WO1992022643A1 - PREPARATION ENZYMATIQUE IMMOBILISEE ET PRODUCTION DE D-α-AMINOACIDE - Google Patents

PREPARATION ENZYMATIQUE IMMOBILISEE ET PRODUCTION DE D-α-AMINOACIDE Download PDF

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Yukio Yamada
Hirokazu Nanba
Masayuki Takano
Yasuhiro Ikenaka
Satomi Takahashi
Kazuma Okubo
Kazuhiko Yamada
Yoshiro Hiraishi
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    • C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the present invention relates to an immobilized enzyme preparation and a method for producing D-amino acid using the same.
  • the immobilized melamine preparation of the present invention is particularly useful as a D- ⁇ -a-intermediate for antibiotics such as D- ( ⁇ -hydroxypropyl) glycine used in the production of the antibiotic amoxicillin. Useful for the production of amino acids.
  • the present invention is intended to obtain an immobilized preparation of a weakened rubamil enzyme having stability that can withstand repeated use and to be used for industrial production.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above circumstances, and as a result, have found that an antioxidant is effective in stabilizing a weakened rubamil enzyme.
  • the present inventors have found that an immobilized preparation of a weakened rubamyl enzyme that can be used repeatedly can be obtained by bringing the rubamyl enzyme into contact with a solid support, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to an enzyme (hydrolytic rubamil enzyme) which hydrolyzes N-potassium-D-hiamino acid to produce D- ⁇ -amino acid, an antioxidant, and an appropriate fixing agent.
  • the present invention provides a method for producing D- ⁇ -amino acid.
  • the weakened balbamyl enzyme used in the present invention is melamine, which has an action of releasing the ⁇ -barbamil group of ⁇ -barbamil-D- ⁇ -amino acid. Any one may be used as long as it has a stereospecific action on D-amino acid or any action on D or L-amino acid. Depending on the mode used, an enzyme specific to D-amino acid is often useful.
  • microorganisms are suitable for industrial production.
  • microorganisms include Agrobacterium disclosed in Japanese Patent Publication No. 57-18793, Japanese Patent Publication No. 63-20520 and Japanese Patent Publication No.
  • the weakened rubamil enzyme may be present in the immobilized enzyme preparation as a purified enzyme, a partially purified enzyme, or a crude enzyme, optionally in the form of cells, and may have a weakened rubamil activity. As long as it can be demonstrated, it does not matter whether it exists or coexists.
  • Antioxidants include dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, L-cystine hydrochloride, cysteamine hydrochloride, dithioerythritol, dithiothreitol and dithioerythritol A mixture of lithol, reduced glutathione and the like can be used.
  • the immobilization support used depends on the mode of immobilization of the weakened rubamil enzyme.
  • a crude enzyme solution such as a cell-free extract or a partially purified enzyme solution subjected to ammonium sulfate fractionation is used for immobilization
  • a polymer support having an ion exchange group or a covalent bond group can be used. .
  • polymer support having an ion-exchange group examples include anion-exchange resins, such as Duolait® A having an exchange group of a primary, secondary, tertiary or quaternary amine, or Ambary Light IRA. (Registered trademark) series or polystyrene resin having a diethanol type functional group, for example, Diaion EX.
  • anion-exchange resins such as Duolait® A having an exchange group of a primary, secondary, tertiary or quaternary amine, or Ambary Light IRA. (Registered trademark) series or polystyrene resin having a diethanol type functional group, for example, Diaion EX.
  • a substituted polymethacrylic acid polymer having an aldehyde as a bonding group, a high-density alumina covered with a polyethylenimine / glutaraldehyde complex, etc. are used. it can.
  • the immobilized enzyme preparation of the present invention is produced as follows. First, a microorganism is cultured, the cells are collected, and then subjected to ultrasonic crushing and mechanical crushing.
  • a cell-free extract by using a homogenizer (eg, a homogenizer) or enzyme treatment.
  • a homogenizer eg, a homogenizer
  • an antioxidant of 0.1 mM to 20 mM, usually about 5 mM is present.
  • prominic acid sulfate is added at 1/5 to 1/10 of the protein amount to precipitate nucleic acids, heated at 50 ° C to 60 ° C for about 20 minutes, and then 4 ° C. Cool to C to precipitate thermolabile proteins, which are centrifuged to remove nucleic acids and thermolabile proteins. Further, if necessary, ammonium sulfate fractionation is performed to prepare an enzyme solution to be brought into contact with the support. During this time, the antioxidant should be present in the range of 0.1 mM to 2 O mM, usually about 5 mM.
  • the support After activating the exchange group with saline or the like, the support is equilibrated in a buffer containing 0.1 to 20 mM, usually about 5 mM of antioxidant. use.
  • the support and the enzyme solution are brought into contact with each other in the presence of 0.1 to 20 mM, usually about 5 mM of an antioxidant, and the mixture is stirred at 4 to 30 ° C, preferably at 25 ° C.
  • the amount of enzyme adsorbed After the amount of enzyme adsorbed has reached the expected amount (usually 8 to 48 hours), it is filtered, treated with a cross-linking agent, insolubilized and stabilized.
  • the cross-linking agent for example, known ones such as 1% or less (preferably 0.2%) of glutaraldehyde can be used.
  • the antioxidant is preferably present in the range of 0.1 mM to 2 O mM.
  • the cross-linked immobilized enzyme preparation is washed with distilled water or a buffer (preferably containing an antioxidant), and stored in a closed container at low temperature (about 4 ° C) in a wet state.
  • the loading of the enzyme varies depending on the degree of purification of the enzyme, etc., but generally it is 10 to 80 units of Z g support (here, 1 unit of weakened sorebamil enzyme is N-forced rubamil (1)
  • the reaction is carried out in the presence of an antioxidant
  • R is, if desired, a group having 1 or more carbon atoms which may be substituted with a group such as a hydroxyl group, an alkylthio group, a carboxyl group, an amino group, an amide group, etc.
  • An alkyl group having 4 to 4 carbon atoms, and an aromatic ring optionally having 7 to 8 carbon atoms such as a benzyl group or a phenyl group, which may be substituted with a hydroxyl group or the like; or, optionally, a hydroxyl group or a halogen. Also means a good funyl group] It is represented by
  • the amount of antioxidant is between 0.1 and 20 mM, preferably between 2.0 and 5.0 mM.
  • the concentration of the reaction substrate N-hydroxyl-D-amino acid is 5 to 25 wZv%, preferably 15 wZv%.
  • the amount of immobilized enzyme preparation used is in the range of 10 to 20 units, preferably 15 units, per substrate and preferably 10 units of Zg substrate per 10 to 80 units / g of support. This is done while controlling the pH in the range of pH 6.5-8.0, usually pH 7.0.
  • the temperature depends on the enzyme, but is generally 30. (: Up to 60 ° C, especially for thermostable enzymes, higher temperatures can be used.
  • the reaction is carried out by the column method or suspended in a reactor. In the latter case, a batch reaction is usually carried out.
  • the reaction time is about 6 to 48 hours per batch.
  • the immobilized enzyme preparation of the present invention is very stable, for example, there is almost no decrease in activity even after 15 or more uses. More than 30 repetitions were possible. It is preferable to replace the inside of the reaction vessel with an inert gas so that oxygen is absent.
  • the weakened lubamil enzyme was produced by bacterial lysis using the following method.
  • N—Carno 'Miru D—Phenylglycine 15 g Defoamer 15 g 15 liters of fermentation medium containing these components was prepared and adjusted to PH 7.0. This medium was placed in an 18 liter fermenter and autoclaved at 121 ° C. for 30 minutes. The urea and N-potassium-D-funyldaricin solutions were separately sterilized by Millipore filter, and 500 milliliters of each were added to the fermenter under aseptic conditions. In the fermenter, Agrobacterium radiopak- er KNK712 (FERMBP-190) grown in a similar medium without N-potassium-D-phenylglycine for 30 hours at 30 ° C was added. The seed culture of 0) was inoculated. The fermentation was kept at 3 and aerated. PH was controlled to 7.0 using sulfuric acid and a possible soda solution.
  • a 3% aqueous solution of protamine sulphate is added slowly with stirring, with the addition of 76 milliliters, to precipitate the nucleic acid.
  • the enzyme solution is heated at 50 ° C for 20 minutes and then cooled to 4 ° C. did. After overnight storage at 4 ° C, nucleic acids and proteins were precipitated and centrifuged to remove cell debris. The preparation was assayed to determine the weakness of the rubamil activity.
  • dithiothreitol was added to this enzyme preparation so as to have a concentration of 5 mM, and fractionation with ammonium sulfate was performed. Ammonium sulfate was added little by little while cooling with ice and stirring to precipitate the protein. An active fraction with an ammonium sulfate saturation of 15 to 35% was collected, dissolved in phosphate buffer (100 milliliters, pH 7.0), and a similar activity assay was performed.
  • Example 2 Samples of three ion exchange resins (Duolite, Amberlite and Dione) obtained from commercial sources were washed in 1M NaC1 for 1 hour, and then washed with 0.2M phosphorus containing 5mM dithiothreitol. Equilibrated overnight in acid buffer. The equilibrated resin was filtered and stored until needed. Partially purified melamine prepared as described in Example 1 was used for immobilization. 5 g and 10 mL (10 to 80 units Zg resin) of the enzyme of Example 1 after heat treatment and after ammonium sulfate fractionation, respectively, per 1 g (wet weight) of resin ) was mixed with 25 at 24 hours to adsorb the enzyme to the resin.
  • ion exchange resins Duolite, Amberlite and Dione
  • the enzyme-resin complex was filtered and treated with 1% glutaraldehyde at pH 7.0. After one hour, the resin sample was filtered again and washed three times with distilled water. Finally, wash the enzyme-resin complex with 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0) and keep it moist at 4 ° C in a closed container filled with N 2 gas.
  • Table 1 shows the specific activities obtained for a series of commercial exchange resins treated in this way.
  • Duolite and Amberlite resins are products of Rohm and Haas in Philadelphia, USA Diaion resin is a product of Mitsubishi Kasei Industries, Japan.
  • Example 3 Duolite and Amberlite resins are products of Rohm and Haas in Philadelphia, USA Diaion resin is a product of Mitsubishi Kasei Industries, Japan.
  • the temperature was controlled at 40 ° C while continuously blowing nitrogen gas. After the system was equilibrated, 147 units of the enzyme-resin complex (15 g) were added and reacted. During that time, the pH was adjusted to 7.0 with a hydrochloric acid solution. After 24 hours, the yield of D-hydroxyfunglysine was determined to be 97% by HPLC.
  • the product produced by this method can be isolated by conventional means and has been found to have high optical purity.
  • the enzyme-resin after the ammonium sulfate fractionation 15 g of N-carmyl-D-hydroxyphenylglycine and 8 mg of dithiothreitol were added to 100 milliliters of distilled water in a container with a jacket. The same operation was performed in the same manner as in the above, and 2 10 units of the enzyme-resin (3 g) were added.
  • the enzyme-resin used in this method should be used to ensure that the enzyme is kept under a nitrogen atmosphere at the end of the reaction, while keeping the enzyme under nitrogen atmosphere.
  • the substrate solution was aspirated and replaced with a fresh set of pre-equilibrated substrate suspension, which was reused 30 times. Throughout these cycles, conversion to D-hydroxykindylglycine was 95% or more.
  • Pseudomonas * species KNK003A (FERMBP-3181) was grown in the medium described in Example 1, and cells were harvested from 9 liters of fermentation broth by centrifugation. The cells are resuspended in 300 milliliters of 0.2M tris / hydrochloric acid buffer (pH 7.0), added to 5 mM dithiothreitol, and sonicated to dissolve rubamyl into the solution. The enzyme was released. To this, 20 milliliters of a 3% aqueous solution of protamine sulfate was gradually added with stirring to precipitate nucleic acids. The enzyme solution was heated at 65 for 20 minutes and then cooled to 4 ° C.
  • the partially purified enzyme solution after this heat treatment (activity: 0.0 100 milliliters were added to 10 g of Duolight A568 resin. The mixture was stirred at 25 ° C for 24 hours to adsorb the decarbamylase onto the support. The enzyme-resin complex was filtered and cross-linked gently for 1 hour in a 0.2% glutaraldehyde solution (pH 7.0) containing 5 mM dithiothreitol. Washed three times with distilled water and finally with 0.2 M Tris Z hydrochloric acid buffer (PH 7.0). Its specific activity was 0.38 units / g resin and the activity was 4.2 units / g when N-carbamyl-D-alanine was used as a substrate.
  • PH 7.0 Tris Z hydrochloric acid buffer
  • a column was filled with 1 g of the enzyme-resin produced by the method described in Example 4, and 2% N-hydroxyl-D- (P-hydroxyphenyl) glycine containing 1 mM of antioxidant was added.
  • the solution was passed through the above column to perform a continuous hydrolysis reaction.
  • Dithiothreitol, sodium cysteine hydrochloride, and cysteamine hydrochloride were used as antioxidants.
  • a continuous reaction was performed for 4 days under C and N 2 seals.
  • an immobilized preparation of a weakened rubamyl enzyme for producing D——amino acids which is important as an intermediate for antibiotics and the like.
  • this preparation By using this preparation, it can be used more than 30 times repeatedly, and it can be expected to be used for industrial production.

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Description

明 細 書
固定化酵素調製物および D— α—ァ ミ ノ酸の製造法
発明の分野
本発明は、 固定化酵素調製物およびそれを使用する D—ひ ーァ ミ ノ酸の製造法に関する。 本発明の固定化醇素調製物は、 特に、 抗生 物質ァモキシシリ ンの製造に用いる D—（ρ— ヒ ドロキシフ ヱ二ル） グリ シンなどのような抗生物質の中間原料となる D— α—ア ミ ノ酸 の製造に役立つ。
従来の技術
N—力ルバミ ル一 D— α—ァ ミ ノ酸誘導体を D一 a —マ ミ ノ酸に 変換できる酵素（以下 「脱力ルバミ ル酵素」 という）が存在するこ と は、 例えば、 特公昭 5 7— 1 8 7 9 3号、 特公昭 6 3 - 2 0 5 2 0 号、 特公平 1 — 4 8 7 5 8号などですでに知られている。
酵素または酵素産生細胞を不溶化すなわち固定化して使用すると、 不純物が少ない酵素反応液が調製でき、 生成物の回収が容易になる こと、 酵素の反復使用が可能になるためコス ト回収に有利であるこ となどがすでに他の多数の酵素について知られており、 また、 工業 生産にも使用して効果をあげている。
しかし、 脱力ルバ ミ ル酵素の場合、 全細胞、 ト ルエ ン化菌体、 細 胞のァセ トン処理粉末または無細胞抽出液として使用した例はある が、 固定化酵素としての使用は、 特公昭 6 3 - 2 0 5 2 0号に使用 態様としての可能性が一般的に示唆されているに過ぎな 、。
脱力ルバ ミ ル酵素のこれらの使用例は、 酵素活性は示すが、 活性 の錐持に問題がある。 特に、 反復使用の点で劣っており、 商業的べ —スで使用できるものではない。
発明の目的 - 本発明は、 反復使用に耐えうる安定性を備えた、 脱力ルバ ミ ル酵 素の固定化調製物を得、 工業生産への使用をはかるものである。 本発明者らは、 前記事情に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、 酸化防 止剤が脱力ルバミル酵素の安定化に有効であり、 これの存在下に脱 力ルバミ ル酵素を固体支持体と接触させることにより反復使用の可 能な脱力ルバミル酵素の固定化調製物を得ることができることを見 いだし、 本発明を完成させるに至った。
発明の概要
本発明は、 N —力ルバ ミ ル— D —ひーァ ミ ノ酸を加水分解して D — α —ア ミ ノ酸を生成させる酵素 （脱力ルバミ ル酵素） 、 酸化防止 剤および適当な固定化支持体からなることを特徵とする固定化酵素 調製物、 脱力ルバ ミ ル酵素を酸化防止剤の存在下、 固定化支持体に 接触させることを特徵とする該固定化酵素調製物の製造法、 および Ν —力ルバミ ルー D — α—ア ミ ノ酸に該固定化酵素調製物を作用さ せる.ことを特徴とする D— α —ァ ミ ノ酸の製造法を提供するもので あな。
発明の詳細な説明
本発明で用いる脱力ルバミ ル酵素としては、 Ν —力ルバミ ル一 D — α—ア ミ ノ酸の Ν —力ルバミ ル基を脱離する作用のある醇素であ ればいずれでもよく、 D—ァ ミ ノ酸に立体特異的な作用があるもの でも Dまたは L—ア ミノ酸いずれに作用するものでもよい。 使用す る態様にもよるカ^ 普通は D—ァミ ノ酸に特異的な酵素が有用なこ とが多い。
酵素源については、 動物、 植物、 微生物など特に制限はないが、 工業生産のためには微生物が適している。 かかる微生物としては、 例えば、 特公昭 5 7— 1 8 7 9 3号、 特公昭 6 3 - 2 0 5 2 0号お よび特公平 1 一 4 8 7 5 8号に開示されたァグロパクテリ ウム属、 シユー ドモナス属、 アースロバクター属、 アルカ リ ゲネス属、 ァク 口モバク夕一属、 モラキセラ属、 ノ、0ラコ ッカス属、 ァエロパクター 属、 ァエロモナス属、 ブレビバクテリ ウ厶属、 バチルス属、 フ ラボ パクテリ ゥム属、 セラチア属などの天然の微生物や、 特願平 2— 4 0 0 8 4 8号に記載されるごとき遺伝子組換えによって脱力ルバミ ル酵素産生能を付与された、 あるいは増強された人工微生物が挙げ られる。 これらの微生物の代表的な例としては、 ァグロバクテリ ウ — b—
ム * ラ ジオパク ター K N K 7 1 2 (F E RM B P— 1 9 0 0)、 シ： — ドモナス · ス ピーシ一ズ K N K 0 03 A(F E RM B P— 3 1 8 1 )、 シユー ドモナス . ス ピーシーズ K N K 5 0 5 (F E RM B P— 3 1 8 2)、 ェシエ リ ヒア · コ リ J M 1 0 9 pA D 1 0 8 (F E RM B P— 3 1 84)、エ シュ リ ヒア ' コ リ J M 1 0 9 pP D 3 0 4 (F E RM B P— 3 1 8 3)などが挙げられる
本発明においては、 該脱力ルバミ ル酵素は精製酵素、 部分精製酵 素または粗酵素として、場合によっては菌体のままで固定化酵素調 製物中に存在していてよく、脱力ルバミ ル活性を発揮できる状態に あれば、 存在型態や共存物を問わない。
酸化防止剤と しては、 ジチオス レィ トール、 2—メ ルカプ ト ェ.タ ノ ール、 L一 システィ ン塩酸塩、 システア ミ ン塩酸塩、 ジチォエ リ ス リ トール、 ジチオス レィ トールと ジチォエ リ ス リ トールの混合物、 還元型グルタチォンなどが使用できる。
用いる固定化支持体は、脱力ルバミ ル酵素の固定化時の態様によつ て異なるが、無細胞抽出液のような粗酵素液や硫安分画等を行つた 部分精製酵素液を固定化に供する場合は、ィォン交換基や共有結合 基をもったポリマー支持体が使用できる。
ィォン交換基を持ったポリマー支持体としては、 陰ィォン交換樹 脂、 例えば、 第 1 、 2、 3、 4級アミ ンを交換基とするデュォラ ィ ト（登録商標） Aやアムバ一ライ ト I R A (登録商標）のシリーズ、 あるいはジエタノール型の官能基を持つボリ スチレン樹脂、 例えば、 ダイアイオン E Xなどが使用できる。
共有結合基を持つものと してはアルデヒ ドを結合基として持つ置 換ポリ メタク リル酸ポ リ マ一、 ポ リ エチレンィ ミ ン/グルタルァル デヒ ド複合体で被覆きれた高密度アルミナなどが使用できる。
また、 生菌体ゃ乾燥菌体のような全細胞を固定化するには、 ポリ アク リ ルア ミ ド、 ポ リ ウ レタンまたはァルギン酸カルシウムなどの ポ リ マーや軽石、 アルミ ナのような多孔質材料を使用することがで きる。 本発明の固定化酵素調製物は以下のようにして製造される まず、 微生物を培養し、 菌体を採取して超音波破砕、 機械的破砕
(ホモゲナイザーなど）、 酵素処理などによって無細胞抽出液を調製 する。 この場合、 0. 1 mM〜 2 0 mM、 通常 5 mM程度の酸化防 止剤を存在させる。
無細胞抽出液より酵素を部分精製するには当業者が通常使用する 手段が用いられる。 例えば、 硫酸プロ夕 ミ ンを蛋白量の 1 / 5〜 1 / 1 0量加えて核酸を沈澱させ、 5 0°C〜6 0°Cの温度で約 2 0分 間加熱した後、 4°Cに冷却して熱に不安定な蛋白を沈澱させ、 これ を遠心分離して核酸と熱不安定な蛋白を除去する。 さらに、 必要に 応じて硫安分画を行い、 支持体と接触させる酵素溶液とする。 この 間、 酸化防止剤を 0. 1 mM〜2 O mMの範囲、 通常 5 mM程.度存在 せしめる。
支持体は交換基を食塩水などで活性化した後、 0. 1〜 2 0 mM, 通常 5 mM程度の酸化防止剤を含む緩衝液中で平衡化させたものを 使用する。 支持体と酵素溶液を 0 . 1〜2 0 m M、 通常 5 m M程度 の酸化防止剤の存在下で接触させ、 4〜 3 0 °C、 好ましくは 2 5 °C で攪拌する。 酵素の吸着量が所期の量に達した後（通常 8〜4 8時 間）、 濾取し、 架橋剤で処理して不溶化し、 安定化させる。 架橋剤 としては、 例えば、 1 %以下（好ましくは 0 . 2 % )のグルタルアル デヒ ドなど公知のものが使用できる。 この間も酸化防止剤を 0 . 1 m M〜2 O mM存在させるのが好ま.しい。 架橋された固定化酵素調 製物は蒸留水や緩衝液（酸化防止剤を含むのが好ましい）で洗浄し、 低温（約 4 °C)にて密閉容器中に湿潤状態で保存する。
可能な限り全操作は窒素など不活性ガスの雰囲気下で行うのがよ い。 酵素の負荷量は、 酵素の精製の度合いなどにより異なるが、 一 般には、 1 0〜8 0単位 Z g支持体である（こ こに、 1単位の脱力 ソレバミル酵素は、 N—力ルバミル一 D— (p— ヒ ドロキンフエニル） グリ シン 1 molを 1分間で D—（p—ヒ ドロキンフ ユ二ル）グリ シン に転換するに必要な酵素量である）。 固定化酵素調製物中の酸化防 止剤の量 5〜 1 O mg/ g調製物になるようにすることが好ま しい。 つぎに、 脱力ルバ ミ ル酵素の固定化調製物を使用した N—力ルバ ミ ル一D— α—ア ミ ノ酸から D— ひーァ ミ ノ酸を製造する工程につ いて説明する。
反応は、 酸化防止剤の存在下で行われ、 反応式：
R -C H -C O O H
ΝΗ 酸化防止剤
I + Η 20
C O 固定化酵素
I 調製物
N H 2
R -C H- C O O H
N H 2 + C 02+ N H 3
[式中、 Rは、 所望により、 水酸基、 アルキルチオ基、 カルボキシ ル基、 ア ミ ノ基、 ア ミ- ド基などの基で置換されていも-よい炭素数 1
〜 4のアルキル基、 所望により、 芳香環が水酸基などで置換されて いてもよい炭素数 7 ~ 8のァラルキル基 （ベンジル、 フ ヱネチル基 など） または、 所望により、 水酸基やハロゲンで置換されていても よいフ ュ ニル基を意味する] で表される。
酸化防止剤の量は、 0. 1〜 20 mM、 好ましくは 2. 0〜 5. 0 m Mである。
反応基質である N—力ルバ ミ ル— D— ーァミノ酸の濃度は、 5 ~2 5wZv%、 好ましくは 1 5 wZv%で使用される。 固定化酵素調 製物の使用量は、 1 0〜8 0単位/ g支持体のもので対基質当り 1 0〜2 0単位、 好ましくは 1 5単位 Zg基質の範囲で用いられ、 反 応は pH 6.5-8. 0の範囲、 通常 P H 7. 0に p Hを制御しつつ行 う。 温度は酵素によって異るが、 一般には 3 0。 (：〜 6 0°C、 特に耐 熱性の酵素ではさらに高い温度で使用することもできる。 反応は、 カラム法や、 反応器中に懸濁して行うが、 後者ではバッチ反応が普 通に行われ、 通常 1バッチ当たり 6〜4 8時間程度の反応哼間であ る。 本発明の固定化酵素調製物は、 非常に安定で、 例えば、 1 5回 以上の使用でも活性低下はほとんどなく、 3 0回以上の反復使用も 可能であつた。 反応容器中は不活性ガスで置換して、酸素不在の状態にしておく のが好ま しい。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、 本実施 例は本発明の例示に過ぎず、 何らこれらに限定されるものではない, 実施例 1
脱力ルバミ ル酵素はつぎの方法を用いて細菌発醇により生産した' 培地成分：
シュ一ク ロース 3 0 Og
尿素 2 . g
K H 2 P 0 + 3 0 g
Na2H P 0 +. 3 0 g
MgS〇 4 · 7 H 20 1 5 g . MnC 12 · 4 H 20 1 5 0 mg 酵母エキス 7 5 g
N—カ ルノ ' ミ ルー D— フ エ ニルグリ シン 1 5 g 消泡剤 1 5 g これらの成分を含む発酵培地 1 5 リ ッ トルを用意し、 P H 7 . 0 に 調整した。 この培地を 1 8 リ ッ トルの発酵槽に入れ、 1 2 1 °Cで 3 0分間ォ一トクレーブ滅菌した。 尿素および N—力ルバミル一 D— フ ュニルダリ シン溶液を別々に ミ リ ポアフィ ルタ一にて除菌し、 そ れぞれ 5 0 0 ミ リ リツ トルずつを無菌条件下で発酵槽に加えた。 発酵槽には、 N—力ルバミルー D—フェニルグリ シンを除いた同 様な培地で 3 0 °C 3 0時間生育させたァグロパクテリ ゥム · ラ ジオ パク ター K N K 7 1 2 ( F E R M B P— 1 9 0 0 )の種培養物を接 種した。発酵は 3 3でに保ち通気した。 P Hは硫酸と可性ソ一ダー溶 液を用いて 7 . 0に制 ©した。
発酵を 3 0時間行ったあと、 細胞を遠心分離により採取した。 こ の細胞沈殺物を 0 . 2 Mリ ン酸緩衝液 1 . 5 リ ッ トル（pH 7 . 0 )中に 再懸濁し、 ジチオス レィ トール 5 m Mになるよう加え、 超音波処理 して溶液中に脱力ルバミル醇素を放出させた。 酵素の部分精製はつぎのように行った。
3 %硫酸プロタ ミ ン水溶液 7 6 ミ リ リ ッ トルを攪拌しながら徐々 に添加し、 核酸を沈澱させ、 その酵素溶液を 5 0°Cで 2 0分間加熱 処理し、 その後 4°Cに冷却した。 4 °Cで一夜貯蔵後、 核酸と蛋白質 を沈澱させ、 遠心分離して細胞破砕物を除いた。 この調製物の脱力 ルバミ ル活性を測定するために検定した。 1 %N—力ルバミ ル— D —フ ユニルグリ シン/ 0. 2Mリ ン酸緩衝液（pH 7. 0)に酵素調製 物を加え 4 0 °C条件下反応を行ない、 D—フ ユ二ルグリ シンの生成 を調べた。
一方、 この酵素調製物にジチオス レィ トール 5 mMとなるよう添 加し、 さらに硫安による分画を実施した。 氷冷、 攪拌しながら硫安 を少量ずつ添加し、 蛋白を沈'殿させた。 硫安飽和 1 5〜3 5 %の活 性画分を採取し、 リ ン酸緩衝液 1 0 0 ミ リ リ ッ トル（pH 7. 0)に溶 解させ、 同様の活性検定を行った。
実施例 2 商業的供給源から入手した 3種の陰ィォン交換樹脂（デュォライ ト、 アンバーライ トおよびダイアイ オン）のサンプルを 1 M NaC 1中で 1時間洗浄したのち、 ジチォス レイ トール 5mMを含む 0.2 Mリ ン酸緩衝液中で一夜平衡化した。 平衡化した樹脂は濾過して必 要になるまで貯蔵した。 実施例 1に記載のごとく調製した部分精製 醇素を固定化に使用した。 樹脂 1 g (湿潤重量）当たり実施例 1の酵 素の熱処理後のものおよび硫安分画後のものそれぞれ 5 ミ リ リ ッ ト ルおよび 1 0 ミ リ リ ッ トル（1 0〜80単位 Zg樹脂）を、 25でで 24時間混合することにより、 酵素を樹脂に吸着させた。 この酵素 —樹脂複合体を濾過し、 PH 7. 0にて 1 %グルタルアルデヒ ドで処 理した。 1時間後、 樹脂サンプルを再度濾過し、 蒸留水で 3回洗浄 した。 最後に、 酵素一樹脂複合体を 0. 2Mリ ン酸緩衝液（PH 7. 0) で-洗い、 N 2ガスを注入した密閉容器中に 4 °Cで湿った状態のまま
R丁蔵した。
この方法で製造したそれぞれの酵素一樹脂複合体は、 実施例 1に 1 δ一
Ϊ己載のよ う にその活性を測定すべく検定した。 表 1はこの方法で処 理した一連の市販のィ才ン交換樹脂に対して得られた比活性を示す 部分精製
樹脂 支持体 官能基 酵素 比活性 デュオライ ト フエノールホルム 第二アミ ン A 10.0 アルデヒ ド B 80.2 アンノ 一ライ ト ポリスチレン 第三ァミ ン A 7.3
B 52.2 ダイアイオン ポリスチレン ジエタノー A 12.2 ル型 B 69.9
A. 熱処理後酵素
B. 硫安分画後酵素
比活性：単位 g樹脂
デュオライ ト（D uolite)およびアンバーライ ト（Amberlite)樹脂 は米国フ ィ ラデルフ ィ ァ、 ローム ' アン ド * ハ一ス社の商品であり ダイアイオ ン（Diaion)樹脂は日本、 三菱化成工業の製品である。 実施例 3
実施例 1で調製した熱処理後の部分精製酵素液（活性： 2.5単位 Zミ リ リ ツ トル） 1 00 ミ リ リ ツ トルをデュオライ ト A 568樹脂 1 5 gに添加した。 この混合物を 25でで 24時間穏やかに攪拌し て脱力ルバミ ル酵素を支持体に吸着させた。 ついで、 酵素一樹脂複 合体を濾過により分離し、 ジチオスレィ トール 5mMを含む 0.2 %グルタルアルデヒ ド溶液中（pH 7.0 )で 1時間攪拌した。 蒸留水 で 3回洗い、 最後に 0.2Mリ ン酸緩衝液（pH 7.0)で洗った。 こ の酵素一樹脂は密閉容器中に 4 °Cで湿った状態のまま貯蔵した。 一 方、 硫安分画後の酵奪液（活性： 9.3単位 Zミ リ リ ッ トル） 30 ミ リ リ ッ トルをデュオライ ト A 568樹脂 3 gに添加し、 以下同様に 調製した。 固定化酵素液は実施例 1のようにして検定し、 その比活 性はそれぞれ 9.8単位/ g、 70単位 Zg樹脂であった。
N—力 ルバ ミ ル一 D— ヒ ドロキシフ エニルグリ シン 1 0 gおよび ジチオス レィ トール 8 m g (0. 5 mMとなる）をジャケ ッ ト付きの 容器中の蒸留水 1 0 0 ミ リ リ ッ トルに加え攪拌しながら 1 0 N N a 〇 Hを加え、 p Hを 7. 0に調製した。 窒素ガスを連続的に吹き込 みながら温度を 4 0°Cに制御した。 この系を平衡化した後、 1 4 7 単位の酵素一樹脂複合体（ 1 5g)を加え反応させた。 その間、 塩酸 溶液で pH 7. 0に調整した。 24時間後 D— ヒ ドロキシフ ュニルグ リ シンの収率は 9 7 %である事が H P L Cにより測定された。 この 方法で製造した生成物は慣用手段で単離する事ができ、 高い光学純 度をもつことが判明した。 一方、 硫安分画後の酵素一樹脂では、 N —カル ミ ル一 D— ヒ ドロキシフ エニルグリ シン 1 5 gおよびジチ オス レィ トール 8 m gをジャケ ッ ト付き容器中の蒸留水 1 0 0 ミ リ リ ッ トルに加え、 以下同様の操作を行ない 2 1 0単位の酵素一樹脂 3 gを加え、 同様に反応させ、 高光学純度のものを得た。
この方法で使用した酵素一樹脂は、 反応の終了時に酵素を窒素雰 囲気下に保つように注意しながら、 D— ヒ ドロキシフ ヱニルグリ シ ン溶液を吸引し、 その代わりに予め平衡化しておいた基質懸濁液を 新たにセッ トすることにより、 30回再利用した。 これらのサイク ル全体を通じて、 D— ヒ ドロキンフユ二ルグリ シンへの転化率は 9 5 %またはそれ以上であつた。
実施例 4
実施例 1に記載の培地でシュ一 ドモナス * ス ピーシ一ズ KNK 0 03 A(F E RM B P— 3 18 1：)を生育させ、 細胞を遠心分離に より発酵ブロス 9リ ッ トルから収穫した。 この細胞を 0.2Mト リ ス /塩酸緩衝液（pH 7.0)300 ミ リ リ ツ トル中に再懸濁し、 ジ チオス レィ トール 5 mMとなるよう加え、 超音波処理して溶液中に 脱力ルバミ ル酵素を放出させた。 これに 3%硫酸プロタ ミ ン水溶液 20 ミ リ リ ッ トルを攪拌しながら徐々に添加し、 核酸を沈殿させた。 その酵素溶液を 65で、 20分間加熱処理し、 その後、 4°Cに冷却 した。 4°Cで一夜貯蔵後、 核酸と蛋白質で沈殿させ、 遠心分離して 細胞破砕物を除いた。 この熱処理後の部分精製酵素液（活性： 0.0 6単位/ミ リ リ ッ トル） 1 0 0 ミ リ リ ッ トルをデュオライ ト A 5 6 8樹脂 1 0 gに添加した。 この混合物を 2 5°Cで 24時間攪拌して 脱カルバミ ル酵素を支持体に吸着させた。 酵素一樹脂複合体を濾别 し、 ジチオス レィ トール 5 mMを含む 0. 2 %グルタルアルデヒ ド 溶液中（p H 7. 0)で穩かに 1時間攪拌架橋した。 蒸留水で 3回洗 い、 最後に 0. 2Mト リス Z塩酸緩衝液（P H 7. 0)で洗った。 その 比活性は 0.3 8単位/ g樹脂で N—カルバミル— D—ァラニンを 基質とした場合の活性は 4. 2単位/ gであった。
実施例 5
実施例 4に記載の方法で製造した酵素一樹脂 5 gを用いて、 ジチ オス レィ トール 0. 5 mMを含む蒸留水 4 0 ミ リ リ ッ トル中で Ν— 力ルバミ ル一 D—ァラニン 2 gを加水分解した。 加水分解^応はこ の混合物に N2を吹き込んで酸素を排除しながら 4 5° (：、 pH 6. 7 〜マ . 0で 24時間行った。 反応終了時の D—ァラニンの収率は 9 6. 5 %であると測定された。 その後、 5 % N—力ルバミルー D—ァラニンを 3 5回加水分解し て平均収率 9 6 . 1 %を得た。
実施例 6
実施例 4に記載の方法で製造した酵素一樹脂 1 gをカ ラムに充填 し、 1 m Mの酸化防止剤を含む 2 % N—力ルバミ ル一 D— ( P — ヒ ドロキシフ ヱニル） グリ シン溶液を上記の力 ラムに通液し連続加水 分解反応を行った。 酸化防止剤としてはジチオス レィ トール、 し一 システィ ン塩酸塩、 システア ミ ン塩酸塩を使用し、 通液速度 1 m 1 Z分、 4 0。C、 N 2 シール下で 4日間連铳反応を行った。
これらの酸化防止剤を使用すると 4曰間の酵素失活が 3 0〜3 5 %に抑えられたが、 酸化防止剤を使用しない場合は 8 0 %以上の酵 素失活が認められた。 ，
酸化防止剤 酵素活性 残存率 （％)
1 曰後 2 曰後 3 曰後 4 曰後 ジチオ ス レィ トール 8 0 7 0 6 8 6 5
L -システィ ン塩酸塩 7 8 7 1 6 8 6 6 システア ミ ン塩酸塩 7 8 7 δ 7 3 6 8 ジチォエ リ ス リ トール 7 8 7 2 6 8
無添加 5 0 2 9 2 0 1 4 以上記載したごとく、 本発明によれば抗生物質の中間原料等とし て重要な D — —ァミノ酸類を製造する脱力ルバミル酵素の固定化 調製物が提供される。 この調製物を使用する こ とにより、 3 0回以 上の反復使用が可能になり、 工業生産への使用が期待できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. N—力ルバ ミ ルー D— 一ア ミノ酸を加水分解して D— — ァミノ酸を生成させる酵素、 酸化防止剤および固定化支持体からな ることを特徵とする固定化酵素調製物。
2. 固定化支持体が陰ィォン交換樹脂である請求項 1記載の固定 化酵素調製物。
3. Ν—力ルバミ ル一 D— α—ァ ミ ノ酸を加水分解して力ルバミ ル基を脱離させる酵素が、 微生物由来の酵素である請求項 1記載の 固定化酵素調製物。
4. 微生物がァグロパクテリ ゥム ' ラ ジオバク タ一 Κ Ν Κ 7 1 2 ( F E R Μ Β Ρ— 1 9 0 0 )、 シユー ドモナス · ス ピーシ―ズ Κ Ν Κ 0 03 A(F E RM B P— 3 1 8 1 )、 シユー ドモナス ·.ス ピー シ一ズ KNK 50 5 (F E RM B P— 3 1 82)、 ェ シエ リ ヒア · コ リ J M 1 0 9 pA D 1 0 8 (F E RM B P— 3 1 84)または ェ シエ リ ヒア * コ リ J M 1 0 9 pP D 3 04 (F E RM B P— 3 1 8 3 )である請求項 3記載の固定化酵素調製物。
5 . 陰ィォン交換樹脂がァ ミ ンを交換基とするフ ュノ ール型ィォ ン交換樹脂である請求項 2記載の固定化酵素調製物。
6 . 酸化防止剤がジチオス レィ トール、 2 —メ ルカプ ト エタ ノ 一 ル、 L— システィ ン塩酸塩、 システア ミ ン塩酸塩、 ジチォエ リ ス リ トール、 ジチオス レィ トールと ジチォエ リ ス リ トールの混合物また は還元型グルタチオ ンである請求項 1記載の固定化酵素調製物。
7 . N—力ルバミ ル一 D— α —アミ ノ酸を加水分解して D - a - ァミノ酸を生成する酵素と固定化支持体を酸化防止剤の存在下で接 触させることを特徴とする固定化酵素調製物の製造法。
8 . 固定化支持体を、 酸化防止剤を含む緩衝液中で平衡せしめた 後、 酵素と接触させる請求項 7記載の製造法。
9 . N—力ルバミ ル— D— 0：—ア ミ ノ酸に請求項 1〜 6いずれか 1項記載の固定化酵素調製物を作用させることを特徴とする D— a 一アミ ノ酸の製造法。
1 0 . 酸化防止剤を反応系に添加して固定化酵素調製物を作用さ せる請求項 9記載の D — ーァ ミノ酸の製造法。
1 1 . 固定化酵素調製物を反復使用する請求項 9または 1 0記載 の製造法。
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