WO1983003258A1 - Nouvelle levure limitant l'action bacterienne, son procede de production et ses applications - Google Patents

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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention relates to a novel killer yeast, a method for constructing the same, and use of the killer yeast for sake brewing. More specifically, the present invention relates to the construction of a superior yeast having a killer factor in which a killer factor has been introduced into a superior yeast having a homothalism ⁇ , and the production of a vinegar using the yeast.
  • the killer factor be introduced into a superior yeast to produce sake and budo liquor using the superior killer yeast (Japanese Patent Publication No. 57-23007).
  • the construction method is based on (1) the backcrossing method or (2) the cytoplasmic introduction method using heterothalamic yeast.
  • (1) the operation is complicated and breeding is performed. And that it is difficult to completely restore the genetic traits governed by the nuclear gene of a good parent strain. There is a problem that it can only be applied to somatic yeast.
  • the present invention provides a method that solves the above problems. [Disclosure of the Invention]
  • the killer yeast of the present invention it is an essential requirement that the excellent yeast use a yeast of complete homothalism (Reference (1)), while the killer yeast must be a fusion-deficient mutation.
  • the complete homothalamic strain is one in which killer factor cannot be introduced by ordinary crossing.
  • the present inventors have confirmed that the spores of the complete homothalamic yeast have the mating type of ⁇ or “ The spores usually undergo a mating-type conversion after two cell divisions.], And each of them conjugate.])
  • a fusion-deficient mutant strain should be used as the killer yeast. It is now possible to construct a diploid or better yeast having only a yeast and a killer factor, even if it is a diploid or more yeast. For example, A! TCC32 on the other hand, as a killer yeast, a fusion-deficient mutant, such as ⁇ CZ / Solar 24 (Reference (2)), is also applicable. In addition, the addition of killer or yeast insensitivity or sensitivity to antibiotics as a marker is a good choice for the desired yeast.
  • the present inventors as shown in Example 1, showed that even in the final stage of fermentation, the proportion of viable bacteria was high, and the sedimentation was weak, and the homozygote maintaining sufficient buoyancy was observed.
  • the killer yeast Sacharomyces cerevisiae Selepiche 301 that has been constructed is used for brewing Budo liquor. It was possible to control undesired yeast contamination and to produce high quality vinegar. Furthermore, the excellent killer yeast is used to increase the killing rate of various germs, and to increase the amount of precipitates such as actin, protein, tannin, and pigment derived from the vines. By avoiding the use of sedimented yeast mixed with water and collecting and using only a clean and sufficient amount of suspended yeast with a lot of viable bacteria in the supernatant ⁇ Increase of viable bacteria in the recovered yeast and convenience The figure shows that the number of excellent killer yeasts increased, and that it was possible to prevent the growth of harmful yeasts.
  • the yeast was recovered intermittently, and the brewer could easily adjust the brewer's sake. With no effect on the quality of the dough, the yeast was recovered industrially, brewed again and again three times, and succeeded for the first time in producing good and poor vinegar. It has already been known to produce killer wine by introducing a killer factor into the wine yeast.
  • a sporulation medium calcium acetate 0.5%, agar 2
  • One-five cells were placed on a small agar medium and placed under a microscope using a thin glass rod so that both cells were in contact.
  • O PI Yeast SA — 301 was obtained. This strain has been deposited at the Institute of Microbial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Table 1 shows the strains produced by this crossing and the sex of the used strains. Furthermore, as a result of examining the presence or absence of a cytoplasmic RNA of SAT-301 and a plasmid that expresses killer protein, MdsRNA and LdsRNA with the same molecular weight as SY-5 were examined. There was mosquito. In addition, the kill specification of SAT-301 was exactly the same as S5. Table 2 shows this. Further, the mycological properties of 301 (Reference (4)) were all the same as those of 01. Table 3 shows the fermentability of sugar.
  • Saccharomyces ces oviformi s Saccharomyces ces oviformi s (Saccharomyces ces ov iformi s)
  • Saccharomyces fermentatii Sac cha-romyces ferment at ⁇ ) ⁇ Tri-preserved bacteria Hosaccharomyces ferment at Sacchar'omy ceslct is preserved Strain
  • Saccharomyces wi II ianus IF 0-24,8 Sccro omyces ceres e ev istev r. ell is oideus IF 0-2 5 1
  • Method A Looking at the number of viable bacteria in the mash after 7 days of cultivation, in Method A, all were killer yeast, and in Method 2, 298% were contaminated yeast 5-1. The distinction between killer yeast and contaminated yeast was made based on the presence or absence of erythromycin (100 ⁇ - ⁇ ) resistance of the colonies produced on the nutrient agar medium [killer yeast was resistant. Yeast is not resistant).
  • Tables 4 and 5 show the results of comparison of the amount of free and bound forms of sulfite, and the results of sensory tests, respectively.
  • the free method has a larger amount of free hypochlorous acid than the method, and it can be expected to be effective in preventing oxidation and preventing microbial contamination.
  • Example a Effect of suppression of re-fermentation by use of killer yeast Glucose was added to fresh Delaware seed juice (sugar content 18.0 ° h, acidity 0.89%), adjusted to 19.9% sugar content, and centrifuged. Clarify, and then sterilize with a membrane filter (manufactured by Millipore Co.), and put in 5 liters into fermentation bottles sterilized by dry heat.
  • a membrane filter manufactured by Millipore Co.
  • Turbidity was measured at 660%.
  • ⁇ the vinegar using the yeast according to the invention increased the growth of the vinegar fermented with vinegar yeast having no chirality, and The effect of preventing fermentation was found.
  • Example 4 Effect of using killer yeast on continuous brewing After crushing Koshu Budo 2 and removing the stem, it is immediately squeezed to obtain juice. Add 100% of metabisulfite calcium to this
  • SAV - 3 0 1 is 4 X 1 0 6 or Zra, pollution yeast 7 5 -? 1 4 X 1 0 5 pieces? ⁇ , 5 method, 4 ⁇ 10 6 vinegar yeasts? ⁇ , Contaminated yeast _P — 1 is 4 X 10 5
  • goro juice which is a raw material when using yeast with a uniform character, is used for sake brewing, which is usually used without sterilization. It became possible to use.
  • Example 5 Continuous Koshu grape 150 with killer yeast using non-sterilized juice Juice 150 grape was crushed, de-stemmed, and immediately drained. To this was added 100 ppm of sulfurous acid, sugar was supplemented to a sugar content of 22%, and then centrifuged.
  • the recovered yeast is added to the juice prepared in the same manner and fermented at 4 ⁇ 10 6 cells / cm 2. After repeating this operation five times, some of the yeast recovered were Saccharomyces vesba (MS), a typical contaminating yeast, which was not detected.
  • MS Saccharomyces vesba

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Description

明 細 害
新規なキラー酵母、 その造成方法およびその利用 〔 技術分野 〕
本発明は、 新規なキラー酵母、 その造成方法およびそ のブ ドウ酒薩造への利用に関する。 詳しくは、 ホモタ リ ズム侏である優良酵母に、 キラー因子を導入した、 キ ラ 一因子を持つ優良酵母の造成と該酵母を用いたブ ドウ酒 禳造に関する。
〔 背景技術 〕
酒類醸造においては、 原料や容器、 空気からと様々な 雑菌による汚染の恐れがある。 特に野性酵母に対しては、 優良株との環境による差別化は難しく、 優良株を種菌、 酒母と して使用しても野性酵母のコ ン タ ミ ネ一シ ヨ ンの 可能性がぁ 、 品質管理上大きな問題である。 例えば、 ブドウ酒醸造においては、 仕込時にブドウ果等に由来す る有害な野性酵母やその他の微生物の繁殖を抑える目的 で、 亜硫酸がブドウ杲もろみに 5 0 m いし 1 0 0 p 添加され、 この亜硫酸の作用で野性の微生'物が抑え られている間に優良酵母を増殖させることが行なわれて いる。 しかし、 この亜锍酸による微生物の抑制は完全な ものでな く ノ、 ンゼヌ ラ ( Han s ひ ) ゃピ ヒア （ Pichi ) の様ないわゆる産膜酵母に対しては効果があるが亜硫酸 に強い一咅 のサッカ 口 マ イ セ ス Sa c c ar omy c e s )属は そのまま発酵醪中でも生存し貯蔵原料酒及び製品ブドウ 酒に移行する。 その中で特に亜硫酸耐性があ 又アル コ —ル酑性も強い仮性産膜薛母のサッカ πマイセ ス ' バイ ャヌ ス Scb c c ka T o y c e s b y anu s ) の― [5の ¾カ もろみ又はブ ドウ酒中で増殖すると異味、 異臭をつけ、 品質を劣化させた i?、 製品の再発酵をおこ し破瓶の原因 となる。 一方ブ ドウ酒 造において発酵もろみからの回 収酵母を次の発酵に使用しょう とした場合、 通常のブド ゥ酒酵母を用いると発酵後期には亜硫酸耐性とアル コ 一 ル耐性の強い上記の好ま しからざるサッ カ ロマイセス属 の酵母が、 添加した優良酵母にま じってお]?、 この酵母 はアル コ 一ル耐性が強いため く かえし回収酵母を使用 していると回収酵母中の汚染酵母の割合が高くなつてく る。 .そのためそのまま この回収薛母を酒母と して用いる ことは微生物管理上、 問題であった。
これに対して、 優良酵母にキラ一因子を導入して、 キ ラー優良酵母による清酒、 ブ ドウ酒の製造が提案されて いる.（特公昭 5 7— 2 3 0 7 )。 しかしながらその造成 の方法は、 （1)戻し交配法または (2)ヘテロタ リ ズム酵母を 用いた細胞質導入法に基づくもので、. それらの欠点と し て、 （1)においては操作が繁雑で育種に日数がかかること、 優良親株のもつ核遣伝子に支配される遺伝的形質を完全 に回復させることが困難なことがあげられ、 また（2)にお いては通常工業適性がない一倍体酵母にしか応用できな いという問題がある。
本発明は、 上記問題を解決した方法を提供するもので ある。 〔 発明の開示 〕
本発明におけるキラー酵母を造成するには、 優良酵母 は完全ホモタ リ ズム （文献（1) )の酵母を用い、 一方キ ラ一酵母は核融合欠損変異であることを必須の要件とす る。 完全ホモ タ リ ズム株は、 通常の交配ではキ ラ 一因子 の導入は出来ないカ、 本発明者らは、 完全ホモタ リ ズム 酵母の胞子が α又は "の接合型を有すること、 およびこ れら胞子が通常 2回の細胞分裂後接合型の変換が起こ ]?、 それぞれが接合することによ ]) 2倍体となることに注目 し実験を進めた結果、 本発明を完成した。 すなわち優良 ホモタ リ ズム酵母の胞子が 2回分裂する前にキ ラ 一酵母 と交配させ、 さらに.キ ラ ー酵母と して核融合欠損変異株 を用いるこ と によ i?、 優良酵母の核ゲノ ムだけを持ち、 かつキラ一フ ァ ク タ一をもつ 2倍体以上の優良酵母の造 成が可能となった。 使用する優良酵母は、 たとえ 2倍体 以上の酵母でもホモタ リズム機構をもつものであればよ い。 それらの酵母と しては、 例えば A !T C C 3 2 7 4 7 などがあげられる。 一方、 キラ一酵母と しては、 核融合 欠損変異株例えば、 ^ C Z /尸 2 4 (文献 (2) )のようなも のであれば、 これもまたすべて適用できる。 また、 キラ —酵母にマ一カーと して抗生物質に対する非感受性また は感受性を付加しておく ことは、 目的する酵母の選択に 好ま しいものである。
本発明者らは実施例 1 に示す如く、 発酵末期でも生菌 教の割合が高く又沈降性が弱 ぐ充分な浮遊性を保つホモ
O PI タ リ ズムブ ドゥ酒酵母 S — 0 0 1 S — 5酵母をサ ィ ト ダクシヨ ン （ Cy i o diic ί ）法によ ]?交配し、 キ ラ 一性を持ったブ ドゥ酒藤造用酵母を造成 した。
—方、 本発明に開示された方法によ ]3造成 したキラー 酵母 （ サッカ ロマ イ セ ス ' セ レ ピ シェ 3 0 1 ) をブ ドウ酒醸造に用いるこ とによ Ϊ 発酵中での好ま し からざる酵母の汚染を抑制し、 品質の秀れたブ ドウ酒を つく ることができた。 さ らに、 該優良キラ一酵母を用い、 雑菌の死滅率を高く し、 又ブ ドウ果から由—来するぺクチ ン、 タ ンパ ク質、 タ ン ニ ン、 色素等の沈澱物を多 く混じ た沈降酵母を使用することを避け、 上澄み中の生菌教の 多いきれいな充分量の浮遊酵母のみを回収し使用するこ とによ Ϊ 回収酵母中の生菌玆の増加と、 便用 した優良 キラー酵母の増加を図 ]?、 有害酵母の増殖を阻止するこ とができることを見い出した。 このような方法によ ]?、 違続して酵母を回収し、 酒母を簡単に調整するこ とがで き、 安定した酒質のブ ドゥ酒を得ることが可能となった C 即ち、 ブ ドウ酒の品質に何らの影響を与えるこ となく、 工業的にその酵母を回収し、 再度、 三度と連続し醸造を 行い、 良貧なブ ドウ酒を製造することに初めて成功した < 優良ブ ドウ酒酵母にキラー因子を導入し、 ブ ドウ酒を 製造することはすでに知られている 〔特公昭 5 7—
2 3 0 7 ヽ そこで開示された方法で得られたキラ一 因子をもつ酵母は、 ブ ドウ酒発薛後の酵母の死钹率が通 常の酵母とほぼ同様であ ])、 該キラ一酵母を回収して連
Ο ΡΙ 続、 再利用するこ とは好ま しいものではない。
以下実施例にて本発明をさ らに詳細に説明する。
実 施 例 1· ブ ドゥ酒醸造用キラ一酵母の造成
2倍体のブ ドウ酒酵母サッ カ ロマイ セス · セ レ ピ シェ S W— 0 0 1を酵母エ キス 1 %、 ポ リ ペプ ト ン 2 %、 グ ルコース 2 %を含む培地 （ P i)培地 ) で培養 （ 2 容- 静置 3 0 Ό )後、 胞子形成培地 （ 酢酸カ リ 0.5 %、 寒天 2 % )上にのせ、 3 0 1C、 2 4時間培養し胞子形成させ .た。
—方キ ラ一酵母サッ カ ロ マ イ セス · セ レ ピシェ — 5 (見 leu 1 Ear l-l lK+ ^ iEryr^ )を : Γ尸 培地 中で 2 4時間培養した。 0 0 1株の胞子及び S
一 5細胞を小さな 寒天培地上に置き、 顕微鏡下で 細いガラス棒を用いて両細胞を接する様に置いた。
{Spore ίο CeZ 交配法文献（3))胞子と細胞が融合し たこ とを顕微鏡下で確めたあ と、 この小さな : P 寒天 培地を Υ尸 £>寒天平板培地上に移し、 3 日間 3 0 で培 養してコ 口 -—を形成させた。 このコ ロニーよ ]?釣 ]3菌 し、 3 %グリ セ 口 一ルを含む最小培地 （ 0.6 7 % Yeast Nitrogen Base , Difco 製 ） に 1 0 0 n / ェ リ ス ロ マイ シンを加えた寒天培地上で生育させた。 独立した 2つの交配を行い上言己 3 %グリ セ ロ ール · ェ リ ス ロマイ シ ン最少培地で生育したク ロ一ンをそれぞれの交配から 5 ク ロー ンずつ取 出 し、 四分子解析及びキ ラーの性質 を検討した。 その結果目的とする 0 0 1核遺伝子
O PI を持つキ ラ 一酵母 S A — 3 0 1を得た。 この株は、 ェ 業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている ェ研 条寄第 2 6 1号（ ^ 2 6 1 )。 なおこの交配 によ]?生じる菌株及び用いた菌株の性貧を表 1に示す。 さ らに S AT— 3 0 1の細胞質 RN A、キラ一 フ了 ク タ ーを発現するプラ スミ ド）の有無を検討した結果、 S Y- 5 と同じ分子量の M ds RNA及び L ds RNA カ存在していた。 また S AT— 3 0 1のキラ一スペッ ク は S 5 と全く同じであった。 表 2にそれを示す。 ま た 3 0 1の菌学的性質（文献 (4) )は 0 0 1 とすべて同じであった。 表 3に糖の発酵性を示す。
Figure imgf000008_0001
2
Figure imgf000009_0001
Λ サッ カ ロ マ イ セ ス · ノ ィ ャ ヌ ス S c char omy ces ba us) サン ト リ ー (株ソ保存菌株
C2 サッ カ ロ マイ セス · ベチカス ( Sa c char omy ces bet icus) サン ト リ ー （株）保存菌株
サッ カ ロ マ イ セス · 才 ビホノレ ミ ス (Sacchar om 一 ces ov iformi s )サン 卜 リ一 (株)保存菌珠
サッ カ ロ マイ セス · フアーメ ンタティ Sac cha- romyce s ferment at ί) ^ ト リ — 〔株)保存菌 ホ サッ カ ロ マイ セス * ラ クチス 〔 Sac char'omy c e s l c t is サン ト リ 一 （株）保存菌株
へ サッ カ ロ マ イ セス · レ ビ シェ (Sacchar omy ces c er evis iae ) 協会 7号
サッ カ ロ マ イ セ ス ' ウ イ リ ア■ヌ ス ( Saceん ar omy ces wi I I ianus ) I F 0 - 24, 8 チ サッ カ ロ マ イ セス ' セ レ ピ シェ ' ノくラ エティ · エ リ フ ソ イ デウ ス （ S c c h r omy c e s c er ev i s t e v r. ell i s oideus ) I F 0 - 2 5 1
サッ カ ロ マイ セス ' 才ビホノレ ミ ス ( Sacch ro y- ces ovijo rmi s j i F 0 - 2 Q 2 ヌ サッ カ ロ マ イ セス · セレ ビシェ ( S c char omy ce s c er evi s iae) I F 0 - 3 0 4 ル サッ カ ロ マ イ セス · ジァスタ チカ ス (Sac char o y- c es as t at i cus) I F 0 - 1 0 1 o
才 サッ カ ロ マイ セス · ジァスタ チカス (_Sacch ro y- c es diastaticus) I F 0 - 1 0 4 6
表 3
SAV- 3 0 1 SW- 0 0 1 ! グルコ一ス + +
ガラ ク ト ス 十 十
シュク ロ ス + 十 マ ル ト 一ス 十 +
ラ ク ト ース
ラ フ イ ノ ス 十
メ リ ビオ ス
+ 醱酵性有 ]3
一 鏺酵性無し
^ 施 例 醸造中の汚染菌の消長と酒質の検討
甲州ブ ドウ 2 0 を破砕、 除梗後、 直ちに圧搾して杲 f ΟΜΠ 汁を得る。 これにメ タ重亜硫酸カ リを 1 0 0 pp 加えて 糖分 2 0.2 %まで補糖し、 遠心分離後 フ ィル ターで 無菌 過する。 この果汁を殺菌済の発酵瓶に入れ、 あら かじめそれぞれ純粋培養したキラ一酵母 S A — 3 0 1 ' 汚染酵母サッ カ ロマイ セス · ノ ィ ャ ヌ ス Sac charom- yces bayanus ) 5— 1及びブ ドウ酒酵母サッ カ ロマ イ セス ' セ レ ビシェ ( S c char omy c e s cerevisi e ) S W- 0 0 1をキラ一酵母 S A — 3 0 1 と污染薛母 F B - 1 との組合せ 法）及びブ ドウ酒酵母 S W— 0 0 1 と汚染酵母 5— 1 の組合せ （ 法） で、 それぞ れの組の中の菌の割合は醪中で A法ではキラ一酵母
^ A - 3 0 1 ) 2 X 1 06 個. Z？^、 汚染酵母 _Ρ 5— 1 カ 2 X 1 0 5 個ノ 、 法ではブ ドウ酒酵母 0 0 1 カ 2 X 1 06 個ノ 7 、 汚染酵母 F Β— 1が 2 X 1 0 5 個 ノ m になる様に加え 2 0 Όで発酵させる。
培養 7 日後の醪中の生菌数をみると、 A法ではすべて がキラ一酵母であ 、 法では 2 9 8 %が汚染酵母 5 — 1であった。 キラ一酵母と汚染酵母の区別は栄養寒天 培地に生じるコ ロ ニーのエ リ ス ロ マ イ シ ン （ 1 0 0 ^- ^ )耐性の有無によって行った 〔 キラ一酵母は耐性があ Ϊ 汚染酵母は耐性がない ）。
'次に、 上記の操作によって得られたブ ドウ酒について、 メ タ重亜硫酸力 リを 3 0 0 ？)? 加えて亜硫酸の遊離型と 結合型の量を比較した結果、 及び官能検査の結果をそれ ぞれ表 4及び表 5に示した。
Οί ΡΙ 4 分析項 A 法 B 法
*亜硫酸 1 9 5
(遊離型 Ζ·^ )
*結合型 1 3 9 1 4 9
^ Ά )
*総亜硫酸 1 5 8 1 5 4
5
A 法 B 法 to
Figure imgf000012_0001
ί ( 1 0 0 0 1 ) = 3.1 0 6 なお、 官能検査は熟練したパネル 1 1名によ 、 色 0 〜 2点、 香気 0〜 4点、 風味 0〜 1 2点の 1 8点満点で 実施した。
表 4中 Α法は 法にく らべ遊離型亜巯酸が多く出てお 、 酸化防止及び微生物汚染防止に効果が期待出来る。 又、 表 5中、 * * : 危険率 1 %で有意差有 Ϊ？、 έ分布表 ょ （ 1 0 0 0 1 ) = 3.1 0 6、 香気、 風味、 総合に 於ける έο值〉 3.1 0 6であ ])、 したがって、 本発明の酵 母とキラ一性のない酵母との間には有意差が認められた < 上記の結果よ ]9明らかな如くキラ一酵母 — 301 によ 汚染菌をおさえて発酵し製成したブ ドウ酒のほう が遊離の亜硫酸が生成し.やすく、 又、 ブ ドウ酒に不快臭 を付与するアルデヒ ド様の香 が少な く、 官能的にもす ぐれていた。
*亜硫酸（-遊離型及び結合型）定量は Ha k i e
( 1 9 6 2 )を採用した。 （文献 (5) )
実施例 a—キ ラ ー酵母使用による再発酵抑制の効果 新鮮なデラウエァ種果汁（糖度 1 8.0 °h、 酸度 0.8 9 % ) にグルコ ースを加え、 糖度 1 9.9 %に調整した後に 遠心分離で清澄、 しかるのちにメ ンブラ ンフ ィ ルタ一 ( ミ リポ-ァ社製）で無菌^過し、 乾熱殺菌した発酵瓶に 5 Άずつ入れる。
上記の果汁に、 あらかじめ、 キ ラ ー酵母 — 301 及びブドゥ酒酵母 S W- 0 0 1をそれぞれ純粋培養した 酒母を果汁の容量に対して 5 %添加し、 それぞれ発酵さ せる。
2 0 Όで発酵させ糖分約 1.3 %となった時に冷却して 発酵を止め、 お]?引き、 护過、 清澄した後亜硫酸を 7 0 ppmに調整し、 メ ン ブラ ンフ ィ ルタ ー 〔 ミ リ ポァ社製） で無菌^過しながら乾熱殺菌した発酵瓶に入れる。
上記のキラ一酵母 3 0 1 とブ ドウ酒酵母 一 0 0 1で発酵させたプドウ酒にあらかじめ純粋培養し た汚染酵母サッカ ロマイセス · ノ ィ ャ ヌ ス （； Sacch ro- mvces bay nus 一 1 それぞれに 2 X 1 05 1固/ 1 0 0 と 2 X 1 0 6 個 / 1 0 0 π ずつ加えて 2 0 Όに 放置し、 再発酵するかどうか観察した。 菌の増殖は島津 ボッ シュ ロ ム分光光度計スぺ ク ト ロ ニ ク ス 2 0 Αを用い
6 6 0 % で濁度を測定した。 その結果、 表 4に示す様に^:発明による酵母を使用し たブ ドウ酒のほうがキラ一性を持たないブ ドウ酒酵母で 発酵させたブ ドウ酒よ 菌の増殖を く らせ、 再発酵を 防止する効果が判明した。
表 4 培 養 日 教
条、件
2 5 7 . 1 0
0.0 2 0.1 2 2 0- 3 9 5 0.7 3 3
0.0 2 0.2 3 0 0.4 6 9 0.8 0 9 ノヽ 0.0 1 0.0 2 0.1 5 1 0.7 6 7
0.0 1 0.0 2 0.2 8 2 0.8 6 4 上表において、 各条件を下表に示す。 添加酵母数 料
Figure imgf000014_0001
施 例 4 連統釀造に けるキラー酵母使甩の効果 甲州ブ ドウ 2 を破砕、 除梗、 後、 直ちに圧搾し果汁 を得る。 これにメ タ重亜硫酸カ リを 1 0 0 加え欐分
2 1.6 %に補正後、 遠心分離機で混濁を取 のぞき ^ フ ィ ルター （ザイ ツ社）を用い無菌^過する。
上記の果汁を殺菌済の発酵瓶に入れ、 あ らかじめ、 キ ラ ー酵母 S A — 3 0 1、 汚染酵母サッ カ ロマイ セス ' ィ ャヌ ス ( S<x c char omy c e s o ay anus ) F B— 1 と ブ ドウ酒酵母 — 0 0 1をそれぞれ純粋培養した酒母を、 キラ一酵母 S A — 3 0 1 と汚染酵母サッカ ロマイ セス' ャ ヌ ス 〔 Sac char omy c e s b y anus ) _P _B— 1 との 組合せ （ A法 ）及びブ ドウ酒酵母サッカ ロ マイ セス · セ レ ビ シェ Sa c h r omy c e s cerevisi e SW— 0 0 1 と污染酵母サッカ ロ マイ セス · バ ャヌ ス ί Sac char 0- myces 6a2/a ¾s ) 5— 1 との組合せ ( J5法） で、 そ^ L それの組の中の菌の割合は醪中で、 A法ではキラ一酵母
S A V - 3 0 1が 4 X 1 0 6 個 Zra 、 汚染酵母 ?75 - 1 が 4 X 1 0 5 個 ？^、 5法ではブ ドウ酒酵母 — 001 が 4 X 1 0 6 個ノ？^、 汚染酵母 _P — 1が 4 X 1 0 5 個
になる様に加え 2 0 'Cで発酵させる。
培養後、 残糖分約 1 %になった時点でそれぞれ A B の醪から酵母を回収する。 回収したそれぞれの酵母が
4 X 1 0 6 個. と、 純粋培養しておいた汚染酵母サッ カ ロマ イ セス . ィ ャヌ ス ( Sa c c har omy c e s b ay anus j — 1が 4 X 1 0 5 個ノ? ^になる様に同じ方法で調整 した果汁に加え発酵させる。 これをも う 1度繰 ]?返した
O PI 合計 3回目の醪の発酵終了時の生菌数中の酵母の割合は. 表 5に示す様に Α法ではほとんどがキラ一酵母で、 汚染 薛母を防止出来たが 法では逆に 8 0. 5 %が汚染酵母と なってしまった。
上記の結杲からキラ一性を持った酵母を使用すれば原 料となる杲汁は、 通常は無殺菌で使用されるブドウ酒釀 造においても、 純度の高い回収酵母を酒母と して連続便 用することが可能となった。
表 5
Figure imgf000016_0001
実施例 5· 無殺菌果汁を用いたキラ一酵母による連続 甲洲種ブドウ 1 5 0 を破砕、 除梗後、 すぐに液抜き 圧搾して杲汁を得る。 これに亜硫酸を 1 0 0 ppm添加し 糖分を 2 2 %になるまで補糖した後に遠心分離し清澄な
OMFI 果汁を得る。
これにあらかじめキラ一酵母 3 0 1を純粋培 養した酒母を果汁の容量に対して 4 %添加する。 2 0 'C で発酵させ残糖分約 1 %になった時点で上ずみを遠心分 離にかけ酵母を回収する。
この回収した酵母を同じ方法で調整した杲汁に 4 X 1 06 個/ ¾ 当り加え発酵させる。 この操作を 5回繰り 返した後に回収した酵母中には代表的な汚染酵母である サッ カ ロ マイ セス · パ イ ャヌ ス ( Sac char omyc e s b a— MS ) ίま検出されなカ つた。
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Claims

請 求 の 範 囲
(1J サッ カ ロ マ イ セス ' セ レ ピシェに属する S Α —
3 0 1 ο
(2) 2倍体以上のホモタ リ ズム酵母を減数分裂させ得ら れる胞子に、 キ ラ ープラ ス ミ ドを保持する核融合欠損変 異酵母を融合させ、 その融合体から出芽する細胞から目 的とする細胞を選択するこ とを特徵とするキラ一酵母の 造成法。
(S) ホモタ リ ズム薛母が醸造用ホモタ リ ズム酵母である 請求の範囲第 2項記載のキラ一酵母の造成法。
(4) ホモタ リ ズム酵母;^ブ ドウ酒酵母 S 1 — 0 0 1であ り、 キ ラ ープラ ス ミ ドを保持する核融合欠損変異酵母が
S Y - 5である請求の範囲第 2項または第 3項記載のキ ラ一酵母の造成法。
(5) 2倍体¾上のホモタ リ ズム酵母を減数分裂させ、 得 られた胞子にキラ一プラ ス ミ ドを保持する核融合欠損変 異酵母を融合させ、 その融合体から出芽する細胞から巨 的とする細胞を選択したキラ一酵母を用いるこ とを特徵 とするブ ドウ酒の醸造法。 .
(6J キラ一酵母が S A 7— 3 0 1 である請求の範囲第 5 項記載のブ ドゥ酒の醸造法。
(T) 1回以上発酵に使用され回収された酵母を酒母と し て用いる請求の範囲第 5項または第 6項記載のブ ドゥ酒 の讓造法。
OMPI ^
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