WO1991018002A1 - Nukleoside als synthone für die rna-synthese - Google Patents

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Volker Erdmann
Mathias Sprinzl
Karsten Henco
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to nucleosides of the formula
  • the ribonucleic acids play an important role in protein synthesis in the organism.
  • the ribonucleic acids are also an important tool in genetic engineering, for example in the clarification of protein sequences via cloned DNA, since the mRNA of the corresponding proteins is first isolated in order to create so-called cDNA banks.
  • the search for the desired clones often uses the hybridization technique with complementary, synthetically produced nucleic acids.
  • the synthetic production of ribonucleic acids is a major preparative problem. One reason for this is the additional 2'-hydroxy group of the sugar residue (ribose) in the ribonuic acid. Therefore, a complicated protecting group
  • RNA with enzymatic activities the use of which is conceivable in vivo and in vitro.
  • RNA syntheses whereby guanine is protected with the isobutyryl protective group at Posi .ti.on N2 of the purple system.
  • the cleavage of the group is unavoidable at 55 ⁇ C. It occurs under these conditions disturbing the cleavage of the silyl protecting groups at the 2'-O-position of the ribose on. For example, the 2'-0-t-butyldimethylsilyl group is partially split off. This would be avoidable if milder conditions were used.
  • Wu, T. et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17., 3501-3517 uses the phenoxyacetyl protecting group known from DNA chemistry (Schulhof, JC et al. (1987), Nucl. Acids Res. 2_5, 397-416) in order to achieve an increase in yield . This is only possible to a limited extent in RNA synthesis. The yield is only 25 to 35%. Another disadvantage of this method is the difficult workup of the phenoxyacetylated monomers.
  • the nucleophilic nitrogen atoms of the purine residue must first be blocked, then the hydroxyl groups of the sugar residue, the ribose, are chemically modified.
  • the technical problem on which the invention is based is the provision of a method for producing ribonucleic acids.
  • the process should be economical, selective and can be used in the automatic production of RNA.
  • Another technical problem is the provision of improved synthons for the production of RNA, namely the purine residues adenyl and guanosyl protected on the corresponding N atoms.
  • Another technical problem is the stability of the synthons used for automated RNA synthesis. For example, Ogilvie et al. an automated RNA synthesis that works with an average coupling efficiency of 96%. They used phosphoramidite chemistry (Usman, N. et al. (1987), J. Am. Chem. Soc.
  • R is an amidine protecting group, in particular the dimethyl ammomethylene group (DMM) at position N 2 of the purine residue,
  • DDM dimethyl ammomethylene group
  • R 2 eeiinnee AAil kylsilyl group or methyl group or hydrogen (H)
  • R 3 eeiinnee Ttriieetthhyylliammonium H-phosphonate group, a hydrogen atom or a phosphoramidite group
  • R 4 is a substituted T ⁇ tyltikoli or H, and if
  • R is an amidine protecting group, in particular the dimethylaminomethylene group (DMM) on N of the purine residue, and
  • the nucleosides preferably have an alkylsilyl group
  • Trityl group (R 4) on the 4,4'-dimethoxytrityl residue thus also relates to ribonucleic acids composed of at least two ribonucleic acid nucleosides as nucleoside of at least one of the compounds according to the formula given above.
  • the amidine, preferably DMM, group is introduced into the A / G nucleosides.
  • the 5'-position of the ribose is then protected with a trityl protecting group, followed by the silylation at the 2'-position of the ribose, tritylation of the 5'-function and phosphonation at the 3'-position.
  • the process can preferably be carried out as a so-called one-pot reaction, starting with the corresponding nucleoside of adenine or guanine and adding the protective groups step by step.
  • the resulting N-protected nucleosides can be protected in a simple manner by classic 4,4'-dimethoxytrityl groups.
  • the dimethylaminomethylene (DMM) protective group can be split off by treatment with aqueous ammonia / methanol, preferably at room temperature, for a period of 10 to 50 hours, preferably 48 hours.
  • the course of the reaction can be followed by UV spectroscopy at 300 n.
  • the other protective groups are stable and no other reaction product could be detected.
  • the treatment with aqueous ammonia / ethanol solution at room temperature for a period of 10 to 50 hours, preferably 48 hours, is also a condition which can be used for the removal of the protective groups in RNA oligonucleotides.
  • the 2'-ot-butyldimethylsilyl-protected RNA is among these Conditions stable.
  • a corresponding procedure is followed for the preparation of the corresponding adenosine derivative.
  • the preparation of the two protected purine derivatives is straightforward and can be carried out as a one-pot reaction, starting with the corresponding nucleosides and gradually ending with the addition of the appropriate reagents to the easily separable mixture of the 2'- and 3'-silylated compounds.
  • the rate at which the N-benzoyl protective group of cytidine is split off is very similar to the corresponding hydrolysis rate of the dimethylaminomethylene (DMM) protective group of purines. This makes the use of the classic synthon N 4-Benzoylcyti.dm. as a partner in the
  • Table 1 shows particularly preferred compounds according to the invention.
  • the protected nucleosides were converted into the corresponding H-phosphonates in a manner known per se (Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. JL, 9285-9298).
  • the compounds were characterized by means of thin-layer chromatography, UV spectroscopy and " H-NMR. The most important nuclear magnetic resonance spectroscopic data are summarized in Table 2.
  • Ti NMR spectra are based on chloroform as the internal standard ( ⁇ 7.24, based on tetramethylsilane as the standard).
  • the H2 • and H3 'signals are of great diagnostic value for the purity analysis with regard to the isomers of the protected nucleosides and nucleotides.
  • the combination of the DMM-H-phosphonates to form oligoribonucleotides was preferably carried out with 1-adamantane carbonyl chloride as the condensing agent. Coupling yields of> 95% were achieved with a 10 to 30-fold molar excess of the reagents and a coupling time of 5 to 30 minutes, preferably 5 to 10 minutes. Preference was given to a 20-fold molar excess Reagents and a reaction time of 10 minutes achieved a coupling yield of 97%.
  • the protective groups were cleaved off with aqueous ammonia / ethanol. The mixture was preferably exposed to this mixture for 48 hours. The hydrolysis of the 2 * protective group by using preferably tetra-butylammonium fluoride proved to be advantageous. The rate of this deprotection can be followed by reversed phase HPLC. A homogeneous, completely deprotected oligoribonucleotide can be isolated after 5 to 30 hours, preferably 24 hours, of incubation at room temperature by means of gel permeation chromatography and ion exchange chromatography. If desired, the last purification step can be carried out using HPLC chromatography.
  • FIG. 1 shows the result of the analysis with polyacrylamide gel electrophoresis of various RNA molecules.
  • FIG. 1 contains 6 samples, in column 1 synthetic RNA oligonucleotide crude product of the sequence mentioned, in column 2 DNA oligonucleotide (18mer) as a marker, in column 3 41mer (RNA) from a natural source as
  • the chemically synthesized 24mer can be aminoacylated by alanine tRNA synthetase from E. coli.
  • the yield of the aminoacylation when using an unprocessed reaction product without chromatographic purification is approximately 16%, as shown in FIG. 2. This is in good agreement with the results reported by Ogilvie et al. (Ogilvie, K.K. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 »5764-5768; Perreault,
  • RNA synthesis is advantageous over enzymatic one because it makes it possible to insert smaller nucleotides, nucleotides labeled with isotopes or derivatives of natural nucleotides for affinity labeling and for spectroscopic studies.
  • this relates to 8-bromoguanine and 8-azi doadenin as an affinity ligand for specific binding proteins and inosine and 5-bromouracil as a cross-linking reagent.
  • Specific synthetic analogs of the natural nucleosides can only be incorporated at specific positions using synthetic methods. Only statistical, generalized incorporation of these analogs can be achieved with enzymatic methods.
  • the possible uses of synthetically producible RNA molecules in genetic engineering and biotechnology cannot be estimated.
  • amidine in particular DMM
  • the invention is described in more detail by the following examples.
  • the nucleosides were obtained from Phar a-Waldhof, phenoxyacetyl chloride from Janssen, abs. Pyridine, HPLC-acetonitrile, abs. Dichloromethane, N, N-dimethylformamide diethylacetal, 4,4'-dimethoxytrityl chloride, t-butyldimethylchlorosilane, puriss.
  • I idazol, Triethyla in (puriss.) Obtained from Fluka and used without further purification steps.
  • Phosphorus trichloride was obtained from Aldrich as a 2M solution in dichloromethane. CPG base with spacer were used according to Usman, N. et al.
  • Uridine-3 • -H-phosphonate and 2'-0- (t-butyldimethylsilyl) - 5 • -0- (4,4'-dimethoxytrityl) -N 4-benzoylcytide-3'-H-phosphate were synthesized according to known regulations (Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. JL6, 9285-9298). Thin layer chromatography was performed on Fluka TLC silica gel aluminum foils; serving as flow agents: S.
  • a 381A DNA synthesizer from Applied Biosystems was available for automatic RNA synthesis.
  • AdamantancarbonylChlorid and IM tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran were purchased from Fluka.
  • Dichloroacetic acid in methylene chloride and pyridine / acetonitrile (1: 1, v / v) are from Applied Biosystems.
  • the compound was prepared starting from 10 mmol adenosine according to the same scheme as (Ia). The final cleaning was carried out with the same initial solvent in 250 ml portions with increasing amounts of 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%, 1.25% and 1.5% of isopropanol .
  • the fractions collected in each case contained 3.6 g (50%) of Ha (R p - S 1 0.80) and 2.1 g (29%) of the Iso ers Ilb (R réelle-S 1 0.77).
  • the H-phosphonates were dissolved in 50% pyridine / acetonitrile to a concentration of 0.03 M each.
  • Freshly sublimated adamantane carbonyl chloride was also dissolved in 50% pyridine / acetonitrile in a final concentration of 0.12 M.
  • the automatic oligoribonucleotide synthesis was carried out in commercial DNA synthesis machines (for example AB / 381A). The coupling times wore 5 to 10 minutes.
  • the cleavage of the crude oligoribonucleotide from the CPG support and the deprotection were carried out in one step.
  • the CPG support was treated with 2 ml of ethanol / 35% NH 3 (1: 3, v / v) for 48 hours at room temperature. After filtration, the resulting solution was evaporated to dryness. The remaining colorless 2'-blocked oligoribonucleotide was dissolved in 2 ml of IM tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran and incubated at room temperature. After 3, 6, 9, 12 and 24 hours, 10 ⁇ l aliquots were removed and placed on Nucleosil C-4 HPLC (Macherey - Nagel, 4.6 mm x 25 cm, e
  • the aminoacylation was carried out in 150 mM Tris / HCl pH 7.6, 50 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 1 mM ATP, 5 mM ⁇ -mercaptoethanol, 300 ⁇ M ( 14 C) alanine (162 Ci / mol) in the presence of 0 , 3 A_ 60 units were carried out on RNA and 50 ⁇ g Ala-tRNA synthetase (E. coli), total volume 100 ⁇ l, 37 ° C. 10 ⁇ l aliquots were removed after appropriate times (FIG. 2) and analyzed on Whatman 3MM filters Radioactive precipitable trichloroacetic acid
  • E. coli (specific activity 57.5 u / mg; 1 unit catalyzes the formation of 1 nmol Ala-tRNA Ala at 37 * C in one minute) was isolated according to Hill, K. and Schimmel.
  • FIG. 2 shows aminoacylation in the presence (-A-) and absence (- • -) of chemically synthesized RNA with alanyl tRNA synthetase from E. coli and (14C) -alanine with the specific radioactivity given in Example 6. At the times indicated, 10 ⁇ l aliquots were removed from the reaction mixture and the total radioactivity of the radioactivity which can be precipitated with trichloroacetic acid was measured.

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Abstract

Es werden Nukleoside der Formel (I) beschrieben, wobei, wenn B = Guanin oder 8-Haloguanin, R1 eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Dimethylaminomethylengruppe (DMM) an Position N2 des Purinrestes, R2 eine Alkylsilylgruppe oder Methylgruppe oder Wasserstoff (H), R3 eine Triethylammonium H-Phosphonatgruppe, ein Wasserstoffatom oder eine Phosphoramiditgruppe, R4 eine substituierte Tritylschutzgruppe oder H ist, und wobei, wenn B = Adenin oder 8-Azidoadenin, R1 eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Dimethylaminomethylengruppe (DMM) an N6 des Purinrestes ist und R?2, R3 und R4¿ wie bei B = Guanin sind. Diese Verbindungen sind als Synthone für die chemische RNA-Synthese geeignet. Bei Verwendung der DMM-geschützten Purinbasen Adenin und Guanin werden Kopplungsausbeuten von > 95 % erreicht.

Description

Nukleoside als Synthone für die RNA-Synthese
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleoside der Formel
Figure imgf000003_0001
als Synthone für die RNA-Synthese sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäuren.
Neben der Desoxyribonukleinsäure als Träger der gene¬ tischen Information spielen die Ribonukleinsäuren eine wichtige Rolle bei der Proteinsynthese im Organismus. Die Ribonukleinsäuren sind ebenfalls ein wichtiges Werk¬ zeug in der Gentechnologie, beispielsweise bei der Auf¬ klärung von Proteinsequenzen über klonierte DNA, da zunächst die mRNA der entsprechenden Proteine isoliert wird, um sogenannte cDNA-Bänke anzulegen. Bei der Suche nach den gewünschten Klonen bedient man sich häufig der Hybridisierungstechnik mit komplementären, synthetisch hergestellten Nukleinsäuren. Anders als bei Desoxyribo¬ nukleinsäuren stellt jedoch die synthetische Herstel¬ lung von Ribonukleinsäuren ein großes präparatives Pro¬ blem dar. Ein Grund hierfür liegt in der zusätzlichen 2 '-Hydroxygruppe des Zuckerrestes (Ribose) in der Ribonu- \ kleinsäure. Daher ist eine komplizierte Schutzgruppen-
^ Strategie erforderlich. Längeren RNA-Strängen wird in
*• Zukunft auch therapeutische Bedeutung zukommen. Bei dem sogenannten antisense RNA-Konzept werden synthetische Gegenstrang-RNA in Zellen eingeschleust, um durch Dop¬ pelstrangbildung zum Beispiel virale mRNA biologisch funktionslos zu machen. Ein weiteres wichtiges Einsatz¬ gebiet wird den sogenannten Ribozymen zugeschrieben. Dabei handelt es sich um RNA mit enzymatischen Aktivi¬ täten, deren Einsatz in vivo und in vitro vorstellbar ist.
Um eine Synthese auch längerer RNA-Stränge wirtschaft¬ lich vertretbar zu gestalten, ist es erforderlich, mög¬ lichst hohe Ausbeuten der einzelnen Reaktionsschritte der RNA-Synthese zu erzielen. Interessant sind Ausbeu¬ ten von höher als 95% pro Reaktionsschritt. Problema¬ tisch hierbei ist die Abspaltung der Schutzgruppen. Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16, 9285-9298, beschreibt Schutzgruppen für automatische
RNA-Synthesen, wobei Guanin mit der Isobutyryl-Schutz- gruppe an Posi .ti.on N2 des Purmsystems geschützt ist.
Die Abspaltung der Gruppe erfolgt unvermeidbar bei 55βC. Es tritt unter diesen Bedingungen störend die Abspaltung der Silylschutzgruppen an der 2'-O-Position des Riboserestes auf. Zum Beispiel wird die 2'-0-t-Bu- tyldimethylsilylgruppe teilweise abgespalten. Dies wäre bei Anwendung milderer Bedingungen vermeidbar. Wu, T. et al. (1989), Nucl. Acids Res. 17., 3501-3517, bedient sich der aus der DNA-Chemie bekannten Phenoxyacetylschutz- gruppe (Schulhof, J.C. et al. (1987), Nucl. Acids Res. 2_5 , 397-416) , um eine Ausbeutesteigerung zu erzielen. Dies gelingt bei der RNA-Synthese nur bedingt. Die Aus¬ beute beläuft sich lediglich auf 25 bis 35%. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist die schwierige Aufarbeitung der phenoxyacetylierten Monomere.
Es ist bei der Schutzgruppenstrategie zu beachten, daß ausgehend von den jeweiligen Ribonukleosiden zunächst die nukleophilen Stickstσffatome des Purinrestes blok- kiert werden müssen, woraufhin dann die Hydroxygruppen des Zuckerrestes, der Ribose, chemisch modifiziert wer¬ den.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Ribonukleinsäuren. Das Verfahren soll wirtschaft¬ lich, selektiv und bei der automatischen RNA-Herstel- lung einsetzbar sein. Ein weiteres technisches Problem ist die Bereitstellung verbesserter Synthone für die RNA-HerStellung, nämlich der an den entsprechenden N-Atomen geschützten Purinreste Adenyl und Guanosyl. Ein weiteres technisches Problem ist die Stabilität der zur automatisierten RNA-Synthese verwendeten Synthone. So entwickelten Ogilvie et al. eine automatisierte RNA- Synthese, die mit einer durchschnittlichen Kopplungs¬ effizienz von 96% arbeitet. Dabei verwendeten sie die Phosphoramidit-Chemie (Usman, N. et al. (1987) , J. Am. Chem. Soc. 109, 7845-7854; Ogilvie, K.K. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85., 5764-5768; Perreault, J.-P. et al. (1989), Eur. J. Biochem. 186, 87-93; Leh¬ mann, C. et al. (1989), Nucl. Acids Res. _\J_, 2379-2390; Iwai, S. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16., 9443-9456). Nachteilig an dieser Methodik tritt die Labilität der Synthone in Erscheinung. Es ist nicht möglich, die Aus¬ gangschemikalien lange bei Raumtemperatur zu lagern bzw. sie wiederzugewinnen, was von großem Vorteil wäre, da bei der Synthese von RNA große Überschüsse der Reagenzien verwendet werden müssen, um überhaupt befriedigende Aus¬ beuten zu erzielen. Das gilt auch für die bei DNA hoch¬ reaktiven Phosphora idite. Die O-Funktion der RNA setzt die Reaktivität der Phosphoramidite in der Kopplungsreak¬ tion herab. Im Gegensatz zu Desoxyribonukleotiden muß vor der Aktivierung der 3*-O-Funktion die 2'-O-Funktion geschützt werden. Das 2 ' ,3 '-Isomerengemisch stellt bei der Verwendung bekannter Schutzgruppen ein nur sehr müh¬ sam zu trennendes Gemisch dar. Die Schwierigkeiten be- ruhen zum Beispiel auf Löslichkeitsproblemen bei der präparativen Chromatographie.
Die Synthone für die RNA-Synthese, die diese technischen Probleme lösen, sind Nukleoside der Formel
Figure imgf000006_0001
wobei, wenn
B = Guanin oder 8-Haloguanin,
R eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Dimethyl- ammomethylengruppe (DMM) an Position N 2 des Purin¬ restes,
R 2 eeiinnee AAil:kylsilylgruppe oder Methylgruppe oder Was- serstoff (H) , R 3 eeiinnee TTrriieetthhyylliammonium H-Phosphonatgruppe, ein Was- serstoffato oder eine Phosphoramiditgruppe,
R 4 eine substi.tuierte Tπtylschutzgruppe oder H ist, und wobei, wenn
B = Adenin oder 8-Azidoadenin,
R eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Dimethyl- aminomethylengruppe (DMM) an N des Purinrestes ist und
R 2, R3 und R4 wie bei B = Guani.n sind.
Vorzugsweise weisen die Nukleoside als Alkylsilylgruppe
(R 2) den t-Butyldimethylsilylrest und als substituierte
Tritylgruppe (R 4) den 4,4'-Dimethoxytritylrest auf. Gegen¬ stand der Erfindung sind somit auch Ribonukleinsäuren aus mindestens zwei Ribonukleinsäure-Nukleosiden enthal¬ tend als Nukleosid mindestens eine der Verbindungen nach der oben angegebenen Formel. Zur Herstellung der Verbindungen der Formel wird die Amidin-, vorzugsweise DMM-Gruppe in die A/G-Nukleoside eingeführt. Danach wird die 5'-Position der Ribose mit einer Tritylschutzgruppe geschützt, gefolgt von der Silylierung an 2'-Position der Ribose, Tritylierung der 5'-Funktion sowie Phosphonierung an 3'-Position. Das Verfahren kann vorzugsweise als sogenannte Eintopfre¬ aktion durchgeführt werden, wobei mit dem entsprechenden Nukleosid des Adenins oder Guanins begonnen wird und die Schutzgruppen schrittweise angefügt werden.
Nach der Einfügung der Amidin-, insbesondere DMM-Gruppe
? 6 an N -Position des Guanosins und N -Position des Adeno- sins können die resultierenden N-geschützten Nukleoside in einfacher Weise durch klassische 4,4'-Dimethoxytrityl- gruppen geschützt werden. Anschließende Silylierung des 5'-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N 2-Dimethylammomethylengu- anosin, vorzugsweise mit t-Butyldimethylchlorsilan, ergab überwiegend (zu 68%) die gewünschte 2'-O-silylierte Ver¬ bindung, die in einfacher Weise an Silicagel in einem Laufmittelgemisch von Chloroform/2-Propanol als Elutions- mittel gereinigt werden konnte. Die Dimethylaminomethylen (DMM)-Schutzgruppe kann durch Behandlung mit wäßrigem Ammoniak/Methanol vorzugsweise bei Raumtemperatur während einer Zeit von 10 bis 50 Stunden, vorzugsweise 48 Stun¬ den, abgespalten werden. Der Reaktionsverlauf kann durch UV-Spektroskopie bei 300 n verfolgt werden. Während dieser Reaktion sind die anderen Schutzgruppen stabil, und kein anderes Reaktionsprodukt konnte nachgewiesen werden. Die Behandlung mit wäßriger Am oniak/Ethanol- Lösung bei Raumtemperatur für die Dauer von 10 bis 50 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden, stellt ebenfalls eine Bedingung dar, die für die Abspaltung der Schutzgruppen bei RNA-Oligonukleotiden Anwendung finden kann. Die 2 '-O-t-Butyldimethylsilyl-geschützte RNA ist unter diesen Bedingungen stabil. Für die Herstellung des entsprechen¬ den Adenosinderivates geht man entsprechend vor. Die Herstellung der beiden geschützten Purinderivate verläuft ohne Umwege und kann als Eintopfreaktion durchgeführt werden, indem man mit den entsprechenden Nukleosiden beginnt und schrittweise durch Zugabe der entsprechenden Reagenzien bei dem leicht zu trennenden Gemisch aus den 2'- und 3'-silylierten Verbindungen endet.
Ein bedeutender Vorteil der erfindungsgemäßen Verbin¬ dungen sei an dieser Stelle erwähnt. Die Geschwindig-
4 keit der Abspaltung der N -Benzoylschutzgruppe des Cy- tidins ist sehr ähnlich der entsprechenden Hydrolysege¬ schwindigkeit der Dimethylaminomethylen(DMM)-Schutzgrup¬ pe von Purinen. Dadurch wird die Verwendung des klas- sischen Synthons N 4-Benzoylcyti.dm. als Partner in der
Synthese von RNA in besonders vorteilhafter Weise er¬ möglicht.
Die Tabelle 1 zeigt besonders bevorzugte erfindungsge¬ mäße Verbindungen.
Figure imgf000008_0001
Die geschützten Nukleoside wurden in an sich bekannter Weise in die entsprechenden H-Phosphonate überführt (Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. JL , 9285-9298) . Die Verbindungen wurden mittels Dünnschicht¬ chromatographie, UV-Spektroskopie und" H-NMR charakte¬ risiert. Die wichtigsten kernresonanzspektroskopischen Daten sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Figure imgf000009_0001
J-Werte sind in Hz angegeben
Ti-NMR-Spektren sind auf Chloroform als internen Standard bezogen (δ 7.24, bezogen auf Tetramethylsilan als Standard).
Für die Reinheitsanalyse bezüglich der Isomere der ge¬ schützten Nukleoside und Nukleotide sind die H2 •- und H3 '-Signale von großem diagnostischem Wert. Die Zusam¬ menfügung der DMM-H-Phosphonate zu Oligoribonukleotiden wurde vorzugsweise mit 1-Adamantancarbonylchlorid als Kondensationsmittel durchgeführt. Kopplungsausbeuten von > 95% wurden mit einem 10- bis 30-fachen molaren Überschuß der Reagenzien und 5 bis 30 Minuten, vorzugs¬ weise 5 bis 10 Minuten, Kopplungszeit erzielt. Vorzugs¬ weise wurden bei einem 20-fachen molaren Überschuß an Reagenzien und einer Reaktionszeit von 10 Minuten eine Kopplungsausbeute von 97% erreicht. Eine Abspaltung der Schutzgruppen konnte mit wäßrigem Am oniak/Ethanol er¬ reicht werden. Vorzugsweise wurde das Gemisch 48 Stunden lang dieser Mischung ausgesetzt. Die Hydrolyse der 2*-Schutzgruppe durch Verwendung von vorzugsweise Tetra- butylammoniumfluorid erwies sich als vorteilhaft. Die Geschwindigkeit dieser Schutzgruppenabspaltung kann mittels Umkehrphasen-HPLC (reversed phase) verfolgt werden. Ein homogenes, völlig von Schutzgruppen befrei¬ tes Oligoribonukleotid kann nach 5 bis 30-stündiger, vorzugsweise 24-stündiger, Inkubation bei Raumtempera¬ tur mittels Gelpermeationschromatographie und Ionenaus¬ tauscherchromatographie isoliert werden. Gewünschten- falls kann der letzte Reinigungsschritt mittels HPLC- Chromatographie durchgeführt werden.
Die Figur 1 zeigt das Ergebnis der Analyse mit Poly- acryla idgelelektrophorese verschiedener RNA-Moleküle. Rohprodukt von verschiedenen RNA-Oligonukleotiden, welche durch chemische Synthese erhalten wurden, ver¬ glich man mit einer aus natürlicher Quelle stammenden RNA und einem chemisch synthetisierten DNA-Oligonukleo- tid (zum Beispiel der Sequenz
5 '-GGGGCUAUAGCUCUAGCUCCACCA-3 ' (1) ) . Es ergibt sich, daß die enzymatisch und chemisch hergestellten Oligoribo- nukleotide vergleichbare Reinheit aufweisen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß die Mobilität der Oligo- ribonukleotide während der Polyacrylamidgelelektropho- rese stark abhängig ist von der SekundärStruktur der Moleküle. Die Figur 1 enthält 6 Proben, wobei in Spalte 1 synthetisches RNA-Oligonukleotid-Rohpro- dukt der erwähnten Sequenz, in Spalte 2 DNA-Oligonukleotid (18mer) als Marker, in Spalte 3 41mer (RNA) aus natürlicher Quelle als
Marker, in Spalte synthetische RNA (7mer) , in Spalte 5 synthetische RNA (llmer) und in Spalte 6 synthetische RNA (7mer) aufgetragen ist. Dabei treten durch unterschiedliche Konformere gegebenenfalls mehrere Banden auf.
Das chemisch synthetisierte 24mer kann durch Alanin- tRNA-Synthetase aus E.coli aminoacyliert werden. Die Ausbeute der Aminoacylierung bei Verwendung eines nicht aufgearbeiteten Reaktionsproduktes ohne chromatographi¬ sche Reinigung beträgt etwa 16%, wie Figur 2 zeigt. Dies ist in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die von Ogilvie et al. (Ogilvie, K.K. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85» 5764-5768; Perreault,
J.-P. et al. (1989), Eur. J. Biochem. 186. 87-93) ge- funden wurden, di .e ei.ne syntheti.sche E.coli. tRNAfMet herstellten. Die chemische RNA-Synthese ist gegenüber der enzymatischen vorteilhaft, da sie es ermöglicht, kleinere Nukleotide, mit Isotopen markierte Nukleotide oder Derivate der natürlichen Nukleotide zur Affinitäts¬ markierung sowie für spektroskopische Studien einzufü¬ gen. Insbesondere betrifft dies 8-Bromoguanin und 8-Azi- doadenin als Affinitätsliganden für spezifische Bin¬ dungsproteine sowie Inosin und 5-Bromuracil als quer¬ vernetzendes Reagenz. Nur mit synthetischen Methoden lassen sich an spezifischen Positionen gezielt bestimm¬ te Analoga der natürlichen Nukleoside einbauen. Mit enzymatischen Methoden läßt sich nur ein statistischer, generalisierter Einbau dieser Analoga realisieren. Nicht abzuschätzen sind darüber hinaus die Einsatzmög¬ lichkeiten synthetisch herstellbarer RNA-Moleküle in Gen- und Biotechnologie.
In überraschend vorteilhafter Weise macht sich die Ein¬ führung der Amidin-, insbesondere DMM-Gruppe auf die 2 '-Spezifität der Silylierung und die Abtrennbarkeit der in 2'- und 3 '-geschützten Verbindungen bemerkbar. Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
Die Nukleoside wurden von Phar a-Waldhof, Phenoxyacetyl- chlorid von Janssen, abs. Pyridin, HPLC-Acetonitril, abs. Dichlormethan, N,N-Dimethylformamiddiethylacetal, 4,4'-Dimethoxytritylchlorid, t-Butyldimethylchlorsilan, puriss. I idazol, Triethyla in (puriss.) von Fluka be¬ zogen und ohne weitere Reinigungsschritte eingesetzt. Phosphortrichlorid wurde als 2M-Lösung in Dichlormethan von Aldrich bezogen. CPG-Basis mit Spacer wurden gemäß Usman, N. et al. (1987), J. Am. Chem. Soc. 109, 7845- 7854, aus 5'-0-4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl-N-substitu- ierten Ribonukleosideή (35 bis 50 μMol/1 g) präpariert. 2 •-0-(t-Butyldimethylsilyl)-5'-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-
Uridin-3•-H-Phosphonat und 2'-0-(t-Butyldimethylsilyl)- 5•-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N 4-Benzoylcytιdm-3'-H-Phos¬ phonat wurden synthetisiert nach bekannten Vorschriften (Stawinski, J. et al. (1988), Nucl. Acids Res. JL6, 9285- 9298) . Dünnschichtchromatographie wurde an DC-Kieselgel- Alufolien von Fluka durchgeführt; als Fließmittel dien¬ ten S. = Chloroform/Isopropanol (9:1), S_ = Chloroform/ Methanol (9:1), S_ = Toluol/Ethylacetat (2:1). Die Säu¬ lenchromatographie wurde an Kieselgel 60 der Firma Fluka durchgeführt. Dimethoxytrityl-enthaltende Verbindungen wurden detektiert nach Entwicklung der Dünnschichtplat- ten in Salzsäuredampf. Protonenkernresonanzspektren wurden auf einem Bruker AC300-Spektrometer vermessen. Die Signale beziehen sich auf Deuterochloroform als internen Standard. UV-Spektren wurden auf einem Shimadzu UV-160 (UV/Vis) bestimmt. Die HPLC-Analytik wurde auf einem Beckman System-Gold 180 Pump Model 167 Multiwave- length-UV-Detector gefahren. Für die automatische RNA- Synthese stand ein DNA-Synthesizer 381A von Applied Biosystems zur Verfügung. AdamantancarbonylChlorid und IM Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran wurden von Fluka bezogen. Dichloressigsäure in Methylenchlorid und Pyridin/Acetonitril (1:1, v/v) stammen von Applied Biosystems.
Beispiel 1
Synthese von 2'-0-(t-Butyldimethylsilyl)-5'-0-(4,4*-Di- methoxytrityl)-N 2-Dimethylamm. omethylenguanosm. (Ia)
Eine Suspension von wasserfreiem Guanosin (10 mMol) in N,N-Dimethylformamid (25 ml) und N,N-Dimethylformamid- diethylacetal (6 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Zur klaren Lösung wurde 1 ml Wasser ge¬ geben, und nach 5 Minuten wurde die Lösung mit 100 ml Pyridin verdünnt und im Vakuum zu einem sirupösen Rück¬ stand eingeengt. Es wurden 30 ml Pyridin zugesetzt so¬ wie 11 mMol 4,4'-DimethoxytritylChlorid. Die Mischung wurde 10 Minuten gerührt und über Nacht belassen. 1 ml Methanol wurde zugesetzt, und nach 10 Minuten wurde die Mischung im ölpumpenvakuum eingeengt, bis sich ein Schaum bildete. 20 ml Pyridin und 26 mMol Imidazol wur¬ den zugesetzt, 10 Minuten gerührt und t-Butyldimethyl- chlorsilan (13 mMol) zugesetzt und für eine weitere Stunde gerührt. Das Gemisch wurde mit 60 ml Chloroform/ 30 ml Wasser ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wurde mit 10 ml Chloroform extrahiert, die kombinierten Chlo¬ roformextrakte mit 30 ml Toluol verdünnt und eingeengt bei Raumtemperatur. Der Rückstand wurde mit 30 ml Toluol verdünnt und nochmals eingeengt. Restliches Lösungsmit¬ tel wurde im ölpumpenvakuum abgezogen. Der verbliebene Schaum wurde in 20 ml Chloroform mit 0,5% (v/v ) gelöst und auf eine 400 ml Silicagelsaule aufgetragen, die im gleichen Lösungsmittel äquilibriert war. Man eluierte mit Chloroform/Triethylamin (99,5/0,5) in 250 ml-Portio- nen mit einem steigenden Gehalt an Isopropanol von 1%, 2%, 3%, 5% und 6%. Die DMT-positiven Fraktionen wurden 50 l-weise aufgefangen und mittels Dünnschichtchroma¬ tographie im Laufmittel S. kontrolliert. Die Fraktionen 12 bis 17 enthielten reines Ia (5,1 g), erhalten nach Einengen und weiterem Einengen mit Chloroform (68% Aus¬ beute, bezogen auf Guanosin) . Die Fraktionen 20 bis 22 ergaben 1,8 g (24%) an unerwünschtem Isomer Ib.
Beispiel 2
2 '-O-(t-Butyldimethylsilyl)-5'-0-(4,4'-Dimethoxytri¬ tyl)-N -Dimethylaminoethylenadenosin (Ha)
Die Verbindung wurde, ausgehend von 10 mMol Adenosin, nach demselben Schema wie (Ia) präpariert. Die Endrei¬ nigung wurde mit demselben Anfangslaufmittel in 250 ml- Portionen durchgeführt bei jeweils steigenden Mengen von 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25% und 1,5% an Isopropa¬ nol. Die jeweils gesammelten Fraktionen enthielten 3,6 g (50%) von Ha (Rp - S1 0,80) und 2,1 g (29%) des Iso ers Ilb (R„-S1 0,77).
Beispiel 3
Herstellung der H-Phosphonate (Ic, IIc)
Die Verbindungen wurden in gering abweichender Form nach Froehler, B.C. et al. (1986) , Nucl. Acids Res. 14, 5399-5407, präpariert. Eine Lösung von 30 mMol Imidazol in 75 ml Methylenchlorid wurde unter Rühren auf Eis gekühlt, und 2M Phosphortrichlorid in Dichlormethan (4,32 ml) wurden per Spritze unter Rühren zugesetzt, gefolgt von einer Zugabe von 4,2 ml Triethylamin. Die Mischung wurde für 15 Minuten gerührt und dann die Lö¬ sung des geschützten Ribonukleosids (2 mMol, zuvor mit 10 ml Acetonitril eingedampft) in 25 ml Methylenchlorid über 20 Minuten tropfenweise zugefügt. Nach einer Stun¬ de zeigte die Dünnschichtchromatographie im Laufmittel¬ system S3, daß die Ausgangssubstanz vollständig reagiert hatte. 20 ml Wasser wurden zugesetzt und die Mischung für 5 Minuten gerührt. Die organische Phase wurde abge¬ trennt, die wäßrige Phase mit 40 ml Chloroform extra¬ hiert und die vereinigten Extrakte mit Toluol verdünnt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Chlorofor /Tri- ethylamin (99:1,8 ml) aufgenommen und auf eine 100 ml Silicagelsaule, die mit gleichem Lösungsmittel äquili- briert war, aufgetragen. Die Elution wurde 100 ml-weise durchgeführt mit Startlösung, nacheinander auf 5%, 10%, 15% und 25% Methanol eingestellt. Die geeigneten Frak¬ tionen wurden eingeengt und der Rückstand zweimal mit Chloroform aufgenommen, eingeengt, im ölpumpenvakuum getrocknet und das Triethylammoniumsalz des H-Phospho- nates Ic bzw. IIc als glasiger Schaum erhalten (Ic: 1,46 g = 79%, p-S3 0,55), (IIc: 1,55 g = 86%, Rp-S3 0,68) .
Beispiel 4
Automatische RNA-Synthese
Die H-Phosphonate wurden in 50% Pyridin/Acetonitril zu einer Konzentration von je 0,03 M gelöst. Frisch subli- miertes Adamantancarbonylchlorid wurde gleichfalls in 50% Pyridin/Acetonitril gelöst in einer Endkonzentra¬ tion von 0,12 M. Die automatische Oligoribonukleotid- synthese wurde in kommerziellen DNA-Synthesemaschinen durchgeführt (z.B. AB/381A) . Die Kopplungszeiten be- trugen 5 bis 10 Minuten. Dies wurde erreicht durch auf¬ einanderfolgende Pulse einer l:l-Mischung (v/v) der 0,1 M H-Phosphonat- und 0,4 M Adamantancarbonylchlorid- lösung auf die CPG-Trägersäule (1,1 ml/min Flußrate) , gekoppelt mit 1 μMol Starternukleosid. Nach jedem Puls wurde ein Warteschritt von 60 Sekunden eingelegt.
Beispiel 5
Schutzgruppenabspaltung und Reinigung eines RNA-Oligo- nukleotids
Die Abspaltung des rohen Oligoribonukleotids vom CPG- Träger und die Schutzgruppenabspaltung wurden in einem Schritt vorgenommen. Der CPG-Träger wurde mit 2 ml Ethanol/35% NH3 (1:3, v/v) für 48 Stunden bei Raumtem¬ peratur behandelt. Nach Filtration wurde die resultie¬ rende Lösung zur Trockne eingeengt. Das verbleibende farblose 2'-blockierte Oligoribonukleotid wurde in 2 ml IM Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3, 6, 9, 12 und 24 Stunden wurden 10 μl Aliquots entnommen und auf Nucleosil C-4 HPLC (Macherey - Nagel, 4,6 mm x 25 cm, e
300 A, 5 μ Partikel) analysiert (Gradient 70 Minuten, 100%, 50 mM Triethylacetat/Essigsäure pH 7,3 bis 100% Acetonitril). Nach 24 Stunden waren die 2'-Schutzgruppen vollständig entfernt (singuläre HPLC Peak) . Die rohe RNA wurde über Biogel-P6 entsalzt. Eine weitere Reini¬ gung der RNA wurde in Teilen an Sepharose A25 in einem Puffer von 400 mM NaCl, 20 mM Natriumacetat pH 5,2 und 10 mM MgCl_ durchgeführt. Die Elution wurde mit 1 M NaCl, 20 mM Natriumacetat pH 5,2 und 10 mM MgCl. durch¬ geführt. Die Entsalzung erfolgte wie bereits beschrie- ben. Die gelelektrophoretische Analytik wurde bei
♦ 12,5 V/cm auf einem 20%-igen Polyacrylamidgel in 7 M j Harnstoff ausgeführt (89 mM Tris, 89 mM H3B03, 2,5 m
J MEDTA, pH 8,2) .
Beispiel 6
Funktionsprüfung der synthetischen RNA durch Amino- acylierung
Die Aminoacylierung wurde in 150 mM Tris/HCl pH 7,6, 50 mM Kaliumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM ATP, 5 mM ß-Mercaptoethanol, 300 μM (14C)-Alanin (162 Ci/Mol) in Gegenwart von 0,3 A_60-Einheiten an RNA und 50 μg Ala-tRNA-Synthetase (E.coli) durchgeführt, Totalvolumen 100 μl, 37"C. 10 μl Aliquots wurden nach entsprechenden Zeiten (Figur 2) entnommen und auf Whatman 3MM-Filtern analysiert. Trichloressigsäure-fällbare radioaktive
Fraktionen wurden im Beckman-Scintillationszähler be- stimmt (LS 1801) . Die Alanyl-tRNA Ala-Synthetase aus
E.coli (spezifische Aktivität 57,5 u/mg; 1 Unit kataly- siert die Bildung von 1 nMol Ala-tRNA Ala bei 37*C in einer Minute) wurde isoliert nach Hill, K. und Schimmel.
P. (1989), Biochemistry 28., 2577-2586.
Die Figur 2 zeigt Aminoacylierung in Gegenwart (-A-) und Abwesenheit (-•-) chemisch synthetisierter RNA mit Alanyl-tRNA-Synthetase aus E.coli und ( 14C)-Alanin mit der in Beispiel 6 angegebenen spezifischen Radioaktivi¬ tät. Bei den angegebenen Zeiten wurden 10 μl Aliquots aus dem Reaktionsgemisch entnommen und die Gesamtradio¬ aktivität der mit Trichloressigsäure fällbaren Radio¬ aktivität gemessen.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Nukleoside der Formel
Figure imgf000018_0001
wobei , wenn
B = Guanin oder 8-Haloguanin,
R eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Dimethyl- ammomethylengruppe (DMM) an Position N 2 des Purin¬ restes,
R 2 eeiinnee AAll:kylsilylgruppe oder Methylgruppe oder Was- serstoff (H) ,
3 R eeiinnee TTrriieetthhyylammonium H-Phosphonatgruppe, ein Was- serstoffato oder eine Phosphoramiditgruppe,
4 R eine substituierte Tritylschutzgruppe oder H ist, und wobei, wenn
B = Adenin oder 8-Azidoadenin,
R eine Amidinschutzgruppe, insbesondere die Di ethyl- aminomethylengruppe (DMM) an N des Purinrestes ist und
R 2, R3 und R4 wie bei B = Guani.n sind.
2. Nukleoside nach Anspruch 1, wobei die Alkylsilylgruppe
R R 2 2 tt--BBuuttyyllddii.mmeetthhyyllssiillyyll uunndd//ooddeerr ddli.e substi.tui.erte Tπ.- tylgruppe 4,4'-Dimethoxytrityl ist.
3. Ribonukleinsäuren aus mindestens zwei Ribonukleinsäure- Nukleosiden enthaltend als Nukleosid mindestens eine der Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mono¬ meren über die Sauerstoffatome an Kohlenstoffatom C-5 des einen und an Kohlenstoffatom C-3 des anderen ver- knüpft sind, so daß die entsprechenden Reste R = R jeweils zur Hälfte der PO,-Brücke entsprechen.
4. Ribonukleinsäuren nach Anspruch 3, wobei die RNA Mes- senger-RNA ist.
5. Ribonukleinsäuren nach Anspruch 4, wobei die Messenger- RNA zur Synthese von Proteinen geeignet ist.
6. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Amidinschutzgruppe, insbesondere DMM-Gruppe in die A/G-Nukleoside einge¬ führt wird, danach die 5'-Position der Ribose mit einer Tritylschutzgruppe geschützt wird, die 2*-Position der Ribose silyliert sowie die 3'-Position phosphoniert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Reaktion als soge¬ nannte Eintopfreaktion ausgestaltet ist, beginnend mit dem entsprechenden Nukleosid des Adenins oder Guanins und schrittweiser Durchführung der Herstellung der Syn¬ thone für die RNA-Synthese.
8. Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäuren unter Verwendung mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die DMM-H-Phosphonate in Gegenwart von 1-Adamantancarbonylchlorid kondensiert werden, die Schutzgruppen durch 10- bis 50-stündige, vorzugsweise 48-stündige, Einwirkung von wäßriger ammo- niakalischer Ethanollösung, die 2 •-O-Schutzgruppen durch 5- bis 30-stündige, vorzugsweise 24-stündige, Einwirkung von Tetrabutylammoniu fluorid in Tetrahydro- furan bei Raumtemperatur bei 15 bis 30*C, vorzugsweise 20 bis 25βC entfernt werden und das Rohprodukt chroma¬ tographisch gereinigt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei zwi¬ schen den Abspaltungsschritten die jeweiligen Fraktio¬ nen von Salz befreit werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die RNA Messenger-RNA ist.
12. Arzneimittel enthaltend RNA nach einem der Ansprüche 3 bis 5.
13. Arzneimittel nach Anspruch 12, wobei die RNA antisense RNA, ein Ribozym ist und/oder proteinspezifisch bindet.
14. Verwendung der RNA nach einem der Ansprüche 3 bis 5 als mRNA zur Proteinsynthese, als antisense RNA, als Ribo¬ zym und/oder als spezifischer Ligand von RNA-bindenden Proteinen, wobei dieser gegebenenfalls durch entspre¬ chende chemische Gruppen kovalent an das Protein gebun¬ den wird.
15. Verwendung der RNA nach einem der Ansprüche 3 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ge¬ netisch bedingten und/oder infektiösen Erkrankungen durch intrazelluläre Komplexierung komplementärer Nu- kleinsäure in biologisch nicht funktionsfähigen Doppel¬ strangstrukturen oder durch ribozym-enzymatische Inak- tivierung der die entsprechende Erkrankung auslösenden spezifischen Nukleinsäuren.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0595839A4 (de) * 1991-07-12 1994-08-03 Applied Biosystems, Inc.

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 113, Nr. 7, 13. August 1990, Seite 761, Zusammenfassung Nr. 59748e, (Columbus, Ohio, US); B.S. SPROAT et al.: "New synthetic routes to protected purine 2'-O-methylriboside-3'-O-phosphoramidites using a novel alkylation procedure", & NUCLEIC ACIDS RES. 1990, 18(1), 41-9, siehe Zusammenfassung, & CHEMICAL ABSTRACTS FORMULA INDEX, Band 113, C24-Z (Part 3 of 3 parts), Juli-Dezember 1990, Index of Ring Systems, siehe C35H38N6O7 guanosine, 5'-O-Äbis(4-methoxyphenyl)phenylmethylÜ-N-Ä(dimethylamino)methylene-2'-O-methyl. *
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 77, Nr. 7, 14. August 1972, Seite 520, Zusammenfassung Nr. 48730e, (Columbus, Ohio, US); K.K. OGILVIE et al.: "Synthesis of 8,2'-thioanhydroguanosine", & CAN. J. CHEM. 1972, 50(7), 1100-4, siehe Zusammenfassung, & CHEMICAL ABSTRACTS, NINTH COLLECTIVE FORMULAE INDEX, Bands 76-85, 1972-1976, Formulas C12H10N2O3-C14H18F6O6, siehe C13H17BrN6O5: Guanosine, 8-bromo-N-Ä(dimethylamino)methyleneÜ und C33H33BrN6O6: Guanosine, 8-bromo-N-Ä(dimethylamino)methyleneÜ-5'-O-Ä(4-methoxyphenyl)diphenylmethylÜ *
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 93, Nr. 19, 10. November 1980, Seite 312, Zusammenfassung Nr. 182338s, (Columbus, Ohio, US); "Studies on polynucleotide synthesis. XI. Synthesis of the tetranucleoside triphosphate CpGpCpm2-2G of the 5'-half molecule of yeast alanine transfer RNA", & SHENG WU HUA HSUEH YU SHENG WU WU LI HSUEH PAO 1980, 12(1), 87-92, siehe Zusammenfassung, insbesondere "N-(dimethylaminomethylene)-3'-guanylic acid" *
COLLECTION OF CZECHOSLOVAK CHEMICAL COMMUNICATIONS, Band 31, Nr. 8, August 1966, Seiten 3198-3211; J. ZEMLICKA et al.: "Oligonucleotidic compounds. XIV. Synthesis of some diribonucleoside phosphates using the N-dimethylaminomethylene derivatives of2',3'-O-ethoxymethylene ribonucleosides", siehe den ganzen Artikel *
COLLECTION OF CZECHOSLOVAK CHEMICAL COMMUNICATIONS, Band 32, Nr. 9, 11. Oktober 1967, Seiten 3159-3168; J. ZEMLICKA et al.: "Preparation of N-dimethylaminomethylene derivatives - a new method of a selective substitution of nucleoside amino groups", siehe den ganzen Artikel *
COLLECTION OF CZECHOSLOVAK CHEMICAL COMMUNICATIONS, Band 34, Nr. 8, 26. September 1969, Seiten 2449-2458; A. HOLY et al.: "Oligonucleotidic compounds. XXXIII. A study on hydrolysis of N-dimethylaminomethylenecytidine, -adenosine, -guanosine, and related 2'-deoxy compounds", siehe den ganzen Artikel *
COLLECTION OF CZECHOSLOVAK CHEMICAL COMMUNICATIONS, Band 52, Nr. 10, Oktober 1987, Seiten 2572-2588; I. ROSENBERG et al.: "Synthesis of phosphonylmethyl analogues of diribonucleoside monophosphates containing modified internucleotide bond", siehe den ganzen Artikel *
JOURNAL OF HETEROCYCLIC CHEMISTRY, Band 14, Nr. 1, Februar 1977, Seiten 135-138, HeteroCorp.; H.L. CHUNG et al.: "Fluorescent derivatives of nucleosides", siehe Seite 135, Verbindungen 1b,3a-c,4 *
JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, Band 92, Nr. 11, 3. Juni 1970, Seiten 3445-3451; E. OHTSUKA et al.: "Studies on transfer ribonucleic acids and related compounds. II. A method for synthesis of protected ribooligonucleotides using a ribonuclease", siehe Zusammenfassung; Seite 3448, Verbindungen X,XI,XVI *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0595839A4 (de) * 1991-07-12 1994-08-03 Applied Biosystems, Inc.

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