WO1992001808A1 - Reactif permettant de diagnostiquer mycoplasma pneumoniae - Google Patents

Reactif permettant de diagnostiquer mycoplasma pneumoniae Download PDF

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WO1992001808A1
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monoclonal antibody
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Yoshiko Nakamura
Junichi Sato
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DOJIN IYAKU-KAKO Co Ltd
Dojin Iyaku Kako Co Ltd
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DOJIN IYAKU-KAKO Co Ltd
Dojin Iyaku Kako Co Ltd
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56933—Mycoplasma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Gram-negative bacteria
    • C07K16/1253—Gram-negative bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]

Definitions

  • the present invention provides a diagnostic reagent for Mycoplasma pneumoniae stably containing an anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody or a labeled antibody thereof, and an anti-Mycoplasma pneumoniae antibody obtained from culture supernatant of hybridoma.
  • Mycopusma's pneumoniae infection occurs in epidemics about every four years, and in children and young people, it can lead to serious complications such as aggravation and central nervous system damage.
  • Mycoplasma' pneumoniae infections are the second most common common cold syndrome after those caused by viruses. A prompt definitive diagnosis in the early stages is needed.
  • diagnostic methods currently used include culture methods and serological methods, but both require a long period of time.
  • detection of antibodies in serological diagnostic methods becomes possible only after the recovery period, and there is a drawback that non-specific reactions are not uncommon.
  • the present inventors have conducted research to solve such drawbacks, and have previously obtained an anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody specific to Mycoplasma pneumoniae, which is used to diagnose Mycoplasma pneumoniae infection. We found that it is useful as a medicine (Japanese patent application Sho 63-184064).
  • antibody purification is generally performed by immunoglobulin purification methods such as ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, gel filtration, and affinity chromatography using protein A and antigens. It is carried out based on the law.
  • the present inventors also disclosed in the above-mentioned patent publication that an anti-My. have antibodies.
  • the following points were extremely disadvantageous in obtaining a large amount of anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody.
  • the culture supernatant of hybridomas producing anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibodies is concentrated 2- to 20-fold, then salted out, and the resulting fraction is treated with pH 0-7.5.
  • a method for purifying an anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody characterized by dissolving in a buffer of pH 8-10 after washing with a buffer of
  • a method for stabilizing an anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody characterized by dissolving it in a solution or further freeze-drying it;
  • An anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody (hereinafter abbreviated as the present monoclonal antibody) or its labeled product, and 5- to 5,000-fold weight of albumin for the antibody or labeled product.
  • a diagnostic reagent containing Mycoplasma pneumoniae (hereinafter abbreviated as M.P) is provided.
  • FIG. 1 shows the gel filtration pattern of the ammonium sulfate fraction washed with a neutral buffer in Example 3
  • FIG. 12 shows the gel filtration pattern of the unwashed ammonium sulfate fraction in Example 3. be.
  • hybridoma culture supernatant used for purification of the present monoclonal antibody can be obtained, for example, by the method described in JP-A-63-184064. That is, hybridomas (for example, C2-G3, G1-B8, G1-B6) obtained by fusing mammalian immunocompetent cells immunized with M.P. It can be obtained by culturing in an appropriate medium or by collecting peritoneal ice after injecting the hybridoma intraperitoneally into an animal.
  • hybridomas for example, C2-G3, G1-B8, G1-B6
  • the culture supernatant obtained as described above is adjusted to pH 8-9, and then concentrated 2- to 20-fold, preferably 5- to 10-fold.
  • the method of concentration is not particularly limited as long as it does not produce precipitates, but ultrafiltration or dialysis is preferred.
  • the concentrated culture supernatant is salted out to collect precipitates. Salting out can be performed, for example, by an ammonium sulfate fractionation method. That is, an equal volume of saturated ammonium sulfate solution adjusted to pH 7 was added to the concentrated solution (50% saturation) and allowed to stand overnight. 5), add a half volume of saturated ammonium sulfate solution (33% saturation) and collect the resulting precipitate.
  • the resulting precipitate was then washed with a small amount of pH 6.0-7.5 buffer, for example, 0.05 M phosphate buffer (PH 7.2), and then washed with pH 8.
  • a ⁇ 10 buffer solution such as 0.5 M carbonate buffer (PH 9.5)
  • PH 9.5 0.5 M carbonate buffer
  • the purity of the monoclonal antibody is considerably high, but it is preferable to purify it by a gel filtration method in order to further increase its purity.
  • a carrier for the gel filtration method a carrier suitable for the molecular weight of G, such as Cephalil S-300 HR, is used, and gel filtration is performed with a 0.5 M carbonate buffer (PH 9.5). preferred to do. Active fractions are collected and concentrated by ultrafiltration to obtain the purified monoclonal antibody. This purified antibody shows a homogeneous band by electrophoresis. In addition, when this purified antibody is dialyzed against a buffer more acidic than pH 9, a large amount of precipitate is produced, making handling difficult. It is preferable to carry out the operation on the side in a cool place.
  • the monoclonal antibody thus obtained has excellent specificity to M.p. 1251 ), colloidal gold, labeling with latex, etc., immunofluorescence assay, immunoassay, radioimmunoassay, gold particle immunoassay, agglutination reaction, etc. Although applicable as a diagnostic agent for infectious diseases, this monoclonal antibody is unstable and requires refrigeration. However, the monoclonal antibody or its labeled form is used in an amount of 5 to 1,000 times by weight, preferably 10 to 1,000 times the weight of the antibody or labeled form.
  • an aqueous solution of pH 5.5 to 8.5, preferably pH 6.0 to 8.0, containing 500 times by weight of albumin, or 5 to 5,000 times by weight of the antibody or label preferably Lyophilization of an aqueous solution of pH 5.5 to 5, preferably pH 6.0 to 0, containing 50 to 5,000 times the weight of albumin increases the stability of the monoclonal antibody. Room temperature storage is also possible.
  • an aqueous solution of pH 5.5 to 8.5, preferably pH 6.0 to 8.0 containing 10/1 g to 200 3 ⁇ 4 Zm of the present FITC-labeled monoclonal antibody is added with 1.0 mg to 20 mg Zm of albumin, Preferably, 2.0 mg to 5.0 mg/ ⁇ is added, or 5.0 mg to 50 mg Zm£, preferably 10 mg to 50 mg Zm, of albumin is added and lyophilized, The stability of this monoclonal antibody is enhanced and it can be stored at room temperature.
  • the type of albumin used in the present invention is not particularly limited, but serum albumin, especially bovine serum albumin (J3 ⁇ 4 below, BSA and omitted) is preferred.
  • the present monoclonal antibody thus obtained or its labeled product and the antibody or labeled product have a concentration of 5 to 5,000.
  • a composition with twice the weight of albumin can be used as a stable M.p diagnostic reagent.
  • Mac strain was inoculated into PPL0 liquid medium and precultured at 37 t for 5 days. This culture broth was inoculated into 1,000 of the same medium, and 100 ml of each was transferred to a 500-liter lupine and allowed to stand at 37°C for 5 days for culturing. After culturing, the culture medium was discarded, and 0.01M phosphate-buffered saline (pH 7.2) (abbreviated as PBS below) was added to the cells adsorbed on the glass surface, and the cells were collected with a rubber policeman. This bacterial solution was freeze-thawed four times and washed three times with PBS to obtain M.P membrane antigen (1). The protein concentration of this antigen was measured according to the method of Lowry et al. (note)
  • mice were administered intraperitoneally to BALBZ c-strain female mice (6 to 7 weeks old). One week later, they were boosted intraperitoneally with the same amount. After another 6 weeks, the mice were boosted intravenously with the same dose of M.P membrane antigen (2). One to two weeks later, after confirming that the blood antibody titer had increased, M.P membrane antigen (2) was intravenously administered in an amount equivalent to 10 as a protein.
  • spleens were aseptically collected.
  • the collected spleen was loosened with tweezers and passed through a mesh (#100) to obtain a cell suspension.
  • a 10-fold amount of tris-ammonium chloride buffer was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 2 to 3 minutes to remove erythrocytes. After washing three times with Eagle MBM medium (hereinafter abbreviated as MBM), 5.
  • MBM Eagle MBM medium
  • Pre-cultured myeloma cells (X63-Ag 8.6.5.3) were washed three times with MEM, and then 5. OX 106 cells were prepared into Zm.
  • 5.0 ⁇ of splenocytes and 5.0 ml of myeloma cells prepared in 4 were placed in a 40 ml centrifuge tube, centrifuged (1,100 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed. cells were collected. The pellet was loosened well, and 0.5 ml of a 50% polyethylene glycol 1000 solution prewarmed to 37 t was gradually added over about 1 to 2 minutes. Next, 10 ml of MEM that had been kept at 37° C.
  • RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum was added to prepare the myeloma cells to 5.0x 105 Zm£, and placed in a 96-well microplate. 200WZwell was dispensed. After culturing for 1 day in a carbon dioxide gas incubator containing 5% carbon dioxide gas at 37°C, half the medium was discarded and hypoxanthine was added to HAT medium (RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum). 0-4 M, aminopterin 4.0 X .10-7 M, thymidine 1.6 X 10-5 M) are added.
  • HAT medium HAT medium without aminopterin
  • HT medium HAT medium without aminopterin
  • HT medium HT medium without aminopterin
  • RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum every 2 to 3 days.
  • anti-M.p antibody-producing hybridomas were screened by BLISA method and indirect hemagglutination (Cerodia, Fujirebio Co., Ltd.). As a result, fused cells were found in 100% of the wells, of which antibody production was found in 6.8% of the wells, but reproducibility was observed in 3.7% of the wells after the culture process. %Met.
  • Antibody-producing hybridomas were cloned by the limiting dilution method. In other words, high pre-doma
  • hybridomas C2-G3, G1-B8 and G1-B6 were obtained.
  • the hybridoma G1-B6 obtained in Reference Example was cultured using GIT medium (manufactured by Yusui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37 tons in a carbon dioxide incubator containing 5% carbon dioxide gas.
  • the culture supernatant was collected on the 4th to 5th day, and the obtained culture supernatant (1,500 m was adjusted to pH 8, centrifuged (10, OOO rpm, 20 minutes) and filtered through a membrane filter. , The filtrate was concentrated 5-fold by ultrafiltration.To this concentrate was added an equal volume of saturated ammonium sulfate solution (SAS) adjusted to PH 7 (50% saturation), left overnight in a cool place, and centrifuged.
  • SAS saturated ammonium sulfate solution
  • the precipitate was collected by heating (10, ⁇ for 20 minutes), dissolved in 200 ml of 0.5 ml carbonate buffer ( ⁇ 9.5), to which 100 ml of SAS was added. (33% saturation) After standing in the cold, the resulting precipitate was collected by a centrifugal cone (10, ⁇ for 20 min), which was added to 10 rn ⁇ of 0.05 M phosphate. After washing with a buffer (pH 7.2), the precipitate was collected by centrifugation ( ⁇ , ⁇ for 20 minutes), and suspended in 8 ml of 0.5 M carbonate buffer ( ⁇ 9.5).
  • Example 1 The same hybridoma culture supernatant as in Example 1 (1,500 ml) was added with an equal amount of saturated ammonium sulfate solution (SAS) adjusted to PH 7, and stored in a cold place.
  • SAS saturated ammonium sulfate solution
  • Example 1 The culture supernatant indicated in Example 1 was concentrated to various concentrations by ultrafiltration, to which half the volume or an equivalent amount of SAS was added (33% saturation or 50% saturation) to produce Antibody recovery rates in the precipitates were compared. The results are shown in Table 1.1.
  • FIG. 1 and Fig. 1 show the separation patterns when the ammonium sulfate fraction (3) washed with a neutral buffer and the unwashed ammonium sulfate fraction (1) were purified by the gel filtration method, respectively. It was shown to.
  • the PHA value indicates the aggregation activity using Celody Ryoichi MYC0- ⁇ (manufactured by Fujirebio Co., Ltd.). Antibodies were more clearly separated when the ammonium sulfate fraction washed with a neutral buffer was used.
  • the purified antibody (5 mg) obtained in Example 1 was added with 4 times the molar amount of FITC (fluorescein isoth iocyanate), and the mixture was dissolved in 0.5 M carbonate buffer (pH 9.5) for 4 hours. reacted. After completion of the reaction, insoluble matters were removed by centrifugation (10,000 rpm, 10 minutes), and the mixture was placed in a seph deck filled with 0.01 M carbonate buffer (PHS5) and 150 mM sodium chloride.
  • the purified fluorescently labeled monoclonal antibody was purified by gel filtration using a G-25* (manufactured by Pharmacia) column (diameter 10 mm, length 400 mm) to remove unreacted FI. The antibody was obtained (yield: 4.5 mg).
  • the FITC binding ratio (FZP ratio) per antibody molecule was 1.1. was confirmed by SDS-electrophoresis.
  • Example 1 1 nig of ⁇ -hide ⁇ -x'succinimide biotin (manufactured by Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) was dissolved in 50 to 100 dimethylformamide, and the purified antibody 5 obtained in Example 1 (after adjustment to 1 mgZ (dialyzed against 0.1 M sodium bicarbonate overnight against 4 tons) was added and reacted at room temperature for 4 hours. After completion of the reaction, insoluble materials were removed by centrifugation (10, OOO rpm, 10 minutes), followed by 0.01M carbonate buffer solution (pH 9.5) 0.15M sodium chloride-packed ult gel.
  • Example 8 Effect of BSA on thermal stability of fluorescently labeled antibody solution and solutions containing 1.0 mg to 50 mg of BSA and 8.5 mg of sodium chloride, respectively. These solutions were heated at 50 for 12 hours or 40 t for 1 week and the stability was compared to solutions without BSA. The results are shown in Table 1-4. As a result, this monoclonal antibody was stable in a solution containing 1.0 to 2013 ⁇ 4/ ⁇ of 85, and particularly stable in a solution containing 2.0 mg to 5.0 mg of BSA (that is, this monoclonal antibody against lonal antibodies Stable at 12.5-250 weight-fold BSA, especially stable at 25-62.5 weight-fold BSA).
  • Example 4 80 FITC-labeled monoclonal antibody obtained in Example 4, 5.0 mg to 50 mg BSA, and 8.5 mg sodium chloride were added per lm£ in a solution of pH 6.5. 0.5 mL of each of these solutions was dispensed into brown vials, lyophilized, and then replaced with nitrogen gas (each vial contains 40 FITC-labeled monoclonal antibodies and , 2.5 mg to 25 mg BSA, and 4.25 mg sodium chloride). These vials were heated at 50°C for 1 week and the stability was compared to vials without BSA. tie The results are shown in Table 1-5.
  • this monoclonal antibody was stable in a vial containing 2.5 nig to 25 nigZ vial of BSA, and was particularly stable in a solution containing 5.
  • Gmg to 25 mgZ vial of BSA (i.e. , stable at 62.5 to 625 times weight of BSA, particularly stable at 125 to 625 times weight of BSA against this monoclonal antibody).
  • BSA content 50 Heated for 1 week
  • Table 1-6 shows the stability of the Mycoplasma pneumoniae diagnostic agent using the fluorescently labeled monoclonal antibody produced by methods (1), (2), and (3).
  • an anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody having excellent specificity to Mycoplasma pneumoniae It has become possible to obtain the complex in large quantities at a low cost, in a simple manner, with high purity and high yield.
  • the stability of this anti-Mycoplasma pneumoniae monoclonal antibody or its labeled product can be remarkably enhanced, making it extremely useful as a diagnostic agent.

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Description

明 害
発明の名称
マイ コ プラズマ 一モニエ診断用試薬
技術分野
本発明は抗マイ コ プラズマ · ニュ ーモニエモノ ク ロ ーナル 抗体又はその標識体を安定に含有してなるマイ コプラズマ · ニュ ーモニエの診断用試薬、 並びにハイ プリ ドーマの培養上 清から抗マイ コプラズマ ' ニュ ーモニエモノ ク ロ ーナル抗体 を大量に、 かつ髙純度、 髙収率で簡便に精製する方法に関す る o
背景技術
マイ コプ ズマ ' ニュ ーモニエ感染症はおよそ 4年周期で 流行し、 小児'や若年者では重症化や中枢神経障害等の重篤な 合併症を招く ことがある。 マイ コプラズマ ' ニューモニエ感 染症はかぜ症候群の中ではウ ィ ルスによるものに次いで多く . 治療にはマクロ ライ ド系又はテ ト ラサイ ク リ ン系の抗生物質 が有効であるので、 本症の発病初期に於ける迅速な確定診断 が必要とされてき^。 しかし、 今日行われている診断方法と しては培養法や血清学的方法等が挙げられるが、 いずれも長 期間を必要とするものであった。 特に血清学的診断方法に於 ける抗体の検出は回復期に至って初めて可能になるものであ り、 非特異反応も少なくないという欠点があった。 本発明者 らは、 かかる欠点を解決すべく研究し、 先にマイ コプラズマ . ニュ ーモニエに特異的な抗マイ コプラズマ · ニュ ーモニエ モノ クローナル抗体を得、 これがマイ コプラズマ ' ニュ ーモ ニェ感染症の診断薬として有用であるこ とを見出した （特開 昭 63- 184064 号） 。
しかしながら、 当該抗マイ コプラズマ ' ニュ ーモニエモノ ク ϋーナル抗体の取得手段及びこれを含有する診断薬にはい くつかの問題点が存することが判明した。 すなわち、 抗体の 精製は、 一般に硫安分画法、 ィォン交換ク口マ トグラ フィ一 ゲル滤過法などの免疫グロブリ ンの精製法や、 プロテイ ン A や抗原による了フ ィ ニティ ーク ロマ トグラフ ィ 一法などに基 づいて行われている。 本発明者らも、 上記特許公開公報の中 で、 硫安分画法とプロティ ン Aセフ ァロース C L— 4 B (フ アルマシア社製） を組み合わせて精製された抗マイ.コブラズ マ · ニューモニエモノ ク ローナル抗体を得ている。 しかし大 量に抗マイ コプラズマ · ニューモニエモノ ク ロ一ナル抗体を 得るためには ^下の点で著しく不利であった。
1) 硫安分画での収率が著しく悪い。 5 0 %飽和硫安濃度 でも充分な抗体の沈澱物が得られない。
2) 中性の緩衝液に対して溶解性が悪く、 硫安沈澱物を少 量の緩衝液に髙濃度に溶解させることが困難である。 低塩濃 度の緩衝液に対しては更に溶解性が悪く、 透析すると多量の 沈澱物が析出して失活する。
3) プロテイ ン Aセフ ァ σ—ス 4 Bは高価である。
これらの問題点により、 本発明者らの見出した抗マイ コプ ラズマ · ニュ ーモニエモノ ク ϋ—ナル抗体は、 一般的な I g G に属する抗体の精製法によって精製することが困難であった c また、 得られた抗マイ コプラズマ · ニュ ーモニエモノ ク 口 ーナル抗体は、 通常の保存.条件では不安定であり診断薬と し て開発するには問題があった。 従って、 大量生産に適した抗マイ コプラズマ · ニュ ーモニ ェモノ ク ローナル抗体の精製法及び当該モノ ク ローナル抗体 を安定に維持した診断薬の開発が望まれていた。
本発明者らは、 かかる現状に鑑み鋭意研究した結果、 抗マ ィ コプラズマ · ニューモニエモノ ク ローナル抗体を産生する ハイ プリ ドーマの培養上清を濃縮した後塩折し、 P Hを一定の 範囲に調整すれば、 精製が容易に行い得ること、 及び得られ たモノ ク ローナル抗体を了ルブミ ンとともに一定の P Hを有す る緩衝液に溶解し、 又はこれを更に凍結乾燥すれば安定な診 断薬が得られることを見出し、 本発明を完成するに到った。 発明の開示
本発明は抗マイ コプラズマ · ニューモニエモノ ク ローナル 抗体を産生するハイ プリ ドーマの培養上清を 2〜 2 0倍に濃 縮し、 次いで塩析して得られた画分を P H 0〜7. 5 の緩衝液 で洗浄後 P H 8〜 1 0の緩衝液に溶解することを特徴とする、 抗マイ コプラズマ · ニューモニェモノク ーナル抗体の精製 法 ；
抗マイ コプ.ラズマ · ニューモニエモノ ク ローナル抗体又は その標識体を、 当該抗体又は標識体に対して 5〜5， 000 重量 倍のアルブミ ンを舍有する p H 5. 5〜8. 5 の水性溶液に溶解す るか又はこれを更に凍結乾燥することを特徴とする抗マイ コ プラズマ · ニューモニエモノ ク ローナル' 体の安定化法 ； 並 びに
抗マイ コプラズマ · ニューモニエモノ ク ローナル抗体 （以 下、 本モノ ク ローナル抗体と略す） 又はその標識体、 及び当 該抗体又は標識体に対して 5〜 5 , 000重量倍の了ルブミ ンを 含有するマイ コブラズマ · ニューモニエ （以下、 M. Pと略す） 診断用試薬を提供するものである。
図面の簡単な説明
図一 1 は、 実施例 3において中性緩衝液で洗浄した硫安分 画のゲル滤過パタ一ンを示し、 図一 2は実施例 3における未 洗浄硫安分画のゲル濾過パターンを示す図面である。
発明を実施するための最良の形態
本モノ ク ローナル抗体の精製に用いられるハイ ブリ ドーマ の培養上清は、 例えば特開昭 63- 184064 号に記載の方法によ つて得られる。 すなわち、 M. P で免疫した哺乳動物の免疫担 当細胞と骨髄腫細胞とを常法により融合させて得られたハイ ブリ ドーマ （例えば C2-G3, G 1-B8, G 1- B6)を適当な培地で培養 するか、 該ハイ プリ ドーマを動物の腹腔内に投与した後腹氷 を採取するこ-とによって得られる。
本発明精製法を実施するには、 まず上記の如く して得た培 養上清を pH 8〜 9 に調整した後、 2〜 2 0倍、 好ま しく は 5 ~ 1 0.倍に濃縮する。 濃縮方法は沈澱物が生じない方法であ れば特に限定されないが、 限外濾過法又は透析法が好ま しい, 次いで、 濃縮した培養上清を塩析して沈澱物を採取する。 塩 析は、 例えば硫安分画法によって行う ことができる。 すなわ ち、 濃縮液に PHを 7 に調整した等量の飽和硫安溶液を加えて ( 5 0 %飽和） 一夜静置し、 生じた沈澱物を 0. 5 M炭酸塩緩 衝液 （PH 9. 5 ) に溶解し、 2分の 1量の飽和硫安溶液を加え て （ 3 3 %飽和） 生じた沈澱を採取する。
次に得られた沈澱物を少量の P H 6. 0〜7. 5 の緩衝液、 例え ば、 0. 0 5 Mリ ン酸塩緩衝液 （PH 7. 2 ) で洗浄した後、 P H 8 〜 1 0の緩衝液、 例えば 0. 5 M炭酸塩緩衝液 （P H 9. 5 ) に溶 解すれば、 髙純度の本モノ ク口ーナル抗体溶液が得られる。 この段階で本モノ ク ローナル抗体はかなり純度が高いが、 更 に髙純度にするためにはゲル滤過法によって精製するのが好 ま しい。 ここで他の精製方法、 例えば弱イ オ ン交換ク ロマ ト グラ フィ 一などの中性域、 低塩濃度で吸着させることが必要 な精製法は適用が困難である。 また、 吸着、 溶出に酸性の状 態が必要な精製法は安定性の面から適用が困難である。 ゲル 攄過法の担体と しては G の分子量から適当な担^、 例えば セフ アタ リル S-300 H Rを用い、 0. 5 M炭酸塩緩衝液（P H 9. 5 ) にてゲル攄過を行うのが好ま しい。 活性画分を集め、 限外濾 過法にて濃縮し精製本モノ ク ローナル抗体を得る。 この精製 抗体は電気泳動で均一なバン ドを示す。 また、 この精製抗体 を P H 9より酸性側の緩衝液で透析すると、 多量の沈澱物が生 じ、 取扱いが困難になる.。 辺上の操作は冷所で行うのが好ま しい。
このようにして得られる本モノ ク ローナル抗体は、 M. p に 優れた特異性を持つことから、 そのまま、 あるいは蛍光色素 (例えばフルォレ ツ セ ンス） 、 酵素 （例えばペルォキシダー ゼ） 、 放射性物質 （例えば1 2 5 1 ) 、 金コロイ ド、 ラテ ッ クス などで標識して、 蛍光抗体法、 ェンザィ ムィ ムノ アツセィ、 ラ ジオィ ムノ 了ッセィ、 金粒子免疫測定法、 凝集反応などの 方法で、 M. P 感染症の診断薬として適用可能であるが、 本モ ノ ク ローナル抗体は不安定であり冷蔵保存が必要である。 し かし、 本モノ ク ローナル抗体又はその標識体を、 当該抗体又 は標識体に対して 5〜 1， 000重量倍、 好ま しく は 1 0〜 500 重量倍の了ルブミ ンを舍有する PH 5.5〜8.5 、 好ま しく は pH 6.0〜8.0 の水性溶液に溶解するか、 あるいは当該抗体 又は標識体に対して 5〜 5, 000重量倍、 好ま しく は 5 0〜 5， 000 重量倍のアルブミ ンを舍有する PH 5.5〜 5 、 好ま し く は PH 6.0〜 0 の水性溶液を凍結乾燥すれば.、 本モノ ク ロ ーナル抗体の安定性が髙まり、 室温保存も可能となる。 例え ば本 FITC標識モノ クロ—ナル抗体を 1 0 /"g〜200 ¾Zm£含む pH 5.5〜8.5 、 好ま しく は PH 6.0〜8.0 の水性溶液に、 アル ブミ ンを 1. Omg〜 2 0 mgZm 、 好ま しく は 2. Gmg〜5. Omg/ π ^添加するか、 あるいはアルブ ミ ンを 5. Omg〜 5 0 mgZm£、 好ま しく は 1 0 mg〜 5 0 mgZm£添加して凍結乾燥すれば、 本 モノ ク ロ ーナル抗体の安定性が高まり、 室温保存も可能とな 本発明で使用されるアルブミ ンの種類は特に限定されない が、 血清アルブミ ン、 特に牛血清アルブ ミ ン （J¾下、 BSA と 略す） が好ましい。
ここで、 アミ ブミ ンは本モノ ク ローナル抗体の反応を妨害 しないので、 かく して得られる本モノ ク ロ ーナル抗体又はそ の標識体及び'当該抗体又は標識体に対して 5〜5， 000 重量倍 のアルブミ ンを舍有する組成物は安定な M.p 診断用試薬と し て用いることができる。
実施例
以下実施例を挙げ、 本発明を更に詳しく説明する。
参考例
ハイ ブリ ドーマの調製法 ：
( i ) 抗体産生細胞の調製 ① マイ コプラズマ ' ニューモニエ（Mycoplasma
pneumoniae)Mac株を PPL0液体培地に接種して 3 7 tで 5 日間前培養を行った。 この培養液を同培地 1， 000 に接 種し、 各 100 m£を 500 »!£容ルーピンに移して 3 7 :で 5 日間静置して培養を行った。 培養後、 培養液を捨て、 ガ ラス面に吸着した菌体を、 0.01Mリ ン酸緩衝食塩液 （pH 7.2) (^下、 PBS と略す） を加えてラバーポ リ スマンに てかき集めた。 この菌液について凍結融解を 4 回繰り返 し、 PBS で 3回洗浄し M. P膜抗原 (1)と した。 この抗原の 蛋白濃度をロー リ ーらの方法に準じて測定した。 （注）
② 同様に、 Mac 株を佐々木らが報告している EY培地 （卵 黄 2 %含有） に接種して 3 7 :で 5 日間前培養を行った。 この培養'液を、 同培養液 1, 000 m£に接種して、 3 7 で
5 日間静置して培養を行った。 培養後、 培養液を捨てガ ラス面に吸着した菌体を、 PBS を加えてラバーポ リ スマ ンにてかき集めた。 この菌液について凍結融解を 4回行 い、 PBS で 3回洗浄して M. p膜抗原 (2)と した。 この抗原 についてもロー リ 一らの方法に準じて蛋白濃度を求めた。
③ M. P膜抗原 (1) (蛋白として 100 相当） をそのまま、
BALBZ c系雌性マウス （ 6 ~ 7週齢） の腹腔内に投与し た。 1週後、 同量を腹腔内に追加免疫した。 更に 6週後、 M. P膜抗原 (2)を同量静脈内に追加免疫を施した。 1 〜 2 週後、 血中抗体価が上昇していることを確認した後、 M. P 膜抗原 (2)を蛋白と して 1 0 相当量を静脈内に投与した。
(注) し owry, 0. H, N. J. Rosenbrough, A. L. Farr, and R. J. Randall, 1951, J. Biol. Chem. 193： 265-275
④ 最終免疫 3日後に脾臓を無菌的に採取した。 採取した 脾臓はピンセッ トでほぐし、 メ ッ シュ （ # 100)を通過さ せて細胞浮遊液とした。 ト リ ス塩化アンモニゥム緩衝液 を 1 0倍量加えて氷冷中 2〜 3分放置して赤血球を除去 した。 ィ ーグル MBM 培地 （以下、 MBMと略す） にて 3回 洗浄後 5. Ox 1 07.個 Zm£に調製した。
( π ) 細胞融合及び抗体産生ハイ プリ ドーマの調製
① 予め培養しておいたミ ェ口一マ細胞（X63- Ag 8.6.5.3) を MEM にて 3回洗浄した後、 5. OX 1 0 6 個 Zm£に調製 した。 （ i ) ④で調製した脾細胞 5.0 πι とミ エ口一マ細 胞 5.0m£を 4 0 m£の遠沈管にとり、 遠心分離（1, 100rpm、 5分間） して上清を除去して細胞を集めた。 ペレツ トを よく解きほぐし、 予め 3 7 tに温めておいた 5 0 %ポ リ エチレングリ コ ール 1000溶液 0.5 m£を約 1 〜 2分間で徐 々に加えた。 次に 3 7 に保温しておいた MEM 1 0 m£を 約 2 分の速度でゆつ く りと加えて反応を停止させた, 遠心分雜 （l，100rpm、 5分間） して上清を除去した後、 1 0 %牛胎児血清を含む RPMI- 1640培地を加え、 ミ エ口 —マ細胞が 5. Ox 1 05 個 Zm£になるよう に調製し、 9 6穴マイ クロプレー トに 200WZwell分注した。 3 7 で 5 %炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で 1 日培養し た後、 培地の半量を捨て HAT培地 （ 1 0 %牛胎児血清を 含む RPMI- 1640 培地にてヒポキサンチン 1. Ox 1 0— 4M、 ア ミ ノ プテ リ ン 4.0 X .1 0— 7M、 チ ミ ジン 1.6X 1 0一5 Mを加えたもの） 100 を添加する。 以後、 2 ~ 3日毎 に半量を HAT培地で交換した。 1 0〜 1 4 日後、 細胞の 増殖がみられたら、 培地の半量を HT培地（HAT培地からァ ミ ノプテ リ ンを除いたもの） で交換し、 2 日後 HT培地で 半量交換した後は、 2 ~ 3 日毎に 1 0 %牛胎児血清を含 む RPMI - 1640 培地で交換した。 約 2週間後、 BL I SA 法及 び間接赤血球凝集反応 （セロディ ア— 富士レビォ ㈱製を使用） により抗 M. p 抗体産生ハイ プリ ドーマをス ク リ ーニ ングした。 その結果、 融合細胞は 100%のゥェ ルに認められ、 そのうち抗体産生が認められたゥエルは 6. 8%であったが、 培養経過後も再現性の認められたも のは 3. 7 %であった。
抗体産生の認められたハイ プリ ドーマは限界希釈法に より、 クローニングを行った。 即ち、 ハイ プリ ドーマを
6. 0 個 Z m£に調製し、 正常 BALBZ c系マウスの胸腺細胞 を 1 0 7 個 Z に調製した液を 1 ： 1 に混合して、 9 6 穴マイ クロプレー トに 200 ずつゥエルに分注した。
3 7 tで 5 %炭酸ガスを含む炭酸ガス培蹇器中で培養し、 約 2〜 3週後に培養上清中の抗体産生を前記の方法にて 検討した。 その結果抗体産生の良好なハイ プリ ドーマに ついては再度クロ一ニングを繰り返した。 2回ク ロー二 ングをして得られたハイ プリ ドーマは、 培養上清中の抗 体を得ること及び長期の培養でも安 に産生することを 確認する目的で、 9 6穴マイ クロプレー トから 2 4穴マ ルチプレー ト に移しかえ、 更に 5 0 m£組織培養フ ラ スコ に移しかえた。 その結果、 抗体産生は長期の継代にても 安定に産生された。 以上の如く して、 ハイ ブリ ド一マ C2 - G3、 G1-B8 及び G1-B6 を得た。
実施例 1 本モノ ク σ—ナル抗体の精製
参考例で得られたハイ プリ ドーマ、 G1 - Β6 を GIT 培地 （曰 水製薬㈱製） を用いて、 3 7 tで 5 %炭酸ガスを舍む炭酸ガ ス培養器中で培養を行い、 .4〜 5 日目に培養上清を採取した, 得られた培養上清（1， 500m を PH8 に調整後、 遠心分雜 (10, OOOrpm. 2 0分間） しメ ンブラ ンフィ ルタ ーで濾過した, 濾液を限外濾過により 5倍に濃縮した。 この濃縮液に等量の PH 7 に調整した飽和硫安溶液（SAS) を加え （ 5 0 %飽和） 、 冷所にて一夜放置後、 遠心分雜（10, ΟΟΟΓΡΠΚ 2 0分間） によ り沈澱を集めた。 この沈澱物を 0. 5 Μ炭酸塩緩衝液（ΡΗ9. 5 ) 200 m£に溶解し、 これに 100 m£の SAS を加え （ 3 3 %飽和） . 冷所に静置後-、 生じた沈澱を遠心分錐（10， ΟΟΟΓΡΠΚ 2 0分 間） により集めた。 この沈澱物を 1 0 rn^の 0.05Μリ ン酸塩緩 衝液 （PH7.2)にて洗浄し、 遠心分雜（ΙΟ, ΟΟΟΓΡΠ 2 0分間） により.沈澱を集めた。 この沈澱物を 0.5Μ炭酸塩緩衝液 （ΡΗ 9.5) 8 m£に懸濁し、 0.5M炭酸塩緩衝液（PH9.5)で一夜透析し た。 ごく僅かに残った不溶物を遠心分雜（10, ΟΟΟΓΡΠΚ 2 0分 間） で除いた後、 0.5Μ炭酸塩緩衝液 （ΡΗ9.5)で充塡したセ フ ア タ リ ル S- 300 HR (フ ァルマシァ社製） のカ ラム （直径 26 mm、 長さ 1, 000mm)を用いてゲル濾過法によって分画した。 活 性画分を集め、 限外濾過により濃縮し精製抗体を得た （収量 35.6mg) 。 この精製抗体は電気泳動的に均一であった。
比較例 1 本モノ ク ローナル抗体の精製 （特開昭 63-184064
号の方法） 実施例 1と同様のハイ ブリ ドーマ培養上清 （l,500m に 等量の PH 7 に調整した飽和硫安溶液 （SAS)を加え、 冷所にて
—夜静置後、 遠心分雔（10, ΟΟΟΓΡΠΚ 20分間） により沈澱を集 めた。 この沈澱物を 0.05M ト リス緩衝食塩液（ PH8. 6 ) 250 m£に溶解し、 一夜透析した。 不溶物を遠心分雔（10, 000rpm、
20分間） で除いた後、 0.05M ト リ ス緩衝食塩液（ ΡΗ8· 6 ) で 充塡したプロティ ン Α—セフ ァ ロ ース 4 Β (フ ア ルマ シア社 製） のカ ラ ム （直径 2 6 mm. 長さ 400mni)を用いたァフ ィ ニテ ィ ーク ロマ ト グラ フ ィ ーによって分画し、 活性画夯を集め、 限外濾過により'濃縮し精製抗体を得た （収量 1.3mg)。
実施例 2
実施例 1に示した培養上清を限外瀘過法により種々の濃度 に濃縮し、 これに 2分の 1量または等量の SAS を加え （ 3 3 %飽和または 5 0 %飽和） 、 生じた沈澱物中の抗体回収率を 比較した。 結果を表一 1.に示した。
硫安沈澱によるハイ ブリ ドーマ培養上清からの抗体 回収率の比較
培養上清濃縮率 回収率 （％) 未濃 ¾ ( 3 3 %飽和） 1 0 未為 ( 5 0 %飽和） . 1 7 2 濃 f6 ( 5 0 %飽和） 2 5 5倍濃縮 ( 3 3 %飽和） 3 3 5倍濃縮 ( 5 0 %飽和） 8 7 1 0倍濃縮 ( 3 3 %飽和） 5 0 1 0倍濃縮 ( 5 0 %飽和） 8 3 実施例 3
実施例 1 に示した本モノ ク ロ ーナル抗体の精製過程で、 培 養上清から得られた 3 3 %飽和硫安沈澱物を中性緩衝液で洗 浄することによる精製効果を検討した。
5 0 %飽和硫安沈澱物を PH 9. 5炭酸塩緩衝液に溶解した液 を 2等分し、 それぞれに SAS 2分の 1量を加え、 3 3 %飽和 硫安沈澱物を得た。 一方はこれをそのまま P H 9. 5炭酸塩緩衝 液に溶解し（1) 、 もう一方は PH 7. 2 リ ン酸塩緩衝液で洗淨し (2) 、 その後 PH 9. 5炭酸塩緩衝液に溶解した（3) 。 それぞれ の抗体比活牲と回収率を比較した。 結果を表一 2 に示した。 表一 2 3 3 %飽和硫安沈澱物を中性緩衝液で洗浄すること による精製効果
精製段階 比活性 * 回収率 ^)
(1) 3 3 %飽和硫安沈澱物 630 100
(2) PH 7. 2 リ ン酸塩緩衝液洗浄液 350 12
(3) PH 9. 5炭酸塩緩衝液溶解液 820 88
* 活性単位 Zタ ンパク質量 （mg) また、 中性緩衝液で洗浄した硫安分画（3) と、 洗浄しない 硫安分画（1) をそれぞれゲル攄過法で精製したときの分雜パ ター ンをそれぞれ図一 1及び図一 2 に示した。 図一 1及び図 — 2中、 PHA 価はセロディ 了一 MYC0— Π (富士レビォ㈱製） を用いた凝集活性を示す。 中性緩衝液で洗浄した硫安分画を 用いた方が抗体がきれいに分雜していた。
実施例 4 蛍光標識本モノ ク ロ ーナル抗体の作製
実施例 1 で得た精製抗体 （ 5 mg) にモル比で 4倍量の FITC (Fluorescein i soth iocyanate)をカロえ、 0. 5 M炭酸塩緩衝液 (pH9. 5 ) 中で 4 ：、 時間反応した。 反応終了後、 遠心分 雜（10，000rpm、 10分間） により不溶物を除き、 0.01M炭酸塩 緩衝液 （PHS". 5 ) 、 150mM 塩化ナ ト リ ゥムで充塡したセ フ 了 デッ ク ス G-25* (フ ア ルマ シア社製） のカ ラ ム （直径 10,、 長 さ 400mm)を用いてゲル攄過法により未反応の FI を除き、 精 製蛍光標識本モノ ク ロ ーナル抗体を得た （収量 4. 5 mg〉 a 抗 体 1分子当りの FITC結合比 （ F Z P比） は 1. 1 であった。 ま た FITCはそのほとんどが抗体分子中の H鎖に結合しているこ とが SDS—電気泳動によって確認された。
実施例 5 ペルォキシダーゼ標識本モノ クロ一ナル抗体の作 製
西洋ヮサビ . ペルォキシダーゼ水溶液 （ 4 mg/m£) に、 4 mgの過ヨウ素酸ナ ト リ ウムを加え室温で 1 (3分間反応した。 反応絡了後、 I mM酢酸塩緩衝液 （PH4.0)に対し、 4 で一晩 透析した。 得られたアルデヒ ド · ペルォキシダーゼ溶液を、 0.2M炭酸塩緩衝液 （PH9.5)により PH9.3 に修正後、 直ちに、 実施例 1で得た精製抗体 5 mg (0.01M炭酸塩緩衝液 PH9.5 に 対し、 4でで一晩透析したもの） を加えた。 室温で 2時間反 応した後、 水素化ホゥ素ナ ト リ ウム 0.4 mgを加え、 4 t:で 2 時間反応後、 遠心分雜（10, 000rpm、 1 0分間） により不溶物 を除いた。 0.01M炭酸塩緩衝液 （PH9.5) · 150mM 塩化ナ ト リ ゥムで充塡したウルト ロゲル ACA- 44(LKB社製） のカ ラム （直 怪 16 、 長さ 700mm)を用いて、 ゲル濾過法により、 ペルォキ シダーゼと抗体の高分子重合体、 未反応のペルォキシダーゼ 及び抗体を除き、 精製ペルォキシダ一ゼ標識本モノ ク ローナ ル抗体を得た （収量 4.5mg) 。
実施例 6 ビォチン標識本モノ ク 口ーナル抗体の作製
Ν—ハイ ド αキシ ' スク シンィ ミ ドビォチン （フナコ シ薬 品社製） 1 nigを 5 0〜100 のジメ チルホルムァ ミ ドに溶解 し、 実施例 1で得た精製抗体 5 ( l mgZ に調整後、 0. 1 M炭酸水素ナ ト リ ゥムに対し、 4 tで一晩透析したもの） を 加え、 室温で 4 時間反応 した。 反応終了後、 遠心分離 (10, OOOrpm. 1 0分間〉 により不溶物を除去後、 0.01M炭酸 塩緩衝液 （pH9.5) · 0.15M塩化ナ ト リ ゥムで充塡したウル ト 口ゲル ACA- 44(LKB社製） のカ ラム （直径 16關、 長さ 400關）を 用いて、 ゲル濾過法により、 未反応の N—ハイ ドロキシ ' ス ク シンィ ミ ドビォチンを除き、 精製ビォチン標識本モノ ク 口 ーナル抗体を得た （収量 4. lmg) 。
実施例 Ί 蛍光標識抗体の熱安定性に対する PHの影響
当り、 8 0 の実施例 4で得られた FITC標識本モノ ク πーナル抗体と、 2 0 mgの BSA 、 及び 8.5 mgの塩化ナ ト リ ウ ムを含む溶液を種々の pHに調整した。 これらの溶液を 5 0 t で 1 2時間又は 4 0 t で 1週間加熱し、 安定性を比較した。 結果を表一 3に示した。
表一 3 蛍光標識抗体溶液の熱安定性に対する PHの影響
(残存活性の％で示した）
PH 50 ：、 12時間加熱 40 :、 1週間加熱
5.0 13% 46%
5.5 38% 78%
6.0 64% 82%
6.5 56% 83%
7.0 7% 71%
7.5 7% 74%
8.0 46% 64%
8.5 28% 63%
9.0 13% 50%
9.5 0% 29% 実施例 8 蛍 ·光標識抗体溶液の熱安定性に対する BSA の影響 PH6.5 の溶液中、 I mf当り、 80 の実施例 4で得た FITC標 識本モノ ク ロ ーナル抗体と、 1.0mg〜50mgの BSA 、 及び 8.5 mgの塩化ナ ト リ ゥムを含む溶液を各々調製した。 これらの溶 液を 50でで 12時間又は 40tで 1週間加熱し、 安定性を BSA を 含まない溶液と比較した。 結果を表一 4に示した。 その結果 本モノ ク ロ ーナル抗体は 1.0 〜201¾/^の85 を含む溶液 中で安定であり、 2.0mg~5. OmgZ の BSAを含む溶液中で特 に安定であった （すなわち、 本モノ ク ローナル抗体に対して 12.5~250重量倍の BSAで安定、 25〜62.5重量倍め BSAで特 に安定） 。
表一 4 蛍光標識抗体溶液の熱安定性に射する BSAの影響
(残存活性の％で示した）
BSA 含量 50t；、 12時.間加熱 40 、 1週間加熱
(mg/raf)
0 50% 74%·
1 67% 99%
2 77% 100%
5 86% 99%
10 73% 97%
20 66% 86%
50 53% 73% 実施例.9 蛍光標識抗体凍結乾燥品の熱安定性に対する BSA
の影響
PH6.5 の溶液中、 l m£当り、 80 の実施例 4で得た FITC標 識本モノ ク n—ナル抗体と、 5.0 mg〜50mgの BSA 、 及び 8, 5 mgの塩化ナ ト リ ウムを含む溶液を各々調製し、 これらの溶液 を 0.5 m£ずつ褐色のバイ アル瓶に分注し、 凍結乾燥後、 窒素 ガス置換を行った （ 1 バイ アル当り、 40 の FITC標識本モノ クローナル抗体と、 2.5mg〜25mgの BSA 、 及び 4.25mgの塩化 ナ ト リ ウムを含む） 。 これらのバイ アル瓶を、 50でで 1週間 加熱し、 安定性を BSA を含まないバイ アル瓶と比較した。 結 果を表一 5 に示した。
その結果、 本モノ ク ロ ーナル抗体は 2.5nig〜25ingZバイ アル の BSA を含むバイ アル中で安定であり、 5. Gmg：〜 25mgZバイ 了 ルの BSA を含む溶液中で特に安定であった （すなわち、 本モノ クローナル抗体に対して 62.5〜625 重量倍の BSA で安定、 125 〜625 重量倍の BSAで特に安定） 。
表一 5 蛍光標識抗体凍結乾燥品の熱安定性に対する BSA
の影響
(残存活性の％で示した） '
BSA 含量 50 :、 1週間加熱
(mg/バイ 了ル）
0 3%
2.5 35%
5.0 61%
10 88%
25 78% 実施例 1 0 蛍光標識本モノ クロ一ナル抗体によるマイ コプ ラズマ · ニュ ーモニエ診断薬
① 実施例 4で得た FITC標識本モノ ク ロ ーナル抗体 8 mg、
BSA 500 mg、 塩化ナ ト リ ウム 850 mg、 及び了ジ化ナ ト リ ゥ ム 50mgを 50mMリ ン酸塩緩衝液 （pH7.0) 100m£に溶解して褐 色ガラ ス瓶に 1 m£ずつ分注した。
② 実施例 4で得た FITC標識本モノ ク π—ナル抗体 2 mg、 BSA 500 mg、 塩化ナ ト リ ウム 850 mg、 及びァジ化ナ ト リ ゥ ム 50m を 50mMリ ン酸塩緩衝液 （PH8.0)100 ra£に溶解して褐 色ガラス瓶に 1 m£ずつ分注した。
③ 実施例 4で得た FITC標識本モノ ク口ーナル抗体 8 mg、 BSA2, OOOmg. 塩化ナ ト リ ゥム 850 mg、 及びアジ化ナ ト リ ゥ ム 50mgを 50mMリ ン酸塩緩衝液 （ΡΗ8.0)100 m£に溶解して褐 色ガラス瓶に 0.5 ί ^ずつ分注し、 凍結乾燥後、 窒素ガス置 換- ¾r行った。
①、 ②、 ③の方法で製造した蛍光標識本モノ ク ロ ーナル抗 体によるマイ コプラズマ · ニュ一モニエ診断薬の安定性を表 一 6 に示す。
比較例① BSA 無添加 PH9.5 の緩衝液に抗体を 80 Zm£溶 解させた液。
比較例② pH9.5 の緩衝液に BSA 5 mg/rd, 抗体を 80 ¾ m£溶解させた液を褐色ガラス瓶に 0.5 ？ ^ずつ分 注し、 凍結乾煶後、 窒素ガス置換を行った。 表一 6 マイ コプラズマ · 一ユーモニエ診断薬の安定性
(初期値を 1 0 0 とする） 保存条件 ① ② ③ 比較例① 比較例② 冷蔵庫中 1 力月 100 100 100 90 95
25 1 力月 100 98 98 15 40
40t: 1 力月 90 95 98 0 0 産業上の利用可能性
本発明によりマイ コプラズマ · ニュ一モニエに優れた特異 性を持つ抗マイ コプラズマ • 二ュ一モニエモノ ク ロ一ナル抗 体を、 安価、 簡便、 髙純度、 髙収率で大量に得られるように なった。 またこの抗マイ コプラズマ · ニューモニエモノ クロ ーナル抗体又はその標識体の安定性を著しく高めることがで き、 診断薬として極めて有用となった。

Claims

2 ί . 補正された婧求の範囲 【1991年 8月 9日（09.08.91)国際事務局受理;出願当初の請求の範囲 3-5は捕正された請求の 範囲 6-8に Sきかえられた;新しい請求の範囲 3— 5が加わった；他の講求の範囲は変更な し。 (21)]
1. 抗マイ コプラズマ ' ニュ ーモニエモノ ク ローナル抗体 又はその標識体、 及び当該抗体又は標識体に対 して 5 〜 5, 000 重量倍の了ルブミ ンを含有するマイ コプラズマ ' ニュ 一モニエ診断用試薬。
2 . 抗マイ コプラズマ ' ニュ ーモニエモノ ク ロ ーナル抗体 又はその標識体、 及び当該抗体又は標識体に対 して 5 〜 5, 000 重量倍の了ルブミ ンを ρΗ 5.5〜 5 の水性溶液に溶解 した後凍結乾燥することにより得られる請求項 1 記載のマイ コプラズマ ' ニュ ーモニエ診断用試薬。 . ·
3. (追加） 1 0 g ~ 2 0 0 g /m£の抗マイ コプラズマ ' ニュ ーモニエモノ ク ローナル抗体又はその標識体、 及び
5. Omg ~ 5 0 mgZm^の了ルブミ ンを pH 5.5〜8.5 の水性溶液 に溶解した後凍結乾燥することにより得られる請求項 1 記載 のマイ コプラズマ · ニ ュ ーモニエ診断用試薬。
4. (追加） 抗マイ コプラズマ ' ニューモニエモノ ク ロ一ナ ル抗体又はその標識体 1 〜 2 (3重量部、 及び了ルブ ミ ン 100 〜2， 000 重量部を PH 5.5〜8. 5 の水性溶液に溶解することに より得られる請求項 1 記載のマイ コプラズマ · ニュ ーモニエ 診断用試薬。
5. (追加） 1 0 i g〜 2 0 O i g Zm^の抗マイ コ プラズマ ' ニューモニエモノ ク π —ナル抗体又はその標識体を、 1.0 mg〜 2 0 mg Z miのアルブ ミ ンを含有する pH 5.5-8.5 の水性 溶液に溶解することにより得られる請求項 1 記載のマイ コプ ラズマ ♦ ニュ ーモニエ診断用試薬。
6 . (補正後） 抗マイ コプラズマ ' ニュ ーモニエモノ ク ロ一 ナル抗体又はその標識体を、 当該抗体又は標識体に対して 5 〜： U 000 重量倍のアルブミ ンを舍有する PH 5.5〜8. 5 の水性 溶液に溶解することを特徵とする抗マイ コプラズマ · ニュ ー モニエモノ ク 口 ーナル抗体の安定化法。
7. (補正後） 抗マイ コプラズマ ' ニュ ーモニエモノ ク n— ナル抗体又はその標識体を、 当該抗体又は標識体に対して 5 -5, 000 重量倍のアルブミ ンを舍有する PH 5.5-8.5' の水性' 溶液に溶解した後凍結乾燥することを特徴とする抗マイ コプ ラズマ . ニュ ーモニエモノ ク ロ ーナル抗体の安定化法。
8. (補正後） 抗マイ コプラズマ ♦ ニュ ーモニエモノ ク ロ 一 ナル抗体を産生するハイ.ブリ ドーマの培養上清を 2 ~ 2 0倍 に濃縮し、 次いで塩折して得られた画分を PH6.0 〜？. 5 の緩 衝液で洗浄後 PH 8 ~ 1 0の緩衝液に溶解するこ とを特徴とす る、 抗マイ コ プラ ズマ ' ニュ ーモニエモノ ク τρ—ナル抗体の 精製法。 -
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