UA120539C2 - Сполуки-інгібітори передавання сигналів шляхом notch - Google Patents

Abstract

Цим винаходом запропоновані наведені нижче сполуки або їх фармацевтично прийнятні солі і фармацевтичні композиції, що містять згадані сполуки, прийнятні як інгібітор передавання сигналів шляхом Notch, для лікування вказаних форм раку, нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою слухових волоскових клітин та індукування утворення слухових волоскових клітин. (1) (2)

Description

Втрата сенсорних волоскових клітин у внутрішньому вусі через старіння, вплив шуму, вплив хімічних речовин, лікарських засобів, захворювань та генетичних розладів щорічно викликає порушення слуху у багатьох людей. Незалежно від етіології, загибель або дисфункція механосенсорних волоскових клітин, що знаходяться в кортієвому органі завитки вуха, є основною причиною нейросенсорної втрати слуху (5МНІ). Профілактичні заходи, що перешкоджають втраті слуху, передусім обмежуються периферичним захистом, таким як вушні вкладки, шумозаглушення або припинення використання навушників. Поточні лікарські процедури для 5МНІ базуються головним чином на електронних технологіях, таких як посилення звуку за допомогою слухових апаратів або обхід волоскових клітин шляхом електричної стимуляції нейронів спіральних гангліїв, що вижили, із використанням кохлеарних імплантатів. У разі раптової нейросенсорної втрати слуху було також запропоновано введення стероїдних препаратів для здійснення системної терапії або інтратимпанічної терапії.

Кохлеарний сенсорний епітелій містить волоскові клітини, призначені для виявлення звукової вібрації, яка перетворюється стереоциліями на апікальних поверхнях волоскових клітин на електричні імпульси і передається в головний мозок через МІ! черепний нерв. Слухові волоскові клітини, утворені у процесі розвитку організму, є пост-мітотичними, і їх заміна не відбувається ні після втрати, ні як частина нормального оновлення клітин у ссавців. В результаті, ЗМНІ. через втрату слухових волоскових клітин є незворотнім. Розвиток слухових волоскових клітин протягом ембріонального періоду включає стадію диференціювання, на якій передсенсорні епітеліальні клітини набувають різних метаболічних шляхів, і стають або волосковими клітинами, або підтримувальними клітинами у процесі латерального інгібування, яке опосередковується передаванням сигналів шляхом Моїсп. Диференціації передсенсорних епітеліальних клітин у волоскові клітини запобігає активне передавання сигналів шляхом Моїсй, стимульоване лігандами на прилеглих волоскових клітинах. Ці клітини стають підтримувальними клітинами.

Сигнальний шлях Моїспй являє собою еволюційно збережений шлях, який відіграє суттєву роль у розвитку і тканинному гомеостазі у ссавців. Рецептори і ліганди Моїсй, які містять однопрохідні трансмембранні домени, експресуються на клітинній поверхні, і з цієї причини сигнальний шлях Моїсі є особливо важливим в опосередкуванні зв'язку між сусідніми клітинами,

Зо які експресують ці рецептори і ліганди. Еснують чотири відомі рецептори Моїсп, знайдені у гризунів і людини, які позначають Моїсй 1, Моїсй 2, Моїсп З, Моїсй 4. Ці рецептори Моїсп являють собою гетеродимерні білки, які складаються з позаклітинних та внутрішньоклітинних доменів, які первісно синтезуються у вигляді окремого поліпептиду. Взаємодія рецептор-ліганд ініціює ряд протеолітичних розщеплень поліпептиду рецептора Моїс!, у яких бере участь активність у- секретази. Активність у-секретази відщеплює інтрацелюлярний домен Моїсп від внутрішньої сторони плазматичної мембрани, який транслокується до ядра з утворенням комплексу факторів транскрипції. Активність у-секретази відщеплює внутрішньоклітинний домен Моїсй від клітинної поверхні, який транслокується в ядро з утворенням комплексу фактора транскрипції.

Внутрішньоклітинний домен Моїспй (МІС) являє собою активну форму білка. Різні функції сигнального шляху Моїспй охоплюють проліферацію, диференціювання, апоптоз, ангіогенез, міграцію та самовідновлення. Ці різноманітні ролі сигнального шляху Моїсп під час розвитку і підтримки нормальних тканин можуть бути аберантно активовані при різних формах раку. До онкогенних функцій сигнального шляху Моїсп належать інгібування апоптозу і стимулювання клітинної проліферації. у-секретаза відіграє ключову роль в каскаді активації Моїсй. Тому інгібітори у-секретази активно досліджують щодо їх здатності до блокування активації рецептора Моїсп для лікування раку. Незважаючи на продовження клінічних випробувань, у продажу немає жодного хіміотерапевтичного лікарського засобу-інгібітору Моїср. у-секретаза, через сигнальний шлях Моїсп, також відіграє ключову роль у диференціації передсенсорних клітин. Тому інгібітори у-секреази активно досліджуються щодо їх здатності до блокування активації рецепторів Моїспй для лікування 5МНІ. Замість введення інгібувальної речовини Моїспй за різними методиками для її потрапляння до системного кровотоку для індукування експресії атонального гомолога 1 (Аїой1 або Маїй1!) на аномально підвищених рівнях і протягом тривалих періодів часу, було б корисним і бажаним індукування експресії

Аїоп1 в середовищі передньої частини вушного лабіринту на більш цілеспрямованому рівні експресії і більш доцільний період часу. Неможливість модулювання Аїйойп1 залишається перешкодою для дослідження слухових волоскових клітин і створення терапевтичних засобів для регенерації слухових волоскових клітин. Незважаючи на продовження досліджень (дивись, наприклад, УМО 2014/039781), у продажу немає жодного наявного інгібітору Моїсп для лікування бо нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою слухових волоскових клітин.

Еснує необхідність одержання сполук, що мають інгібувальну активність щодо передавання сигналів шляхом Моїсп. Еснує також необхідність одержання сполук, які інгібують передавання сигналів шляхом Моїсі через інгібувальну активність до у-секретази. Еснує також необхідність одержання сполук, що мають різні структурні характерні особливості, які можуть сприяти інгібувальній активності щодо передавання сигналів шляхом Моїсп та у-секретази. Еснує також необхідність одержання сполук, які індукують експресію Аїой 1 інгібуванням передавання сигналів шляхом Моїсп. Еснує також необхідність одержання сполук, що демонструють бажані властивості абсорбції, розподілу, метаболізму та виділення.

Один з аспектів цього винаходу полягає у наданні сполуки, що має структуру:

Мео

Ів; / мА : Н о 7 8; ;

Сполука 1 4,4,4-трифтор-М-(25)-1-(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1 Н- бензо|Опіроло(1,2-а|азепін-б-іл)яаміно)-1-оксопропан-2-іл)бутанаміду, або її по суті діастереомерно чистого ізомеру, або фармацевтично прийнятної солі будь-якої вказаної вище сполуки.

Еншим аспектом цього винаходу є сполука, що має структуру: 5 М зС М и-м (в);

Н

АК

(в); 7 (в)

Сполука 2

М-(25)-1-(8,8-диметил-б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридо|З3,2-Ппіроло|1,2-а|азепін-5- ілламіно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанамід, або її по суті діастереомерно чистий ізомер, або фармацевтично прийнятна сіль будь-якої вказаної вище сполуки.

У ще одному аспекті цього винаходу запропонована фармацевтична композиція, що включає Сполуку 1, або її по суті чистий діастереомер, чи Сполуку 2, або її по суті чистий діастереомер; або фармацевтично прийнятну сіль будь-якої з вказаних вище спольук, і фармацевтично прийнятний носій.

У ще одному аспекті цього винаходу запропонований спосіб лікування раку, яким є Т- клітинний гострий лімфобластний лейкоз, гострий лімфобластний лейкоз, хронічний лімфобластний лейкоз, гострий мієлогенний лейкоз, хронічний мієлогенний лейкоз, еритролейкоз, тричі негативний рак молочної залози, рак молочної залози, рак яєчника, меланома, рак легенів, недрібноклітинний рак легенів, рак підшлункової залози, гліобластома, рак ободової та прямої кишки, рак голови та шиї, рак шийки матки, рак передміхурової залози, рак печінки, плоскоклітинний рак порожнини рота, рак шкіри, медулобластома, ангіосаркома, рабдоміосаркома, ліпосаркома, злоякісна фіброзна гістіоцитома, гепатоцелюлярний рак, холангіокарцинома внутрішньопечінкових та позапечінкових жовчних протоків і аденоїдна кістозна карцинома у пацієнта, який включає введення пацієнту, що цього потребує, терапевтично ефективної кількості Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі.

В іншому аспекті цього винаходу запропонований спосіб лікування раку легенів у пацієнта, який включає введення пацієнту, що цього потребує, терапевтично ефективної кількості

Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі.

У ще одному аспекті цього винаходу запропонований спосіб лікування нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою слухових волоскових клітини, у пацієнта, що цього потребує, який включає введення згаданому пацієнту терапевтично ефективної кількості Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, або Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі.

В іншому аспекті цього винаходу запропонований спосіб індукування утворення слухових волоскових клітин у пацієнта, що цього потребує, який включає введення згаданому пацієнту терапевтично ефективної кількості Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі.

У ще одному аспекті цього винаходу запропонована Сполука 1, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль, чи Сполука 2, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії.

В іншому аспекті цього винаходу запропонована Сполука 1, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль, чи Сполука 2, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування у лікуванні Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу, хронічного лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, хронічного мієлогенного лейкозу, еритролейкозу, тричі негативного раку молочної залози, раку молочної залози, раку яєчника, меланоми, раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, раку підшлункової залози, гліобластоми, раку ободової та прямої кишки, раку голови та шиї, раку шийки матки, раку передміхурової залози, раку печінки, плоскоклітинного раку порожнини рота, раку шкіри, медулобластоми, ангіосаркоми, рабдоміосаркоми, ліпосаркоми, злоякісної фіброзної гістіоцитоми, гепатоцелюлярного раку, холангіокарциноми внутрішньопечінкових та позапечінкових жовчних протоків або аденоїдної кістозної карциноми.

У ще одному аспекті цього винаходу запропонована Сполука 1, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль, чи Сполука 2, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування у лікуванні раку легенів.

В іншому аспекті цього винаходу запропонована Сполука 1, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль, чи Сполука 2, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування у лікуванні нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою слухових волоскових клітин.

Зо В іншому аспекті цього винаходу запропонована Сполука 1, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль, чи Сполука 2, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування в індукуванні утворення слухових волоскових клітин.

У ще одному аспекті цього винаходу запропоноване використання Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для лікування Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу, хронічного лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, хронічного мієлогенного лейкозу, еритролейкозу, тричі негативного раку молочної залози, раку молочної залози, раку яєчника, меланоми, раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, раку підшлункової залози, гліобластоми, раку ободової та прямої кишки, раку голови та шиї, раку шийки матки, раку передміхурової залози, раку печінки, плоскоклітинного раку порожнини рота, раку шкіри, медулобластоми, ангіосаркоми, рабдоміосаркоми, ліпосаркоми, злоякісної фіброзної гістіоцитоми, гепатоцелюлярного раку, холангіокарциноми внутрішньопечінкових (та позапечінкових жовчних протоків або аденоїдної кістозної карциноми.

В іншому аспекті цього винаходу запропоноване використання Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для лікування раку легенів.

У ще одному аспекті цього винаходу запропоноване використання Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для лікування нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою слухових волоскових клітин.

В іншому аспекті цього винаходу запропоноване використання Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для індукування утворення слухових волоскових клітин.

У ще одному аспекті цього винаходу запропонований спосіб лікування нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою слухових волоскових клітин, у свійської тварини родини бо собачих, який включає введення терапевтично ефективної кількості Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, згаданій свійській тварині родини собачих.

У ще одному аспекті цього винаходу запропонований спосіб індукування утворення слухових волоскових клітин у свійської тварини родини собачих, яка потребує цього, який включає введення терапевтично ефективної кількості Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, згаданій свійській тварині родини собачих.

Фраза "Сполука 1, її діастереомер" означає 4,4,4-трифтор-М-(25)-1-(9-метокси-3,3- диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1Н-бензо|Чпіроло|1,2-а|азепін-6-іл)аміно)-1-оксопропан-2- іл/бутанамід; або діастереомер 4,4,4-трифтор-М-((5)-1-((5)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо- 2,3,5,6-тетрагідро-1Н-бензо|Опіроло(1,2-а|азепін-б6-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)бутанаміду, або 4,4,4-трифтор-М-((5)-1-((8)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1 Н- бензо|Опіроло(1,2-а|азепін-б-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл/бутанамід. Аналогічним чином, фраза "Сполука 2, її діастереомер" означає М-(25)-1-(8,8-диметил-б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н- піридоЇ3,2-Чпіроло|1,2-а|азепін-5-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанамід; або діастереомер М-((5)-1-(((5)-8,8-диметил-б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридо|З3,2-Ппіроло|1,2- а|азепін-5-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанаміду або М-((5)-1-((В)-8,8-диметил- б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридоЇЗ3,2-Ппіроло|1,2-а|азепін-5-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)- 4,4,4-трифторбутанамід.

Термін "пацієнт" означає ссавця, а термін "ссавець" охоплює, але не обмежується цим, людину після постнатального періоду. Постнатальним періодом у людини є період, який починається відразу після пологів і триває 30 днів. "Терапевтично ефективна кількість" або "ефективна кількість" означає дозу Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру, який являє собою Езомер 1 або Езомер 2, або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру, який являє собою Езомер 1 або

Езомер 2, або її фармацевтично прийнятної солі, або фармацевтичної композиції, що містить будь-яку сполуку зі згаданих вище, необхідну для інгібування передавання сигналів шляхом

Моїсп у пацієнта з онкологічним захворюванням, яка або знищує цільові ракові клітини, або

Зо сповільнює чи припиняє прогресування раку у пацієнта. Аналогічно, ""ерапевтично ефективна кількість" або "ефективна кількість" означає дозу Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру, який являє собою Езомер 1 або Езомер 2, або її фармацевтично прийнятної солі, або Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру, який являє собою Езомер 1 або Езомер 2, або її фармацевтично прийнятної солі, або фармацевтичної композиції, що містить будь-яку сполуку зі згаданих вище, необхідну для інгібування передавання сигналів шляхом Моїсп у пацієнта з нейросенсорною втратою слуху, спричиненою втратою або пошкодженням слухових волоскових клітин, або для індукування утворення слухових волоскових клітин. "По суті чистий діастереомер Сполуки 1 або Сполуки 2" означає Езомер 1 або Езомер 2, який практично не містить іншого ізомеру. Сполука 1 або Сполука 2 є "по суті діастереомерно чистою", коли ізомерна чистота у 6 позиції Сполуки 1 або у 5 позиції Сполуки 2 є більшою за 90 96 енантіомерний надлишок. У одному із варіантів здійснення цього винаходу ізомерна чистота є більшою ніж 95 95 енантіомерний надлишок в б позиції Сполуки 1 або у 5 позиції

Сполуки 2. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу ізомерна чистота є більшою ніж 98 95 енантіомерний надлишок у 6 позиції Сполуки 1 або у 5 позиції Сполуки 2. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу ізомерна чистота є більшою ніж 9995 енантіомерний надлишок у б позиції Сполуки 1 або у 5 позиції Сполуки 2. В межах цього винаходу розглядаються усі стереоізомери, в тому числі діастереомерні суміші Сполуки 1 або Сполуки 2.

Можливі дози Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, або Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі для лікування раку знаходяться у діапазоні від 0,1 мг/пацієнта/удобу до 100 мг/пацієнта/добу.

Припускають що дози, яким віддають перевагу, знаходяться у діапазоні від 1,0 мг/пацієнта/добу до 75 мг/пацієнта/добу. Припускають що дози, яким віддають найбільшу перевагу, знаходяться у діапазоні від 2,0 мг/пацієнта/добу до 50 мг/пацієнта/добу. Можливі дози Сполуки 1, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі, або Сполуки 2, її по суті чистого діастереомеру або її фармацевтично прийнятної солі для лікування нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою або пошкодженням слухових волоскових клітин, або індукування утворення слухових волоскових клітин, знаходяться у діапазоні від 0,01 мг/пацієнта/добу до 100 мг/пацієнта/добу. Припускають що дози, яким віддають перевагу, знаходяться у діапазоні від від 0,1 мг/пацієнта/добу до 10 мг/пацієнта/добу. Припускають що дози, яким віддають найбільшу 60 перевагу, знаходяться у діапазоні від 0,2 мг/пацієнта/добу до 1,0 мг/пацієнта/добу.

У разі раку, нейросенсорної втрати слуху або індукування утворення слухових волоскових клітин точна доза, необхідна для лікування пацієнта, і тривалість часу лікування буде визначатися лікарем з огляду на стадію та тяжкість захворювання, а також на конкретні потреби і реакцію конкретного пацієнта. Хоча і виражена як доза на добу, схема прийому лікарського засобу може бути скоригована для забезпечення більш оптимальної терапевтичної дії для пацієнта, та для зняття і зменшення будь-якої пов'язаної з лікарським засобом токсичності. Крім щоденного введення, доречним може бути введення через день (0203); через день протягом п'ятиденного періоду з наступними двома днями без введення дози (Т.І.М/.); через три дні (030); або один раз на тиждень (0.І.М/.) протягом 21-денного циклу дозування; або інші схеми введення.

Терміни "лікування", "курс лікування" і "лікувати" означають включення повного спектру втручання у разі раку, нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою або пошкодженням слухових волоскових клітин, або індукування утворення слухових волоскових клітин, такого як введення активної сполуки для полегшення, уповільнення або звертання одного чи декількох симптомів і уповільнення розвитку раку або втрати чи пошкодження слухових волоскових клітин, на які страждає пацієнт, або для індукування утворення слухових волоскових клітин у пацієнта.

Термін "свійські тварини родини собачих" означає одомашнених та вирощених у домашніх умовах представників родини собачих, у тому числі, але не обмежуючись ними, кімнатних собак, службових собак, рятувальних собак, собак-пастухів та собак-охоронців худоби.

Терміни "втрата слуху" або "нейросенсорна втрата слуху" у людини означає поріг чутності (найтихіший звук (інтенсивність), який прослуховується на певній частоті) у пацієнта, який становить від 21 дБ до 40 дБ для слабкої; від 41 дБ до 55 дБ для помірної; від 56 дБ до 70 дБ для помірно-тяжкої; від 71 дБ до 90 дБ для тяжкої; і 91 дБб і вище для глибокої втрати слуху.

Випробувальна інтенсивність зазвичай коливається у межах від 0 дБ до 120 дБ. Випробувальні частоти зазвичай становлять 250 Гц, 500 Гц, 1000 Гц, 2000 Гц, 4000 Гц ї 8000 Гц. Діагностичну оцінку слуху здійснюють за допомогою звичайних тестів, відомих і використовуваних фахівцями у цій галузі, включаючи аудіометрію чистого тону, у тому числі середнє чистого тону, мовну аудіометрію, включаючи поріг сприйняття мови, оцінку відповіді слухового відділу стовбуру головного мозку (АВК або ВАЕК), транстимпанічну електрокохлеографію (ЕСОС), і

Зо випробування з реєстрацією отоакустичної емісії (ОАЕ). Педіатричне та дитяче оцінювання також здійснюють за допомогою звичайних тестів, відомих і використовуваних фахівцями у цій галузі, включаючи аудіометрію з візуальним підкріпленням, ігрову аудіометрію, випробування з реєстрацією отоакустичної емісії (ОАЕ) та оцінку відповіді слухового відділу стовбуру головного мозку.

Сполуці за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, надають форму фармацевтичної композиції з фармацевтично прийнятним носієм, і вводять різноманітними шляхами. Для лікування раку такі композиції переважно є призначеними для перорального введення.

Для лікування нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою або пошкодженням слухових волоскових клітин, або індукування утворення слухових волоскових клітин, для місцевої або системної терапії може бути одержана і введена фармацевтична композиція, придатна для перорального або парентерального введення. Пероральні композиції охоплюють таблетки, таблетки з оболонкою, тверді або м'які желатинові капсули, розчини, емульсії або суспензії. Парентеральні композиції можуть бути одержані так, щоб надавати можливість введення, в тому числі шляхом підшкірних ін'єкцій, внутрішньовенних, внутрішньом'язових, внутрішньочеревинних, інтраплевральних, інтрастернальних, транстимпанічних, інтралабіринтних або інтракохлеарних ін'єкцій або інфузії. Фармацевтичні композиції можуть бути одержані так, щоб забезпечувалась біодоступність сполуки за цим винаходом після введення композиції пацієнту, або одержані так, щоб забезпечувалось регульоване або тривале вивільнення активного фармацевтичного інгредієнта. Перевагу віддають фармацевтичній композиції, придатній для транстимпанічного введення в порожнину середнього вуха, і перевагу також віддають введенню в нішу круглого вікна середнього вуха. Також передбачається інтралабіринтна ін'єкція та інтракохлеарна ін'єкція. Переважним шляхом введення для лікування втрати слуху є місцева транстимпанічна ін'єкція, однак це не виключає фармацевтичних композицій, придатних для альтернативних шляхів введення із забезпеченням системної доставки, і можуть бути застосовані композиції та схеми прийому лікарського засобу, альтернативні або додаткові до місцевого транстимпанічного введення. Також перевага віддається композиції для місцевої доставки з пролонгованим вивільненням, яка містить

Сполуку 1, або її по суті чистий діастереомер, або її фармацевтично прийнятну сіль, та інтервал 60 вивільнення якої може коливатись від трьох (3) днів до дев'яноста (90) днів залежно від носія для доставки або суміші речовин-носіїв для доставки.

Фармацевтичні композиції, способи одержання і системи доставки для цілеспрямованої доставки лікарських засобів є добре відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, КЕМІМСТОМ:

ТНЕ 5СІЕМСЕ АМО РВАСТІСЕ ОЕ РНАВМАСУ (А. Сеппакго, ві аї!., едв., 19? єд., Маск Рибіїзпіпу

Со., 1995); за апа Ріопіке, "Ріїіпсіріез ої Госа! Огид Оеєїїмегу ю їйе Іппег Еаг", Ацаїо! Меигоо), 2009, (14); 350-360; АВНеє, єї аї., "Зивіаіпед-КеїІєазе Іпівєстаріє Огид Овєїїмегу", Рнаптасецііса

Тесппоіоду, зресіа! Ієвие Огид Оеїїмегу, 01 Мом. 2010. Фармацевтичні композиції можуть містити консерванти, солюбілізатори, стабілізатори, зволожуючі речовини, емульгатори, підсолоджувачі, барвники, ароматизатори, солі для різного осмотичного тиску, буфери, маскувальні агенти або антиоксиданти.

Сполука за цим винаходом здатна вступати в реакцію з низкою неорганічних та органічних кислот з утворенням фармацевтично прийнятних солей, одержуваних додаванням кислот. Такі фармацевтично прийнятні солі та загальна методика їх одержання добре відомі в цій галузі.

Дивись, наприклад, Р. зіайі, еї аї, НАМОВООК ОЕЄ РНАКМАСЕОЦШТІСАЇ. ЗА! Т5: РВОРЕВТІЕ5,

ЗЕГЕСТІОМ АМО О5Е, (МСНАЛМЙеу-УСН, 2002); 5.М. Вегоєеє, єї а!., "Рнаптасеціїса! Зав", УоШтпаї ої Рпаптасеціїса! 5сієпсев, Мої. 66, Мо. 1, Уапиагу 1977.

Сполука 1, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль або Сполука 2, її по суті чистий діастереомер або її фармацевтично прийнятна сіль можуть бути одержані різноманітними способами, відомими в цій галузі, а також способами, описаними нижче.

Конкретні етапи синтезу можуть бути скомбіновані різними шляхами для одержання Сполуки 1, її діастереомера або її фармацевтично прийнятної солі, чи Сполуки 2, її діастереомера або її фармацевтично прийнятної солі.

Сполука 1 називається: 4,4,4-трифтор-М-(25)-1-(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6- тетрагідро-1Н-бензоГЧпіроло|1,2-а|азепін-б-ілламіно)-1-оксопропан-2-іл)бутанамід, і також може бути названа 4,4,4-трифтор-М-(15)-2-(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1Н- піроло(1,2-а|1|бензазепін-6-іл)аміно|1-метил-2-оксоетилібутанамід; і також може бути названа: бутанамід, 4,4,4-трифтор-М-(15)-1-метил-2-оксо-2-((2,3,5,6-тетрагідро-9-метокси-3,3-диметил-5- оксо-1Н-піроло|1,2-а|1|бензазепін-б-іл)аміно|етил)-; та для однозначної ідентифікації Сполуки 1 можуть бути використані й інші назви. Діастереомери називаються 4,4,4-трифтор-М-((5)-1-(((5)-

Зо 9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1Н-бензо|Чпіроло|1,2-а|азепін-б-іл)аміно)-1- оксопропан-2-іл)бутанамід та 4,4,4-трифтор-М-((5)-1-((8)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6- тетрагідро-1Н-бензоГЧпіроло|1,2-а|азепін-б-ілламіно)-1-оксопропан-2-іл)бутанамід. Для однозначної ідентифікації кожного з діастереомерів можуть бути використані й інші назви.

Сполука 2 називається: М-((25)-1-((8,8-диметил-6б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридоїЇ3,2-

Тпіроло|1,2-а|азепін-5-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанамід, і також може бути названа М-(15)-2-(8,8-диметил-б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридоЇЗ3,2-Чпіроло|1,2-а|азепін-5- іл)аміно|-1-метил-2-оксоетил)-4,4,4-трифторбутанамід; і також може бути названа: бутанамід, 4,4,4-трифтор-М-((15)-1-метил-2-оксо-2-І((6,8,9,10-тетрагідро-8,8-диметил-6-оксо-5Н-піридої|3,2-

Тпіроло|1,2-а|азепін-5-іл)аміно|етил|-; та для однозначної ідентифікації Сполуки 2 можуть бути використані й інші назви. Діастереомери називаються М-((5)-1-((5)-8,8-диметил-6б-оксо-6,8,9,10- тетрагідро-5Н-піридо|З3,2-Ппіроло|1,2-а|азепін-5-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4- трифторбутанамід та М-((5)-1-((8)-8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридої3,2-

Тпіроло|1,2-а|азепін-5-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанамід. Для однозначної ідентифікації кожного з діастереомерів можуть бути використані й інші назви.

Зрозуміло, що Сполука 1 та Сполука 2 зображені з одним з двох визначених хіральних центрів. У цьому документі для позначення конкретних ізомерів використовують символи (К)- та (5)- за номенклатурою Кана-Енгольда-Прелога. Конкретні стереоіїзомери можуть бути одержані за допомогою стереоспецифічного синтезу з використанням енантіомерно чистих або збагачених початкових матеріалів. Конкретні стереоїзомери будь-яких початкових матеріалів, проміжних хімічних сполук або рацемічних сумішей, включаючи Сполуку 1 або Сполуку 2, можуть бути відокремлені методами, добре відомими в цій галузі, такими як ті, що наведені в

Зіегеоспетівігу ої Огдапіс Сотроипав, Е. І. ЕЇїєїЇ апа 5. Н. УМієп (/Міеу 1994) та Епапіотегв,

Касетаїгез, апа Кезоїшіоп5, у)., Чдасдцев5, А. СоїПеї, апа 5. Н. Меп (УМіеу 1991), включаючи хроматографію на хіральних стаціонарних фазах, ферментативне відокремлення або фракційну кристалізацію, або хроматографію діастереомерів, сформованих з цією метою, таких як діастереомерні солі. Коли хіральна сполука виділяється або розділяється на її ізомери, але абсолютні конфігурації або оптичне обертання не визначаються, ізомери довільно позначаються як Езомер 1 та Езомер 2 відповідно до порядку, в якому кожен з них елююється під час хіральної хроматографії, і якщо хиральна хроматографія починається на початку бо синтезу, аналогічне позначення застосовується до подальших проміжних хімічних сполук та прикладів. Незважаючи на те, що в межах цього винаходу розглядаються усі суміші, які містять сполуки за цим винаходом, варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, є

Сполука 1, Езомер 2, або Сполука 2, Езомер 2.

Сполуки, використані як початковий матеріал при синтезі сполук за цим винаходом, добре відомі і, якщо відсутні у продажу, легко синтезуються з використанням конкретних наданих посилань за стандартними процедурами, які традиційно використовуються фахівцями в цій галузі або віднаходяться в загальновідомих довідкових джерелах.

Приклади відомих процедур та методів охоплюють описані в загальновідомих довідкових джерелах, таких як Сотргепепзіме Огдапіс Тгапетогтайоп5, МСН Рибіїзпеге пс, 1989;

Сотрепаїйт ої Огдапіс зупіпеїйс Меїподз», Моїштез 1-10, 1974-2002, М/еу Іпіегзсіепсе; Адуапсед

Огдапіс Спетівігу, Неасіюпе Меспапізтв, апа бігисіиге, 57 Еййоп, Міснає!ї В. тій апа дуету

Магси, М/Іеу Іпіегзсієпсе, 2001; Адмапсей Огдапіс Спетівігу, 4т Едйоп, Ра В, Веасійпв апа зЗупіпевзів, Егапсів А. Сагеу апа Віснага у. зипабрего, Кішмег Асадетіс/РІіепит Рибіївпегв, 2000, еїс., а також в цитованих в них посиланнях.

У значенні, вживаному у цьому описі, наведені нижче терміни мають такі значення: "тАїоп1" означає мишачий білок атонального гомолога 1; "ПАЙ 1" означає людський білок атонального гомолога 1; "А(оп1" означає людський ген - атональний гомолог 1; "Вазіс Медішт" ("Основне живильне середовище") означає 500 мл середовища ОМЕМ/Е12ж-5 мл 100х концентрованого розчину добавки М2 і 10 мл 50х концентрованого розчину добавки В27 плюс 500 мкл концентрованого розчину ампіциліну (1000х, 50 мг/мл) і 1667 мкл фунгізону (300х); "ВЕСЕ" означає основний фактор росту фібробластів; "ОМЕМ" означає модифіковане за способом

Дульбекко середовище Егла; "ОМ5О" означає диметилсульфоксид; "ЕЮОТА" означає етилендіамінтетраоцтову кислоту; "ЕСЕ" означає фактор росту епідерміса; "ЕСТА" означає етиленгліколь-біс(2-аміноетиловий ефір)-М, М, М,М-тетраоцтову кислоту; ЕБ/М5 означає мас- спектроскопію з електророзпиленням; "ЕВ5" означає ембріональну бичачу сироватку; "СЕР" означає зелений флуоресцентний білок; "год." означає годину або години; "НВ55" означає збалансований сольовий розчин Хенкса; "НЕК" означає ембріональну нирку людського зародку; "ІСво" означає концентрацію речовини, що спричинює 50 95 максимальної реакції пригнічення, можливої для цієї речовини; "Ід" означає імуноглобулін б; "Маїй1" означає людський ген -

Зо атональний гомолог 1; "Медіит А" ("Середовище А") означає 200 мл основного середовища х єавгзтьванг-авЕ-1 ж гепарансульфат з концентрацією 20 нг/мл, 10 нг/мл, 50 нг/мл та 50 нг/мл, відповідно; "МЕМ" означає мінімальне підтримувальне середовище; "хв" означає хвилини; "М5" означає мас-спектроскопію; "М1ІСО" означає інтрацелюлярний домен Моїсп1; "МОЕР" означає ядерний зелений флуоресцентний білок; "ОС" означає кортієв орган; "РВ5" означає забуферений фосфатом фізіологічний розчин; "РВЗТ" означає забуферений фосфатом фізіологічний розчин ї- Тмееп?; "ДРОВ" означає кількісну полімеразну ланцюгову реакцію; "ОВТ-

РСК" означає кількісну полімеразну ланцюгову реакцію зі зворотною транскрипцією; "об/хв" означає обороти на хвилину; "КІТ рийег" означає буфер КМеавзуї увів; "КТ" означає кімнатну температуру; "Тер" означає ТАТА-зв'язуючий білок;

Препаративна методика 1 1-Бром-3-(2-бром-4-метоксифеніл)пропан-2-он

Ф)

НзС7 (е) ів;

Вг

До перемішуваного при температурі 02С розчину 2-(2-бром-4-метоксифеніл)ацетилхлориду (52 г, 197,3 ммоль) у тетрагідрофурані (197 мл) та ацетонітрилі (197 мл) у атмосфері азоту краплями додають розчин триметилсилілдіазометану (118,4 мл, 236,80 ммоль, 2М у гексанах).

Через 15 хв дозволяють нагрітися до кімнатної температури, і перемішують протягом 2 год. у атмосфері азоту. Концентрують до одержання густого масла червоного кольору (61 г). До перемішуваного при температурі 5"С розчину 2-(2-бром-4-метоксифеніл)ацетилазиду з попереднього етапу в оцтовій кислоті (265 мл) краплями додають розчин бромистого водню (36 мл, 197 ммоль, 33 95 у оцтовій кислоті). Після завершення додавання суміші дозволяють нагрітися до кімнатної температури у атмосфері азоту. Через 45 хвилин гасять сумішшю льоду з водою (500 мл), і одержують осад коричневого кольору. Тверді речовини відфільтровують, промивають водою (100 мл) та гексанами (100 мл), сушать під вакуумом при температурі 45 С протягом 2 год., і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді масла оранжевого кольору (63,0 г, 99 965). "Н ЯМР (300 МГц, СОСІз): 7,17-7,12 (т, 2Н), 6,85 (ай, 9У-2,5 Гц, 8,5 Гц, 1Н), 4,03 (5, 2Н), 3,97 (5, 2Н), 3,79 (5, ЗН).

Препаративна методика 2 (32)-1-(-2-Бром-4-метоксифеніл)-3-(3,3-диметилпіролідин-2-іліден)пропан-2-он

Ге)

Нзе о НМ -й

Вг Нзс УНз

До суспензії проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 1, 1-бром- 3-(2-бром-4-метоксифеніл)пропан-2-ону (60,00 г, 186 ммоль) та йодиду калію (31 г, 86 ммоль) у тетрагідрофурані (600 мл) при кімнатній температурі однією порцією додають 3,3- диметилпіролідин-2-тіон (26,5 г, 205 ммоль), і перемішують протягом 1 год. Додають метил- трет-бутиловий простий ефір (200 мл), тверді речовини відфільтровують, відфільтрований осад промивають метил-трет-бутиловим простим ефіром (100 мл), і одержують 1-(2-бром-4- метоксифеніл)-3-((4,4-диметил-2,3-дигідропірол-1-іум-5-іл)усульфаніл|Іпропан-2-ону йодид у вигляді твердої речовини світло-жовтого кольору (100 г). До суспензії вказаної твердої речовини (100 г, 201 ммоль) в ацетонітрилі (1 л) додають триетиламін (56 мл, 401 ммоль) та трифенілфосфін (58 г, 221 ммоль), і перемішують при температурі 65 "С протягом 2,5 год.

Додають метил-трет-бутиловий простий ефір (200 мл), і тверді речовини відфільтровують.

Фільтрат випарюють, залишок розтирають з метил-трет-бутиловим простим ефіром (20 мл), їі тверді речовини відфільтровують (двічі). Об'єднані фільтрати випарюють, і одержують 50 г неочищеного матеріалу. Залишок очищають флеш-хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 20-50 95 етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (41 г, 70 95). М5 (т/2): 338,0/340,0 (М-/М--г).

Препаративна методика З 9-Метокси-3,3-диметил-2,3-дигідро-1Н-піроло(1,2-А1И |бензазепін-5(6Н)-он

Нзб-о

М

СНУ

/ сна в)

Суміш проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 2, (32)-1-(2- бром-4-метоксифеніл)-3-(3,3-диметилпіролідин-2-іліден)упропан-2-ону (40,0 г, 118 ммоль), ацетату паладію (2,7 г, 12 ммоль), карбонату цезію (77 г, 237 ммоль), 4,5-бісі(ідифенілфосфіно)- 9,9-диметилксантену (13,7 г, 24 ммоль) та М-метил-2-піролідону (1,2 л) знегажують, і продувають азотом (х3). Вказану суспензію нагрівають при температурі 150 "С протягом 4 год.

Охолоджують до кімнатної температури, тверді речовини відфільтровують, промивають

Зо етилацетатом, і тверді речовини видаляють. До фільтрату додають етилацетат (1 л) та воду (500 мл), тверді речовини відфільтровують через діатомову землю, і видаляють. Шари фільтрату розділяють, водний шар екстрагують спочатку етилацетатом (2х20 мл), потім дихлорметаном (3х100 мл). Об'єднані органічні шари двічі промивають 5 95 водним розчином бікарбонату натрію, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання 100 мл масла темно-коричневого кольору. Матеріал фільтрують через шар силікагелю, елююючи спочатку дихлорметаном, потім 195 сумішшю метанол/дихлорметан, і фільтрат концентрують. Залишок розподіляють між етилацетатом та 5 95 водним розчином бікарбонату натрію, водний шар піддають зворотному екстрагуванню етилацетатом, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання неочищеного продукту у вигляді піни темно- коричневого кольору. Одержану піну розчиняють в етилацетаті (250 мл), додають ЗійВопа ТпіоІ? (80 г), і перемішують при кімнатній температурі протягом ночі. Тверді речовини відфільтровують, відфільтрований осад промивають етилацетатом і дихлорметаном, фільтрат концентрують, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини світло- коричневого кольору (19,6 г, 65 95). М5 (т/2): 258,0 (М.Н).

Препаративна методика 4 6-Гідроксиїміно-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигідро-1Н-піроло|(1,2-а|П1 |бензазепін-5(6Н)-он

Нзб-о

М

СНУ сна ноу (в)

До перемішуваного при температурі 0 "С розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за

Препаративною методикою 3, 9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигідро-1Н-піроло|1,2-АІ1|бензазепін- 5(6Н)-ону (16,8 г, 65 ммоль) у тетрагідрофурані (336 мл) декількома порціями додають трет- бутоксид калію (11 г, 98 ммоль), і перемішують протягом 15 хв. Краплями додають амілнітрит (12,2 мл, 91 ммоль), і суміш перемішують протягом 30 хв при температурі 0 "С. Реакційну суміш виливають на суміш льоду та води (200 мл), і одержану суміш екстрагують етилацетатом (2х200 мл). Кристалізовану тверду речовину відфільтровують, фільтрат екстрагують дихлорметаном (2х100 мл). Об'єднану органічну речовину промивають розсолом (100 мл), сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання твердої речовини світло- коричневого кольору. Тверду речовину розтирають з сумішшю метил-трет-бутиловий простий ефір/гексан (1:1), об'єднують з попередньо зібраною твердою речовиною, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини світло-жовтого кольору (16,5 г, 88 95). М5 (т/л): 287,1 (М.Н).

Препаративна методика 5 6-Аміно-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигідро-1Н-піроло|1,2-а|1|бензазепін-5(6Н)-он

Нзб-о

М сСНз / сна

НьЬМ о

До перемішуваної при температурі 5-10 "С суспензії проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 4, б-гідроксиіїміно-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигідро-1Н- піроло(1,2-а|1|бензазепін-5(6Н)-ону (16,5 г, 58 ммоль) і цинкового пилу (11,3 г, 173 ммоль) у дихлорметані (248 мл) краплями протягом 10 хв додають трифтороцтову кислоту (17 мл, 231 ммоль), після чого дозволяють нагрітися до кімнатної температури. Суміш фільтрують через шар діатомової землі, фільтрат виливають до суміші льоду та насиченого водного розчину карбонату натрію (1:11, 500 мл). Одержану суспензію фільтрують через діатомову землю, і фільтрувальний шар промивають дихлорметаном. Водний шар екстрагують дихлорметаном (100 мл), об'єднані органічні шари сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді піни світло-коричневого кольору (14,7 г, 94 9). М5 (т/2): 273,1 (МАН).

Препаративна методика 6

Зо Бензил-(25)-2-(4,4,4-трифторбутаноїламіно)пропаноат

Е но

Е оч ио о сн,

До перемішуваного розчину 4,4,4-трифтормасляної кислоти (7,1 г, 49 ммоль) у дихлорметані (162 мл) додають гідрохлорид бензилового складного ефіру І-аланіну (7 г, 32,5 ммоль), діззопропілетиламін (28 мл, 162 ммоль), гідроксибензотриазолу гідрат (7,5 г, 49 ммоль) та 1-(3- диметиламінопропіл)-3-етилкарбодіїміду гідрохлорид (9,3 г, 49 ммоль), і перемішують при кімнатній температурі у атмосфері М2 протягом 20 год. Гасять 20 96 водним розчином лимонної кислоти (150 мл), суміш перемішують протягом 5 хв, шари відокремлюють, і водний шар екстрагують дихлорметаном (100 мл). Об'єднані органічні шари промивають насиченим водним розчином бікарбонату натрію (150 мл), сушать над сульфатом магнію, фільтрують і концентрують до одержання 10,6 г твердої речовини блідо-жовтого кольору. Залишок очищають флеш-хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 25-50 905 етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору

(9,2 г, 94 95). М5 (т/г2): 304,2 (М.Н).

Препаративна методика 7 (25)-2-(4,4,4-трифторбутаноїламіно)пропанова кислота доб бен й о тк І

До перемішуваного розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 6, бензил-(25)-2-(4,4,4-трифторбутаноїламіно)дупропаноату (8,8 г, 29 ммоль) в метанолі (88 мл) при кімнатній температурі додають паладій (1,8 г, 0,8 ммоль, 5 95 на С). Суміш знегажують, і перемішують у атмосфері водню (еластична камера з газом під тиском) протягом 5 год. Цю суміш фільтрують через шар діатомової землі, шар промивають метанолом, і фільтрат концентрують до одержання твердої речовини білого кольору. Тверді речовини розтирають з дихлорметаном, сушать під вакуумом протягом ночі при кімнатній температурі, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору (6,11 г, 99 95 вихід). М5 (т/2): 214,1 (М'-Н).

Препаративна методика 8

Метил-3-(3,3-диметил-2-тіоксопіролідин-1-іл)упропаноат о) нНзс-о | СН 5

З,З-диметилпіролідин-2-тіон (15,7 г, 122 ммоль) і метилакрилат (12 мл, 134 ммоль) розчиняють у тетрагідрофурані (100 мл), і перемішують при кімнатній температурі в атмосфері азоту. Додають гідроксид натрію (0,8 г, 20 ммоль), і перемішують протягом ночі при кімнатній температурі в атмосфері азоту. Розбавляють розсолом, екстрагують етилацетатом, шари розділяють, органічний шар промивають розсолом, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання 27,5 г неочищених твердих речовин. Залишок очищають флеш- хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 20-50 9о етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини білого кольору (25,9 г, 99 96). М5 (т/2): 216,2 (МАН).

Препаративна методика 9

Метил-3-(22)-2-(2-етокси-2-оксоетиліден)-3,3-диметилпіролідин-1-іл|пропаноат (о)

Ук сна -09 | сна (в) о. и СНз

До перемішуваного розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 8, метил-3-(3,3-диметил-2-тіоксопіролідин-1-іл)упропаноату (41,4 г, 192 ммоль) в толуолі (156 мл) додають тетракіс(ацетат)диродій(ІІ) (3,74 г, 8,5 ммоль), і нагрівають до температури 110С в атмосфері азоту. Краплями протягом приблизно 18 год. додають етилдіазоацетат (89 мл, 844 ммоль), після чого гріють протягом ночі при температурі 110 76.

Залишок концентрують, і очищають флеш-хроматографуванням на силікагелі, елююючи 30 95 розчином етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді масла жовтого кольору (34,5 г, 67 90). М5 (т/2): 270,2 (М.Н).

Препаративна методика 10

Етил-(22)-2-(3,3-диметилпіролідин-2-іліден)ацетат

Нм сн

СНз

Ге) о. СН

До перемішуваного розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 9, метил-3-|((22)-2-(2-етокси-2-оксоетиліден)-3,3-диметилпіролідин-1-іл|Іпропаноату (33,8 г, 126 ммоль) у тетрагідрофурані (430 мл) у атмосфері азоту краплями протягом 45 хв додають розчин гексаметилдисилазиду калію (301 мл, 0,5 М у толуолі, 151 ммоль), використовуючи водяну баню з льодом для підтримання температури «30 "С. Після завершення додавання перемішують протягом 40 хв. Гасять насиченим водним розчином бікарбонату натрію (250 мл), потім концентрують. Розподіляють між діетиловим ефіром і розсолом, водний шар екстрагують етилацетатом (х4), сушать над сульфатом натрію, фільтрують і концентрують до одержання 37 г матеріалу. Залишок очищають флеш-хроматографуванням на силікагелі, елююючи 10 95 розчином етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку (9,1 г, 40 95). М5 (т/2): 184,2 (М.Н).

Препаративна методика 11

Етил-(22)-2-ІЗ,З-диметил-1-(3З-метил-2-піридил)піролідин-2-іліден|іацетат

СНУз

Се СНз

СН о. 4 з о. СН 2-бром-3-метилпіридин (1,5 г, 8,7 ммоль), проміжну сполуку, одержану за Препаративною методикою 10, етил-(227)-2-(3,3-диметилпіролідин-2-іліден)ацетат (1,6 г, 8,7 ммоль) і симетричний диметилетилендіамін (0,77 мл, 8,7 ммоль) об'єднують у 1,4-діоксані (15 мл) у реакційній посудині. Через цей розчин барботують азот з перемішуванням протягом 10 хв.

Одразу додають карбонат калію (3,6 г, 26 ммоль) та йодид мідіс(І) (0,83 г, 4,4 ммоль), посудину герметизують, і перемішуваний розчин гріють при температурі 120 С протягом 2 днів.

Розбавляють дихлорметаном, фільтрують через діатомову землю, і фільтрат концентрують.

Залишок очищають флеш-хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 5-100 95 етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді масла блідо-жовтого кольору (1,58 г, 66 95). М5 (т/2): 275,0 (М.--Н).

Препаративна методика 12 8,8-Диметил-9,10-дигідро-5Н-піридо|З,2-Ппіроло|1,2-а|азепін-6(8Н)-он

М

Ам

СНУ

/ СНУ (в)

До перемішуваного в реакційній посудині розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за

Препаративною методикою 11, етил-(227)-2-ІЗ,З-диметил-1-(З-метил-2-піридил)піролідин-2- іліденіацетату (2,88 г, 10,5 ммоль) і тетрагідрофурану (60 мл) за допомогою шприца додають

Зо біс(триметилсиліллуамід натрію (22 мл, 1 М у тетрагідрофурані, 22 ммоль). Посудину герметизують, і гріють при температурі 70 "С з перемішуванням протягом З днів. охолоджують до кімнатної температури, гасять розсолом, екстрагують етилацетатом, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання масла коричневого кольору. Залишок очищають флеш-хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 50-100 95 етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини жовтого кольору (1,70 г, 71 Фо). М5 (т/2): 229,2 (М.Н).

Препаративна методика 13 6-Азидо-10-аза-3,3-диметил-2,б-дигідро-1Н-піроло|1,2-а|/1|бензазепін-5-он - М "Мм-Мме-М (в);

До перемішуваного в атмосфері азоту при температурі -78 "С розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 12, 8,8-диметил-9,10-дигідро-5Н-піридоїЇЗ,2-

ПЦпіроло|1,2-а|азепін-6(8Н)-ону (1,85 г, 8,1 ммоль) у тетрагідрофурані (50 мл) протягом 10 хв додають діїзопропіламід літію (7,0 мл, 10,5 ммоль, 1,5 М у гексанах). Через 30 хв за допомогою шприца додають оцтову кислоту (2,3 мл, 41 ммоль), і потім дозволяють нагрітися у атмосфері азоту до кімнатної температури. Гасять насиченим водним розчином бікарбонату натрію. Суміш розподіляють між розсолом та етилацетатом, шари відокремлюють, етилацетатний шар промивають розсолом, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання твердої речовини коричневого кольору. Залишок очищають /флеш- хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 5-60 о етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку (1,2 г, 55 Ув). М5 (т/2): 270,2 (М--Н).

Препаративна методика 14 5-Аміно-3,3-диметил-9,10-дигідро-5Н-піридо|З,2-Ппіроло|1,2-а|)азепін-6(8Н)-он

М лат

СсНз ном / СНз (в)

До перемішуваного при кімнатній температурі розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 13, б-азидо-10-аза-3,3-диметил-2,6-дигідро-1Н-піроло|1,2- а| Пбензазепін-5-ону (1,2 г, 4,5 ммоль) в етанолі (50 мл) та воді (15 мл) додають спочатку цинковий пил (1,2 г, 18 ммоль), а потім хлорид амонію (5 г, 66 ммоль). Через 1 год. розбавляють етилацетатом, тверді речовини відфільтровують, і фільтрат концентрують. Залишок суспендують між етилацетатом і розсолом, шари відокремлюють, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують. Залишок очищають флеш-хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 5-4095 суміші (1095 2М розчину аміаку в метанолі/дихлорметан| у дихлорметані, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини жовтого кольору (0,72 г, 67 Ус). М5 (т/2): 244.2 (МАН).

Препаративна методика 15 трет-Бутил-М-(15)-2-(10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6б-дигідро-1Н-піроло|1,2-а|1|бензазепін-6б- ілламіно|-1-метил-2-оксоетилІікарбамат -5 М

М

7 ус ці СНз в) М о сн. о

До перемішуваного при температурі 0 "С розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за

Препаративною методикою 14, 5-аміно-3,3-диметил-9,10-дигідро-5Н-піридоЇЗ,2-Ппіроло|1,2- а|азепін-6(8Н)-ону (0,72 г, 3,0 ммоль), у тетрагідрофурані (10 мл) у атмосфері азоту додають

Зо (25)-2-(трет-бутоксикарбоніламіно)пропанову кислоту (0,69 Г, 3,6 ммоль), 1- гідроксибензотриазолу гідрат (0,55 г, 3,6 ммоль) та діізопропілетиламін (0,67 мл, 3,9 ммоль).

Додають 1-(З-диметиламінопропіл)-3-етилкарбодіїміду гідрохлорид (0,68 г, 3, ммоль), і дозволяють суміші нагрітися до кімнатної температури в атмосфері азоту. Через 2 год. розбавляють водою, і екстрагують етилацетатом. Органічний шар промивають розсолом, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують. Залишок очищають флеш- хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 50-100 9о етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини жовтого кольору (1,04 г, 84 9в). М5 (т/2):415,0 (М-А-Н).

Препаративна методика 16 (25)-2-Аміно-М-(10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6-дигідро-1Н-піроло|1,2-а|/1|бензазепін-б-іл) пропанаміду гідрохлорид -: М на М

З Її ; сна

НЬМ

2 ща сна о

До перемішуваного розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 15, трет-бутил-М-(15)-2-К10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6-дигідро-1 Н-піроло|1,2- а| Пбензазепін-б-іл)ламіно|-1-метил-2-оксоетилІкарбамату (1,04 г, 2,5 ммоль) у 1,4-діоксані (40 мл) додають хлорид водню (12,5 мл, 50 ммоль, 4 М у діоксані), і нагрівають до температури 45"С з перемішуванням. Після завершення реакції за даними ГС/М5, реакційну суміш концентрують, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини жовтого кольору (0,93 г, неочищена). М5 (т/2): 315,2 (М'-1).

Приклад 1 4,4,4-Трифтор-М-(25)-1-(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1 Н- бензо|Опіроло|1,2-а|азепін-б-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)бутанамід

Нзс-о

Е

Е М сн

Е Ге)

Н | снз с і о сну! о

Частина 1

Діастереомерний 4,4,4-трифтор-М-((25)-1-(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро- 1Н-бензо|піроло(1,2-а)азепін-6-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)бутанамід

До перемішуваного при кімнатній температурі розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 5, б-аміно-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигідро-1Н-піроло|1,2- а|ППІбензазепін-5(6Н)-ону та проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 7, (25)-2-(4,4,4-трифторбутаноїламіно)пропанової кислоти (10,9 г, 51 ммоль), у дихлорметані (294 мл) додають 1-(З-диметиламінопропіл)-3-етилкарбодіїміду гідрохлорид (12,4 г, 65 ммоль). Суміш охолоджують до температури 5 "С, додають 1-гідроксибензотриазол (8,75 г, 65 ммоль), і продовжують перемішування при кімнатній температурі протягом 10 хв. Суміш промивають водою (3х100 мл), сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують до одержання твердої речовини темного кольору. Розтирають з метил-трет-бутиловим простим ефіром, і одержують вказану в заголовку сполуку (суміш діастереомерів) у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (22,0 г, 87 Уо). М5 (т/2): 468,1 (М--1).

Частина 2 4,4,4-трифтор-М-(25)-1-(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1 Н- бензо|Опіроло(1,2-а|азепін-б-іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)убутанаміду Езомер 1 і Езомер 2

Суміш діастереомерів Прикладу 1, Частина 1, розділяють на колонці СпігаІрак АО, елююючи

Зо 1095 розчином ацетонітрилу у етанолі (0,295 диметилетиламіну), і одержують Езомер 1 (Ве3,20 хв) у вигляді твердої речовини білого кольору (9,8 г, 38 95) та Езомер 2 (К-7,37 хв) у вигляді твердої речовини білого кольору (9,0 г, 36 905). М5 (т/2): 468,2 (М.--Н) для обох ізомерів.

Приклад 2

М-(25)-1-(8,8-Диметил-6б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридо|3,2-Ппіроло|1,2-а|азепін-5- ілламіно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанамід

Е - М

Е М Я М сна

М . ї

Осн о

Частина 1

Діастереомерний М-(15)-2-(8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридоїЇ3,2-

Тпіроло|1,2-а|азепін-5-іл)аміно|-1-метил-2-оксоетил)-4,4 4-трифторбутанімід

До перемішуваного у атмосфері азоту при температурі 0 "С розчину проміжної хімічної сполуки, одержаної за Препаративною методикою 16, (25)-2-аміно-М-(10-аза-3,3-диметил-5- оксо-2,6-дигідро-1Н-піроло|1,2-а|1|бензазепін-6-іл)упропанаміду гідрохлориду (0,93 г, 2,6 ммоль) у тетрагідрофурані (50 мл) додають 4,4,4-трифторбутанову кислоту (0,45 г, 3,2 ммоль), 1- гідроксибензотриазолу гідрат (0,49 г, 3,2 ммоль) та діізопропілетиламін (2,3 мл, 13,2 ммоль).

Додають 1-(З-диметиламінопропіл)-3-етилкарбодіїміду гідрохлорид (0,61 г, 3,2 ммоль), і суміші дозволяють нагрітися до кімнатної температури в атмосфері азоту протягом 16 год.

Розбавляють водою, та екстрагують етилацетатом. Органічний шар промивають розсолом, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують. Залишок очищають флеш- хроматографуванням на силікагелі, елююючи з градієнтом 75-100 9о етилацетату в гексанах, і одержують вказану в заголовку сполуку (суміш діастереомерів) у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (0,82 г, 71 95). М5 (т/2): 439,2 (М.Н).

Частина 2

М-(25)-1-(8,8-Диметил-6б-оксо-6,8,9,10-тетрагідро-5Н-піридо|3,2-Ппіроло|1,2-а|азепін-5- іл)аміно)-1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанаміду Езомер 1 і Езомер 2

Суміш діастереомерів Прикладу 2, Частина 1, розділяють на колонці СВігаІрак Аб-Н, елююючи 15 95 Меон/Со» (газ), і одержують Езомер 1 (Р:-1,60 хв) у вигляді твердої речовини білого кольору (194 мг, 24 95, епімеризується до 3295 ОЕ (діастереомерний надлишок) та

Езомер 2 (Р-2,31 хв) у вигляді твердої речовини білого кольору (469 мг, 57 Ус). М5 (т/л): 439,0 (МАН) для обох ізомерів.

Рак все частіше визнають як гетерогенний набір захворювань, початок і розвиток яких індукується аберантним функціонуванням одного або декількох генів, які регулюють репарацію

ДНК, стабільність геному, проліферацію клітин, некроз клітин, адгезію, ангіогенез, інвазію і метастазування в клітинному і тканинному мікросередовищі. Варіантна або аберантна функція "ракових" генів може бути результатом природного поліморфізму ДНК, змін кількості копій в геномі (шляхом ампліфікації, делеції, втрати хромосом або дуплікації), змін в генній та хромосомній структурі (шляхом хромосомної транслокації, інверсії або іншої перебудови, що призводить до розрегулювання експресії гена) і точкових мутацій. Ракові пухлини можуть бути індуковані однією аберантною функцією гена і підтримуватись тією ж самою аберантною функцією гена, або їх підтримка та прогресування посилюється додатковими аберантними функціями генів.

Крім генетичних хромосомних аберацій, згаданих вище, кожен із раків може також включати епігенетичні модифікації геному, у тому числі метилування ДНК, геномний імпринтинг і модифікації гістонів ацетилюванням, метилуванням або фосфорилуванням. Епігенетична модифікація може відігравати певну роль в індукуванні та/або підтримуванні злоякісної пухлини.

Були складені, підтримуються і регулярно оновлюються в режимі он-лайн великі каталоги

Зо цитогенетичних аберацій раку людини (дивись Те Міїеітап Оаїарахе ої Спготозоте

Аре!таййопв5 іп Сапсег аї Ше 05 Маїйопа! Сапсег Іпнвійше (МС) Сапсег Сбепоте Апаюту Ргоіесі (ССАР). Ця база даних включає хромосомні аберації щонайменше деяких зі злоякісних пухлин, які розглядаються в цьому винаході. Проект Тпе Умейсоте Тги5і Запдег Іпзійше Сапсег сСепоте

Рго|есї у режимі он-лайн підтримує докладний список "Сапсег Сепе Сепзивз" усіх генів людини, які були причинно пов'язані з онкогенезом, а також базу даних СОЗМІС (Саїаіюдце ої Зотайіс

Мшайцоп5 іп Сапсег) соматичних мутацій при ракових захворюваннях людини. Ще одним джерелом, що містить значний обсяг інформації стосовно цитогенетичних змін, причинно пов'язаних з різними видами раку, є АйШа5з ої Сепеїійс5 апа Суодепеїіс5 іп ОпсоІоду апа

Наетапю!оау.

Діагностика ракових злоякісних новоутворень за допомогою біопсії, імунофенотипування та інших тестів є відомою і широко використовується. На додаток до методів диференційного фарбування хромосом з високим розділенням і передових технологій візуалізації хромосом, хромосомні аберації в підозрюваних випадках раку можуть бути визначені за допомогою цитогенетичного аналізу, такого як гібридизація іп 5йи із флуоресцентною міткою (РІЗН), каріотипування, спектральне каріотипування (5КУ), мультиплексна РІЗН (М-РІЗН), порівняльна геномна гібридизація (СОН), сукупності однонуклеотидних поліморфізмів (чипи ЗМР), та інших діагностичних тестів та аналізів, відомих і використовуваних фахівцями в цій галузі.

Онкогенна роль Моїспй! вперше була зафіксована відносно Т-клітинного лейкозу, який спричинює транслокацію внутрішньоклітинного домену МоїсСп1 в промоторну ділянку рецептора

Т-клітин типу В, що призводить до надекспресії внутрішньоклітинного домену Моїснп1 (Сгарнпег єї а! Маїште ВНеміему Сапсег, 2006(6):347-359; МУєпуд єї аї., зЗсієпсе, 2004(306):269-271).

Надекспресія внутрішньоклітинного домену МоїсСп1ї в гемопоетичних клітинах-попередниках мишей викликала у мишей Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз, схожий на людський.

Окрім Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу, з'являється все більше доказів того, що

Моїсп сигнали є онкогенними у інших ракових захворюваннях через численні механізми, у тому числі ампліфікацію рецепторів і надекспресію лігандів та/або рецепторів, у тому числі у разі гострого лімфобластного лейкозу, хронічного лімфобластного лейкозу (Козаїї еї аї, Віоса, 2009(113): 856-865), гострого мієлоїдного лейкозу (5іім'а еї аї., Іпї У Сіїп Ехр Раїйої, 2014(7(3)): 882-889), хронічного мієлоїдного лейкозу (МаКапага еї аї!., Віоса, 2010(115(14)): 2872-2881) і 60 еритролейкозу (КоБреп-Могепо єї оаКі, ІешКетіа, 2007(21): 1496-1503). Аберантний конститутивний сигнальний шлях Моїспй унаслідок мутації або надекспресії лігандів та/або рецепторів також припустимий в певних випадках солідних злоякісних пухлин, у тому числі тричі негативного раку молочної залози (5(о0ескК еї аіІ, Сапсег Оізсомегу, 2014(4): 1154-1167), раку молочної залози, раку яєчників (Рагк еї аїЇ., Сапсег Кезеагсп, 2006(66):6312-6318), меланоми (Саві єї а)., Сепе5, Сптотовотез в Сапсег, 2010(49): 733-745), раку легенів, недрібноклітинного раку легенів (МуУезійой еї аіІ,, РМАБ5, 2009 (106):22293-22298), раку підшлункової залози, гліобластоми, раку ободової та прямої кишки, раку голови і шиї, раку шийки матки, раку передміхурової залози, раку печінки, плоскоклітинного раку (ротової порожнини), раку шкіри і медулобластоми (Капдапайнап еї а!., Маїиге Кемієм Сапсег, 2011(11):338-351 апа Зирріеєтепіагу іптогтайоп 51 (абіє)). Аберантне конститутивне передавання сигналів шляхом Моїсіп унаслідок мутації або надекспресії лігандів та/або рецепторів також вважають причетною до ангіосаркоми (Камі еї аї., У Сіїп Опсої, 2007, (25(185, дУипе 20 бБирріетепю)): АБзігасі 10030), рабдоміосаркоми (Веїуєа єї а!., Сіїп Сапсег Вев, 2011(17(23)): 7324-7336; Вота еї а!., Сіїп Сапсег Вез, 2011(17(3)): 505-513), ліпосаркоми (У Сіїп Опсої, 2009, (2701155, 5ирріеєтепО): АбБзігасі 10526), злоякісної фіброзної гістіоцитоми (У/апд еї аі., Сапсег Кев5, 2012, (723: 1013-1022), гепатоцелюлярної карциноми (Мійапицема еї аї., С«зазігоепіегоїоду, 2012, (143): 1660-1669), холангіокарциноми внутрішньопечінкових та позапечінкових жовчних протоків (УМи еї аї., п 9 Ехр Раїйої, 2014, (7(6)): 3272-3279; БекКіуа еї аї., У Сіїп Іпмеві, 2012, (122(11)): 3914-3918; Мооп еї аї., Мопа

Савзігоепієгої, 2011, (17(35)): 4023-4030) та аденоїдної кістозної карциноми (Веї! єї аї., АппаїЇ5 ої

Оіадпозвіїс Раїшоіоду, 2014, (18): 10-13; ефоесК єї аЇ., Сапсег Оівсом, 2014, (43: 1154-1167).

Енгібування передавання сигналів шляхом Моїсй являє собою привабливу мету для забезпечення терапевтичної дії терапевтичного результату для хворих на рак, хвороба яких була індукована аберантною активацією конститутивного шляху передавання сигналів Моїсй.

ПН єї а)., Сапсег Везєагсі, 2007(67)1879-1882.

Одним з визначальних генів для розвитку волоскових клітин внутрішнього вуха служить гомолог транскрипційного фактора з доменом типу "спіраль-петля-спіраль" ссавців АйюпаїЇ!-1 (Ап). Експресія АїОйпІї в кохлеарних клітинах є необхідною для генезу слухових волоскових клітин. Передсенсорні епітеліальні клітини в кортієвому органі, що розвивається, які експресують АїопІ, диференціюватимуться на слухові волоскові клітини (НеЇт5 еї аї.,

Зо ОемеІортепі 2000, (127(6)): 1185-1196), ії АїпІ є одним з перших маркерів диференціації слухових волоскових клітин. Підтримувальні клітини кортієва органа зберігають потенціал для розвитку характеристик волоскових клітин, включаючи формування війок (2Пепод еї аї., Маїиге

Мешйгозсієпсе, 2000,(3(6)): 580-586; Кауматоїо еї аїЇ., У Мешговсі, 2003, (23(11)): 4395-4400;

Ігитікама єї аї., Маї Меса, 2005, (11(3)):271-276;) і належне функціонування волоскових клітин (Кажатой еї аї, 2003).

Кожна волоскова клітина завитки оточена нечутливими підтримувальними клітинами, які забезпечують трофічну і структурну підтримку волоскових клітин і гангліїв, і Є важливими для підтримання належної іонної концентрації в кортієвому органі завдяки міжклітинному спілкуванню через нексус. Еснує два типи волоскових клітин: внутрішні та зовнішні волоскові клітини. Волоскові клітини завитки у ссавців, включаючи людей, складаються з одного ряду внутрішніх волоскових клітин та трьох рядів зовнішніх волоскових клітин. Внутрішні волоскові клітини є фактичними чутливими рецепторами, і 95 95 волокон слухового нерва, які виступають в головний мозок, виникають з цієї субпопуляції. Закінчення на зовнішніх волоскових клітинах майже всі є закінченнями від еферентних аксонів, які виникають з клітин у головному мозку, і ці клітини функціонують як акустичні передпідсилювачі. Підтримувальні клітини відіграють ключову роль в утворенні слухових волоскових клітин після їх втрати або пошкодження. Під час розвитку волоскові та підтримувальні клітини розвиваються від спільного попередника, і поява волоскової клітини подає сигнал навколишнім клітинам до перетворення на підтримувальні клітини через контактне інгібування, опосередковане сигнальним шляхом Моїсі (КеїПеу, Маї Кем

Мешговзсі, 2006, (11): 837-849.

На підставі здатності підтримувальних клітин до трансдіференціації у слухові волоскові клітини, разом з їх спільним шляхом розвитку, висунули припущення про те, що підтримувальні клітини можуть функціонувати як клітини-попередники волоскових клітин (РагкКег еї аї., АчаіоІоду апа Мешйгооіоіоду, 2004, (9(2)): 72-80). Декілька досліджень продемонстрували, що оминання інгібування клітинного циклу в підтримувальних клітинах може призвести до утворення волоскових клітин у ссавців (Гожмеппеїт еї аї., Ргос Май Асай 5сі О5А, 1999, (96): 4084-4088;

ТогсПіпзвкКу еї аї., У Мепйгосуїої, 1999, (28(10-11)): 913-924; Міпода еї а!., Неаг Нез, 2007, (232): 44- 51). Таким чином, дорослі підтримувальні клітини ссавців зберігають здатність трансдиференціювання у слухові волоскові клітини у разі можливості їх вільного входження в бо клітинний цикл.

Лікарська терапія для відновлення слухових волоскових клітин - це новий підхід, а інтратимпанічне введення до рідини середнього вуха, переважно у нішу круглого вікна, без фактичної ін'єкції у завитку, може ефективно індукувати експресію Ап! в достатній для лікування кількості та протягом періоду часу тривалості, прийнятної для спричинення трансдиференціювання підтримувальних клітин в завитці в слухові волоскові клітини. Міг шагі еї аІ,, Мешйгоп, 2013 (77(1)): 58-69 показали, що доставка інгібітору гама-секретази (І 411575) до середнього вуха може бути використана для регенерації слухових волоскових клітин, втрачених унаслідок акустичної травми у мишей, і що ця генерація нових волоскових клітин з підтримувальних клітин призвела до значного вимірюваного відновлення слуху. Ця робота надала концептуальні докази терапевтичного впливу інгібування передавання сигналів шляхом

Моїспй на генерацію слухових волоскових клітин та відновлення слуху на мишачій моделі і надала механістичне (диференціювання підтримувальних клітин у слухові волоскові клітини) пояснення фізіологічного ефекту. Під час системного введення 1411575 була продемонстрована дозообмежувальна токсичність.

Наведені нижче дослідження іп мійго та іп мімо демонструють інгібувальну активність відносно передавання сигналів шляхом Моїсп та ефективність Сполуки 1 і Сполуки 2, або по суті чистих стереомерів цих сполук, на конкретній лінії ракових клітин. Ці дослідження зазвичай визнаються фахівцями у цій галузі як свідчення клінічної хіміотерапевтичної активності на людині. Вважають, що інгібування розщеплення інтрацелюлярного домену Моїсп у-секреазою є ефективним проти кожного з рецепторів Моїсп 1, Моїсп 2, Моїсп З та Моїсп 4. Дослідження, що свідчать про ефективність та інгібувальну активність відносно передавання сигналів шляхом

Моїсй, можуть бути виконані по суті так, як наведено далі, або аналогічними дослідженнями, що надають подібні дані.

Сцинтиграфічне дослідження накопичення Моїсп1 М1ІСО клітинними ядрами

Клітини НЕК29ЗАЕ12 (клітини НЕК293, розроблені для стабільного експресування кКДНК мишачого МоїсСп1, що кодує амінокислоти 1703-2183, МР 032740.3, (непроцесований мишачий білок-попередник Моїсй 1: послідовність ФЕО ІЮ МО: 1) з сигнальною пептидною послідовністю з 23 амінокислот, МРЕГТРІЇ СІ ТІ І РАГААКОЇІ К (послідовність БЕО ІЮ МО: 2) на його М-кінці) висівають з розрахунку 5000 клітин/лунку в 96-лункові планшети, інкубують в модифікованому

Зо за способом Дульбекко середовищі Егла (ОМЕМ) з високим вмістом глюкози з 595 ембріональної бичачої сироватки (ЕВ5) при температурі 37 "С, 5595 СО», протягом 24 год.

Клітини обробляють досліджуваною сполукою з дозуванням для 10 точок одержаних розведенням (1:3) розчинів в діапазоні від 1000 нм до 0,05 нМ і з кінцевою концентрацією диметилсульфоксиду (ОМ5О) 0,2 95. Після 24 год. обробки планшети для культивування клітин піддають послідовній обробці на подальших етапах: клітини фіксують (100 мкл/лунку) фіксатором РКЕРЕР М протягом 30 хв при кімнатній температурі (КТ); підвищують коефіцієнт проникності клітин 0,195 ТВІТОМ? Х100 (100 мкл/лунку) у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (РВ5) протягом 20 хв при кімнатній температурі; тричі промивають РВ5, кожного разу з розрахунку 100 мкл/лунку; додають кроляче анти-М1ІСО (інтрацелюлярний домен Моїсп1) антитіло (50 мкг/лунку, 1:2000 в РВ5) з 1 95 бичачого сироваткового альбуміну, і інкубують протягом 1,5 год. при температурі 37 "С; тричі промивають РВ5, кожного разу з розрахунку 100 мкл/лунку; інкубують з козячим анти-кролячим до (імуноглобулін б) АїІеха 488 (50 мкл/лунку, розведення 1:1000 в РВ5) з 1 95 бичачого сироваткового альбуміну, і інкубують протягом 1 год. при температурі 37 "С; тричі промивають РВ5, кожного разу з розрахунку 100 мкл/лунку, і додають 15 мкМ йодиду пропідія (100 мкл/лунку) з РНКазою (50 мкг/мл) на 30 хв для забарвлення ядер. Планшети сканують за допомогою мікропланшетного цитометра з лазерним скануванням флуоресценції АСОМЕМ ЕХРІГОКЕР м (ТР ГАВТЕСН І ТО) для визначення загальної кількості імпульсів/лунку від клітинних ядер та загальної площі перерізу проекції ядер/лунку флуоресценцією при 655-705 нм (випромінювання зв'язаного з ДНК йодиду пропідія) та флуоресценції зв'язування антитіл з МІІСО в ядерній області при 505-530 нм. Головним результатом дослідження є співвідношення загальної флуоресценції ядерного МІІСО до загальної площі перерізу проекції ядер, нормалізований ядерний сигнал М1ІСО. Профілі відносної цитотоксичності збирали як відсоток (95) кількості клітин до кількості клітин контрольного розчину з 0,2 95 ЮМ5О. Антитіло, яке розпізнає розщеплений Моїсп1 або М1ІСО, вирощують для людського пептиду, що відповідає амінокінцевому сайту розщеплення Моїсп1 людини на Ма11744. У необроблених контрольних клітин, М1ІСО з МОоїсСНп1 буде транслокуватись і накопичуватись в ядрі. Коли клітини оброблюють сполукою, що інгібує розщеплення Моїсі 1, сигнал ядерного МІІСО буде зменшуватись. Реакцію у залежності від концентрації та ІСв5о визначають підгонкою кривої до чотирипараметричного логістичного рівняння для сигналу 60 ядерного МІТІСО, тоді як відсоток (95) кількості клітин наносять на той самий графік для дослідження профілю цитотоксичності. При проведенні дослідження по суті, так як описано вище, середня ІСво для Сполуки 1, Езомер 2, становить 0,37 нМ (0,16; п-2), і для Сполуки 2,

Езомер 2, вона становить 1,55 нМ (41,12; п-2). Жодна зі сполук не впливає на кількість клітин до концентрації 1000 нМ. Ці дані свідчать про те, що як Сполука 1, Езомер 2, так і Сполука 2,

Езомер 2, має спорідненість до Моїспй 1 та інгібує внутрішньоклітинне накопичення інтрацелюлярного домену Моїсй 1 клітинного сигнального пептиду.

Дослідження цільового інгібування іп мімо

Дослідження на тваринах

Для оцінки впливу іп мімо Сполуки 1, Езомер 2 та Сполуки 2, Езомер 2 щодо інгібування фармакодинаміки (РО) обробки Моїсі, дослідження на тваринах проводили на мишах лінії

Ва!р/С без пухлин (Спагезх Кімег). Загалом для кожної групи було використано 5 мишей. Мишей годують ай Прішт звичайним кормом. Обробку починають з перорального введення (шлунковий зонд) сполуки або носія (1 95 Ма-СМС (натриєвої солі карбоксиметилцелюлози) у 0,25 95 Гуееп- 80) у об'ємі 0,2 мл. У завдані моменти часу (через 4 год. або 8 год. після введення дози) після обробки тварин вмертвлюють шляхом удушення СОг та зміщення шийного хребця. Тканини (легені) видаляють, та використовують для дослідження РО реакції, що визначається розщепленим М1ІСО.

Дослідження МІСО

Для оцінювання рівнів М1ІСО в легенях від замороженої тканини відрізають шматок масою приблизно 75 мг, і подрібнюють його перед гомогенізацією (фактичну масу записують).

Заморожені зразки пухлин переносять у пробірки І увзіпд Маїгіх-Отм, і ресуспендують в охолодженому до температури 02С лізисному буфері ХУ (25 мМ трис-буфера, рн 7,5, 10 мкг/мл інгібітора трипсину/хімотрипсину, 10 мкг/мл апротиніну, 60 мМ бета-гліцерофосфату, 1 95 Тійоп?о

Х-100, 10 мМ МаБЕ, 2,5 мМ пірофосфату, 150 мм Масі, 15 мм етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕОТА), рН 8,0, 5 мм етиленгліколь-біс(2-аміноетиловий простий ефір)-М, М, М',М'-тетраоцтової кислоти (ЕСТА), рН 8,0, 1 мМ ванадату натрію, 10 мкг/мл лейпептину, 1 мМ дитіотреїтолу, 1 мкм мікроцистіну-ЇК, 10 мкг/мл /М-п-тозил-Ї -ренілаланінхлорметилкетону (ТРСК), 2 мМ гідрохлориду Ма-п-тозил-І -аргінін метилового складного ефіру (ТАМЕ), 15 мМ ди(трис)-4- нітрофенілфосфату (РМРР), 0,1 мМ гідрохлориду 4-(2-аміноетил)/убензолсульфонілфториду

Зо (АЕВ5БЕ), 5 мМ бензамідину, 1 мкМ окадаєвої кислоти), що містить 1х таблетку Сотрієїе (Коспе

Сотрієїе"м, номер за каталогом: 11 697 498 001) і 1х коктейль інгібіторів протеаз (б5ідта Аїагісй,

Р8340) у співвідношенні маса:об'єм 75 мг/мл буфера. Тканини гомогенізують у гомогенізаторі

Еазі Ргер ЕР120 (Тпегто зЗсіепійіс, Косктога, штат Еллінойс) зі швидкістю 6,0 протягом 30 с при температурі 14 "С, з подальшим 15 хв інкубуванням на льоду. Це повторюють в цілому 2-3 цикли до завершення гомогенізації. Лізати центрифугують в еппендорфівській центрифузі при температурі 4 "С ії 30000 об/хв протягом 15 хв для видалення дебрису. Відбирають 400 мкл супернатанту, переносять у нову еппендорфівську пробірку, і піддають циклу заморожування/відтавання. Зразки повторно центрифугують в еппендорфівській центрифузі при температурі 4 "С і 30000 об/хв протягом 30 хв, після чого відбирають 120 мкл супернатанту для проведення аналізу. Загальну концентрацію білка визначають за допомогою набору Ріегсе

ВСА Ргоївїп Аззау Кім (Тнепто Зсієпійіс, Косктога, штат Еллінойс) із застосуванням планшет- рідера Тпеппотах"м (МоїІесціаг ЮОемісе5, Зиппумаїє, штат Каліфорнія). Рівні МІІСО визначають за допомогою розробленого на замовлення МІІСО ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз). Досліджувану речовину іммобілізують за допомогою розробленого на замовлення кролячого моноклонального антитіла, специфічного для розщепленого Моїснп1 (Мма11744), і виявляють за допомогою С-кінцевого Моїспт! БИ РО-ТАС? (Мезо 5саїе (Оізсомегу, Сайпетзриго, штат Меріленд) поліклонального овечого антитіла (КО 5уз(етв5, Міппеароїї5, штат Міннесота).

Лізати розбавляють до 2 мкг/мкл охолодженим до температури 09С ЕГІ5БА трис лізисним буфером (ЕбОТХ) (Мезо 5саїе (Оіб5сомегу, сайпегериго, штат Меріленд), що містить 1х таблетку Сотрієїе (ВНоспе Сотрієїе"м тіпі, номер за каталогом: 11 836 153 001) і 1х коктейль інгібіторів протеаз (Зідта Аїагісй, Р8е340), і 25 мкл додають на планшет для проведення ЕЇ І5А.

Енкубування 50 мкг кожного білкового лізату виконують при кімнатній температурі впродовж однієї години для іммобілізації досліджуваної речовини з ідентифікуючим антитілом. Планшети зчитують за допомогою Бесіог Ітадег 6000тм (Мезо ЗсаІе (Оізсомегу, Сайпег5риг9, штат

Меріленд). Показники М1ІСО з видаленими фоновими значеннями нормалізують за загальним вмістом білка, і виражають як відсоток (95) інгібування відносно групи, яка одержувала носій.

Відсоток інгібування МІТІСО та показник статистичної значущості (величина р), визначені за методом Даннета у пухлинах, зібраних через 4 год. після останньої дози Сполуки 1, Езомер 2, або Сполуки 2, Езомер 2, аналізують по суті так, як описано вище, й узагальнені результати аналізів наведені в Таблиці 1.

Таблиця 1 скан ШО ОДУ етенсеруююнретн | гоненнь.

Сполука (Середнєжсереднє квадратичне Р-значення р (мг/кг) обробки й ший відхилення; п-1)

ЕЗоМер2 | 10 | («8.771716 | «0001

ЕЗзомер2 | 100 | (8 7777171сс92311111111171 | «0001

ЕЗзОМеЕр2 | 30 | -: 8 (| -(:...ЙЮКрНес8яЗз 7 | «0001

ЕЗОМеЕр2 | 10 | 87777177 5аю! | 00054

ЕЗОМЕр2 | З | 8777777 Ї7717171717171717171717171лляи3 | Незначущеб (

Езомер2 | 1 | ЮБ 8 щ| (виб ////////// /Незначуще

ЕЗОМер2 | 03 | (8 777С/77171717171717171717171-74526 1 |Незначуще 2.Езомер2| 10 | (| 8 / | 777/7/7/7/7/7/0/0олл155-74 | Незначуще (

Дані Таблиці 1 свідчать про інгібування розщеплення МІІСО Сполукою 1, Езомер 2, та

Сполукою 2, Езомер 2, в легеневій тканині мишей. Дані, наведені в Таблиці 1, додатково надають співвідношення іп мімо до даних стосовно функціональної активності, описаних вище.

Індукція експресії тАФп1 у вушних сферах

Зазвичай виділення клітин кортієва органа здійснюють на 0 день, переважно за методикою

О5піта еї аЇ., Мешос5 Мої! ВіоІ., 2009; 493: 141-162. Культивування і розмноження клітин здійснюють протягом 3-4 днів. Висівання клітин і обробка експериментальними сполуками відбувається на 3 день або 4 день. Прикріплення і диференціація відбуваються протягом наступних 7 днів. На 10 день або 11 день здійснюють лізис клітин і ізоляцію РНК. ТадМап дкт-

РСЕК проводять на 12 день, і результати з експресії Ап та Трр1 аналізують на 13-15 день.

Езоляція клітин

Навколишню тканину з кам'янистої частини скроневої кістки видаляють у мишей віком 1-4 дні (трансгенна лінія: тАїоп1-стимульований пОЕР; Гитркіп ЕА еї аї., сСепе Ехрг Рацегпв5, 2003; (36): 389-95) обох статей. Раковиноподібну завитку відокремлюють від вестибулярної системи за допомогою щипців. На цьому етапі розвитку кістковий лабіринт є не повністю кальцифікованим, і легко розчленовується за допомогою щипців. Кістковий лабіринт завитки акуратно відкривають, і видаляють спіральну зв'язку і прикріплений кортієв орган, сплетені разом вздовж спіралі стрижня завитки, розкручуванням в апікальному напрямку зі стрижня завитки. Починаючи від основи, спіральну зв'язку за допомогою тонких щипців відокремлюють від кортієва органу.

Розсічений кортієв орган (ОС) переносять в окремі 1,5 мл пробірки, заповнені 850 мкл

НВЗ5, що має температуру танення льоду. В одну пробірку переносять до 12 фрагментів тканини ккортієва органа. Тканину кортієва органа піддають ультрацентрифугуванню, і видаляють НВ5З5. Клітини дисоціюють додаванням 100 мкл попередньо нагрітого Тгурі Етм

ЗеїІесі (Ше ТесПппоїодіє5), та інкубують при температурі 37 "С протягом 13 хв. Піддають ультрацентрифугуванню дисоційовані тканини кортієва органа. Видаляють Тгурі Е"м 5Бе|есі.

Зо Додають 100 мкл середовища А (ОМЕМ/Е12, добавка М2 (І їе Тесппоіодіе5), добавка В27 (І їїе

Тесппоодіе5), ампіцилін (50 мкг/мл) та фунгізон (І їе Тесппоіодієз), ЕСЕ (20 нг/мл), БЕСОЕ (10 нг/мл), ІОЕ-1 50 нг/мл) та гепарансульфат (50 нг/мл)). Після цього дисоційовану і гідролізовану тканину розтирають наконечником піпетки Р200. Видаляють будь-які агрегати та дебріс; суспензію клітин переносять, і промивають за допомогою попередньо змоченого 70 мкм клітинного фільтра для об'єднання клітинної суспензії в одній свіжій культуральній пробірці.

Пробірки, використані для дисоціації, та клітинний фільтр промивають достатньою кількістю середовища А, і змив об'єднують з клітинною суспензією. Густину клітин підраховують за допомогою гемоцитометру або Соицпієз5? (Ійе Тесппоодіез). До клітин додають свіже середовище А для досягнення остаточної висівної густини 1,0 Е5 клітин/мл, і висівають в культуральний посуд з наднизьким прикріпленням, Т-75 ((1геїпег).

Культивування в суспензії для розмноження сфер кортієва органа

Дисоційовані одиночні клітини культивують в культуральному посуді з наднизьким прикріпленням (Сгеїіпег) у середовищі А протягом 3-4 днів у зволожному 5 95 СОг-інкубаторі при температурі 372С для одержання клонально вирощених сфер, які називають сферами першого покоління, з плаваючих клітин. Якщо протягом періоду культивування клітини прилипають до чашок для культивування без прикріплення до субстрату, їх можна відокремити обережним перемішуванням.

Прикріплення культури і її обробка

Після культивування сфер протягом 3-4 днів, сфери візуально підраховують за допомогою мікроскопа для стандартизації висівної густини вушних сфер на мл на цьому етапі. Клітини збирають центрифугуванням, і ресуспендують в основному середовищі в концентрації приблизно 2000 сфер на 1 мл. Сфери висівають в об'ємі 150 мкл на лунку 96-лункового планшета для культури тканин, і одержують приблизно 300 сфер на лунку. Сфери чотири рази обробляють досліджуваними реагентами при кінцевому об'ємі 200 мкл в основному середовищі (ОМЕМ/Е12, добавка М2 (Ійе ТесппоїЇодіех), добавка В27 (Іїе Тесппоіодіє5), ампіцилін (50 мкг/мл) та фунгізон (Ге Тесппоіодієб5))о. Оброблені сфери культивують протягом 7 днів в зволожному 5595 СОг2-інкубаторі з регульованою температурою при температурі 376.

Середовище видаляють, і переходять до екстрагування РНК.

Екстрагування РНК

Додають буфер КІТ ріих (Оіадеп), доповнений 1 95 бета-меркаптоетанолу, 175 мкл на лунку. До кожної лунки перед екстрагуванням РНК додають 2,5 мкл РНК-носія (4 нг/мкл) (АМеазу? Ріиз Місго Кії, Оіадеп), розбавленого в буфері РІ Т Різ. Сукупну РНК екстрагують за допомогою набору КМеазу? Рій Місго Кії (Оіадеп) відповідно до інструкцій виробника.

Синтез КДНК

Синтез КДНК здійснюють із застосуванням системи Зирегбогірі? ПІ Рігві-5ігапа БЗупіпевів (І теТесппоіодіех, а за каталогом 18080-051) відповідно до протоколу виробника з використанням довільних гексамерів для синтезу кКДНК. кКДНК розбавляють до 50 95, додаючи 21 мкл надчистої безнуклеазної води. Для ФРСК використовують 5 мкл розбавленої кКДНК. аРсСА

Для кількісного визначення експресії маркерів волоскових клітин з культур оброблених сфер, 4РСК з зондами для виявлення гена тАїйойпт!, що становить інтерес, та ендогенного контрольного гена, здійснюють в одній двокольоровій мультиплексній реакції. Еталонну суміш

Тадмап Сепе Ехргеззіоп Мазіег Міх (Ше Тесппоїіодіє5, 4369016) та зонд, що становить інтерес

Зо (Аїоп1!; Міт00476035 51 та ендогенний контрольний зонд (ТбБр!і; Мто0446971 ти;

І їеТесппоіодієх), використовують відповідно до інструкцій виробника. Умови для кожного зонду підтримують на постійному рівні. Відносну експресію генів між експериментальними групами аналізують за допомогою методу ДАСт, і результати повторних визначень усереднюють.

Експерименти проводять з потрійним повторенням як мінімум, і результати представляють у вигляді загального середнього.

Таблиця 2

Дані Таблиці 2 показують відносні кількісні значення (КО) експресії Ап, маркера генерації волоскових клітин, у вушних сферах, оброблених Сполукою 1, Езомер 2 та Сполукою 2, Езомер 2, в трьох концентраціях (10 нМ, 100 нМ та 1 мкМ). Дані (ї- середня квадратична помилка середнього, 5ЕМ) відображають кратне індукування експресії генів відносно зразків, оброблених негативним контролем (носій ОМ5О). (" значуща різниця у зіставленні з негативним контролем, р-0,05).

Індукція експресії ПАЛЮНПІ в лініях пухлинних клітин людини

Для оцінки потенційної здатності Сполуки 1, Езомер 2 та Сполуки 2, Езомер 2, до індукування експресії пАбоОп!, використовують лінію пухлинних клітин людини. Регулювання ендогенного передавання сигналів шляхом Моїспй ов цій клітинній лінії є аналогічним регулюванню у внутрішньому вусі. Зазвичай це дослідження проводять за принципами, викладеними в Калапіап еї аї., Ссавзігоепіегоїоду, 2010, 139 (3): 918-928 та Додаткових матеріалах та методах.

Зазвичай застосовують стандартні методики культивування клітин. Лінію І 51747 (АТСС (Американська колекція типових культур) СІ --188) клітин аденокарциноми ободової та прямої кишки людини з низьким числом пасажів, які підтримуються в ростовому середовищі (МЕМ 10 Фо

ЕВ5), висівають з розрахунку 10000 клітин в 100 мкл аналітичного середовища (МЕМ 1 95 ЕВ5) на лунку на 96-лункові планшети для культури тканин.

Наступного дня здійснюють напівлогарифмічне послідовне розведення 10 мМ концентрованого розчину експериментальних сполук (розведених в 100 96 МБО) з одержанням одинадцяти зменшених доз лікарської сполуки. Остаточні концентрації знаходяться в межах від 10 мкМ до 0,127 нМ. Використовують 3,16-кратне послідовне розведення зі 100 95 концентрацією ОМ5О в кожній лунці. Подальше розведення (1:10) розчину, одержаного початковим розведенням у ОМ5О, здійснюють в аналітичному середовищі. Ще одне розведення (1:100) знову здійснюють в аналітичному середовищі.

До кожної лунки, що містить клітини і середовище для вирощування, додають 100 мкл з одержаних розведенням розчинів досліджуваної сполуки, і клітини вирощують протягом 72 год. при температурі 37 "С в 5 95 СО».

Клітини збирають з планшетів на 4 день, і РНК екстрагують, та очищають за допомогою

АМеазу? Ріиз 96 АМА (Оіадеп), дотримуючись протоколу виробника.

Синтез кКДНК здійснюють із застосуванням системи Зирегосгірі? ПІ Ріг5і-5ігапа Бупінезів (І теТесппоіодіех, а за каталогом 18080-051) відповідно до протоколу виробника з використанням довільних гексамерів для синтезу кКДНК. кКДНК розбавляють до 50 95 додаванням 21 мкл надчистої безнуклеазної води. Для ФЗРСЕ використовують 5 мкл розбавленої кКДНК. аРсСА

Для кількісного визначення експресії маркерів волоскових клітин з культур оброблених сфер, З2РСК з зондами для виявлення експресії ПА! або ТВР здійснюють в одній двокольоровій мультиплексній реакції. Для визначення відносної експресії гену для кожного зразка, еталонну суміш ТадМап Сепе Ехргеззіоп Махіег Міх (Се Тесппоїіодіє5, 4369016) та зонд, що становить інтерес (людський Айоп1; І йе Тесппоіодіеє Абзау І Н5зО0944192 51) плюс ендогенний контроль (людський ТВР; Їйе Тесппоіодіезє Аб5зау 4 Н5зО0427620 т!) використовують відповідно до інструкцій виробника. Умови для кожного зонду підтримують на постійному рівні. Відносну експресію генів між експериментальними групами аналізують за допомогою методу ДАст, і результати повторних визначень усереднюють.

Для визначення значень ІСво для кожної досліджуваної сполуки проводять чотири окремі аналізи. Значення ІСво визначають підгонкою даних залежності "реакція-концентрація" до моделі "Іод(антагоніст) у залежності від реакції (три параметри)", використовуючи програму

СтарнРаа Ргізт? для 12 доз в діапазоні концентрацій від 4.0Е-11 М до 1.0Е-6 М з аналізом 108 загальних точок для кожної сполуки. Значення ІСво для Сполуки 1, Езомер 2 та Сполуки 2,

Езомер 2 показані в таблиці 3.

Таблиця З

Дані Таблиці З показують значення ІСво Сполуки 1, Езомер 2 та Сполуки 2, Езомер 2, як обчислені за відносною експресією ПАїТОй1, маркеру генерації слухових волоскових клітин в цьому дослідженні.

Дослідження реакції на сполуки в експлантаті кортієва органа

Взагалі, культивування органотипового експлантату кортієва органа проводять у 0 день згідно з методом, описаним в РаїгкКег еї аї., доигпаї ої Мізцаїїгей Ехрегітепів, 2010, (36), е1685.

Культивування експлантату здійснюють протягом 4-7 днів, після чого культура готова або до клітинного лізису для ЗКЕТ-РСКЕ, або для фіксації тканин для імуногістохімії.

Езоляція і культивування експлантату кортієва органа

Булу і навколишню тканину з кам'янистої частини скроневої кістки видаляють у мишей віком 1-4 дні (трансгенна лінія: А(п1-стимульований поОЕР; І итрКіп ЕА еї аї., Сепе Ехрг Райцегпв5, 2003; (36): 389-95) обох статей. Кортієви органи розрізають в розчині Хенкса, спіральну зв'язку видаляють, а експлантати поміщають на покривні стекла, покриті полі-І -орнітином (0,01 95,

Зідта) та ламініном (50 мг/мл, Весіоп ОісКіпбоп) для одержання препарату з пласкою кохлеарною поверхнею. Потім кожний завитковий експлантат поміщають в одну лунку 24- лункового планшету (РаїЇсоп), і культивують у ОМЕМ (Іпмігодеп) з 5 95 ембріональної бичачої сироватки, 5595 конячої сироватки і пеніциліном-стрептоміцином (Ге Тесппоїіодіе5).

Досліджувані сполуки додають із середовищем на 0 день, і замінюють кожні 2-3 дні. Всі культури підтримують у зволожному 5 95 СОг2-інкубаторі при температурі 37 "С.

Дослідження експресії генів за допомогою ОПЗКТ-РСВА

Екстрагування РНК здійснюють лізингом експлантатної тканини 350 мкл буфера КІТ Рій

(Оіадеп) на лунку, а сукупну РНК очищають за допомогою набору ЕМеазу" Різ Міпі Кії (Оіадеп).

Синтез кКДНК здійснюють із застосуванням системи Зирегбсгпірі? ПІ Рігзі-Зі(апа бупінезів (їеТесппоїІодіеєї) з використанням довільних гексамерів. Для кількісного визначення індукції експресії маркеру волоскових клітин проводять ЗФЗРСК з еталонною сумішшю ТадМап Сепе

Ехргеззіоп Мазієг Міх (Ше Тесппоіодіе5, 4369016) і зондами для виявлення генів, що становлять інтерес (наприклад, ПАїп!1; Аззау ІЮ МтоО0476035 51, РошаїЗ; Авззау І

Мто4213795 51 та Муо7а; Аззау ІЮ Мто1274015 т1, І йе ТесппоІодіе5) та контрольним ендогенним геном, Трбр (Аззау ІЮ Міт00446971 ті, І їе Тесппоіодіеє5). Відносну експресію генів між досліджуваними групами досліджують за допомогою методу ЛАст, і результати повторних визначень усереднюють. Експерименти проводять з потрійним повтором як мінімум, і результати представляють у вигляді загального середнього.

Таблиця 4

Дані Таблиці 4 показують відносні кількісні значення (КО) експресії маркерів генерації волоскових клітин, АбОйп!, Роц4ї3 та Муо7а, в експлантатах кортієвого органу, оброблених

Сполукою 1, Езомер 2 та Сполукою 2, Езомер 2, в концентрації 1 мкМ. Дані (- ЗЕМ) відображають кратне індукування експресії генів відносно зразків, оброблених негативним контролем.

Емунологічний метод забарвлення нових волоскових клітин, що експресують Ап

Після експлантатного культивування тканини фіксують в 24-лунковому планшеті за допомогою 200 мкл Суїоїйх/Суїорегт (ВО) протягом 30 хв, промивають РВ5, що містить

ТтйопХ100 (РВЗТ), і забарвлюють 200 мкл розчину першого антитіла, що складається з 4 95 нормальної ослячої сироватки в РВ5Т з козячим анти-сЕР (1:2500; АБСАМ, ар5450) антитілом і кролячим антитілом проти міозину МПа (1:1000; Ргоївиз Віозсіепсе, а за каталогом: 25-6790), протягом 1 год. Потім тканини ретельно промивають РВЗТ, і забарвлюють розчином другого антитіла, що складається з ослячого анти-козячого Ідс АїЇеха Рішог 488 (1:1000, Іпмігодеп, А- 11055) та ослячого анти-кролячого до Аїеха РіІпог 568 (1:1000; Іпмігодеп, А10042), протягом 1 год. Потім їх ретельно промивають РВ5Т, і розміщують на предметних стеклах для мікроскопа.

Ендивідуальні волоскові клітини ідентифікують за допомогою експресії сурогатного маркера

Зо Аїоп1 СЕР (зеленого кольору) та міозину МПа (червоного кольору), візуалізують, а потім підраховують в межах 100 мкм довжини на середньо-верхній ділянці для перевірки утворення виникаючих волоскових клітин в досліджуваних зразках, оброблених сполуками, на відміну від кількості волоскових клітин в необроблених або негативних контрольних (оброблених біологічно неактивними сполуками) зразках. В п'яти окремих експериментах кількість клітин підраховують сліпим методом.

Таблиця 5

Дані, наведені в Таблиці 5, показують кількість зовнішніх волоскових клітин в експлантатах кортієва органу, культивованих протягом чотирьох днів у присутності Сполуки 1, Езомер 2 (п-13), або Сполуки 2, Езомер 2 (п-15) при 1 мкМ та забарвлених імунологічним методом на

СЕР (сурогатний маркер Ай!) та міозин Міа. Відсоток збільшення волоскових клітин наведено відносно зразків, оброблених негативним контролем (п-18).

Дослідження експресії генів після ототоксичного ПошКодДження

Зміну органотипової експлантатної культури кортієва органа використовують для моделювання регенерації волоскових клітин у відповідь на подальшу обробку сполуками після ототоксичного пошкодження. Цю модель пошкодження відтворюють за методом, описаним в

Коїтараїї еї аі., Р О5Опе, 2013, 8(8), е73276, де повідомлялось про 95 95 зменшення кількості середньо-верхніх волоскових клітин. На 0 день, для пошкодження та вибіркового вмертвлення волоскових клітини в експлантаті кортієва органа, протягом 18-24 год. здійснюють обробку аміноглікозидом (гентаміцин (100 мкМм)). На 1 день гентаміцин видаляють, і починають обробку

Сполукою 1, Езомер 2, та Сполукою 2, Езомер 2, в концентрації 5 мкМ. Культивування експлантату триває загалом протягом 4 днів, після чого культуру готують для проведення ЯКТ-

РСК за протоколом, описаним вище. Візуальне підтвердження пошкоджень, спричинених гентаміцином, легко спостерігається серед культур, оброблених негативними контрольними сполуками. Проте кількісне визначення реакції на обробку Сполукою 1, Езомер 2 та Сполукою 2,

Езомер 2 після ототоксичного пошкодження, одержане за допомогою ЯДКТ-РСК, показало збільшення експресії генів маркерів передсенсорних волоскових клітин Ап! та Роц4їЗ і маркеру волоскових клітин Муо7А.

Таблиця 6

ПИ Пій ЗК с іс сполуками (Середнє х ЗЕМ; значення р) п-11

Дані Таблиці 6 показують відносне збільшення експресії генів за результатами визначення за допомогою ЯКТ-РСК маркерів генерації волоскових клітин Аїойп1, Роцй4ї3 та Муо7а в експлантатах кортієвих органів, оброблених Сполукою 1, Езомер 2, та Сполукою 2, Езомер 2, в концентрації 5мкМ після пошкодження гентаміцином (100 мкМ). Дані відображають відсоткове збільшення експресії генів у порівнянні зі зразками, обробленими негативними контрольними сполуками, з індукованим гентаміцином пошкодженням волоскових клітин. (", значуща відмінність від негативного контролю, р-0,05)

Індукція маркеру волоскових клітин в культурі суцільної слухової капсули

Слухову капсулу (експлантат слухової капсули), що складається з кохлеарної частини кісткового лабіринту та вестибулярної системи, видаляють у мишей віком 1-4 дні (трансгенна лінія: тАФоп1-стимульований псЕР; І итркКіп ЕА, єї аї!., Сепе Ехрг Райегпв5, 2003; 3(4): 389-95) обох статей, загалом відповідно до методу, описаного в РаїгКег еї аї., доигпа! ої Мізчаїїлей

Ехрегітепів5, 2010, (36), е1685. Всю слухову капсулу відокремлюють від тім'яної кістки, і підтримують ех-мімо у ролерній культуральній системі до З днів у середовищі, що містить ОМЕМ з високим вмістом глюкози, 5 95 ЕВ5, 5 95 конячої сироватки, 1 мкг/мл ампіциліну.

Експлантат слухової капсули використовують для оцінки досліджуваної сполуки в різних носіях для доставки та її проникнення у внутрішнє вухо. Випробування проводять з композиціями Сполуки 1, Езомер 2 (7,2 мМ), у різних носіях для доставки. Невеликі об'єми (100- 200 нл) вводять безпосередньо в нішу круглого вікна завитки. Завитку розсікають, обробляють,

Зо інкубують протягом 1-2 год., потім вводять у ролерну культуру. Через 48 год. експлантат слухової капсули відкривають для видалення кортієва органа з кісткового лабіринту завитки, і досліджують із застосуванням КТ-РСВ.

Композицію залишають на 1-2 год., після чого її вимивають культуральним середовищем.

Після цього експлантат слухової капсули культивують протягом 48 год. у необробленому середовищі. Завитку розривають, весь кортієв орган розсікають, і готують до кількісної КТ-РСВ для визначення рівнів експресії маркеру волоскових клітин Ай! (як описано в наведеному вище дослідженні експлантату кортієва органа). Таблиця 7 показує індукцію Ай у вказаному носії для доставки. Активацію Ай! Сполукою 1, Езомер 2, в усіх випробуваних композиціях (2-

З-кратна, п-12-17) визначають у порівнянні з обробленими контрольною сполукою експлантатами слухової капсули лише з носієм після культивування протягом 48 год.

Таблиця 7

Експресія гену Ай (КЕТ-РСВ) 45-70 з6 РЕС 10 95 20 95 полоксамеру!| . АЙ (поліетиленглі- полоксамеру ; є гіалуронової коль 400) РіІшгопіс? Е108 (Рішгопіс" Е108) кислоти - Прозорий розчині Суспензія Суспензія Суспензія ментальної сполуки індукції

Таблиця 7

Експресія гену Ай (КЕТ-РСВ) 45-70 6 РЕ 10 бе 20 95 полоксамеру| . око (поліетиленглі- полоксамеру (Рігопісе Е1О8) гіалуронової коль 400) Рішгопіс? Е10О8 кислоти

Поглинання досліджуваної сполуки перілімфою внутрішнього вуха іп мімо

Самиць-альбіносів морських свинок лінії Нагіеу (Спагпеб5 Кімег, Франція) анестезують сумішшю кетамін/ксилазин перед введенням 70 мкл Сполуки 1, Езомер 2, у композиціях, описаних вище для дослідження культури суцільної слухової капсули, шляхом транстимпанічної ін'єкції до повного заповнення середнього вуха. Зразки перілімфи (рідина внутрішнього вуха) відбирають через 0,5 год., 1 год., б год., 24 год. та 48 год. після ін'єкції, Її досліджують із застосуванням І СМ5 (п-5) для визначення концентрації експериментальної сполуки. У Таблиці 8 показано поглинання досліджуваної сполуки рідиною внутрішнього вуха після транстимпанічного введення до середнього вуха з вказаними носіями для доставки.

Таблиця 8

Рівні у перілімфі іп мімо 70 96 РЕСЯ 10 95 20 9о 1 95 (поліетиленгліколь полоксамеру полоксамеру |/ гіалуронової 400 РіІигопісФ Е108 РіигопісФ Е108 кислоти до введеної досліджува-

АЦШС (площина під

Амінокислотні послідовності

ЗЕО ІЮ МО 1 (Мишачий білок-попередник Моїсі 1; непроцесований)

МРАГІ ТРІТ СІ ТІЇ РА ААВаї ВСБОРБатсІ МайАСЕМАМаТЕАСУС5ЗИаАєМаОВсСОО5МРОЇ

ЗзТРОКМАСТОоНУУЮНОСИТУОМАСЗСРІ СЕБОРІ СІ ТРІ ОМАСІ АМРОВМИааТтТСоОг І ТІ ТЕУКСВОСР

РОМУБаКЗСООАОРСАЗМРСАМИасСОСІ РЕЕЗ5МІСВСРРАЕНИРТСВООУМЕСЗОМРСІ СВНОСТ

СНМЕІСЗУВСАСВАТНТОаРНСЕЇ РУМРСЗРОРСОМОаТСАРТИаОЮТТНЕСАСІ РОБЕАСОМСЕЕММО реСРОММСКМасаАсУрауУМ и"МсАСРРЕУТаОМУСТЕОМОЕСОЇ МРМАСОМОЯТоНнМТНОСУМСМ

СУМОМ ТЕЕОСЗЕМІВООСАБААСЕРОСАТОСНОВМАЗЕУСЕСРНОВТИп СНІ МОАСІЗМРОМЕСаЗМО

ОТМРУМОаКАІСТОРБЗахуТаРАСБЗООЮМОЕСАЇ САМРСЕНАСКСІ МТ аЗЕЕСОСІ ОСУТаРВСЕЇІЮМ

МЕСІЗМРСОМОАТСІ ВОІСЕРОСІСМРаМЕСУМСЕІМТ ОЕСАЗЗРОЇ НМАНСМОКІМЕРОСОСРКаИаЕ

Ман сСОоМОМрЕСАЗТРОКМОаАКСІ ВСРМТ УТ СУСТЕСМТатНсЕМОІСЕСОРОРСОНУИ,ЗСКРраИамА

ТЕТСГСОРОМТаННСЕТМІМЕСНБОРСННОИОаТСООВОМ5МІ СІ СІ КЕИТТаРМСЕІМСООСАЗМРОЮ

Затс ОЯКкКІРАУЕСАСЕРИУТаЗМОСМУМІОПЕСАаЗРОНМИаСТСЕРС,СІАСЕТСАСРЕСУНОРТСІ ЗЕМ

МЕСМЗМУРСІНСАСВрагмаикорСАРОМУЗатМСрІМММЕСЕЗМРСУМОС ТСКОМТЗахМстовВЕ

СЕБаРМСОТМІМЕСАЗМРОЇ МОСТСІВОМАСУКСМСРІ РУТЕАТСЕММІ АРСАТЗРСОКМЗОаМСКЕЗЕ

ОМЕЗБЕЗБСУСРТОМОСОТСЕМОІМЕСУКЗРСОАНОИаАЗСОМТМаУВСІ СОДаУТавмМСЕЗОПІВОСАР

МРОоНМааесСтраімМмтТАРЕСОСІ РИаРОСАРЄСЕЕРІМЕСАЗМРСОМаАМСТОСУО5УТСТСРУСЕМаїН

Зо СЕММТРОСТЕЗЗСЕМО, ТСУраИатмЗЕТсІ СРРаЕєТаЗУСОМОУМЕСОЗАРСОЇ НОСТСОЮБМОа УК

СТСРОСУТаї МСОМІ МАМ СОБАРСКМАДС ВСУМОТМТОМНСЕСНЗОМТОаММСОМІ БМБСЕМААЛДОК ватрут сонаасІ смМрЕСОКНУСНСОАДаУТазУСЕВЕМОЕСЗРМРСОМОаАТСТОМІ ССЕЗСКОСМУ

АС,УНаЗзмМО5ЕБІМЕСІ БОРСОМИааТтТСсСІОЇ ТМЗУКОСЗСРАИТОСУНСЕІММООСНРРІОРАЗАЗРКО

ЕмчМатсУроУааМуТСТСРРОЕЄЕМаЕВАВСЕСОУМЕСІ БМРСОРДИТОМСМОВУМОЕНСЕСНАСНТО В

ВСЕЗМІМЕСВакКРОКМаСУСАМАЗМТАВСОРІСАВСРАСЕРЕСАТСЕМОАВТСаИбБІ ВСІ МИ ТСІЗаРА

ЗРТСІ С а5ЕТЯАРЕСОЕРАБЗБЗРСОУаЗМРОУМОСТСЕРТЗЕМРЕМАСІ СРАКЕМСТІ СНІ ЮУЗЕТОаС

АаВОрІРРРОІЕЕАСЕ РЕСОМОА,МКУСМ ОСММНАСОаМУ пса рсБІ МЕМОРМУКМСТО5І ОСУМУКМЕ зрансрвосмМзАасСіграгрсСОІ ТЕСОСМРІ УВОМСКОНЕЗОВСИНОСрОССМЗАЕСЕМ ОСІ ОСАЕН

МРЕВ ААДСТІ МЕ ММ РРООЇ АММЗЕНЕЇ ВЕ ЗНМІ НТМУМЕКАРАОСООМІЕРУМОаНЕЕЕЇ ВКНРІК

ВЗ5ТМОМАТОЗИ РОТЗСаВОВАеЕГОРМОІВавІММІ ЕІОМАОСУО5ЗБЗОСЕГОБАТОМААНРІ СА АБІ а5І МІРУКІЕАУКЗЕРМЕРРІ РБОЇ НІ МУМААДААРМИЇ гЕЕМЕАСОМІ І ЗАКААВОНИОЇ М/ЕРЕСЕКМУЗЕ

АЗКККАРЕРІ ЕОМ КРІ КМАЗОСАІ МООМОМЕУМС,ОЕОЇ ЕТККЕАВРЕЕРУМІ РОЇ БРОТОННО

МТООНІ РААОЇ АМЗБАМАРТРРОСЕМОАОСМОУМУВОаРОСЕТРІ МІАБСОЗИаССИОЇ ЕТаМЗЕЕЕЕВАР

АМІБОРІМОСАБІ НМОТОВТОЕТАЇ НІ ААВУЗАЗОААКАВІ ЇЇ ЕАЗАВАМІОЮММОИа ВТРІ НААУЗАВАО

СМЕОІ АМААТОЇ ВАВМНОСИТТРІ ПП ААВІ АМЕСМІ ЕОГІМЗНАОУМАМООЇ СКБЗАЇ НУУХАААММММО

ААУМІЇ КМСАМКОМОММКЕЕТРІ Р ААВЕСЗУЕТАКМІ І ОНЕАМАВІТОНМОВІ РАБІАОЕВМННОЇ

МАГП'ОЕУМІ МАЗРОГ НОаТАЇ СОаТРТІ 5РТІ СЗРМОаМІ СМІ КЗАТОСККАВКРОЗТКИЇ АСОаЗКЕАКОЇ.

КАНАККЗОрИаКаТси О555МІ 5РМОБІ ЕБРНОИамМІ БОМАЗРРІ І РОРЕООБРОМРІ ЗНІ РЕМРОТНІ.

СІЗНІ ММААКРЕМААЇ АСОЕБВІ АГЕРРРРВАВІ НІ РИАЗЗАЗТМІ БТМА ТИАММЕТУСАРАБІ МСОСЕ

М РАГОМамМУРБОММРІАРИМТРИИтІ БТОДАаг ОонамМмМаРІ НЗБІ ТМ ЗРИМОСІ РМТАГАТОР

НІМОТООМОРОМІ ОЇ ОРОМІ ОРРБОРНІ 5М55ААМОИНІ САРІ ЗИЕРБОАОМОРІ СРББІ РУНТІЇ.

РОЕБОАГРТБІ РОБМУРРМТТТОРСТРРІЬОНЗУЗЗЗРМОМТРЗНОГОМРЕНРЕСТРУЬРЕБРООМІ 55

ЗЗРНОМІЗОМ ЗЕСІЗОРРТТМРБЗОЇІТНІРЕАЕК

ЗЕО ІЮ МО:2 (сигнальний пептид)

МРАГІ ТРІТ СІ ТІ РА ААВаї В

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

   1. Сполука, що має структуру: Ме шах у Ще ЕзС щи в н ) і Сх, 2 Н а х Б

   4.4,4-трифтор-М-(25)-1 -((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагідро-1 Н-бензо|Чпіроло|1,2- а|азепін-б-іл)ламіно)-1-оксопропан-2-іл)бутанамід, її по суті діастереомерно чистий ізомер або її фармацевтично прийнятна сіль.

   2. Сполука, що має структуру: М шу

   ЕзС.. в ме Н ї СА ми : Н 05 о М-(25)-1-(8,8-диметил-б-оксо-6,8,9,1 О-тетрагідро-5Н-піридо/3,2-Ппіроло(! 2-а|азепін-5-іл)аміно)- 1-оксопропан-2-іл)-4,4,4-трифторбутанамід, її по суті діастереомерно чистий ізомер або її фармацевтично прийнятна сіль.

   3. Фармацевтична композиція, що містить сполуку за п. 1 або п. 2 або її по суті чистий діастереомер, або її фармацевтично прийнятну сіль, і фармацевтично прийнятний носій.

   4. Застосування сполуки за п. 1 або п. 2 або її по суті чистого діастереомеру, або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для лікування Т- клітинного гострого лімфобластного лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу, хронічного лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, хронічного мієлогенного лейкозу, еритролейкозу, тричі негативного раку молочної залози, раку молочної залози, раку яєчника, меланоми, раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, раку підшлункової залози, гліобластоми, раку ободової та прямої кишок, раку голови та шиї, раку шийки матки, раку передміхурової залози, раку печінки, плоскоклітинного раку порожнини рота, раку шкіри, медулобластоми, ангіосаркоми, рабдоміосаркоми, ліпосаркоми, злоякісної фіброзної гістіоцитоми, гепатоцелюлярного раку, холангіокарциноми внутрішньопечінкових (та позапечінкових жовчних протоків або аденоїдної кістозної карциноми.

   5. Застосування сполуки за п. 1 або п. 2 або її по суті чистого діастереомеру, або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для лікування раку легенів.

   б. Застосування сполуки за п. 1 або п. 2 або її по суті чистого діастереомеру, або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для лікування нейросенсорної втрати слуху, спричиненої втратою слухових волоскових клітин.

   7. Застосування сполуки за п. 1 або п. 2 або її по суті чистого діастереомеру, або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для індукування утворення слухових волоскових клітин.