WO1994002146A1 - Composition pharmaceutique a base de flavopereirine et son utilisation dans un traitement contre le virus vih - Google Patents

Composition pharmaceutique a base de flavopereirine et son utilisation dans un traitement contre le virus vih Download PDF

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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • the present invention relates to the antiviral use of flavopereirine. It relates more particularly to a pharmaceutical composition containing as the only active principle of flavopereirine and the use thereof for the treatment in humans of viral infections, in particular such as those caused by the human immunodeficiency virus HIV,
  • Flavopereirine is an alkaloid from the beta-carboline class. It is also conventionally called “compound H or PB 100" and exhibits UV emission fluorescence at 250-254 and 306 nm.
  • flavopereirine administered at a dose of 200-600 ⁇ g intradermally or 2.5-500 mg / day, preferably 30 mg / day, prevents the appearance and development of viral papules in the case viruses of the type of those of Shope's fibroma and vaccinia.
  • flavopereirine is supposed to act in vivo against the influenza virus (RNA virus) and that it can also inhibit the multiplication of the tobacco mosaic virus (VMT) during a brief contact with this virus.
  • RNA virus influenza virus
  • VMT tobacco mosaic virus
  • EP-A-0 059 817 further discloses that flavopereirine is active against the influenza virus, but that the half-life of such a quaternary beta-carboline is too short for it to be effectively administered to humans in a dosage form other than microgranules with a delay effect.
  • Document FR 88 15845 describes a system for improving the immune defense in humans (against RNA viruses - AIDS in particular - and DNA viruses). According to this document, the inhibition of the multiplication of the viruses concerned is only possible by a system of four different substances, of which flavopereirine is only one of them.
  • the pharmaceutical composition thus disclosed must include at least one representative from each of these four categories of active substances.
  • the flavopereirine included in such a composite system is administered at a dose of 0.25 to 1 g / day, preferably orally,
  • flavopereirine alone can constitute an effective active ingredient in the fight against HIV viruses in mammals, including humans. It has more particularly been found that flavopereirine is an active principle which alone exerts, both in vitro and in vivo, a selective inhibition action on viral HIV infection, in particular in patients infected with HIV-1.
  • the present invention therefore has as a first object a pharmaceutical composition, in particular for use as a drug against viral infections by HIV, comprising flavopereirine as sole active principle, advantageously in a solid form containing per unit dose approximately 500 mg of flavopereirine or one of its salts or other pharmacologically acceptable derivatives.
  • Flavopereirine has no toxic and side effects in mammals, including humans.
  • the LD50 in the Sprague-Dawley EOPS rat is 10.45 g / kg (confidence limits: 9.63 to 11.35) orally and 2.45 g / kg (confidence limits: 2.35 to 2.55) for intraperitoneal administration.
  • the animal dies within 30 to 60 minutes following oral or intraperitoneal administration, by respiratory arrest. No delayed death was observed for the next 14 days.
  • Sub-chronic oral administration in male and female Sprague-Dawley rats demonstrated the absence of toxicity at doses equal to 1/20 of the LD 50 (ie 530 mg.kg -1 .d - 1 ) or 1/5 of the LD 50 (i.e. 2,120 mg.kg -1 .d-1).
  • LD 50 ie 530 mg.kg -1 .d - 1
  • LD 50 i.e. 2,120 mg.kg -1 .d-1
  • no changes were detected in either body weight or food intake.
  • no changes in the blood count and hepatic and renal function remained normal. No lesions of the liver, kidneys, duodenum, myocardium, spleen, thyroid and parathyroid glands, testes and ovaries were observed under the microscope.
  • Flavopereirine crosses the blood-brain barrier, as shown by the fact that in CDI male mice having received 10 mg of this compound by the oral route, the encephalic flavopereirine content was approximately 7 ⁇ g (i.e. a concentration of 14 ⁇ g / g, for 20 g mice with a brain weighing 0.5 g).
  • flavopereirine is prepared for its use according to the present invention, for example by hydrolysis in 1N HCl of powder of Geissospermum vellosii at 100 ° C., followed by neutralization by KOH, by extraction with ethanol and reduction by distillation. The residue from distillation is then taken up in chloroform, and is eliminated. excess salts by cold precipitation in the presence of ethanol and the residue is concentrated, which essentially contains flavopereirine.
  • flavopereirine can be used either as such or in the form of a salt or other pharmacologically acceptable derivative.
  • Fig. 1 represents a graph showing the compared counts of cells / ml as a function of time in hours following the infection, the addition of flavopereirine (called "H") being made 12 hours after infection;
  • - Fig. 2 represents the compared titrations of the infectious units (in IU / ml) as a function of time in hours following the infection, without addition of compound H and with addition of this respectively at the rate of 30 and 60 ⁇ g / ml.
  • FIG. 3 shows in diagram form the effect of the product H (flavopereirine) on the production of interleukin-6 by human monocytes from healthy donors.
  • FIG. 4 shows in diagram form the effect of the product H on the spontaneous production of interleukin-6 by human monocytes from seropositive patients. Flavopereirine antiviral effect against HIV
  • HIV had been obtained as HTLV III from Dr. Gallo and propagated in the above-mentioned H-9 cells.
  • the supernatant from the culture of infected H-9 cells was stored at -80 ° C. This supernatant had a concentration of 10 6 IU / ml when used.
  • the H-9 cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 15% fetal calf serum, 0.002 ⁇ m of glutamine and 100 IU of penicillin / ml in Falcon vials (25 cm 2 ). 8-20 ml of medium were used per flask. The vials were incubated at 37 ° C, in an upright position.
  • the culture was started at a concentration of 2 ⁇ 10 5 H-9 cells per ml and split when the cell number reached 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • microtiter plates were used to test flavopereirin in cultures of infected and uninfected H-9 cells. In this case the cultures were started at a concentration of 6 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • 0.1 ml of RPMI 1640 medium containing 10 2 IU of HIV was added to each cell containing 0.1 ml of this cell suspension. This corresponded to a multiplicity of infection of 1.6 ⁇ 10 4 , or one infectious unit per 500 cells.
  • RPMI 1640 medium 16 hours after infection, 0.1 ml of RPMI 1640 medium with or without flavopereirine was added to the infected cells and to the uninfected cells. Flavopereirine was used at the concentration of 30 ⁇ g and 60 ⁇ g / ml.
  • the microtiter plates were covered with an Amersham plate cover and incubated at 37 ° C. Cell counts were determined in a Neubauer chamber. The total amount of HIV antigen was determined using an HIV antigen kit or kit supplied by Abbott Laboratories. For the titration, a volume of 10 ⁇ l (from each of the cells of the plate microtitration) was prediluted in 1 ml of RPMI 1640 medium.
  • Flavopereirine was used in the form of an alcoholic solution (40 mg in 100 ⁇ l of alcohol). Dilutions were made in RPMI medium at 10% FCS, 1% PSN, 1% glutamine. The MT4 cells were pre-incubated for two hours at 37 ° C with a successive dilution of flavopereirine containing 3 ⁇ 10 5 cells for 10 ⁇ l of flavopereirine solution. We got the solution by adding 100 ⁇ l of a 10 -4 dilution of the HIV-1 virus, producing a syncytia formation in 4 to 6 days.
  • Table I shows a cellular toxicity for 100 and 400 ⁇ g / ml of flavopereirine. At 50 ⁇ g / ml there was no syncytia after 7 days of culture. From 10 ⁇ g / ml to 100 ng / ml, syncytia was observed as in the control HIV-1.
  • Table II confirms the protection provided by flavopereirine at 50 ⁇ g / ml and Table C once again confirms these results: syncytia at 60 ⁇ g / ml did not form after 7 days of culture and we observed a little after 2 days with a dose of 30 ⁇ g / ml.
  • Viral infection test determination of P24 antigen
  • PBMCs peripheral mono-nuclear blood cells
  • the cells were washed twice and cultivated in 1 ml of RPMI 1640 containing 20 IU of IL-2 per ml (Boehringer Mannheim, Germany), 2 ⁇ g of polybrene (hexadimetrine bromide ) per ml (Sigma, St Louis, MO, USA) and 10 -7 IU of goat antiserum per ml, acting against human interferon alpha (Janssen, Beerse, Belgium). Half of the culture medium was changed after 72 hours and then every 48 hours until the 30 th day.
  • the culture supernatants were tested by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the production of P24 antigen (Abbott, Chicago, IL, USA) and the optical density (OD) of the resulting color was converted into concentration P24 protein through a standard nomogram, as described by W. Lu and J.-M. Andrieu, Journal of Virology, 66 (1): 334-340 (1992).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the viability of blast PBMCs decreased significantly (p ⁇ 0.001) in the group of cells treated with 200 ⁇ g / ml, but not in the groups treated with 100, 60, 30 and 10 ⁇ g / ml of compound H respectively (see Table IX) .
  • HIV-1 replication was completely inhibited by 60-100 ⁇ g of compound H per ml. These concentrations are 2 to 4 times lower than the cytotoxic concentrations. Such an effect appeared not to be influenced by the constituents of human serum. Effects of product H on the production of primary (IL-1 ⁇ and TNF- ⁇ ) and secondary (IL-6) cytokines by normal monocytes from seropositive patients
  • HIV-positive donors from medical consultations these are people at the start of seroconversion and who have no treatment at the time of the sample.
  • the risk factors are intravenous drug addiction for six of them, sexual transmission for three patients and blood transfusion (Zaire) for one case. No correlation between risk factors and experimental results could be made.
  • Product H was not used in these experiments at more than 20 ⁇ g / ml of water, a value beyond which a clear toxicity could be demonstrated.
  • Four donors were tested beforehand at 30, 50, 100 ⁇ g / ml with practically total cytotoxicity: more than 40% at 30 ⁇ g / ml and 100% beyond (analyzes of culture supernatants were not carried out) .
  • TNF- ⁇ production there was a large decrease in production only at a high dose of product (20 ⁇ g / ml) (p ⁇ 0.05);
  • IL-1 ⁇ production there was no significant modification of the responses to LPS or to IFN- ⁇ + LPS (p ⁇ 0.05).
  • monocytes from different seropositive donors were tested in terms of spontaneous response.
  • the effects obtained are the same as those of healthy donors, namely an almost total decrease in the production of TNF- ⁇ (only at 20 ⁇ g / ml) and an absence of effect on the production of interleukin-1 at the three doses. tried (p ⁇ 0.05).
  • Interleukin-4 was used at the same time as product H, because it had been shown, prior to these experiments, that this cytokine blocked the spontaneous production of interleukin-6 in certain HIV-positive patients.
  • interleukin-9 was used in comparison, because it also blocks the production of IL-6 by normal monocytes stimulated by LPS.
  • Interleukin-9 partially inhibited spontaneous production (50% maximum) and there is never an additive effect with the interleukin-4 effect (on the contrary, in two cases out of five, the effects were canceled ; these results have not been reproduced in the figures).
  • the clinical study was carried out on 24 HIV-positive patients with a T4 lymphocyte count in absolute value between 0.200 and 0.400 ⁇ 10 9 / l.
  • T4 lymphocytes men and women over 18 years of age, with an equal or higher Karnofsky index 90%, with anti-HIV-1 antibodies, in two successive control trials (ELISA method), groups CDC II, CDC III, CDC IV C2, CDC IV E of the CDC 87 classification; hemoglobin being greater than 100-120 g / l, the neutrophils being greater than 1.5 ⁇ 10 9 / l, the platelets being more than 80 ⁇ 10 9 / l, the T4 lymphocytes being equal to or greater than 0 , 2 ⁇ 10 9 / l and less than or equal to 0.4 ⁇ 10 9 / l, in the absence of antiretroviral therapy, in particular with AZT.
  • Flavopereirine (compound H) was administered in the form of 600 mg capsules at a daily dose of 1-3 g, preferably at least about 1 g of active ingredient per day.
  • the mean duration of treatment was 43 ⁇ 11 weeks. There were only few side effects during the first three months. No blood or renal toxicity or significant change in ALT or ASAT was observed. There was no degradation in the CDC classification and no infection; Karnofsky's index was still around 100%. Physical or professional activity of patients remained strictly normal.
  • the immune response to treatment was essentially a significant increase in CD4 + cells (p ⁇ 0.05), as well as CD19 + cells (p ⁇ 0.05). The negative CD4 + slope was reversed in 18 of 19 patients (p ⁇ 0.05).
  • beta-2 microglobulins at 3-6 and 12 months.
  • it is preferably recommended for administration by the oral route in solid form, such as tablets or capsules, for example.
  • a unit dose of approximately 250-500 mg of the active ingredient is very particularly suitable.
  • the recommended dosage is, taking into account the above-mentioned results and the reported indications of toxicity, of approximately 1 to 3 g of active principle per day (g / d), and preferably of at least approximately 1 g / d, advantageously by successive catches distributed throughout the day.
  • the dosages and / or galenical forms retained can however vary according to the state of the patient and the stage of the viral attack to be treated. Their adaptation to the specific case concerned in each particular treatment can be easily carried out by a person skilled in the art, on the basis of his knowledge in the matter and if necessary with the help of preliminary routine tests.
  • the doses to be administered in practice include, in addition to the active principle or a salt or other derivative thereof, at least one pharmaceutical carrier or carrier and usual excipients, fillers, perfuming agents and / or coloring agents.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood cells
  • PBMC mononuclear peripheral blood cells

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Abstract

La composition selon l'invention comporte de la flavopéreirine, ou un sel ou autre dérivé pharmacologiquement acceptable de celle-ci, comme unique principe actif. Elle se présente sous une forme solide contenant environ 250-500 mg de principe actif, administrable par voie orale à la dose journalière d'environ 1-3 g. Application au traitement des humains atteints par VIH-1 et aux malades du SIDA.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE A BASE DE FLAVOPEREIRINE ET SON
UTILISATION DANS UN TRAITEMENT CONTRE LE VIRUS VIH
La présente invention concerne l'utilisation antivirale de la flavopéreirine. Elle concerne plus particulièrement une composition pharmaceutique contenant comme seul principe actif de la flavopereirine et l'utilisation de celle-ci pour le traitement chez l'homme des infections virales, en particulier telles que celles provoquées par le virus de l'immunodéficience humaine VIH,
La flavopéreirine est un alcaloïde de la classe des bêta-carbolines. Elle est également dénommée classiquement "composé H ou PB 100" et présente une fluorescence UV d'émission à 250-254 et 306 nm.
On peut l'obtenir à partir de l'écorce de Pao Pereira, Geissospermum vellosii-Baillon, Apocynaceae [voir H. Rapoport et al. (J. Am. Chem. Soc. 80, 1601-1608 (1958); et M. Beljanski et J. Bugiel: demande de 1er certificat d'addition No. 79 05853 à la demande de brevet français No. 78 07155 et document EP-A-0 059 817].
Il est connu que la flavopéreirine, administrée à la dose de 200-600 μg par voie intradermique ou de 2,5-500 mg/jour, de préférence 30 mg/jour, empêche l'apparition et le développement des papules virales dans le cas de virus du type de ceux du fibrome de Shope et de la vaccine.
On sait également que la flavopéreirine est sensée agir in vivo contre le virus de l'influenza (virus à ARN) et qu'elle peut en outre inhiber la multiplication du virus de la mosaïque du tabac (VMT) lors d'un bref contact avec ce virus.
Le document EP-A-0 059 817 divulgue en outre que la flavopéreirine est active contre le virus de la grippe, mais que la demi-vie d'une telle bêta-carboline quaternaire est trop courte pour qu'elle puisse être administrée efficacement chez l'homme sous une forme galénique autre que des microgranules à effet retard. Le document FR 88 15845 décrit quant à lui un système d'amélioration de la défense immunitaire chez les humains (contre les virus à ARN -SIDA en particulier- et les virus à ADN). Selon ce document l'inhibition de la multiplication des virus concernés n'est possible que par un système de quatre substances différentes, dont la flavopereirine n'est que l'une d'entre elles. La composition pharmaceutique ainsi divulguée comprend obligatoirement au moins un représentant de chacune de ces quatre catégories de substances actives. La flavopéreirine comprise dans un tel système composite est administrée à une dose de 0,25 à 1 g/jour, de préférence par voie orale,
On a maintenant trouvé de façon inattendue que la flavopéreirine peut constituer à elle seule un principe actif efficace dans la lutte contre les virus de VIH chez les mammifères, y compris l'homme. On a plus particulièrement trouvé que la flavopéreirine est un principe actif qui à lui seul exerce, tant in vitro que in vivo, une action d'inhibition sélective sur l'infection virale par VIH, notamment chez des patients infectés par VIH-1.
La présente invention a donc pour premier objet une composition pharmaceutique, notamment pour utilisation comme médicament contre les infections virales par VIH, comportant de la flavopéreirine comme unique principe actif, avantageusement sous une forme solide contenant par dose unitaire environ 500 mg de flavopéreirine ou d'un de ses sels ou autres dérivés pharmacologiquement acceptables.
Elle a également pour objet l'utilisation d'une telle composition pharmaceutique à base de flavopéreirine pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement antiviral contre le virus VIH.
Ces objets, ainsi que d'autres, ressortiront mieux de la suite de la présente description, dans laquelle les essais et expérimentations relatés ne sont donnés qu'à titre indicatif et ne limitent aucunement l'invention.
La flavopéreirine est dénuée d'effet toxique et d'effets secondaires chez les mammifères, y compris l'homme. La DL50 chez le rat Sprague-Dawley EOPS est de 10,45 g/kg (limites de confiance: 9,63 à 11,35) par voie orale et de 2,45 g/kg (limites de confiance: 2,35 à 2,55) pour une administration intrapéritonéale. L'animal meurt dans les 30 à 60 minutes suivant l'administration orale ou intrapéritonéale, par arrêt respiratoire. Il n'a pas été observé de mort différée durant les 14 jours suivants.
Une administration sous-chronique par voie orale chez des rats Sprague-Dawley mâles et femelles (OFA) a démontré l'absence de toxicité à des doses égales à 1/20 de la DL50 (soit 530 mg.kg-1.d-1) ou à 1/5 de la DL50 (soit 2120 mg.kg-1.d-1). A ces doses on n'a détecté de modifications ni dans le poids corporel, ni dans la prise de nourriture. On n'a pas non plus décelé d'altération de la numération globulaire sanguine et les fonctions hépatiques et rénales restaient normales. On n'a observé au microscope aucune lésion du foie, des reins, du duodénum, du myocarde, de la rate, des glandes thyroïdes et parathyroïdes, des testicules et des ovaires.
La flavopéreirine franchit la barrière hématoencéphalique, ainsi que l'a montré le fait que chez des souris mâles CDI ayant reçu 10 mg de ce composé par voie orale, la teneur encéphalique en flavopéreirine était de 7 μg environ (soit une concentration de 14 μg/g, pour des souris de 20 g ayant un cerveau pesant 0,5 g).
Dans la pratique on prépare la flavopéreirine, en vue de son utilisation selon la présente invention, par exemple par hydrolyse dans HCl 1N de poudre de Geissospermum vellosii à 100°C, suivie d'une neutralisation par KOH, d'une extraction à l'éthanol et d'une réduction par distillation. On reprend ensuite le résidu de la distillation par du chloroforme, on élimine l'excès de sels par précipitation à froid en présence d'éthanol et on concentre le résidu, qui contient essentiellement la flavopéreirine.
Aux fins de la présente invention, la flavopéreirine peut être mise en oeuvre soit telle quelle, soit sous forme d'un sel ou autre dérivé pharmacologiquement acceptable.
Les essais pharmacologiques suivants, correspondant à l'indication thérapeutique susdite, ont été réalisés. Ils sont complétés par les figures annexées, dans lesquelles:
- Fig. 1 représente un graphique montrant les comptages comparés de cellules/ml en fonction du temps en heures suivant l'infection, l'addition de flavopéreirine (dénommée "H") étant faite 12 heures après l'infection;
- Fig. 2 représente les titrages comparés des unités infectieuses (en UI/ml) en fonction du temps en heures suivant l'infection, sans addition de composé H et avec addition de celui-ci respectivement à raison de 30 et 60 μg/ml.
- Fig. 3 représente sous forme de diagrammes l'effet du produit H (flavopéreirine) sur la production d'interleukine-6 par des monocytes humains provenant de donneurs sains.
- Fig. 4 représente sous forme de diagrammes l'effet du produit H sur la production spontanée d'interleukine-6 par des monocytes humains provenant de patients séropositifs. Effet antiviral contre VIH de la flavopéreirine
La destruction du VIH dans des cellules en culture in vitro sans effet sur les cellules normales ou saines a été démontrée par l'utilisation de la souche H-9 des lymphocytes T4 obtenue auprès du Dr. R. Gallo via le Paul Ehrlich institute (Francfort, Allemagne) et propagée à l'Institut fur Medizinische Mikrobiologie und Hygiene (Université de Berne, Suisse).
Le VIH avait été obtenu en tant que HTLV III auprès du Dr. Gallo et propagé dans les cellules H-9 susmentionnées. Le surnageant provenant de la culture de cellules H-9 infectées a été stocké à -80°C. Ce surnageant avait une concentration de 106 Ul/ml lorsqu'on l'utilisait. Les cellules H-9 ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 contenant 15% de sérum de veau foetal, 0,002 μm de glutamine et 100 UI de pénicilline/ml dans des fioles de Falcon (25 cm2). On a utilisé 8 à 20 ml de milieu par fiole. Les fioles ont été mises à incuber à 37°C, en position droite. La culture a été débutée à une concentration de 2 × 105 cellules H-9 par ml et scindée lorsque le nombre de cellules atteignait 1 × 106 cellules/ml. Pour tester la flavopéreirine dans des cultures de cellules H-9 infectées et non infectées, on a utilisé des plaques de microtitrage. Dans ce cas les cultures ont été débutées à une concentration de 6 × 105 cellules/ml. Après 23 heures d'incubation il a été ajouté, à chaque alvéole contenant 0,1 ml de cette suspension cellulaire, 0,1 ml de milieu RPMI 1640 contenant 102 UI de VIH. Cela correspondait à une multiplicité d'infection de 1,6 × 104, soit une unité infectieuse pour 500 cellules. 16 heures après l'infection, on a ajouté dans les alvéoles infectées et dans les alvéoles non infectées 0,1 ml de milieu RPMI 1640 avec ou sans flavopereirine. La flavopéreirine a été utilisée à la concentration de 30 μg et de 60 μg/ml. Les plaques de microtitrage ont été recouvertes avec un couvercle de plaques d'Amersham et on a incubé à 37°C. Les comptages cellulaires ont été déterminés dans une chambre de Neubauer. On a déterminé la quantité totale d'antigène de VIH en utilisant un kit ou trousse d'antigène de VIH fourni par la société Abbott Laboratories. Pour le titrage un volume de 10 μl (provenant de chacune des alvéoles de la plaque de microtitrage) a été prédilué dans 1 ml de milieu RPMI 1640. On a fait à partir de ce stock 8 dilutions en série respectivement de 1 à 3 et de 1 à 5. Un volume de 0,1 ml de chaque dilution a été prélevé et ajouté à 0,2 ml d'une culture préincubée de cellules H-9 contenant 5 × 105 cellules/ml. Après incubation à 37°C, la présence d'antigène de VIH a été testée au moyen d'un kit d'antigène de VIH fourni par la société Abbott Laboratories.
Les résultats reproduits sous forme graphique sur la figure 1 ci-annexée montrent que la flavopéreirine n'affecte pas la multiplication de cellules non infectées.
Au contraire la quantité de cellules infectées est d'environ 40% inférieure en présence de la flavopéreirine.
Ce qui est plus frappant encore, c'est que (voir la présentation des résultats sur la figure 2), alors qu'il y avait un accroissement de particules virales de cellules infectées non traitées avec le temps, on n'a pas pu, dans les limites du test appliqué, détecter la présence d'unités infectieuses au-delà de 3000 dans les séries de cellules infectées traitées avec la flavopéreirine (30 μg ou 60 μg). Cela montre que l'inhibition de l'infection dépasse au moins 99%.
Une évaluation de l'effet antiviral de la flavopéreirine a également été effectuée par étude de l'effet cytopathogène du virus de VIH sur des cellules MT4, étant donné que l'on avait observé une formation de syncytia 4 à 6 jours après l'infection par VIH 1, suivie de la mort des cellules.
La flavopéreirine a été utilisée sous la forme d'une solution alcoolique (40 mg dans 100 μl d'alcool). On a fait des dilutions dans du milieu RPMI à 10% de FCS, 1% de PSN, 1% de glutamine. Les cellules MT4 ont été mises à pré-incuber pendant deux heures à 37°C avec une dilution successive de flavopéreirine contenant 3 × 105 cellules pour 10 μl de solution de flavopéreirine. On a obtenu la solution en ajoutant 100 μl d'une dilution par 10-4 du virus VIH-1, produisant une formation de syncytia en 4 à 6 jours. Après 1 heure d'incubation à 37°C, les cellules MT4 infectées ont été lavées 3 fois avec du milieu RPMI avant d'être mises en culture (3 × 105 celllules/μl dans des microplaques à 24 alvéoles) en présence de différentes dilutions de flavopéreirine. Le comptage des syncytia a été effectué chaque jour en double. Les résultats sont résumés dans les tableaux I, II et III ci-dessous.
Tableau I H d3 d4 d6 d7
400 μg/ml Tox Tox
100 Tox Tox
50 (+) (+) (+) (+) - - - -
10 + + + (+) + ++ ++ ++
1 + (+) + + ++ ++ ++/T ++/T
100 ng/ml + + + + ++ ++ ++/T ++/T
VIH-1 seul + + + + ++ ++ ++ ++/T
MT4 - - - - - - - -
Tableau II H d3 d4 d5 d6 d7 d10
100 μg/ml Tox Tox
50 - - - - - - - - - - - -
10 - - + (+) + + + ++ ++ ++
1 - - + + + ++ ++ ++ ++ ++/T
100 ng/ml - (+) + + + + ++ ++ ++ ++
VIH-1 seul - - (+) + + ++ ++ ++ ++/T ++/T
Tableau III H d3 d4 d5 d6 d7
60 μg/ml - - - - - - - - - -
30 - - - - - - (+) - ++ (+)
10 (+) - (+) (+) + (+) ++ ++ ++ ++
1 (+) (+) (+) (+) (+) (+) ++ + ++ ++
100 ng/ml - (+) (+) (+) + (+) + ++ ++ ++
VIH-1 seul (+) (+) (+) (+) + + ++ ++ ++ ++
MT4 - - - - - - - - - -
Le tableau I montre une toxicité cellulaire pour 100 et 400 μg/ml de flavopéreirine. A 50 μg/ml il ne se formait pas de syncytia après 7 jours de culture. De 10 μg/ml à 100 ng/ml on a observé des syncytia comme dans le VIH-1 témoin.
Le tableau II confirme la protection procurée par la flavopéreirine à 50 μg/ml et le tableau C confirme une nouvelle fois ces résultats: il ne se formait pas de syncytia à 60 μg/ml après 7 jours de culture et on en observait un peu après 2 jours avec la dose de 30 μg/ml. Essai d'infection virale (détermination de l'antigène P24)
On a inoculé 1 nanogramme d' isolâts primaires de VIH-1, BRE1 (d'un patient asymptomatique) et TIG2 (d'un patient atteint du SIDA) avec 106 cellules sanguines mono-nucléaires périphériques (PBMC) stimulées au PHA recueillies à partir de cinq donneurs négatifs pour VIH pris au hasard. Après 2 heures d'incubation, on a lavé les cellules deux fois et on les a cultivées dans 1 ml de RPMI 1640 contenant 20 UI de IL-2 par ml (Boehringer Mannheim, Allemagne), 2 μg de Polybrène (bromure d 'hexadiméthrine) par ml (Sigma, St Louis, MO, USA) et 10-7 UI d'antisérum de chèvre par ml, agissant contre l'interféron humain alpha (Janssen, Beerse, Belgique). On a changé la moitié du milieu de culture après 72 heures et ensuite toutes les 48 heures jusqu'au 30ème jour. On a testé les surnageants de culture par un dosage immuno-enzymatique (ELISA) quant à la production d'antigène P24 (Abbott, Chicago, IL, USA) et la densité optique (DO) de la couleur résultante a été convertie en concentration en protéine P24 par le biais d'un nomogramme standard, comme décrit par W. Lu et J.-M. Andrieu, Journal of Virology, 66(1): 334-340 (1992).
Test d'efficacité de la flavopéreirine sur le pouvoir infectant du VIH-1
1) Première expérience: avant incubation du virus en présence de PBMC stimulées par PHA (cellules blastiques), des stocks viraux extracellulaires ont été prétraités en triple avec 30 ou 60 μg de flavopéreirine par ml pendant 2 heures.
2) Deuxième expérience: des cellules blastiques ont été prétraitées en triple avec 30 ou 60 μg de flavopéreirine par ml pendant 2 heures, et on a ensuite lavé deux fois avant d'exposer à l'inoculum viral. Cytotoxicité de la flavopéreirine dans les PBMC au repos et dans des cellules blastiques
Des PBMC fraîches et des PBMC blastiques prélevées sur cinq donneurs sains, séronégatifs pour VIH, pris au hasard et traités à trois reprises avec 30 ou 60 μg de flavopéreirine par ml de solution alcoolique pendant 2 heures ont été réunies. Après lavage à deux reprises, les cellules ont été mises en culture dans du milieu de culture cellulaire jusqu'au quinzième jour. La viabilité des cellules de chaque groupe a été examinée par coloration d'exclusion au bleu trypan et par analyse quantimétrique. Des cultures de PBMC séronégatives pour VIH sans flavopéreirine (composé H) ont été utilisées comme témoins.
Inhibition de l'infection productive par VIH-1 par le composé H 1) Un prétraitement de VIH-1 par le composé H (à raison de 30 ou 60 μg/ml) a complètement inhibé l'infection des PBMC cibles par des isolats de VIH-1 primaires dérivés de patients aussi bien asymptomatiques que symptomatiques (voir tableau V plus loin).
2) Seul cependant le prétraitement des PBMC cibles avec 60 μg/ml a conduit à une inhibition complète des infections virales productives (voir tableau VI). Cytotoxicité du composé H dans les PBMC humaines au repos et les cellules blastiques stimulées par PHA
1) La viabilité des PBMC au repos diminuait significativement (p<0,05) dans le groupe de cellules traitées avec 60 μg/ml, mais pas dans le groupe traité avec 30 μg de composé H par ml (voir tableau VI). 2) La viabilité des cellules blastiques est apparue dépendante de l'exposition au composé H (voir tableaux IV, V et VI).
Inhibition de l'infection productive par VIH-1 au moyen du composé H
Un prétraitement de VIH-1 avec du composé H (à raison de 10, 30, 60, 100, 200 μg/ml) inhibait l'infection des PBMC cibles par le virus d'une manière dépendante de la dose (voir tableau VII plus loin). La dose égale ou supérieure à 60 μg de composé H par ml est apparue être la concentration requise pour l'inhibition complète des infections virales productives.
Dans le système de culture de PBMC humaines primaires, l'efficacité du composé H dans l'inhibition du VIH-1 de type sauvage demeurait inchangée lorsqu'on mettait le médicament à incuber dans un milieu de culture contenant 50% de sérum humain avant l'essai d'inhibition (voir tableau VIII).
Cytotoxicité du composé H dans les PBMC humaines stimulées par PHA
La viabilité des PBMC blastiques diminuait significativement (p<0,001) dans le groupe des cellules traitées avec 200 μg/ml, mais pas dans les groupes traités avec respectivement 100, 60, 30 et 10 μg/ml de composé H (voir tableau IX).
La réplication du VIH-1 était totalement inhibée par 60-100 μg de composé H par ml. Ces concentrations sont 2 à 4 fois plus faibles que les concentrations cytotoxiques. Un tel effet est apparu ne pas être influencé par les constituants du sérum humain. Effets du produit H sur la production de cytokines primaires (IL-1β et TNF-α) et secondaire (IL-6) par des monocytes normaux provenant de patients séropositifs
Les monocytes adhérents provenant du sang de deux types de donneurs ont été utilisés:
- des donneurs normaux, volontaires sains, donneurs spontanés se présentant à la banque de sang de l'hôpital de la Pitié-Salpêtrière, Paris (France);
des donneurs séropositifs provenant de consultations médicales: ce sont des personnes en début de séroconversion et n'ayant au moment du prélèvement aucun traitement. Les facteurs de risque sont la toxicomanie par voie intraveineuse pour six d'entre eux, la transmission sexuelle pour trois patients et la transfusion sanguine (Zaïre) pour un cas. Aucune corrélation entre facteurs de risques et résultats expérimentaux n'a pu être faite.
Dans le cas des donneurs séropositifs quelques anomalies ont été relevées, anomalies qualitatives touchant essentiellement les lignées polynucléaire et lymphocytaire:
- polynucléaires hypersegmentés ou hyposegmentés (de type Pelger) dans quatre cas sur 10;
- lymphocytes hyperbasophiles également dans quatre cas sur 10 (différents des précédents).
Les anomalies observées n'ont pu être corrélées avec les résultats obtenus au cours des expériences.
En analyse immunophénotypique, aucune expression des antigènes de différenciation étudiés (CD34, CD33, CD13 et CD11b) n'a été montrée déficiente.
I. Donneurs normaux
Les dix donneurs rentrant dans ces expériences ont montré une grnde cohérence de résultats:
- aucune production spontanée ni de cytokines primaires (IL-1β et TNF-α), ni de l'interleukine-6, cytokine secondaire; - la stimulation des monocytes pendant 48 heures avec de l'interféron-γ (1000 U/ml) n'a abouti à aucune production de cytokines primaires, sauf pour le donneur #10 en IL-β, et de cytokine secondaire, sauf pour les donneurs #1 et 5.
les stimulations obtenues avec le LPS
(lipopolysaccharide) et le mélange interféron-γ + LPS ont été comme attendues, c'est-à-dire d'amplitude différente d'un donneur à l'autre, mais toujours significatives avec un effet synergique dans le cas de la double stimulation.
Effet du produit H
Le produit H n'a pas été utilisé dans ces expériences à plus de 20 μg/ml d'eau, valeur au-delà de laquelle une nette toxicité a pu être mise en évidence. Quatre donneurs ont été testés préalablement à 30, 50, 100 μg/ml avec une cytotoxicité pratiquement totale: plus de 40% à 30 μg/ml et 100% au-delà (les analyses des surnageants de culture n'ont pas été réalisées).
Les doses de 5, 10 et 20 μg/ml ont été choisies dès la deuxième série d'expériences, les résultats obtenus avec les deux premiers donneurs indiquant que les doses en dessous de 5 μg/ml se révélaient inactives. Activité directe du produit H:
- sur la production de cytokines primaires :
. augmentation de la production de TNF-α (donneur #7) mais à une seule dose, l'effet étant également visible sur la réponse à l'IFN-γ;
. augmentation de la production d'IL-1β (donneurs #3, 5 et 6) avec un effet-dose, mais cette réponse est restée marginale. En revanche, le donneur #10 a très bien répondu aux doses de 10 et 20 μg/ml;
sur la production de cytokine secondaire (interleukine-6): aucune modification de la réponse n'a été observée.
Activité indirecte du produit H:
- sur la production de cytokines primaires:
production de TNF-α: il y a eu une forte diminution de production uniquement à forte dose de produit (20 μg/ml) (p<0,05);
. production d'IL-1β:il n'y a eu aucune modification significative des réponses au LPS ou à l'IFN-γ+ LPS (p<0,05).
- sur la production de cytokine secondaire (interleukine-6):
. il y a eu une forte diminution de la production d'IL-6; cette inhibition n'est jamais totale et, contrairement au cas du TNF-α, elle est dose-dépendante (p<0,05).
Ces différents résultats sont regroupés sur les figures 3 et 4, où les doses mesurées, en ordonnée, sont en pg/ml de cytokines, et les déviations standard ne sont pas précisées, car elles sont toujours inférieures à 10% de la moyenne. II. Donneurs séropositifs
La réponse des monocytes provenant des différents donneurs séropositifs a été testée en terme de réponse spontanée. Les quantités de cellules obtenues étant faibles (ce ne sont pas des donneurs prélevés par cytaphérèse), les expériences ont été limitées en fonction de ce nombre de cellules.
Activité directe du produit H:
- sur la production de cytokines primaires.
Aucune modification de la production de base n'a été observée, que ce soit pour le TNF-α ou pour l'IL-1β.
- sur la production de cytokine secondaire. 8 patients sur 10 ont présenté une réponse spontanée significative d'interleukine-6.
Activité indirecte du produit H:
- Effet sur la production de cytokines primaires.
Les effets obtenus sont les mêmes que ceux de donneurs sains, à savoir une diminution presque totale de la production de TNF-α (uniquement à 20 μg/ml) et une absence d'effet sur la production d' interleukine-1 aux trois doses essayées (p<0,05).
- Effet sur la production d'interleukine-6.
En même temps que le produit H, l'interleukine-4 a été utilisée, car on avait montré, préalablement à ces expériences, que cette cytokine bloquait la production spontanée d'interleukine-6 chez certains patients séropositifs.
Dans cinq cas, l'interleukine-9 a été utilisée en comparaison, car elle bloque également la production d'IL-6 par des monocytes normaux stimulés par du LPS.
Les résultats obtenus sont les suivants : . L'interleukine-4 inhibait la production d'IL-6, mais cette inhibition n'était jamais complète (p<0,05).
L'interleukine-9 a partiellement inhibé la production spontanée (50% au maximum) et il n'y a jamais effet additif avec l'effet interleukine-4 (au contraire, dans deux cas sur cinq, il y a eu annulation des effets; ces résultats n'ont pas été reproduits sur les figures).
. Le produit H a présenté un effet inhibiteur avec un très net effet-dose (p<0,05). Il n'y a pourtant jamais eu inhibition totale de la production spontanée d'IL-6. En revanche, en présence d' interleukine-4, un effet d'amplification a pratiquement toujours été obtenu (sauf dans le cas #4), avec disparition totale de la production à 3 μg/ml de produit H (et même souvent dès 1 μg/ml) (p<0,05). En conclusion:
- le produit H s'est révélé toxique au-delà de la dose de 20 μg/ml in vitro sur les cellules utilisées dans le cadre des expériences du titre, à savoir des monocytes humains provenant soit de donneurs sains, soit de patients séropositifs asymptomatiques;
- le produit H s'est révélé apte à moduler la production de cytokines soit directement pour les cytokines primaires, effet qui restait faible, soit de manière très nette indirectement pour les productions de TNF-α et d'IL-6, mais non d'IL-1. De même, le produit H inhibait les productions spontanées d'IL-6 observées chez certains patients séropositifs. Cet effet inhibiteur, qui n'était jamais total dans le cadre des expériences relatées, était amplifié en présence d'IL-4;
- la normalisation des réponses IL-6 et TNF-α chez le sujet séropositif, sans pour cela inhiber les productions d'IL-1, était tout à fait importante, puisque le produit H ne modifiait pas le potentiel de relations immunes entre monocytes et lymphocytes, ainsi qu'une grande partie des réactions inflammatoires nécessaires à la survie, comme la stimulation des cellules souches de la moelle osseuse et l'établissement d'une réaction de défense au niveau général.
Tolérance clinique et efficacité de la flavopéreirine
L'étude clinique a été effectuée sur 24 patients séropositifs présentant une numération de lymphocytes T4 comprise en valeur absolue entre 0,200 et 0,400 × 109/l.
Tous les patients avaient été informés sur le composé actif concerné et sur les autres médicaments antirétrovirus couramment utilisés à l'époque de l'étude. La sélection des patients a été effectuée sur la base du nombre absolu de lymphocytes T4: hommes et femmes de plus de 18 ans, ayant un indice de Karnofsky égal ou supérieur à 90%, présentant des anticorps anti-VIH-1, dans deux essais témoins successifs (méthode ELISA), des groupes CDC II, CDC III, CDC IV C2, CDC IV E de la classification CDC 87; l'hémoglobine étant supérieure à 100-120 g/l, les polynucléaires neutrophiles étant supérieurs à 1,5 × 109/l, les plaquettes étant de plus de 80 × 109/l, les lymphocytes T4 étant égaux ou supérieurs à 0,2 × 109/l et inférieurs ou égaux à 0,4 × 109/l, en l'absence de thérapie antirétrovirale, en particulier par l'AZT.
20 patients ont été admis sur la base de ces critères d'inclusion. Avant de les inclure dans l'étude, on a fait pour chacun d'eux un bilan préthérapeutique: état historique postclinique et thérapeutique, examen clinique avec détermination de la fièvre, l'anorexie et les nausées, les maux de tête, le prurit, la toux et l'expectoration, la diarrhée, les adénopathies, la mycose buccale, la dermatite séborrhéique et les lésions de Kaposi. On a également effectué une étude biologique incluant les hématies et les plaquettes, les sous-populations lymphocytaires (CD2, CD4, VD8, CD19, CD4/8), la détermination de l'antigène P24 et de la bêta-2 microglobuline, de la LDH (lactate déshydrogénase), de la ferritine plasmatique, de l'ALAT (alanine-amino-transférase), de l'ASAT (aspartate-aminotransférase) et de la créatinine plasmatique.
On a administré la flavopéreirine (composé H) sous forme de gélules de 600 mg à une dose journalière de 1-3 g, de préférence d'au moins environ 1 g de principe actif par jour. La durée moyenne du traitement était de 43 ± 11 semaines. Il y a eu peu d'effets secondaires seulement pendant les trois premiers mois. On n'a observé ni toxicité sanguine ou rénale, ni modification significative dans l'ALAT ou l'ASAT. On n'a noté aucune dégradation dans la classification CDC et aucune infection; l'indice de Karnofsky se maintenait toujours autour de 100%. L'activité physique ou professionnelle des patients restait strictement normale. La réponse immunitaire au traitement était essentiellement une augmentation significative des cellules CD4+ (p<0,05), ainsi que des cellules CD19+ (p<0,05). La pente négative des CD4+ s'est inversée chez 18 patients sur 19 (p<0,05).
Tous les résultats obtenus in vitro et in vivo indiquent clairement que le composé flavopéreirine exerce un effet inhibiteur significatif sur le pouvoir infectant viral du VIH tant in vitro sur des cellules humaines que in vivo chez des patients infectés par VIH-1.
Sur 10 des malades qui ont été traités pendant 1 an, on a en outre noté les variations significatives suivantes :
- augmentation des hématies à 9 mois;
- augmentation de l'hémoglobine à 9 mois;
- augmentation de la masse totale des lymphocytes à 9 et 12 mois;
- augmentation des CD2 à 9 mois;
- augmentation des CD4 à 12 mois;
- augmentation des CD8 à 9 mois;
- augmentation des CD19 à 6-9 et 12 mois;
- augmentation des bêta-2 microglobulines à 3-6 et 12 mois. Dans la pratique on préconise de préférence une administration par voie orale sous forme solide, telle que des comprimés ou des gélules, par exemple. Une dose unitaire d'environ 250-500 mg du principe actif est tout particulièrement appropriée.
La posologie recommandée est, compte-tenu des résultats susmentionnés et des indications de toxicité relatées, d'environ 1 à 3 g de principe actif par jour (g/d), et de préférence d'au moins environ 1 g/d, avantageusement par des prises successives réparties au cours de la journée. Les dosages et/ou formes galéniques retenues peuvent cependant varier selon l'état du malade et le stade de l'atteinte virale à traiter. Leur adaptation au cas spécifique concerné dans chaque traitement particulier peut être réalisée aisément par l'homme du métier, sur la base de ses connaissances en la matière et si besoin est avec l'aide d'essais de routine préliminaires. A cet égard, il est tout particulièrement recommandé de prendre en compte les données fournies par une étude de pharmacocinétique faite sur l'homme pour évaluer la durée de demi-vie du principe actif administré et éventuellement d'adapter en fonction des résultats obtenus la forme de préparation pharmaceutique pour administration. Celle-ci peut ainsi comporter des formes galéniques à effet retard, par exemple.
Les doses à administrer comprennent en pratique, outre le principe actif ou un sel ou autre dérivé de celui-ci, au moins un support ou vecteur pharmaceutique et des excipients, charges, agents parfumants et/ou colorants habituels.
Tableau IV
Prétraitement d'inoculum viral avec du composé H (expériences en triple)
Stock viral VIH prétraité Production postinfection
(1 ng/ml) avec H de P24 de VIH (pg/ml)
pendant 2 h. d3 d5 d14 c21 d30
VIH-1Asym. Témoin 250±25 >1500
(StockBret) +30μg/ml - - - - - +60μg/ml - - - - -
VIH-1SIDA Témoin 575±129 >1500
(StockTigr) +30μg/ml - - - - - +60μg/ml - - - - -
Cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) réunies
issues de cinq donneurs en bonne santé séronégatifs pour VIH
choisis au hasard
Tableau V
Prétraitement de cellules cibles avec eu composé H (expériences en triple)
Stock viral PBMC* prétraitées Production postinfection
(1 ng/ml) avec H de P24 de VIH (pg/ml)
pendent 2h. d3 d5 d14 d21 d30
VIH-1Asym. Témoin 250±25 >1500
(StockBret) +30μg/ml 113±7 >1500
+60μg/ml - - - - -
VIH-1SIDA Temo in 575±129 >1500
(StockTiQr) +30μg/ml 515±103 > 1500
+60μg/ml - - - - - *PBMC réunies à partir de cinq donneurs en bonne santé
séronégatifs pour VIH choisis au hasard Tableau VI
Cytotoxicité du composé H dans des PBMC humaines au repos et des PBMC stimulées par PHA (blastiques) (expériences en 5 fois)
Cellules Cellules Viabilité (%) des PBMC après exposition cibles traitées au composé H
avec H
( 2 h.) d3 d7 d11 d13 d15
PBMC* Témoin 97±2 95±3 98±2 91±8 85±9
+30 μg/ml 95±4 93±2 88±7 82±10 81±11
+60 μg/ml 56±6 23±4 17±4 12±5 25±8 Blastes** Témoin 86±5 84±6 76±4 75±5 68±7
+30 g/ml 88±3 85±7 71±3 76±9 69±8 +60 g/ml 79±4 74±5 70≡4 71±8 63±7 * PBMC réunies provenant de cinq donneurs en bonne santé
séronégatifs pour VIH choisis au hasard
** Cellules blastiques stimulées par PHA provenant de cinq
donneurs sains séronégatifs pour VIH choisis au hasard
Tableau VII
Prétraitement d'inoculum viral avec du composé H en l'absence de sérum humain du groupe AB (expériences en 5 fois)
VIH prétraité Production de P24 de VIH (pg/ml) avec H
pendant 2 h. d4 d10 d14 d21
Témoin 510±235 >1500
+200 μg/ml - - - - +100 μg/ml - - - - +60 μg/ml - - - - +30 μg/ml 173±102 >1500
+10 μg/ml 388±124 >1500
Cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) réunies issues de cinq donneurs en bonne santé séronégatifs pour VIH choisis au hasard Tableau VIII
Prétraitement d'inoculum viral avec du composé H en présence de sérum humain du groupe AB (expériences en triple)
VIH prétraité sans/avec Production de P24 de VIH (pg/ml) avec H (-/+)
pendant 2 h. 50% de d4 d10 d14 d21
sérum AB
Témoin - 510±235 >1500
+200 μg/ml + - - - - +100 μg/ml + - - - - +60 μg/ml + - - - - +30 μg/ml + 275±98 >1500
+10 μg/ml + 384±83 >1500
Cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) réunies issues de cinq donneurs en bonne santé séronégatifs pour VIH choisis au hasard
Tableau IX
Cytotoxicité du composé H sur des PBMC humaines stimulées par PHA (blastiques) en présence ou en l'absence de sérum humain du groupe AB (expériences en cinq fois)
Cellules sans/avec Cytotoxicité du composé H après traitées (-/+) exposition à des PBMC*
avec H 50% de
( 2 h.) sérum AB d4 d10 d14 d21
Témoin - 85±1,4** 86±1,3 80±2,7 77±3,1
+200 μg/ml - 45±6,3 33±7,8 24±7,6 15±5,4
+100 μg/ml - 84±1,6 79±3,1 73±5,3 74±4,7
+60 μg/ml - 86±1,5 82±2,4 82±2,6 80±3,3
+30 μg/ml - 81±2,8 83±2,6 80±3,9 78±4,5
+10 μg/ml - 87±1,2 86±1,4 84±1,5 81±2,3
+200 μg/ml + 37±6,8 24±6,6 17±7,9 11±5,6
+100 μg/ml + 83±2,3 80±4,5 77±5,6 73±4,4
+60 μg/ml + 85±1,2 84±1,7 82±2,1 79±3,5
+30 μg/ml + 88±1,3 84±2,5 82±3,7 81±4,6
+10 μg/ml + 87±1,1 88±1,4 84±3,2 82±3,1 * Cellules blastiques stimulées par PHA provenant de cinq
donneurs sains séronégatifs pour VIH choisis au hasard ** Pourcentage (moyenne ± écart-type) de cellules viables

Claims

REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique pour utilisation comme médicament contre le virus VIH, caractérisée en ce qu'elle comporte de la flavopéreirine comme unique principe actif sous une forme solide contenant par dose unitaire environ 250-500 mg de flavopéreirine ou d'un de ses sels ou autres dérivés pharmacologiquement acceptables.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est sous la forme de comprimés ou de gélules.
3. Composition selon l'une des revendications 1 ou
2, caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique à effet retard.
4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la flavopéreirine est extraite de l'écorce de Pao Pereira, Geissospermum vellosii-Baillon.
5. Utilisation d'une composition pharmaceutique contenant de la flavopéreirine comme unique principe actif pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement antiviral contre le virus VIH.
6. utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que la flavopéreirine est présente dans une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
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