був присвоєний показник тяжкості захворювання від 0 до 5 із максимально можливим показником 32. Показники для кожної групи мишей усереднювали. Проводили моніторинг виживаності.

У віці 12 місяців у жодної з мишей, що одержували мишачу гомологічну молекулу в будь- якому дозуванні, не розвивалася протеїнурія. На відміну від цього, у 10095 мишей, що одержували Ід або РВ5 у обох досліджених дозуваннях, була відзначена протеїнурія. Фіг. ВА та 9В. У близько 6095 та 3595 мишей, що одержували антитіло до тВ7ВРІ та оВАРЕЕ у меншому дозуванні, відповідно, і в близько 50 9о та 25 95 мишей, що одержували антитіло до тВ7ВРІ та аВАРЕЕ, відповідно, у більшому дозуванні розвивалася протеїнурія. Фіг. ВА та 9В. На додаток до цього, дія мишачої гомологічної молекули в обох дозуваннях призводила до зменшення рівнів дб: до длДНК у сироватці крові у порівнянні із негативним контролем під впливом тиїЇдаі. Фіг. 88 і ЗА. Під впливом біспецифічної молекули виживаність тварин значно підвищувалася у порівнянні із контрольними групами тварин, що одержували тідс та РВ5. Дані не показані. Однак, ніякої явної різниці у виживаності не спостерігалося після впливу біспецифічної молекули у порівнянні із дією однієї молекули на момент завершення експерименту.

Нирки всіх мишей, що одержували досліджувані речовини, включаючи мишей, що вмерли перед завершенням дослідження, виділяли для гістологічної бальної оцінки тяжкості захворювання нирок. Групи мишей, що одержували аВАРЕРЕ, комбінацію аВАБЕЕ та антитіла до тВ7ВАРІ або мишачу гомологічну молекулу, характеризувалися більш низькими показниками тяжкості захворювання нирок у порівнянні із контрольною групою, що одержувала тідаі. Фіг. 10.

У груп, що одержували мишачу біспецифічну гомологічну молекулу або комбінацію, була відзначена тенденція до зменшення патологічних змін нирок у порівнянні із групами, що одержували одну речовину, причому даний результат явно корелює з описаними вище результатами за протеїнурією. Можна зіставити фіг. 10 із фіг. А та 9В. У такий спосіб подвійне інгібування ВАЕЕ та В7ВРІ1 під впливом мишачої гомологічної молекули або комбінації «ВАЕЕ та антитіла до тВ7ВРІ було більш ефективним, ніж інгібування під впливом тільки ВАЕЕ (аВАЕР) або тільки В7ВРІ1 (антитіло до тВ7АРІ) у відношенні запобігання початку та розвитку захворювання в моделі вовчака на мишах Н; лінії МАВЛМУ.

Для визначення того, чи може інгібування як ВАЕРЕ, так і В/АРІ ефективно пригнічувати симптоми колаген-індукованого артриту в мишей, проводили наступний експеримент. Самців бо мишей ОВА імунізували 100 мкг бичачого колагену ІЇ типу, емульгованого в 2 х повному ад'юванті Фрейнда (СЕА), на 0-у добу, повторно імунізували бичачим колагеном ІІ типу в неповному ад'юванті Фрейнда (ІРА) на 21-у добу. Миші одержували одну з досліджуваних речовин два рази на тиждень на протязі дослідження тривалістю 41 тиждень, починаючи з 0-ї доби. Через кожний інтервал часу для кожної групи оцінювали кількість мишей у відсотках у кожній групі, в яких проявлялися симптоми артриту, і середній показник ступені тяжкості артриту. Показники ступеня тяжкості артриту визначали шляхом обстеження кожної кінцівки та шляхом визначення бала від 0 до З для кожної кінцівки, причому більш високі бали були використані для більш припухлих та/або більш запалених кінцівок. Таким чином, максимальний загальний показник ступеня тяжкості артриту був рівний 12. Вважалося, що миша мала артрит, якщо у неї був показник ступеня тяжкості артриту щонайменше 1 для будь-якої кінцівки.

Результати проілюстровано на фіг. 11. Ці дані свідчать про те, що ефективність комбінації

ОоВАРРЕ та антитіла до тВ7ВРІ (зафарбовані кружечки, з'єднані жирними лініями) була більш високою у відношенні пригнічення симптомів артриту, ніж «ВАЕЕ (незафарбовані кружечки, з'єднані жирними лініями) або тільки антитіла до тВ7/АРІ (зафарбовані кружечки, з'єднані пунктирними лініями). Групи негативного контролю, що одержували тідсї (зафарбовані квадрати, з'єднані жирними лініями) або РВ5 (зафарбовані квадрати, з'єднані пунктирними лініями), характеризувалися найвищою частотою випадків виникнення артриту та найбільш високими показниками ступеня тяжкості артриту. Ці результати вказують на те, що інгібування як ВАЕЕ, так і В7ВРІ, на відміну від інгібування тільки одного із цих шляхів, могло б бути ефективним методом лікування автоїмунного та/(або запального захворювання артритної природи, як, наприклад, ревматоїдний артрит (РА).

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«ЗО Н5УО, НАЩО "НАМ; МІН

КАММАМ, БИМАЗЕКАВАМ

ТАСОВ5ЕМ, ЕВЕОЕВІСК МУ.

ТБ, МАУМЕ «1205 БІЛКИ, СПЕЦИФІЧНІ ЛО ВІДНОШЕННЮ ДО ВАРЕТА В7КРІ, ТА ЇХНЕ ЗАСТОСУВАННЯ 1305 А-1887-УУО-вСТ «1405 буде призначено: «1412 2014-03-12 «50» 51/942776 151 2014-02-31 «1502 61/780259: «1515 2013-03-43 «їі505 75 «1705 ваепов версн 3.5 «21йх1 «АТ 18. «212» Біло 213» Штучна паслідовність

«ах ; : «ввіз заштсе «2232 /поїех "Опис штучної п. слідовності: смінтетичний пепти ди - а» 1 во вто у Суб Гуз тр. Азрієв ви Пе уз бій Тер Ма! Су Авр

І 5 16 15

Ргєіїви «022 «7511538 «а1и» Білок «213» Штучна послідовність «930 «ігІ5ошсе «223» /поген Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" й «400» 2

Ре Ні Ахр Сує Гуз Ттр Акрїен ви Тв? Бу біп Тер Ма! Сує Нів ї 5 10 15

Зківи каТіх 12 «2124» Нілок «132 Штучна послідовність «2ах «вдї5 зацтсе «2235 /потек "Опис штучної послідовності: смитетичний пептид" «0» «221» ВАВІДНТ ката х (3) 43) «223» Леріасех Ту або рве" 20» «221» МОЮ.

ВЕ «2792 451-45) «223» Будв-яка амінокислота «220» «221» ВАРІАНТ «2295 (7).(7)

«2235 /теріасех "Не" «2212» ВАРІАНТ «фІаз (ія) «8723» /терівбе- Аг або "Ні" ре: «221» ВАРІДНТ «222» (30410) «7235 леріась- АР або "Не"; або "діа", або "Ма", або "Кей", або "Че", або "Рго", або "Ре", або "Ттр", або "Меї" «20 «ду» піс Тезиге «кааах ЦІ «2735 /поге:"Варіанти залишків, наведені в послідовності, не мають ніяких переваг по відношенню до залишків; наведених в примітках для варіамтів положень" «мі

Сує сує Тр Ар хаа ве Твг у біл іує ма! Сух

І 5 ї0 «14 «1» й «219» Білок «2135 Штучна послідовність

«бл ї» бите «2235 /погек "лис штучної послідовності: синтетичний пептид" «А» й

Су віх су Оу 1 «210» 5 «2112 73 «112» білок «213» Штучна послідовністіх «220х «і» зош «1235 /потех"Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «2205 «2215 ВАРІАНТ «22251423. хга3З» й еріасве" Ма" -7205 «2215 тів Тевцив

«222»41).423) «2235 /поїех Варіанти залишків, наведені в послідовності; не мають ніяких переваг по відношенню дозалишків, наведених в примітках для варіантів положень" «ах 5

Сіу заг біу Бег Ага Тит ОБУ Су бе Оу бет 5ет Дів бе 5ег Оу 1 5 в 15 ет бек Ав Тр Ні а) «1056 «РІЇ» 23 «из БІЛОК «7135 Штучна послідовність «зах «2215 50інсе «8232 поїв Овислучної послідовності: синтетичний пептид" «ДО о

Сіу бек бі ет Аа Те СУ СТУ Хек СИу бег Маї Аіа бег бе біу 3 З 30 15 бек Сіу бег Аа ТВг Ні Без та ках «21ї1з73 «212»: Білок «2132 Штучна послідовність кох «дві» оце «213» лпотех Опис штуаної послідовності: смнтетичний пептид «0057

Оу БегСу бек Аз Ти СУ Оу бек БУ Зег баг Аа ет бек О1у ії 5 юю і5 5егОіу бег Дів Пи Ні Кей «210558 -2131: 11 «212» Білок «813 Цітучна послідовність «ай

«241» 5о0се «у23» /поге- "Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «4005 10

Сів ба Руг Ар зег Тук Рго Аг ТВг 1 5 «310531 «5 кої» Білок 2135 Штучна паслідовність «Дод» «81» зопсе «2785 /пгев"Сіпис штучної послідовмості: синтетичний пептид" «щЮ1

Беє Гуг Тр Ме бе из 5 «21051 «Іі «2122 Білок «132 Штучна послідовність

КК)

«олії» 5оше: «Р23 пов ОпИис штучно послідовне: синтетичний пейтид" «Не 17

Туг Не Гу біп Ар БЖ Ап СН Дуб Туг Тук Маг Аєрбет Уа у 1 5 10 І5 су «2513 «1 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «230х «3715 хашсе

КЗ» /потен Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «а» 13

Сіш Оу Це ей Тео Ре Ну Ар ви то Те ене 1 5 10

«2105 14 «2315 08 «12» Білок «2132 Штучна послідовність «27» «2215 оце «223: /похее"Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «400514

Дер Не бів Меї Тлк бір зек Рго бег 5егіем 5ег Аа 5ег Ма! Фу ї 5 16 5

Абр'Аєв ма! Ти Пе тв Су Агр Ага бег св ау Не баг Аиа Тор ем Ада Тер Туг Сів бів ус Рго бін (ух Аа Рго ух бех Тец Це

Туг Ав Аа бек Бегіви біп бег Оу Мо Рго бег Ате Ре бе Бу 5а БО бегбіу бек Сім Те Ахр Рве Тігіеч ТНе Пебегеківи бій Ро

55 70 75 50

В Ар Ре Ав ТС Тук Тук Суб бій Сів Туг Авр бат Тук го Дер 85 ча 55

ТреРве Су бів Оу Те Гу Ма Ов Пе бує Ат 100 105 «210» 15 «1151 «2192 Білок «5135 Штучна послідовмість «220х «ої» «оце. «23 ипох Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «а0О5 а сема! Ой еру мі біб бег су ЯМ Зуівманов бго у СУ ії 5 не 15 5егіви Ап ему беї Сух Аа Аа Зег Біу не Пе Ріне-зег бер Ту

ЗО

ТенМеїт5егтТто ма Ат бів Ав Рг 5 уз Бу ез ЇМ Тр. Уві 35 Ай 45

Діва Буг Не бух БП дер Оу Асп св ух Бус Туг Маг Аєр 5ег Ма

БО

Гу СІ Атя Ре ТвВг Не Бег Др Ар вп Ав Ку Ап бег ей Туг 55 70 75 о

Єви Ов Ме Аби бЗег ео Ага Дів іо Або Те Аівосла! Тує Тут Сух 85 90 25

Аа Агв бі ОК Не їв Тер вне 0іу Ар ец го ТНу Ре Тер Оу

Мо 105 110 бів Оу Тег ей Мві Те Ма! бегбег 115 120 «215 16 «7112 50 «212» Білок «з13» Штучна послідовність кхрлї» мине «523» употее"Опис штучної послідовнаєті: синтетичний полійептид" «АО00х 15 сів ма Сів ей Узі бів бе біу Бу Б ей уа! ов го СУ у і 5 10 15 вегіен Аг ецбеєсСує Аа Дів бе СХ ейе Те РНе бр Заг Тує

Зо

Тер мМесбестТкр Уа! Ато ій Аа Рго віуїує іх ви бів Тр Уа 35; й 45

Ав Туг Не у біт Ар Оу Аби Сію бух Тук Туг Ма! А5р бег Ма

БО

Ем у Агр Не Те бег Дер Ар Ап Ав Бу Ап бегіеи Тує 65 7 75 Во

Сев біп Меї Азп зегієц Аге Аа су Дер ТВг Аз Маг Туг Тут бух 85 о 98

Аа Агв СІЮ Біу Не ги Тер Ре Су Дер се Рго Те Рае Тер Оу 0 105 тло вій іх ве ген узі ТВе Ма бе заг АВ бе ТНК ух Оу Рго Баг 115. 120 325

Уві Рве Рго Гец Аа Рго Суб 5ег Дер бет ТАТ бат у аг ТВ АВ 130 135 140

Аа ей Сім Суз Ееи Ма уз Ар Тут Ре Рго Сім Рго Ма! Тне Уві. 145 150 155 160 5еє Тер Аби Бек Оу Дів іесв Тв бег біу Маг Ні Тк Не Ро Аа 165 170 175

Ман ев біп бегб5егсіу бен Туг бегїеч Зегбег Уві Ма! Тіт Ма 150 185 190

Рго баг бег Ах Ре БУ Пе бій Тв тує Тв Сув Азп Уві Ар Ні: 155 200 205 мує Рго Бек Ази Туз Ма! Акр Гуз ТНг Ма! СИ Агр ух Су Сух 71а 715 220

Уві сію Су Рго Рго бух Рую Аа Рго Рго Уа! діз Оу Рго 5ег Уві 225 230 235; 240 вне ешРНе Рго Рго Му Рго цу Ах ТНгТеи Мекіе ек Аги ТВе 245 250 дао

Рго біс Ууаї Так Сух Ма! Уві Уві Дер Маї Хек Ніз Син Ахр Рео іо 250 265 2

Уа с Рне Аби То Ту Уа! Ар Зу ма! біс Узі Ні Ап Аа Гух 275 во 285

Те ух без Акр о сбію бідосів еВе Ап бек ТВ РНе Аг магма! вет 290 295 за

Ма бе Тве Ма) Уа! Ні5 бів Ар Тр Геш Ах Оу ух ою Тут Су 305 ЗІ0 315 320

Сує уз Ма! баг Авт ух Оу ви Рко Ав Руо Ме В Су ТВ 325 330 335

Зегіух Те іув Оу сів Ресодтр Сім то іп Ма! тугі ей рго з40 з45 з50

Рго Бе Аг ів Ме тн ух хи із Узі сег без ве Суб ев 355 350 865

Ма ух ВІЖ Рпе Гуг Рго 5ет Ар Пе Аа Май ЇХ Тер За бек Ах 370 575 380

СУ бів Рго Біо Абп Авл Туг ух Твг ТА бго Рго Мет ви Ар 5ег 385 3930 395 3ов

Дер сіу ет Ре Ре ви Туг бет уз ви Тіт Ма! Азро уз бег Ат дО ща 415

Тур біб бій Су Ап ма! Ре бет Су бек Уві Мет НВ сі Аів'єв 420 3425 4330

Нв Ав Ні Туг Тк іп у» Зег1ео бегівц ек Рго ЗУ Бу Су

435 дай 445

Фу вк рез Рго Сім Суб Гуз Тгр Авр беу Сен е Гу бій Тго Уві 450 455 460

Суз дер Рго бен бу бек Су бег Аа ТА у Оу бек Сіу бек Оу 465 479 475 480

Ав бег 5ег ІМ 5ег Сім бе АВ ТНт У бегїви Рго Оу Су Гух 485 490 495

Тер Ар кевіва Неї бій тив Уві Сує Ахр Ро тей 500 505 «230517 «2115511 «їв Білак 2135 Цнучна послідовність «ках «221» зойке «лоз поет Опис штузної послідовності: синтетичний поліпгятид"

Сім Маї біпіви Ма! бІц-бет БІХ Оу бу еш Ма! біп Рго Зіу Су 1 5 10 15 5Зег і еци Аг цеи бег Сух Ага Дів 5ег СУ Ре Тлг Ре бек бе Тує

Зо

Тер Мек5ег Тер Уа! Аге сій Да Рго Су бух Су Тез ОЇ Тр Уа

Зо ЩІ 45 «Кіа Тує Пе ух Вів Ар СУ Авп бів ух тус тує Уві Ахр бек Уа!

З о

Гу біу Ат Ре Те Пе бот Аге Абр Ар Аа Гу Ах бегве ТУ 70 75 80 цез бій Ме доп хек ец Ате Аа ОіШ Авр Те дів мав Тук тук Су 85 ЗО 95

Дів Ате Січ бу Пе (ен Тор ве Бу Ахрїео бо Тін Ре Тгр біх 100 105 по бій іх Твгігь Уві Тиг Уа беє бен дів бе ТНг ух Сіу Рох 5еї 115. 120 125

Ма Рне Рго Гей Ага Ре Су 5ег Агвобет Твгбет од бег Тл АВ 130 135 140

Ав іс біу Суз їв Ма ух Дхр ТуєВре бго іч Рго Ма! Тнг Ма 145 150 155 160 ет Тер Абп зер Зіу Ав їв Тег біу Ма! Ні» Тв Рне го Аа 165 174 175

Уаїїга біп 5ег беє ЗУ бе Тут Зегіец бет бег Уа Уа Тома 180 185 196 вто бег Зв Асп Ре біу Ті бів твк Туг ТНК Суб дев Уа! А5р Ні таб 290 295 ух Рго Зег АБИ Твгі ув Уа Азріух Те Уа) СИ Аге і у5 Гу Су 210 215 реч:

Мао Су Рго Рго Су Рго Дів Рко Рго Уа! Ав. Сіу Рео Бек Ма

215 230 235 240

Рпефешрне Ро Регбі ук Рго ух Авр ТВЕ Бен Мене бе Ате Те 245 250 555

Рго ім Ма! Тв Сух Ма! Ма! Ма Ар Уві ет Ні5 бів Ар Рг ом 250 255 7

Ма бія РНе Азо Тгр тує Уві! Ар: біх Уві Сію Маї Ні Абл АВ ух 75 288 285

Тіг і ув Бго Агр'Сін ін Сп Ре Ап бег Те ве Ате Ма! Ма! бе 290 295 зо

Уаїтештін ма Маї Ніє бій Ар Тр ев Аз ОМ Був сію тугу 305 316 315 320

Сузцує Ма! бе Ап ух Су Гей Рео Аве Рго Не сім Цув ТАНЕ: 325 зай 335 бегіув ТІ уз БМ бів го Ага Сб рго іп Уві Ту нг без го зай 345 350

Рго ет Аге сне біб Меї Тв Гук Ап біп Узі бег тво Ту Суб Те 360 з65

Май ух Оу Рне Тук Рго бе Авр Пе Аа Узі Бім Тер. и 5еї Аби 370 З75 Зо вік бів го Со Депоаеп Гу ух Тіт Тв Рго Рез Меї с ецу Абр бе

ЗВ 390 395 400

Авр Біу Бек Рне Рпе ен Туг Зег бух Сей Так уві Авр гу бе Ат 405 4азї0 415

Тгр бів біп Оу Аеп Уві Рве хег Су Бег Уві Меї Ні Сів Дів Гей 420 425 аз

Ніх Ахо КН5 Тух Те біл гу бек ео 5ег Єви Зех Рто Сіу Ту Оу 435 аа ч45

Ох Ох Оу біу еи Рго ЗУ Суз Гуз Тер Азр ем ео Пе уз бій 450 455 460

ТгрУгі Суб Ахр Рг Ген Сіу 5ег біу Зег Аа Твг Оу біу бек іу 465 470 87У Зо

Бег Маг Аа 5ет Бек у бег (у 5ет. Аз ТА Ні Гео сем Ро у

А85 493 455

Сузіує Пр.Азріеціви Не ух бів Тер Уа Сух Абр Ро їв 500 ЗЯ5 510 «30-18 «11511 «1» ВІНОК хаі32 Штучна послідовність «а ч215 Баг «823» іпотее Опис штучної послідовності: синтетичний поліпейтид" «пів сін Ма! Сп ей Ма! бів-бек Су Оу бу і во ма! ов Рго Бу Му 1 5 16 15

Бегієез Аге Тец ЗегСух Ага Аа ек віу Рве Те Рле бегбег Тут

28 25 зо

Тер Ме бег То МагАгр оп Аа Рго Бім Сух БУ Бей С; Тер Ма! 35 40 45

АЇВ тує Не ус біт Аве Бім Ап іш Гу Туг Туг Ма! Ар Баг Уві 5а ще во

Гук оіу Атр Ре ТНг Це 5ет Акр Лер Астп Аа Куя Абп ет Бен Туг бе 70 75 ва ви бій Меї Ав 5ег беи Аге Аа Вів Дер Тне діз УВІ Туг Туббув 85 оо 5

Аа дув Ой ОМ Пе ем тер вне су Ар бен ка Как рве Тр Оу ю5 о бін авт гец УаЕтв Мага ек Аа Бе ті гук Сіу Бко баг 115 120 125

Уві вве го ге Аа бо См бет АпЕ бе Те его ек Тве Дів 130 135 140

Дів ви Оіу Су теп Уа ує Ар туге Рго сім Рто Ма! Те Уві 145 150 ТБ 160 ет Тгр Авіа бег біу Аа ет зе Оу Мавнів Ту Рне Рго лів 165 1-70 175

Уа їец іп бек бе бік ер Гуг бек їеи бег Зек МаЇ Мві Тиє Уві ї8о ї85 190

Рго бег Бек Ап Рпе о ТВе Ви тв Тук ТАт Сух Абу Маї Ар Ні 195 200 205

Тух Рго 5егоАсл Те ув Мав Ахр ух Те Уві вк Агр Туз Сух Су 210 15 220

Уа! бів Суб Бто ко Суз Рг Дід Рг Рго ма! Ав су Рто бек Ма! 225 230 235 240

Рре еч вве Рго Рго у Ро ух Ар тт ей Ме не зек Атр ТВг 285 250 7255

Ро бів уУг ТАг Суб Узі Маг Уві Ар Уа! бег Ні Сіц Авр Рто Он 260 265 270 ма! бів Ре Абп Тур Тук Уа Ар Оу Уа іш Ма! Ні Ахп Аз ух 275 280 285

Тіт ух Рго Агя бій СПО бія Рве еп бег Тіт пе Агро Уаг Уві 5ег 290 295 Зоо

УВІ ее Твг Уа! Уві Ні5 бів Ар Тер бенсАхп СПУ 1у5 Но Туг ух 305 зю 315 320

Суєїує Уа 5ех деп і у5 Сім ТешРго діа Рго Ле бі у5 тн Не 325 3за 385 ет уз Таг Був у бів Ро Аге біз ко бів Ма! Туг Тр дев во за з45 350 рго зег Агв Сію сій Мей Тигіує Абв сів Уа бех ей ТВ Суб (ви 355 ЗО 355

Ма Еув Су вне Тук Рго 5ет Ар. Не: Ада Ма! 1) Тер біц бет Авп 70 375 80 вІусий Ргоів Аза Ав Тук Су Тйг Твг го Рг Месіви Ар бег 385 390 395 здо

Ар бік бе РБе Рпе Гео Тут 5ог у Се По Уві Аеріув 5ег Аге

АдЬ 310 4іб

Тер бій бій біу Авп уві Ре бег Суя ек Уві Меї Піх Ов Аа ев 451 425 430

Ні Ахи Ні: ти Тен біл бух бе Гео беттен бе Рго М Гу Су аз5 440 445

ОКОМ ох Оу гео Ргоу Су ух Тер Азріеи рем Пе ух сів 4 455. 450

Тер Уві Су Акр рез їен сі б5еє Бім зер Аз ТВі су Бег Бу 455 473 475 48о

Бег5ег Ав ет 5ег сіу Бе у 5ег Аза Те Ніз ем Кеш бго біу

485 490 495

Сувїує Пр.Акрієвтев Пе бук сів Тгр Узі! Суб Ар Ргоївй

ОО 505 510 «а З к2115214 к2422 Білок «2135 учна послідовність «ай «2115 5оМгсе кг23» /потег Отис штучної лослідовності: синтетичний поліпептид" «АПО» 19

Ар ее бін Ме Тк ОК Зеє Рго хек вет Цен Бек Аз 5ег Маг оїу:

Її 5 10 15

АзрАге Ма! Тег ів Тег Сух Аге Ара бег бій Су Несе Ар Тгр за ев Ав Тер Ту біля й бує Рго бів цу Аа Ре уз без ев е: о 45

Тип Ав Аїд 5ег 5ег їеи біп чех СУ Уві Рго баг Аг Ріе бег СЯу 50 55 Бо

Бег біу зе Сіу Тит Абр Ре Тл івец ТВ Пе бек Зег іви бів Ро 55 7) 75 Во іш Абр Ре Аа ТП Тує Туг Сх» сі Ой Тут Абр 5ег Туг го Де 55 ща 95

Тк оне су бів Оу Твгіух ув! бій Не їуз Аге ТАг Уа Аа Аа 300 105 110

Рго бег Уа! Не Не бе Рго Рго Зег Азр СПО іп бе Гуз бег Ок 115 20 125

Тв Аа бег ма! Ма! Су бец ев Аби Аєп.оене Тух Ро Агро АВ 130 135 140 ус манти Тур ув Уа Ар Аве діа гер біп бег Оу Азп бек СІЙ 150 155 160 сш бег Маї Ти сш віп Аєр бе Ту Ар бег Тг Тугбегіву 5ег 165 170 15

Бех Тргьец Тве бен 5ег Гуз Ада Ахр Тут ої Бу» Ні бух Ма! Туг 180 І85 190

Аа Суз ій Уві ТНе Нів бів біу Тен бе бег то Маі Те ув бек 135 290 205

Рве Ази кв іх сі Су; 210 «210520 «243159 «517» Білок «2135 ПШНучна послідовність крах «геїх 5оаце «23» пе Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" их «9212 МОЗ ДЕ5

«223» Будь-яка амінокислота к4доз 20

Єу5 Хаа Хаа Хаа Хва Хаа Ха Хай Ха 1 5 «Т10х21 кої «213» Білок «213» Штучна послідавність «Та» «ві» Бошсе: «2335 у/поех Опис інтучної послідавності: синтетичний пептид" «АПОз І

Кеш о тр Пе Оу 1 5 «ій» 29 «21154 «от» Білок х?71521Штучна послідовність

«21» зош «23» /потех "Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «2205 «вії» МОБ ВЕ5 «2225 131.43) «2235 Будь-яка змінокислота «ай» 22

Тур зу Хав СОУ

І

«210223 «21154 «712» Білок «215» Штучна послідовністі» «220» «ої» хОоцЕсе «пПІЗх по Опис втучної послідовності: синтетичний пейтид" «ох «215 МО ВЕ5 «222х413р 3

«2252 Будь-яка амінокислота ка00» 23

Рів Оу Хаа Су

І: «21025724 «2115 23 «Тих Білок «2135» Штучні послідовність «205 «221» 5оигсе «й43» /потех "Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «400» 24 су чес ом Зеє Аа ТНУ у Бім Зах Сіу Зег ІУ Аів ЗекЗег Оу 1 З юю 15

Бег і; ет Аа тт оіу Бе «105725 «211 447 «212» Бівок

«2185 Штучна послідовність «йо» «аАї»5ошсе «2935 / поїв Опиє штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 25 бій Ма! біпчеоз Уві Сім ет бу іх Бім ер Узі бів Рко бік бу 1 5 13 ІВ чегівец Аг Гео бен сує Аа ій Зег Оу Ве ТВе Ре Зег бе Тук

Тер Ме ет Бер Уа Аг іп Аа Рго Сім уз Оу ви Ов Тур Ма!

Аа Тук Пе (у5 Оп Аби сну А си ув Туг Ту МаєАзр бат Уа!

БТ! Ба 50 ух СНУ Ага пе вт Пе 5егоАте Ахр Ази А вух два 5егіво Тут 79 75 во

Гео бій Мат Ап. ет Бей Аге Ав бій Ар Твє Аа Маг Тує Ту Сук

85 90 95

Да Аге бін Оу Пе ек Тер ве Су Акр беи Рго Те Ре Ттр віу 100 105 1юЮ

Сі Оу Пт гей Уа! ТНг Ма! хег ет Авіа заг ТВК уз су Рго зе 115 що 125

Уа Ре рої ен Аве Рго Су 5ег Дкр бе Тв ет І 5ег ТАК АВ 130 135 140

Аве м Суб рен уві Сух Авуєтут Сне Рга сіру Рто Маї ТНК Ма 145 150 155 їі80

Фег Ттр Ап бег у Ав Меи Те бек оїу Уа! Ні Твг рве Рго. дів 165 170 175

Ма Бецоіп бе бе іт ви Тугбегіво зек ву Уаі Ма! ТНК ма їхо 155 190

Рго бек бек Ап Ре су Твоїй ТАЄ у Тв Сух Дбп Мат Ар нів 195 200 205 уз Рго бек Ази ТНу бух Уві Ахр у. Те Уві Сію Атр Гує Су Сук ?Іа 715 220 ма! бів Сух Рго Ред Сух Рго Аа Рго Ро Маг Ав у Ро 5ег Уа! 295 230 2235 240

Впеїви Вне Рго Рго Гуз Рго (ув Асі Тгіви Ме Це чек Аге Те 345 250 55

Рева сін Узі Таг Сук маї ма! Узі дер Узі бе НО Авр Реб Си 250 265 270

Уа! сій Ріє. Ази Ттр Тут Уві Азр обіу Уа бін Уві Ні Азп Аа ух в 280 285 "Тве ух Бгто Аг біо Ох бій Біле Ап бек ТвеРВе Ага Уві Уа! 5ег 290 295 збо маїцен тв Уві мар 5 бів Ар Тер ец Ап біу ув бів Туггух

З зіб 315 320 бо

Сузіув Маї зег Авп ух Бу ви Рго діа Рго Пе Сів Гу5 Тв Пе 325 330 335. бегіує Тату СУ п га Ат Б Рго и Ма! Тук ТНК кеч Рео 340 3а5 зо

Рго 5ек Атв ім сів Ме Те ух Або бій Уа? Бек ївеи Тв Сух Геу 355 за 365

Уа! ух іх Ре тую Рго 5ег Авр Не Діа Маїс Тер бів 5ег Ав 370 375 ЗВО

Сім бів Рго бі Ап Авт Туг ув Те Тс го Рго Ме ей Ар бе 385 зо 395 490 дер Оу бее Ре рНекец Тугбегіу ви Тк зі Ар у ет Аг 205 30 815

Тгр бів бій су Авп Уа! еле зе Сув бе Уві Мет Ніх Сію ліжіео 550 425 430 дет Ні Тує Тв бій бух зе фе бек гей Зег Рео біу ух 435 440 445 «210526 «11 505 «ЗТ» Білок «2135 Штучна послідовність «205 «феї» ване «223» іп Опис штучної вослідовності: сивтетичний поліпептид" «400» 26

Мем Ргобіу Сух Цує Тер Акріїви кео Не цу Сіл Тер Ма! суб Ар 1 5 о 15

Рго ей БІ; 5ег Бу бег Аа ТНК ОК віру бек С; бе Біу Ав бег

Бе у 5ег Бу 5ег Ав. Те БІК Зектеи Ре СУ Суб Гу Тр Ар 85 0 45 іен тва Неї ув бів тв а! Су Ар Ро ей Бу БК ОЇ ма Сів а іви Маі бій бег ОКА СНУ іх ем Магсій бго су Сіу бег Беи АгЕ

Бо 70 75 во їей бе Су Аз дів 5ег БІК ее не Ріе бе бег Туг тр Меєвег 85 98 по

Тер уві дув біп-Аїа Рго Оу бух Віу ем ОЇ Тер Маї Аа Туг Ме 100 105 116

Гука А5о віу Ап СЮ іу5 Туг Туг Уа Ар без ма) у су Ат 115 пло 1275

Ре Тнг Пе бек Атв Аер Азп дів Гу Ап оегієи Тугіец біп Меї 130 135 146

Двпобег бец'Агре Аа бін Азр Тег Аа ма! Ту Тут Суз Аа Агр бю 145 150 155 160

Оу Не їев Тер Ре Бу А5р їец Рго ТВ РНе Трр.ом Ов бу ТНЕ 1655 70 175 ів маєте маг5еєбег діа зе ТВгі ув сіу Рго бе Ма! Рпе Рко 180 185 150

Гей Ада Рго Сус баг Ат бег ТНе Чег Сію беє Ту Аа Лів беч біу 195 200 205

Суз сей Уа уз Азр тут РаеРго Сів Рго Мві Ту Уві 5ег ТерА 210 215 220

Зег Сбіу Аа цем Те бек у мані Євгене Рго Аа Уві Севай 225 230 235 240 чег5ег Мі ви Ти бегіво бег бек ма! Уа! ТА Уві го бе 5еї 245 з50 255

Ав Рне Сім Пагазі Тве тує Те Сує Ази Маї Ар ння ух бу бе 250 255 270 дп Тег уз Ма! Ар ув ТвВг Уа ом Аг Ту Суз Су Ма! псує 275 280 285

Рго Рго бух Бго АВ Рко Рго Мат Ав іу Ро баг Уві пе Тез Рне 290 295 00

Рго Рголуз Рго Буз'Азр ТВгіек Меї Не Зег Дте Те Рго бів Уві 305 1о З15 320 твгоОрвУуаі ага Ахр Уві 5ет Ніз у Ар Бгто бі Магоїв Рпе 395 330 335

Ап Тгр.Тує Уві Абросіїу Уа! ін Маї Ні Доп Аа Гуз Те Ту Рго: зо 335 50

Ат о о біз Рне Ап баг Тв? Ре Ага Уа! ма ет Ма цес ТАг 355 360 365

Уві манні іп Або Тир ви Дяп ту бух бід Ту бух Сухі ух Уаї зо 375 зво бег дп Гук ЗВ Бен го іа Рго Не бір ух Тр Це бек ух Піт 385 390 395 400 уз бік біп Рго Дте Сів Рео біг Уві тує Ті Бец Рго Рео бегАте

405 0 415 со Ме Твг ув Ап сів Ма зег фев Так Сує ви Уві ух Сі 420 425 430

Ре Тук Рто Зег Ар Це Аа Мі Сім Тер Си Зег ха Ов Рго 435 44) 45 ім Ап Азп Ту Бує ТН ТВгРго Рго Мері ет Авр БЕК Азр БЕ бег 450 455 «во

РнеРнеіїев Тут ет ув ев Те Уві Ахр у бек Ак Тер вів Оз 455 470 475 ВО бі Аеп уві Ре 5ег Су бек Уві Ме Ніз СИМ Аве ео Ні Ай Біб 485 490 495

Тмг т бів ув бе" еп бегітеи 5ех Рго СІУ у

БЮ 505 «210527 «21ї»275

«212 Білок «2155 Штучна послідовність «2205 «2212» зацксе «2235 Дютех "Опис штучної послідовності: синтетичний поліпентид" «Ох 27

Іеч Рго Бі Суз (ух Ткр Девіесітео Ме Гуз бі Тер Маї Су Абр ї 5 10 15

Рго ей цу зе біу ес Ді те Су Су 5ег су бе Зх Айва бе

Бегоім бег Бім бег Аа Тит о 5ег ЕеО Рг СУ Сув Гух Тгр Ар

За 4 45 їеш без Не ух Сів Ттро уві Су Ар го їеи Су су Ар Не віп

БО 55 бо

Ме Те бів Зек Рго-5ет бег ей бег Аз зеєуаї Су Азр Ав Уа!

Б 79 75 кота.

Те Пе Тре Сух Агв Аа бет бів бі Не бет Ази Прівн Аа Тр 85 50 95

Ту біп бій бує Рг бі Ехо Аа Ріо ух ет ен Це Тут Аа Ав на 05 10

Зегсбегівц Снп Зег біу Ма! Ро бег Агв Ре баг бі зе ої баг 115 120 125 ві Тк Азр ве Тіт ев Тек Не 5ек зег сен сів Ре ів Ахр ве 130 135 140 діа те Тук Тук Сув'біп бів Туг Азр бег Тук Рео Аго Певне біу 345 150 155 1650 й тиг ух Маї біс Целув Ате Тк Узі ліз Аа Рго Зег ві 165 170 175

Рне Пе вне Рго бо заг Ар Сію бів ем ух Заг Оу Тл Аа бет ї80 185 190

Мама Суб іва ви Аа Ап пе Туг Рго Ате Ор Ав ух Ма сій

195 200 20

Тер уз Маг Авр Акт Ав бер оп баг БУ Ай ет біп Ор бег Ма! го 215 320

Те сік дій Арзегіух до ет ТНг Тут Зегіви бег Зег гів 225 330 235 750

ТВг еф бегіує Аа Ар Тук ей Суб Ні ух Маг тує Ав Сує від 245 250 258

Уаї Тв Ні бій бу бео бегові Рго Уві Туз бек Рре Абп Аг 250 255 270 зу сін Су 275 «2105 28 «231511 «13» БІЛОК «7135 іШЦтузна послідовність «220»

«27825 /поте "Опис лучної поспідовності: синтетичний поліпептид" «005 78 си магев бец масі бе СУ ім Сіу без Уа сій Ро Бу Оу 1 5 10 і5 зегієв Акт ви зе Су Ав Дів зе у РБе ТВ РНе вет ах Тує

Тер Меї 5ег Тер МаЇ Атк біп Аа Рго біу у Сіу ее Сів Тер Уа! діа тут Пе бує бій А5р Су Ази Сім Гуз Туг Туг Ма Ар Зег Уа бо і у Аге Рпе Тс Не бек Агро Ар Доп вія ув Ахв Бег бе туї 65 70 75 во

Сеча Ме Аби бег іви Агр. Аза ін Ахр ТА Лів Уві Туг Туг Сув 85 90 95

Аа Агр ОІ У Не сем Ттр Не біх Ахр ем Ро ТВ Вле Те Су

Мо 105 110 сій бу Тківно уві Тве уві 5ег 5ег Аіобег Таг ух Шу Рг ес 115 120 125

Ма! Ре Рго Сени Ав Рео Суз ех Дер ес Тк бек Зк бек Тк Аа 130 135 140

Аізісц Су Сузіви ма Гу Ар ТугРНе Ро ЄПисрго Масть Май 145 150 155 і60

Бег Тур Ап ет Су Аа Гео Тв Зеу Оу Узі Ні Те Рве Реб Ав 165 170 175

Ма ей бів бе Бе Сім ви Ту бег ес бетг ех Ма! Уві Ту Уа

ВО 185 190

Рго Хек бек Авп. Ре 5їу Те ой ТВ Тує ТА Єує Аа Уа Авр Ні5 195 щю 205

Гух то зег Авп Тік у маї ер Ту Пи Уві бі тр іу» бух Сух

210 215 220

Ма о Су Ре Ре Су Ріо Аа то Рго Уа Ада СУ Рго бег Уа 225 23 235 240

Ре ец Рне Рго Рго | ух го ух Дер Пе ей Ме Не 5егАго Те 245 2503 255

Ргоіо Маг Те Сух Усі Уа ма Ар уві бат іні Оу Дер Ро збо 255 270 ма! бів Ре Доп Тер Тут МагАхуєбіу Уві ім Ма Ні Ав Ав ух 275 280 285

Тк іує Рго Аке сно ОВО Рне Ап обек Тх не Аге Ма Уві зе 290 295 з00 магйеиц Тв маї ма Нів біг Ар тро ев аво у уз 1 Тук ух

З05 З10 315 з2а

Суз уз Уві 5ег Ав іу5 ОМ 1еи Реє діа Ро Це Сім Гу Ту Не 325 З30 335

Бегіу5 Тіг1ух біу бій Рго Агв і Рго бій ма! Буг Ту ів Ро зо З45 350

Рго 5ег Аге бін бій Ме Тв Тує Асп біл Ма бес ів Пі Суєїех 353 З5о0 Зо чан о РнНе Тук Рго бех Ар ле Аг Ма! ай тьр сів зег Ази: 371 З75 ЗВО

ОБОЇ Рео бів Ахп Ап Тусіух тт Тве Рго Рго Меї Геи Ар бег 385 з90 395 Зоо

А5р Оу бег РНе Япе Се Тут Зегіуютви Те МВгАбр ув беє Ар: 405 410 415

Тер Сів ап Зіу Абп уві Ре бву Суб бек Ма Ме Ні Ав Кей ага 425 430

Ніб АхиНіх Тує Те ій ух бег Гео бек без бек Рго сіу су зу 435 ад) 445 су бів Рго ОХ бух у Тер. Ахріевіву Не Гуз бів Тер ма! 450 455 Бо

Сух Абр Рго ви СіуУ Су Бу Сі бе Су сіу СУ бу бе су бі; 465 470 щ75 АБО

Су біу ек Оу Сіу бу Оу ек Оу Оу СУ біу бег ей Рго біу 485 490 495

Сувів тив Абрівцівй Неїу Чі Тер. Маг Сує Авр Рго Гей 500 505 51 «219229 «и115 51 «812» БІЛОК -ї3х Штучна послідовність. «вах «221» 5о0Ісе «273» /поїех "Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «Ай 29

Сі Ма! біпією ма! бів Зег бІх біУ Су ре Ма! біп Рго біу бу.

Ї і 10 15

Бегфец'Аєв ей бег Су» Аа Аз Хег Сіу Ре Ті Рне бек зак тує зо

Тгр.Меї ет Тгр. Уа! Ас біп А! Ргозу у ОБ Тец ібн Тр ма!

Аа Тує Не Цух біп Авр бі Ал іш у Тук Тук МагАвр зеє уаї що 60 му у Ап Ре тре Не хег Ах Ар. Ап Аа Гу Аст Бак ем ТУг 70 75 о

Іеч біп МегАкп 5егіви Аге Ав сію Аер ТВх Аза Ма! Тук Тут Су 85 що 95

Аа Аг б біу Не Кео Тр рве бу Ар без Рто Те РНе Тер бу 130 305 ле віп ох Тісівєц уві Твг Ма! бет чек Аа бег Тек Гуз біу Рго бег 315 120 125

Уві ве Рго Ге Да Рго Суз 5ег Аг 5ег ГГ. бег бін 5ег тег АВ 130 135 140

Аа ви біу Сугіви Уві Гу Або Тук Рпе Рго Сію Рго Уві Ве Ма 345 150 155 160 бег Тер Ап 5еї СУ Аа Тео ТВ 5ек су Манів Те Рве Рус Аа 165 170 175

Уві еи бів бег Заг Оу і ей Туєбегіви Зег ет ма Уві ТАг Уа! 180 185 10

Рго 5еє 5ег Аза Ре Су ТНК біоти тує Те Су Аби Уа Абр Ні 195 200 205

Гує Ро бек Ап Тк бух Уа! Азр Гу Те Ма! ЗіН АТ Сух Су Суб 210 2715 220

Ма З Сує Рг Ро Су Рго Аа Рго Рго УВА Сіу Рго Зег Уві 225 230 235 240

Рвеїешй Ре Рго Рго ух Ро ув. Абр ТАг рен Ме Не бег Атв ТВг 245 250 255

Рей сім Ма! Те Сує Магруаї Маг Авромаї бек Ні Сі АзроРго вів 260 265 270

Маг біт РВЕ Авп Тр Туг МагАбр Су Маї бів Ме 5 Авп Аа ух 275 280 285

Тв Гу Рго Ат б. бів бів Рне Або зег Те Ре Аге Уа! Узі баг 290 295 з

Манец Тк Уа узі ніх біп Дер Терец деп ЗМ ух бід Тут ув аб З 15 370

Сувіуз Ма! беє Ану Оу Бен го Ага рто Не СИ Бу ЕВ Не 325 зза 335

Баг Сух Пи цує СУ бів вто Ап о. Рто біп Ма! Ту Твг ен го 340 345 350

Рго зе Агро бін бів Меї С1у іх бен Ро Су Сує ух Тгр Ар ем 55 З 365

Гем Ме ув бів Тр Уаї Суб Ахр Рго тем іу Зег Оу бег Аіа Ту

Злі. 375 зо су у зекок зе СМ Дія 5ег бек БВ; баг Оу Зех Аа Ті Оу зя5 390 395 400 егівн ко Оу Су бух Ттр Азрівц тен Не ух бій Ттр Уві Сує 405 А1й 415 дер.Рго Це су Бі Те ух асп бій Уа! беєбео Те Сує Без Уа 525 430

Гук Сіу рве ТугРтю бек Азр. Не Аа Маг Тер іа бег Ах Оу 435 440 445 біт вхо бів ап деп тугу ТВ ТАеРКО го Месію Ав бе Ар 450 455 Бо

ЗУ Зег Бре ро ем Тут Звг Гуз їв Ті Уаі Ахріух бе Аг То

465 470 475 Аво іп Оу Ап Уві Ре бог бує Бет Ма! Ме Ні ЇМ Аа (ев НЕ 485 490 495

Авт Ніс тукТнг іп ув бег Геибег ей бесРго Оу ух 50 505 510 «210530 «11х450 «217» Білок «713» Штучна паслідовністе «20 «?71х 5омшсе «223» /поте Опнс штучної послідовності: синтетичний поліпептид" «а00» 30. іш Уа! біпіви Ма! сін зе сіу віх біуїец ма бій Ро Су Оу 1 З 10 15 бегіви Ага Ге бе Су Аа Аза баг у Ре Ву Ре бог ет Туг

Тер Ме збет Ттр Маі Аге біп Аа Рко Бу ух Оу Бец оь Тгор ма

Аа Гук Не 1у5 біп Або Су Ап іо губ Тут Туг Маг Авр бег Маї 5 Се) вує біу Ате Ре ТВг Це Хек йтр Ар. деп Аа ух Авп бет Те Тут 70 75 хо ев біп Ме Авп 5егеи Агро Аїв Сію Аєр ТВг Дів Ма! Тут Туг Су 85 90 95

Аа Дер біо У Пе сем Тер еле пу Ар бе Рео ТВЕР Ттр бу 100 105 116 сіп сіу Тв іеи Маї Ту Узі хек бек Ав бе ТАгіуз Бу рго бег 115 120 125

Уа! Рне бго ви діз Рео Сух зе Атр 5ег Ті 5ег-ОІШ ек ТВЕ дів 130 135 ма

Аівіви біксСу«тец Ма Гуз Ахр Тук РНа Ро бід Ре Уа ту Маї 145 150 155 150

Бек Тер.Асп бет біу діа ва ТВ бек Бу Ма Ні Тег Реве Рго АВ 165 76 175

Ммагбеи бін ек бек Сіу есе Ту? 5егіви ет 5ег Уві Маї Трг Ма! 180 185 190

Рго бег бек Або Рів БК ТАТ о ТАК ту Тв Сух Аби Мат Агро Ні 195 яю 205

Гуз го бет Ази Тпгіух Уа Ар уз Те ма! аКЕАгв уз Сух Суб 210 215 220 маг сі су» Во Рго Суб Рго Лів со Рго УагАа біу Рто Зег ма 225 230 235 280

Рнеїец не Рго Рго Бук Респ ух Або Те ео Мет Не бе Ав ТАг 245 254 255

Вгозжав Ма Те Сух Уаї Уві ма! Ар Уві бек Нік іш Ар Ро ОМ

2650 265 29

Уагаіп Рне деп Ткр Туг Ма Аер су уві бін магєНік Аа Аа у - 275 280 255

Тве ук Рео Ага ою и бій Ре Авпо бе ТВт Ре Аге Ма! Ма! Зег 290 235 300

Ма Без Тит у ма) Ні БІВ Аее Ттр Беца Зм ух іш Туг ух 305 310 315 320

Сув ух Маг бе деп ух бі еи Ред Ада Рго Це бір Гу Так Пе 335 330 335

Баг ув г Куб у Сів Кго Агр сіш Бгто Сів має тує Те Бе Ро зай зА5 з50

Рто ет Аге зів ме сіу біу ей бноіу Суб Тер Ав тев за5 БІТ 365 ев Пе Гук сій Тгр Узі Сує Авр Рео тео сту у Ат суб Авиовій 370 375 зво

Ма 5вг ен Твг Сухе мМанує сіу Ре Туг Рго Зек Авр Ме Дів зво 390 395 408

Мане тер ов 5ег дев ЗМО Ро ОШ деп АБИ Тугцує ть ті 405 410 щі

Рго Рго Мебіви Ар бек Ар у бе Рпе Рне Геи Тут Зег ув ек 420 825 430

ТВ МагАхріув 5ег Аге Тер бій іп ОБ Ази Ма) не зе Сує бег 435 440 345

Узі Меї Ніє бів Аа Бен Ні Аза Ні Тут ТВ Оп ух бег їв дет 455 460 івм 5ег Рго СМ ЯМУ біу БІК іх 1 еи Рго біу Суб Бу Тер Азр Гео 465 ата 75. 480

Кеш еїух бів Тур Уві Су Ар бго Се 485 аа

«2115 491 «212» Білок «213 Штучна послідовність. «220 «221 5ошнсе «га /погек Опис штучної послідовності: синтетичний поліпентид' «40031 сів ма! бій їер Уві (Я Зек б оіу бі бен Ма! іп Ро Бу бу 1 5 10 15 5ег є Агр і ец бег Суз Ав Ав 5ег Оу Рле Кр БНе бег Зег Туг

Тер Ме Беє Тер МабАте іп-Ава Рко біу був БіУ їв ою Тер Уаї 4 45

Ав туєНеїух сій Авр ОМ Ап сні ук тує Туг МагАвр ет ма ве БО

Гуз сім Аг ве ТНК Не зек Ате Ар деп Аа ух Дей Зегіво Туг

655 70 75 Во їеч бій Ме Азп 5ет їеи Атв АВ Би Ар. ТЕ Аа МагТує Тут Суз де 80 95

Аа Аге Сів Оу Це без Тур Рае СУ Азріво Ро ТВт Ре Тер Оу яІА 5 110

ОЗіп су Твсіеио Маі ТАК Магзек бе дів зе Так ух ЗК. Рко бек 115 120 125

МагРБе Ріо їви Ав Рг Сух ЗегАгв Бек Тк 5ег ій бег ТНІ Ав т30 135 140

Дій їез Оу Сузіеи Уа ух Дер Тут Ре го пи Рге Уві Тве Уві

Т85 150 їІ55 160

Бет Тер Асо бет БУ Ада бе Твг ех БІК ай іх Тв вле Рув Аг 1655 Т/л 175

Уа ев бів Зек бот Сіу ецТуг ек Бей Зет Зех Ма! Ма) Тл Уа! ї8а 185 90

Вга бет зе Аби Не і Те Тв Тук Тве Су Аке Маї Ар Нів

Іч5 200 205 вух Вго чес Асп Тиг уз Ма! Асі их Тне Уабоїи Ат ух Су Су 2 215 22)

Уа еіш сух Рез Ртосух Рго Аа Рго Рго Маг А(е Бі го зег Уві 225 250 235 280

Рнетей Ре Рго бго іу5 Рго 1у5 Ар т Ге Меї Це бег Аг ТЕ 245 250 255

Рго бів Маг тйг сСує маг Уа МагАзр Уві Бех Ніз Є ОМ Бе Ро 260 265 270

СУ Сух бух Тр Азвівої ви Це ух бій Ттр Уа Су Азр Ргоїеи 275 ТВО 255

ОВК ОМ Акр Рго біс Ма сій Рее Ап Тр Туг УВЕАзр ОК Уві 280 295 зо сш Ма! Ніє Ав Аа Бу Тк бує Рго Дербі сім сій Реве Ар бек 305 310 315 320

ТВгРНе Аге Ма! Маї 5ег ай во Те Уві Уа! Ні бій Авр тр бео 325; 530 335

Авп біу Гуз СПотут рух См ух Ма! бег делі уз іх ей Рго Дів 340 345 З5о

Ргое- бін бує Тит Це бег Бу Те Су ЗМ с РеосАка Сіно Рго 355 зво 365

Сів Уві Туєтвг ей Ро Рго ет Аге бів Си Меї бу Оу Сви Ро 370 375 зво сі суху Тк дер ген Бе Пе Гук біз Тероуві Су Ахр Рко Сей 385 39 395 00 біу Біу- Ті Був ев бів Уа! бек уец Тв Сух уев Уа ух Су Рве 405 ца 415

Тут Рго-бБег Акр Пе Аа Узі бі Тер іс бек Ав у ій Рго бім 420 425 430

Ав Акп Тук Гух Тв Ту бо Руо Ме ібеи Ав бег. дробу хег рве 435 440 445

Рпесез Тугбет Бук ев Тк Уа АвріувбегАгто Тер біл (3Еезіу 450 455 460

Асп ма! РНе бег су бе Ма Мет Ні (І Ав Сен Бе Ази Ні Туг 45 270 45 ява

Твебіліх5еєіеюо зе ен бег Ргоат у 485. Кеті «20235 «2112 7583 «2135 Білок «2133 Штучна послідовність «20» «гії» оце «293 /погех"Опис штучної послідевності: симтетичний поліпептид"

Мегієц Рго Сім Сух іу5 Ттр Акр без ес Не ух бір Тер Уві Сух

Ії 5 то 15

Авр Руку ен бі бе Оу 5ег дів Тв с су бегоіу 5еї ТА Аа 5егбегоу бек ЗіуУ бег Аа Ти НЕ Меківи Ра су Су Гуз Тер

В. 45

Ахрівврітвен не ух ів Тер Уа! Сух Авр Ро гео у су Су бу 60 віх ма Аєр ух ТиСНІЄТВУ Су Рг Ро Сух Рго Ав Рго ів рей 55 70 75 що іер біу біу Ро Зек Уві Ре Гец Ре ро Рго ух Рго бух Ар ТВг 35 о 95

БешМесПе вет Ате Ті бго бін Маг Тк Су Уві Уві Уві Дер Уві 300 305 1юЮ бек Ніх біш Ав Рго Сім Уа! бух РВе Авт Тер Туг Ма! Азр Оу Ма! 7 125

См Ма! Ні доп Аа бух Твг (ух го Ага сів Бім бій Туг Ахл бег 130 135 140

Тек ТуєсАвв Уві Ма 5ег маціец Таг Уві геу Ніз Вій Дер Теріев 145 150 155 1650

Аа Оу ув ін Туг Був Су їу5 Ма! баг Ап у Аа ем Его Аз ї55 4У0 175

Рго Пе ів бує Тр Ме бек ух Аа гу Ну іп Рго Аг Ойерго 180 185 190 бів МабТуєтТьківн) Ре Рго бесдги Ар ні ен Тк рух Авп бій 155 200 205

Ма баг цев ТрРСубіви магкув Оу Бе Тук Бко ее Аер Не Аа 210 215 220

Манів тив січ бе Аа Су Сів Рто Сій Дер Ас Туг бує ТВ ТЕ 225 280 235 240

Рго Рго Май ек А5р-5ег Ар Оу Бег рве Рреїецй Тугбекіує Теги 2435 250 255

ТвЕМа! Абр ув бекАта Ттр Сів бій Ву Аби Ма! Рне Зв Суб бек 250 255 270

Уаї Месніє Є|н АВ Тек Ні Ап Ні Туг ТВ п ух Бегіеи вет 775 780 285 іви ек Рго Сім Гух 290 «210533 «112232 «217з Білок «139 Ногпо зарієпе «0025 33: бій бто гу бек Сов Авр ує Те Ні Пе сує Рто го Суб го Ав: 1 5 10 15

Вт си зеніви бІХ ОІуУ Рго Бег уа| РнеТец Не Рго Рго Гув Ро 20 25 зо

Гуз Ар Твгіец Ме Не баг Атге Тс го бів Магт Сух Ма! Уві 35 чо 45

Уа! Азр Ма! зак Ніб СІ Абр Рго бі Уа бує Ре Ап Тер Туг Уві 50 5 Бо

Ар Оу Уа он Маї Ні Дей Лів ух Тему Рго Агв з Сім бів б5 70 75 80

Туга бег Тр Туг Агро уві ма! бек мані ви Ті Уа Те Нів біп 90 95

Ави терієей Аза с у бів ТуєтухсСує і у5 Ма бет Аби уз Ав 100 195 110

Геи Рго Аве Рго Не спи ух Тв Не ет ув Аів ув ОМ ій РЕ:

МІ 120 125

АТЕ біговій мої Тук ТиЕЕеН Рго Рео бе Агр Аср СІ Тер ТВ ї30 135 150 уз Ай бій Уа 5ег ее ТП Суб ге ман іує су ене Туг Рго бег 145 150 155 150 дер Не Ав Уві БІ Тер би оех Аблов бів го бік Азп Ази Тут 165 270 175 ух Те Те его Рго Уві цен Ар зет Абр.їу Заг Ре Ре ев Ту 1850 185 190 бег тує їви ТВг Уа Ар (ух зеу Атр гр сп бів Сіу лей Уві Ве і95 200 205 чег' Су» ет Уа! Ме Ніх СИ Ага ви Ні Авп Ні тує Тв Ой ру 210 715 зга бегіви бегіви Бе го Сік ух 225 «30 «210534

«її» 238 «и122»- Білок «-213» Ното зарфнепе «00» 34 сім Аг Су Сух Сук Ма! Сію Су Ред Ру Сує Рг Аа Рез Різ Ма! 1 5 10 15 діа у Рго бег уд! Ре цем Ре го го ух Река ув Авр Тк ех

Мене 5ег Ду То Рго сів Маг Те Сух Ма! Уа Уві Дер Уві бе дО АВ

Ні Сіш Аєр Рго Сів Маг бій Ріє Абп Тко Туг Уа! Ар у Ме бів 5 50

Ма Ніс Ап Аа у Пн рух го Ак біз бід сій Рве доп зек ТВ ва 7 7а 80

Рне Аго Маг Уві бе магів Тр Уві Уві Ні бій Акр гр Се Д5и 85 90 95

Бі уєєів Тугє і ув Сух цу Маі Заг Ап іує ом 1 еи Ріо Ав Рто о 105 по

Меч зім у тнє Це сег Цує Тв Бу бу бін Рео Аг бін Во. бін: 115 120 125

МмагТує нг бецРтго Вго 5ег Агя ОБО Ме Те бух А5и іп Ма 130 135 140

Зек ем Пе Сух Ге Ма у ОЇ Ряе ТукРес вт Ахр Пе Аа Ма 145 150 155 160 сів Тер бо бег Ап Оу біп Рго бін АбпоАбп Тут Ту ТВт Тпгобго 165 170 175

Вго Ме Ееу Дер бет Акр бу бег Рпе Ре їв Туг ер ув Гео ТВг 180 185 1950

Ма Азріучбег Агр Тгр біг бів Оу Ап Узі пе ет Сух бег Уві 195 200 205 ме ніх сім Дік їен Ніх Авп Нів Тук ТАг бів ух зегівен бегіво

210 215 220

ЗегРго су ух 225 «210535 «11 «212 Білон «213» Ното зарієпе: «ДЮ» 35 сн ге Суб Тк Ргоїви бу Ар Твг Те НІВ Суз РгосАтя Суб 1 5 30 15

Рго бін Бгто ух беї Сує Дер тн Рго Вго Ро Сує Рго Аге бух Рто сід го уз век сСух дор Те го га Вго Сух Ро Аке Сує то бін

Рко Туз заг Су А5р Тк Рго Ріо Рго Суб Рго Ате Су Рго Ав го

КЗ) 55 Ба сішіввіви сб ОБ Рго бег маг вве тец Ре Рего Рго вух Реб ух 65 70 75 во

Авр Тео меєне зекАтке Так Ро бір ма! Те Сує Ма мали 85 по щ5

Дер узі Зег Ніз іо Ахр го бів Маг бів Не Гух Тер Туг Уві Ахр 100 105 і су маї бір Ма! Ні Аза Да ух Те ух Рго Аг Бій ом сій тує 115 420 125

Аби Бе Ці рве Агр Уа! Ма зе Ма Се Те Ма! ен нн бій Абр 130 135 її

Тер Сец де іх ух 1 Тут ув Сує ух Уві бег Ап у Ді 1еи 345 ї5а 155 160

Вго Ав Рер Ме со (ув ТВ Пе бег бує р Бу» віх віп бо Дке 165 1/5 175 бір Ро біт Уві Ту Пн Геу го Ргобег Ага бі бід Меєтве ух

1850 185 190

Азп сій має 5ег ей Тр Сувіїеи Ма 1у5 Оу Ре тує Рго 5ет ор 195 0 205

Не діа ма! бін Тер бій зег бег Оу бів Рго Си Ап Абп Тут Ай 215 220

Ті твеРго Рго Мегвь А5р бег Абр біу зег Ріе.Рпе сен Ту 5ег 225 230 235 243 іухтер Ти Маг Аер Гуз ех Аг Тер бів бу Асп Не рве бек 250 5

Суз Зег Уа! Ме Ні Сім Аїа Ген Ніб Аби Аге Ре Тіт біп ув беї 250 255 270

Тен бегіви бек Рго (іу (ух 775 «210536 «2115229

«932» Білок «135 Ното заріепь «00» 36 сін бек (ух Туг Сіу Рго Рго Су Рго 5еу. Сух Рго Аа Рго Оу РЕ ня 5 НІ, 15

Теми Сіу бу Рго бе Маг РНе ер Ре Рго Рго Гуз Ргоу5 Ахротнх 2а 25 30

Гео мене бес Атр Те Рео бій Ма! Ти Сук ма) Ма! Ма дер маї 5ег бів СВ Авр Рго Ор ма! бій Вне Аа Тур Ту Уві Аєр у Уві

І--)

М Ма! Ні АбеАза Цу5 Те ух Рго Агр Сі С16 бій Ре Авл бег 65 70 75 та

Тв Тук Атя маї Уві бег ма гео Те Уа ецеНів біл Акр Ттр ей 85 ча 935

Ап Бім ух Зою Туг Ту Суху Ма! зег Ап цух іх 1 ец Рго 5ег що 105 1ю

Зес Не біб уз Тве Не Зег Су Аа Гу Му бій Рго Ар ОВ Ро 115 120 125

Ой Ма! Тук Тпг ей го Рго бег бів Сів ОХ М етьг кує Ап сів 130 135 а

Уа бет ви Тйг Суб ви Уві ух Су ЕВе Тує Рго 5ег Ар Не ДІ 145 150 155 160

Уа! бів Тур'Єїю бе Авт СТУ і Рго 1 Ап Аеп Ту? Бу Те ТАЄ 155 1/0 175

Рехрга ма! еи дер-бет Абр ау бегРНе ве ев Ту ет Ат їв ї180 155 а

Тву маї Ар бух бек Ак Тгр гл вім ох деп маї Рне бег Су беє 1955 200 205 ма мені обі дів ес Ні Аа Ні Туг Тпе бін ух Бег се 5ет 219 215 220 іеш5егіви бі Тує «210537 «КМ 4 «1» Білан: «213» Штучна послідовність «ад «2212 5оцгсе к2735/ ие Опис штучної послідовності: сивтечичний пептид" «ЛО0» 37

ПО Оу бег 1 «1038 «гії «217 Білок «213» Штучна послідовність «а «аа» вот «23» лотах С писштузної послідовності: Єйнтетичний пептид" «МК» 38

ОК віу бір Рто 1 «2105-38 «21124 «217» вілок х/132 Штучна послідовність «ад» «2» анусе «255» гпстех"Опис штучної послідовнастк синтетичний пептид" «00» 39 сус ЗУ Вій

І

«71д5 Ап «Вр 212» Вілок «2135 Штучна посвідавність «20» «721»50Щсе

«793 йпоге Опис штучної послідовності; синтетичний. пептид" «05 40

ЗБ ОО о і 5 «ЕН» 4і «11254 «3125 ДНК «213» Штучна послідовність «20» «1» зашисе каза»х /поте Оптис штучної послідовності: смнтетичний олігонуклестид" «4005 ді сідссННЕЙ різватрреа ССірсінаїс ааасаріяви ЗЕвінассс ВИ 54 «и» 42 к21і12:12 «2125 ДНК «913» Штучна послідовність «ай? «ізо

«2532 /потех"Опис штучної послідовності синтетичний олігонуклестид: «Ой» 45

ВРІВЕЕКІВ В 12 «10х43 кз1їУ 59. «З12УДНК «13 Штучна послідовність «0 «2721250цтсе «235 /потек Опис штучної лослідовності синтетичний олігомнуклеютид" «220» «221» модифікована основа «222361. 36) «223» акс, їв, невідома або інша «4005 43

ВЕЗІССВЕН сійстасіве ВЕС ССвес Тссабпвсаа всі вИ с арЕсавіШся БО айсасе 63

«9105 44 «2115 Я «2122 ДиК «713» Штучна послідовність «ще «2215 50Витхе «во /погес тис штучної послідовності: синтетичний олігозуклевтид' «ох 44 веаїссррі сірегаре кві ссвееїссрісьсаа рсгрвйсаврсавівсв бо зсісаісв ща «210545 211559 «212» ДНК «213з Штучна послідовність «В» «ех ваше «ТЗ» поїв Опис штучної послідовності; синтетичний олеонуклеотид" «40545 яБеІССрЕМ СрСТаЄТвВ (ЕМ ССЕЕЄ Ксстсресва всістерисаввсарівся 650 зссас 53 «30» а «1533 «212» ДНК «13» Штучна послідовність «270» «2212 50игсе «293» /посех Опис штучної послідовності: синтетвчний олігонуклеотид" «ВО» 46: севкекавісаврретвиіве сазствена всс 33 х2105 47 «її» 21 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «о» ке» зацесе каз» пеагех Опис штучної послідовності: єимтетичний олігонуклестид" «ДОП» 47 всівсаїсса вин есвзавиї 21

«ТІ 27 «ЗБ ДНК «215» Штучна послідовність «од» кегІт»5ошисе: «223» пове Опис штучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид" «ОО АВ сазсеріатр зізаНасссіснвася 27 «210549 «211515 «212» ДВК «213» Штучна послідовність жах «йаї» оце «а33» пинех"Опиє втучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид'

«00» 48 авНайроаівані 15

«2105 50 «122 ДНК «713» йШнучна послідовність «220» «241» оце «273» /вотек"Опиє штучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид «4005 50. їасагазаре авакаїдквав тІравзамас 1Вірівкасі сцидававен с зі «2251 «11535 «2125 ДНК «2132 Штучна послідовність «й» каїї» зоиксе «вг3з /име«7"Опислотучної послідовкоєсті: синтетичний лігонуклейтид" «А0О» 51

Казревяасас ен ИсрЕ нас асо асвис 16

«и» ЗА «2125 ДНК кг13 Штучна послідовність «30» «221» оце «2235 /пове Опислатучної послідовності: синтетичний полінуклеотид"' «ЩО» 52 вБасаїссава грасссаріс їссаіссіса стрістясяї сіріарвана саравісясс 60 вісаси ріс рерсраніса вена йарс азсівенар ссівиіаїсв резрааасся 120 веЕЗазнесе сіаарісссі вас аївстрсасссави рсааавіре ярісссаїса 180 вевмсався есартвраїствевасараї Нсасісіса ссвісовсав сстрсавссі 240 вазнацітв сзаєнеана ствссаасад іагратарі зссстрвасвисвресав 0 00 втрдассавлн т рраавісаз асва 3285 «21053 к21ї» 363 «2125 ДНЕ «2135 Штучна послідовність

«21» 5виге «223» /щек"Опис лучна послідовності: синтетичний полінуклевотид" «0053

Баввівсанс витер аніс (врЕриаЕнс Пеніссавс співр вревісссірарасіє БО

ІссіВгЕвсав СИсіввай тесспартавнанпвва вав цвевіссвсосавес 120 ссарейзаай явсерадвір ретнрсосіас зівазрсває аіроззатра вааастатає 180 вівдасісітв нвароиссь аймсассаїстссавадаса асвссазваа сацені 240 сідсааваїра асарострав арссварнає асерсіірі апасірівсвавррравзевя 300 агзспівеї ссявивасії зссрасийс ревкссаня дзасссіреєсаєсвіст ЗО віча зЗ3 «10» 54 «21151527 сиі2з ДНК «135 Штучна послідовність «2202 «2215 50 «2235 іп Опис плучзне послідовності: синтетичний полінуклеотид" «АдО» 54

ЕЗЕВІВСавствВіввавістяввиваннс пиніссавс свв ЕЕввіссствавасіс 80 тссінівсав СИ СТрЕай сассмйарї армайенка нано ссевссависї 120 хсарввааар врсівварів КеЇрЕссінс війаарсаав відраваїрз равоіаста?й 150 шІЕрасіств рааровссе агйсассаїє іссзрараса асросзораа сісайріаї 240 серсаваїра всавсствав арссварває зсресттеі апастрівсвареваврри. -З00 вІасптяві їевеваєи зссвасвнстіввнессаве реассстврі сасевісст Зв аВівссісся ссаарЕессс іс ссссрЕсвс сс сіссав яарсассісс 420 карарсасав срясссівве сівссевіс ааррайтасі 1ссссраавсс врвірасвоикв:; 480 їсріровасі саррсосіст вассарсресвірсасасст ісссавоівессіасавісс 540 ісеррасістасіссстсав свесвірнка асирінсссі ссбазаЦісвррасвсав 500 аснавсаїрсваїрійка ссагаанс іссавсисва зрріякасва пасівінеая 560 свназрірії ясвісвавій сссассріві ссгесієсіссриісвсівв сссатсарія (78) шасисс стссварес вазанатаса стов'ввіс! сооравссссарзавіваєй 780

ІрІдівНісв (внасріріс рсатрареві ссрвавирс ярі аасо віаївірваї 850 риснсававеи їссасаасес сававассвов ссахарадя аасааісаасісвасвис 900

ЗБЕЕТНВІсв вСрід вас аріавіссассиррасівесПазівяваз виавтаєсва 950

Хитазекісі сааасазоре ЕСТСссвиса сесанраре арасааціс єзазаєсаяя 1029 вкосанссєз вивавсссса арівсніасв сірссеєсва весредайва азідаснаня 1080 заїсаввіса ресісаворів (сбсвіааар рраМИтасс срісввасаєсвсррвівнав 1140 трршапісва зірвасавсс срззаасвастаєзанаєса сассассвогастсратсе 1200 васрразнет тва сісвазаєсьв асевірраса зайсревс р рвсзасавяви 1560 авівістне срсісеві спідсаєсвав сссїссаса агсанасасісанааавис 1320 преса свосвиріне ЕЕЕТНВанна сірсссвви Есаватррра ТЕН ЕВІС 1380 авасавіввв с ЕСвассс т Енначнс ястсвесва среотеввіс явив 340 ксріссарсе реаїсвявссрессаствяр ісасіссоств нагвсзавір вва нсИи 1500 вісзадсваї верінівсва сс 1527 «210555 «21151533

«2122 ДНК «21325 Штузна послідовність «22» «825 «оце «223» поїв "Опис штучної послідовності: синтетичний полінунлеотид" «00» 55 вавнтшсавсівнрнаністввЕвнаррс НОвіссарс рони ріссравасє бо сера СИ ства іасстарі ад зраз вартової ссросавасі 120 сездввааве Бисівнарів прідисстас аізаарсавав а1рравара ваватестя 380

Івасів раавирсср вітсассаїстссарараса асросзаваа стсайріяї 240 ствсвазіра асарссірак арссрернас асрвствіріайасівівсваревязрви 300 агасіцері севовасії ассрасвнстррриссазре ввассствні сзссрість ЗБ арівсеїссв ссаавнисссвісевІсМс єсесідвсвс ссЕсвссан вавсасстсс 820 нарзисасар срисссітвее стрсстввісааврасіасііссссвваєсвивасняній ЯВИ 1свіревасі саресвсцї вассавсвесвірсасассі гессарківЕ сстасадісєє Зо

Ісав т асіссстсар савсрвіввта асритвсссі ссссааацтсеррасвсяв 500 стсваїса азсадівярі Меїрассся че таз «10» 56 «211» 1533 «212» ДНК «фа» Штучна послідовність «2205 «2212 5ОНЕСе «2035 іпогех "Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклесотид" «ОО 5 яаЕБЕНСарс івртррарістЕвревареЕс Мрріссавс ствер нісссрарасіс БО тесввсав СПстЕран тассттаді арпейцрва давав сссрссаввст 420 ссареназар васіраовів ЕВІВесстас звізазрсази зірраваіра даваатаї 180 вірвастсв тЕЗарвВЕсКЕ зіхсассаїє їссарадакав асвссзаєсва текамвіаї 230 сірсаваіва асавсстрав аЕссваррас асевсівірг айс дінсраривачрре ЗО

ВіаСНвЕрРІ срвВяаси зссвасвлстрареєсаре дазсссірві сасовіссє 350 аетрссіссв ссварриссс агсврісне сссствровс ссівсіссов вансасстсс 420 равансасад свесссівев стрсствртсааррастаст ісєссраасскнівасврів 480 тевірезасі сарвсвстсї вассавсерс Вівсасаєсі (сссарсірі ссїзсавісє 50 їсарвасісї асісссісар савсртвета ясрріессск ссісазацісвевасясав /-ВО0 зсоїзіасаї ясааірівна гсайзарсссіссазсаєна арвіррасоа ввсівівнав 6БО севБаарвівії вСрісварів сссвссрівс сов ессіс севісвс ве сссаєсаюта 720 пес сісссвавсс азааратаса сісатраїсьсавравосссараввірає УВО ін вЕісе і рвасвіНісясаїнавеві ссрравитвс арк авств різівівеах 840

ЕЕсвізваав ссасавасре сванассвав ссізрароре засаацсва сісвасрис 00

ВевЕвніса свівтвас артаріссас саррастерс Нааівяваз вдавіасаза 960 ідіааврік! сваасвавра виісссвеса сесацрава арасаацієсзаавосвая 4020

Евасарссса рреаасссса аріргнкаси стрессссаа вссернанна заівасвава 3080 ваїсарріса досісасвів (сісвіавак ввасасс єрісррасвт: срсввтрвав 1140 (веварісав вірравсансс скаввасаас їаіаснасся бассассват веісвасісс 1200 расревавсі 1СНИНрта сісваваєів асррірваса авіспсесів ясвасаривк 1250 завіс ма рів сирсасрар вессіссаса вісамасасісаваазарс 1350

Прісрсісі сессровіза зиеїрніврі вріврісірссреріівіса зіррраєсів 1380 сіраїсазас аріявен в грассевств еваіссивИ сівсізсіврірвиєснвс 1440 тесторесаз КСТСТЕВИС сресавівся встає твосеевик ївавівянає 1500 авсваіса азсавівної Мрівассся че 1533 «21057 «21150542 «2» ДНЕ «7213» Штучна послідовність «ВЯП» «221» оце «2235 /поїв-"Опиє штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «адО» 57 яасвіссараїрасссавіс тссвісста сітсірсиї старрара карантсвсс о акаснвівеесвавіса рЕвіаНарсзасримав ссср всававаєса 320

Езваварссссівавісссї даїстатвст всаїссарт трсааовіри веїсссяїса 180 анриїсався всавінваіс іднЕасвваї псасісіса ссаісансви ссідсввес 280 вказане савасцаня сірссзасар ізідайаеН асссісввас ви севссвв 300 веЕвассазрЕ рраввісаа зсравсірін Есінсассві сіріспсві сйсссясся 360 таваїгравс авирагаїстоезасівсс ци вс всвазіааєнсавт 420 сссаравене ссаваяіаса віри агнирів паїаасроссіссавісввріаасісссав 480 ваваріріса сарарсарва сарсзаррас авсасстаєа рссісарсар сассстраси 540 сідавсазав савастасна базесасава вісіасвсстрсваарісасссаїсанвис 500 стварсієрс ссрісасава варсисзає авриварясея ві 64з «зх 58 «2115659 -2125 ДНК «2132 Штучна послідовність «В «22» зоесе «223» /пюте- Опис штучної послідовності: синтетичний озлігонуквеотид" «400558

ЕБаавснвсі срясвасеве ТЕрЕїСВинЕ свв рІВсеї ссавсеваєсвивсісвися 50 ацрриїсе 55

«2105 59

«2125 ДНК «2132 Штучна послідовність «й» «Їх зошсе «біз пасе Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклестид"

«Ах а давЕТЕсавствВінЕавіс ЕЕ Енс Мевіссавссівиевевісссіваваєтс 60 їссівівсав спосо гассттартарнайрра бар неввессрссаввсї 20 ссаррраззв ресрвавке ррівеЕсстає аізаарсвав зіррасака раватаєтає 180 вірасісір іразаррнсся вісаєєаісіссавараса асросварза сові 740 сівсазазіра зоврссірав вессваррасасррсіріві апасірірсваррваавкк 300 азс ев їсвеЕвЕасИ ассрасвйстівввиссави ваасосівві саговістєї 350 автессіссв ссааревссс вісвріснс сессівисрс сстрсіссав вврсасстює 420 варарсасав свессстовв сівсстввіє заррастасііссссязассерінасввів 480 іспівевасі саресесісі рассарсррс рідсасаєст ісссарсівї сстасартсс 540 їсавраєстісьасісссісав сансвінвів асЕвівссст ссісавайі сввкасясар БОЮ асаїатасаї всваїрірна їсаїзарссіїссзасасвв аррірвасва васіріврад БО спяванірії рсрісрарів сссасор'я: сссисіссіс сррсястре сссаїсарта 720

Несе сісрсавярос аввараїаса сісвіратсі сааравсоосарчаріваєє 780

ТЕХН ВісВ вва срініс всВтрареасссеваввірсавійаасів нівівівва: 840

ЕЕСВІарагв і ссасвагре сварассвар сстарзнани аасавісаа стсрасвцс 900 зрретвріса всрірісвас арізріссас сзрнасінрс авірееза ррааізсява 960

Чвізанвісї сааасаавев всісссврса сссацрвава арасаат с свазаєсвав 1020 реасавссса деназсссса анініатаєр стрсссссве весеввавка авідаєнана 1080 заїсадніса вссісасрів гсторіовар вка асс срісрвасає свсрвтввав 1140

ЖЕвКарісаа аіїврасансс срзазасаасівізанаєса сассассває рсісрасісє 4200 наснраавст тс нрав сісразасія асерідраса забсесосін Есаасаввви СТБ ваїріснтя ретестсвві сатнсасвар усссіссаса аісаноасасісаразварс 31350

Тс сієї сессррріва а па

«УНІ» ба «211: 1524 «2122 ДИК «213» Штучна послідовність «2205 ч1» 5ашнсе «2232 Йімее"Опис йтучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «4005-60 сіпсссвраї всаврівнив сі раїєаарсавіввн Істрсвасссіствввіса ВО

ЕрРЕЕССЕСра СсрЕТрватс вЕЕВІсвера ЕсрісвісреЕ Рсвесрраае сестасрива 120 їсасиссев реїрсаватв реассісств аісазасааі вині атніра ссвссвві 180 висезеЕіВс авствеівЕе Все рЕва вЕсПЕВсавсстввсри ніссстварва 240 сейсстив сан сіде війассій адізнизи вЕзіравинн ерісснссвв 300

Есіссавера зарвисівра віревівесстасагазавс зараіреааатравааатає 350 тІВІЕВасі срівзавор ссвамсасс вісіссарар зсвасвесва каастсате 420 та1ствсаав ірпасврострарадссваЕ взсасрвств рів мнаствтрсрарррав я рекВіаси рр гсеррЕа стасскасе істрернсс веросаасостннісвсеріс 540 істарірссї єсассаврре сссаєсрріс ессссівв срессівсссарварсасє 600 1ссеЕВЕавсе СЗБСВЕССсЕ вес рісаарвастаснссссвоа есевірася 6650 нірісвівда асісаррсисістдаєсарс весвідсвся ссмсссзвеівісстасав 70

Іссвсаввасійвсісссі сарсавсвів вівассвівсссієсявсва спсрвсаєс 780 танассіаса ссівсаасек араїсасаае сссансааса ссзаввівра сварасаві 840 навєсесаваї вннівісва вівсссассв ІВсссарсає сассівіресарваєсвіса 900 вісиесістісссессваа вссосазрраєс асосісвіда сстсссррасссствавиіс 960; зсвінсвівв нкіквасві Еавссвсвав вассссвари їссадсаа сдніасвів 3020

БОСЕЕСВТВЕ ВррідкаїЗа тиссаанаса аввосасере зво нсарі сдосавсаєв 080

МеСВсвірЕ їсавсвіссї сассвтвір сассакрасу вестваасви сайвревтяс 3340 аарівсаади 1 сїссаасая арБестсссав всссссафсв араваассаг «(ссавазос 1200 зЗаародеавс-оссвавазссасавогртасассстросєєсасссввва визратвасє 1950 даказсеарв ісорестває сінсстввіс заавЕссї ассесансва саїсросдія 1320 вавівреава всваївевса Бссввараос вагізсаара ссасассісссвівсіврає ЗВО

ЕСсвасввсі соМСНесї стасерсваи стсассвівк асаанарсар ріррсарсав 1440

БЕнаЗсрІСтістсатисіє Срідаїрсає варисі стрес асазссаєта сасвсаввар 1500 виссітссс трісіссвве ївав 1524 «2105 Б «2112825 «712» ДНК «13» Нтучна послідовність «0» «Фіз яоитсе «223» пове Опиг птучної послідваності: синтетичний полінуклеотид" «4005 651 сісссідері рсзавірреа сіра аорсарірре ІСіреєдасссісісвраїсв 00 вдависвсва сідвревис здрогсвнве вставсіссв пасе рісреєсасвярв 120 ісдссесея Баївізанір вваст тв айааасаві виріріясва іїссасйвЕва 180 кЕдаїаєсс арвірасасі вісасесісвісв/брарся ссарсвірек вватаравів 250 зсвассассї рісвавссар ссариесаїс єсаастрес Прсріввіа ссвасвазав 300 сесварвени сассказайс всіраїстас пси свісві сасінсарісяннівтасся 300 їсвсввима всевніссве ВіссЕвався васісасвс сасваєиссівайвсяю 20 ссрравван Чисраспа настдісве сааатрасі сахтайсосор сзсаййсвя! 480 садобаасса арріснарає сваасріася вія стрсзс сад саіснссся 0540 сесвісіраїр арсавннаа вістрвааст ресор взаїзасіс бОй татессарар зррссаварі зсврірраар піреаізасе состссвагсвеетавстєс 650 савяарайів їсагарарса врасавсавр расансассі зсадссісве савсасеств: 759 асесіварсз ззвсарасіа сиввааасас заарістасв ссідсравеі сасссвісаю 80 явссідарсі сесссвісас заакакснс аасарревав зер 825 «105 62 «и11» 1533 «212» ДНК «2135 Штучна послідевністе: «820» «21» 5арусе «За» погех" Опис штучної послідовності: синтетичний полінуюлтестид"

«ай» 62

ЕВЕВІВСАЕС ВВ равісірвокрарвсрріссанс стрревввіссстварасіс БО вірсар спствваттассттаві врігайвра вавннврєссвссявної 0120 ссарензаан весівкарія рвіккссївс аіававсаан айнноватвараввівстає 1850 віррасієр і іразоввсся всассвісіссарараса асрсєварав стсантй 240 сівсзааіра асарсстрав арссраврас свист ацагрівсваврезавня З вас сврериси зссрастисірерассаре равесстррі сасевісйї 360 авірсстссассааввнссс вісввіснс ссоонеснс ссівсіссве вавсассісс 490

Барансасав серсоствня стрссіввис ваврасасі єсесераасс вртвасьнів «80 ісвірдаасі садосесіст рассарсвис БІвсасвост ісосавсірі сстасавісс 540 ісзирасіссасіссстсав сарсріррів асррівсссі ссісаван сревасесає оо взеавіатасаї рсаафвівва ісаіавросєізссавсасра знрівваєаа расідірвай 560 серазрцнй всвісравір сссассріві сосрстссіс сввісвсївв сссаісврів 790

Нстенес сісссварссзааараіаса ісагозісї сзаваассссаваарівасєт 780 ірівірвісніввасвівісесвінарові сскраррівсавніааєів віавірнає 85 весвізнаве гссасавсве сзаваєссвар сстзраваро васаайсаа ісвеасвМмс 900 аринікніса всверіткеас арізніссас сарраєїрес навнррзанвавтасава 960 івівавнісї савасазари всксссвеса сосяц реа врасзацніссаваассяав 1020 ввасадссса вевавсссса артвтвтасв ствсссссав вссвеванна ваїрасваая 3080 авісарріса рестсвзстр і стсртавар вва насс сріспрасзтсрсрвіввав 3140 тЕЕварісаз відрасарся стааааєзастасазвасра сесгасєіай всісваєсв 1200 дасвесавсі спиріа чсаазеНр зсарірраса ваїсрсваїр всарсадввс 1960 засніснсї саївйсаді заїрсевав вссспсаса ассастасасвсврвавісє 1320 сЕсайві сессррнтве серівнавва рсссевЕ рсвавірнва ссістваїс 1380 авасавтрее Таївсвассс Нівиванря внівррісев ваворинари йссевівра 1440 дЕЕНССЕ ВЕКНавесве вісареарні рраннані інсссвиств аадіневаї 1500 гівстраєсв зесарінсві спрінвісс Не 1533 «210» 653 «2115 1530 «3125 ДНЕ «213» Штучна послідавність

«220х к2915 50итсе «23» /воїех "Опис штучної послідовності; синтетичний полінуклеотид" «ОО» 63

Карртвсарстевідвевіс твевнкавяс прессанс стрес сствавасіс бо 1обвірсзр систррай сассцарі ані ацрра варт ссессареист 120 ссаревавар ресіснарітр врідрссіас зізазрсаан аірсаваєра азаїаєаї 180 кіреасісів їЕзавриссв зисаєсаїсіссавараса асвссвараз-сісейнає 240 сірсаавіра асарссівар арссраврас аскнсткірі аасівівсраревназрив 300 агасцитвні с сЕвЕваси зссврасен с твривссаве ЕвасссввЕ сассріс З 60 арідссіссв ссааринссс аісреістс ссссіреєвс ссірсіссвр дадсассісс 420 ваварсасяю серсссірве сірдссвніс апввастасттеєссснаасснатвасвнів -АВО 1свірввасЕсаврсвсісі рассарсянс вінсасасст тсссзвсіві ссізсарісс 540

Ісвенасістасіссстсав садсрінвій ассвІвесст ссарсаасн сресасссар 800 зесвсассі всавесккава сзсаарссос арсвасассв арріррасвз касевіван БО срсаваївс сініссавій сссассрідсссавсассас стрівнсади асснісввіє (720

ВНосієнсс ссссазазсос свадрасасе сісніваєсі сссерасссстванрвісасв 780

ІрСВтвВІвВ врасрірав ссасяварає сссрарріссзвисзаств віасвірвас ВО

ЕСЕ Ева (Есвізнівс сваваєсаааю ссаєдикаве зесатисза сансасвис 900 сеевіввіса всвіссісас ЄВИ рінсас саркасівестразсвесаа внавтаєваю БО тЕсаарві с севасаааре сстсссавоє сссеїсвара заассатсіє сваааєсава 3020 риисавессс вадааєсаса еріртасасс сівссасстї сроревавна авікяравяя 1980 сІссссерНї Всзаріввеа пса авасарінво таївсвасссвсіввряіса 1340 квиїсзвсва сарнісватє реріавсенс веаїсвавсе ватсаревіссесвасвявс 1200

Ясвснссск раїнсааатс ррасссне амасрсаві вевівініва сєсвневві 1950 вевасрвавааісвроеніс ви расрій сф разре дини сісввавіс 1320

ЕСІВССВарІ реварісняа (нрасансес веаайсвасі асаарассассссуссіяія 1380 сідвастссрв зів сп Не тасісвазасіва с ірірратаа дарсаррідв 1440 савсзасрив зірізп сіє вір серіс відсасраар сссіссвіва ссасіяаіївса 41500 гавазвзісрк т йсаскає сссвнравая та

«210» 64 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «вх «221» оце «2335 /потез"Юпис штучної послідовності: синтетичний полінуклесотид" «АХ» Ба

БЗЕЕТИсарс іретреавістерревавес періссавс сірреравісссівараєтс 60

ЕсСТЕТЕсар сИсівнан гасстпаві арчейрва рев пвесссвссаввсї 129 ссаврезазе внстнвавів рЕщІнесізс агззарсави аіреаазіра ваавасає 380

БІррасіств іраврриссе аіїсасєвіє іссавараса асрссазназ сісайрівй 280 сідсзавіра асвисстнав арссларвасасрисівес ана взревазняв 300 віасійові ісряррасії зссрасвййстрЕрессане Баасссіряє сассріснї 360 авівссісса ссвавресес аісрвісне сессреисвс ссівсіссар варсяссієс 820

Каравсасар сррссствее стрссівріс азевастастітссссвазсс врірасерір 480 їсвіревастсвевсвсісї рассввсвиЄ рівсасасстісссарсіві ссіасавієє 540

Ісарвасісіасісссісав сарсвіретв ассрірсссі ссавсаасій сррсасссаю 600 зостасасєї всвасрізратсасвавсяс знсвасасса аритарасза васарцвая 8560 свсаваєві вірісварів сссассвірс ссавсассяс сберосарв ассрісаріс 70 пессисс соссвазасєс санррасасс йсаїваїсі сссррассссірарвісасв 780

Есе е вва срівов ссосваврос сесварвіссависвасе ріасвівнас 840 вЕспіеване срсагаатис сазрасавар ссасерсаре арсавітсза сарсасвс 900 евівінвіса всвіссісає сви нірсас сакеасіввс ввасврсаа Єкаріасаан 950

Твсаввнісї ссаасавави сеісссарсє сссесрава ааассаїсіссааавссвва 1020 "ВвЕсарсссс варзаєсаса ввіртасасс стяссвсест свраваравва вацнявсввЕ 1080 пінссврері різарівнря СИРИ ВЗ заасавірри ріЕкрасссісрововиї 340 аєєаврааєс зрвісісасі раса є дізазареії Нізсесрієсрататсвея 1200 вісванівнк авессаасня всзасссвар заїааєтвса авасрасісссссавівсіс 1260 ваисЕватр вас ссстатврс аааснасаріарасаватсзєрвіввсвв 1320 савршдзаси ївПщавст перріІвати сасвзаростівсятавіса татасрсав 1360 аарісрсмї сесірісвссрераррнвра ввірррсісссірваєвсва вівровісн 1440 праїсаавс витер свасссссіс 170 «2102 655 «І 1473 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «р. «ВЗ 5ошсе «233» /посее Зпис єтучної послідовності: синтетичний полінуклеюотид" «005 55 даветясавстврівЕавіс ЕВревевис нвіссарс стрЕвЕевісссвавасіс 0 БО іссідівсар спетсвай зассііаріаснайрра їравмневні ссвссавест 420 ссаврвваав нисівЕавів ВЕЕвссіає тзаавсазе вінрааасив дазаїзетаї зва вівнасісів іравеннссв айбсассаєє іссараваса асрссвадаа сісайвіаї 2450 сЕсазаїна зсавсствав арссеврвасасврстрівіанасттрсваррвазввр 30

ВіасцірВісереввси ассвасвистіввивссавв яазсествик сассрієтї 360 арінссісса ссааррессс сві сесстблревссствстссзв варсасєтс 420 равансасвв сЕНссстеВЕ ЕсСТвісоаревстасі іссссвзассритнесветв 480

ІсВІЕквасі сарнсвсісЕ вассавсяес вірсасасст ссссавсіві ксіасаюісс 540 аввасістастсссісар савсвіретв зссрівссєї ссарсзасій свдсаєстав 600 ассасассі ясвасрізра є сасааессс арсавсасса зрдірнасза расанійвав 6550 свсазагрИ вірісрарівд ссосасорінс ссавсаєсас сівіресарв аєстісаріс 720 тпегсисс ссссваааєскаввнаєасссісвівніст оссррассссіваноїсаєд 780

ТЕСВІрВІвЕ сеВівіаав ссВірреена сівСссвватрсвавіввва снеїсай 840 завсазіквЕ НЕ есстЕЕесева каврасссеє аарієсовиї саасіввтеє Зо вінвасерся Тераретоса сазірссвар асаварссвс ррозиравса КН свасарс 960

ВСвИсерів троїсавсик сетсассри рірсассарр асіврсівав снясааннав 3020 їасазрівсав авнісіссва свааниссіс ссврссссса іграразааєссацсістаза 2050 ассаазвирє арссссрова ассасаррір тасасосірссросєісрар аваораванв 1340

ЕВСВВЕНЕС севвАТвіяа вівввасне чвайадасзаївррівівсваєссів 1200 веиснетаєса арагісвеві сісастраса ріс ісвіва варена сссвісараї 3750 вісясевіся авірвеавіставсврасва сссвавааів асіасварає васіссссса 1320

ВівсісваМ скраївваїє СПИС іагарсазасМосаріара саавісаєвв 1350 твесарсаве еказсвівИ таве се ріраїесасе зарості дса савісветат 3440 асрєсвравні спос ві ссвеві дай 1473 «10 56 «11» 875 «2123 ДНК «213 Штучна послідовність «ах «21 5овусе «223» пипе "Опис ттучної послідовності: синтетичний полінуклеотид" «400» 66 зідсіссви вп дізанія дивісн ст ачазасазі вини нріваїссаснрик б ів сів за нвіне Мссвнсіссасбосварсі стр сарв сідстасії 3У0 сапафнствс свв ваз віневассів стваєсивас ввів ірівасссястяв 180 вит варрся рірревісва саазасісає асаіріссас сп ріссавсіссвваасіс 240 апрерЕнрас спісаріст ссісИсесс ссвазассса аднасасссі саєтайстьс 300 среЕВССССІВ аршісзсаїв сетваіните васріравсс всвазнаєсстрарвтсвай 350

Нсвасіввтасріввасевр СВІДвавите сасзатрсса звасааавсс роррвавван 420 саріаєпасе рсасвіасся дів саЕс рісстсвсся МСрсаєсарносіввстя 480 заїресзане зитасаавів сзаввістеє засзазнсссісссавоссссатварааа 530 зесвісієса завссваарвеЕ всавссссва язассасари сріасвесск роєсссаісс БОЮ свевафвавсівассавева ссавнісавс сівасствсс тввісаварв сп сратссс 650 звсраєсаіся ссрівравтр крзелвсазі ррясарссря араасазсіз саввассасв 720 сстсссВівстввасосва свветссмс тесістаса всавесісає свіряасаав ува арсароірес арсзврноза свісмсієв встссвісатрсаінаввсійвсасввє 840 састасасес арвававссї сіссєтвисії ссвритааа 879 «210587 «211» БОБ «212 ДНК «13 Ното заріейе «00557 райсесаааі спріраєза аасісасвося есгоассрі оессарсиссіввасісв 650 вВверассві савіснсст спссссссв звасссаарв асассгісеї наїстсссвЕ 420 есссстдави їсасатвсве ветвитввасвівавссвсв аараєссіра ррісвавнс 1850 засікріаср вра сррсяї драсоіясаї ззірссавна сааарссуси праррарсав 240 тасаасарвса свізсерівс вв ісавсвіс ссассрієсінсяєсарва стрестваяі 00

ЕВсзаревві нсазнірсва рісіссавс зааресесс савсєсссаї свравававаєс 350 агсіссазан ссаваринса вссосраваа сєасареіві асасссідссвосяісссвв ОО кагавсіва ссавеваєса крісаевсств асстросінн їсааввесії стаїсссарс І 480 ждасакссессвЕвавіевка равсанеки савссявана асаастасаа рассасевссї 540 сссвіве ЕВ встсснасяв ссспсиссістнадса арсісассві ррасванавс 600 аретресарс зррнраасв СИС с сват Есатравесіствсасаассяс 560 тасасисарз арарсстстс сс ссв визаа 596 «2105 58 «211» 684 «12» ДНК «135 Найт зарівне

«АД» 68 кевсвсвазі ЕМЕТЕсве ЯТЕсссасев рсссвесес сассівіввсавнассвіса 80 вІСЦсСсіСтісссоссава асесавррас асссісвідасісссррасссснавніє 120 есе свіве ев асвї вавссасваа рассосрави єссавісаа: сна сві 180 васвесвіреи ареірсоїав грссазраса аарссасрир зроавсаярії сзасансасе 940 песВІВво їсарсрієсі сассвн вір сассврвасї вИСТЕВастя тааревЕТає 300 вавінсаари їсіссазсва аррсгіссса дессссвісв аввааассаї сіссзатасс 360 зааврЕсавссссванаасс асвевіріає асєсівсесє саїсссррна краваївасс 490 звраассарв ісарсствес ствосіррісазарисистассссавсна саїснесяір 480

ДорТЕвЕара всеафвевса вссвБараасааєтаєвева ссасасстсстаєвствває 540 тІссраєвне сопе ссі стасввсварн сесассрірв асазвансав віврсавсав БОЮ

Ерражнісііссатсіс свіварсаї паввсіствс асавсєвзста сасвсараад 650 анессістесс Ерісіссвив тай ва. іо» ОЗ «ії» 837

«213» ДН «2135 Ной зарівне «4005 69 вансісаназ ссрсаспенірасзсвасі сасасатюсс сасввірсссадарсссваа БО

Іспреваса сассіссссс дірсссасрор грессараресссвавіснвірасасвсті 20. сесссрівсє сасреівсоє зварсссааа (спрінаса сассієсссс вірсссворе 180 івсссавсвс сівзастссі врезевассрігарістсстістссесссазавсссаво 240 ватассинатваттсссви нассосікае рісасвірсн ірвісвірна свіравссяс 300 разваєсссв зертссаніє сааніветас тирасевсе рраввінсаїзвінссзав 360 асававссвє рЕракванса Нисаисавс асист іввісарсні ссісвссвіє 420 свсассаве асевсвва синсааннає сасааритвса зврісієсва сазарссстс 480 ссавсссссв їсрадаанає саїстссаза ассазаривс арсгосвара ассаседяів 50 тасасссіве ссссаїтсссв рраераваїр вогаанвассаррісанесстнассвсте 500 вісаварест(стассссяр спасаісрсс віпсаріррн анерсарсре всавссвван 560 засзасіаса асассаєвссісссвнств васієсваєв вс мсн сс єтасадя 790 аавсісассе (врасавнав гаретяясав садвсезася КИсісаїв сіссвівайв 780

СОТЕЗЕЕСІСТрсасвассе Спсасеисав аарарсссії сесеіссврвінав 837 «2» 7 «211587 «12» ДНК «2132-Ното 5арівпь «800570

Бовіссяввіасвріссссс аірсссвісатроссарсасстваннос вер асса 060 єсарісцсстриссссссаавасссави расастстсз ірасосси ваєссствав 120 вісворірся сасіреїроз срікавссзв ваврасссср ареіссав' сазсірвтає 180

ЕІЕКВТВНСЕ Трееврівса тазірссяар зсазакссвс викаркввса вИсвасавс 240 зевассютвірріаневЕ ссісаєсвіс с тисассавк астррсіваз срисваррав 300 івсванірса видістссва саавррссте ссріссісся їсрараааассяісіссава 360

Ессазарвес арссссрава вссасвевіє сасассстроссссатосса дравровав 420 вссавеазаєсанрвісавссї вассірссів вісззарисі (сізссесер свасаїсвсє 40 шЕварідие вравсасіре ссарссрроав айсацвсівса враскасвссісссвівсв 0 50 раєісскаєв рсісснсн сесчасавс аррсіааєсв і рбасзавав саррінвсов 900 ванЕввааїх ІСП стсаїр сіссрірянте сатраврсїс (рсаєааєса стаєасасад 650 звававесіс сессії внвізаа 687 «310571 «1125 ках» Білок «213» Штучна послідовність «й» «беї»5ОоштеЕ «235» /покех "Опис штучної послідовності; синтетичний пептид" «ах

Біу Оу Бі Оу Зек Бі БУ Оу у Зех бі у БУ біу зег бі; 1 5 н3) 35

Су піу сіу Зег Сіу ву бу ОХ 5ег т «210272 «21125 «212 Білок «2ї3х Штучна послідовність

«ей хг зо0гсе «2235 /потег" Опис штучної посліловності: синтетичний пептид" «ДОЮ» 72

Оу М еНу Су бет і 5

Claims (22)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Біспецифічний білок, що містить: (а) поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має наступну формулу: А-Ї 1-Р-І 2- Р, де А являє собою важкий ланцюг імуноглобуліну антитіла дсС, 11 являє собою перший пептидний лінкер, який відсутній або довжина якого становить від З до 40 амінокислот, Р являє собою ВАРРЕ-зв'язуючий пептид, довжина якого становить від 10 до 40 амінокислот, та 12 являє собою другий пептидний лінкер, який відсутній або довжина якого складає від 5 до 50 амінокислот; і при цьому важкий ланцюг імуноглобуліну (а) та легкий ланцюг імуноглобуліну (б) формують антитіло Дб, що містить дві молекули поліпептиду (а) та дві молекули легкого ланцюга (б), яке може зв'язуватися з В/КРІ1; та (б) легкий ланцюг імуноглобуліну антитіла Ідс; причому важкий ланцюг імуноглобуліну (а) та легкий ланцюг імуноглобуліну (б) формують антитіло Ідс, яке зв'язується з В7ЕРІ, при цьому даний білок містить дві молекули поліпептиду (а) та дві молекули легкого ланцюга (б); причому Р має амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО (ГРОСКУМОЇ ГІКОУМУМСОРІ); причому поліпептид (а) містить СОКІ важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11 (5БММ/М5), СОК2 важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12 (МІКОСОМЕКУУМОБМКО), та СОКЗ важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 13 (ЕСІМУРСИОІ РТ); причому легкий ланцюг імуноглобуліну (б) містить СОКІ легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8 (КАБОСІЗМУМ А), СОК2 легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕБЕО ІЮ МО: 9 (ААББІО5), СОКЗ легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 10 (ОФООМО5УРКТ); причому даний білок інгібує ВАЕР-опосередковану проліферацію В-клітин людини, та причому даний білок інгібує В/КР1-опосередковану проліферацію Т-клітин людини.

2. Біспецифічний білок за п. 1, який відрізняється тим, що у важкому ланцюзі імуноглобуліну Зо відсутній лізин на С-кінці відразу попереду 1.1.

3. Біспецифічний білок за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що антитіло |Їд являє собою людське або гуманізоване антитіло ДО1 до В7КРІ1.

4. Біспецифічний білок за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що антитіло до В/КР1 являє собою людське або гуманізоване антитіло Іде2 або людське або гуманізоване антитіло да.

5. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що 11 має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 40 (ВО).

б. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що 12 має амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО: 5, причому за варіантом, якому надають перевагу, 12 має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 6 або 5ЕО ІЮ МО: 7.

7. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-6, що містить варіабельний домен легкого ланцюга імуноглобуліну, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14.

8. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-7, що містить варіабельний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, який має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 15.

9. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-8, який відрізняється тим, що легкий ланцюг імуноглобуліну (б) має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19.

10. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-8, який відрізняється тим, що поліпептид (а) має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17 або 18.

11. Біспецифічний білок за п. 1, де: (а) поліпептид (а), зазначений у п. 1, має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17 або 5ЕО ІО МО: 18, та (б) поліпептид (б), зазначений у п. 1, має амінокислотну послідовність ЗЕО І МО: 19.

12. Біспецифічний білок за п. 11, який відрізняється тим, що поліпептид (а) має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17.

13. Біспецифічний білок за п. 11, який відрізняється тим, що поліпептид (б) має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 18.

14. Фармацевтична композиція, яка містить біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-13 та фізіологічно прийнятну допоміжну речовину.

15. Нуклеїнова кислота, яка кодує біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-13.

16. Вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п. 15.

17. Клітина-хазяїн, яка містить нуклеїнову кислоту за п. 15 та/або вектор за п. 16.

18. Спосіб одержання біспецифічного білка, що включає: культивування клітини-хазяїна за п. 17 у таких умовах, які забезпечують експресію нуклеїнової кислоти, та виділення білка із клітинної маси або культурального середовища.

19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця або клітину ЕзсепПегіспіа соїї, при цьому за варіантом, якому надають перевагу, клітина ссавця являє собою клітину СНО.

20. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-13 або фармацевтична композиція за п. 14 для застосування при лікуванні системного червоного вовчака, вовчакового нефриту або ревматоїдного артриту.

21. Біспецифічний білок або фармацевтична композиція за п. 20 для застосування при лікуванні системного червоного вовчака, вовчакового нефриту або ревматоїдного артриту, за якого інший терапевтичний засіб вводять пацієнтові до, після або одночасно із біспецифічним білком, причому цей інший терапевтичний засіб являє собою кортикостероїд, протималярійний засіб, Зо ретиноєву кислоту, НПЗЗ, циклофосфамід, дегідроепіандростерон, мофетилу мікофенолят, азатіоприн, хлорамбуцил, метотрексат, такролімус, дапсон, талідомід, лефлуномід або циклоспорин, причому переважно за варіантом, якому надають перевагу, цей інший терапевтичний засіб являє собою мофетилу мікофенолят, кортикостероїд, протималярійний засіб, метотрексат або азатіоприн.

22. Біспецифічний білок за будь-яким із пп. 1-13 для застосування як лікарської речовини. з нехстції! Назва конструкції! 71937 | РУЗОТВ Ше рРУ1620 її Р/1621 Шо рРТБІ : : Харзктеристика |ІМ-злиттяє 1 Ме авиття єр Сезлиттях | Созлмття 31 2 Експехла 1 Бе-петля | М СН? конетрукції В що їк ба: | есйз шо ши шш ша шик злиття сш Структура й я іш, ву св, СТ да ща їй ве ОО А пише й, М А ай 04 І ; МАВ СД | те. Я | 1 | | ІЧ Фіг

1одо ЩЕ шо вві? у жи и а МВВ снвівик м Ж я в; я но. зак БУДКУ « РМВІВ І: - аж» во Рів т Фо о РИВМ ЩЕ ФфоРв? і: ох вм п : і : М ш 8 Е ж в з г о 4 з 3 4 Модні Фіг2А КО ще а РИВІВ ву ДЖЕК 00 лов ОК я РІЗНИ Е вого ; Я: Фо 5ВАБЕ

5 Я. нсЯ в В 7 бод нм

Фі.2Б 150 ж РИБІВ

5. Й ж РІВ яке х а РІО ; ж зт Й оВТНРІ 5 т як ЩА а во і щи 4 3 448912 їоа (ямі З кЯ

! іл-17 1-4 вк : І ; ше Б ші ї я в сна ех НИ ке і І і: й пву й іло : - з ! : : - тв сні ШИ | щ

АН. ШИ. З вай сен. Не ШКАК. ШУ

4. Іллю Я ж я - - І Й В : ії 7 3 4 Фа т М й й « меч що і і і і щі ЖАНА Речвінинок і | УАНАЛЮВ Еездіякнох ї Її я Ачаліяінтадуких вінків Н я дива інбаютьих піна і р ки п ОА як кп вах з Її к . й т ще ; я І шк 2 т ! АНАЛІЗ Ее-дійнукИх | ФАЦОЛІЗ Ро-діляеух заф я. Я Е | я двхма с міакиннх Міикій | жк Аналіз Ви зктних бівю ї . ї ! н | однин Е и а ВИН рей а ппхчтнжічи не Ш ртлгаЗ вва с "АК Шк й НН еоре В ої | й Е і щі Н ї ФОУНАДІЗ бедіваМок і ФфУНАЛІЗ годіланок я ж Аналіз імеаьунех бін : хв Кезліх інтветнех кбякія ьо А я п з шк яко жще жа ж Я Част) . чЧас(г3 рн.

що шо ОВ Е 8 Ех в Е Ах ; ж СЯ І, Е Х 2 Х « о 2 о 2 ев їм Фіг А во ее се й ж й р песееееетят іт й : ї що. С: 5 мо ;

х а. У - Е ші ія її ї Дав осі БОЯЯ-- - стен їх - а Я 2 Хоковотаація бідез Под, ямі як 5

Ж. ДАЖЕ Ї МОЖ Е КО ї т І З ш- щ Ко ніш що ШИ. х жо Е я о Я, х НІ БЦ Ся ій тво І Бу з здето жа ря їв : МУ р нт 2 пат пн о по е КЕ ; | ! Ессе Ко сер ОС лилия коксекик нт зе йевив. Кт афер» 7 ш ; Е я В ий уе ух ков л ре ові ні т я Б з » і 2

ЕН. Що Ав, рай я зі Зно кн окркістня м пиши г - 2 «як «ек Зм (місні ФЕОВА Щи зве є й ш а 80 не «й і маснкіонннох з - ї - З що « маш 4- я че Е М ж ї 4 . е ває ї «2 за з В с М я ай «а в й з ІЗ вч: М . сойка д-- су Сай - 1 ? з З 5 фіг. 85 та Ж жи о жкж от - че то Ф м . « т й з. ШИЯ Енн Б каф , -й- ех а аза а Ь4 з «ав ві ч » жаб в -е в - ба» Я 2 » « зай заз . Я рин а 1 8 З 4 З Б фіг. А ко. зап МН і ДО г вЯ ій ; ви іх У єю і Е : Н А ї є - УНІ ; СИ же со из фдолколна й Гі ля З « з ра ко з: В лак Е ве Щи В х.кле КІ КЗ ' лй "РН їв аж й Ку Е : Не АД пах і ВК АУ КУ; - ж 9 шо «а У Кк вію іехісхці) Фі Б

0 зо т. ж Кі ї ї Б БО з х НО а ни БОЙ меш ШИ и НЕ М и крік. 100 пренннннттттттмнтентннінткквенснкентн 90 Й 80 КА, хх 70. зує ві й те т 80 бу РН га е і Од! ще їх 40. ЛШ, ! зо ши : ве я ЙО зве, Й я п

19. 13 16 15 22 95 928 531 34 37 40 в п Е Р Б ї : М м 4 аа х і-й : о : и 5 А й ті г й 5 МАЙ, Я шк у е: 5 їі е е Лі и: У - З р С г Й СУ 13 ї6 19 29 95 98 31 34 37 40 дні фіг.