WO1993007487A1

WO1993007487A1 - Method of detecting mesitylene-resistant staphylococcus aureus, novel peptide, and dna coding for same

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Publication number: WO1993007487A1
Application number: PCT/JP1992/001317
Authority: WO
Inventors: Yoshiyuki Kamio; Kazuo Izaki; Hiroshi Kita
Original assignee: Iatron Laboratories Inc; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 1991-10-09
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 1994-04-09
Also published as: EP0597110A4; CA2097912A1; EP0597110A1

Description

明細書メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法、新規べプチド及びそれをコードする D N A 技術分野

本発明は、メチシリン耐性黄色ブドゥ球菌（ Methicillin Resistant Staphylococcus aureus；以下、 M R S Aと称することがある）が特異的に産生する新規のペプチド、そのペプチドをコードする DNA、及び前記ペプチドに対する抗体を用いる前記 MRS Aの検出方法に関する。背景技術

黄色ブドウ球菌は、通性嫌気性のグラム陽性球菌で、自然界に広く分布し、院内感染や日和見感染の原因となる微生物であり、腎盂炎、膀胱炎、膿迦疹、限局性膿症、骨髄炎、敗血症等の起炎菌として重視されている。黄色ブドウ球菌の中に、染色体変異により多種の抗生物質に対して高度の耐性を有するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRS A ) が存在する。この MRSAは、高齢者や新生児、ガン患者等のような抵抗力の衰えた人の体内で増殖し、肺炎や敗血症等を引き起こし、死亡させることがある。従って、 MRS A感染を適格に診断することは臨床的に極めて重要である。

MRSAの検出方法としては、生体液（血液、尿、唾液等）から MR SAを分離して同定する方法や薬剤耐性試験が行われているが、確定するには煩雑な手順を経る必要があった。 MRSA感染の診断は、早期に、高感度で、正確に判定する必要があるにもかかわらず、これらの要望に応じることのできる手法は従来存在しなかった。

本発明者は、 MRS Aが特異的に産生するべプチドが存在ることを見出し、そのペプチド（即ち、ロイコシジン〉の部分アミノ酸配列を利用してオリゴヌクレオチドプローブを合成し、そのプローブを用いて口ィコシジン及びその前駆体（プロロイコシジン〉をコードする DNAをクローン化し、更にクローン化 DN Aを用いてロイコシジン S及び F、並びにプロロイコシジン S及び Fを発現させることに成功した。また、前記ロイコシジン S及び F、並びにプロロイコシジン S及び Fに対する抗体を作成し、 MRS A検出用の抗体としての評価を行ったところ、迅速かつ正確で特異的に MR S Aを検出することができることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。発明の開示

従って、本発明は、式

A 1 a A s n As p Thr G 1 u Asp l i e G 1 y

L y s G 1 y S e r Asp l i e G 1 u l i e l i e

L y s A r g Thr 1 u Asp L y s Th r Se r

A s n Ly s Trp G 1 y Va 1 Thr G 1 n A s n l i e G i n P h e As p P h e V a 1 L y s As p

Thr し ys T y r A s n し ys Asp A l a Leu l i e Le L y s Me t Gi n G 1 P h e l i e

Se r Se r A r g Thr Thr Ty r Ty r A s n

Ty r L y s Ly s Thr A s n Hi s V a 1 L y s

A l a Me t A r g Trp P r o P h e Gi n Ty'r

As n l i e G 1 Le u L y s Thr A s n Asp

L y s Ty r V a 1 Se r Leu l i e As n T y r

Le Pr o L y s As n し ys l i e G 1 u Se r

Thr As n Va 1 Se r G i n Thr Le u G 1 y

Ty r As n l i e G 1 G 1 As n Phe G 1 n

Se r A l a Pr o Se r Le u G 1 G 1 y As n

G 1 Se r Phe As n Tyr Se r L y s Se r l i e Se r Tyr Thr G 1 n G i n As n T r

V a 1 Se r G 1 u Va 1 G 1 u G i n G 1 n As n

Se r し ys Se r Va 1 Leu Trp G 1 V a 1

Ly s A l a As n Se r Phe A l a Th r G 1 u

Se r G 1 G i n L y s Se r A l a Phe As S e r Asp Le u Ph e Va 1 G 1 y Ty r し y s P r o H i s S e r し y s As p P r o A r g As p Ty r P h e Va 1 P r o As p S e r G 1 u Le u P r o P r o Le u Va 1 G 1 n S e r G 1 y P h e A s n Pr o S e r P h e I 1 e A 1 a Th r Va 1 S e r H i s G 1 u L y s G 1 y S e r S e r As p Th r S e r G 1 u Ph e G 1 u I 1 e Th r Ty r G 1 A r g A s n Me t As p V a 1 Th r H i s A 1 a I 1 e L y s A r g S e r Th r H i s Ty r G 1 y A s n S e r Ty r Le u As p G 1 H i s A r g Va 1 H i s A s n A 1 a P h e Va 1 A s n A r g A s n Ty r Th r V a 1 し y s Ty r G 1 u Va 1 A s n T r p し y s Th r H i s G 1 u I 1 e L y s Va 1 し y s G 1 y G 1 n A s n

のアミノ酸配列を有するペプチド又はそのペプチドをコードする塩基配列を含む DN Aに関するものである。

また、本発明は式

Me t Le u し y s A s n L y s I 1 e Le u A 1 a Th r Th r Le u S e r Va 1 S e r Leu Le u A l a P r o le u A 1 a A s n Pr o Le u し 'e u G 1 u A s n A 1 a L y s A 1 a A 1 a A s n As p Th r G 1 u Asp I 1 e G 1 y し y s G 1 y S e r As p I 1 e G 1 u I 1 e I 1 e し y s A r g Th r G 1 u As p L y s Th r S e r A s n し y s T r p G 1 Va 1 Th r G 1 n A s n I 1 e G 1 n P h e As p P h e Va 1 し y s As p Th r L y s Ty r A s n L y s As p A 1 a Le u I 1 e Le u し y s Met G 1 n G 1 y P h e I 1 e S e r S e r A r g Th r Th r Ty r Ty r A s n Ty r L y s し y s Th r A s n H i s Va 1 L y s A 1 a Me t A r g T r p P r o Ph e G 1 n Ty r A s n I 1 e G 1 y Le u L y s Th r A s n As p L y s Ty r Va 1 S e r Le u I 1 e A s n Ty r し e u- P r o L y s A s n L y s I 1 e G 1 u S e r Th r A s n Va 1 S e r G 1 n Th r Leu G 1 Ty r As n I 1 e G 1 G 1 y As n Phe G 1 II S e r A 1 a P r o S e r Le u G 1 y G 1 y As n G 1 S e r Phe A s n Ty r S e r し y s S e r I 1 e S e r Ty r Th r G 1 n G 1 n As n Ty r Va 1 S e r G 1 u Va 1 G 1 u G 1 n G 1 n As n S e r し y s S e r Va 1 Leu T r p G 1 Va 1 し y s A 1 a As n S e r Phe A 1 a Th r G 1 u S e r G 1 y 1 n し y s S e r A 1 a Phe Asp S e r As p Leu Phe Va 1 G 1 Ty r し y s P r o H i s S e r L y s As p P r o A r g As p Ty r Phe Va 1 Pro As p S e r G 1 u Le u P r o P r o Leu Va 1 G 1 n S e r G 1 y Phe As n P r o S e r Phe I 1 e A 1 a Th r Va 1 S e r H i s G 1 u し y s G 1 y S e r S e r As p Th r S e r G 1 u Phe G 1 u I 1 e Th r Ty r G 1 A r g As n Me t Asp Va 1 Th r H i s A 1 a I 1 e L y s A r g S e r Th r H i s Ty r G 1 As n S e r Ty r Leu As p G 1 y H i s A r g Va 1 H i s A s n A 1 a Phe Va 1 As n A r g As n T y r Th r Va 1 し y s T y r G 1 u Va 1 As n T r p し y s Th r H i s G 1 u I 1 e L y s Va 1 L y s G 1 y G 1 n As n

のアミノ酸配列を有するペプチド又はそのペプチドをコードする塩基配列を含む DNAにも鬨する。

更にまた、本発明は、式

A 1 a G 1 u G 1 y L y s I 1 e Th r P r o Va 1 S e r Va 1 L y s L y s Va 1 As p As p L y s Va 1 Th r Le u T y r L y s Th r Th r A 1 a Th r A 1 a Asp S e r Asp L y s Phe し y s I 1 e S e r G 1 n I 1 e し e u Th r Phe As n Phe I 1 e し y s As p L y s S e r Ty r As p L y s As p Th r Leu Va 1 Le u し y s A 1 a Th r G 1 As n I 1 e As n S e r G 1 y Phe V a 1 L y s P r o A s n P r o Asn As T y r Asp P h e S e r L y s Le u Ty r T r p G 1 y A 1 a L y s Ty r A s n V a 1 S e r I 1 e S e r S e r G 1 n S e r A s n As p S e r V a 1 A s n A 1 a V a 1 As p Ty r A 1 a P r o L y s A s n G 1 n A s n G 1 u G 1 u P h e G 1 n Va 1 G 1 n A s n Th r Le u G 1 y Ty r Th r Ph e G 1 y G 1 y As p I 1 e S e r I 1 e S e r A s n G 1 y Le u S e r G I y G 1 y Le u A s n G 1 A s n Th r A 1 a P h e S e r G 1 u Th r I 1 e A s n Ty r L y s G 1 n G 1 u S e r Ty r A r g Th r Leu S e r A r g A s n Th r A s n T y r し y s A s n Va 1 G 1 y T r p G 1 y Va 1 G 1 u A 1 a H i s し y s I 1 e Me t A s n G 1 y T r p G 1 y Pr o Ty r G 1 A r g As p S e r Ph e H i s P r o Th r Ty r G 1 y A s n G 1 u Le u P h e Le u A 1 a G 1 y A r g G 1 n S e r S e r A 1 a Ty r A 1 a G 1 y G 1 n A s n P h e I 1 e A 1 a G 1 n H i s G 1 n Me t P r o Le u Le u S e r A r g S e r A s n P h e A s n P r o A r g P h e L e u S e r Va 1 Le u S e r H i s A r g G 1 n As p A 1 a A 1 a し y s し y s S e r し y s I 1 e Tli r Va 1 Th r Ty r G 1 n A r g G 1 u Me t As p Le u Ty r G 1 n I 1 e A r g T r p A s n G 1 y P h e Ty r T r p A 1 a G 1 y A 1 a A s n Ty r L y s A s n Ph e し y s Th r A r g Th r P h e L y s S e r Th r Ty r G 1 u I 1 e As p T r p G 1 u A s n H i s し y s Va 1 し y s Le u Le u As p Th r し y s G 1 u Th r G 1 u A s n A s n し y s

のアミノ酸配列を有するペプチド又はそのペプチドをコードする塩基配列を含む DN Aに関する。

また、本発明は、式

Me t L y s Me t A s n L y s Le u V a 1 L y s 卜 ss6asod.0/ε6 OAV

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のアミノ酸配列を有するぺプチド又はそのべプチドをコードする塩基配列を含む DN Aに関する。

更には、本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の菌体から染色体 DNAを分離し、制限酵素で消化し、得られた DNA断片をベクターに揷入し、そのベクターで宿主を形質転換して D N Aライブラリーを作製し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の菌体から精製したロイコシジン又はプロロイコシジンの部分アミノ酸配列をコードする合成 DN Aをプローブとして用いて前記 DNAライブラリーからロイコシジン又はプロ口ィコシジンをコードする DN Aを選び、得られた DN Aをクローン化することを特徴とする、ロイコシジン又はプロロイコシジンをコードする DN Aの製法に鬨する。

そして、本発明は、ロイコシジン又はプロロイコシジンをコードする DN Aを発現ベクターに連結して複製可能な組換え DN Aを作製し、この組換え D N Aで宿主を形質転換し、その形質転換体を培養して前記のロイコシジン又はプロロイコシジンをコードする DN Aを発現させて口ィコシジン又はプロロイコシジンを産生させ、得られたロイコシジン又はプロロイコシジンを単離する特徴とする、ロイコシジン又はプロロイコシジンの製法に鬨する。

更に、本発明は、プロロイコシジン又はロイコシジンに対する抗体を用いることを特徴とする、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法にも鬨する。本明細書の塩基配列において、 Aはアデニン残基、 Cはシトシン残基、 Gはグァニン残基そして Tはチミン残基の意味である。図面の簡単な説明第 1図は、 TSKゲル SP— 5PWカラムを備えた HP LCによって、 MRSA菌株 No . 4からロイコシジンの S画分を精製した結果を示すグラフである。 S画分をィムノブロッテイングによって定量した（第 1 図の点描部が S画分である。）

第 2図は、 MRS A菌株 No. 4及び黄色ブドウ球菌 V8からの精製 S画分調製物の SDS— PAGE電気泳動パタ一ンの結果を示す。レーン 1は黄色ブドウ球菌 V 8からの S画分であり、レーン 2は MRS A菌株 No. 4からの S画分であり、レーン 3は分子量マーカーである。使用した分子量マーカーは以下のとおりである。

1…ホスホリラーゼ（ 97. 4kDa) 、

2…ゥシ血清アルブミン（ 66. 2kDa) 、

3…ォバルブミン（45 kD a ) 、

4…ゥシカルボニックアンヒドラーゼ ( 31 kD a ) 、

5…大豆トリプシンインヒビター（ 21. 5kDa) 、

6…リゾチーム（ 14: 4kD a ) 。

第 3図は、プラスミドベクター P UC 119に H i n dlll-Xb al断片（2. 2kb ) を挿入した状態を示す説明図である。第 3図の略号は以下の通りである。

H〜H i n. dill ； E E c o R I ； X Xb a I ； B B amH I ； K — K'p n I。

第 4図は、 H i n dlll-Xb al断片（ 2. 2kb ) の制限酵素地図である。ロイコシジン（S画分）コード領域を矢印で示す。 2本線部分は揷入された 2. 2 kb断片であり、 1本線部分はベクタープラスミド p UC 119のポリリンカ一領域である。略号は以下の通りである。

^■•H i n dill ； E E c o R I ; X Xb a I ； B B amH I ； K 〜Kp n I。

第 5図は、ロイコシジン（ S画分）コード領域の塩基配列及びそれから演繹されるロイコシジン（S画分）のアミノ酸配列である。配列は、制限酵素 H i n dillの認識塩基配列の最初のヌクレオチドを 1番目とし、 P S R K 1 - 1 DN Aの最後のヌクレオチドを 1 , 466番目として示す。 2本の下線で示した部分はリボソーム結合（推定）部位であり、長方形で囲った部分は（推定）プロモーター部位である。平行方向の矢印は翻訳停止コドンの下流にある 3か所の逆位反復配列を示し、 1本の下線で示した部分はシグナル配列であり、クサビ型で示した部分は S画分前駆体のプロセシング部位である。

第 6図は、プラスミド p SRK 9 1がコードするインビトロ翻訳産生物に鬨する電気泳動の結果を示す。レーン 1は p SRK9 1 DNAがコードするインビトロ産生物であり、レーン 2は p UC 1 1 9がコードするインビ卜ロ産生物であり、 P Sは S画分前駆体である。

第 7図は、ウェスタンプロッティングの結果を示し、 ( A) のレーン 1は精製 S画分であり、レーン 2は大腸菌（p SRK 91 ) の細胞抽出物であり、レーン 3は大腸菌（P UC 1 1 9 ) の細胞抽出物であり、レーン 4は大腸菌（P SRK 91 ) の培養液であり、レーン 5は大腸菌 ( P U C 1 19 ) の培養液である。

( B ) は大腸菌 DH 5 a ( p SRK 1 ) からの細胞抽出液中の S画分の分析結果であり、レーン 1は I PTG存在下、レーン 2は I PTG不在下、そしてレーン 3は S画分標準品である。

第 8図は、大腸菌 DH 5 a ( p S R K 91 ) の細胞画分のウェスタンブロッテイングの結果を示す。レーン 1は標準 Sタンパク質であり、レーン 2はショックを与えた細胞画分であり、レーン 3はペリプラズム空間であり、レーン 4は全細胞画分であり、レーン 5は培養液である。第 9図ほ、 TSKゲル S P— 5 PWカラムを備えた HPLCによって、 MRS A菌株 No . 4からロイコシジンの F画分を精製した結果を示すグラフである。 F画分をィムノブロッテイングによって定量した。（第 9図の斜線部が F画分である。）

第 1 0図は、 MRSA菌株 N o . 4及び黄色ブドウ球菌 V8からの精製 F画分調製物の SD S— PAGE電気泳動パターンの結果を示す。レーン 1は黄色ブドウ球菌 V8からの F画分であり、レーン 2は MRSA 菌株 No. 4からの F画分であり、レーン 3は分子量マーカーである。使用した分子量マーカーは第 2図のものと同じである。

第 11図は、プラスミドベクター一 pUC 119に Ec oRI— Ec oRI断片（4. Okb ) を挿入した状態を示す説明図である。第 11 図の略号は第 3図の略号と同じ意味である。但し Cは C 1 a Iを意味する

第 12図は、 EcoRI— EcoRI断片（4. Okb ) の制限酵素地図である。ロイコシジン（F画分）コード領域を、 Fを含む太い矢印で示す。 2本線部分は揷入された 4· Okb断片であり、 1本線部分はベクタープラスミド PUC 1 19のボリリンカ一領域である。略号は第 4図の略号と同じである。なお Cは C 1 a Iを示す。

第 13図は、ロイコシジン（F画分）コード領域の塩基配列及びそれから演繹されるロイコシジン（F画分）のアミノ酸配列である。配列は、制限酵素 E c o R Iの認識塩基配列の最初のヌクレオチドを 1番目とし、 PFRK92DNAの最後のヌクレオチドを 2, 012番目として示す。長方形で囲った部分は（推定）プロモーター部位である。平行方向の矢印は翻訳停止コドンの下流にある逆位反復配列を示し、 1本の下線で示した部分はシグナル配列であり、クサビ型で示した部分は F画分前駆体のプロセシング部位である。

第 14図は、プラスミド PFRK92がコードするインビトロ翻訳産生物に鬨する電気泳動の結果を示す。レーン 1は P F RK 92 D N Aがコードするインビトロ産生物であり、レーン 2は P UC 1 1 9がコードするインビト口産生物であり、 P Fは F画分前駆体である _β

第 15図は、ウェスタンブロッテイングの結果を示し、レーン 2は精製 F画分であり、レーン 1は大腸菌（PFRK92 ) の細胞抽出物であり、レーン 3は大腸菌（P UC I 1 9 ) の細胞抽出物であり、レーン 4 は大腸菌 ( P FRK 92 ) の培養液であり、レーン 5は大腸菌（P UC 11 ) の培養液である。

第 16図は、大腸菌 DH5a (_PFRK92 ) の細胞画分のウェスタンブロッティングの結果を示す。レーン 1は標準 Fタンパク質であり、レーン 3はショックを与えた細胞画分であり、レーン 2はペリプラズム空間である。発明を実施するための最良の形態

黄色ブドゥ球菌が産生する或る細胞変性外毒素は、 2つのタンパク質画分〔即ち、カチオン交換クロマトグラフィーで分離した場合に早く溶出される F画分（ f a s t— e l u t e d)及び遅く溶出される S画分 ( s l ow— e l u t e d) 〕とからなり、これらの S画分及び F画分はそれぞれ単独では不活性であるが、両者が協同して活性型となり、ヒトゃラビットの多核性白血球に細胞毒性変化を起こすことが知られていた。しかしながら、これらの各画分の化学構造やその機能との鬨係等は従来全く分かっていなかった。本発明者が遣伝子工学の手法により見出したところによれば、後に詳述するように、前記の S画分はアミノ酸 2 86個からなるタンパク質（成熟体：ロイコシジン）であり、そのタンパク質は細胞内においてアミノ酸 315個からなる前駆体（プロロイコシジン）として生成されていることが分かった。また、前記の F画分はアミノ酸 298個からなるタンパク質（成熟体：ロイコシジン）であり、そのタンパク質は細胞内においてアミノ酸 323個からなる前駆体（プ口ロイコシジン）として生成されていることも分かった。以下、ロイコシジン及びプロロイコシジンをコードする D N Aのクローニング及びその D N Aの発現について説明する。

( A ) ロイコシジン S画分及び F画分の精製及びァミノ酸部分配列の解明

ロイコシジン S画分及び F画分は、それぞれメチシリン耐性黄色ブドゥ球菌（MRSA) の培養上清に含まれる。この培養上清に塩化亜鉛を加えて沈殿させ、この沈殿をリン酸ナトリウムで処理して得られる粗精製品をイオン交換クロマトグラフィーにより精製してロイコシジン S画分及び F画分を得ることができる。得られたロイコシジン S画分及び F 画分のアミノ酸の部分配列は、例えばエドマン分解等により、解明することができる。

(B) プローブの合成

前記（A)項で決定したアミノ酸の部分配列の適当な部分を選択してプローブを合成することができる。プローブとして用いる DNAの合成には、公知の方法〔例えば、 DNA自動合成機を利用するホスホアミダィト法、日本生化学会編：道伝子研究法 I， 1一 27，（ 1986 )又は M att eucc iら： Te tr ahe d r on Le t t. ， 21， 719, ( 1980 ) 〕を使用することができる。

(C) DNAの抽出

培養上清にロイコシジン（ S画分及び F画分）を産生しているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA) から DN Aを抽出する。染色体 D NAは、菌体を 50 mMグルコース及び 25mMトリス緩衝液（P H7. 9) 中でリゾスタフインで処理した後、 SDSで溶出させ、抽出する。抽出 DNAは、 Ma n i a t i sらの方法〔Ma n i a t i sら： Mo l e cu l ar C l on i ng, A Lab o rat o ry Manua l , Co l d Sp r i ng Ha rb o r Lab orat o ry, New Yo rk, ( 1982) 〕を用いて精製すればよい。

(D )ベクターへの DNAの揷入

DNAをベクターへ揷入するには、例えば、 P UC系又は pBR系のベクターへ前記の Man i at i sらの方法を利用することができる。

(E)スクリーニング

前記（D)項で作成された DN Aライブラリーから、目的遺伝子を含むコロニーをスクリーニングするには、前記（B)項で作成されたプローブを用いることができる。まず、コロニーをナイロンメンブラン又はニトロセルロース等のフィルターメンブラン上に焼き付ける（ペイキング）。また、前記（B)項で得られたそれぞれのプローブを、

Man i at i sらの前記文献に記載の方法等により〔³²P〕等の放射性同位体でラベルする。前記フィルターメンブラン上に焼き付けたプラークと、前記³² P等でラベルしたプローブとをハイプリダイゼーシヨンさせ、目的遺伝子を含むプラークのスクリーニングを行うことができる。更に、 DNAライブラリーからの、目的遣伝子を含むプラークのスクリ一二ングに、 G l ove r : DNA C l o n i n , 1 , 51— 52， IRし P r e s sに記載されている方法を用いることもできる。即ち、目的とする DNAから発現したタンパク質の活性を検出したり、そのタンパク質に特異的な抗体を用いて目的とする DN Aから発現したタンパク質を検出することにより、目的とする DNAを同定する、抗体によるスクリーニング方法である。

( F ) サブクローニング

サブクローニングに用いるベクターとしては、例えば p UC系列又は PBR系列のプラスミドを挙げることができる。前記のスクリーニング工程によって選択されたプラーク又はコロニーからファージ DN A又はプラスミド DNAを取り出して精製し、適当な制限酵素で消化し、サブクローニング用ベクターに挿入する。こうして得られる組換えベクターを、例えば、 Hanahanら： Mo に B i o l . 166， 557 — 5&0，（ 1983 ) に記載の方法によって、コンビテント細胞に導入する。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌又は酵母、例えば、大腸菌 K 12株由来のものを挙げることができる。こうして得られた形質転換体を、例えば、 Ma n i a t i sらの前記文献に記載の方法、例えば、ィソプロピルチオガラクトシダーゼ（ I PTG) を用いる方法によって選定することができる。

(G) プラスミド DN Aの調製

サブクローニングによって得られたクローンから、例えば、 Ma— n i a t i sらの前記文献に記載のアルカリ— SDS法、又はボイリング法によってアラスミド DNAを精製することができる。必要により、塩^;セシウム超遠心法を用いることもできる。

(H) DN Aの構造解析前記（G)項で得られたプラスミド DNAを、各種の制限酵素で切断して制限酵素地図を作成する。更に、ジデォキシ法〔S_{a n g}e rら： J. Mo l . B i o l . 143, 161 -178, ( 1980 ) 〕等によって、ヌクレオチド配列を決定する。

( I )発現

前記（G)項で得られたプラスミド DNAを利用し、例えば、

Man i a t i sらの前述の文献に記載の方法により、大腸菌 Y A 21 株のコンビテント細胞を形質転換してロイコシジンを発現させることができる。発現用の宿主細胞としては、前記の大腸菌 Y A 21株の他、大腸菌、枯草菌又は酵母、例えば、大腸菌 MM294、 DH 1、 DH5、 JM109、 HB 101、 GC 508又は CES201等を挙げることができる

更に、本発明で利用することのできるベクターとしては Co 1 E l系プラスミドべクターである p U C系又は p B R系を挙げることができる。また、ファージ系ベクターとしては、 λファージ由来の λ g t 10、 λ g t 11 _ν Char o n4A、入 gtWES ' AB、 EMBL3、 EM BL4等を挙げることができる。また、酵母用の発現ベクターとしては、例えば、 PYES2. 0、 pAH9、 pMAC 561. P LG669. pMA91、 PAM82、 pMC2010、 pOP、 pTE432、 p SD922等を挙げることができ、枯草菌用の発現ベクターとしては、例えば、 pPL608、 pKTH50、 pKTH51、 pKTH53、 PKTH38. pHY300、 pLK等、そして、動物細胞（例えば、 COS— 7細胞、 Bowe s黒色腫細胞、 C H 0細胞）用の発現べクタ一としては、例えば、 PMT、 p SV、 P CD、 pMDSG、 pBPV 等を挙げることができる。

得られた形質転換体を適当な公知の培地において、細胞密度が十分な濃度に達するまで培養する。続いて、例えば超音波処理して細胞を破砕し、その破碎液を、例えば遠心分離してタンパク質や核酸等を含有する細胞上清を得、その細胞上清を公知の方法によって処理してロイコシジンを精製することができる。

精製したロイコシジン又はプロロイコシジンを免疫原として用い、公知の方法、例えば続生化学実験講座（日本生化学会編）の「免疫生化学研究法」等に記載の方法に従って、抗体即ち、抗血清又ほモノクローナル抗体を調製することができる。これらの抗体に必要に応じて公知の方法で標識を付ける。例えば、プロロイコシジン又はロイコシジンの検出を、ウェスタンプロットハイブリッド法によって行う場合には、非放射性標識抗体（例えば、酵素標識抗体、ピオチン化抗体、ジゴキシゲニン化抗体又は化学発光物質、蛍光物質で標識した抗体）を用いることができる。

本発明による検査方法で用いることのできる液体試料は、 M R S Aを含有している疑いのある試料であれば特に制限されない。例えば、血液、唾液、尿、固定化遊離細胞、組織切片等を用いることができる。

本発明による検査方法を実施する際には、まず前記液体試料を直接、あるいは適当な希釈液によって希釈した液、又は必要に応じて培養し、その上清を被検試料とし、前記の抗体を用いて免疫学的手段等によって検査を行う。例えば、被検試料を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離し、電気的にニトロセルロースフィルターに吸着させ、標識した一次抗体か、又は標識した二次抗体を用いて同定することができる（いわゆるウェスタンブロッテイング法）。別に、抗原—抗体反応による凝集反応も可能である。この場合、抗体はポリスチレン等の不溶性担体に感作した状態でもよい（いわゆるラテックス凝集反応）。また、その他公知のィムノアツセィ系（E L I S A法、 E I A法、 C L I A法等）への応用が可能である。これらの検出は、その信号を目視的あるいは光学的な手段によって検知することによって容易に行うことができ、その結果から M R S A感染の有無を診断することができる。実施例

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例 1 ： MRS Aのマーカータンパク質の精製

培地 10リットル中に酵母エキス（オリエンタル酵母工業） 250 g、カザミノ酸（D i f c o ) 200g、グリセ口燐酸ナトリウム（和光純薬） 200 g. Na₂HP0₄ - 12H₂0-60 . KH₂ P0₄4 g 及び 0. 1%乳酸ナトリウム（和光純薬）を含む培地（以下、 A培地と称することがある）に MRS A菌株 No. 4 〔大阪大学微生物病研究所に、 RIMD3109025 (MRSANo . 4) として寄託されいる〕を接種し、 37^eCで振盪培養した。 22時間後に培養液を 4 ^eC及び 11 , O O OXgで 20分間遠心して菌体を除き、上清 10リットルを得た。この上清に終末濃度が 0. 1Mになるように塩化亜鉛を加え、撹拌下に放置し、生じた沈殿を 4^eC及び 8， 000 §で15分間の遠心処理して集めた。得られた沈殿を、 0. 4M燐酸ナトリウム緩衝液 (PH6. 5) 1リットルに懸濁し、生じた燐酸亜鉛の沈殿を、 4°Cにて 10， O O OXgで 20分間の遠心により除いた。上清を 0. 2M食塩含有。 . 05M酢酸緩衝液（PH5. 2 ) (以下、緩衝液 Aと称することがある） 20リツトルに対して透析した後、硫酸アンモニゥムを飽和になるまで加え、攪拌下に 60分間放置した。生じた濁りを、遠心 (4で、 15, 000Xg、 20分間）して集めた。得られた沈殿を緩衝液 Aに懸濁し、同じ緩衝液 Aに対して透析した。透析後、緩衝液 Aで平街化した CM— S e ph a d ex C50カラム（ 2. 5 X 50 c m ) に載せ、緩衝液 A 500 m 1と 1. 2 M食塩含有 0. 05 M酢酸緩衝液 (pH5. 2 ) (以下、緩衝液 Bと称することがある） 500m lとを用いた食塩の直線溏度勾配により、吸着しているタンパク質を溶出した。食塩濃度 0. 9 Mで溶出される S画分及び食塩濃度 0. 5 Mで溶出される F面分を集め、緩衝液 Aに対して透析した。

透析した S画分及び F画分は、それぞれ TSK 3?— 5? ゲルのカラム（0. 75X7. 5 cm) に載せ、 25 m 1の 0. 4 M食塩を含む 0. 051\1酢酸緩衝液（ 115. 2) と同量の緩衝液 Bを用いた食塩の直線漉度勾配により精製し、食塩濃度 0. 75Mで溶出される S画分、及び食塩濃度 0. 06〜0. 08Mで溶出される F画分を集めた。結果を第 1図（ S画分）及び第 9図（F画分）に示す。得られた S画分及び F画分（第 1図の点描部及び第 9図の斜線部）の MRSAのマーカータンパク質は、電気泳動的に均一であった。結果を第 2図（ S画分）及び第 10図（F画分）に示す。第 2図及び第 10図のレーン 1は、それぞれ MRS Aの標準株であるブドウ球菌 V8 ( ATCC 27733 ) を前記と同様に処理して得た S画分及び F画分であり、レーン 2は本実施例 1で得た S画分及び F画分である。

実施例 2 ： MRSAのマ一カータンパク質の一次構造

前記実施例 1で得られた M R S Aのマーカータンパク質の一次構造を P r o t e i n S e q u e n c e r Mo d e l 6600 (M i— l l i p o r e M i l l i g e n B i o s e a r c h社）を用いて、エドマン分解法により、 S画分はァミノ末端から 50番目までのァミノ酸配列が次の式（ 1 ) で表され、 F画分はァミノ末端から 41番目までのアミノ酸配列が次の式（ 2 ) で表されることを明らかにした。

Ala Asn Asp Thr Glu Asp lie Gly Lys Gly Ser Asp lie Glu lie lie Lys Arg Thr Glu Asp Lys Thr Ser Asn Lys Tip Gly Val Thr Gin Asn lie Gin Phe Asp Phe Val Lys Asp Thr Lys T r Asn Lys Asp Ala Leu lie Leu ( 1 )

Ala Glu Gly Lys lie Thr Pro Val Ser Val Lys Lys Val Asp Asp Lys Val Thr Leu Tyr Lys Thr Thr Ala Thr Ala Asp Ser Asp Lys Phe Lys lie Ser Glu lie Leu Thr Phe Asn Phe ( 2)

S画分及び F画分の有する生物活性〔Pretlow，ら， Immunology, 24， 85-92, (1973)， Rahmanら， Biochem. Biophys. Res. Conunun., 181, 138-144, 1991に記載の方法で測定〕、精製した S画分及び F画分の分子量（第 2 図及び第 1 0図参照）、及び前記のアミノ酸組成より、実施例 1で得られた MRS Aのマーカータンパク質はロイコシジンであることが分かる。実施例 3 ：プローブの合成ロイコシジンの DN Aをクローニングするためにプローブを合成した。プローブの合成は 381型自動 DN A合成装置（アプライドバイオシステム社）を用い、常法により行った。 S画分については、実施例 2で決定したアミノ酸配列のァミノ末端から 18番目までのアミノ酸に対応する以下の式（ 3 )で表される 53マーの DNA、 25番目から 40番目のアミノ酸に対応する以下の式（4 ) で表される 47マーの DNA及び 25番目から 31番目のアミノ酸に対応する以下の式（ 5 ) で表される 20マーの DNAを合成し、 F画分については、実施例 2で決定したァミノ酸配列の 10番目から 15番目までのアミノ酸に対応する以下の式 ( 6 )で表される 17マーの DNA、及び 16番目から 21番目までのアミノ酸に対応する以下の式（ 7 ) で表される 18マーの DN Aを合成し、混合プローブとして用いた。なお、以下の各式で Iはイノシン残基であり、 5 ' 側を左側に、 3 ' 側を右側に記載する。

ΑΉ ΑΉ AAAf又は G) AG (3 )

AAT (又は C) AAA(又は G) GGGGI GTI ACI CAA(又は G) AAT(又は。） ΑΉ CAA(又は G) 1ΊΤ(又は C)GAT (又は C) ΠΤ(又は C) GTI ΑΑΑ(又は G)GA (4 )

AAT (又は C) AAA(又は G) TGG GGI GU ACI CA ( 5 )

GTI AAA (又は G) AAA(又は G) GTI GAT(又は C) GA ( 6 )

AAA (又は G) σΠ ACI C(又は T)TI TAT(又は C) AAA(又は G) ( 7 ) 実施例 4 ： MRS A— DNAの抽出と精製

前記実施例 1で使用した MRS Aの菌株 No . 4を、実施例 1に記载した条件で培養して菌体を集めた。得られた菌体を 10倍量の 1 OmM トリス緩衝液（PH7. 5 ) に懸濁し、リゾスタフイン（シグマ社） ( 50 1 /m 1 ) で処理した。次に、全体量の 0. 1容量の 10%ドデシル硫酸ナトリウム塩（以下、 SDSと称することがある）、及び 1 OmM— EDTA含有の 10mMトリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン一塩酸緩衝液（PH7. 9 ) (以下、トリス緩衝液 1と称することがある）を加えて可溶化した。可溶化された液に、リボ核酸分解酵素 (シグマ社）を終末濃度 2 g/m 1になるように加え、 37^eCで 1時間保温した後、プロテアーゼ Kを終末濃度 50 gZm 1になるように加えて、 37。Cで 2時間消化した。プロテアーゼ消化液から、フエノール水クロ口ホルムの系で MRS Aの DN Aを抽出し、ェチルアルコ一ルを水層に加えて DN Aを沈殿させ、染色体 DN Aをガラス棒に卷き取った。この DNAを 1 mM— EDTA含有のトリス緩衝液（pH 7. 6 ) (以下、トリス緩衝液 3と称することがある）に溶かし、 MR SA— DNA標品として、以下の実験に用いた。

実施例 5 ： MRSA— DNA断片とプラスミド DNAとの結合

前記実施例 4で得た MRSAの DNA5 1 ( 15>u g/m 1 ) を、制限酵素 H i n dill ( 20単位）、 10 OmM— MgC 1₂、 1 OmM ジチオスレィトール含有 10 OmMトリス緩衝液（pH7. 5 ) 2 u 1 及び蒸留水を加えて 20 1にした反応液中で、 37 Cで 4時間消化し、更に制限酵素 Xb a I ( 20単位）、 10 OmM— MgC 1₂、 10 mMジチオスレィトール、 5 OmM食塩、 0. 1%牛血清アルブミン (以下、 BS Aと称することがある）含有トリス緩衝液（PH7. 5 ) 2 ju 1及び蒸留水を加えて 20 1にした反応液中で 37^eCにて 10分間、部分消化して、 MRSAの DNA断片を調製した（ S画分）。 F画分については制限酵素 Ec oR I ( 20単位）を用いて行った。

他方、同じ条件で S画分として制限酵素 Xb a I及び H i n dillを用い、 F画分として制限酵素 E c oR Iを用い、 PUC 1 19プラスミド D NA (宝酒造； 19. 5 £ 1 ) に 3 Μ食塩 1. 0 1、 0. 1 Μトリス緩衝液（P H8. 0 ) 2. 5M 1. 細菌由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造、大腸菌 A 1 9 ) (以下、 BAPと称することがある） 2 ί ΐを加え、 6 5^ECで 1時閭処理した。 B AP処理した P UC 1 1 9プラスミド DNAを、反応液にトリス緩衝液 3 ( 25 1 )及び 3M酢酸ナトリウム（ 1 5 z 1 ) を加えて実施例 4に記載した条件で抽出し、ェチルアルコールを加えて沈殿させ、室温で 30分間乾燥させ、蒸留水 3 QM 1に溶解した。前記の方法で調製した MRS A— DNA断片 0. 45 gと BAP処理した p UC l 1 9プラスミド DNA— 0. 1 5U S ( 8. 74u l ) の混合液に、 D N Aリガーゼ（ T a k a r a DNA L i g a t i o n K i t ) の A液を 8容量、 B液を 1 容置加え、 16 °Cで一夜反応させた。反応終了後の本反応液を溶液 Iと呼ぶ。

実施例 6 ：プラスミド e SRK91盈び pFRK92による邋菌のアンピシリン感受性大腸菌 DH5 a (二ツボンジーン）の一白金耳を、トリプトン 1 0 gZリットル、酵母エキス 10 gノリットル及び食塩 5 gZリットルの組成の 2 XYT培地 5 m 1に接種し、 37 Cで一夜培養した培養液 360〃 1を採り、新鮮な 2 XYT培地 36m 1に移レ、 37^eCで、 60011111の濁度が0. 4になるまで振盪培養を続けた。その培養液 25m lを採り、遠心により菌体を集め、冷 5 OmM

CaC 1₂ ( 12. 5m 1 ) に懸濁した。この懸濁液を溶液 IIと呼ぶ。実施例 5で調製した溶液 I ( 20 1 ) と前記溶液 II ( 200 ί 1 ) を混合し、 0〜5^eCで 30分間放置した後、温度を 42でに上げて 45 秒間更に放置した。次いで、 37^eCに予熱したアンピシリン含有トリプトン 10 gZリットル、酵母エキス 5 gZリットル及び食塩 10 gZリットルの組成で、 P H7. 5の Lu r i a— B e r t a n i培地（以下、 LB培地と称することがある） 780〃 1を加え、 37°Cで 1時間振盪培養した。この培養液を、 37'Cに保持したアンピシリン含有 LB培地の寒天平板上にプレイティングし、 37でで一夜培養した。実施例 7 ： MRS Aのロイコシジンのクローンのスクリーニング

実施例 6で得られた形質転換処理を受けた菌を、アンピシリン含有 L B寒天平板培地に接種し、 37 で一夜培養した。 4 Cに 30分間置いて冷やした寒天平板上に C o 1 o n y/P 1 a q u e S c r e e n NE F— 978X (D uP o n t社）を載せ、室温で約 3分間放置した。菌が付着したスクリーンを寒天平板上より取り外し、室温で 2回（各回 2分間）、 0. 5 N— N aOH ( 750 l ) に浸漬した。続いて、 1 Mトリス緩衝液（p H 7. 5 ) で同様な操作を 2回行ってから、 DNA をブロットしたスクリーンを室温で 30分間乾かした。乾かした

C o l o n y/P l a q u e S c r e e nをプラスチック袋に入れ、 0. 2%ボリビニルピロリドン（分子量 40 , 000 ) 、 0. 2%フィコール（分子量 40 , 000 ) 、 0. 2%牛血清アルブミン、 0. 0 5 Mトリスー塩酸緩衝液（p H 7. 5 ) 、 1 M食塩、 0. 1 %燐酸ナトリゥム、 1. 0%ラウリル硫酸ナトリウム（分子量 500 , 000 )及び変性した鮭精子 DN A ( 1 O Ou s/m 1 ) の組成のハイブリダィゼィシヨン用緩衝液 5 m 1を加えて封じた。 65 で一夜放置した後、 ³² P で標識した実施例 3で合成したプローブの溶液 1 00^ 1 ( 2 n g-D NA) を加え、更に 65 ^eCで一夜放置した。処理の終わった

C o l o n y/P l a q u e S c r e e nを、室温で 5分間、 0. 1 X S SCに浸漬し、撹拌下に 2回洗浄し、室温で 1時間乾かした。 MR S Aの DNAプローブとのハイブリダィゼイシヨン、洗浄、及び乾燥の済んだ C o 1 o n y/P 1 a q u e S c r e e nを感光用カセットに入れて固定し、フィルム（K o d a k— X— OMAT— AR XAR - 5 ) を重ね、一 7 CTC又は室温で感光させ、現像して、形質転換されたコロニーの判定を行った。判定の結果、前記した釣菌 1 , 000株中から、前記式（ 3 ) 〜（ 5 ) のァローブとのハイブリダィゼイションからは N 0. 1 1〜N o . 1 6の 6株が選抜され、前記式（ 6 )及び（ 7 ) のプローブとのハイブリダィゼイシヨンからは N o . 2 1〜N o . 25 の 5株が選抜された。実施例 8：形質転換コロニー中の MRS A— DNAの大きさ

コロニーハイブリダィゼイシヨンで選抜したコロニーに組み込まれている MRS A— DNAの大きさを決定するために、前記 No. 11〜 No. 16及び No. 21〜No. 25の 11種の菌をそれぞれ 1白金耳 50 g/m 1のアンピシリン含有 LB培地 25m 1に接種し、 37 Cで一夜振盪培養した後、培養液 lm 1を採り、新鮮な同種の培地 200mlに移し、 600ηπιの濁度が 0. 4になるまで培養を続けた。菌体を遠心により集め、 5 OmMグルコース及び 1 OmMEDTAを含有する 25 mMトリス緩衝液（PH8. 0 ) 4m lに懸濁し、その懸濁液にリゾチームを 7. 5mg m 1になるように加え、約 0でで処理した。 30分閭経過した後、 1%ラウリル硫酸ナトリウム含有 0. 2N -NaOH8m 1を反応液に加え、更に 10分間、約 0°Cに保持した。最後に、 5 M酢酸カリウムを加えて約 0でに 10分間置いた後、ベックマン JA20の遠心機で 19 , 000回転で 30分間遠心した。得られた上清を 0. 6容量のイソプロパノールと混合し、沈殿を集めた。この沈殿に 75%エチルアルコール 30m 1を加え、更に、同一条件で遠心し、沈殿を集めて 5分間真空乾燥した。乾燥した沈殿を、トリス緩衝液 3 (2. 48ml ) に溶かし、塩化セシウム 2. 91 g及びェチジゥムブロマイド（ 5mgZm 1 ) 0. 43m lを加え、ベックマン ALA 1 03. 3の遠心機で 65， 000回転で一夜遠心し、環状 DNAが局在する下側のバンドを採った。集めた画分を、まず 1—ブタノールで処理して混在するェチジゥムブ口マイドを除去し、次いでエチルアルコールで処理してアラスミド DNAを沈殿させ、得られた沈殿をトリス緩衝液 3に溶かした。

前記の精製プラスミド DNAを、実施例 5に記述した条件で S画分については Xb a I及び H i n dillで、また F画分については E c oR I で消化した後、 0. 8%ァガロース（フナコシ、 GA— 001 ) 、トリス塩酸 4. 4gZリットル、氷酢酸 1. 142g/リットル及び 0. 5 M— EDTA2m 1 リットルの組成の TE A緩衝液中で 1. 5時間電気泳動を行った。電気泳動終了後、ァガロースゲルを 0. 5N— 0?1含有1. 5 M食塩水に室温で撹拌下に 45分間浸漬し、 DNA を変性させた。次いで、ァガロースゲルを 1. 5M食塩含有トリス緩衝液（PH8. 0 ) で、室温で撹拌下に、 45分間浸漬して中和した。変性させた DNAが載っているァガロースゲルの上に、 Ge ne

Sc re e n P l u s NEF— 976 (DuPひ n t社）を重ね、一夜キャピラリーブロッテイングし、実施例 7に記载した方法でハイブリダィゼイシヨンを行った。このサザンハイブリダィゼイシヨンの結果より、形質転換菌 No. 11及び No. 2.1に組み込まれている MRS A由来の DNAの大きさはそれぞれ約 2. 2 k bと約 4 k bであった。ロイコシジン（ S画分）の遣伝子 DNAが挿入されたプラスミドを p S RK91と命名し、ロイコシジン（ F画分）の遺伝子 DNAが挿入されたプラスミドを P FRK 92と命名した。プラスミド p SRK 91及びプラスミド PFRK92の構造を第 3図及び第 11図に示す。プラスミド P SRK 91及びプラスミド p FRK 92の制限酵素地図を第 4図及び第 12図に示す。なお、第 4図において、 p SRK91の上に示した矢印はロイコシジン S画分遣伝子が存在する箇所であり、矢印の先端は S画分タンパク質の C末端に相当する。また、 p SRK91— :U p S RK91の誘導体でありそれらの下に示した矢印は塩基配列を決定した方向を示す。第 12図の PFRK92において、 Fで示した太い矢印はロイコシジン F画分遣伝子が存在する箇所であり、矢印の先端は F画分タンパク質の C末端に相当する。また、複数の細い矢印は塩基配列を決定した方向を示す。更に、塩基配列を DYEプライマーを利用してジデォキシ法によって決定した。その塩基配列と、その塩基配列から演繹されるアミノ酸配列を第 1表及び第 5図、並びに第 2表及び第 13図に示した。なお、第 5図においてアミノ酸配列は 1文字表記で示し、第 13 図においてァミノ酸配列は 3文字表記で示してある。 Ζ 0 Z d 丄 s u s ν 9 s S d s v n I -o DO i VVV XVV vov VVV 丄 VO VV ) ≤ I

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TCA CTC GGT GGT AAT GGA TCA TTT

S e r Le u G 1 y G 1 y A s n G 1 y S e r Ph e

125 130

AAC TAT TCT AAA TCG ATT AGC TAT

A s n Ty r S e r L y s S e r l i e S e r Ty r

135

AC A CAA CAA AAT TAT GTA AGT GAA

Th r G 1 n G i n A s n Ty r Va 1 S e r G 1 u

140 145

GTA GAA CAA CAA AAC TCA AAA AGT

Va 1 G 1 u G 1 n G i n A s n S e r L y s S e r

150 1 55

GTT TTA TGG GGC GTC AAA GC G AAT

V a 1 Le u Trp G 1 y V a 1 L y s A l a A s n

160

TCA TTC GCC ACT GAA TCA GGT CAA

S e r Phe A l a Th r G 1 u S e r G 1 G i n

165 170

AAA TCA GC A TTT GAT AGC GAT TTA

L y,s S e r A l a Ph e As p S e r As p Le u

175

TTT GTA GGC TAC AAA CCT CAT AGT

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180 185

AAA GAT CCT AGA GAT TAT TTC GTT

L y s As p P r o A r g As p T y r Ph e V a 1

190 1 5

CCA GAC AGT GAG TTA CCT CCT CTT

P r o As p S e r G 1 u Le u P r o P r o Le u

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82 AAA GTT ACT TTA TAC AAA AC A AC A

L y s V a 1 Th r Le u Ty r L y s Th r Th r

20

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A l a Th r A l a As p S e r As p L y s Phe

25 30

AAA ATT TC A C AG ATT TTA AC A TTT

L y s l i e S e r G i n l i e Le u Th r Phe

35

AAT TTC ATC AAA GAT AAA AGT TAT

A s n Phe l i e L y s As p L y s S e r T y r

40 45

GAT AAA GAT ACT TTA GTA CTT AAA

As p L y s As p Th r Le u V a 1 Le u L y s

50 55

GCT ACT GGG AAT ATT AAC TC A GGC

A l a Thr G 1 y A s n l i e A s n S e r G 1

60

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Phe V a 1 L y s P r o A s n P r o A s n As p

65 70

TAT GAC TTT TC A AAA TTA TAT TGG

T y, r As p Phe S e r L y s Le u T y r Trp

75

GGA GCT AAA TAC AAT GTA TCT ATA

G 1 y A l a L y s Ty r A s n Va 1 Se r l i e

80 85

AGC TCA CAA TCT AAT GAT TC A GTA

Se r Se r G i n Se r A s n As p Se r V a 1

90 95

AAC GCT GTT GAT TAT GC A CCA AAA

Asn A l a V a 1 As p T y r A l a Pr o L y s

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290 295

AAC AAT AAA

A s n A s n L y s

298

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( a ) プラスミド p SRK 91及び p FRK92がコードするインビト口翻訳産生物の同定プラスミド P SRK91 (実施例 7の形質転換菌 No. 1 1 )及びプラスミド P FRK92 (実施例 7の形質転換菌 No . 21 ) を用いてのィンビトロ産生物をトランスクリプシヨン Zトランスレーション法

C Z u d a y , Ann Re v. Ge ne t . 7， 267— 287

( 1 974 ) 〕によって確認した。即ち、〔³⁵S〕メチォニンでラベルされたィンビトロ産生物を SD S— PAGE上で電気泳動し、オートラジオグラフィーを行った。結果を第 6図及び第 14図に示す。 P SRK 9 1では約 35 k dのポリペプチド（P S ) を確認することができ、 P FRK92では約 37kdのポリペプチド（PF) を確認することができた。同様に行った P UC 1 1 9には見られない。実施例 1において S 画分の分子量が約 32 k dであり、 F画分の分子量が約 34 k dであつたことから、この結果は約 35k dのポリペプチド（PS)及び約 37 kdのポリペプチド（ PF ) がそれぞれ前駆体（p r emat ur e d, S—プロティン；プリプロロイコシジン S ：及び F—プロティン；プリプロロイコシジン F) であることを示唆している。

( b ) ィンビボにおける S画分及び F画分の同定

( b— 1〉抗体の作製

実施例 1で調製したロイコシジンを抗原とし、常法によりゥサギに免疫し、抗血清を調製した。得られた抗血清を硫安分画（50%飽和）し、遠心分離によって沈殿を分取した。沈殿を PBSに溶解し、再度硫安分画（33%飽和）し、遠心分離によって沈殿を分取した。この沈殿を 1 7. 5mMリン酸緩衝液（pH6. 8 ) に溶かし、同緩衝液に対して透析を行ない、続けて DEAE—セルロースカラムにより精製した I gG 画分を抗体として用いた。

(b— 2 )実施例 7の形質転換菌 No. 1 1及び形質転換菌 No. 21 をアンピシリン含有 LB培地にて I PTG ( 2mM) の存在下で培養

( 5 X 10⁸ c e 1 1 /m 1 ： m i d Lo pha s e ) した。遠心分離によって細胞を集め、 1 OmMトリスー HC 1緩衝液（pH 7. 5 ) で 1回洗浄し、超音波処理してから遠心処理（ 15000 X S , 1 0分間）した。この菌体抽出液を実施例 1の条件で部分精製した。先の培養液及び菌体抽出部分精製物を S D S— P A G E上で電気泳動し、上記抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行った。なお、二次抗体として、アル力リフォスファターゼ標識抗ゥサギ抗体を用いて検出した。結果を第 7図の A及び第 15図に示す。同様にして I PTG不存在下による試験結果を第 7図の Bに示す。

これらの結果から、分子量 32 k d及び分子量 34k dの各成熟体 (mat u r e d t yp e ) は、培養液から確認することはできないが、超音波処理して調製された菌体抽出液からそれぞれ確認することができた。また、 DH5な (p SRK91 )及び DH 5or ( p F RK 92 ) でのみ確認され、 DH 5 (P UC 1 1 9 ) においては、培養液及び菌体抽出液の両方で確認すること-ができない。 DH5 ( p SRK91 ) においては、 I PTGを除いても、その菌体抽出液から 32 kdの成熟体（プロロイコシジン S ) を確認することができる。また DH5 ( p FRK92 ) においても同様であった。

(C ) DH5な ( p SRK91 )及び DH5な (p FRK 92 ) 中の発現 S面分及び F画分の位置

DH5a (P SRK91 )及び DH5 a (p FRK92 ) をアンピシリン含有（ 100 g/m 1 ) LB培地で 37でにて培養した (m i d e xp o ne nt i a l p ha s e ) 。 10 mMトリス H C 1緩衝液 (pH7. 5 ) で 1回洗浄し、 He p p e 1の方法〔S c i e n c e， 156 , 1451— 1455 ( 1967) ] によりショックを与え、ペリプラズム空閩（外膜と内膜の間隙）とショック細胞画分を得た。これらの画分に対して前記（b— 2 ) と同様にウェスタンブロッテイングを行った。結果を第 8図及び第 16図に示す。約 32kbのプロロイコシジン Sは、 DH5な ( P SRK91 )のペリプラズム空間（外膜と内膜の間隙）に存在し、約 34kbのプロロイコシジン Fは、 DH5ひ（p FRK92 ) のペリプラズム空間（外膜と内膜の間隙）に存在している。以上の結果から、形質転換菌より得られたプリプロロイコシジン S ( 35 k d )及びプロロイコシジン S ( 32 k d ) 、並びにプリプロ口ィコシジン F ( 37 k d )及びプロロイコシジン F ( 34 k d ) は、抗ロイコシジン F抗体を作製するための抗原として使うことができ、 MR S A診断への利用が可能であることがわかった。

実施例 10 ： MRSA検出マーカーとしてのロイコシジンの評価

MRSA21株（信州大学医学部から入手の臨床株）を実施例 1の条件で培養し、部分精製したプロロイコシジン画分を、実施例 9記載の条件下でウェスタンプロットした。その結果、試験に用いた検体は総て口ィコシジン（ S及び F ) を産生していることが確認された。同様に、通常の黄色ブドウ球菌について試験した結果、ロイコシジンを産生しているものは見い出されなかった。

従来、 MRS Aに特異的なマーカーがなく、 MRS Aの検出には、菌の分離等の操作を必要とするため、時間と手間がかかっていた。本発明では、 MRSAが特異的にロイコシジン（ S画分及びF画分）、プロ口ィコシジン（ 3画分及び画分）を産生していることを明らかにし、 M RS A同定のマーカーになることを示した。このロイコシジン（ S画分及び F画分）及びプロロイコシジン（3画分及び画分）の全構造を初めて決定し、道伝子操作の技術を用いて MRS Aの免疫学的診断に用いる抗体調製に必要な抗原を産生させることに成功した。その結果、 MR S A感染患者の早期発見に役立ち、問題になつている M R S Aの院内感染防止に貢献することができる。更に、ロイコシジン及びプロロイコシジンをコードしている塩基配列を明らかにした結果、 M R S Aの確定診断が可能になった。

Claims

3/07487 請求の範囲

1. プロロイコン又はロイコシジンに対する抗体を用いることを特徴とする、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法。

2. 式

Al a AS H AS p Th r G 1 u As p I 1 e G 1

Ly s G 1 y S e r Asp I 1 e G 1 u I 1 e I 1 e

Ly s A r g Th r G 1 u Asp L y s Th r S e r

As n Ly s T r P G 1 y Va 1 Th r G 1 n As n l i e G i n P h e As p P h e Va 1 し y s As p

Th r し y s Ty r A s n し y s As p A 1 a Le u l i e Le u し y s Me t G 1 n G 1 y P h e I 1 e

S e r S e r A r g Th r Th r Ty r Ty r As n

Ty r L y s L y s Th r A s n H i s Va 1 L y s

A 1 a Me t A r S T r p P ro P h e G 1 n Ty r

A s n l i e G 1 y Le u L y s Th r As n Asp

L y s Ty r Va 1 S e r Le u I 1 e A s n Ty r Leu Pro し y s A s n し y s I 1 e G 1 u S e r

Th r A s n V a 1 S e r G 1 n Th r Leu G 1 y

Ty r A s n I I e G 1 G 1 A s n P h e G 1 n

S e r A l a P r o S e r Leu G 1 G 1 y As n

G I y S e r P h e A s n Ty r S e r し y s S e r l i e S e r Ty r Th r G 1 n G 1 n As n Ty r

Va 1 Se r G 1 u Va 1 G 1 u G 1 n G 1 n As n

S e r L y s S e r Va 1 Leu T r p G 1 Va 1

L y s A l a As n S e r P h e A 1 a Th r G 1 u

S e r G 1 G 1 n し y s S e r A 1 a P h e As p S e r As p し e u P h e Va 1 G 1 Ty r し y s

Pro Hi s Se r L y s Asp P ro A r g Asp

Ty r P h e Va 1 P r o Asp S e r G 1 u Leu P r o Pr o し e u Va 1 G 1 n S e r G 1 P h e

Asn Pr o Se r P e I 1 e A 1 a Th r Va 1

S e r Hi s G 1 u し y s G 1 S e r S e r Asp Th r S e r G 1 u P h e G 1 u l i e Th r Ty r

G 1 A r g A s n Me t A s p Va 1 T h r H i s

A l a l i e Ly s A r g S e r Th r H i s Ty r

G 1 y A s n S e r Ty r L e u A s p G 1 y H i s

A r g V a 1 H i s A s n A l a P h e V a 1 A s n

A r g A s n Ty r Th r Va 1 L y s Ty r G 1 u

Va 1 A s n T r p Ly s Th r H i s G 1 u l i e

L y s V a 1 L y s G 1 y G i n A s n

のァミノ酸配列を有するペプチド。

3. 式

Me t L e u L y s A s n L y s l i e L e u A l a

Th r Th r L e u S e r V a 1 S e r L e u L e u

A l a P r o L e u A l a A s n P r o L e u L e u

G 1 u A s n A l a L y s A 1 a A l a A s n A s p

Th r G 1 u A S P l i e G l y Ly s G 1 y S e r

A s p l i e G 1 u l i e l i e L y s A r g Th r

G 1 u A s p L y s Th r S e r A s n L y s Tr p

G l y V a 1 Th r G i n A s n l i e G i n Ph e

A s p Ph e V a 1 L y s A s p Th r L y s T y r

A s n L y s A s p A l a L e u l i e L e u し y s

Me t G i n G l y P h e l i e S e r S e r A r g

Th r Th r T y r T y r A s n T y r L y s L y s

Th r A s n H i s Va 1 L y s A l a Me t A r g

T r p P r o P h e G i n Ty r A s n l i e G l y

L e u L y s Th r A s n A s p L y s T y r V a 1

S e r L e u l i e A s n T y r L e u P r o L y s

A s n し y s l i e G 1 u S e r Th r A s n V a 1

S e r G i n Th r L e u G l y Ty r A s n l i e

G l y G l y A s n P h e G i n S e r A l a P r o

S e r L e u G l y G l y A s n G l y S e r P h e

As n T y r S e r L y s S e r l i e S e r T y r

Th r G i n G i n A s n Ty r V a 1 S e r G 1 u

V a 1 G 1 u G i n G i n A s n S e r L y s S e r

V a 1 L e u T r p G l y Va 1 L y s A l a A s n S e r Phe Al a Th r G 1 u S e r G 1 G i n L y s S e r A l a Phe As p Se r A S P Leu P h e V a 1 G 1 y Ty r L y s P ro H i s Se r L y s As p Pro A r g As p Ty r Phe V a 1 P r o As p Se r G l u Leu P r o P r o Le u Va 1 G 1 n Se r G 1 Phe A s n P r o Se r Phe I 1 e Al a Thr Va 1 Se r H i s G l u L y s G 1 y Se r Se r Asp Thr Se r G l u Phe G 1 u l i e Th r Ty r G 1 A r g A s n Met As p V 1 Thr H i s A l a l i e Ly s A r g S e r Thr H i s Ty r G 1 y A s n Se r Ty r Leu Asp G 1 H i s A r g Va 1 H i s As n A 1 a Phe Va 1 A s n A r g A s n Ty r Th r Va 1 L y s Ty r G 1 u V a 1 A s n Trp L y s Th r Hi s G 1 u l i e L y s Va 1 L y s G 1 G 1 n A s n

のアミノ酸配列を有するペプチド。

4. 式

A 1 a As n A S P Th r G 1 As p l i e G 1 y L y s G 1 Se r AS P l i e G 1 u l i e l i e L y s A r g Thr G l u A S P L y s Thr Se r A s n L y s Trp G 1 y Va 1 Thr G 1 n A s n I 1 e G 1 n Phe As p Phe Va 1 L y s As p Th r L y s Ty r As n L y S AS P A l a Leu I 1 e Leu Ly s Me t Gi n G 1 y Phe l i e S e r Se r A r g Thr Thr Ty r Ty r A s n Ty r L y s L y s Th r A s n H i s V a 1 L y s A 1 a Met A r g Trp P r o Phe G i n T y r A s n I I e G 1 y Leu し y s Thr A s n Asp し y s Ty r Va 1 Se r Le u l i e A s n Ty r Leu P r o L y s A s n Ly s l i e G 1 u Se r Th r As n Va 1 Se r G 1 n Th r Le u G 1 y Ty r As n l i e G 1 y G 1 y A s n Phe G i n S e r A 1 a P r o Se r Leu G 1 y G 1 y A s n G 1 y Se r Phe A s n Ty r Se r L y s Se r l i e Se r Ty r Th r G i n G i n A s n Ty r

V a 1 Se r G 1 u V a 1 G 1 u G i n G i n A s n Se r L y s Se r V a 1 Le u Trp G 1 y V a 1 L y s A l a A s n Se r Phe A l a Th r G 1 u Se r G 1 y G i n L y s Se r A l a Phe As p Se r As p Le u Ph e Va 1 G 1 y Ty r Ly s P r o Hi s Se r L y s As p P r o A r g As p T y r Phe V a 1 P r o As p Se r G 1 u Le u P r o P r o Le u V a 1 G i n Se r G 1 y Phe A s n P r o Se r Phe l i e A l a Th r V a 1 Se r H i s G 1 u L y s G 1 Se r Se r Asp Th r Se r G l u Phe G 1 u l i e Th r Ty r G 1 y A r g A s n Me t As p V a 1 Th r H i s A l a l i e Ly s A r g Se r Th r H i s Ty r G 1 y A s n Se r Ty r Le u As p G 1 y H i s A r g V a 1 H i s A s n A l a Phe Va 1 As n A r g A s n Ty r Th r V a 1 L y s Ty r G 1 u

V a 1 A s n Trp L y s Th r H i s G 1 u l i e L y s V a 1 L y s G 1 y G i n A s n

のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含む DN A

5. 式

Me t Leu L y s A s n L y s l i e Le u A l a

Th r Th r Le u Se r V a 1 Se r Le u Leu

A】 a P r o Le u A l a A s n P r o Le u Le u

G 1 u A s n A l a L y s A l a A l a As n As p

Th r G 1 u A S P l i e G 1 y L y s G 1 y Se r

As p l i e G 1 u l i e l i e L y s A r g Th r

G 1 u As p L y s Th r Se r A s n L y s Trp

G 1 y V a 1 Th r G i n A s n l i e G i n Phe

As Phe V a 1 L y s As p Th r L y s T y r

A s n L y s As p A l a Le u l i e Le u L y s

Me t G i n G l y Phe l i e Se r Se r A r g

Th r Thr Ty r Ty r A s n Ty r L y s L y s 3/07487

Th r A s n H i s V a 1 Ly s A 1 a Me t A r g

Tr p P r o P h e G 1 n Ty r As n I 1 e G 1 y

Le u し y s Th r A s n As P L y s Ty r V a 1

S e r Le u l i e A s n Ty r Le u P r o L y s

A s n L y s l i e G 1 u S e r Th r As n Va 1

S e r G 1 n Th r Le u G 1 y Ty r As n I 1 e

G 1 G 1 A s n Phe G 1 n S e r A 1 a P r o

S e r Le u G 1 G 1 As n G 1 y S e r Phe

A s n Ty r S e r L y s S e r I 1 e S e r Ty r

Th r G i n G 1 n A s n Ty r Va 1 S e r G 1 u

V a 1 G 1 u G i n G i n As n S e r L y s S e r Va 1 Le u Tr p G 1 V a 1 L y s A 1 a As n S e r Ph e A l a Th r G 1 u S e r G 1 G 1 n L y s S e r A l a Ph e As P S e r As p Le u Ph e Va 1 G 1 Ty r L y s P r o H i s S e r L y s As p P r o A r g As P Ty r Ph e Va 1 P r o As p S e r 1 u L e u P r o P r o Le u Va 1 G i n S e r G 1 y P h e As n P r o S e r Ph e l i e A l a Th r V a 1 S e r H i s G 1 u し y s G 1 y S e r S e r As P Th r S e r G 1 u Ph e G 1 u l i e Th r Ty r G 1 y A r g As n Me t As p V a 1 Th r H i s A 1 a I 1 e し y s A r g S e r Thr H i s Ty r G 1 y As n S e r T y r Le u As p G 1 H i s A r g V a 1 H i s A s n A l a Phe V a 1 As n A r g As n Ty r Th r Va 1 し y s Ty r G 1 u V a 1 A s n Tr p Ly s Th r H i s G 1 u I I e し y s V a 1 し y s G 1 G i n A s n

6. 式

A l a G 1 u G 1 y Ly s I I e Th r P r o Va 1

S e r Va 1 L y s L y s V a 1 As p As p L y s

V a 1 Th r Le u Ty r し y s Th r Th r A l a Th r A l a As p S e r A s P L y s Ph e L y s £//sz6Jodrd £60M

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のアミノ酸配列を有するペプチド

7. 式

Met し y s Me t As n し y s Le u Va 1 L y s S e r S e r Va 1 A 1 a Th r S e r Me t A 1 a Leu Leu Leu Leu S e r G 1 y Th r A 1 a As n A 1 a G 1 u G 1 y し y s I 1 e Th r P r o Va 1 S e r Va 1 し y s L y s V a 1 As p As p L y s Va 1 Th r Le u Ty r し y s Th r Th r A 1 a Th r A 1 a As p S e r As p し y s Phe L y s I 1 e S e r G 1 n I 1 e Leu Th r Phe As n Ph e I 1 e し y s As p し y s S e r Ty r As p L y s Asp Th r Le u Va 1 Leu L y s A l a Th r G 1 y As n I 1 e As n S e r G 1 P h e Va 1 し y s P r o As n P r o As n Asp Ty r Asp Phe S e r し y s Leu Ty r T r p G 1 A 1 a し y s Ty r As n Va 1 S e r I 1 e S e r S e r G 1 n S e r As n As S e r Va 1 As n A 1 a Va 1 As p Ty r A 1 a P r o し y s As n G 1 n As n G 1 u G 1 u Phe G 1 n Va 1 G 1 n As n Th r leu G 1 y Ty r Th r Phe G 1 G 1 As p I 1 e S e r I 1 e S e r As n G 1 y Leu S e r G 1 y G 1 y Leu As n G 1 y As n Th r A 1 a Phe S e r G 1 u Th r I 1 e As n Ty r し y s G 1 n G 1 u S e r Ty r A r Th r Leu S e r A r g As n Th r As n Ty r し y s As n Va 1 G 1 T r p G 1 V a 1 G 1 u A 1 Hi s L y s I 1 e Me t As n G 1 T r p G 1 Pr o Ty r G 1 y A r g As p S e r Phe H i s Pro Th r Ty r G 1 y As n G 1 u eu P h e Le u A 1 a G 1 y A r g G 1 n S e r S e r A 1 a Ty r A 1 a G 1 y G 1 n As n Phe I 1 e A 1 a G 1 n H i s G 1 n Me t P r o e u Leu S e r A r g S e r As n Phe As n P r o A r g Ph e Leu S e r V a 1 Le u S e r H i s A r g G 1 n As p A 1 a A 1 a し y s し y s S e r し y s I 1 e Th r V a 1 Th r Ty r G 1 n A r g G 1 u Me t As p Le u Ty r G 1 n I 1 e A r g T r p A s n G 1 y P h e Ty r T r p A 1 a G 1 y A 1 a A s n Ty r し y s A s n P h e し y s Th r A r g Th r Ph e し y s S e r Th r Ty r G 1 u I 1 e As p T r p G 1 u A s n H i s し y s Va 1 し y s Le u Le u As p Th r し y s G 1 u Th r G 1 u As n A s n L y s

のァミノ酸配列を有するペプチド

8. 式

A 1 a G 1 u G 1 y し y s I 1 e Th r P r o Va 1 S e r Va 1 し y s し y s Va 1 As p As p し y s Va 1 Th r し e u Ty r L y s Th r Th r A 1 a Th r A 1 a As p S e r Asp し y s P h e し y s I 1 e S e r G 1 n I 1 e Le u Th r P h e A s n P h e I 1 e し y s As p し y s S e r T y r As p し y s As p Th r Le u V a 1 Le u し y s A 1 a Th r G 1 A s n I 1 e A s n S e r G 1 y P h e Va 1 し y s Pr o A s n P r o A s n As p T y r As p P h e S e r し y s Le u Ty r T r p G 1 y A 1 a し y s T y r A s n V a 1 S e r I 1 e S e r S e r G 1 n S e r A s n As p S e r Va 1 A s n A 1 a Va 1 As p Ty r A 1 a P r o し y s A s n G 1 n A s n G 1 u G 1 u P h e G 1 n V a 1 G 1 n A s n Th r Le u G 1 y Ty r Th r P h e G 1 y G 1 y A s p I 1 e S e r I 1 e S e r A s n G 1 y Le u S e r G 1 y G 1 y Le u A s n G 1 y A s n Th r A 1 a P h e S e r G 1 u Th r I 1 e A s n Ty r L y s G 1 n G 1 u S e r Ty r A r g Th r Le u S e r A r g A s n Th r A s n Ty r し y s A s n Va 1 G 1 T r p G 1 y Va 1 G 1 u A 1 a H i s し y s I 1 e Me t A s n G 1 y T r p G 1 y Pr o Ty r G 1 y A r g As p S e r P h e H i s Pr o Th r Ty r G 1 A s n G 1 u Le u Phe Leu A 1 a G 1 y A r g G 1 n S e r S e r A 1 a Ty r A 1 a G 1 G 1 n A s n Phe I 1 e A 1 a G 1 n Hi s G 1 n Met Pr o Leu Le u S e r A r g S e r A s n Phe A s n P r o A r g Phe Leu S e r Va 1 Leu S e r H i s A r g G 1 n Asp A 1 a A I a し y s L y s S e r L y s I 1 e Th r Va 1 Th r Ty r G 1 n A r g G 1 u Me t Asp eu Ty r G 1 n I 1 e A r g T r p A s n G 1 Phe Ty r T r p A 1 a G 1 y A 1 a A s n Ty r し y s A s n Phe L y s Th r A r g Th r Phe L y s S e r Th r Ty r G 1 u I 1 e As p T r p G 1 u A s n H i s L y s Va 1 し y s Leu Leu Asp Th r し y s G 1 u Th r G 1 u A s n A s n し y s

9. 式

Met し y s Me t As n L y s Le u Va 1 し y s S e r S e r Va 1 A 1 a Th r S e r Me t A 1 a Leu Le Leu Leu S e r G 1 y Th r A 1 a A s n A 1 a G 1 u G 1 y L y s I 1 e Th r Pr o Va 1 S e r Va 1 し y s し y s Va 1 As p As p L y s Va 1 Th r Leu Ty r し y s Th r Th r A 1 a Th r A 1 a As p S e r As p し y s Phe L y s I 1 e S e r G 1 n I 1 e Le u Th r Phe A s n Phe I 1 e L y s As p し y s S e r Ty r Asp L y s Asp Th r Le u Va 1 Leu し y s A 1 a Th r G 1 As n I 1 e As n S e r G 1 y Phe Va 1 し y s P r o As n Pr o As n As p Ty r As p Phe S e r L y s Leu T y r T r p G 1 A 1 a し y s Ty r As n Va 1 S e r I 1 e S e r S e r G 1 n S e r As n As p S e r Va 1 As n A 1 a Va 1 As p Ty r A 1 a P r o L y s A s n G 1 n As n G 1 u G 1 u Phe G 1 n Va 1 G 1 n A s n Th r Le u G 1 y Ty r Th r P h e G 1 y G 1 y As p I 1 e S e r I 1 e S e r A s n G 1 y Le u S e r G 1 y G 1 y Le u A s n G 1 y A s n Th r A 1 a P h e S e r G 1 u Th r I 1 e A s n T y r し y s G 1 n G 1 u S e r Ty r A r g Th r Le u S e r A r g A s n Th r A s n Ty r し y s A s n Va 1 G 1 y T r p G 1 y Va 1 G 1 u A 1 a H i s L y s I 1 e Me t A s n G 1 T r p G 1 y P r o Ty r G 1 y A r g As p S e r Phe H i s P r o Th r Ty r G 1 y A s n G 1 u Le u P h e Le u A 1 a G 1 y A r g G 1 n S e r S e r A 1 a T y r A 1 a G 1 y G 1 n A s n P h e I 1 e A l a G 1 n H i s G 1 n Me t P r o Le u Le u S e r A r g S e r A s n Ph e A s n P r o A r g Ph e Le u S e r Va 1 Le u S e r H i s A r g G 1 n As p A 1 a A 1 a し y s L y s S e r し y s I 1 e Th r V a 1 Th r T y r G 1 n A r g G 1 u Me t As p Le u T y r G 1 n I 1 e A r g T r p A s n G 1 y P h e Ty r T r p A 1 a G 1 y A 1 a A s n Ty r し y s A s n P h e し y s Th r A r g Th r P h e L y s S e r Th r Ty r G 1 u I 1 e As T r p G 1 u A s n H i s し y s V a 1 し y s Le u Le u As p Th r し y s G 1 u Th r G 1 u A s n A s n し y s

のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含む DNA。

10. メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の菌体から染色体 DNAを分離し、制限酵素で消化し、得られた DNA断片をベクターに挿入し、そのベクターで宿主を形質転換して D N Aライブラリーを作製し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の菌体から精製したロイコシジン又はプロロイコシジンの部分アミノ酸配列をコードする合成 DN Aをプローブとして用いて前記 DNAライブラリーからロイコシジン又はプロロイコシジンをコードする DN Aを選び、得られた DN Aをクレーン化することを特徴とする、ロイコシジン又はプロロイコシジンをコードする DN Aの製法。

1 1 . ロイコシジン又はプロロイコシジンをコードする D N Aを発現ベクターに連結して複製可能な組換え D N Aを作製し、この組換え D N Aで宿主を形質転換し、その形質転換体を培養して前記のロイコシジン又はプロロイコシジンをコードする D N Aを発現させてロイコシジン又はプロロイコシジンを産生させ、得られたロイコシジン又はプロロイコシジンを単離する特徴とする、ロイコシジン又はプロロイコシジンの製法。