WO1994017181A1 - Nucleotidase cyclique et procede de production - Google Patents

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WO1994017181A1
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Toshio Tanaka
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Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a novel A-like nucleotide degrading enzyme and a method for producing the same.
  • c AMP cyclic adenosine 3, ⁇ -monophosphate
  • cGMP cyclic guanosine 3 ', 5'-monophosphate
  • Cyclic nucleotide degrading enzymes cyclic nucleotide phosphodiesterases
  • cyclic nucleotide phosphodiesterases are known as enzymes that degrade cAMP and cGMP, and in vivo, cyclic nucleotides are degraded. It plays an important role in providing for metabolism of leotide. Therefore, drug-induced inhibition of cyclic nucleotide degrading enzymes has a significant effect on cyclic nucleotide metabolism, and ultimately, cell-organization.
  • cyclic nucleotide degrading enzyme inhibitors have been It is being developed as a drug.
  • the basis for this development was to analyze selective rutted rivers for cyclic nucleotide degrading enzymes and to elucidate screening methods and mechanisms of blockade. It is important.
  • An object of the present invention is to provide a novel cyclic nucleotide-decomposing enzyme for producing a new drug.
  • the present inventor has conducted intensive studies in view of the above objectives.)) An organ or tissue of an object has a new type different from a conventionally known isosome family. A cyclic nucleotide degrading enzyme was found. This inventor is the first to separate and purify the enzyme and clarify its properties.
  • the present invention is at least a cyclic nucleotide degrading enzyme having the following physicochemical properties (1) to m (hereinafter referred to as the enzyme of the present invention), and the present invention relates to animal organs and the like. Or the tissue is excised, and the homogenate is eluted by a linear gradient elution method using a Monoq (Mono-Q) HR ion exchange column.
  • the following physicochemical properties characterized by
  • a method for producing the enzyme of the present invention which has (1) to (7).
  • the Km value for cAMP is 0.1 ⁇ ⁇ . ⁇ , and the Km value for cG ⁇ is 1.78 ⁇ M.
  • Influence of inhibitor 50% inhibition by dicardipine is more than 300 ⁇ M, and depends on silosol and SK & F 924.
  • the 50% inhibition m degree by 50% inhibition is 300 M or more, and the 50% inhibition ⁇ degree by mouth replenishment and R202-174 is more than 300 jiU. Not activated by the power module. c Not activated by G ⁇ ⁇ .
  • FIG. 1 shows the relationship between ⁇ ⁇ and the enzyme activity of the enzyme of the present invention.
  • FIG. 2 shows the effect of temperature on the enzyme activity of the enzyme of the present invention.
  • FIG. 3 shows the effect of temperature on the enzyme activity of the enzyme of the present invention.
  • FIG. 4 shows the effect of metal ions on the enzyme activity of the enzyme of the present invention.
  • Fig. 5 shows Q — S e p h a r o s e F a s t
  • FIG. 6 shows the relationship between the fraction and the enzymatic activity when subjected to calmodulin, semaphore, and sufficiency.
  • Fig. 7 shows the relationship between the fraction and the enzyme activity when ⁇ 0 ⁇ 0—QHR10 / 10 is applied to the anion-exchange column.
  • the above-mentioned present invention is widely found, especially in the brain of mammals, and also inhibits cyclic nucleotide degrading enzymes such as myocardium, lung,, smooth muscle, and platelets. ⁇ Distributed in living animal organs or tissues.
  • the enzyme of the present invention is obtained by removing an organ or tissue of an animal, homogenizing the same, and ultracentrifuging the homogenate to obtain a glass wool. And the filtrate is subjected to ion exchange chromatography such as Q-Sepharose Fast Flow negative ion exchange chromatography. Purification is performed using a module such as a module-separator-finity column, and then a straight line using a monocure-HR ion exchange column. Separation and purification can be achieved by elution by a static concentration gradient elution method.
  • the feature of the production method of the present invention resides in the use of a Monochrome HR ion-exchange column, whereby the enzyme of the present invention can be found for the first time. Therefore, it does not depend on the method of other processes such as extraction of organs or tissues, homogenization, ultracentrifugation, and elution. this These steps can be performed by methods generally used in the art.
  • [8 - 3 H] c AMP or is - when the action of the enzyme of the present invention to a substrate to [8 3 H] c GMP, respectively [8 - 3 H] 5 ' - AMP (5 -adenosine monop osphate ) Or [8 — 3 H] 5'-GMP (5'-guanosine
  • PDEI cyclic nucleotide degrading enzymes
  • the enzymatic activity of the enzyme of the present invention was determined by changing the concentrations of the substrates cAMP and cGMP, and the Km value was determined by a double reciprocal plot.
  • the value of the Km value for cAMP 0.11 0M (0.109 ⁇ 0.008 ⁇ M)
  • the value of Km value for cGMP 1.
  • a value of 78 ⁇ M (1.78 ⁇ 0.042 2M) was shown, indicating that the specificity for cAMP was high.
  • the enzyme activity of the enzyme of the present invention was measured by changing the concentration of these inhibitors, and Existence The concentration of the inhibitor that inhibits 50% by -100% of the enzyme activity below- ⁇ .
  • the enzyme of the present invention is not inhibited by two-potency ludipine as compared to PDEI, and compared to PDE II, it has SKF9412 ⁇ It is not hindered by the boules. In addition, it can be said that it is not inhibited by rolipram or Ro20-1724 compared with PDEIV.
  • the present invention is not activated by calcium-modululin. Therefore, it is ffl different from PDE I activated by CAL.
  • the present element is different from PDHE which is not activated by cGMp but activated by cGMP.
  • Magnesium is the most effective gold ion for the enzyme of the present invention, and]! 3 ⁇ 4large effect was observed at a concentration of 5 mM or more (Fig. 4). ).
  • Mangan showed a relatively facilitating effect.
  • Co 2 + exhibited an inhibitory effect at a concentration of 100; M or higher, and had a promoting effect at lower concentrations.
  • EGTA 0.1 mM dithiothreitol, 20 ⁇ M mouthpiece, 10 g Zm 1 large liposome inhibitor 3 ⁇ 4- ⁇ , 1 ⁇ gZm Evening chin, 1 ⁇ ⁇ g Z m 1 Kimos Evening chin, 1 Mp APMSF ((p-ami di nopheny]
  • buffer B [30 mM sodium phosphate (pH 7.2), 0.1 mM dithiothreitol, 0.1 M p [APMSF]] to a Q-Sepharose Fast Flow (manufactured by Pharmacia) anion exchange column (1.6 x 20 cm) at a flow rate of 1.0 m1 / min. I put it.
  • the column was washed with 300 ml of buffer B.
  • Cytoplasmic cyclic nucleotide-degrading enzyme was used in a total amount of buffer solution B containing a sodium acetate concentration gradient (0.03 to 1.0 M) in a total amount of 420 m1. Eluted at a flow rate of / min.
  • the eluate is 1 flux We collected 7 m 1 per yon.
  • Figure 5 shows the elution pattern.
  • the enzyme activity was determined by the following two-step Atssay method.
  • [8 - 3 H] c AMP or the [8 - 3 H] a c GMP as a substrate when the action of the enzyme of the present invention which is rat cerebral cortex or al separation made in the examples, respectively [8 — 3 H] 5 '— AMP (5 -adenosine monophosphate or [8 — 3 H] 5'-GMP (5 '-guanos i ne
  • the enzymatic activity of the enzyme of the present invention was changed by changing the concentration of the substrate cAMP or cGMP from 0.06 M to 100 M in the same manner as in the method for measuring the enzymatic activity described in the Examples.
  • the Km value was determined by the double reciprocal plot.
  • the enzyme of the present invention has a Km value power of 0.1 .mu.m (0.109 ⁇ 0.008 ⁇ M) for cAMP and a 1.78% Km value for cGMP. M (1.7 8 Sat
  • Fig. 1 shows the IM1 relationship between ⁇ of 5 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM magnesium chloride (MgC ⁇ 2 ) and the enzyme activity of the present enzyme. showed that. Human activity was observed at ⁇ ⁇ 1 ⁇ .
  • the enzyme activity of the enzyme of the present invention was determined by changing the concentration of various inhibitors, and the concentration of the inhibitor that inhibited the enzyme activity by 50% assuming that the enzyme activity in the absence of the inhibitor was 100% was determined. More specifically, in the method for measuring enzyme activity described in the examples, when reacting the enzyme of the present invention, various concentrations of inhibitors were further added to the reaction solution to measure the enzyme activity.
  • the 50% inhibitory concentration of 50% inhibition by dicardipine is more than 300 ⁇ M, and the 50% inhibition concentration by Syros evening and SK & F 940 is more than 300 ⁇ M.
  • Roli plum and R 0 2 0 — 1 The 50% Hi harm according to 724 is more than 300M.
  • 50% inhibitory concentration by IBMX a non-selective inhibitor
  • the inhibition constant was determined by the concentration of cAMP and the inhibitory papaverine, which were the bases, to increase the enzyme activity, and determined by the Dickson plot.
  • bovine brain power 0.4 ⁇ g Zm1 power module produced in parallel and 0.2 mM chloride water potassium chloride were added, and their effects on the enzyme of the present invention were analyzed.
  • Activator of PDEI Significant difference in the enzymatic activity of the enzyme of the present invention between the presence of calcium-calmodulin and the presence of EGTA (2 mM), which is a canoleate chelate. was not recognized.
  • the enzyme activity of the enzyme of the present invention was measured by changing the concentration of 5 mM MgC12 in the reaction solution. As a result, 1 M (1 X 1 0 "6) M g C 1 2 or et present invention the enzyme is activated, 5 m M
  • a novel cyclic nucleotide degrading enzyme, I was released by the present inventors.
  • Several enzyme inhibitors are being developed as new medicines.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a screening method for analyzing the selective inhibitory effect on a ⁇ -nucleotide-degrading enzyme, which is the basis for the development of a pharmaceutical, and the elucidation of the mechanism of action are disclosed. It is now possible.

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Description

明 細 環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素及びその製造 技術分野
本発明は、 新お Aな ^状 ヌ ク レ オチ ド分解酵 ¾及びその 製造法に する。
背 ¾技術
c A M P ( cycl ic adenosine 3 , ΰ -monophosphate) や c G M P ( cycl i c guanosine 3' , 5' -monophosphate) が、 細胞内情報伝達物質 と して発見さ れ、 稗々 の細胞機 能調節にお ける その重要性が明 らかに さ れて き た。 環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素 （環状 ヌ ク レ オチ ドホスホ ジエス テラ 一ゼ） は、 c A M P や c G M P を分解する酵素 と し て知 られてお り 、 生体内にあ っ ては環状 ヌ ク レ オチ ド代 謝に間与する重要な役割を果たす も のであ る。 従っ て、 環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素の薬物に よ る阻害は、 環状 ヌ ク レ オチ ド代謝に重大な影響を与え、 最終的には細胞機 台 Π匕
じを変化さ せる。
環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素の了 イ ソザィ 厶 フ ァ リ ー は現在 5 タ イ プ （ I 〜 V ) が報告さ れ、 それぞれのア イ ソザィ ム フ ァ ミ リ ー には さ ら にサブタ イ プが存在する こ とが報告さ れている [田中 ら， 日 薬理誌， 第 1 0 0 巻， 第 2 4 9 〜 2 5 8 ( 1 9 9 2 年） 参照] 。
近年、 環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素阻害薬が、 新 しい医 薬品 と して開発さ れつつあ る。 その 発の ¾礎 と して、 環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素に対する選択的阯 作川を解 析する こ とか、 阻 剂のス ク リ ーニ ン グ法や作川機序の 解明に si要であ る。
本発明の Π的は、 新 しい医薬品を 発す る ための新お 環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵 を提供する こ と にあ る。
発 '!ilの開示
本発明者は、 上記 Ι的に鑑みて鋭意検討 した結 ¾、 ) 物の臓器 ま たは組織よ り 従来知 られている ア イ ソザィ ム フ ァ ミ リ ー と は異な る タ イ プの新規環状 ヌ ク レ オチ ド分 解酵素を見い出 した。 該酵素を分離 · 精製 しその性質を らかに したのは、 本発明者が初めてであ る。
本発明は少な く と も下記の理化学的性質（ 1 ) 〜 m を 有する環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素 （以下、 本発明酵素 と 称する。 ） であ り 、 ま た本発明は動物の臓器 ま たは組織 を摘出 し、 こ のホモ ジ ネ ー ト をモ ノ キ ュ ー （ M o n o — Q ) H R イ オ ン交換カ ラ ムを用いた直線的濃度勾配溶出 法に よ り 溶出する こ と を特徴 とする下記の理化学的性質
(1) 〜（7) を有する本発明酵素の製造法であ る。
( 1 ) 作用 ； c A M P に作 ffl し 5 ' — A M Pを生成する。 c G M P に作用 し 5 ' — G M P を生成する。
(2) 基質特異性 ； c A M P に対する K m値は 0 . 1 \ μ. Μ、 c G Μ Ρ に対する K m値は 1 . 7 8 〃 Mを示す。
(3) 至適 p H ； c A M P加水分解の至適 p Hは 1 0 であ (4) 熱安定性 ； 3 7 °Cにお け る酵素 ί,Γ,性の初速度は 3 0 °Cの畤よ り も速い。 6 0 °Cで 1 0 分 li の加温に よ り 酵素 -性は 失す る o
(5) 阻害剂の影響 ； 二カ ル ジ ピ ン に よ る 5 0 %阻害濃疫 は 3 0 0 〃 M以上、 シ ロ ス 夕 ゾ一 ル 及び S K & F 9 4 1 2 ϋ に よ る 5 0 %阻害 m度は 3 0 0 M以上、 口 リ プラ 厶及び R 0 2 0 — 1 7 2 4 に よ る 5 0 %阻害 β度は 3 0 0 ji U以上であ る。 力 ル シゥ 厶 一 力 ルモデュ リ ン に よ り 活性化さ れない。 c G Μ Ρ に よ り 活性化さ れない。
(6) 金 ¾ イ オ ン の影響 ； マ グネ シウ ムは最 も効架的な醉 素活性を示す金属陽ィ オ ンであ る。
(7) 分子量 ; 2 9 8 0 0 0 ± 8 0 0 0 (ス—ノ、。一 ロ ース 1 2 H R 1 0 / 3 0 ゲル濾過法） 。
図面の簡^な説叨
第 1 図は、 ρ Η と本発明酵素の酵素活性との関係を示 示す。
第 2 図は 本発明酵素の酵素活性に対する温度の影響 を示す。
第 3 図は 本発明酵素の酵素活性に対する温度の影響 を示す。
第 4 図は 本発明酵素の酵素活性に対する金属 イ オ ン の影響を示す。
第 5 図は、 Q — S e p h a r o s e F a s t
F 1 o w陰イ オ ン交換カ ラ ムに力、けた と き の フ ラ ク シ ョ ン と酵素活性との関係を示す。 , 6 図は、 カ ル モ ジ ュ リ ン 一 セ ヮ ァ 口 一 ス ァ フ ィ ニ テ ィ 一 力 ラ 厶にかけた と き の フ ラ ク シ ョ ン と酵尜活性 と の
1½1係を示す。
第 7 図は、 Μ 0 η 0 — Q H R 1 0 / 1 0 陰 イ オ ン交 換カ ラ ム に力、けた と き の フ ラ ク シ ョ ン と酵素活性 との 係を示す。
発明を実施す る ための ¾ の形態
本発 に よれば、 上記の本発 Iリ] ^素は、 特にほ乳励物 の脳に広 く 見いださ れ、 その他心筋、 肺、 、 平滑筋、 血小板な どの環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素を ^生する動物 の臓器ま たは組織に分布する。
本発明酵素は、 動物の臓器 ま たは組織を摘出 し、 こ れ をホモ ジナ イ ズ し、 こ のホモ ジ ネ ー ト を超遠心 して得 ら れた上淸をガラ ス ウ ールにて濾過 し、 その濾液を例えば Q - S e p h a r o s e F a s t F l o w陰イ オ ン 交換カ ラ ムな どを川 いた イ オ ン交換カ ラ ム ク ロマ ト グ'ラ フ ィ 一、 並びにカ 儿'モ ジ ュ リ ン 一 セ フ ァ ロ 一スァ フ ィ ニ テ ィ 一 カ ラ ムな どを用いて精製 し、 そ して更にモ ノ キ ュ - H R ィ ォ ン交換力 ラ ムを用いた直線的濃度勾配溶出法 に よ り 溶出する こ と に よ っ て分離 · 精製する こ とができ る。 本発明の製造法の特徴はモ ノ キ ュ ー H R イ オ ン交換 カ ラ ムを用 いた点にあ り 、 こ れに よ つ て初めて本発明酵 素が見いださ れる も のであ る。 従っ て、 その他の、 臓器 ま たは組織の摘出、 ホモ ジナイ ズ、 超遠心、 溶出な どの 工程の方法に よ っ て何 ら左右さ れる も のではない。 こ れ らのェ程は当分野で通常 Π1い られる方法でよ い。
本発明酵素の活性は、 以下に示す実施例に詳細に説 »)J する よ う に 2 段階ア ツ セ ィ （ M a s u o k a ら，
Bi ochem. Blophys. Res. Commun. ， 第 1 6 9 卷， ¾'ϊ 3 1 5 〜 3 2 2 ϊί , 1 9 9 0 ) で测定 した。 実験に よ っ ては c A Μ Ρ加水分解を c G M P ( 1 0 〃 M ) 存在下ま たは E G T A [ e t h y 1 e II e g 1 y c 01 b i s ( 2 - a m i n o e t h y 1 e t h e r ) t e t raace t i c acid] に代えて 0 . 4 g / m 1 力 儿 モ ジ ュ リ ン と 0 . 2 m M C a C 1 2 存在下で则定 した。
次に、 本発明酵素の理化学的特性について述べる。 (1) 作用 ；
[ 8 — 3 H ] c A M P ま たは [ 8 — 3H ] c G M P を 基質 と して本発明酵素を作用 さ せる と、 それぞれ [ 8 — 3 H ] 5 ' - A M P ( 5 -adenosine monop osphate) ま たは [ 8 — 3H ] 5 ' - G M P ( 5' -guanosine
monophosphate) を生成 した。 こ の生成物に対 して 5 ' ー ヌ ク レ オチ ダ一ゼを作用 させる と、 それぞれ [ 8 — 3 H ] アデノ シ ン ま たは [ 8 — 3 H ] グア ノ シ ンを生成 した。
環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素のア イ ソザィ ム フ ァ ミ リ ー と して、 5 つの タ イ プが知 られている （以後、 こ れ ら 5 つの タ イ プをそれぞれ P D E I ， P D E E，
P D E I , P D E IV, P D E V とい う ） 。 こ れ らの う ち P D E Wは c G M P を加水分解 しに く く 、 ま た P D E V は c A M P を加水分解 しない こ とが知 られている。 従つ て、 本発明 素は P D E IV及び P D E Vのいずれ と も與 な ^ と 曰 ん O
(2) 基 ¾特與性 ；
基質である c A M Pや c G M Pの濃度を変化させて本 発明酵素の酵尜活性を则定 し、 二重逆数プロ ッ ト によ り K m値を決定 した。 その結 - 、 本発叨 素は、 c A M P に対する K m値力、 0 . 1 1 〃 M ( 0 . 1 0 9 ± 0 . 0 0 8 〃 M ) 、 c G M Pに対する K m値力、 1 . 7 8 〃 M ( 1 . 7 8 ± 0 . 0 4 2 〃 M) を示 し、 c A M Pに対す る特異性が高いこ とが明 らかにな った。
(3) 至適 p H ；
第 1 図に、 5 m M塩化マ グネ シウム （ M g C 1 2 ) を 含む 5 0 m M 卜 リ ス塩酸緩衝液を いた時の p Hと本発 明酵素の酵素活性との閱係を示 した。 最大活性は p H 1 0 で観察された。
(4) 熱安定性 ；
本発明酵素の酵素活性に対する温度の影響を、 4 V、 2 5 °C、 3 0 °C及び 3 7 °Cで検討 した。 第 2図は 3 7 °C における初速度が 3 0 °C以下の時よ り も速いこ とを示 し ている。 6 0 °Cや 9 0 °Cでの 1 0分問の加温によ り本発 明酵素の酵素活性は明 らかに消失 した （第 3 図） 。
(5) 阻害剤の影響 ；
P D E I ， HIある いは IVの活性を阻害する こ とが知 ら れている種々 の阻害剤を用い、 これらの阻害剤の濃度を 変化させて本発明酵素の酵素活性を測定し、 阻害剂非存 -{.下の酵素活性を 1 0 0 % と して 5 0 %阻 ^す る ^害剂 の濃度を決定 した。
二 カ ル ジ ピ ン （ P D E I の l?U - 剂 ） に よ る 5 0 % I'll 濃度は 3 0 0 〃 M以上、 シ ロ ス 夕 ゾー ル及び S K & F 9 4 1 2 0 [ 5- ( - a c e t a in i d 0 p h e n y ] ) p y r a z i 11 - 1 H - 0 II e ] ( P D E 1の阯辔剂） に よ る 5 () %阻害 度は 3 0 0 〃 M以上、 口 リ ブラ 厶及び R 0 2 0 — 1 7 2 4 [ ·! - ( 3 - buthox y - 4- ni ethox y benzyl) - 2 - imidazol idi none]
( P D E Wの阻害剂） に よ る 5 0 % m害濃 ^は 3 0 0 M以上であ る。 非選択的阻害剂であ る I B M X [ 3-isob utyl-卜 methyl xanthine ] に よ る 5 0 %阻害濃度は 2 6 . 5 〃 M ( 2 6 . 5 ± 2 . 5 〃 M ) であ る。 非選択的阻害 剂であ るパパベ リ ン に よ る 阻害定数 （ K i 値） は 0 . 0 3 6 Mであ る。 こ こ で、 阻害定数は芘 ^であ る c A M P及び阻害剂パパベ リ ン の濃度を変化さ せて酵素活性を 测定 し、 デ ィ ク ソ ン プロ ッ 卜 に よ り 決定 した。
以上か ら、 本発明酵素は、 P D E I に比べて二力 ル ジ ピ ンに よ っ ては阻害さ れない も のであ り 、 P D E IIに比 ベて S K F 9 4 1 2 0 ゃシ ロ ス 夕 ブールに よ っ ては阻害 さ れない も のであ る。 ま た P D E IVに比べて ロ リ プラ ム や R o 2 0 — 1 7 2 4 では阻害さ れない もの と言え る。
ま た、 牛脳か ら単一に精製 した 0 . 4 〃 g / m 1 カ ル モデュ リ ン と 0 . 2 m M塩化カ ル シウ ムを加え、 本発叨 酵素に対する そ の影響を解析 した。 P D E I の活性化因 子力 ル シ ゥ 厶 一 カ 儿 モデュ リ ン存在下 と、 カ ル シウ ムキ レ ー 卜剂であ る E G T A ( 2 m Μ ) 存 :下で本発 ιリ J醉 - の酵素活性に冇 な差は認め らなか っ た。
本発叨 m素は、 カ ル シ ユ ウ 厶 ― 力 ルモデ ュ リ ン に よ り 活性化さ れない。 従つ て、 カ ル シ ユ ウ ム ー カ ル乇デュ リ ン に よ っ て活性化さ れる P D E I と は ffl違する。
ま た本発 素は、 c G M p に よ っ ては活性化さ れず c G M P に よ っ て活性化さ れる P D E H と は相違する。
( 6 ) 金] ¾ イ オ ン の影響 ；
マ グネ シ ウ ムは本発明酵素に と つ て最 も効果的な金屈 陽イ オ ンであ り 、 ]!¾大効 ¾は 5 m M以上の濃度で観察さ れた （第 4 図） 。 マ ン ガ ン は比較的促進効果を示 した。 C o 2 +は 1 0 0 ; M以上の濃度では阻害作用を、 それ以 下の濃度では促進作用を示 した。 Z n 2 +、 C u 2 +、
C a 2 +、 N i 2 +及び B a 2 +は酵素反応に対する補助因子 の可能性は無かっ た。
(7) 分子量 ；
0 . 0 5 M リ ン酸緩衝液 （ p H 7 . 1 ) , 0 . 1 5 M 塩化ナ ト リ ウ ムで平衡化 したスーノヽ。ロ ース 1 2 H R 1 0 Z 3 0 (フ ア ルマ シア社製） （カ ラ ムサイ ズ l O m m x 3 0 O m m ) で、 ゲル濾過 ffl分子量测定用マ 一 力 一を使 用 し、 本発明酵素の溶出位置か ら分子量を測定 した結 ¾ 2 9 8 0 0 0 ± 8 0 0 0 であ っ た。
以下、 本発明を実施例及び試験例に よ り 更に具体的に 説明する。
実施例 ラ ッ ト大脳皮質か らの環状 ヌ ク レ オチ ド分解 m素の 離
( 1 ) ラ ッ ト 脳よ り 1 ϋ g の大 I 皮 を取 り 出 し、 氷 冷 したホ乇 ジ ェ ナ ィ ズ川緩衝液 A [ 5 0 M 卜 リ ス塩酷 ( p H 7 . 5 ) 、 0 . 2 5 M シ ョ 枥、 0 . 1 m M
E G T A、 0 . 1 m M ジチオス レ ィ ト ー ル、 2 0 〃 M 口 ィ ぺプチ ン 、 1 0 g Z m 1 大 ΐ 卜 リ プシ ン 阻 ¾-剂、 1 ϋ 〃 g Z m 】 ぺプス 夕 チ ン 、 1 ϋ 〃 g Z m 1 キモ ス 夕 チ ン 、 1 M p A P M S F ( ( p-ami d i nopheny ]
methanesulfonyl f luoride hydrochloride) ] で数回洗 つ た。 組織は 8 〜 1 0 倍量の緩衝液 A と と も にポ ッ タ ー S ホモ ジナイ ザーを用いて緩やかにホモ ジナイ ズ した。 大脳皮質ホ モ ジ ェ ネ ー ト は次に 1 0 0 ， 0 0 0 X g で 6 0 分間遠心 した。 得 られた細胞質環状 ヌ ク レ オチ ド分解 酵素を含む上清は グ ラ ス ウ ー ルで濾過 し、 次いで 0 . 2 0 〃 mの酢酸セ ル 口 一ス フ イ ノレ タ ーユニ ッ ト （束洋濾紙 社製） を通 した。 濾過 した上淸は、 あ らか じめ緩衝液 B [ 3 0 m M齚酸ナ ト リ ウ ム （ p H 7 . 2 ) 、 0 . 1 m M ジチオス レ イ ト 一ル、 1 〃 M p A P M S F ] で平衡化 し た Q — S e p h a r o s e F a s t F l o w ( フ ァ ルマ シ ア社製） 陰イ オ ン交換カ ラ ム （ 1 . 6 X 2 0 c m ) に流速 1 . 0 m 1 / m i n でのせた。 こ の カ ラ ム は 3 0 0 m 1 の緩衝液 B で洗浄 した。 細胞質環状 ヌ ク レ オチ ド 分解酵素は、 酢酸ナ ト リ ウ ムの濃度勾配 ( 0 . 0 3 〜 1 . 0 M ) を含む緩衝液 B総量 4 2 0 m 1 を用い、 1 . 0 m 1 /m i n の流速で溶出 させた。 溶出液は 1 フ ラ ク シ ヨ ン当 り 7 m 1 集めた。 第 5 図にその溶出パタ ー ンを示 した。
( 2 ) 次いで、 Q— S e p h a r 0 s e F a s t F 1 o wカ ラ ムで分離 した本発明酵素を含むフ ラ ク シ ョ ンを さ らに精製する ために、 上記の フ ラ ク シ ョ ン 1 0 〜 1 7番 0を集め濃縮 し、 過剰量の C a 2 +存在下 （ 2 m M；) で カ ノレモ ジ ュ リ ン ー セ フ ァ ロ 一 ス ァ フ ィ ニテ ィ 一 カ ラ ム にかけた。 本発 "J]酵素活性 も 含 ま れる カ ラ ム に結合 しな いカ ルモ ジ ュ リ ン非感受性タ ンノ ク 質は、 2 7 m 1 の平 衡化緩衝液 [緩衝液 C ： 2 0 m M ト リ ス塩酸 （ p H 7. 5 ) 、 0 . 1 5 N a C l 、 1 m M M g C l 2 、 2 m M C a C l 2 、 0 . 1 m M E G T A、 I m Mジチ オス レ ィ ト ール、 1 〃 M p A P M S F ] でカ ラ ム よ り 溶 出 させた。 図 6 にその溶出パタ ー ンを示 した。
( 3 ) 溶出液 （ フ ラ ク シ ョ ン 1 〜 6 ) は緩衝液 D [ 5 O m M 卜 リ ス塩酸 （ p H 7. 5 ) 、 0 . I m M
E G T A、 0 . 1 m Mジチオス レ イ ト 一ル、
1 / M p A P M S F ] でー晚透析 し、 あ らか じめ緩衝液 Dで平衡化 した M 0 n 0 — Q H R 1 0 / 1 0 陰 イ オ ン 交換カ ラ ム （ フ ア ルマ シア社製） に流速 0 . 5 m 1 Z m i nでのせた。 こ のカ ラ ムは 8 0 m 1 の緩衝液 Dで洗 浄 した。 本発明酵素は塩化ナ ト リ ウ ムの濃度勾配 （ （） 〜 0 . 1 5 M) を含む総量 5 0 m l の緩衝液 Dを用い、 0 . 1 5 m 1 /m i nの流速で溶出 させた。 溶出液は 1 フ ラ ク シ ヨ ン当 り 2 m 1 集めた。 第 7 図にその溶出パタ ー ンを示 した。 本発明 m素の活 性は フ ラ ク シ ョ ン 1 9 及び 2 0 で 大値を示 した。
上記 した本発明酵素の iii離精製の際には、 その酵素活 性は以下に示す 2 段階ア ツ セ ィ 法に よ っ て测定 した。
m素活性の则定法
反応液 （総量 0 . 5 m l ) は、 5 ϋ ιη Μ T r i s - H C 1 ( H 8 . 0 ) , 5 m M M g C 1 2 , 2 m M E G T A， 0 . 1 m g / m 1 牛血 'ί· Ύ ルブ ミ ン存在下に 分離 した本発明酵素を加え、 さ ら に [ 8 — 3 Η ]
c A Μ Ρ を加えた後、 3 0 でで反応させる。 1 0 分後に 1 0 0 °Cの ヒ ー ト スに入れ 5 分問で反応を停止させる , すなわち、 1 0 0 て加熱に よ り 、 本発明酵素を失活さ せ る。 次に、 こ の反応液の入 っ た試験管を氷冷する。 次に
5 0 〃 g の蛇 ( s n a k e v e n o m ； こ れには 5 ' — ヌ ク レ オチ ダーゼが含ま れている ） を加え、 3 0 °Cで 1 0 分問反応さ せる。 その結 、 [ 8 — 3 H ] c A M Pが本発明酵素で [ 8 — 3 H ] 5 ' 一 A M P に分 解さ れ、 さ ら に蛇毒の 5 ' — ヌ ク レ オチ ダ一ゼで [ 8 — 3 H ] アデ ノ シ ン に分解さ れる。 そ こ で、 こ の反応液に 4 m 1 の水を加えた後、 陽イ オ ン交換樹脂カ ラ ム
( A G 5 0 W X 4 , オ ラ ド社製） を充埙 した カ ラ ムに吸着さ せ、 充分洗浄後、 反応生成物であ る [ 8 -
3 H ] アデノ シ ンを 1 . 5 m 3 N · N H 〇 Hで溶出す る。 こ の溶出 さ れた [ 8 — 3 H ] アデノ シ ンの放射能活 性を则定する こ と に よ り 、 本発明酵素の活性を测定する < 試験例 1 Ll
[ 8 — 3 H ] c A M P ま たは [ 8 — 3 H ] c G M P を 基質 と して、 実施例において ラ ッ ト 大脳皮質か ら分離 製さ れた本発明酵素を作用 さ せる と、 それぞれ [ 8 — 3 H ] 5 ' — A M P ( 5 -adenosine monophosphate ま たは [ 8 — 3 H ] 5 ' - G M P ( 5' -guanos i ne
monophosphate) を生成 した。 こ の生成物に対 して 5 ' — ヌ ク レ オチ ダーゼを作川 さ せる と、 それぞれ [ 8 — 3 H ] アデノ シ ン ま たは [ 8 — 3 H ] グア ノ シ ン を生成 した。 こ れ ら は、 陽イ オ ン交換樹脂カ ラ ム （ A G 5 0 W— X 4 ， バイ オ ラ ド社製） にて分離 し、 放射能活性を m定 した。 こ れ らの方法は実施例において説明 した酵素 活性の測定法 と 同様に して実施 した。
試験例 2 基質特異性
基質であ る c A M P や c G M P の濃度を 0 . 0 6 〃 M か ら 1 0 0 Mの間で変化させて本発明酵素の酵素活性 を、 実施例において説明 した酵素活性の測定法 と同様の 方法で測定 し、 二重逆数プロ ッ ト に よ り K m値を決定 し た。 その結果、 本発明酵素は、 c A M P に対する K m値 力 0 . \ I u M ( 0 . 1 0 9 ± 0 . 0 0 8 〃 M ) 、 c G M P に対する K m値力く 1 . 7 8 〃 M ( 1 . 7 8 土
0 . 0 4 2 / M ) を示 し、 c A M P に対する特異性が高 い こ とが明 らかにな つ た。
試験例 3 至適 P H
5 0 m M 卜 リ ス塩酸緩衝液の p Hを変化させた反応液 に、 一定;！の本発明酵素と基 ( c A M P ) を加え、 ¾ 施例において説明 した酵素活性の则定 と同様の方法で II？素活性を则定した。
第 1 図に、 5 m M塩化マ グネ シウ ム （ M g C 〗 2 ) を 含む 5 ϋ m M ト リ ス塩酸緩衝液を川いた の ρ Η と本発 明酵素の酵素活性との IM1係を示 した。 ¾人活性は ρ Η 1 ϋ で観察された。
試験例 4 熱安定性
実施例において説明 した酵素活性の测定法と同様の方 法によ り、 本発明酵素の酵素活性に対する温度の影響を 4 °C、 2 5 °C、 3 0 °C及び 3 7 °Cで検討 した。 第 2 図は 3 7 °Cにおける初速度が 3 0 °C以下の時よ り も速いこ と を示 している。 6 0 °Cや 9 0 °Cでの 1 0 分問の加温によ り、 本発明酵素の酵素活性は明 らかに消失 した （第 3 図） 。
試験例 5 阻害剂の影響
種々 の阻害剂の濃度を変化させて本発明酵素の酵素活 性を测定し、 阻害剂非存在下の酵素活性を 1 0 0 % と し て 5 0 %阻害する阻害剤の濃度を決定 した。 よ り具体的 には、 実施例で説明 した酵素活性の测定法において、 本 発明酵素を反応させる時に、 その反応液に更に種々 の濃 度の阻害剤を加えて、 酵素活性を测定 した。
二カ ルジ ピ ンによ る 5 0 %阻害濃度は 3 0 0 〃 M以上、 シロス夕 ブール及び S K & F 9 4 1 2 0 によ る 5 0 %阻 害濃度は 3 0 0 〃 M以上、 ロ リ プラ ム及び R 0 2 0 — 1 7 2 4 に よ る 5 0 % Hi害 度は 3 0 0 M以上であ る。 非選択的阻害剂であ る I B M X に よ る 5 0 %阻害濃度は
2 6 . 5 M ( 2 6 . 5 ± 2 . 5 〃 M ) であ る。 非選択 的阻害剂であ るパパベ リ ン に よ る 阻害定数 （ K i 値） は
0 . 0 3 6 Mであ る。 こ こ で、 阻害定数は基 であ る c A M p 及び阻害剂パパベ リ ンの濃度を変化さ せて酵 活性を则 ^ し、 デ ィ ク ソ ン プロ ッ ト に よ り 決定 した。
ま た、 牛脳力、 ら丄 一に 製 した ϋ . 4 〃 g Z m 1 力 ル モデュ リ ン と 0 . 2 m M塩化力 ル シゥ 厶を加え、 本発明 酵素に対する その影響を解析 した。 P D E I の活性化因 子力 ル シゥ 厶 一 カ ルモデュ リ ン存在下 と、 カ ノレ シゥ ムキ レ ー ト剂であ る E G T A ( 2 m M ) 存在下で本発明酵素 の酵素活性に冇意な差は認め らなかつ た。
試験例 6 金厲イ オ ンの影響
実施例で説明 した酵素活性の測定法において、 反応液 の 5 m M M g C 1 2 の濃度を変化さ せて、 本発明酵素 の酵素活性を测定 した。 その結果、 1 M ( 1 X 1 0 " 6 ) M g C 1 2 か ら本発明酵素が活性化 し、 5 m M
( 5 X 1 0 — 3 ) で最大活性とな っ た （第 4 図） 。
マ ンガ ン は比較的促進効果を示 した。 C 0 2 +は 1 0 0 M以上の濃度では阻害作用を、 それ以下の濃度では促 進作 fflを示 した。 Z n 2 +、 C υ 2 +、 C a 2 +、 N i 2 +及び B a 2 +は酵素反応に対する補助因子の可能性は無か つ た。 試験例 7 分子量
0 . 0 5 M リ ン酸緩衝液 （ p H 7 . 1 ) , 0 . 1 5 M 塩化十 ト リ ウ ムで平衡化 したスーパロ ー ス 1 2 H R 1 0 / 3 0 ( フ ア ルマ シア社製） （ カ ラ ムサ イ ズ 1 0 m m >': 3 0 O m m ) で、 ゲル濾過川分子 ut測定川マ ー カ ーを使 用 し、 本発明酵素の溶出位置か ら分子量を测定 した結 ¾ 2 9 8 0 0 ϋ ± 8 0 0 0 であ っ た。
産業上の利川可能性
本発 Iリ jに よ り 新規な環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素が I、 ださ れた。 い く つかの酵素阻害薬が、 新 しい医薬品 と し て開発さ れつつあ る。 本発明に よ り 、 医薬品の開発及び その基礎 と な る ^状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素に対する選択 的阻害作用の解析のためのス ク リ 一ニ ン グ法や作用機序 の解叨が可能にな つ た。

Claims

請 求 の 範 閉
1. 少な く と も下記の现化学的性 ' を trする環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素
( 1 ) 作用 ； c A M P に作用 し 5 ' — A M P を生成する c G M P に作川 し 5 ' — G M P を生成する。
(2) 基質特異性 ； c A M P に対する K in tiは 0 . 1 1 H M , c G M P に対する K m値は 1 . 7 8 〃 Mを 示す。
(3) 至適 p H ； c A M P加水分解の至適 p Hは 1 0 で め o
(4) 熱安定性 ； 3 7 °Cにお ける酵素活性の初速度は 3 0 °Cの時よ り も速い。 6 0 °Cで 1 0 分問の加温に よ り酵素活性は消失する。
(5) 阻害剤の影響 ； 二カ ルジ ピ ン に よ る 5 0 %阻害濃 度は 3 0 0 〃 M以上、 シロ ス 夕 ゾール及び S K & F 9 4 1 2 0 に よ る 5 0 %阻害濃度は 3 0 0 〃 M 以上、 ロ リ プラ ム及び R o 2 0 — 1 7 2 4 に よ る 5 0 %阻害濃度は 3 0 0 〃 M以上であ る。 カ ル シ ゥ ム ー カ ルモデュ リ ン に よ り 活性化さ れない。 c G M P に よ り 活性化さ れない。
(6) 金属イ オ ンの影響 ； マ グネ シウ ムは最 も効果的な 酵素活性を示す金属陽イ オ ンであ る。
(7) 分子量 ； 2 9 8 0 0 0 ± 8 0 0 0 (ス一ノ、。— 口 一 ス 1 2 H R 1 0 / 3 0 ゲル濾過法） 。
2. 動物の臓器ま たは組織を摘出 し、 こ のホモ ジ ネ ー 卜 をモ ノ キ ュ ー H R イ オ ン交換カ ラ ムを用いた直線的 度勾配溶出法に よ り 溶出する こ と を特徴 とする請求の範 囲第 1 項記載の環状 ヌ ク レ オチ ド分解酵素の製造法。
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