WO1991015239A1 - Anticorps purifies specifiquement diriges contre les lipopolysaccharides (lps) des bacteries gram negatif - Google Patents

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WO1991015239A1
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antibodies
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lipopolysaccharides
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Bertrand Basuyaux
Alain Laroze
Anne Trincot
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FONDATION NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE
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FONDATION NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Gram-negative bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to purified antibodies specifically directed against the lipopolysaccharides (LPS) of gram-negative bacteria.
  • LPS lipopolysaccharides
  • LPS lipopolysaccharides
  • the LPS structure of all gram negative bacteria can be schematized as well. They all have a structure consisting of a lipid part, lipid A, which is largely responsible for the toxic effects of LPS. This lipid A is attached to a core by a trisaccharide 2-keto-3-deoxyoctonate or KDO. On the nucleus, whose polysaccharide structure is common to all LPS, are linked side chains or polysaccharide sequences which preserve each antigenic specificity.
  • Such a preparation could be available in a lyophilized form, suitable for long storage. Finally, the administration of this preparation intravenously would allow the injection of a large amount of active product with limited loss in the body.
  • the object of the present invention is precisely to meet this objective. It aims to develop preparations rich in specific immunoglobulins for therapeutic uses and particularly useful for preventing septic shock in human clinics.
  • the technique used according to the invention for preparing these anti-LPS antibodies, in a purified form consists of an immunoaffinity chromatography and implements an immobilization of LPS antigens on a support.
  • the present invention relates to purified antibodies specifically directed against the lipopolysaccharides (LPS) of gram negative bacteria, characterized in that they are purified from a medium containing them by an immunoaffinity chromatography step using insolubilized LPS antigens, immunoaffinity support essentially comprising the lipid A fraction and the nucleus of LPS 2 common to many lipopolysaccharides of gram negative bacteria, and in that after separation of the antibodies by immunoaffinity, a continuous enrichment of these antibodies is obtained in order to obtain a fraction rich in IgM.
  • LPS lipopolysaccharides
  • LPS lipopolysaccharides
  • They may be purified antibodies specifically directed against the lipopolysaccharides (LPS) of gram negative bacteria, characterized in that they are obtained with an enrichment factor greater than 500 and preferably greater than 750, in particular performing an immunoaffinity chromatography of anti-LPS antibodies present in biological fluids, said chromatography employing the fixing of said antibodies to LPS antigens immobilized on a support.
  • LPS lipopolysaccharides
  • enrichment factor is intended to denote the ratio of anti-LPS antibody activity per mg or g of proteins or immunoglobulins of the eluate to anti-LPS antibody activity per mg or g of proteins or immunoglobulins of the biological fluid d 'origin.
  • the media containing these antibodies are preferably biological fluids which can be from various sources, in particular human plasmas or sera or even animal plasmas or sera. These may in particular be fractions enriched with IgM, in this case, the final purification step will not necessarily be necessary.
  • the biological liquids used have been previously selected by an ELISA method for their anti-LPS specificity. This method, well known to those skilled in the art, will not be explained here in detail.
  • the immunoaffinity chromatography used according to the invention therefore relies on the use of insoluble LPS antigens which retain the immunoglobulins of the mixture directed against them. These immunoglobulins are then recovered after dissociation of the antigen-antibody complexes.
  • the originality of the proposed technique lies in the transformation of the hydroxy groups of the LPS into very reactive aldehyde groups which allow coupling either directly on a resin carrying hydrazine or amino functions (aminohexyl sepharose, hydrazide of adipic acid sepharose, lysine sepharose, gelatin sepharose) or on a protein, for example albumin of human or animal origin, which will itself be coupled to an activated resin, from sepharose activated to cyanogen bromide for example.
  • This method thus has the advantage of leaving accessible the lipid A of the LPS, that is to say the antigenic part common to all the LPS.
  • the immunoglobulins present in the biological fluid to be purified are therefore retained by these LPS antigens.
  • the antibodies attached to the antigens are then washed so as to eliminate most of the molecules which do not recognize the antigen and then recovered by dissociation of the antigen-antibody complexes.
  • This dissociation step, the eution, is an important step in immunopurification.
  • the elution is most often carried out using a chemical agent, which modifies the physicochemical properties of the solution, thus allowing the dissociation of the antigen-anti ⁇ body complexes, without however altering the biological properties of the antigens and specific antibodies.
  • the pH must be sufficiently acid to guarantee a good elution yield, but not too acidic so as not to be detrimental to the antibodies. It will preferably be of the order of 2.5. It is thus possible to use glycine-HCl and sodium acetate buffers.
  • the LPS antigen immobilized on the support comes from a mutant of a gram negative bacterium, devoid of polysaccharide side chains and consisting only of lipid A and of a nucleus common to many lipopolysaccharides of gram negative bacteria. This mutant thus has antigenic properties common to many LPS.
  • mutant 35 is used, the structure of which is as follows:
  • This E. Coli mutant 35 does not have an O-specific chain and, on the other hand, its nucleus is simplified. It is therefore an antigenic determinant common to many natural LPS and recognizes the antibodies directed against lipid A and the nucleus.
  • the present invention relates more particularly to compositions based on IgM, in particular anti-LPS IgM from gram negative bacteria directed against the lipid A fragment - nucleus of LPS common to many LPS of bacteria.
  • IgM anti-LPS IgM from gram negative bacteria directed against the lipid A fragment - nucleus of LPS common to many LPS of bacteria.
  • the following examples demonstrate that the therapeutic activity is essentially carried by IgM.
  • the anti-LPS antibodies which are the subject of the present invention can be administered to animals and / or to humans, alone or in combination with another compound in a pharmaceutical composition. They are particularly useful in the prevention or treatment of endotoxin shock.
  • the present invention therefore also relates to pharmaceutical compositions containing at least as active principle, anti-LPS antibodies according to the invention.
  • FIG. 1 describes the anti-LPS activity of a concentrate of purified anti-LPS antibodies, object of the present invention.
  • LPS The chemical reactivity of LPS was made possible by oxidative cleavage to sodium periodate of the alphadiols carried by KDO (the trisaccharide 2-keto-3-deoxyoctonate, connecting the nucleus and lipid A) and the oses of the nucleus (heptosis and glucose ), with the formation of aldehyde functions (Malprade reaction).
  • KDO the trisaccharide 2-keto-3-deoxyoctonate, connecting the nucleus and lipid A
  • oses of the nucleus heptosis and glucose
  • aldehyde functions can condense on amino or hydrazine functions (Schiff reaction) originating either from a chromatographic support (for example hydrazide
  • REPLACEMENT SHEET Sepharosis REPLACEMENT SHEET Sepharosis
  • a protein bovine serum albumin
  • the imine function formed can then be stabilized by reduction with sodium borohydride or sodium cyanoborohydride.
  • 25 ml of gel are washed on sintered glass with, first, 1 liter of PPI water, then 500 ml of 100 mM acetate buffer pH5.
  • the washed and drained gel, 11 ml of activated LPS solution and about 80 ml of acetate buffer are introduced into a 250 ml glass vial.
  • the tube is shaken for 24 hours at room temperature in the dark.
  • the gel is then drained and washed on sintered glass successively with 200 ml of acetate buffer and 200 ml of a 2M NaC solution and then equilibrated in 100 mM phosphate buffer pH 7.5.
  • the test was carried out on an IBF 25 column containing 30 ml of the above-mentioned gel.
  • the chromatographic system consists of:
  • a peristaltic pump (Giison, type minipuls 2),.
  • a UV detector DO: 280 nm (Pharmacia, S.P.M. UV-1), equipped with an HR-10 cell,.
  • a recorder (Pharmacia, REC-482).
  • REPLACEMENT SHEET washing the gel with 150 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5,
  • the source to be purified is human plasma (600 ml) selected by ELISA method for its anti-LPS specificity. This plasma is diluted to half in 0.1 M phosphate buffer pH 7.5 (ie 1,200 ml total).
  • the 1200 ml of diluted plasma (25 g / l " of protein, titer in ELISA at l / 53 e ) were injected into the column at a flow rate of 60 ml per hour, ensuring a residence time of 30 minutes. washing with
  • An immunochemistry Analyzer ICS-II Beckman is used. This device measures the intensity of the light deflected by particles suspended in a detection cell. These 0 particles come from the immunoprecipitation reaction between the antigen that we want to assay, and the antibody. Depending on the calibrator and the antibody used, the classes of human immunoglobulins, G, A, or M, human albumin or transferrin can be determined. The accuracy is around 5% at the center of the range, 10% at low concentrations. - Determination of the protein concentration of the eluate.
  • the concentration was evaluated using the assay by BCA (bicinchoninic acid) (Kit PIERCE).
  • BCA-Cu + is soluble in water and shows a strong absorbance at 562 nm.
  • the assay is carried out as follows:
  • REPLACEMENT SHEET 0.2 M is added to 0.1 ml of dosing solution or 0.1 ml of sample dilution buffer for the blank + 2 ml of reagent, the whole is stirred, incubated for 2 hours at room temperature or 30 minutes at 37 ° C then revealed at 562 nm against the reading blank;
  • the enzymatic activity is revealed by adding orthophenyiene diamine in H 2 0 ⁇ 0.03% (Pasteur Diagnostics) for 20 minutes at room temperature in the absence of light (100 ⁇ l of substrate per well); the enzymatic reaction is stopped by adding H-SO ⁇ 4N (50 ⁇ l per well). The optical density of each well is determined at 492 nm, using an ELISA microplate reader (Molecular Devices, Vmax).
  • Example 2 Preparation and characterization of a concentrated mixture of human plasma IgG and IgM directed against LPS
  • the immunoglobulin classes G, M and A are determined by nephelometry using a Beckman IC5-11 immunochemical analyzer.
  • E Coli OR I B 4, Salmonella Minnesota R5, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa (Sigma).
  • the concentration of the IgG, IgM and IgA classes in the anti-LPS mixture is 6.1, 3.1, and 0.9 g / 1 respectively.
  • the anti-LPS mixture recognizes the LPS of the 4 wild strains tested (Table 2).
  • the titers measured for the LPS of wild strains are slightly lower than that obtained with respect to the mutant strain E
  • REPLACEMENT SHEET Coli 35 This is explained, on the one hand by the method of preparation of these antibodies, immunopurified on immobilized E Coli 35, on the other hand by the fact that these antibodies can only bind to the nucleus of LPS, which is more or less accessible depending on the importance of the polysaccharide side chains on the LPS of wild strains.
  • the Polygamma product also recognizes the LPS of the strains used; but in the present case all the antibodies are taken into account, both those directed against the nucleus and those directed against the side chains.
  • the bacteriophage ⁇ X 174 virus holds its infectivity with respect to the E Coli host for the specific recognition of the lipopolysaccharides of the walls of E Coli in the presence of Ca2 + ions (AM FIELD, E. ROWAIT and RJP WILLIAMS in Biochem 3 263, 695-702 (1989)
  • a FIELD, E. ROWAIT and RJP WILLIAMS in Biochem 3 263, 695-702 (1989) We have therefore implemented this property in an assay for inhibition of multiplication of viruses 0 X 174 by adding immunoglobulins having an anti-LPS titer of E Coli.
  • the phage titration is made by decimal dilutions of the primary virus stock in the diluent containing the sensitive strain
  • the dilutions are incubated in the presence of liquid surface agar, then poured onto the Petri dishes containing the nutritive agar in depth.
  • the dishes are read according to the number of lysis plaques obtained.
  • REPLACEMENT SHEET Titers are expressed in range forming units (PFU / ml).
  • the activity of the concentrated anti-LPS IgG / IgM immunopurified mixture was evaluated on this model in comparison with that of polyvalent intravenous immunoglobulins (Polygamma from BIO Transfusion).
  • the activity inhibiting the multiplication of phages ⁇ x 174 as a function of the concentration of the mixture of IgG / IgM anti LPS is expressed in Table 4.
  • TNF is therefore a good marker for the action of endotoxins.
  • the murine peritoneal macrophages are taken from 3 BALB / C mice having received 0.5 ml of complete Freund's adjuvant 7 days previously intraperitoneally.
  • 5 ml of complete medium RPMI 1640 supplemented with glutamine, antibiotics and ultrose HY 1% (v / v) (IBF) are injected into the peritoneal cavity of each mouse, then re-aspirated and mixed.
  • the cell pellet is resuspended in the complete medium. Approximately 10 million cells are obtained, including 60 million macrophages.
  • a solution adjusted to ⁇ o macrophages per ml (2.5 ⁇ 10 peritoneal cells / ml) in the complete medium is prepared, 100 ⁇ l of this solution are distributed in wells of microplates (96 wells). After incubation for 3 hours at 37 ° C. in the CO ⁇ incubator, the supernatants are eliminated: only the macrophages remain adsorbed on the bottom of the microwells. 100 ⁇ l of antibody to be tested are then added (or 100 ⁇ l of complete medium alone) diluted in the medium
  • REPLACEMENT SHEET complete then 100 ⁇ l of LPS also diluted in complete medium. Three wells are dedicated by dilution of antibodies and by dilution of LPS.
  • the supernatants are removed: the 3 supernatants from each "situation" are mixed so as to have enough volume to be assayed by ELISA.
  • the supernatants are then frozen at -40 ° C and the TNF alpha assay is carried out offline.
  • the assay of murine TNF alpha is carried out using ELISA milk produced by GENZYME Laboratories and marketed by the company TEBU. This is a sandwich type assay with a monoclonal hamster anti-TNF alpha murine antibody adsorbed on the microplates. After incubation with TNF alpha, incubate with goat anti-murine TNF alpha poiyclonal antibodies.
  • these immunopurified antibodies on immobilized E. Coli 35 are capable of very effectively neutralizing in an in vitro biological evaluation system the action of LPS of wild strains.
  • These antibodies thus clearly show their potential interest in the prevention and / or treatment of endotoxin shock.
  • the Polygamma product only partially inhibits the action of LPS, and this at doses at least 100 times greater than those of the immunopurified anti-LPS mixture.
  • the concentrated mixture of IgM / IgG obtained and described previously (Example 2) is reconcentrated in a volume of 4 ml before being chromatographed by molecular sieving on ACA 34 gel (IBF).
  • the immunoglobulin classes (G, M, A) are determined by nephelometry.
  • IgG and IgA are 9, 0.7 and 1 g / 1 for the IgM concentrate, and 0.8, 12.5 and 0.4 g / 1 for the IgG concentrate.
  • the prepared anti-LPS IgM and IgG recognize in ELISA the LPS of the 4 wild strains tested. In appearance, IgGs seem to show a slightly higher titer, but given the fact that IgMs cannot bind to the solid phase adsorbed antigen by all of its binding sites, it is difficult to draw a conclusion more precise.
  • the anti-LPS IgM preparation very significantly and dose-dependent inhibits the action of LPS E. Coli 35 and E. Coli 055: B5.
  • Anti-LPS IgMs are thus able to very effectively neutralize the action of LPS of wild-type strains in an in vitro biological evaluation system. IgMs thus clearly show their potential interest in the prevention and / or treatment of endotoxin shock.
  • the neutralizing activity of anti-LPS polyclonal IgMs is much higher than that of polyclonal IgGs, perhaps due to the high molecular weight of the IgMs and the numerous sites of binding of the antigen present on the IgM, thus allowing IgM to effectively trap LPS which are fairly large structures.

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Abstract

La présente invention concerne des anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram négatif, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus en une étape avec un facteur d'enrichissement supérieur à 500 et de préférence supérieur à 750 en réalisant une chromatographie d'immunoaffinité des anticorps anti-LPS présents dans des liquides biologiques, ladite chromatographie mettant en oeuvre la fixation desdits anticorps sur des antigènes LPS immobilisés sur un support. La présente invention se rapporte également aux compositions pharmaceutiques contenant lesdits anticorps.

Description

ANTICORPS PURIFIES SPECIFIQUEMENT DIRIGES CONTRE LES LIPOPOLYSACCHARIDES (LPS) DES BACTERIES GRAM NEGATIF
La présente invention se rapporte à des anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram-négatif.
La surface de la membrane externe des bactéries à gram négatif est essentiellement constituée de lipopolysaccharides ou LPS. La libération de ces LPS dans l'organisme humain, accrue par l'utilisation d'antibiotiques, induisant la libération d'endotoxines à partir de bactéries tuées, provoque des chocs graves voire mortels (80 000 morts aux Etats-Unis chaque année). En effet, parmi les actions biologiques des LPS on peut citer :
- une toxicité qui peut être mortelle, - une modification de la régulation thermique,
- des troubles circulatoires etc.
- des modifications leucocytaires.
Peu de traitements existent à l'heure actuelle pour éviter ces chocs endotoxiniques, ce qui incite de nombreuses équipes à s'intéresser à toute substance pouvant jouer un rôle antagoniste à l'action de ces LPS.
La structure des LPS de toutes les bactéries gram négatif peut être schématisée ainsi. Elles présentent toutes une structure constituée d'une partie lipidique, le lipide A, responsable en grande partie des effets toxiques des LPS. Ce lipide A est rattaché à un noyau (core) par un trisaccharide le 2-céto-3-desoxyoctonate ou KDO. Sur le noyau, dont la structure polysaccharide est commune à tous les LPS, sont liées des chaînes latérales ou séquences polyosidiques qui conservent à chaque souche sa spécificité antigénique.
Des souches mutantes, dites rugueuses, ne synthétisent pas ces chaînes latérales. Leurs LPS possèdent des propriétés antigéniques dues uniquement au lipide A et au noyau.
Puisque la plupart des effets toxiques de l'endotoxine sont à associer à ia partie lipidique A du LPS, il a été envisagé qu'une immunisation avec des mutants rugueux des bactéries gram négatif permettrait d'obtenir des anticorps susceptibles d'éviter les chocs endotoxiniques d'une grande variété d'organismes gram négatif.
FEUILLE DE REMPLACEMENT Les anticorps dirigés contre les LPS de ces souches rugueuses seraient dirigés contre la plupart des LPS bactériens.
E. Ziegler, aux U.S.A., a montré, dès 1985, que l'injection de plasma de sujets vaccinés par le LPS de la souche 35 de E. Coli (structure commune à toutes les bactéries gram négatif, responsable du choc septique mais sans danger pour les sujets vaccinés) entraînait une réduction significative, non pas des infections bactériennes elles-mêmes, mais des chocs septiques et de la mortalité. Toutefois, des immunoglobulines intraveineuses (obtenues par fractionnement de Cohn et traitées à la pepsine à pH 4), n'ont pas montré leur efficacité dans le traitement des chocs (le travail de Baumgartner à Lausanne : colloque à Amsterdam, 1988). En revanche, dans les études expérimentales animales, des immunoglobu¬ lines préparées à partir de plasmas sélectionnés pour leur titre en anti-LPS ont pu prévenir l'infection bactérienne chez des animaux infectés (GAFFIN et al. : Vox Sanguinis 48, 276-83, 1985).
Toutefois, pour des raisons pratiques qui sont principalement dues à des difficultés d'approvisionnement, de stockage et d'administration, l'antisérum dirigé contre E. coli 35 n'est pas approprié pour une utilisation clinique à grande échelle. En revanche, une préparation d'immunogiobulines purifiées, obtenue à partir d'un pool de plasmas de volontaires naturelle¬ ment immunisés, offrirait, elle, de nombreux avantages.
Tout d'abord, une telle préparation pourrait être disponible sous une forme lyophilisée, appropriée à une longue conservation. Enfin, l'administration de cette préparation par voie intraveineuse permettrait l'injection de quantité importante en produit actif avec une perte limitée dans l'organisme.
Le but de la présente invention est précisément de répondre à cet objectif. Il vise à élaborer des préparations riches en immunoglobulines spécifiques pour des utilisations thérapeutiques et utiles tout particulière- ment pour prévenir le choc septique en clinique humaine.
La technique utilisée selon l'invention pour préparer ces anticorps anti-LPS, sous une forme purifiée, consiste en une chromatogra¬ phie d'immunoaffinité et met en oeuvre une immobilisation d'antigènes LPS sur un support.
FEU.LLE DE REMPLACEMENT Des techniques de couplage d'antigènes LPS sur des supports ont certes déjà été décrites. Toutefois aucune d'entre elles n'est réellement satisfaisante.
Il a ainsi déjà été réalisé le couplage des antigènes LPS par l'intermédiaire de leurs fonctions hydroxyies sur des fonctions époxy du support. à pH très basique et donc dans des conditions dénaturantes pour les LPS, ce qui rend la capacité de tels supports très faible voire inexploitable. (R.B. FICK et al. 3. of Immunol. Method. 38 : 103-1 16 (1980) ; 3. FOX et al. Infection and Immunity 2_0, 3 867-868 ( 1978)).
10 De même, le couplage des antigènes LPS a été effectué par les fonctions aminés du ligand sur un support activé comportant des fonctions cyanates et/ou imidocarbonates (gel sépharose activé au bromure de cyanogène). (E. RODAHL et ai., Acta. pat. microbiol. immunol. scand. sect C, 92 : 247-254 ( 1984)). Or, les LPS contenant très peu de fonctions ** *' aminés disponibles, ils se couplent difficilement à ce type de gel.
L'originalité de la technique utilisée selon la présente invention et décrite plus en détail ci-après permet, elle, d'assurer de manière efficace le couplage des antigènes LPS au support.
C'est pourquoi la présente invention concerne des anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram négatif, caractérisés en ce qu'ils sont purifiés à partir d'un milieu les contenant par une étape de chromatographie d'immunoaffinité utilisant des antigènes LPS insolubilisés, support d'immunoaffinité comportant essentiellement la fraction lipide A et le noyau des LPS 2 communs à de nombreux lipopolysaccharides de bactéries gram négatif, et en ce que après séparation des anticorps par immunoaffinié on réalise un continuel enrichissement de ces anticorps pour obtenir une fraction riche en IgM.
Il peut s'agir d'anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre -'- les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram négatif, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus avec un facteur d'enrichissement supérieur à 500 et de préférence supérieur à 750, en réalisant une chromatographie d'immuno¬ affinité des anticorps anti-LPS présents dans des liquides biologiques, ladite chromatographie mettant en oeuvre la fixation desdits anticorps sur des antigènes LPS immobilisés sur un support.
FEUILLE DE REMPLACEMENT Par facteur d'enrichissement, on entend désigner le rapport activité anticorps anti-LPS par mg ou g de protéines ou d'immunoglobulines de l'éluat sur activité anticorps anti-LPS par mg ou g de protéines ou d'immunoglobulines du liquide biologique d'origine.
Les milieux contenant ces anticorps sont de préférence des liquides biologiques qui peuvent être de sources variées en particulier des plasmas ou sérums humains ou encore des plasmas ou sérums d'animaux. Il peut s'agir en particulier de fractions enrichies en IgM, dans ce cas, l'étape de purification finale ne sera pas forcément nécessaire.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les liquides biologiques utilisés ont été au préalable sélectionnés par une méthode ELISA pour leur spécificité anti-LPS. Cette méthode bien connue de l'homme du métier ne sera pas explicitée ici en détail.
La chromatographie par immunoaffinité mise en oeuvre selon l'invention repose donc sur l'utilisation d'antigènes LPS insoiubilisés qui retiennent les immunoglobulines du mélange dirigées contre eux. Ces immunoglobulines sont ensuite récupérées après dissociation des complexes antigène-anticorps.
L'originalité de la technique proposée tient à la transforma- tion des groupements hydroxyies du LPS en groupements aldéhydes très réactifs qui permettent un couplage soit directement sur une résine portant des fonctions hydrazines ou aminés (aminohexyl sépharose, hydrazide d'acide adipique sépharose, lysine sépharose, gélatine sépharose) soit sur une protéine, par exemple l'albumine d'origine humaine ou animale, qui sera elle-même couplée sur une résine activée, du sépharose activé au bromure de cyanogène par exemple.
Cette méthode a ainsi l'avantage de laisser accessible le lipide A des LPS, c'est-à-dire la partie antigénique commune à tous les LPS. Les immunoglobulines présentes dans le liquide biologique à purifier sont donc retenues par ces antigènes LPS. Les anticorps fixés aux antigènes sont ensuite lavés de façon à éliminer la plupart des molécules ne reconnaissant pas l'antigène puis récupérés par dissociation des complexes antigène-anticorps.
FEUILLE DE REMPLACEMENT Cette étape de dissociation, l'éiution, est une étape importante de l'immunopurification. L'éiution est le plus souvent réalisée à l'aide d'un agent chimique, qui modifie les propriétés physico-chimiques de la solution, permettant ainsi la dissociation des complexes antigènes-anti¬ corps, sans pour autant altérer les propriétés biologiques des antigènes et des anticorps spécifiques.
L'éiution à pH acide est la plus utilisée. Le pH doit être suffisamment acide pour garantir un bon rendement d'élution mais pas trop acide pour ne pas être préjudiciable aux anticorps. Il sera de préférence de l'ordre de 2,5. On peut ainsi utiliser des tampons glycine-HCl et acétate de sodium.
De préférence, l'antigène LPS immobilisé sur le support provient d'un mutant d'une bactérie gram négatif, dépourvu de chaînes latérales polyosidiques et constitué uniquement de lipide A et d'un noyau commun à de nombreux lipopolysaccharides de bactéries de gram négatif. Ce mutant possède ainsi des propriétés antigéniques communes à de nombreux LPS.
Il peut ainsi s'agir du mutant 35 d'E. coli O 11 1 ou du mutant Re de Salmonella minnesota 595.
Selon un mode privilégié de l'invention, on utilise le mutant 35 dont la structure est la suivante :
Glc — Hep- -Hep- • KDO- •Lipide A
GlcNAc KDO
Glc •KDO
Ce mutant 35 d'E.Coli ne présente pas de chaîne O-spécifi- que et, son nucleus est d'autre part simplifié. Il est de ce fait un déterminant antigenique commun à de nombreux LPS naturels et reconnaît les anticorps dirigés contre le lipide A et le noyau.
FEUILLE DE REMPLACEMENT A la fin de la chromatographie par immunoaffinité, l'ensemble de l'activité anti-LPS se trouve alors concentré dans l'éluat : en une seule étape il est ainsi possible de purifier les anticorps d'un facteur d'environ 500 à 1 000 fois.
La présente invention concerne plus particulièrement les compositions à base d'IgM, notamment les IgM anti-LPS de bactéries gram négatif dirigés contre le fragment lipide A - noyau des LPS communs à de nombreux LPS de bactéries. En effet, les exemples suivants démontrent que l'activité thérapeutique est essentiellement portée par les IgM.
Compte tenu de leur pureté protéique, les anticorps anti-LPS, objets de la présente invention peuvent être administrés à l'animal et/ou à l'homme, seuls ou en combinaison avec un autre composé dans une composition pharmaceutique. Ils sont tout particulièrement utiles dans la prévention ou le traitement des chocs endotoxiniques.
La présente invention se rapporte donc également aux compositions pharmaceutiques contenant au moins à titre de principe actif, des anticorps anti-LPS selon l'invention.
Les exemples et figures donnés ci-après, à titre non limitatif, permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
La figure 1 décrit l'activité anti-LPS d'un concentré d'anticorps anti-LPS purifiés, objet de la présente invention.
Exemple 1 t Immunopurification d'anticorps anti-LPS
1) Matériel et méthodes
1.1. Préparation du support
La réactivité chimique des LPS a été rendue possible par clivage oxydatif au periodate de sodium des alphadiols portés par le KDO (le trisaccharide 2-ceto-3-désoxyoctonate, reliant le nucleus et le lipide A) et les oses du nucleus (heptose et glucose), avec formation de fonctions aldéhydes (réaction de Malprade). Ces fonctions aldéhydes peuvent se condenser sur des fonctions aminés ou hydrazines (réaction de Schiff) provenant soit d'un support chromatographique (par exemple hydrazide
FEUILLE DE REMPLACEMENT Sépharose), soit d'une protéine (albumine sérique bovine). La fonction imine formée peut être ensuite stabilisée par réduction au borohydrure de sodium ou au cyanoborohydrure de sodium.
5 a) Activation des LPS E.Coli 35
Dans un tube Falcon 50 ml (Becton Dickinson) en polypro- pylène, sont introduits successivement 35 mg de LPS E. Coli 35 (List Biological Laboratories) en solution dans de l'eau pour préparations injectables (soit environ 8 micromoles) et 0,35 ml d'une solution de 2, 15 g ° de NalO. dans 100 ml d'eau PPI (soit 35 micromoles). Le tube est ensuite agité 24 heures, dans l'obscurité et à température ambiante.
b) Couplage des LPS sur gel d'Hydrazide d'Acide Adipique-Sépharose
25 ml de gel sont lavés sur verre fritte avec dans un premier temps, 1 litre d'eau PPI, puis 500 ml de tampon acétate 100 mM pH5. Dans un flacon de 250 ml en verre, on introduit le gel lavé et essoré, les 1 1 ml de la solution de LPS activés et environ 80 ml de tampon acétate. Le tube est agité 24 heures, à température ambiante dans l'obscurité.
Le gel est ensuite essoré et lavé sur verre fritte successive¬ ment avec 200 ml de tampon acétate et 200 ml d'une solution de NaC l 2M puis équilibré en tampon phosphate 100 mM pH 7,5.
1.2. Essai d'immunopurification
a) Chromatographie
L'essai a été réalisé sur une colonne IBF 25 contenant 30 ml de gel susmentionné. Outre la colonne, le système chromatographique se compose de :
. une pompe péristaltique (Giison, type minipuls 2), . un détecteur UV, DO : 280 nm (Pharmacia, S.P.M. UV-1), équipé d'une cellule HR-10, . un enregistreur (Pharmacia, REC-482).
Avant l'injection de la source d'anticorps dans la colonne, un essai à blanc est effectué :
FEUILLE DE REMPLACEMENT . lavage du gel avec 150 mi de tampon phosphate 0,1 M pH 7,5,
. lavage du gel avec 150 mi de tampon glycine-HCl 0, 1 M pH 2,5,
. rééquilibrage du gel avec 150 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7,5.
La source à purifier est du plasma humain (600 ml) sélectionné par méthode ELISA pour sa spécificité anti-LPS. Ce plasma est dilué au demi dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5 (soit 1 200 ml total).
Les 1 200 ml de plasma dilué (25 g/l" de protéines, titre en ELISA au l/53e) ont été injectés dans la colonne à un débit de 60 ml par heure, assurant un temps de séjour de 30 minutes. Après lavage avec du
10 tampon phosphate 0,1 M pH 7,5, les anticorps spécifiques sont élues par du tampon glycine-HCl pH 2,5. L'éluat est neutralisé extemporanément avec 5 ml de tampon phosphate 0,5 M pH 7,5.
b) Suivi analytique - -" - Dosages des classes d'immunoglobulines G, M et A dans l'éluat.
Ils sont effectués par néphelémétrie.
On utilise un analyseur immunochimique (Immunochemistry Analyser ICS-II Beckman). Cet appareil mesure l'intensité de la lumière déviée par des particules en suspension dans une cellule de détection. Ces 0 particules proviennent de la réaction d'immunoprécipitation entre l'antigène que l'on veut doser, et l'anticorps. Selon le caiibrateur et l'anticorps utilisés, on peut doser les classes d'immunoglobulines humaines, G, A, ou M, l'albumine ou la transferrine humaines. La précision est de l'ordre de 5 % au centre de la gamme, de 10 % aux faibles concentrations. - Dosage de la concentration protéique de l'éluat.
La concentration a été évaluée à l'aide du dosage par BCA (acide bicinchoninique) (Kit PIERCE).
Selon le principe de cette méthode, les protéines provoquent
•*"•• en milieu alcalin la réduction de l'ion cuivrique (Cu ) selon la réaction du 3 Biuret. La réaction entre le sel de sodium de l'acide bicinchoninique (BCA) et l'ion cuivreux est sensible et très spécifique. Le complexe formé
BCA-Cu+ est soluble dans l'eau et montre une forte absorbance à 562 nm. Le dosage est réalisé de la manière suivante :
. 1 part de solution à 4 % de sulfate de cuivre et 50 parts d'une solution de -' carbonate, bicarbonate, tartrate de sodium, de réactif BCA dans NaOH
FEUILLE DE REMPLACEMENT 0,2 M sont ajoutés à 0,1 ml de solution à doser ou 0,1 ml de tampon de dilution des échantillons pour le blanc + 2 ml de réactif, l'ensemble est agité, incubé 2 heures à température ambiante ou 30 minutes à 37°C puis révélé à 562 nm contre le blanc de lecture ;
5 . chaque échantillon est dosé en triple ; on réalise une gamme étalon de
SAB (Pierce) et d'une préparation d'immunoglobulines humaines de 0,05 à
1 mg/ml.
- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide 4/30 (Pharmacia) en présence de 10 SDS
- Dosage de l'activité anti-LPS dans la source, le filtrat et l'éluat
Il a été réalisé comme suit: . adsorber pendant 16 heures à température ambiante sur les puits de 5 plaques de microtitration en PVC (Falcon réf. 3912, Becton Dickinson), les LPS E.Coli 35 (List Biological Laboratories) à raison de 0,1 ml par puits d'une solution de LPS à 10 μg/ml dans du PBS contenant 1,6% (p/v) de MgC l - et 0,01 % (p/v) de merthiolate;
. après 3 lavages avec une solution à 0,9% NaCl (p/v) et 0,1 % tween 20 20 (v/v), les puits sont saturés pendant 1 heure à température ambiante avec 150 μl d'une solution d'albumine sérique bovine à 5% (p/v) dans du PBS. . après 3 lavages avec une solution à 0,9% NaCl (p/v) et 0,1% tween 20 (v/v), incuber 3 heures à 37°C les échantillons à doser à différentes dilutions dans du PBS à 5% (p/v) d'albumine sérique bovine. . après 5 lavages avec une solution à 0,9% NaCl (p/v) et 0,1% tween 20 (v/v), incuber 90 minutes à 37°C avec 100 μl d'une solution d'immuno¬ globulines de chèvre anti-immunoglobulines G + M humaines couplées à la peroxydase, diluées au 1/400 000 dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,5 avec 0,1% d'albumine sérique bovine. -"- . après 5 lavages avec une solution à 0,9% NaCl (p/v) et 0,1% tween 20 (v/v), l'activité enzymatique est révélée par addition d'orthophényiène diamine dans H20~ 0,03% (Diagnostics Pasteur) pendant 20 minutes à température ambiante en l'absence de lumière (100 μl de substrat par puits); la réaction enzymatique est arrêtée par ajout de H-SO^ 4N (50 μl par puits). La densité optique de chaque puits est déterminée à 492 nm, à l'aide d'un lecteur de microplaque ELISA (Molecular Devices, Vmax).
FEUILLE DE REMPLACEMENT 2) Résultats
Le tableau I présenté ci-après et la figure I rendent compte des résultats obtenus.
TABLEAU 1
Figure imgf000012_0001
FEUILLE DE REMPLACEMENT Les concentrations protéiques, correspondant au titre (dilution de l'échantillon qui donne un signal égal à la moitié de la densité optique maximale, soit 1,3/2 = 0,65) du plasma de départ et de l'éluat, sont respectivement de :
0,1ml x 25 mg/ml = 0,0472 mg = 7,2 μg
53
0,1ml x 0,63mg/ml = 0,00006 mg = 60 ng
1 050
soit une "différence" de 47 200 mg = 787;
60 mg
cette valeur peut être assimilée à un coefficient d'enrichissement.
On peut évaluer le rendement de la purification par le biais du rapport :
(titre x volume) éiuat x 100
(titre x volume) plasma de départ
soit 1 050 x 30 x 100 # 50%
53 x 1 200
D'une part cette valeur est toute relative, d'autre part la perte en anticorps n'est pas dramatique, dans la mesure où elle est due principalement aux anticorps de faible affinité, peu intéressants pour les applications envisagées.
FEUILLE DE REMPLACEMENT 12
Exemple 2 ; Préparation et caractérisation d'un mélange concentré d'IgG et d'IgM plasmatiques humains dirigés contre les LPS
1) Matériel et méthodes
1.1. Préparation d'un mélange IgG/IgM anti-LPS
Vingt quatre éluats d'immunopurification sont décongelés à température ambiante. Le mélange est ensuite soumis à une diafiltration sur membrane YM 100 (76 mm de diamètre, seuil de coupure 100 kD), (AMICON) avec du tampon phosphate 20 mM pH7 contenant 0,9 % (p/v) de NaCl. Lorsque le volume total du mélange se trouve abaissé à une valeur d'environ 40 ml, celui-ci est prélevé et filtré successivement sur filtre Minisart 5μm puis 0,22 μm (SARTORIUS).
Comme décrit précédemment, les classes d'immunoglobulines G, M et A sont dosées par néphélémétrie à l'aide d'un analyseur immunochimique Beckman IC5-11.
1.2. Caractérisation en ELISA du mélange IgG/IgM anti LPS
La spécificité du mélange immunopurifié et concentré d'immunoglobulines polyclonaies humaines anti LPS a été évaluée en ELISA, en comparaison avec celle des immunoglobulines polyvalentes intraveineuses obtenues par fractionnement de Kistler-Nichmann modifié, de pools plasmatiques d'au moins 1000 donneur de sang (Polygamma de Bio Transfusion, France), vis-à-vis du LPS de E Coli JS (Eurobio) et d'autres bactéries gram négatif : E Coli OU I : B 4, Salmonella Minnesota R5, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa (Sigma).
Le protocole utilisé pour ces évaluations est identique à celui décrit précédemment (exemple 1).
2) Résultats
La concentration des classes IgG, IgM et IgA dans le mélange anti-LPS est de 6,1, 3,1, et 0,9 g/1 respectivement.
Le mélange anti-LPS reconnaît les LPS des 4 souches sauvages testées (Tableau 2). Les titres mesurés pour les LPS des souches sauvages sont un peu plus faibles que celui obtenu vis-à-vis de la souche mutante E
FEUILLE DE REMPLACEMENT Coli 35. Ceci s'explique, d'une part par le mode de préparation de ces anticorps, immunopurifies sur E Coli 35 immobilisés, d'autre part par le fait que ces anticorps ne peuvent se fixer que sur le noyau des LPS, lequel se trouve plus ou moins accessible en fonction de l'importance des chaînes latérales polyosidiques sur les LPS des souches sauvages.
TABLEAU 2
Figure imgf000015_0001
Le produit Polygamma reconnaît également les LPS des souches utilisées ; mais dans le cas présent tous les anticorps sont pris en compte, à la fois ceux dirigés contre le noyau et ceux dirigés contre les chaînes latérales.
Malgré la perte supposée des anticorps dirigés contre les chaînes latérales des LPS lors de l'étape d'immunopurification sur E Coli 35 immobilisés, un enrichissement en activité anti-LPS peut être constaté dans le mélange par rapport au produit Polygamma. Cet enrichissement est bien entendu mis en évidence pour le LPS de E Coli 35 mais aussi pour ceux de
10 Salmonella Minnesota R5, Klebsiella Pneumoniae et Pseudomonas Aeru- ginosa, et dans une proportion plus modeste pour le LPS de E Coli O U I : B4, souche pour laquelle la réponse anticorps naturelle chez l'homme semble plus significativement dirigée contre les chaînes latérales.
l-5 Exemple 3 : Activité pharmacologique in vitro du mélange concentré IgG/IgM anti-LPS
1/ Détermination de l'activité anti-LPS du mélange immuno- purification IgG/IgM à l'aide d'un essai d'inhibition de multiplication de 0 virus bactériophages
1.1.) Matériel et méthodes
Le virus bactériophage ψ X 174 tient son infectivité vis-à-vis de l'hôte E Coli de la reconnaissance spécifique des lipopolysaccharides des parois de E Coli en présence d'ions Ca2+ (A.M. FIELD, E. ROWAIT et R.J.P. WILLIAMS in Biochem 3. 263, 695-702 (1989). Nous avons donc mis en oeuvre cette propriété dans un essai d'inhibition de multiplication des virus 0 X 174 en ajoutant des immunoglobulines ayant un titre anti-LPS de E Coli. Le titrage des phages est réalisé par dilutions décimales du stock primaire de virus dans le diluant contenant la souche sensible. Les dilutions sont mises à incuber en présence de gélose de surface liquide, puis versées sur les boîtes de Pétri contenant la gélose nutritive en profondeur.
Après incubation 18 à 24h à 37°C, les boîtes sont lues selon le 5 nombre de plages de lyse obtenues.
FEUILLE DE REMPLACEMENT Les titres sont exprimés en unités formant plages (UFP/ml).
L'activité du mélange immunopurifié concentré IgG/IgM anti-LPS (cf exemple 2) a été évaluée sur ce modèle en comparaison avec celle des immunoglobulines polyvalentes intraveineuses (Polygamma de BIO Transfusion).
1.2.) Résultats
Par rapport au titre initial de virus dans le stock primaire (6 X ι o UFP/ml) on constate un effet inhibiteur de multiplication de 3,14 Log pour une solution à 10 mg/ml d'immunoglobulines non spécifiques.
L'effet inhibiteur s'estompe avec la dilution, puisqu'à 0,625 mg/ml on ne mesure plus qu'une différence de 1,48 Log (tableau 3).
TABLEAU 3
Inhibition de la Multiplication de & X 174 en fonction de la concentration en Polygamma
Figure imgf000017_0001
L'activité inhibitrice de la multiplication des phages ^ x 174 en fonction de la concentration du mélange de IgG/IgM anti LPS est exprimée dans le tableau 4.
FEUILLE DE REMPLACEMENT TABLEAU 4
Inhibition de la multiplication de p x 174 onction de la concentration en mélange IgG/IgM anti-LPS
Figure imgf000018_0001
FEUILLE DE REMPLACEMENT L'effet inhibiteur est très significativement plus important dans le cas du mélange immunopurifié IgG/IgM anti-LPS que dans celui du produit Polygamma, en particulier aux concentrations 1,25 mg/ml et 0,625 mg/ml où la différence d'activité est d'un ordre de 100 (2 log) ; Ainsi une activité anti LPS supportée par des anticorps se trouve beaucoup plus concentrée dans le mélange immunopurifié que dans les immunoglobulines polyvalentes intraveineuses (Polygamma) ; ladite activité se traduit par une fixation des anticorps sur les LPS des parois des bactéries en culture, fixation très préjudiciable à la reconnaissance de la paroi bactérienne par le phage.
2/ Détermination de l'activité anti-LPS du mélange immuno¬ purifié IgG/IgM, à l'aide d'un essai d'inhibition de la sécrétion de TNF0( par des macrophages péritoneaux murins sensibilisés aux LPS.
2.1.) Matériel et méthodes
Sous l'action des endotoxines bactériennes, les monocytes/ma- crophages sécrètent du TNF et d'autres monokynes (IL 1, IL6...) ; le TNF est donc un bon marqueur de l'action des endotoxines.
Les macrophages péritoneaux murins sont prélevés chez 3 souris BALB/C ayant reçu 7 jours auparavant 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund par voie intrapéritonéale. Ainsi, 5 ml de milieu complet RPMI 1640 supplémenté en glutamine, antibiotiques et ultrose HY 1 % (v/v) (IBF) sont injectés dans la cavité péritonéale de chaque souris, puis réaspirés et mélangés.
Après 3 lavages en milieu de Hanks, le culot cellulaire est remis en suspension dans le milieu complet. On obtient environ 1 0 millions de cellules dont 60 millions de macrophages. Une solution ajustée à ιo macrophages par ml (2,5 10 cellules péritonéales/ml) dans le milieu complet est préparée, 100 μl de cette solution sont distribués dans des puits de microplaques (96 puits). Après incubation 3 heures à 37°C dans l'incubateur à CO~, les surnageants sont éliminés : seuls les macrophages restent adsorbés sur le fond des micropuits. On ajoute alors 100 μl d'anticorps à tester (ou 100 μl de milieu complet seul) dilués dans le milieu
FEUILLE DE REMPLACEMENT complet puis 100 μl de LPS dilués également dans le milieu complet. Trois puits sont consacrés par dilution d'anticorps et par dilution de LPS.
Après 24 heures d'incubation, les surnageants sont prélevés : les 3 surnageants de chaque "situation" sont mélangés pour disposer ainsi d'assez de volume pour être dosés en ELISA. Les surnageants sont ensuite congelés à -40°C et le dosage du TNF alpha est réalisé en différé. Le dosage du TNF alpha murin est réalisé à l'aide du lait ELISA produit par les Laboratoires GENZYME et commercialisé par la société TEBU. Il s'agit d'un dosage de type sandwich avec un anticorps monoclonal de hamster anti-TNF alpha murin adsorbé sur les microplaques. Après incubation avec le TNF alpha, on incube avec des anticorps poiyclonaux de chèvre anti-TNF alpha murin. Enfin, après incubation avec des anticorps poiyclonaux d'âne anti-immunoglobulines de chèvre marqués à la peroxydase, les immuno- complexes sont révélés par l'action de la peroxydase sur de l'orthophenylene diamine et lecture de la densité optique à 492 nm.
Deux souches de LPS ont été utilisées : le LPS de E. Coli 35 et le LPS de E. Coli 055 = B5 (souche sauvage).
La préparation d'anticorps IgG/IgM immunopurifies anti-LPS a été évaluée quant à son pouvoir d'inhiber la sécrétion de TNF par les macrophages sensibilisés aux LPS susmentionnés, en comparaison avec le produit Polygamma (Bio Transfusion). 2.2.) Résultats
Les résultats obtenus sont résumés figure 2 pour le mélange anti-LPS et figure 3 pour le Polygamma (symbolisée par GVP pour gamma poly valantes intraveineuses).
Le mélange anti-LPS inhibe très significativement et de manière dose dépendante l'action du LPS de E. Coli J5 comme celle du E. Coli 055 = B5.
Ainsi ces anticorps immunopurifies sur E. Coli 35 immobilisés (souche mutante dépourvue de chaînes latérales) sont capables de neutraliser très efficacement dans un système d'évaluation biologique in vitro l'action de LPS de souches sauvages. Ces anticorps montrent ainsi clairement leur intérêt potentiel pour la prévention et/ou le traitement du choc endotoxinique. En revanche, le produit Polygamma n'inhibe que partiellement l'action des LPS, et ce à des doses au moins 100 fois supérieures à celles du mélange immunopurifié anti-LPS.
FEUILLE DE REMPLACEMENT Exemple 4 : Préparation et caractérisation d'un concentré d'IgM plasmatiques humaines et d'un concentré d'IgG plasmatiques humaines, dirigée contre les LPS
1) Matériel et méthodes
1.1. Préparation de chacun des 2 concentrés
Le mélange concentré d'IgM/IgG obtenu et décrit précédem¬ ment (exemple 2) est reconcentré dans un volume de 4 ml avant d'être chromatographie par tamisage moléculaire sur gel ACA 34 (IBF). Les classes d'immunoglobulines (G, M, A) sont dosées en néphélémétrie.
1.2. Caractérisation en ELISA de chacune des préparations IgM et IgG anti-LPS La spécificité des deux fractions a été évaluée en ELISA, en comparaison avec celle du mélange initial immunopurifié IgG/IgM anti-LPS et avec celle des immunoglobulines polyvalentes intraveineuses (Polygamma de Bio Transfusion), vis-à-vis du LPS de E. Coli 35 (Eurobio) et d'autres bactéries gram négatif : E. Coli O U I : B4, Salmonella Minnesota R5, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomonas Aeruginosa (Sigma). Le protocole utilisé pour ces évaluations est identique à celui décrit précédemment (exemple 1).
2) Résultats Les concentrations des concentrés IgM et IgG anti-LPS en IgM,
IgG et IgA sont de 9, 0,7 et 1 g/1 pour le concentré en IgM, et 0,8, 12,5 et 0,4 g/1 pour le concentré en IgG.
Les IgM et les IgG anti-LPS préparés reconnaissent en ELISA les LPS des 4 souches sauvages testées. En apparence, les IgG semblent montrer un titre un peu plus important, mais compte tenu du fait que les IgM ne peuvent pas se lier à l'antigène adsorbé sur phase solide par tous ses sites de liaison, il est difficile de tirer une conclusion plus précise.
FEUILLE DE REMPLACEMENT Exemple 5 ; Détermination de l'activité anti-LPS de préparations d'IgM plasmatiques humaines et d'IgG plasmatiques humaines dirigés contre les LPS
Le protocole utilisé est identique à celui exposé dans l'exemple 3 (2.1 ).
Deux souches de LPS ont été utilisées dans ce modèle : le LPS de E. Coli 35 et le LPS de E. Coli 055 : B5.
Les résultats obtenus sont résumés figure 4 (IgM) et figure 5 (IgG).
La préparation d'IgM anti-LPS inhibe très significativement et de manière dose dépendante l'action des LPS E. Coli 35 et E. Coli 055 : B5. Les IgM anti-LPS sont ainsi capables de neutraliser très efficacement dans un système d'évaluation biologique in vitro l'action de LPS de souches sauvages. Les IgM montrent ainsi clairement leur intérêt potentiel pour la prévention et/ou le traitement du choc endotoxinique.
En revanche, la préparation d'IgG anti-LPS n'inhibe que partiellement l'action des LPS. Peut-être même les IgM résidueiles pourraient expliquer partiellement, voire totalement l'effet de la préparation d'IgG.
Ainsi l'activité neutralisante des IgM polyclonales anti-LPS est très supérieure à celle des IgG polyclonales, peut-être en raison du poids moléculaire important des IgM et des nombreux sites de fixation de l'antigène présents sur l'IgM, permettant ainsi à l'IgM de piéger efficacement les LPS qui sont des structures assez volumineuses.
FEUILLE DE REMPLACEMENT

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps purifiés spécifiquement dirigés contre les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries gram négatif, caractérisés en ce qu'ils sont purifiés à partir d'un milieu les contenant par une étape de chromatographie d'immunoaffinité utilisant des antigènes LPS insolubilisés, support d'immunoaffinité comportant essentiellement la fraction lipide A et le noyau des LPS communs à de nombreux lipopolysaccharides de bactéries gram négatif, et en ce que après séparation des anticorps par immunoaffinié on réalise un continuel enrichissement de ces anticorps pour obtenir une fraction riche en IgM.
2. Anticorps purifiés selon la revendication 1, caractérisés en ce que les antigènes LPS sont immobilisés sur un support de manière à laisser accessible leur lipide A auxdits anticorps.
3. Anticorps purifiés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que les antigènes LPS sont liés au support par couplage de leurs fonctions aldéhydes, issues de la transformation de leurs fonctions hydroxyles, avec des fonctions hydrazines ou aminés. * . Anticorps purifiés selon l'une quelconque des revendications
1 à 3, caractérisés en ce que les antigènes sont couplés soit directement sur une résine portant des fonctions hydrazines ou aminés, soit sur les fonctions aminés d'une protéine, elle-même liée à un support.
5. Anticorps purifiés selon la revendication 4, caractérisés en ce que l'antigène LPS est couplé à du gel d'agarose sur lequel sont fixées des fonctions hydrazines ou aminés..
6. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que l'antigène LPS utilisé provient d'un mutant d'une bactérie gram négatif dépourvu de chaîne*. îaierales poiyosidiques et constitué uniquement de lipide A et d'un noyau commun à de nombreux lipopolysaccharides.
7. Anticorps selon la revendication 6, caractérisés en ce que l'antigène LPS provient du mutant J5 d'E. coli OU I.
FEUILLE DE REMPLACEMENT
8. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que les liquides biologiques sont des plasmas ou sérums humains ou des plasmas ou sérums d'animaux.
9. Anticorps selon les revendications 1 à 8, caractérisés en ce que les liquides biologiques comportent une activité anti-LPS.
10. Anticorps selon les revendications 1 à 9, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un mélange d'IgM, IgG et/ou IgA.
11. Anticorps selon les revendications 1 à 10, caractérisés en ce qu'il s'agit de IgM.
10 12. Anticorps selon les revendications 1 à I I, caractérisés en ce qu'ils présentent une pureté proteique supérieure ou égale à 50 %.
13. Anticorps selon les revendications 1 à 12, utiles pour la prévention ou le traitement des chocs endotoxiniques.
14. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle l -5 contient au moins des anticorps selon l'une des revendications 1 à 13.
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