WO1989007761A1 - Analyse immunologique selon un procede en sandwich du collagene humain de type iv - Google Patents

Description

CI) 明 細 書 ヒ ト w型コ ラ ーゲ ン のサ ン ド イ ッ チ 酵素免疫学的定量法

〔技術分野〕

本発明は、 肝臓疾患を簡易に診断す る の に有用 な ヒ ト Ι\τ型コ ラ ー ゲ ン ぺ ブチ ドの酵素免疫学的定量法に関する も のであ る 。

さ ら に詳 し く 言えば、 本発明 は、 ヒ ト IV型 コ ラ ー ゲ ン に対する モ ノ ク ロ ーナ ル抗体を用 いた 1 段階サ ン ド イ ツ チ法に基づ く 酵素免疫学的定量法に よ る ヒ ト W型コ ラ ー ゲ ン の分子中央三重ラ セ ン部位の定量法な ら びに ヒ 卜 IV 型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン の定量法を提供する も ので あ る 。

〔背景技術〕

従来、 血中 ヒ ト Ε型プ ロ コ ラ ー ゲ ン N末端ぺ ブチ ド、 ヒ ト IV型コ ラ ーゲ ン Ν末端べ ブチ ド 7 — S ド メ イ ン お よ び同、 C 末端ペ プチ ド N C 1 ド メ イ ン の各ボ リ ク ロ 一 ナル 抗体を用 いて放射性免疫学的測定を行っ た と.い う 報告が なされている （Rohdeら、 Eur J . Cl in. I nvest . , 9 , 451 ~ 459 , 1979、 Hegemannら、 Cl in. Chim . Acta , 144 1 〜 10 , 1984、 Schuppanら、 J - Cl in. Invest . 78, 244 一 248， 1986)。

し 力 し な力 s ら 、 血中 の ヒ ト IV型コ ラ 一ゲ ン の分子中央 三萆 ラ セ ン部位につい て、 な ら びに ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン について、 それら を定量する方法に関 し ては、 未だ報告はな されていな い。

本発明者 ら は、 ヒ ト W型コ ラ ーゲ ン を特異的に定量す る方法に関 し、 種々研究 した結果、 本発明に よ り ぺ プシ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ーゲ ン に対する モ ノ ク ロ ー ナル抗 体あ る レ、 は ヒ ト IV型コ ラ ーゲン 7 — S ド メ イ ンに対する モ ノ ク ロ ー ナル抗体を用 い、 1 段階サ ン ド イ ッ チ法に基 づ く 酵素免疫学的定量法を行う こ と に よ り 、 少量の試料 で、 良好な精度で迅速に測定 し得る ヒ ト -IV型コ ラ ー ゲ ン ぺブチ ドの定量法を提供する こ と に成功 した。 従来知 ら れてい る サ ン ド イ ッ チ法、 すなわ ち、 固相化抗体と 試料 中の抗原 と の反応 （第 1 反応） 、 次いで、 固相化抗体 - 抗原複合体 と酵素標識抗体と の反応 （第 2 反応） 、 さ ら に酵素基質に よ る発色反応 （第 3 反応） と 、 発色反応ま でに 2 段階の免疫反応を必要 と する サ ン ド イ ッ チ法に く らべ、 本発明方法においては、 第 1 反応と 第 2 反応を同 時に行う 1 段階サ ン ド イ ッ チ法に よ る ため、 よ り 高い精 度で、 短時間で、 多数の揆体の測定を簡易に行う こ と が で き る 。

〔発明の開示〕

本髡明は、 下記（ 1 )およ び（ 2 )に記載 した 1 段階サ ン ド ィ ツ チ法に基づ く 酵素免疫学的定量法 を行 う こ と に よ る ヒ ト W型コ ラ ー ゲ ン の定量法を提供す る も の であ る 。

( 1 ) ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト 1 型 コ ラ ーゲ ン に対する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 いたサ ン ド ィ ツ チ法に基づ く 酵素免 疫学的測定法に よ る ヒ ト IV型 コ ラ ーゲ ン の分子中央三 重 ラ セ ン部位の定量法であ っ て、

( a ) ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン の分子中央三 重ラ セ ン部位 と 交差反応す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体に 酵素標識を付与 し た酵素標識抗体の緩衝液溶液 を用 いて、 測定対象試料 を希釈 し て得 ら れ る 試料希釈液 と 、

Cb) ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型 コ ラ ーゲ ン のみ に交差反 応す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を 固相担体に結合 さ せた 抗体結合固相担体

と を用 い、 上記希釈液（ a )中 に 、 上記の抗体結合固相 担体（ b ) を混和 し、 上記測定対象試料中 に存在す る ヒ ト 17型コ ラ ー ゲ ン と 上記の酵素標識抗体な ら びに上記 の固相担体に結合 し て い る 抗体 と に おい て免疫反応を 行わ し め た後、 固相担体を分別 し、 そ の固相担体の酵 素活性を測定す る こ と に よ り 、 ヒ ト IV型 コ ラ ー ゲ ン の 分子中央三重 ラ セ ン部位 を定量す る 方法。

(2 ) ヒ ト IV型 コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 い たサ ン ド イ ッ チ法に基づ く 酵素免 疫学的測定法に よ る ヒ ト IV型 コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン の定量法であ っ て、

Ca) ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型 コ ラ ー ゲ ン 7 - S ド メ イ ン と 交差反応す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体に酵素標識を 付与 し た酵素標識抗体の緩衝液溶液 を用 いて、 測定 対象試科を希釈 して得られる試料希釈液と 、

Cb) ヒ ト 型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ンのみに交差反 応する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を固相担体に結合さ せた 抗体結合固相担体

と を用 い、 上記希釈'液（a)中に、 上記の抗体結合固相 担体（b)を混和 し、 上記測定対象試料中に存在する ヒ ト 17型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン と 上記の酵素標識抗 体な ら びに上記の固相担体に結合 してい る抗体と にお いて免 反応を行わ しめた後、 固栢担体を分別 し、 そ- の固相担体の酵素活性を測定する こ と に よ り 、 ヒ ト IV 型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン を定量する方法。

本癸明方法において、 酵素標識を付与する抗体と して は、 抗体含有物を硫安分画後、 DEAE - Sephacelおよ びプ ロ テ ィ. ン Aァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム に よ り 精製 した I gG画分 が用 レ、 られる 。

本発明方法においては、 使用する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 ポ リ ク ロ ーナ ル抗体と しては、 それ ら抗体における特異 的結合部分 F(alD ' ) ₂、 ある いは Fab 'そのものを使用する 態様も含まれる も のである 。

添付の第 2 図お よび第 5 図にみ られる よ う に本髡明方 法で測定 した肝疾患患者血清中の ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン べ プチ ドの分子中央三重ラ セ ン部位およ び ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン の濃度の測定値は 、 健常人血清中の それよ り も有意に高い こ と が認め られ、 本発明方法を用 いれば、 血中 ヒ ト IV型コ ラ ーゲンペ プチ ドの分子中央三 重 ラ セ ン部位お よ び ヒ ト IV型 コ ラ 一ゲ ン 7 - S ド メ イ ン の濃度測定に よ り 、 患者に 負担の力 力 る バ ィ ォ ブ シ一を 実施す る こ と な く 、 肝疾患、 特に 肝線維化、 肝癌お よ び 肝転移消化器癌 を 予知す る こ と がで き る

従来の肝機能判定法 と し て使用 さ れて い る Z T τ (硫 酸亜鉛混濁反応） 、 G 0 T ( グル タ ミ ン オ ギザ 口 齚酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ ) 、 ：^:G P T ( グル タ ミ ン ピ ル ビ ン 酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ ) A L P (ァ ル 力 リ 性 フ ォ ス フ ァ タ 一ゼ）、 L D H (乳酸脱水素酵素） お よ び r - G τ P ( 7 — グル タ ミ ル ト ラ ン ス ぺ プチ ダ一ゼ） な どの測定で は 、 肝組織の線維化、 肝癌お よ び肝転移消化器癌を判定す る こ と は で き ず、 こ の こ と は、 本癸明者 ら に よ っ て確認 さ れて い る 。 し たが つ て、 本発明者 ら が先に報告 し た血中 ヒ ト プ ロ リ ン水酸化酵素濃度の測定 （特開昭 61 - 202162 公報参照） と 本発明方法 と を あ わ せ て用 い て血中の 、 ヒ ト 17型 コ ラ ー ゲ ン ぺ プ チ ドの分子中央三重ラ セ ン部位お よ び ヒ ト IV型 コ ラ一ゲ ン 7 一 S ド メ イ ン の濃度を測定す る こ と に よ り 、 こ の種の疾患を早期尧見す る こ と が期待 さ れ る 。

本発明方法に よ り 、 ヒ ト w型コ ラ ー ゲ ンペ プチ ド の濃 度測定に基づ く 肝組織線維化、 肝癌お よ び肝転移消化器 癌の診断 を行 う こ と がで き る の で、 本発明 は著 し い有用 性を有す る も の であ る 。 以下、 実施例に よ り 本発明 を具 体的 に説明す る 。 ただ し本発明 は こ れ ら 実施例に限定 さ れ る も の では な い 実施例 1

抗 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン ぺ ブ チ ドモ ノ ク ロ ーナル抗体の作

(a) 抗原ー ぺプシ ン可溶化 ヒ ト W型コ ラ ー ゲ ン の調製

ヒ ト 胎盤を材料と し て Artery, 7, 262- 280 (1980)に 記載の Mayneらの方法に従い 0 - 5 N齚酸でホモゲナ イ ズ し、 ペ プ シ ン消化（ 1

ra )で コ ラ ー ゲ ン を可溶化後、 最終 濃度 2 M と なる よ う に塩化ナ ト リ ゥ ム を加え コ ラ ー ゲ ン を析出 させた。 これを 0.5N酢酸に溶解 し 0.7M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 0.5 N酢酸溶液で透析する こ と に よ り I 、 m 型コ ラ 一ゲ ンを析出さ せ、 その上清を 1 ..2 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 0 . 5 N酢酸溶液で透析 し、 IV、 V型コ ラ ー ゲ ン を析出 さ せた。 Ι\Γ、 V型コ ラ ー ゲ ン画分を 0.5Μ塩化ナ ト リ ゥ ム含有 50mMト リ ス 一塩酸緩衝液（ΡΗ7·4) に溶解さ せ、 2.2 Μ塩化ナ ト リ ウ ム含有 50mM ト リ ス ー塩酸緩衝液 (PH7 -4) で W型コ ラ ー ゲ ン を析出 させ、 V型コ ラ ー ゲ ン と分別 した。 得られた IV型の純度を Biochem. Biophys. Res. Coramun. , 72, 1472- 1480(1976) 記載の Sykesら の 方法に徒い ドデシル硫酸ナ ト リ ゥ ム ー ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （SDS-PAGE) で調べた と こ ろ約 95%であ つ た。

なお、 その際 174KD、 135KD、 108KD、 92KD、 78KD、 68 KD、 60RD 56KD、 43KD、 34KD およ び 29 - 5KD (メ ジレカ ブ 卜 エ タ ノ ー ル存在下） の 1 1個の異な る バ ン ドが検出 され た。 (b) 型別コ ラ ー ゲ ン 、 酸抽 ffi W型コ ラ ー ゲ ン 、 IV型コ ラ 一ゲ ン 7 — S ド メ イ ン 、 IV型コ ラ ー ゲ ン N C 1 ド メ イ ンお よ びラ ミ ニ ン P1画分の調製

ヒ ト 胎盤およ び新生仔ラ ッ ト を原料に前記（ a)記載の 方法に従っ て ヒ ト 胎盤か らペ プシ ン可溶化 IV型以外に I m、 V お よ び Ή型コ ラ ー ゲ ン を分別精製 した。 ま た、 新 生仔ラ ッ ト か ら 同様にペ プ シ ン可溶化 IV型コ ラ ー ゲ ン を 調整 した。 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン N末端長形 7 — S ド メ イ ン は前記（ a )で調製 したペ プ シ ン可溶化 IV型コ ラ ー ゲ ン を材料 と して Eur . J . Biochem. , 108 , 239- 250(1980) に記載の Risteliら の方法に よ り 調製 した。

酸抽出 W型コ ラ ー ゲ ン は ヒ ト 胎盤を材料に Eu r . J . Biochem. , ， 43 ~ 52 C 1978)お よ び 95.,255- 263(1979) に記載の T i mp l ら の方法に従っ て調製 した。 また、 IV型 コ ラ ー ゲ ン C末端 NC 1 ド メ イ ン は上記酸抽出 IV型コ ラ ー ゲ ン を 材料 に Eur- J . Biochem. , 120, 203~ 211(1981) に記載の Timplら の方法に従つ て調製 した。

一方、 ラ ミ ニ ン P1画分は ヒ ト 胎盤を原料に Biochem. J. , 191, 749〜 755 ( 1981) に記載の R i s te 1 iら の方法に 従っ て調製 した。

(c) 抗体産生細胞の調製

ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン を完全フ 口 ィ ン ド ア ジュバ ン ド と 共に 8 週令の BALBZc雌マ ウ ス 2 匹に初回腹腔内投与 した。 2 回 目 以降は 0.5 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 50mMト リ ス —塩酸緩衝液（PH7.4) に溶解さ せ た抗原 を 2 ~ 4 週間毎に、 2 ~ 4 回 BALBノ c雌マ ウ ス に追加免疫 した。 最終免疫と し て脾臓摘出 3 日 前に静 脈内投与 し脾細胞を調製 した。

(d) 細胞融合

以下の材料およ び方法を用 い る 。

RPM1 1640培地 ： RPMI 1640 (Difco Laborator i es¾ ) に重炭酸ナ ト リ ゥ ム （12mM：)、 ビ ル ビ ン酸ナ ト リ ウ ム （ 1 mM) L 一 グル タ ミ ン （ 2 raM) 、 ペ ニ シ リ ン G カ リ ウ ム (50 u /mJ2) 、 硫酸ス ト レ ブ ト マ イ シ ン （ mi2) 、 お よび硫酸ア ミ カ シ ンひ 00/i3/mi2) を加え、 ド ラ イ ア イ ス で pHを 7.2に し、 0.2iim Toyoメ ン ブ レ ン フ ィ ル ターで除 菌^過する 。

NS- 1培地 ： 上記 RPM I 1640培地に除菌^過した仔牛胎 児血清（M.A. Bioproducts製） を 15 % ( v/v)の濃度に加え る 。

HAT培地 ： 上記の NS - 1培地に さ ら に ヒ ボ キサ ン チ ン (ΙΟΟ^Μ), ア ミ ノ プテ リ ン （0.4 ίΜ)、 お よ び チ ミ ジ ン （ 16 iM) を加え る 。

HT培地 ： ア ミ ノ ブテ リ ン を除去 した以外は上記 HAT培 地 と 同一組成の も のであ る 。

PEG 4, 000溶液 ： RPMI 1640培地のポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー レ 4,000CPEG 4,000, Merck & Co. Inc. ) 50% ( / ) 無血清溶液を調製する 。

8 ー ァザグァニ ン耐性 ミ エ ロ ーマ細胞 NS-1(P3-NS1-1) との融合は Select.ed Method in- Cellular Immunology ( ed. B .B . Mishel 1 and S .M. Shi igi；)、 W .H. Freeman and Company C1980) , 351 ~ 372に記載の 0 iら の方法を若 干改変 して行っ た。 前記（c)で調製 した有核脾臓細胞（生 細胞率 95% ) と ミ エ ロ ー マ細胞 （生細胞率 95% ) と を 5 〜 6 ： 1 の割合で融合する 。 脾臓細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞 と を別々 に前記の！? PM I 1 640培地で洗铮する。 次に同 じ 培地に けん濁 し、 融合さ せる ため上記の割合で混合する 容量 50rai2の円錐形ス チ 口 ール樹脂製試験管（I waki Glass 製） を用 い、 40 の RPMI 1640培地中 400 x g、 10分間遠 心 し、 上清を完全に吸出する 。 沈殿細胞に 37 加温 PEG 4 , 000溶液 1 mi2を穏やかに撹拌 しなが ら 1 分間で滴下 し、 さ ら に 1 分間撹拌 し細胞を再けん濁、 分散さ せる 。 次に 37。C加温 RPML 1640培地 1 milも 1 分間で滴下する 。 こ の 操作を さ ら に 1 回繰返 した後、 同培地 7 m 2を 2 〜 3 分間 で常に 撹拌 し なが ら 滴下 し細胞 を 分散 さ せ る 。 こ れを 400 X 、 10分間遠心分離 し、 上清を完全に吸引除去する < 次に こ の沈殿細胞に 37°C加温 NS-1培地 lOmfiをすみやかに 加え、 細胞の大 き い塊 り を ΙΟτηβの ビぺ ッ ト を用 いて注意 深 く ピペ ッ テ ィ ン グ し て分散する 。 さ ら に同培地 20?Ηβを 加 え て希釈 し 、 ポ リ ス チ レ ン 製 9 6穴 マ イ ク ロ ウ ェ ル ( Iwaki Glass製）に ゥ ェ レ当 り 5.9x 10⁵個 / ^ O . lmfiの細胞 を ま き込む。 な お こ の時使用 した 96穴マ イ ク ロ ウ ェルの 前処理と して 0 . 2 ?η βの N S - 1培地を加え、 炭酸ガス培養器 中 （ 37 ) で一晚保温 し、 使用時に培地を吸引除去す る _t 細胞融合完了 したマ イ ク ロ ウ ェルを 7 %炭酸ガ ス / ^ 93% 空気中で温度 37 °C、 湿度 1 00 %下に イ ン キ ュ ベー ト す o

(e) 選択培地に よ る ハイ プ リ ドーマの選択的増殖

培養 1 日 目 に パ ス ツ ー ル ピぺ ッ ト で HAT培地 2 滴 （約 O.lrafl)を加え る 。 2 、 3 、 5、 8 、 11日 目 に培地の半分 (0. !UJ2)を新 しい HAT培地で置 き換える 。 14 B 目 に HT培地 に； S換え以降 3 ~ 4 日 毎に同操作を繰 り 返す。 通常 2 ~ 3 週間で充分なハイ ブ リ ドーマの生育が観察さ れる 。 ハ ィ ブ リ ドーマ生育全ゥ エ ル に つ い て次項（ f )記載の固相 一抗体結合テ ス ト （ELISA) 法に よ り 陽性ゥ エルをチエツ クする 。 次に フ ィ ー ダ一 と して 10⁷偭のマ ウ ス胸腺細胞 を含む HT培地 1 mi2を ポ リ ス チ レ ン製 24穴セ ル ゥ エ ル (Iwaki Glass製） に加えた も の を用 い、 上記で検出され た各陽性ハイ ブ リ ドーマの全内容物を移す。 これを前記 ( d)における と 同様に 7 %炭酸ガス存在下、 37 °Cで約 1 週間ィ ン キュベー ト する 。 その間 1 ~ 2 回各ゥ エルの上 清 0.5πβを新 しい ΗΤ培地 0.5mi2と 交換する 。 ハイ ブ リ ドー マの充分生育 した時点で ELISA法に よ り 陽性を再確認 し、 それぞれに つ い て次項（g )記載の限界希釈法に よ る ク 口 一二ン グを行う 。 なお、 ク ロ ーニ ン グに使用後の残液を ポ リ ス チ レ ン製 25cm²祖織培養フ ラ ス コ （Iwaki Glass製） に移 し、 凍結保存用試料を調製する 。 ·

(f ) EL I SA法に よ る抗 ヒ ト IV型コ ラ ーゲンペプチ ド抗体 産生ハイ プ リ ドーマの検索

Anal . B i o c h e m . 104， 205 ~ 214 C 1980 ) に記載の Rennar dらの方法を若干改変 した方法を用いる。 こ の方 法は、 ハイ ブ リ ドー マ抗体の検出に適 している 。 96穴 ミ ク ロ タ ィ ト レ ー シ ョ ン プ レ ー ト (F l ow Laborator i es , Inc.製：） を 0.5〜し のペ プシ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲンでコ ー ト し、 さ ら に その他を 1 %牛血清アル ブ ミ ン (BSA) でコ ー ト し ブロ ッ ク す る 。 こ れにハイ プ リ ドー マ 生育 ゥ エルの上清の一部を加えて室温で約 1 時間ィ ン キ ュペー ト する 。 2 次抗体 と して西洋わ さ び由来ペ ルォ キ シ ダー ゼ （ P O D ) 標識ャ ギ抗マ ウ ス ィ 厶 ノ グ ロ ブ リ ン (Cappel Lab.製） を加え さ ら に室温で約 1 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト する 。 次に過酸化水素 と 基質であ る 0 — フ エ ニ レ ン ジァ ミ ン （0PD) を加え生成 した褐色の程度を マ イ ク 口 プ レー ト リ ー ダー （MPR-A4, 東洋曹達工業製） を用 い て 492nmの吸光度を測定する 。

(g) ク ロ ーニ ン グ

各ゥ エル中に は 2 種以上のハ イ プ リ ドーマが生育 し て い る可能性があ る ので、 限界希釈法に よ り ク ロ ー ニ ン グ を行い、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハイ ブ リ ドー マ を取得 する 。 NS- 1培地 mfi当 り フ ィ ー ダ一 と し て 10⁷個のマ ウ ス 胸腺細胞を含む ク ロ ーニ ン グ培地を調製 し 96穴マ イ ク ロ ゥ エ ル の 36ゥ エ ル、 36ゥ エ ル お よ び 24ゥ エ ル に ゥ エ ル当 り 5 個、 1 個お よ び 0 . 5個のハ イ プ リ ドー マ を加え る 。 5 日 目、 12日 目 に各約 O . l mfiの NS- i培地を追加する。 ク ロ ー ニ ン グ開始後 14〜 15日 で充分なハ イ ブ リ ドー マ の生 育が認め られ、 コ ロ ニ ー形成陰性 ゥ エ ルが 50%以上であ る群について EL I SA法を行う 。 テ ス ト した全ゥエルが陽 性でない場合、 抗体陽性ゥ エル中の コ ロ ニ ー数を確認 し、 ウ ェ レ中に 1 コ ロ ニ ー の ゥ エルを 4 ~ 6 偭選び再ク ロ ー ニ ン グする 。 最終的にペ プ シ ン可溶化 Β 型コ ラ ー ゲ ン に 対 して 22铢の ク ロ ー ンを得た。

Ch) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の ィ ン ビ ト 口増殖およ び ィ ン ビ ボ増殖

モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体は、 上記（ g)で得 られた各ク ロ ー ンを NS- 1培地な どの適当な培養液で培養 （ィ ン ビ ト ロ增 殖） し、 その培養上清か ら得る こ と ができ る （モ ノ ク ロ 一ナ ル抗体たん白濃度は 10〜： L00/igfZ mi2であ る）。 一方、 大量に抗体を得る ために は脾細胞 と ミ エ ロ ーマ細胞の由 来動物 と 同系の動 （BALB/c、 マ ウ ス ） に腫瘍形成促進 剤プ リ ス タ ン （2， 6 , 10 , 14— テ ト ラ メ チ ルペ ン タ デ カ ン、 Aldrich Chemical製：） をマ ゥ ス 1匹当 り 0· 5 腹腔内投与 す る 。 1 ~ 3 週間後にハイ ブ リ ドーマ 1 X 10⁷個を同 じ く 腹腔内投与する こ と に よ り イ ン ビボで 1 ~ 2 週間後に モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体たん白質渙度 4 ~ 7 m9, mfiの腹水を 得る こ と がで き る 。

(i) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の重鎮、 軽鎖のア イ ソ タ イ プ 上記（h)で得 られた各々 の腹水を先ずペ プシ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ンを コ ー ト し た ミ ク ロ タ イ ト レ ー シ ョ ンプ レ ー ト の ゥ エル の各列に入れ、 前述した EL I SA法に 従 っ て各腹水中 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を 結合 さ せ る 。 洗浄後、 ア イ ソ タ イ ブ特異性 ゥ サ ギ抗マ ウ ス I g抗体 CZymed Laborator i es製） を加え る 。 洗浄後、 POD標識ャ ギ抗 ゥ サ ギ GCH+ L) 抗体 を加え、 基質 と し て 2, 2'— ァ ジ ノ ー ジ （ 3 — ェ チ ルベ ン ゾチ ア ゾ リ ン硫酸一 6 ) お よ び過酸化水素を 用 いて重鎖、 軽鎖の ア イ ソ タ ィ プを検出 し た。 そ の結果を第 1 表に示 し た。 得 ら れたペ プ シ ン可 溶化 ヒ ト IV型 コ ラ ー ゲ ン に対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体の 内、 1 6 個が免疫 グ ロ ブ リ ン鎮 ァ 1 Z « を、 2 個力 s ァ 2 b Z « を、 1 個が な / / c お よ び 3 個が ^ / κ を有 し て い た。

第 1 表 で得たクロ ンの

No. アイソタイ プ

4 C 1 gM

7 A 1 1 gM μ / Ά

1 D 3 S G r 1 / K

1 D 6 S G Ύ 1/ K

1 E 1 0 s G Ύ \ / K

2 A 7 sM μ / K

2 D 5 sG 7 1/ K

2 H 1 sA a / K

3 A 9 ε G Ύ 1 / K

4 B 1 g G r \/ K

4 H 1 2 g:G r \ / K

5 D 1 0 s G r 1/ K

5 F 6 sG r 1/ K

6 B 5 sG Ύ \ / K

6 C 1 1 s G 71/ K

6 G 5 g G 2 b ァ 2 bム

7 C 8 g G 7 1 / K

7 H 2 s G r 1/ K

8 B 4 s G r 1/ K

8 G 1 2 S G Ύ 1 / K

9 A 3 ε G 2 b 7 2 b / K 9 C 7 s G 1 7 1/ K 〔j) モ ノ ク ロ ー ナル抗体の精製

前記（h)で得 られた各腹水を硫安分画（40 %飽和）後、 I gGク ラ ス は 0.06 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 40mMリ ン酸緩衝 液 (ρΗ8 · 0) で平衡化 した DEAE-SephacelCPharmacia i：)の 非吸着画分を分取 し、 培地中の仔牛胎児血清お よ びマ ウ ス 由来のたん白質を分離、 除去 し た。 IgAお よ び IgMク ラ ス の精製について は 0. 1 M塩化チ ト リ ゥ ム含有 40mM リ ン 酸緩衝液（PH8.0)で平衡化 した DEAE— Sephacel カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ 一において塩化ナ ト リ ゥ ム 0.1Mか ら 1.0 Mま での グラ ディ ェ ン ト でそれぞれ両画分を溶出 した。

さ ら に、 I gGク ラ ス は 0. 15 M塩化ナ ト リ ゥ 厶含有 50mM ト リ ス —塩酸緩衝液（PH8.6) で平衡化 した ブロ テ ィ ン A セル 口 フ ァ イ ン （生化学工業製） カ ラ ム に吸着さ せ非吸 着画分を除去 した後、 0.15M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 50mM酢 酸緩衝液（PH4.0) で溶出する こ と に よ り 精製 した。 なお . 溶出液は直ち に 1.5M ト リ ス —塩酸緩衝液（PH8.9)に よ り 中和 した。

実施例 2

ヒ ト 血淸中の 型コ ラ ー ゲ ン の分子中央三重ラ セ ン部位 の定量

(a) 酵素標識モ ノ ク ロ ー ナル抗体（Fab' -POD複合体）の調 製法

〔1) Fa 画分の調製

実施例 1 ( j )で得られた I gG画分を 0. 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 0.1M群酸緩衝液 （ PH4.2) に溶解 し、 そ の溶 液を以下に述べ る よ う に してペ プ シ ン で消化 した。 す なわ ち、 前記画分中の IgGに対 し 2 % (w/w)のぺ プ シ ン を加え、 37。G、 24時間消化 し た。 更に そ の消化物に 2 M ト リ ス溶液を加え て P Hを 7 . 0に調整する こ と に よ り 消化反応を停止さ せ、 0.1M リ ン酸緩衝液（PH7.0)で平 衡化 した ウ ル ト ロ ゲル AcA44力 ラ ム （L K B 製） を用 い たゲル^過に よ り F(ab ' ) ₂画分を分取 し た。

次に、 こ の F(ab')₂ 画分を 5 mMエ チ レ ン ジァ ミ ン四 酢酸（EDTA) 含有 0.1 M リ ン酸緩衝液（PH6.0) 中で透析 し 、 終澳度 10 mM と な る よ う に ア ミ ノ エ タ ン チ オ ー ル CMEA) を加え 37。Cで 1.5時間還元 した後、 5 raM EDTA含 有 0. i M リ ン酸緩衝液 （ PH6.0) で平衡化 した ウ ル ト ロ ゲル AcA 44力 ラ ム を用 いてゲル 過 し、 Fab '画分を分 取 し た 。

(2) マ レ イ ミ ド標識 POD画分の調製

上記（ 1 )の操作 と は別に、 以下に述べる よ う に して PODに マ レ イ ミ ド を標識 した。 すな わ ち、 PODを lOm Z mflの量で (K IM リ ン酸緩衝液 （ PH7.0) に溶解 し、 そ の PODに対 して、 25倍モ リレ量の N — （ ε — マ レ イ ミ ド カ ブ ロ イ ル ォ キ シ）コ ノヽ ク酸ィ ミ ド （EMCS) を ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド溶液 と し て加え、 30。C、 30分間反応さ せた。 こ れを 0.1M リ ン酸緩衝液 （pH6.0) で平衡化 し たセ フ ア デッ ク ス G-50カ ラ ム でゲル？戶過 し、 マ レ イ ミ ド標識 POD画分を分取 し た。

(3) Fab'-POD複合体画分の調製 上記（ 1 )の如 く して調製 し た画分中の Fab ' に対 して 上記（2)で得 ら れた圃分中の マ レ イ ミ ド標識 PODと し て 等モ ル に な る よ う に し て、 両画分 を 混合 し、 更に Fab' お よ びマ レ イ ミ ド標識 PODの終澳度カ S 100 iMと な る よ う に 5 mM EDTA含有 0.1M リ ン酸緩衝液（pH6.0) で希釈 し た。 こ の混合液 を 4 °C、 20時間反応後、 Fa の 10倍モ ル量の N - ェ チ ル マ レ イ ミ ド で未反応の チ オ ー ル基を ブ ロ ッ ク し た。 こ れ を 0.1M リ ン酸緩衝液 （ PH6.5) で 平衡化 し た ウ ル 卜 口 ゲル Ac A 44カ ラ ム でゲル. 過 し、 Fab POD複合体画分を分取後、 0.1% BSA及び 0.005% チ メ ロ サ ー ル を添加 し、 4 °C で保存 し た。

(b) 固相担体 と し て ポ リ ス チ レ ン ポ ール（怪 6.5mm、 Precision Plastic Ba 11製）を 用 い た 1 段階サ ン .ド ィ ッ チ法

実施例 1 ( j )で得 られたペ プ シ ン可溶化 ヒ ト W型 コ ラ 一ゲ ン に 対す る 精製モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ ク ロ ー ン N o . 4H12) を 0.1% ア ジ化ナ 卜 リ ゥ 厶含有 0.1M リ ン酸緩衝液 (PH7.5) に溶解 し そ の濃度を 0. lms/mfiに調製す る 。 こ の 抗体溶液に 固相担体 と し て の ポ リ ス チ レ ン ポ ー ル を 浸漬 し ポ リ ス チ レ ン ボ ー ル に抗体を コ ー ト す る 。 次に抗体浸 漬液を回収 し ボ リ ス チ レ ン ポールを 0. 1 % BSA、 0. 1 M塩 化ナ ト リ ゥ ム お よ び 0. 1 % ア ジ化ナ ト リ ゥ 厶含有 10 m M リン酸緩衝液（PH7.0) で洗浄 し、 4 °C に保存す る 。 使用時 に は、 0. 1 M塩化ナ 卜 リ ゥ ム含有 l OraM リ ン酸緩衝液 （P H 7 . 0 ) で洗浄 し た 抗体結合 ボ リ ス チ レ ン ボ ー ル を 用 い る 。

標準試料と し て実施例 1 (a)で得 られた精製ペ プ シ ン 可溶化ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン を 1 % BSA、 0 · 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム 、 l/50(v/v) 馬血清 ( M. A. Bioproducts製） および 0.05%チ メ ロサー ル含有 10mMリ ン酸緩衝液（pH7.0) を用 いて、 40η2Ζ20/ίβの溶液を調製 し、 それを段階希釈する こ と に よ り 、 その各 を と り 測定試料と した。

—方、 血清試料 と しては健常人（Ν0Ε) の血清 20 £、 肝 癌 （HCC：)、 肝硬変 （LC) および慢性活動性肝炎 !: CAH) 各 患者の血清を 20/ii2用いた。 これ らの試料をそれぞれ 0.8 /igZ Fab' (ク ロ ーン No.lD3)— POD複合体、 1 % BSA、 0.1M塩化ナ ト リ ウ ム 、 l/50(v/v)馬血清および 0.05%チ メ 口 サール含有 lOraMリ ン 酸緩衝液 （ρΗ7· 0) に溶解 した。 次に これらの標準試料およ び血清試料のそれぞれ に 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体結合ポ リ ス チ レ ン ポ ー ルを添加 して 37°Cで 45分間ィ ン キ ュベ ー ト （免疫反応） 後、 0.1M 塩化ナ ト リ ウ ム含有 10mMリ ン酸緩衝液（PH7.0) にて洗浄 する 。 次に 0.1M醉酸緩衝液（pH5.5) に溶解した POD基質, すなわ ち 0.0134%テ ト ラ メ チ ルベ ン チ ジ ン （TMBZ) を 300 加え、 さ らに 0.01 %過酸化水素水 を加えて 37。C で 30分間イ ン キ ュベー ト （発色反応） 後、 1.33N硫酸 600 を添加する こ と に よ り 反応を停止さ せる 。 反応停止後 水を対照と して島淳マイ ク 口 フ ロ ー紫外可視分光光度計 CUV-730) で波長 450nmの吸光度を測定 し、 盲検と 試料の 吸光度差を求め る 。 標準試料よ り 作成 した換量線よ り 検 体 の吸光度に相当す る W型 コ ラ 一ゲ ン べ プチ ド量を 読み と り 、 そ の値を 50倍す る こ と に よ り 検体 1 j2当 り の IV型コ ラ ー ゲ ン量を求め た （第 2 表参照） 。

第 2 表 検 体 検量線用檫準液 試薬ブランク サ ン プ ル 2 Ομβ 2 0 μβ

酵素標識抗体液 3 0 Ο β 3 0 O fl

抗体結合ビーズ 1個 1個

〔免疫反応〕 混和後 3 7 Όで正確に 4 5分間静置加温

ァスビレーターで吸引し洗浄液 3 を

〔洗 浄〕

用いて 3回洗浄

基 質 液 3 0 Ομβ 3 0 0μ<2 3 0 0 ίβ 発 色 補 助 剤 1 0 0/ifl 1 0 Ομβ 1 0 Ο ίβ

〔発色反応〕 3 7°Cで正確に 3 0分間静匱加温

停 止 液 6 0 Ομβ 6 0 θ β 6 0 0 <2

〔比 色〕 波長 4 5 Onmで吸光度測定

第 1 図にペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ーゲンの検量線 を示 し た。 第 1 図で明 らかな ご と く こ の サ ン ド イ ッ チ法 の定量惑度は 0.31 ng/試験管であ り 、 定量範囲は 0.31〜 40ι ^ノ試験管であ っ た。 ま た、 定量変動係数（CV) は 2.6 〜 9.5 %であ っ た。 こ の ビー ズ法での反応時間は免疫反 応 45分間、 発色反応 30分間で従来の 2 段階サ ン ド ィ ツ チ 法 （例えば特開昭 61 - 202162公報参照〕 の半分以下の時 間で測定が可能 と な つ た。

こ のサ ン ド ィ ツ チ法に よ る 測定に よ り N0R、 HCC、 LCお よ び CAH患者血清中の IV型コ ラ ー ゲ ン を測定 した結果、 NOR血清の M (平均値） + 2SD (標準偏差）を カ ツ ト オ フ値 と した時、 各肝疾患の陽性率は、 それぞれ 97%、 80%お よ び 80%であった （第 2 図） 。

ま た、 胃癌患者で転移を認めな い無転移群（M (― ))12 例、 さ ら に祖織学的に あ る い は画像診断で確診さ れた肝 転移群 （ HM) 13例お よ び リ ン パ行性転移群 （ LM) 10例の 血清中 IV型コ ラ ー ゲ ン を同様に こ の サ ン ド ィ ツ チ法に よ り 測定 した。 第 3 図で明 らかな よ う に IV型 コ ラ ー ゲ ン濃 度は HM、 LMお よ び M (— ）ではそれぞれ 552 ± 300、 199土 81お よ び 104± 62ns ¹ mi2 ( M ± SD) であ っ た。 NOR血清の M ± 2SDを カ ッ ト オ フ値 と した と き に、 各疾患 の 陽性率 は、 それぞれ 100%、 80%およ び 25%であ っ た。

(c) 固相担体 と し て ポ リ ス チ レ ン製マ イ ク ロ プ レ ー ト (Nunc製）を用 いた 1 段階サ ン ド イ ッ チ法

実施例 l ( j )で得 られたペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ 一ゲ ン に対す る精製モ ノ ク ロ ー ナ ル抗侔 （ ク ロ ー ン No . 4H12) を 0.1%ア ジ化ナ ト リ ウ ム含有 0.1M リ ン酸緩衝液 (PH7.5)に溶解 し、 そ の濃度を 0. lmsZ raflに調製する 。 こ の抗体溶液を固相担体と し て のポ リ ス チ レ ンマ イ ク ロ プ レー ト に コ ー ト する ために 1 ゥ エ ル当 り 100 ίβ添加 し、 4 °C保存する 。 使用時に は 1 % BSA、 0.1 M塩化ナ ト リ ウ ムおよび 0. 1 %ア ジ化ナ 卜 リ ウ ム含有 1 OmMリ ン酸緩衝液 (pH7.0)300 にてマ イ ク ロ プ レー ト を ブロ ッ ク した後、 0.1 M塩ィ匕ナ ト リ ゥ ムおよび 0.1 % (v/v)Tween 20含有 10 mMリ ン酸緩衝液（PH7.0) で洗浄 したマ イ ク ロ プ レー ト を 用 いる 。

標準試料 と して実施例 1 (a )で得 られた精製ペ プ シ ン 可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ンを 1 % BSA, 0.1 M塩化ナ ト リ ゥ ム、 l/50(v/v) 馬血清お よび 0.05%チ メ 口 サー ル含有 lOmMリ ン 酸緩衝液（PH7.0) で 50n2/ 50 ii2に調製 し、 こ れ を段階希釈 したも のを各 々 1 ゥ エル当 り 20AJ2用いた。 ― 方、 血清試料と して健常人（NOR) あ る いは HCC、 LC、 CAH. 慢性非'活動性肝炎（CIH) の各患者のそれぞれの血清を 1 ゥ エル当 り 各 用 いた。 すなわ ち、 これ らの試料各 50 iilを 0.8 ig/mi2 Fab' (ク ロ ー ン N0.1D3)— POD複合体、 1 % BSA、 0. 1 M塩化ナ ト リ ウ ム、 l /50 (v/v) 馬血清および 0.05% チ メ ロ サー ル含有 ΙΟιηΜリ ン酸緩衝液 （PH7.0) 200 A 2に溶解 し、 1 ゥ エル当 り l O OAfiの試料溶液をモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体結合マ イ ク ロ プ レ ー ト に添加 し、 室温 （ 10 ~ 30Ό ) で 1 時間イ ン キ ュベー ト （免疫反応） 後、 0.1M塩 化ナ ト リ ゥ ム お よ び 0.1 % ( v/v) Tween 20含有 lOmMリ ン 酸緩衝液（PH7.0)を 1 ゥ エル当 り 100 £添加す る こ と に よ り 免疫反応を停止さ せ、 0.1M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 0.1 % (v/v) Tween 20含有 ΙΟπιΜリ ン酸緩衝液（pH7.0) に て洗 净す る 。 次に、 0.02%過酸化水素含有 ク ェ ン酸一 リ ン酸 緩衝液（PH6.0)に OPD * 2 塩酸塩を溶解 し、 そ の濃度を 4 msZmQに 調製 し た溶液（PH5.0)を 1 OO 加え室温で 15分間 ィ ン キ ュベー ト （癸色反応） 後、 1.33N硫酸 を添加 し反応を 停止さ せ る 。 反応停止後、 マ イ ク ロ ブ レ ー ト リ ー ダ一 で波長 492nmの吸光度を測定 し、 盲揆 と 試料の吸 光度差を求め る 。 標準試料 よ り 作成 し た検量線 よ り 検体 20/：£の吸光度に相当す る IV型 コ ラ ー ゲ ン量を読み と り そ の値を 50倍す る こ と に よ り 検体 Ι τηώ当 り の W型 コ ラ ー ゲ ン量を求め た（第 3 表参照） 。

第 3 表

検 体 検量線用標準液 サ ン プ ソレ 5 0 ίί£ 5 0 ο3¾ 2 0 O lLQ. 2 0 0

2 ゥエル 2 ゥエル 口プレー 卜 混和後 1 ゥエル当り 1 0 0 を加

〔免疫反応〕

え室温で正確に 6 0分間静置 w . 1 0 0 1 0 0 ァスピレーターで吸引し洗浄液

〔洗 浄〕

3 0 0 を用いて 4回洗铮 基 質 液 1 0 0 1 0 0

〔発色反応〕 室温で正確に 1 5分間静置 停 止 液 1 0 0 Ά 1 0 0

〔比 色〕 波長 4 9 2 nmで吸光度測定

第 4 図にペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン の検量線 を示 した。 図であ き らかな ご と く 、 こ のサ ン ド イ ッ チ法 の定量惑度は、 0.16nsZゥ エルであ り 、 定量範囲 は 0.16 〜 20nsノウ エルであ っ た。 また、 本定量系の CV値は 0.5 〜 6.0 %であ っ た。 こ の ブ レー ト 法での反応時間は免疫 反応 60分間、 発色反応 15分間で、 従来の 2 段階サ ン ド ィ ツ チ法の半分以下の時間で多数の検体の測定が可能 と な つ た。 ま た、 同一検体を測定 した時の同時再現性およ び 曰 差変動はいずれも CV値 5 %以内 と 非常に良好な結果が 得 られた （第 4 表参照） 。

第 4 表

(A ) 同 時 再 現 性

(B ) 日 差 変 動

ま た、 本発明方法を用 い る こ と に よ り 血中 コ ラ ー ゲ ン ぺ プチ ド を定量 し た と き 、 HCC、 LC, CAH患者の血清中で コ ラ ー ゲ ンペ プチ ド の有意な増加が認め られた。 各肝疾 息の陽性率は NOR血清の M + 2SD を カ ツ ト オ フ 値 と した 時、 HCC 92%、 LC 87%、 CAH 83%、 C I H 39%であ った (第 5 図）。 こ の よ う な肝疾患患者血清中の コ ラ ー ゲ ン べ プチ ドの増加は、 固相担体 と し て ポ リ ス チ レ ン ポ ー ル を

I

用 いた 1 段階サ ン ド イ ッ チ法に よ る 測定 と 同様な傾向 を し た 。

実施例 3

(a) 抗原の同定

実施例 1 ( a )で精製 し たペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型 コ ラ 一 ゲ ン を SDS-PAGEに供 した後、 実施例 2 (a)で得 られた Fab ' -POD 複合体を用レヽ て細胞工学 1 & 2 1061〜 1068 ( 1983) に記載の 田部の方法に従 っ て ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グを行い、 酵素抗体染色のパ タ ー ン を得た。

SDS-PAGE後 ク マ シ 一 ブ リ リ ア ン ト ブル ー に て タ ン ノ ク を染色 し た も の のノく タ ー ン 、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ 後 の 二 ト ロ セ ル ロ ー ス膜を それぞれ実施例 2 ( a )で得 ら れた Fab' (ク ロ ー ン No.1D3)-P0D複合体で免疫染色 し た も の のパ タ ー ン に は 190KD、 175KD、 125KD、 94KD、 およ び 86KDの 5 個のバ ン ド と 200KD以上に凝集物 2 個 （ 205KDお よ び 220KD) の バ ン ド が認 め ら れ た （メ ノレ カ ブ ト エ タ ノ 一 ル存在下） 。 同 じ く Fa （ ク ロ ー ン No. 4H12)— POD複合 体で免疫染色 し た も の のノく タ ー ン に は 185 KD、 170 K D , 155KD、 120KD、 および 90KDの 5個のパ、ン ドと 200KD 上 に凝集物 2 個 （ 200KDおよ び 220KD) のパン ドが認め られ た（第 6''図） 。

(b) ヒ ト 血淸中免疫反応物の分子量

実施例 2 ）および（c)に記載 した ヒ ト 型コ ラ ー ゲ ン 酸素免疫定量法で補足される ヒ ト 血清中免疫反応物の分 子量サ イ ズを測定 した。 すなわち、 嫿常者およ び肝疾患 (HCC)患者血清（いずれも ヒ ト 17型コ ラ ー ゲ ン 300ns含有） を 0.05%Tween 20、 0.15M塩イ匕ナ ト リ ゥ ム含有 20mMリ ン 酸緩衝液 （PH7.0) で平衡化 した Septiacryl S - 300 ( 1.6 X 90cmv Pharmacia凝）でゲノレ炉過 し、 各画分の免疫反応 物を実施例 2 (b )の ポ リ ス チ レ ンボー ルを用 いる 1 段階 サ ン ドイ ッ チ法で定量 した。 第 7 図に示 した如 く 健常人 (一 · 一）およ び肝疾患息者（一 X -）血清中の免疫反応物 は単一 ピー ク であ り 、 対照 と して用 いたペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ンペ プチ ド（300ng、 — o —） よ り 若干 分子量は小さ かっ た。 フ イ ブ リ ノ 一ゲン、 免疫グロ ブ リ ン 、 牛血清ア ル ブ ミ ン 、 ペルォキ シ ダーゼを用 いた換量 線か ら血清中免疫反応物の分子量は 620KDと 推定 した。

'(c) 特異性

実施例 1 (b)で調製 した ヒ ト i 、 m、 IV (酸抽出.） 、 V 型コ ラ ー ゲ ン 、 7 — S ド メ イ ン 、 N C 1 ド メ イ ン 、 ラ ミ ニ ン P1画分およ びペ プ シ ン可溶化ラ ッ ト IV型コ ラ ーゲン を実施例 2 (b)記載のポ リ ス チ レ ンボー ルを用 いる 1 段 階サ ン ド イ ッ チ法で定量 し、 ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト 型 コ ラ ーゲ ン の定量値と 比較 し た。 第 5 表に示 し た如 く VI型 コ ラ 一ゲンで若干の交差反応（約 7 % )が認め られた以外 は他のいずれの コ ラ ーゲ ンおよ びラ ミ ニ ン P 1画分で交差 反応は認め られなかつ 。

第 5 表 型別コラ —ゲン、 IV型コラーゲン 7-Sドメイ ン、 NC1ドメイ ン

およびラミニン P1画分の交差反応性

型別 コ ラ 一 ゲ ン お よ び基底膜成分

濃 度 I Π IV* IV** V YI 7-S NC1 ラ ミ'二ン P1

125ng/wJ2 1.91 0.35 0.17 0 0 7.13 0 0.50 0 C (2.5ngf/ゥエル）

* 酸抽出 IV型コラーゲン、 ぺブシン可溶化ラッ ト IV型コラーゲン 表中の数値はぺプシン可溶化ヒ ト ] V型コラーゲン値に対する％と して表示。

(d) 回収率

IT型コ ラ一ゲン 93.0ngZml2および 234.0n9_ raJ2濃度の 2 種の ヒ ト血清にそ れぞれ 31〜500n Z?nJ2の範囲でぺ ブ シ ン可溶化 ヒ ト IV コ ラ ー ゲ ン を添加 し、 実施例 2 ( b：)、 同 2 ( c )記載のポ リ ス チ レ ン ボールお よ びボ リ ス チ レ ン ブ レー ト を用 い る 1 段階サ ン ド ィ ツ チ法でそれ ら の回収 率を調べた。 第 8 図に示 した如 く ポー ル法お よ びブ レ ー ト 法での添加ペ プ シ ン可溶化 IV型コ ラ ー ゲ ン ペ プ チ ド に 対する 回収 IV型コ ラ ー ゲ ン の相関係数、 回収率はそれぞ れ 7 = 0.9997、 99.4土 10.3% (M 土 SD)お よ び ァ = 0.9993. 101.6士 7.1%であ っ た。

(e) 抗原決定基

第 6 図の ィ ム ノ プロ ッ テ ィ ン グ図に示 した如 く 実施例 2 (b)およ び同 2 (c)記載のボー ルあ る い は プ レ ー ト を用 レ、 る 1 段階サ ン ド イ ッ チ法に 使用 さ れて い る 固相抗体 (ク ロ ー ン No.4Hi2お よ び POD標識抗体 （ク 口一ン No. lD3) に よ る 抗原認識部位は若干異な る 。 こ の固相抗体 と POD 標識抗体の抗原認識部位を 明 ら かにする ために抗原抗体 阻害率を調べた。 すなわ ち、 試験管当 り 10ns>ペ プ シ ン可 溶化 ヒ ト 17型コ ラ ー ゲ ンおよ び 0 — 10 ^モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗体 （ク ロ ー ン Nos . , 1D3、 3A9お よ び 4H12) を 1 % BSA、 0.1M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 lOmMリ ン酸緩衝液（PH7.0) 中で 37。C、 60分間 ブ レ イ ン キュべ イ シ ヨ ン し 、 次に実施例 2 (b)の 方法 に 従 つ て 調製 し た ク 口 一ン No.4H 12か ら の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体コ ー ト ポ リ ス チ レ ン ポ ー ル を 加 え て 更 に 37°C、 60分間反応させる 。 次に試験管当 り 4011 Fab' (ク ロ ー ン No.3A9) - POD複合侔を加え 37。C、 60分間反応後、 TMBZお よび過酸化水素水を加え 30 °C、 60分間静置後、 A_{t 5}。を測定 した。 第 9 図に示 した如 く 標準ペ プ シ ン可溶 化 ヒ ト IV"型コ ラ ーゲン を ク ロ ー ン No.1D3(— X—）か ら の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体で処理 した場合は、 抗原抗体反応の 阻害は観察されなかっ たが、 こ こ で固相抗体および複合 体に用 いた ク ロ ー ン No .3A9(— · 一） お よ びク ロ ー ン No . 4H12C- 一）か ら のモ ノ ク ロ ーナル抗体で処理 した場合 に は阻害が認め られた。 こ の結杲よ り 、 本明細書に開示 さ れている 1 段階サ ン ドィ ツ チ法に使用 されている 固栢 抗体（ク ロ ー ン No.4Hl2)7^ POD標識抗体（ク 口一ン No.1D3) に対 してペ プ シ ン可溶化 ヒ ト 17型コ ラ ー ゲ ン の異な る抗 原決定基と特異的に反応 している こ と が明 らかであ る 。

以上、 （a)~ (e)の結果よ り 、 本明細書に開示されてい る ボールおよびマ イ ク ロ ブ レー ト を用いる 1 段階サ ン ド ィ ツ チ酵素免疫定量法は極めて 17型コ ラ ー ゲ ン分子中央 三重ラ セ ン部位を特異的に認識する測定系であ る と言え る 。

実施例 4

(a) 坑 ヒ ト IV型コ ラ ーゲン 7 — S ド メ イ ンモ ノ ク ロ ーナ ル抗体の作製

実施例 1 に記載の方法に従っ て ヒ ト W型コ ラ ーゲン 7 - S ド メ ィ ン に対する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 17個を調製 し た。 それ ら ク ロ ー ン の内 4 個が免疫グロ ブ リ ン鎮 ァ 1 Z 他の 13個は / ^ / ' κ を有 し て い た 第 6 表

クローン No. アイソタイプ 鎖 1 - 1 G4O C I gG 1 ァ 1 A 1 -2H 1 2 I gM μ/ K 1 -3D2 I gG 1 r 1 / _K

I gM μ/ K 1 - 5 Η 8 I gM μ / K 1 -6Η4 I gM μ / K 1 -7Ε 4 I gM μ / K 1 -8 G9 1 g G l 71 1 -9Η8 I gM μ / K 1 - 1 0F 5 I gM μ / K 1 - 1 1 D 1 1 I gM μ / K

1 - 1 3Η3 I -gG 1 7 \ /κ 1 - 1 5Β 4 I gM μ / κ 1 - 1 7Η6 I gM / κ. 1 - 1 8Η5 I gM μ / κ 1 - 1 9 F 4 I gM μ/ κ (b) 固 相担体 と し て ポ リ ス チ レ ン マイ ク ロ プ レ ー ト (Nunc製）を用 いる 1 段階サ ン ド ィ ツ チ法

上記（ a )で得 られた ヒ ト ！^型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ンに対する精製モ ノ ク ロ ーナル抗体（ク ロ ー ン N0.31-8G9) を実施例 2 (c ) と 同様な方法でマ イ ク 口 プ レー ト に コ一 ト した。 一方、 POD標識抗体は実施例 1 で得 られたぺ ブ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ーゲンペ プチ ドに対する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体（ク ロ ー ン No.4H12) を用 いて実施例 2 の方 法に従っ て調製 した。

実施例 1 ( b )で調製した ヒ ト W型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン を標準試料と して第 7表に示 した方法で検量線を 作製した （第 10図） 。

第 7 表

検 体 検量線用標準液 サ ン ブ ル 1 0 0 /ίβ 1 0 0 酵素標識抗体液 1 A O liU 1 Ο βίΙ 抗体結合マイク

2ゥエル 2ゥエル ロブレー ト 混和後 1 ゥエル当り 1 0 Ο ίώを加

〔免疫反応〕

え、 室温で正確に 6 0分間静置 洗 浄 液 1 0 0 ϋ2 1 0 Ο ァス ビレータ一で吸引し洗浄液

〔洗 净〕

3 0 0 ^で 5回洗净

1 0 0 /ϋ2 I 0 Ο ϋ

〔発 色反応〕 室温で正確に 3 0分間静置 停 止 液 1 0 0 i2 1 0 0 /ίβ

〔比 色〕 波長 4 9 2 mnで吸光度測定

第 10図で明 らかな如 く こ の サ ン ド ィ ツ チ法の定量感度 は 0.5iigf ゥ エ ルであ り 、 定量範囲は、 0.5~ 54nsZゥ ェ ルであ っ た。 また、 その時の CVは 0.3〜 6.8 %であ っ た。 こ の プ レー ト法での免疫反応は 60分間、 癸色反応 30分間 であ り 、 実施例 2 (c )に示 した ヒ ト 17型コ ラ ーゲン中央 三重ラ セ ン部分の測定 と 同様に短時間、 高惑度で ヒ ト W 型コ ラ ーゲン 7 - S ド メ イ ンの測定が可能と な っ た。

こ のサン ド ィ ツ チ法に よ る測定に よ り N0R、 LCおよび HCC息者血清中の ヒ ト 17型 7 — S ド メ ィ ン瀵度を測定 し た結杲、 NOR血清の M + 2SDを カ ッ ト オ フ値と した時、 LC お よび HCC疾患の陽性率はそれぞれ 71%、 100%であ っ た (第 8 表）。

第 8 表

(c) 回収率

IF型 コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン 5 n^Z d .度の ヒ ト 血 淸に 40~ 1280a^/ mJ2の範囲で ヒ ト 型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ ィ ン を添加 し、 上記（b)記載のマ イ ク ロ ブ レー ト を 用 いる 1 段階サ ン ド イ ッ チ法でそれ ら の回収率を調べた _c 第 11図 に示 した如 く 添加 7 — S ド メ イ ン に対す る 回収 7 - S ド メ イ ン の招関係数および回収率はそれぞれ ァ = 0.9991およ び 94.2± 14.7% ( M 土 SD) であ っ た。 こ の結 杲よ り 、 上記（b)に記載のマ イ ク ロ プ レー ト を用 いる 1 段階サ ン ド イ ッ チ法 は ヒ ト Ι コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン の特異的測定法である と言える 。

図面の箇単な説明

第 1 図は、 固相担体と し てポ リ ス チ レ ンポー ルを用い た 1 段階サ ン ド ィ ツ チ法（ビー ズ法）に よ る ペ プ シ ン可溶 化 ヒ ト 17型コ ラ ー ゲ ン の検量線であ る 。

第 2 図は、 ビー ズ法に よ り 測定 した NOR、 HCC、 LC、 CAHの各息者の血清中の免疫反応性 IV型コ ラ一ゲンぺプ チ ド濃度を示す。 図中、 横棒は Mを、 点線は NORの M + 2SDを、 〇內数値は検体数を示す。

第 3 図は ビー ズ法に よ り 測定 した HM、 LMおよ び M (—） の各患者の血清中の免疫反応性 17型コ ラ ーゲ ン澳度を示 す。 図中、 縦棒は、 M 土 SDを、 点線は、 NORの M ± 2SDを ()内数値は、 検体数を示す。

第 4 図 は、 固相担体と してポ リ ス チ レ ン マ イ ク ロ プ レ ー ト を用 いた 1 段階サン ド イ ッ チ法（プ レー ト法）に よ る ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン の検量線であ る 。

第 5 図は、 プ レー ト 法に よ り 測定 し た N0R、 HCC、 LC、 CAHおよ び CI H各患者の血清中の免疫反応性 IV型コ ラ ーゲ ン ペ プ チ ド濃度を示す。 図 中横棒は M を 、 点線 は M + 2SDを、 （）内数値は検体数を示す。

第 6 図 は標準ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト W型 コ ラ ーゲ ン べ ブ チ ド の ィ ム ノ プ ロ ッ テ ィ ン グ図であ る 。 A ： Fab ' (ク ロ 一ン No.1D3)— PODに よ る染色 B ： Fab' (ク 口一ン No.4H12) 一 PODに よ る染色。

第 7 図は ヒ 卜 血清中免疫反応物のゲル炉過パタ ー ン を 示す図であ る 。 第 8 図はボール法（ A )お よ びプ レー ト 法 (B )に よ る ヒ ト 血清への添加ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ーゲンペ プチ ドに対する 回収！？型コ ラ ー ゲ ン の相関図 を示す。

第 9 図は 3 種類のモ ノ ク ロ ー ナル抗体に対す る抗原抗 体反応の阻害率を示す図であ る 。

第 10図は ヒ ト 17型コ ラ ーゲ ン 7 — S ド メ イ ン の検量線 を示す図であ る 。 第 11図は ヒ ト 血清への添加 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン 7 - S ド メ イ ン に対す る 回収コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ ィ ン の相関図を示す。

Claims

請 求 の 範 囲

. ペ プシ ン可溶化 ヒ ト IV型コ ラ ーゲンに対する モ ノ ク ロ ーナル抗体を用 いたサン ド ィ ツ チ法に基づ く 酵素免 疫学的測定法に よ る ヒ ト 型コ ラ ーゲンの分子中央三 重ラ セ ン部位の定量法であ っ て、

(a) ペ プシ ン可溶化 ヒ ト W型コ ラ ーゲンの分子中央三 重ラ セ ン部位と 交差反応する モ ノ ク コ ーナル抗体に 酵素標識を付与 した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用 いて、 測定対象試料を希釈 して得 られる試科希釈液

Cb) ペ プ シ ン可溶化ヒ ト 型コ ラ ー ゲ ンのみに交差反 応する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を固相担体に結合させた 抗体結合固相担体

と を用 い、 上記希釈液（a )中に、 上記の抗体結合固相 担体（b )を混和 し、 上記測定対象試料中に存在する ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン と上記の酵素標識抗体な らびに上記 の固相担体に結合している抗体と において免疫反応を 行わ しめた後、 固相担体を分別 し、 その固相担体の酵 素活性を測定する こ と に よ り 、 ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン の 分子中央三重ラ セ ン部位を定量する方法。

. ヒ ト ！ ^型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン に対する モ ノ ク - ロ ーナル抗体を用いたサン ド ィ ツ チ法に基づ く 酵素免 疫学的測定法に よ る ヒ ト W型コ ラ ーゲン 7 — S ド メ イ ン の定量法であ っ て、

(a ) ペ プ シ ン可溶化 ヒ ト 17型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン と 交差反応する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体に酵素標識を 付与 し た酵素標識抗侔の緩衝液溶液を用 いて、 測定 対象試料を希釈 して得 られる 試料希釈液 と 、

( b ) ヒ ト W型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ ィ ン の み に交差反 応する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を固相担体に結合さ せた 抗体結合固相担体

と を用 い、 上記希釈液（ a )中に、 上記の抗体結合固相 担体（ b )を混和 し、 上記測定対象試料中に存在す る ヒ ト IV型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン と 上記の酵素標識抗 体な らびに上記の固相担体に結合 し てい る抗体 と にお いて免疫反応を行わ し めた後、 固栢担体を分別 し、 そ の固相担体の酵素活性を測定する こ と に よ り 、 ヒ ト IV 型コ ラ ー ゲ ン 7 — S ド メ イ ン を定量する方法。