WO1989010064A1 - Procede de separation de certaines proteines du lactoserum ou du lait - Google Patents

Procede de separation de certaines proteines du lactoserum ou du lait Download PDF

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WO1989010064A1
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/20—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey
    • A23J1/205—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey from whey, e.g. lactalbumine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation and fractionation of high molecular weight proteins contained in a liquid loaded with this type of protein.
  • Whey is a by-product of the cheese industry, once rejected, which we have been seeking for a few years to develop by extracting from it certain useful materials.
  • the whey contains approximately 40-80 g of dry matter per slat, these dry matter being formed of lactose, mineral matter, and nitrogenous matter of which approximately 65% by weight are formed of proteins.
  • These proteins are in turn formed, by weight, of approximately 80% of albumin, 10% of immunoglobulins and 10% of various proteins such as lactoferrin (approximately 2%) and lactoperoxidase, and are of great interest in various fields (nutrition, preparation of infant formula, etc.).
  • Various methods are already known for recovering proteins from whey or other milk derivatives.
  • FR-A-2 204 948 describes a process for obtaining a concentrate of proteins soluble in water, for example by ultra-filtering whey, then by concentrating it by passage over a chromatographic gel.
  • This prior method is a global method which does not allow the different types of proteins to be separated, unlike the method of the invention.
  • FR-A-2 103 265 describes a process for producing a protein concentrate from whey by means of successive ultrafiltration steps, optionally followed by a gel filtration step. This process is also a global process which does not aim to fractionate the different types of proteins, unlike the process of the invention.
  • FR-A-2 452 881 relates to a process for the separation and fractionation of animal or vegetable proteins by treatment of sources of such proteins, such as, for example, whey or milk, by exclusion chromatography techniques and ion exchange, the starting source being able to be pretreated by various techniques including, among others, ultrafiltration.
  • the process involves the use of several types of resins with specific properties. No fractionation function is outsourced to the ultrafiltration stage which is used only to concentrate the starting source.
  • FR-A-2 487 642 which is an addition to the previous one, relates to a process of the type of that of FR-A-2 452 881 in which the material is subjected to ultrafiltration on a membrane before or after the passage over the resins.
  • concentration factors involved are only around 5.
  • ultrafiltration is not used to separate proteins of high molar mass (greater than 50,000 daltons) from proteins of lower molar mass, peptides and amino acids.
  • the invention aims to provide such a method. More particularly, the invention relates to a process for the separation and fractionation of the proteins of high molar mass contained in a liquid loaded with this type of protein, which comprises two steps: a) an ultrafiltration step aimed at producing a retentate enriched in said proteins and a permeate containing the remainder of said liquid, and b) a step of selective fractionation of the retentate obtained in (a) on a chromatographic support, process characterized in that:
  • the ultrafiltration is carried out with a porous membrane having a cut-off threshold of at least 40,000 daltons
  • the liquid loaded with proteins to be treated by ultrafiltration has a pH of 5 to 8.5 and an ionic strength of 0.2 to 1 molar
  • the ultrafiltration is continued until a concentration factor of at least 100 is obtained.
  • the invention is particularly suited to the case where the protein-laden liquid is decasinated whey, preconcentrated or not, demineralized or not, but can also be applied to other liquids laden with proteins of high molar mass, for example demiculated milk and decasinated, preconcentrated or not, demineralized or not, or delipidated whey reconstituted by solubilization from a whey in the solid state by conventional methods.
  • the proteins contained in whey or other dairy product are differentiated by their molar mass. A distinction is thus made between: - the fraction of ⁇ -lactalbumin albumin 14,000 daltons * approximately ⁇ - lactoglobulin approximately 18,000 daltons - the fraction of immunoglobulins around 180,000 daltons
  • the dalton is the unit used to define the molar mass of a molecule. 1 dalton is equal to 1/16 the mass of an oxygen atom.
  • step (a) of ultrafiltration of the process of the invention is to separate lactose and albumin as best as possible from the immunoglobulin and lactoferrin + lactoperoxidase fractions.
  • the separation is not 100% effective since a fraction of the proteins of high molar mass crosses the membrane and a fraction of the proteins of low molar mass is nevertheless retained by the membrane.
  • the retention rate of a protein defines its propensity to be retained by a given membrane under given conditions. This rate is never, in practice, equal to 100%.
  • the ultrafiltration (a) is carried out with a semi-permeable membrane having a cut-off threshold of at least 40,000 daltons, that is to say preferentially retaining molecules of molar mass greater than
  • the membrane used will have a cutoff threshold between approximately 40,000 and 80,000 daltons.
  • the membrane used can be organic or mineral in nature.
  • the ultrafiltration (a) is carried out in at least two stages. A first stage is carried out with a first membrane up to a concentration rate of 5 to 10 for example, and a second stage is operated on the retentate obtained in the first stage with a second membrane until the final concentration rate is obtained longed for.
  • the first and second membranes can be identical or different in nature.
  • Various membranes which can be used to carry out the ultrafiltration (a) are commercially available. Mention may be made, by way of nonlimiting examples, of the organic membranes sold under the brands AMICON (GRACE group) and PLEIADE (RHONE-POULENC group) or mineral membranes sold under the brand
  • the liquid, such as whey, subjected to ultrafiltration (a) must have a pH in the range of approximately 5 to 8.5, preferably from 7 to 8.5, and an ionic strength of between 0.2 and about 1 molar.
  • the required ionic strength can be obtained by adding a suitably chosen salt, such as sodium chloride, to the liquid to be treated.
  • the ionic strength should preferably be adjusted between 0.2 and 0.5 molar.
  • Ultrafiltration (a) produces a permeate (formed mainly of water, lactose and albumin) and a retentate (formed mainly of water, immunoglobulins, lactoferrin and Iactoperoxidase).
  • the ultrafiltration (a) must be carried out under conditions leading to a final concentration factor (initial liquid ratio / volume of retentate) of at least 40 and which can reach 100 and more.
  • concentration factor initial liquid ratio / volume of retentate
  • concentration factor initial liquid ratio / volume of retentate
  • step (b) it makes it possible to obtain a retentate, concentrated in immunoglobulins, lactoferrin and Iactoperoxidase, which makes it possible to use a compact chromatography installation, therefore economical, to then carry out step (b),
  • the step of selective fractionation on a chromatographic gel of the retentate from the ultrafiltration (a) can be carried out by passing the retentate over a column packed with an appropriate chromatographic support using an eluting agent.
  • This fractionation is based on the different capacities of the molecules of the various proteins contained in the retentate to penetrate into the pores of the stationary support. Very large molecules do not penetrate the support and therefore cross the chromatographic support more quickly. The smaller molecules, on the other hand, penetrate into the chromatographic support and are eluted more slowly.
  • a chromatographic support (often called chromatographic gel) in the form of beads and whose domain of operation corresponds at least to the range of molar masses of the proteins to be separated, for example from 5,000 to 250,000 daltons.
  • chromatographic gel a chromatographic support
  • Such a support will separate the retentate into its constituents, according to their molar mass, into two or more fractions.
  • the support used will be previously balanced by a buffer of high ionic strength in order to limit the protein-protein associations, in particular to avoid the possible polymerization of the residual beta-lactoglobulins.
  • SEPHADEX G 150 crosslinked dextran
  • SEPHACRYL S200 allylic dextran crosslinked with N, N'-methylene bis-acrylamide
  • eluting agents it is possible to use, for example, TRIS (tris (hydroxymethyl) amino methane), phosphate buffer (mixture of mono- and di-sodium phosphates), etc.
  • TRIS tris (hydroxymethyl) amino methane
  • phosphate buffer mixture of mono- and di-sodium phosphates
  • Other chromatographic supports and other usable eluting agents will be obvious to those skilled in the art.
  • the eluting agent must have a pH of same order as that of the liquid to be treated.
  • a volume of sample ranging from 5 to 15% approximately of the volume of the chromatographic support contained in the column and elution rates ranging from 0.5 to 1 times approximately can be treated at each chromatographic fractionation cycle. volume of said support per hour.
  • the chromatographic technique described above is also commonly called gel filtration. It should be noted, however, that the invention is not limited to the use of this particular technique. One could, for example, use a chromatographic technique using ion exchange resins, a high pressure liquid chromatography technique, etc.
  • Figure 1 is a schematic representation of an ultrafiltration installation
  • FIG. 2 is a schematic representation of a fractionation installation on a chromatographic support
  • Figure 3 shows a typical elution diagram.
  • decasinated whey is stored in a tank 1 provided at its lower part with a sintered glass filter 2, retaining the solid particles possibly present in the whey, and feeds a peristaltic circulation pump 3 which sends the whey in an ultrafiltration module 4 comprising a membrane 5, housed in a casing 6.
  • the permeate which passes through the membrane is found in the casing and is sent to the permeate reservoir 7.
  • the retentate which is retained by the membrane gradually depletes the constituents of the permeate (mainly lactose and albumins) and is returned to tank 1 from where it can be recycled to module 4 as many times as necessary.
  • Pressure gauges 8 and 9 and a flow meter 10 make it possible to know the characteristics of the flow of the retentate. The operation is stopped when the desired intermediate concentration factor is reached (typically 5 to 10).
  • This whey contained approximately 7.5 g / l of soluble proteins, including:
  • a porous CARBOSEP mineral membrane, type Ml cutoff threshold 60-80000 daltons was used as membrane 5 and this stage was continued until a concentration factor of 5.56.
  • the permeate flow rate was stable and was maintained at 85 liters / hour / m 2 of membrane surface.
  • More than 90% of the lactoferrin present in the starting whey is found in the retentate obtained.
  • the lactoferrin and soluble protein contents of the starting whey. of the intermediate retentate and the final retentate are as follows: whey retentate initial intermediate final retentate
  • Lactoferrin * g / l 0.11 0.56 7.5
  • lactoferrin contents indicated were determined by radial immuno-diffusion. The estimated accuracy is around ⁇ 15%.
  • the soluble protein contents were deduced from the nitrogen determination by the Kjeldahl method.
  • a stability of the permeate flow rate was found to be 85 1 / h / m 2 .
  • the ultrafiltration stages are preferably carried out over a temperature range of 30 to 50 ° C to maintain the treated liquid at an appropriate viscosity.
  • a heat exchanger can be provided before entering the ultrafiltration module to maintain the temperature at an appropriate value.
  • FIG. 2 shows an installation for chromatographic fractionation of the final retentate produced by ultrafiltration.
  • This installation comprises a reservoir 11 of the retentate to be treated and a reservoir 12 of eluent connected to a three-way valve 13.
  • a peristaltic pump 14 allows a chromatographic column 15 to be supplied at will with retentate or eluent according to the setting of the valve 13.
  • Column 15 is provided with a chromatographic support or gel 16.
  • an optical detector 17 operating at 280 nanometers controlling valves 18, 19, 20 and 21 makes it possible to selectively direct the corresponding fractions at each of the peaks separated by chromatography as well as the rest eluent to tanks 22, 23, 24 and 25 respectively.
  • the detector 17 is associated with a recorder 26.
  • the column 15 had an internal diameter of 16 mm and was equipped with two adapters 27 making it possible to adjust the height of the support or chromatographic gel. This height has been adjusted to 60 cm.
  • the column was packed with a SEPHADEX G 150 chromatographic gel capable of separating molecules with a molar mass of between 5000 and 300,000 daltons.
  • the eluent used is a 0.1 M, 1 M NaCl, pH 8 TRIS buffer (tris-hydroxymethyl / amino-methane) having a high ionic strength limiting protein-protein agglomerations.
  • the chromatographic gel was previously equilibrated in a buffer of high ionic strength and pH of the same order as that of the eluent.
  • a volume of retentate to be treated was injected into the column, corresponding to 10% of the volume of the column, or approximately 12 ml.
  • the elution rate was adjusted, during three tests, to 30, 40 and 60 cm / hour (60, 80 and 120 ml of eluent / hour) which corresponded to a total cycle of 120, 90 and 60 min, respectively.
  • the separation of three fractions was obtained, namely a residual albumin fraction, a lactoferrin + lactoperoxidase fraction and an immunoglobulin fraction.
  • FIG. 3 represents a typical elution diagram showing the separation of the peaks from the various fractions.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de séparation et de fractionnement des protéines de masse molaire élevée contenues dans un liquide chargé de ce type de protéines, qui comprend une étape d'ultrafiltration visant à produire un rétentat enrichi en lesdites protéines et un perméat, effectuée avec une membrane poreuse dont le seuil de coupure est d'au moins 40 000 daltons et poursuivie jusqu'à un facteur de concentration d'au moins 40, suivie d'une étape de fractionnement sélectif dudit rétentat sur un support chromatographique. Application notamment au traitement du lactosérum.

Description

Procédé de séparation de certaines protéines du lactosérum ou du lait
L'invention concerne un procédé de préparation et de fractionnement des protéines do masse molaire élevée contenues dans un Liquide chargé de ce type de protéines.
Le lactosérum est un sous produit de l'industrie fromagère, autrefois rejeté, que l'on cherche depuis quelques années à valoriser en extrayant de celui-ci certaines matières utiles. Typiquement, le lactosérum contient environ 40-80g de matières sèches par latre, ces matières sèches étant formées de lactose, de matières minérales, et de matières azotées dont 65% en poids environ sont formées de protéines. Ces protéines sont formées à leur tour, en poids, d'environ 80% d'albumines, 10% d' immunoglobulines et 10% de protéines diverses telles que la lactoferrine (2% environ) et la lactoperoxydase, et présentent un grand intérêt dans divers domaines (nutrition, préparation de laits maternisés, etc...). On connaît déjà divers procédés visant à récupérer les protéines du lactosérum ou autre dérivé du lait.
Ainsi, FR-A-2 204 948 décrit un procédé d'obtention de concentré de protéines solubles dans l'eau, par exemple en ultra-filtrant du petit-lait, puis en le concentrant par passage sur un gel chromatographique. Ce procédé antérieur est un procédé global qui ne permet pas de séparer les différents types de protéines contrairement au procédé de l' invention.
B.N. Mathur et coll. dans le Journal of Dairy Science vol. 62, N° 1, Janvier 1979, pages 95-105, évoquent la possibilité de fractionner les protéines d'un concentré de protéines par filtration sur gel, mais sans en divulguer véritablement les modalités techniques. Si, par ailleurs, cet article mentionne l' ultrafiltration comme l' une des techniques permettant de préparer le concentré de protéines, il ne suggère nullement, de conduire l' ultrafiltration à un taux de concentration élevé, égal ou supérieur à 40 et avec une membrane dont le seuil de coupure approche celui préconisé par la présente invention.
FR-A-2 103 265 décrit un procédé de production d ' un concentré de protéines à partir de petit-lait au moyen d'étapes d'ultrafiltration successives, éventuellement suivies d'une étape de filtration sur gel. Ce procédé est aussi un procédé global qui ne vise pas à fractionner les différents types de protéines, contrairement au procédé de l'invention. FR-A-2 452 881 a trait à un procédé de séparation et de fractionnement de protéines animales ou végétales par traitement de sources de telles protéines, telles que, par exemple, le lactosérum ou le lait, par des techniques de chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions, la source de départ pouvant être prétraitée par diverses techniques incluant, entre autres, l'ultrafiltration. Le procédé implique l'emploi de plusieurs types de résines à propriétés spécifiques. Aucune fonction de fractionnement n'est impartie à l'étape d'ultrafiltration qui sert uniquement à concentrer la source de départ.
FR-A-2 487 642, qui est une addition au précédent, vise un procédé du genre de celui de FR-A-2 452 881 dans laquelle la matière est soumise à une ultrafiltration sur membrane avant ou après le passage sur les résines. Les facteurs de concentration mis en jeu sont de l'ordre de 5 seulement. Comme pour FR-A-2 452 881 l' ultrafiltration n'est pas employée pour séparer les protéines de masse molaire élevée (supérieure à 50 000 daltons) des protéines de plus basse masse molaire, des peptides et des acides aminés.
Aucun des documents antérieurs précités ne décrit donc un procédé permettant de séparer sélectivement les protéines de masse molaire élevée d'un liquide les contenant. II existe donc un besoin pour un procédé permettant une telle séparation sélective.
L'invention vise à fournir un tel procédé. Plus particulièrement, l' invention concerne un procédé de séparation et de fractionnement des protéines de masse molaire élevée contenues dans un liquide chargé de ce type de protéines, qui comprend deux étapes : a) une étape d'ultrafiltration visant à produire un rétentat enrichi en lesdites protéines et un perméat contenant le reste dudit liquide, et b) une étape de fractionnement sélectif du rétentat obtenu en (a) sur un support chromatographique, procédé caractérisé en ce que :
(i) l' ultrafiltration est effectuée avec une membrane poreuse ayant un seuil de coupure d'au moins 40000 daltons, (ii) le liquide chargé de protéines à traiter par ultrafiltration présente un pH de 5 a 8,5 et une force ionique de 0,2 à 1 molaire, et
(m) l' ultrafiltration (a) est poursuivie jusqu'à obtention d'un facteur de concentration d' au moins 40.
De préférence, l' ultrafiltration est poursuivie jusqu'à obtention d' un facteur de concentration d'au moins 100.
L'invention est particulièrement adaptée au cas où le liquide chargé de protéines est du lactosérum décaséiné, préconcentré ou non, déminéralisé ou non, mais peut également être appliquée à d'autres liquides chargés de protéines de masse molaire élevée, par exemple du lait démicellé et décaséiné, préconcentré ou non, déminéralisé ou non, ou du lactosérum délipidé reconstitué par solubilisation à partir d'un lactosérum à l'état solide par des procédés classiques. On pourrait également traiter des substances d'origine végétale ( jus de fruits par exemple) ou animale (colostrum par exemple), telles qu'obtenues ou après un prétraitement de celles-ci.
Les protéines contenues dans le lactosérum ou autre produit laitier, se différencient par leur masse molaire. On distingue ainsi : - la fraction des albumines α- lactalbumine 14000 daltons* environ β - lactoglobuline 18000 daltons environ - la fraction des immunoglobulines 180000 daltons environ
- la fraction de la lactoferrine et de la lactoperoxydase 80000 daltons environ.
* Le dalton est l'unité utilisée pour définir la masse molaire d'une molécule. 1 dalton est égal à 1/16 de la masse d'un atome d'oxygène.
L'étape (a) d'ultrafiltration du procédé de l'invention a pour but de séparer du mieux possible le lactose et les albumines des fractions immunoglobulines et lactoferrine + Iactoperoxydase. La séparation n'est toutefois pas efficace à 100% car une fraction des protéines de masse molaire élevée traverse la membrane et une fraction des protéines de masse molaire peu élevée est quand même retenue par la membrane. Le taux de rétention d'une protéine définit sa propension à être retenue par une membrane donnée dans des conditions données. Ce taux n'est jamais, en pratique, égal à 100%.
A cette fin, l' ultrafiltration (a) est effectuée avec une membrane semi-perméable ayant un seuil de coupure d'au moins 40000 daltons, cest-à-dire retenant préférentiellement les molécules de masse molaire supérieure à
40000 daltons.
Avantageusement, la membrane utilisée aura un seuil de coupure entre 40000 et 80000 daltons environ. La membrane utilisée peut être de nature organique ou minérale. Avantageusement, l'ultrafiltration (a) est conduite en au moins deux stades. Un premier stade est effectué avec une première membrane jusqu'à un taux de concentration de 5 à 10 par exemple, et un deuxième stade est opéré sur le rétentat obtenu dans le premier stade avec une deuxième membrane jusqu'à obtention du taux de concentration final désiré. Les première et deuxième membranes peuvent être de nature identique ou différente. Diverses membranes pouvant être employées pour réaliser I' ultrafiltration (a) sont disponibles dans le commerce. On peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, les membranes organiques commercialisées sous les marques AMICON (Groupe GRACE) et PLEIADE (Groupe RHONE-POULENC) ou les membranes minérales commercialisées sous la marque
CARBOSEP par la Société TECH-SEP (Groupe RHONE-POULENC).
Le liquide, tel que le lactosérum, soumis à l' ultrafiltration (a) doit présenter un pH compris dans la gamme de 5 à 8,5 environ, de préférence de 7 à 8,5, et une force ionique comprise entre 0,2 et 1 molaire environ. La force ionique requise peut être obtenue en ajoutant un sel convenablement choisi, tel que le chlorure de sodium, au liquide à traiter. Pour éviter une saveur trop salée, on règlera de préférence la force ionique entre 0,2 et 0,5 molaire. Ces conditions se sont révélées nécessaires pour éviter un phénomène de polarisation important pouvant modifier le seuil de coupure de la membrane.
L' ultrafiltration (a) produit un perméat (formé principalement d'eau, de lactose et des albumines) et un retentat (formé principalement d'eau, des immunoglobulines, de la lactoferrine et de la Iactoperoxydase). L' ultrafiltration (a) doit être conduite dans des conditions amenant un facteur de concentration final (rapport de liquide initial/volume de retentat) d'au moins 40 et pouvant atteindre 100 et plus. La seule limite imposée au facteur de concentration est que la concentration de protéines dissoutes dans le rétentat ne devienne pas si élevée qu'elle provoque la gélification du rétentat. Habituellement, la concentration limite des protéines est de l'ordre de 200-250 g/litre. Un facteur de concentration de 40 et plus représente un facteur de concentration inhabituel. Habituellement, dans les procédés antérieurs mettant en jeu une ultrafiltration, on utilise des facteurs de concentration inférieurs à 10, typiquement de 5 ou 6. Le facteur de concentration élevé utilisé dans le présent procédé offre plusieurs avantages :
- il permet d'obtenir un rétentat, concentré en immunoglobulines, lactoferrine et Iactoperoxydase, ce qui permet d'utiliser une installation de chromatographie compacte, donc économique, pour effectuer ensuite l'étape (b),
- il permet d'obtenir un enrichissement relatif important du rétentat en les protéines ayant les taux de rétention par la membrane les plus élevés.
L'étape de fractionnement sélectif sur gel chromatographique du retentat provenant de l' ultrafiltration (a) peut être conduite en faisant passer le rétentat sur une colonne garnie d'un support chromatographique approprié à l'aide d'un agent d'élution. Ce fractionnement est basé sur les capacités différentes des molécules des diverses protéines contenues dans le rétentat à pénétrer dans les pores du support stationnaire. Les très grosses molécules ne pénètrent pas dans le support et traversent donc plus rapidement le support chromatographique. Les plus petites molécules pénètrent par contre dans le support chromatographique et sont éluées plus lentement.
Pour la séparation, d'une part, de la fraction immunoglobulines et, d'autre part, de la fraction lactoferrine + Iactoperoxydase, on peut utiliser un support chromatographique (souvent appelé gel chromatographique) se présentant sous la forme de billes et dont le domaine de fonctionnement correspond au moins à la gamme de masses molaires des protéines à séparer, par exemple de 5000 à 250000 daltons. Un tel support séparera le rétentat en ses constituants, suivant leur masse molaire, en deux fractions ou plus. Le support utilisé sera préalablement équilibré par un tampon de force ionique élevée afin de limiter les associations protéines-protéines, notamment pour éviter la polymérisation éventuelle des bêta-lactoglobulines résiduelles.
Divers supports chromatographiques utilisables sont disponibles dans le commerce. A titre d'exemples non. limitatifs on peut citer, par exemple, le SEPHADEX G 150 (dextrane réticulé) et le SEPHACRYL S200 (dextrane allylique réticulé par du N,N'-méthylène bis-acrylamide).
Comme agents d'élution, on peut utiliser, par exemple, du TRIS (tris(hydroxyméthyl)amino méthane), du tampon phosphate (mélange de phosphates mono- et di-sodiques), etc.. D'autres supports chromatographiques et d'autres agents d'élution utilisables seront évidents pour l'homme du métier. L'agent d'élution doit avoir un pH du même ordre que celui du liquide à traiter.
A titre indicatif, on peut traiter a chaque cycle de fractionnement chromatographique un volume d'échantillon allant de 5 à 15% environ du volume du support chromatographique contenu dans la colonne et des débits d'élution allant de 0,5 à 1 fois environ le volume dudit support par heure. Ces conditions n'ont toutefois rien de critique et il est parfaitement à la portée de l'homme du métier de déterminer des conditions appropriées. La technique chromatographique exposée ci-dessus est également communément appelée filtration sur gel. Il y a lieu de noter, cependant, que l'invention n'est pas limitée à l'emploi de cette technique particulière. On pourrait, par exemple, avoir recours à une technique chromatographique utilisant des résines échangeuses d'ions, à une technique de chromatographie liquide haute pression, etc..
La description qui va suivre, faite en se référant au dessin annexé, fera bien comprendre l'invention. Sur le dessin :
La figure 1 est une représentation schématique d'une installation d'ultrafiltration ;
La figure 2 est un représentation schématique d'une installation de fractionnement sur support chromatographique ; et
La figure 3 représente un diagramme d'élution typique.
Sur la figure 1, du lactosérum décaséiné est stocké dans un réservoir 1 muni à sa partie inférieure d'un filtre 2 en verre fritté, retenant les particules solides éventuellement présentes dans le lactosérum, et alimente une pompe péristaltique 3 de circulation qui envoie le lactosérum dans un module 4 d'ultrafiltration comprenant une membrane 5, logée dans un carter 6. Le perméat qui traverse la membrane se retrouve dans le carter et est envoyé dans le réservoir 7 de perméat. Le retentat qui est retenu par la membrane s'appauvrit progressivement en les constituants du perméat (principalement le lactose et les albumines) et est renvoyé dans le réservoir 1 d'où il peut être recyclé au module 4 autant de fois que nécessaire. Des manomètres 8 et 9 et un débitmètre 10 permettent de connaître les caractéristiques de l'écoulement du rétentât. On arrête l'opération lorsque le facteur de concentration intermédiaire désiré est atteint (typiquement 5 à 10).
A l'aide de l'installation de la figure 1, on a traité un lactosérum fourni par un fabricant de fromage dont les caractéristiques étaient approximativement les suivantes :
- azote total : 1,21 g/l
- azote soluble 1,18 g/l
- pH 7,5 Ce lactosérum contenait environ 7,5 g/l de protéines solubles dont :
- albumines : 6 g/l
- fractions immunoglobulines 0,8 g/l
- fraction lactoferrine + Iactoperoxydase 0,12 g/l
Dans un premier stade d'ultrafiltration, on a utilisé, comme membrane 5, une membrane poreuse minérale CARBOSEP, type Ml (seuil de coupure 60-80000 daltons) et on a poursuivi ce stade jusqu'à obtention d'un facteur de concentration de 5,56. Le débit du perméat était stable et se maintenait à 85 litres/heure/m2 de surface de membrane.
Plus de 90% de la lactoferrine présente dans le lactosérum de départ se retrouvent dans le rétentat obtenu. Dans une deuxième étape d'ultrafiltration, on a utilisé comme membrane 5, un faisceau de fines fibres poreuses parallèles AMICON, type HIP 100-20 (seuil de coupure de 50000) constituées d'un polymère cellulosique de structure anisotrope et on a traité le rétentat obtenu dans le premier stade jusqu'à obtention d'un facteur de concentration volumique de 22, soit un facteur de concentration global de 22 x 5,56 = 121. Les teneurs en lactoferrine et en protéines solubles du lactosérum de départ. du rétentat intermédiaire et du rétentat final sont les suivantes : lactosérum rétentat rétentat initial intermédiaire final
Facteur de 1 5,56 121 concentration
Lactoferrine*, g/l 0,11 0,56 7,5
Protéines solubles
7,5 21,9 230 g/l
*Les teneurs en lactoferrine indiquées ont été déterminées par immuno-diffusion radiale. La précision estimée est de l'ordre de ± 15%. Les teneurs en protéines solubles ont été déduites du dosage de l'azote par la méthode de Kjeldahl.
Comme dans le premier stade, on a constaté une stabilité du débit du perméat à 85 1/h/m2. Il est à noter que les stades d'ultrafiltration sont effectués de préférence sur une plage de température de 30 à 50°C pour maintenir le liquide traité à une viscosité appropriée. Si désiré, un échangeur de chaleur peut être prévu avant l'entrée du module d'ultrafiltration pour maintenir la température à une valeur appropriée.
Sur la figure 2, on a représenté une installation de fractionnement chromatographique du rétentat final produit par l' ultrafiltration. Cette installation comprend un réservoir 11 du rétentat à traiter et un réservoir 12 d'éluant reliés à une vanne à trois voies 13. Une pompe péristaltique 14 permet d'alimenter à volonté une colonne chromatographique 15 en rétentat ou en éluant selon le réglage de la vanne 13. La colonne 15 est garnie d'un support ou gel chromatographique 16. A la sortie de la colonne 15, un détecteur optique 17 opérant à 280 nanomètres commandant des vannes 18, 19, 20 et 21 permet de diriger sélectivement les fractions correspondant à chacun des pics séparés par chromatographie ainsi que le reste d'éluant vers des cuves 22, 23, 24 et 25 respectivement. Le détecteur 17 est associé à un enregistreur 26. La colonne 15 avait un diamètre intérieur de 16 mm et était équipée de deux adaptateurs 27 permettant de régler la hauteur du support ou gel chromatographique. Cette hauteur a été réglée à 60 cm. La colonne était garnie d'un gel chromatographique SEPHADEX G 150 capable de séparer des molécules de masse molaire comprises entre 5000 et 300000 daltons. L'éluant utilisé est un tampon TRIS(tris-hydroxyméthyl/amino-méthane) 0,1 M, 1 M NaCl, pH 8 présentant une force ionique élevée limitant les agglomérations protéines-protéines. Le gel chromatographique était préalablement équilibré dans un tampon de force ionique élevé et de pH du même ordre que celui de l'éluant. On a injecté dans la colonne un volume de rétentat à traiter correspondant à 10% du volume de la colonne, soit environ 12 ml. Le débit d'élution a été réglé, au cours de trois essais, à 30, 40 et 60 cm/heure (60, 80 et 120 ml d' éluant/heure) ce qui correspondait à un cycle total de 120, 90 et 60 mn, respectivement. Dans tous les cas, on a obtenu la séparation de trois fractions, à savoir une fraction albumines résiduelles, une fraction lactoferrine + Iactoperoxydase et une fraction immunoglobulines. La figure 3 représente un diagramme d'élution typique montrant la séparation des pics des diverses fractions.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un procédé de séparation et de fractionnement des protéines de masse molaire élevée contenues dans un liquide chargé de ce type de protéines, qui comprend deux étapes : a) une étape d'ultrafiltration visant à produire un rétentat enrichi en lesdites protéines et un perméat contenant le reste dudit liquide, et b) une étape de fractionnement sélectif du retentat obtenu en (a) sur un support chromatographique, procédé caractérisé en ce que : (i) l' ultrafiltration est effectuée avec une membrane poreuse ayant un seuil de coupure d'au moins 40000 daltons, (ii) le liquide chargé de protéines à traiter par ultrafiltration présente un pH de 5 à 8,5 et une force ionique de 0,2 à 1 molaire, et
(iii) l' ultrafiltration (a) est poursuivie jusqu'à obtention d'un facteur de concentration d'au moins 40.
2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l' ultrafiltration est poursuivie jusqu'à obtention d'un facteur de concentration d'au moins 100.
3. Un procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le liquide chargé de protéines a un pH de 7 à 8,5.
4. Un procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le liquide chargé de protéines est du lactosérum.
5. Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le lactosérum est préalablement concentré.
6. Un procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le lactosérum est préalablement décaséiné.
7. Un procédé selon la revendication 3, 4, 5 ou 6, caractérisé en ce que le lactosérum n'est pas déminéralisé.
8. Un procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le liquide chargé de protéines est un lactosérum délipidé reconstitué par solubilisation, à partir d'un lactosérum mis à l'état solide par des procédés classiques.
9. Un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'étape d'ultrafiltration est conduite en au moins deux stades.
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