WO1989008977A1 - Procede de culture d'organes vegetaux et recipient de culture utilise - Google Patents

Description

明 細 書 植物器官の培養法及びその培養槽

技 術 分 野

本発明は植物器官の大量培養法およびその培養槽に 関する。 '

背 景 技 術

植物組織の培養に用いる培養槽と しては、 例えは、 通気撹拌型培養槽、 ヱァ リ フ ト型培養槽が利用されて いる他、 気相培養装置 （特開昭 59-45873号公報.、 特開 昭 59- 45879号公報） 、 回転 ド ラ ム型培養槽 （H. Tanaka ら、 ノ ィ ォテク ノ ロ ジー ' ア ン ド · ノ 'ィ 才ェ ンジ二ァ リ ング、 25巻 2359ページ、 1983年） 、 ス ピ ンフ ィ ルク —型培養槽（D . J . S ty erら、 プ レナム · プレス干 lj チ ッ シ ュ 一カ ルチ ャ ー ' イ ン ' フ ォ レ ス ト ー ' ァ ン I' ' ァグリ カ ルチャー」 .、 117ページ、 1985年） などか 知られており、 主と して植物の铂胞を培養する手段と して利用されてきた。 しかし、 植物の細胞が通常数咖 以下の集塊となり、 まれに 2 〜 3 on程度の集塊を形成 する こ と もある程度 過ぎないのに対し、 植物の器官-. 例えば根、 茎葉、 植物体などを培養する と細胞と比 & してはるかに大型 生 し . 通常で cm以上 , 時：. は数十 cmにも達する 二 とがある 'で、 従来報告され いる培養槽 いずれも、培養した植物器官か塊状にな V 通気撹拌を行った場合には植物器官が強い剪断応力を 受けて生育が顕著に阻害されるので、 植物の器官を効 率良く培養することは容易ではない。 わずかに、 前記 の培養装置の中で気相培養装置、 回転ドラ ム型培地装 置、 ス ピ ンフ ィ ルター型培養樽が良好であろう と考え られている程度である。 しかし、 一般に培養槽の建設 費は非常に高価なので、 植物の器官培養のみのために 培養楦を建設することは非常に效率がわるいので、 植 物細胞と植物器官、 時には微生物の培養に対しても効 率良く使用できることが望ましい。 こ の点、 従来の培 養槽で微生物、 植物細胞、 植物器官の培養に汎用的に 利甩できる培養橹は開発されていない。

従来の培養槽を用いた場合には、 いずれの培養槽に おいても良く生育した植物器官が塊状になることが多 く、 直径数 cmから時には数十 onを超えることもある _c このように生育した植物器官は、 塊状になつた内部に まで酸素が供給されずに枯死してしまうので、 植物器 官を大量に培養する上で大きな障害になっている。 し かも、 現在までに知られている培養層では、 培養され る植物器官に対して機械的な障害を与えずに植物器官 を塊祅にならないように効率良く培養する装置は知ら れていない。

発 明 の 開 示

本発明 、 植物器官の集垸を攪拌撝'てほ · しながら 培養を行う こ とを特徴とする植物器官の培養方法及び 植物器官の集塊をほ ぐす攪拌機を設けた植物器官の培 養槽に関し、 さ らに攪拌羽根と邪魔端子とを交互に設 けたこ とを特钹とする植物器官の培養槽及び探拌羽根 5 と邪魔端子との間隙を植物器官の大きさ と した植物器 官の培養檀に関する。

図面の簡単な説明

第 1 図は本発明に用いる植物器官のほ ぐ し装置の 1 例を示す図である。

10 1 …撹拌機、 2 …端子、 3 …邪魔部材、 4 …端子-、

5 …培養槽、 6 …空気スパージヤ ー、 7 …排気管、 8 …移植口

発明を実施するための最良の形態

本発明の培養槽が第 I 図に例示される。 撹拌機 1 は I S 撹^ 子 2 を有し、 この端子は棒状 , 板状、. そ の他種 々 の細長い形状のものが用いら ήる。 端子の数は任意 でよいが槽の大きさ植物器官のほ ぐ したい程度によつ て実 ¾的に求める こ とができ る。

く し効果を高めるために邪魔部材を設ける こ とが 20 好ま し く 、 例えば第 1 図の邪魔部材 3 が設けられる。

撹拌機と邪魔部おはお互いに接触しない位置に設け られ、 空間における撹拌端子と邪魔部材の^子 4 Ο 短距難が尸しその -: し た植物器官 大き さ となる 培養檳 5 には他 Ο空気スパージ 一 ί 、 排気管 "： 、. 移植口 8等が設けられる。

かかる装置を利用して培養を行う際、 好ましく は 1 〜 5 日毎に 10〜60回 Z分の画転速度で 20分〜 5時間作 動させる。

撹拌機は橹のどこに設けてもよ く、 作動させるとき 以外培養液から離しておける構造が特に好ましく、 当 業者であればこれらの改良型培養橹を容易に設計でき る。

本発明の培養楦は植物器官の培養檳のみならず微生 物の大量培養檜として汎用的に使用することができる , 本発明の装置を用いて培養することにより植物器官 の集塊がほとんど形成されず、 かつ損傷もほとんどな く培養することができるので効率良く多量に植物器官 を培養する ことがてきる。

本発明二用いられる植物器官としてば.、 一般にシダ 類、 揼子植物、 被子植物に分類される植物の器官であ ればいずれでも用いられるが、 通常は、 葉、 茎、 芽、 生長点、 根、 球根、 胚などの植物器官があげられるが 特に大量に培養することが本質的には可能であり、 ま た大きな集塊を形成する特性を有している根や茎葉か 望ましい _n

植物器官は固体あるいは液&培養して増殖した後 . 本発明の植物器官ほく し装置を培養槽 に設置した ¾ 養装置て培養する :， もちろん、 本発明の培養装置て培 養して増殖した後に、 さ らに本発明の培養装置に移植 してさ らに培養を繰り返すこ と もでき る。 その際培養 は例えば次のよう に行なう。

植物器官を培養増殖する培地の組成は基本的には植 物組織の培養に用いる培地であればいかなる培地でも 利用する こ とができ る。 すなわち、 培地と しては、 10 〜 1008ノ 1 の糖、 0. 】 l O mg Z 1 の植物ホルモ ン額ぉ よび窒素源、 無機物、 ビタ ミ ン類などをほどよ く 舍有 する ものであれば天然または合成培地のいずれても用 いられる。

糖と しては、 シユ ーク ロース、 グルコース、 ラ ク ト ース、 マル ト 一スなどが用いられる。

植物ホルモ ン類と して 、 ォ一キ シン頻 （ 一十フ タ レ ン酢酸、 2， 4 — ジ ク ロ ロ フ ヱ ノ キ シ 酸、 ィ ン ト ール 酸、 イ ン ド一 /レ酩 など ' 、 卄 ィ ト カ イ ニ ン^ (力 イ ネチ ン、 ベン ジルァデ二 ン、 ゼァ チ ン、 4 P L'な ど）、 ジベ レ リ ン類 （主と して G A 3 , G A 4 , G a 7 なと） . ア ブサイ ジ ン酸、 エチ レ ンなどが用いられる。

窒素源と して 、 硝酸カ リ ウム、 硝酸ナ ト リ ウム、 硝酸ア ンモ ニゥ ム、 硝該カ ルシウ ム、 硫酸ア ンモニゥ 丄、、 ア ミ ノ 酸類 （グリ シ ン、 グルタ ミ ン酸、 リ ジ ン . ァスパラギン該など） 、 ノ ース ト ェキ ス 、 肉ェキ ス . ペプ ト ンなどが用いられる。

無機物と しては、 塩化カ リ ウ ム、 塩化力ルン ム 、 塩化マンガン、 塩化ニ ッケル、 塩化コ バル ト、 塩化ァ ルミ二ゥム、 塩化鉄、 硫酸マグネシゥム、 硫酸ナ ト リ ゥ ム、 硫酸ニ ッケル、 硫酸鉄、 硫酸マ ンガン、 硫酸チ タ ン、 硫酸亜鉛、 硫酸銅、 リ ン酸ニ水素ナ ト リ ウム、 リ ン酸二水素カ リ ウム、 ヨウ化カ リ ウム、 ホウ酸、 モ リ ブデン酸チ ト リ ウムなどが用いられる。

その他必要に応じて培地にビタ ミ ン Bい、 ィ ノ シ トー ル、 塩酸ピリ ドキシン、 ニコチン酸、 塩酸チア ミ ン、 ビォチンなどを加えてもよい。

具体的な培地としてはムラ シゲ · スクーグ氏培地、 リ ンスマイ ヤー . スクーグ氏培地、 ホワ イ ト氏培地、 ク ノ ップ氏培地などが用いられる。

培養 温度 10〜 35。C、 照度 0 〜 20 , 000ルク ス、 p H 3. 5 〜 8. 5で行い、 培養時間は 10〜 】 00日間であるこ とが多い _&

植物器官の一般的な培養方法ならびに本発明の方法 で植物器官をほぐ しながら培養する方法の工程を以下 に示す。

植物器官の培養には基本的には既知の方法が用いら れる。 すなわち、 一般的には次のような手嶼て植物器 官の造成、 増殖培養を行なう。 まず、 植物の葉、 茎-. 根などの組織を小片 （ 5 X 5 〜 50 X 50 mm ) に切靳し , 表面を例えば次亜塩素酸 ーダ、 エチルアルコ ール^ どで殺菌処理した後、 無菌水で良 く法う。 こ よ う に 表面殺菌した小片を滅菌固体培地に培地 2 〜1 0 m£当り 小片 1 個の割合で置床後、 1 0〜35 'Cで 20〜50日間静置 培養する と茎荬、 根などの分化組織の塊が得られる。 かく して得られる分化組織の塊を滅菌した植物組織培 養用液体培地を舍むフ ラ ス コまたは培養槽に移植し液 体培養する。 液体培地での培養は、 例えば 3 00 ^容ェ ノレレ ンマイ ヤーフ ラ スコでは 30〜 2 00 mf 程度の液体培 地と培地 1 00 mf 当り上記の組織塊を 1 〜 5個を移植し. 1 0〜 35て、 毎分 60〜 250 回転の振とう培養を行なう。 培養槽を.用いる場合は、 例えば 3 £容の培養槽を用い る場合は 1 〜 2 H. の培地と上記分化組織塊を培地 1 00 当り 1 から 5 個を培養橹に入れ、 10〜 35て で毎分 0. 5 〜 3 £ の無菌空気を通気しつつ培養する。 こ のよ う フ ラ ス コまたは培養槽による液体培養によ り移植 した分化組辙かさ らに生育して移植した量 O 2 から 20 倍に生育した ら、 生育した分化組織を 2 〜 20個 分割 してフ ラ スコあるいは培養槽を用いた液体培地に上記 の方法と同様に液体培地 1 00 当り分割した組織を液 体培地 1 OO rni当り 1 〜 5個移植して同一条件で培養す る操作を繰り返して分化組辙を増殖する。 こ のよ う な 方法を初めと して、 たとえば特閗昭 54 - 401 3 特開昭 55 1 573 4： 特開昭 ^ 1 1 831 9 . 特閒昭 61 - 36022など 既知 方法がその Cま利用でき る。

前記培養によって得ら る培養物を培養^に移植し 大量培養する。

本発明に用いる植物器官ほぐし装置の一例を第 1図 に示す _e

以下に実施例を示す。

実施例 1

ベラ ドンナの茎を約 5 cmの長さに切り、 70 %ェチル アルコールで 2分間、 次いで次亜塩素酸ナ ト リ ウム水 溶液 （有効塩素量 0. 5 % ) で 1 00分殺菌した後に 5〜 l O ramの切片に切った。 該切片を、 第 1表に示したムラ シゲ - スクーグ培地に N— ( 2 —ク ロ 口 一 4 — ピリ ジ ル） N —フ ュニル尿素を培地 1 当り 1 mgおよび寒天を 培地 1 当り 8 g の濃度で添加した培地 10 mを舍有する 直径 24 mm、 長さ 125籠の試験管に移植し、 22て、 2500 ルク ス連続照明下 30日間培養した。

培養 30日後、 生育した組織を無菌的に取り出し、 ピ ンセ ッ ト とメ スを用いて組織から発生した根のみを無 菌的に採取した。 これらの根を再度、 第 2表の組成を 有する新し く作成した培地 1 OO mf を舍有するコ二カル ビーカーに移植して、 22 で 30日間培養し、 生育した 根の塊を得た。 この根の塊をピンセ ッ ト とメスを用い て無菌的に分割し、 第 1表の培地および前記と同様の 培養方法で維代増歹-を繰り返して根のみを増范させた こ Φよう に して増殖した根を無菌的に取り出し、 ピ ン セ ' Γ とメ スを用いて組織から発生した根のみを無 ¾ 的に採取した。 これらの根を第 2表の組成のう ちシュ 一ク ロースを 60. Og に変更し、 さ らに 一ナフタ レ ン 齚酸を 0. 3 mgに変更した液体培地 8 を舍有する 10容の 本発明第 1 図の培養槽に培養檳当り コニカ ルビーカー 4 本分を移植して、 22てで 40日間第 1 図、 器官ほ ぐし 装置を 2 日に 1 回 2時間づっ毎分 30回転でほ ぐ し装置 を運転して培養した。 その結果、 根が集塊を形成する こ とな く 分枝増殖し、 培養槽全体に均一に分散して生 育し、 培養槽当り 3700g (乾燥重と して 210g) に違した これに対し、 ほ ぐ し装置を内蔵しない培養槽を用いた 場合は根が液面下に浮き上がり、 培養槽内部に充満す る形に生育し、 集塊内部の根は枯死するに至った。 根 の生育量は培養楦当り 2400s (乾燥重と して 130g) にす ぎなかつた。

(本頁以下余白、

1表 ム ラ シゲ * スク一グ改変培地 硝酸ア ンモニゥ ム 825 Dig 硝酸力 リ ゥ ム 950 nig 塩化カルシウム · 2水塩 220 nig 硫酸マグネシゥム · 7水塩 185 mg リ ン酸第一力 リ ウ ム 85 mg

· EDTA · 2水塩 18. 65 Dig 硫酸第一鉄 * 7水塩 13. S Dig ホ ウ 酸 3. 1 mg 硫酸マ ンガン · 4水塩 11. 15 mg 硫酸亜鉛 * 水塩 4. 0

U mg ヨ ウ化カ リ ウ ム 0. 415 mg モ リ ブデ ン酸ソ一タ' · 2水塩 0. 125 mg

塩化コバルト 0. 0125mg ビタ ミ ン B 1 0. 2 mg ィ ノ シ トール 50. 0 m 塩酸ピ リ ドキ シ ン 0. 25 ニコ チ ン酸 0. 25 グリ シ ン 1. 00 シ ユーク ロース 30. 0 9, 十 "タ レ ン！^ 0. i 第 2表 ム ラ シゲ ' ス ターグ ¾ϋ 硝酸ァ ンモ ニゥ ム 1,650 mg 硝酸力 リ ウ ム 1,900 Dig 塩化カルシウム · 2水塩 440 mg 硫酸マグネ シウム · 7 水塩 370 リ ン酸第一力 リ ウ ム 170 Dig

Na₂ . EDTA · 2 水塩 37. 3 mg 硫酸第一鉄 · 7 水塩 27. 8 > ホ ゥ ·酸 6. 2 mg 硫酸マ ンガン ' 4 水塩 22. 3 mg 硫酸亜鉛 · 7水塩 8. 6 rag ヨ ウィ匕カ リ ウ ム 0. 8 mg モ リ ブデ ン酸ソ一タ' · 2 水塩 0. 2 mx 硫¾第一網 0. 025 塩化コバル ト 0. 025 ビタ ミ ン B 1 0. 40 mg ィ ノ シ ト 一ル 100 mg 塩酸ピ リ ドキ シ ン 0. 50 ιη, ニコ チ ン 0. 50 グリ シ ン 0 00 シ ュ 一ク Π! —ス 30. n 産業上の利用可能性

本発明装置で植物器官を培養することにより、 従来 の培養法では集塊を形成することが多く培養効率の低 下の原因となつていた問題点が解決され、 植物器官を 培養檀内に分散させながら均一に効率よ く培養するこ とができる。 本発明の装置ば微生物の培養装置として

1

も有用である。 2

Claims

請 求 の 範 囲 . 植物器官の集塊を攪拌機でほ ぐ しなから培養を行 う こ とを特徴とする植物器官の培養方法。

. 植物器官の集塊をほ ぐす攪拌機を設けた植物器官 の培養槽。

. 攪拌羽根と邪魔端子とを交互に設けたこ とを特徴 とする植物器官の培養槽。

. 攪拌羽根と邪魔端子との間隙を植物器官の大き さ とする こ とを特徴とする請求項 2 又は 3記載の培養 槽。