WO1995007101A2 - Salmonella-lebendimpfstoff - Google Patents

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WO1995007101A2
WO1995007101A2 PCT/EP1994/002858 EP9402858W WO9507101A2 WO 1995007101 A2 WO1995007101 A2 WO 1995007101A2 EP 9402858 W EP9402858 W EP 9402858W WO 9507101 A2 WO9507101 A2 WO 9507101A2
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salmonella
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Jörg BEER
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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a special use of a live Salmonella vaccine, to new live Salmonella vaccines not yet used, to a method for producing such vaccines and to suitable Salmonella vaccine strains.
  • ERS ⁇ ZBL ⁇ (RULE 26) adorned animal on humans can be reduced on the one hand by conventional veterinary measures to interrupt the chain of infection. Furthermore, careful observance of the kitchen hygiene regulations when processing contaminated animal foods can prevent transmission to humans. However, the last-mentioned regulations are not always sufficiently taken into account in food storage and preparation. It is therefore necessary to rule out from the outset that infected animals are processed. This can be achieved, for example, by vaccinating the animal population against Salmonalla infections.
  • Suitable live Salmonalla vaccines must meet a number of different conditions:
  • the virulence of the vaccine strains used for the production of the vaccines must be adjusted so that on the one hand an inapparent infection and on the other hand sufficient persistence of the vaccine strains in the host tissue is guaranteed as a prerequisite for a high immunogenicity.
  • the vaccine strains cannot be permanently excreted alive or can only survive in the outside world for a short time.
  • ER $ ARZBL ⁇ rT (REGEl 26)
  • the above three conditions that a live vaccine must meet will be discussed in detail below.
  • the production of a suitable live Salmonella vaccine is based on a reduction in the virulence (attenuation) of the pathogenic Salmonella while at the same time maintaining their antigen structures and thus the immunogenic effect in the host.
  • One possibility is, for example, to use deletion mutants, for example pur or aro-auxotrophic clones, as inoculation strains.
  • the degree of attenuation of these vaccine strains depends on the lack of metabolites in vivo, which may make it difficult to adapt the host to be immunized.
  • Stwd mutation Another possibility of attenuation is to use vaccine strains whose virulence reduction is due to a metabolic drift mutation (hereinafter referred to as the Stwd mutation or marker).
  • the term "metabolic drift” encompasses all essential enzymes or functionally important cell compartments, such as e.g. Ribosome proteins, gyrase, RNA polymerase, permeases, whereby as a result of these mutations the functions of translation, DNA replication, transcription or permeation are more or less disturbed.
  • Stwd mutants continue to be resistant to special antibiotics or other substances (noxae). Stwd mutants can be identified as chromosomal in the laboratory in a particularly simple manner
  • EP 0 263 528 describes e.g. Stwd mutants with resistance to nalidixic acid (Nal), streptomycin (Sm) or rifampicin (Rif) have become known.
  • Nal nalidixic acid
  • Sm streptomycin
  • Rif rifampicin
  • Another condition is that the attenuated vaccine strains obtained by mutation do not mutate back to the virulent wild strain.
  • the stability required can be achieved on the one hand by using only those vaccination strains in which no reversion is detectable in vitro or whose reversion frequencies are ⁇ 10 * 7.
  • Another possibility is to use such vaccination strains that have several mutations independently of one another which reduce the virulence, in which case the likelihood of a backmutation is virtually excluded.
  • Vaccine strain mutants that meet such requirements have become known, for example, from DD-WP 218 836, DD-WP 231 491, DD-WP 253 182, DD-WP 253 183, DD-WP 253 184 and EP 0 263 528.
  • anti-epidemic marker in the broader sense denotes outer envelope mutations which, inter alia, bring about a functional change in the permeability barrier of the outer membrane.
  • the currently known anti-epidemic markers are divided into three groups depending on the change which they bring about in the outer membrane of the vaccine strain.
  • the first group includes the so-called anti-epidemic Hst markers.
  • the incorporation of an Hst marker means that a vaccine strain becomes highly sensitive to bile, anion detergents, macrolide antibiotics and other noxious substances. Because of the high sensitivity to bile, there is a reduced excretion with faeces due to the inactivation of the vaccine strain already occurring in the intestinal lumen. Possibly excreted live vaccine bacteria have in the outside world as a result of the lack of a permeability barrier in the outer - 6 -
  • the Rbt marker can be obtained from the Hst marker by mutation. Like the Hst marker, it gives the vaccine strain an anti-epidemic potency. In contrast to the Hst marker, the vaccine strain provided with an Rbt marker is tolerant of bile and can therefore be administered orally without reducing the virulence which limits the vaccine effect. The same applies to the other group, the so-called Rtt markers (reversion to tenside tolerance).
  • the Rtt marker can be obtained from the Rbt marker by mutation.
  • the vaccine strain provided with the Rtt marker is tolerant of surfactants and at the same time has sufficient anti-epidemic potency due to the remaining high sensitivity to macrolides and other noxae.
  • the Rtt-Marker strain can also be administered orally without any problems.
  • solution to the respective host can e.g. by animal experiments.
  • ERS ⁇ ZBL ⁇ T (RULE 26) independent claim 10 proposes a special method for the production of Salmonella live vaccine substances and in the independent claim 20 live vaccine strain.
  • Claim 1 relates to the use of a salmonella live vaccine strain known per se (see, for example, EP 0 263 528) for the production of a special live vaccine.
  • a salmonella live vaccine strain known per se see, for example, EP 0 263 528, for the production of a special live vaccine.
  • an attenuation marker e.g. auxotrophy marker or stwd marker
  • the known live Salmonella vaccine strains have an envelope marker that gives them an anti-epidemic potency (reduced excretion by the host or reduced survival rate in the outside world).
  • the envelope marker used there also caused the vaccine strains to be sensitized to macrolide antibiotics. This antibiotic sensitization has so far only been used for the selection of suitable envelope mutants, that is to say in the production of the vaccine strain.
  • the macrolide sensitivity of the vaccine strains provided with an envelope marker can also be used as a safety function when the vaccines produced therefrom are used.
  • the vaccine is to be designed in such a way that in the event of an infection of another host caused by it, it enables effective therapeutic treatment of the infected host by means of macrolides. This goal can be achieved relatively simply in that only those vaccine strains (provided with an envelope marker) are selected for the production of the vaccine, the increase of which can be controlled by administration of acceptable doses of macrolide antibiotics.
  • envelope marker due to its envelope marker a sensitivity to macrolides.
  • envelope mutations which have an increased sensitivity to hydrophobic antibiotics (macrolides, for example erythromycin)
  • further envelope mutants are described (inter alia Hancock, REW: Ann. Rev. Microbiol. 1984, 38, 237-264), the have different permeabilities with regard to sensitivity to hydrophilic, hydrophobic and polycationic antibiotics. Envelope markers of this type have so far been of no importance in the production of live bacterial vaccines.
  • the independent claim 2 relates for the first time to Salmonella live vaccines, for the manufacture of which at least one attenuated live vaccine strain is used, which is provided with an envelope marker which gives the vaccine strain an increased sensitivity to a special therapeutically active antibiotic with the exception of Makroliden gives.
  • the live vaccine strains used to produce the salmonella live vaccine according to the invention are therefore provided with an envelope marker which generally gives them an anti-epidemic potency (interruption of the formation of infection chains), possibly a sensitivity to macrolide antibiotics, but in any case an increased sensitivity gives balance to another special therapeutically effective antibiotic.
  • the vaccine strain can be detected relatively easily by using the selected special therapeutic antibiotic, so that the production of a vaccination strain provided with a suitable envelope marker does not pose any major difficulty. It goes without saying that, in view of the need to treat an unwanted infection caused by the vaccine,
  • ERSArZBLATT (REGEL26) - 10 -
  • the vaccination strain is advantageously provided with at least one chromosomal antibiotic resistance mutation for attenuation.
  • the term chromosomal antibiotic resistance mutation includes It was found that the attenuation level of the vaccine strain can be optimally adjusted by using selected Stwd markers or by a targeted combination of several such markers, when selecting such chromosomal antibiotic resistance mutas However, care must be taken to attenuate the vaccine strain so that this does not preclude the increased sensitivity to the therapeutically active antibiotic caused by the envelope marker where appropriate, should be used to treat the vaccine strain. Depending on this, the chromosomal antibiotic resistance mutation then becomes - 1 1 -
  • the envelope marker is selected so that it gives the vaccine strain (in addition to an anti-epidemic potency and possibly a macrolide sensitivity) an increased sensitivity to an antibiotic from the group of quinolones, chloramphelicules or tetracyclines.
  • An envelope marker has proven to be particularly advantageous since it gives the vaccine strain an increased sensitivity to the currently most effective antibiotic ciprofloxacin against Salmonella.
  • the live Salmonella vaccine according to the invention can be obtained from one or more vaccine strains of different (predominant) serovars of the O groups B (for example Salmonella typhimurium), D (for example Salmonella enteritidis), C (for example Salmonella infantis) and E. (eg Salmonella anatum) as a mono-, bi-, tri- or tetra-vaccine.
  • B for example Salmonella typhimurium
  • D for example Salmonella enteritidis
  • C for example Salmonella infantis
  • E. eg Salmonella anatum
  • Salmonella typhimurium vaccine strains for chicks or chickens must have a lower degree of attenuation (compared to mice) in order to compensate for the lower susceptibility. It can be assumed that this also applies more or less to other Salmonella serovars.
  • claim 9 proposes a live vaccine suitable for the immunization of chicks and chickens, which is produced from at least one attenuated vaccine strain, the generation time of which is approximately between 28 to 34 minutes.
  • Vaccine strains with such generation times have a lower sensitivity of chicks / chickens to compensate for lower Salmonella typhimurium and other Salmonella serovars (in Compared to vaccine strains for calves or mice) degree of attenuation.
  • an effective Salmonella vaccine is of particular interest with regard to the host species chicks / chickens.
  • the previously deposited / published Salmonella typhimurium Stwd mutants lack a direct reference to this host species.
  • vaccines are now presented whose vaccine strains are optimally attenuable or already attenuated with regard to chicks / chickens.
  • the vaccine strain S.tm Nal 2 / Rif-9 / Rtt is emphasized, which is optimally attenuated for chicks / chickens.
  • S.tm Nal 2 / Rif 9 which has not been filed in connection with this application, but is nevertheless to be mentioned.
  • the vaccine strains cited have a generation time of approximately 32 minutes. From this fact the "attenuation equivalent generation time" for the selection of optimally attenuated other strains of the same or the other serovars was derived. However, the generation times suitable for the selection of vaccine strains suitable for chickens / chicks are varied over a range of 28 to 34 minutes. This diversification corresponds to the fact that the chicks / chickens can have a different susceptibility to different strains or strain-dependent virulence differences of the respective serovars. With a few test series, those are selected from preselected vaccine strains that have generation times between 28 to 34 minutes that are optimally intended for chicks / chickens. Advantageously, at least the animal experiments otherwise required for the preselection can thus be omitted. - 14
  • a live Salmonella vaccine which contains a vaccine strain with increased sensitivity to a special therapeutically active antibiotic.
  • Chickens are in comparison to other host species e.g. Humans, calves or piglets, relatively short-lived. As a rule, they are slaughtered after a comparatively short rearing phase and are sold as frozen or fresh meat. Since the vaccination is usually not very long ago, it can be assumed that at the time of slaughter the live Salmonella vaccine bacteria can still be found in the chickens. These can then reach the outside world. For the normal population, the low bacterial counts of the stably attenuated vaccine strains in question are insignificant.
  • the prototype of such a safety and therapy marker is the so-called Ssq marker.
  • Vaccine strains provided with the Ssq marker are super-sensitive to quinolones, in particular to ciprofloxacin. which is currently the most effective antibiotic against Salmonella.
  • the Ssq marker is also an envelope mutant and thus also has - depending on the respective Ssq marker on its bile and anion detergent tolerance or Sensitivity - a more or less pronounced anti-epidemic potency.
  • the invention is not limited to the creation of particularly safe live vaccines. Another aim is to provide a method for producing a live vaccine which is optimally attenuated with regard to a specific host and which largely does not require animal testing.
  • a vaccine strain is selected whose generation time is extended to approximately 28 to 34 minutes compared to the wild strain (22 minutes).
  • the vaccine strain used can be obtained, for example, from a wild strain which is first provided with a streptomycin (Sm) or nalideixic acid (Nal) label. This results in a generation time extension from 22 to 25 to 29 minutes.
  • a rifampicin (Rif) marker is then installed as a further marker which extends the generation time.
  • a vaccine can be produced in which
  • Stwd mutants of another antibiotic resistance phenotype with another generation time extended by an additional three to six minutes are isolated, thereby isolating a set of vaccine strain candidates with extended generation times of about 28 to 34 (wild trunk about 22) minutes.
  • an Ssq "safety and therapy" marker is built into the two-marker vaccine strain attenuated by the Stwd mutation, which marker increases the sensitivity to ciprofloxacin (chloramphenicol, doxycycline, etc.) increased by about four times and at the same time slightly reduced excretion and survivability in the outside world.
  • the specified sequence can be varied as desired and also fall back on phenotype resistance phenotypes: DD-WP 235 828.
  • the invention also relates to special Sal onella vaccine strains which, according to claim 20, have generation times of 28 to 32 minutes and variants of these vaccine strains, which can be attenuated more or less and have generation times between 28 and 34 minutes.
  • claim 22 relates to the use of such vaccine strains for the oral immunization of chicks and oral or parenteral immunization of chickens against Salmonella infections.
  • Salmonella vaccine strains listed (and deposited) in the claims and the following examples (with and without Ssq markers) are examples of all vaccine strain candidates with graded levels of attenuation that can be produced according to the same principle. They are suitable for the production of immunogenic live vaccines, in particular for chicks / chickens according to known multiplication methods.
  • Ssq markers accesion No. 8433, 8435, 9362, 8434, 8441, 8432
  • generation times of approximately 32 minutes are indicated.
  • Other special strains with Ssq markers have generation times of 28 minutes (Accession No. 9361) and 30 minutes (Accession No. 9360). This generation time information should not be construed as a restrictive limitation. In the case of strain-dependent virulence (invasiveness / colonization-activity) differences, generation times of 28 to 34 minutes may also be conceivable as attenuation equivalent.
  • Salmonella vaccine strains preferred for the different serovars are listed again in the table below. - 19 -
  • microorganisms were deposited with:
  • Vaccine strains as an example for other two- or three-marker mutants with less (or higher) attenuation / correspondingly less or more extended generation time
  • Ciprofloxacin (Bayer, wild strains MIC 0.05 ⁇ g / ml
  • Chicken chickens from Braunegegegern from different hatcheries were kept in cages with 5 - 10 animals and fed with turkey rearing feed and water ad libitum.
  • Groups of 10 chicks were given oral 10 9 cfu, sometimes 10 8 cfu, of the respective vaccine strain within the throat within 36 hours after hatching or (for the purpose of comparing and determining the optimal immunization age) on the fourth day of life. Immunization under practical conditions is also possible via drinking water. (After previous water withdrawal for 4 hours, a drinking water quantity of 2 ml / chick is absorbed within 3 hours.
  • the chickens received 10 6 (or 10 7 ) cfu of the respective neutral-labeled homologous wild strain orally using a pipette. Proof of the excretion of the
  • the number of Salmonella colonies and the number of enterobacterial colonies was calculated as the blood alcohol percentage.
  • 10 9 (and 10- ** - 0 ) cfu of the wild strain are spatulated on nutrient agar with 100 ⁇ g (or in two steps over 50 ⁇ g and subsequently 400 ⁇ g) nalidixic acid / ml and incubated at 37 ° C. for about two days.
  • Clones are passaged over nutrient agar, checked for resistance obtained and, in comparison to the wild strain, the less or more reduced extinction (speculum with tube attachment, Zeiss-Jena, wavelength 650 nm, number of starting bacteria 10 7 cfu, incubation in a shaking water bath for 3 Hours at 37 ° C.
  • the generation time of suitable-looking clones is measured in the Abbott MS-2 test system, and clone Nal 2 with a generation time of about 28 (wild strain about 22) minutes, as described above , on nutrient agar with 400 ⁇ g Rif- ampicin / ml resistance clones obtained, determined from these generation times and the Nal 2 / Rif clones with graded, extended generation times between about 29 and 34 minutes are used to determine the guideline value (extended) "generation time as attenuation equivalent" (see example 3).
  • the neutral marked wild strains with high bacterial counts are excreted after only 24 hours or the Salmonella bacterial counts gradually reach their highest values in the faeces only between the third and sixth day (maximum values for a 50 percent share of the total enterobacterial flora).
  • the Salmonella colony number drops to a 1.0 to 0.1 per mille portion of the enterobacterial flora and remains in this order of magnitude for a long time.
  • ERSArZBL ⁇ TT Wild strain colonization in immunized chicks are suitable.
  • the immunized chicks which received the vaccine strain with graded generation times between 29 to 32 minutes, excrete the wild strain, especially in the first five to ten days after the oral challenge, significantly reduced (measured in terms of the alcohol level) -Part of the enterobacterial colonization density). The differences are (decreasing over time) up to two powers of ten. From the sixth to tenth day after oral exposure, the Salmonella population densities in immunized chicks are similar to those of the controls (in the 0.1 per mille range of enterobacterial germs). pay). In individual cases, however, immunized chicks show a reduced excretion in the order of one log level even after the tenth day.
  • mice and two-day chicks from S.tm Wildstamm and the S.tm Nal 2 / Rif 9 vaccine strain and additionally the ip LD5 Q - ert of the wild strain for chicks at the age of 17 days are shown in Table 1.
  • the LDs Q values for chicks and mice in Table 1 illustrate the lower susceptibility of the chicks to S.tm, which has to be compensated for by a lower degree of attenuation of the vaccine strain.
  • Table 2 shows that the single ip immunization with all vaccine strains reduces the lethality of an unphysiological toxin infection from about 75% to ⁇ 30%. As shown in Table 3, this reduction in lethality - in contrast to the zoosaloral and metabolic drift mutants with generation times> 33 minutes and ip LD5 0 > 10 ⁇ - 5 cfu ⁇ - is also due to the single oral immunization with the vaccine strain S.tm Nal 2 / Rif 9 (without and with Rtt marker) reached. This means that this vaccine strain is optimally attenuated for chicks.
  • ERS ⁇ TZBL ⁇ TT (REGEL26)
  • Apparent clones measured the generation time using the Abbott MS-2 test system.
  • Rifampicin resistance clones (nutrient agar with 400 ⁇ g rifampicin / ml) are obtained in a second manner from clones with a generation time extended by three to six minutes, as described above, the generation time of which is determined and Sm / Rif- Clones with a generation time of approximately 28 to 32 minutes favored as a two-marker vaccine strain.
  • a fresh culture is suspended in PBS and treated with 100 ⁇ g / ml N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidine (MNG, ZIMET-Jena) up to a survival rate of approximately 10%.
  • MNG N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidine
  • ZIMET-Jena N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidine
  • the mixture is now incubated for two hours at 37 ° C. in a nutrient broth with 0.4 ⁇ g chloramphenicol and subsequently the classic treatment with 1000 IU penicillin / ml is carried out.
  • Clones with no growth on nutrient agar with 0.4 ⁇ g chloramphenicol (0.01 ⁇ g ciprofloxacin, 1.0 ⁇ g doxycycline) / ml are obtained by stamping technology.
  • Such clones are defined as Ssq (super-sensitivity to quinolones) strains and used as safety and therapy markers which optimize / increase acceptance by vaccine strains - Do not grow on nutrient agar with 0.4 ⁇ g chloramphenicol, 0.01 ⁇ g ciprofloxacin or 1.0 ⁇ g doxycycline (and usually 30 ⁇ g erythrocincin) / ml
  • the frequency of reversion of the envelope mutation is better determined on nutrient agar with 20 or 30 ⁇ g erythromycin / ml, since with the high number of bacteria on ciproloxacin, chloramphenicol or doxycycline, the residual growth shifts to a concentration which is about two steps higher.
  • Clones with Ssq markers which experience no or only an insignificant, co-mutation-related increase in generation time / attenuation due to mutagen treatment, are suitable as vaccine strains.
  • Chicks ⁇ 36 hours old are orally infected with 10 9 cfu of the respective wild strains, Stwd one-marker mutants or Stwd two-marker mutants. After five and eight days, the chicks are sacrificed, the sterile liver is homogenized, spread on nutrient agar and the remaining material is mixed with nutrient broth. The grown colonies or cultures are checked for 0-group identity and markers. After five days in S.typhimurium and S.enteritidis the bacterial counts / gram of liver are in the order of 10 3 cfu, after eight days in the range around 10 2 cfu. In contrast, after five days in S. infantis and S.
  • the S.tm Nal 2 / Rif 9 (without Rtt marker) is only occasionally detected after the 18th day, apparently due to the colonization resistance mediated by anaerobes at this age .
  • the immunized chicks excrete the wild strain, in accordance with those with S.tm
  • the vaccine strains show no growth on suitable (expediently protein-free) nutrient media at a concentration of 0.5 mg SDS / ml, while the wild strains grow at 5 mg SDS / ml.
  • the (two-marker vaccine strain without Ssq marker or) the three-marker vaccine strain with Ssq marker are grown in a suitable full medium as a liquid culture until the end of the logarithmic phase.
  • the bacterial suspensions are mixed with a conventional stabilizer and lyophilized.
  • the vaccines obtained in this way are generally administered as a single oral dose of 10 8 to 10 9 cfu to chicks ⁇ 36 hours old. Chickens are given a one-time oral immunization / booster with 10 9 cfu parenterally with about 10 8 cfu before the laying period.

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Abstract

Verwendung mindestens eines attenuierten immunogenen Salmonella-Lebendimpfstammes, der mit einem eine Sensibilität gegenüber Makrolid-Antibiotika verleihenden Marker (Envelope-Marker) versehen ist, zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes für einen bestimmten Wirt, der im Falle einer von ihm verursachten Infektion eines anderen Wirtes eine effektive therapeutische Behandlung des infizieren Wirtes mittels Makroliden ermöglicht.

Description

Salmonella-Lebendimpfstoff
Die Erfindung bezieht sich auf eine spezielle Verwendung eines Salmonella-LebendimpfStoffes, auf neue bislang noch nicht eingesetzte Salmonella-LebendimpfStoffe, auf ein Verfahren zur Herstellung derartiger Impfstoffe sowie auf geeignete Salmonella-Impfstamme.
Die Mehrzahl der Salmonella-bedingten Gastroenteritiden des Menschen werden durch kontaminierte tierische Lebens¬ mittel ausgelöst. Insbesondere Hühner bzw. Hühnereier, die mit dem derzeit prädominant auftretenden Serovar-Salmo¬ nella enteritidis infiziert sind, haben in jüngster Zeit verstärkt Infektionen hervorgerufen. Betroffen sind gene¬ rell aber alle Lebensmittel, die von Tieren aus Massen¬ haltung stammen. Hierbei werden in der Regel viele Tiere auf engem Raum gehalten, was der Ausbreitung von Infek¬ tionen in den Tierbeständen Vorschub leistet.
Die Gefahr einer Übertragung der Infektion von dem infi-
ERSÄΓZBLÄΓΓ (REGEL 26) zierten Tier auf den Menschen läßt sich zum einen durch übliche veterinärmedizinische Maßnahmen zur Infektions¬ kettenunterbrechung herabsetzen. Weiterhin kann eine sorg¬ fältige Beachtung der küchenhygienischen Vorschriften bei Verarbeitung kontaminierter tierischer Lebensmittel eine Übertragung auf den Menschen verhindern. Gerade die letzt¬ genannten Vorschriften werden jedoch bei der Lebensmittel¬ lagerung und Zubereitung nicht immer in ausreichendem Maße berücksichtigt. Es ist also erforderlich, von vornherein auszuschließen, daß infizierte Tiere verarbeitet werden. Dies läßt sich z.B. durch eine Impfung der Tierbestände gegen Salmonalla-Infektionen erreichen.
Geeignete Salmonalla-LebendimpfStoffe müssen eine Reihe von unterschiedlichen Bedingungen erfüllen:
1. Die Virulenz der zur Herstellung der Impfstoffe einge¬ setzten Impfstämme muß so eingestellt sein, daß einer¬ seits eine inapparente Infektion und andererseits eine ausreichende Persistenz der Impfstämme im Wirtsgewebe als Voraussetzung für eine hohe Immunogenität garan¬ tiert ist.
2. Es muß weitgehend sichergestellt sein, daß die einge¬ setzten Impfstamme bzgl. ihrer Virulenz und Schutz¬ eigenschaften stabil sind, d.h. daß sie nicht zu dem virulenten Wildstamm rückmutieren.
3. Um die Wahrscheinlichkeit möglicher Infektketten herab¬ zusetzen, sollte weiterhin vorgesehen werden, daß die Impfstämme nicht dauerhaft lebend ausgeschieden werden können bzw. in der Außenwelt nur kurze Zeit überleben können.
ER$ArZBLÄrT(REGEl 26) Auf die vorgenannten drei Bedingungen, die ein Lebendimpf¬ stoff erfüllen muß, soll im folgenden detailliert einge¬ gangen werden. Wie unter 1. ausgeführt basiert die Her¬ stellung eines geeigneten Salmonella-LebendimpfStoffes auf einer Reduktion der Virulenz (Attenuierung) der pathogenen Salmonellen bei gleichzeitigem Erhalt ihrer Antigenstruk- turen und damit der immunogenen Wirkung im Wirt. Eine Mög¬ lichkeit besteht z.B. darin, als Impfstamme Deletionsmu- tanten, z.B. Pur- oder Aro-auxotrophe Klone einzusetzen. Der Attenuierungsgrad dieser Impfstämme hängt vom Metabo- litenmangel in vivo ab, was möglicherweise eine Feinanpas¬ sung an den zu immunisierenden Wirt erschwert. Es wird in diesem Zusammenhang allerdings auf die EP 0 263 528 ver¬ wiesen, in der stabile Asp-Mutanten von Salmonella-typhi- murium mit unterschiedlich hoher Virulenzreduktion be¬ schrieben werden. Durch Auswahl geeigneter Asp-Mutanten kann man Impfstamme mit einer der jeweiligen Wirtsspezies angepaßten Attenuierungshöhe herstellen.
Eine weitere Möglichkeit der Attenuierung besteht darin, solche Impfstämme einzusetzen, deren Virulenzreduzierung auf eine Stoffwechseldrift-Mutation (im folgenden Stwd- Mutation oder Marker genannt) zurückzuführen ist. Der Be¬ griff "Stoffwechseldrift" umfaßt alle durch Mutationen funktioneil veränderten essentiellen Enzyme bzw. funktio¬ neil wichtigen Zellkompartimente, wie z.B. Ribosomenpro- teine, Gyrase, RNA-Polymerase, Permeasen, wobei als Folge dieser Mutationen die Funktionen der Translation, DNA-Re- plikation, -Transkiption oder Permeation mehr oder weniger ausgeprägt gestört sind. Solche Stwd-Mutanten weisen wei¬ terhin eine Resistenz gegenüber speziellen Antibiotika oder anderen Substanzen (Noxen) auf. Auf besonders ein¬ fache Weise können Stwd-Mutanten im Labor als chromosomale
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Antibiotika-Resistenzmutanten erhalten werden. Aus der EP 0 263 528 sind in diesem Zusammenhang z.B. Stwd-Mutanten mit einer Resistenz gegen Nalidixinsäure (Nal), Strepto- mycin (Sm) oder Rifampicin (Rif) bekanntgeworden. Insbe¬ sondere bei Einbau mehrerer Stwd-Marker in einen Impfstamm (2- oder 3-Marker-Impfstamm) ergeben sich de facto unbe¬ grenzte Möglichkeiten zur Herstellung jeder gewünschten einer speziellen Wirtsspezies optimal angepaßten Gesamt- attenuierungshöhe.
Zum Stand der Technik "Attenuierung mittels Stwd-Mutatio- nen" wird auf folgende Veröffentlichungen verwiesen: DD-WP 155 294/ DD-WP 218 834; DD-WP 235 828; DD-WP 253 182, DD- WP 253 184; DD-WP 281 118; DD-WP 294 420; EP 0 263 528.
Eine weitere (oben unter 2. erwähnte) Bedingung ist, daß die durch Mutation gewonnenen attenuierten Impfstämme nicht zu dem virulenten Wildstamm zurückmutieren. Die ge¬ forderte Stabilität läßt sich einerseits dadurch erreichen, daß nur derartige Impfstamme eingesetzt werden, bei denen in vitro keine Reversionen nachweisbar sind, bzw. deren Reversionshäufigkeiten <10*"7 sind. Eine weitere Möglich¬ keit ist, solche Impfstämme einzusetzen, die mehrere von¬ einander unabhängig die Virulenz reduzierende Mutationen aufweisen. Hier ist die Wahrscheinlichkeit einer Rückmu¬ tation nahezu ausgeschlossen.
Die letzte, oben unter 3. im Zusammenhang mit dem Stich¬ wort "Unterbrechung der Infektkettenbildung" angesprochene Bedingung betrifft insbesondere die Gefahren, die mit einer möglichen Ausscheidung und einem dauerhaften Über¬ leben der Impfstämme außerhalb des geimpften Wirtes ein¬ hergehen. In diesem Zusammenhang ist es wünschenswert, die Ausscheidung und die Überlebensfähigkeit der Impfstämme in der Außenwelt zu reduzieren. Um eine ausreichende Immunantwort zu garantieren, darf andererseits jedoch die zeitweilige Überlebensfähigkeit der Impfstämme im Wirtsge¬ webe nach z.B. oraler oder parenteraler Applikation nicht oder nur geringfügig beeinträchtigt werden. Impfstammutan- ten, die derartigen Anforderungen genügen, sind z.B. aus der DD-WP 218 836, DD-WP 231 491, DD-WP 253 182, DD-WP 253 183, DD-WP 253 184 und EP 0 263 528 bekanntgeworden. Im Stand der Technik wird vorgeschlagen, geeignete Impfstamme zur Verringerung der Ausscheidung und ihrer Überlebens¬ fähigkeit in der Außenwelt mit sogenannten antiepidemi¬ schen Markern zu optimieren. Der Begriff antiepidemische Marker bezeichnet im weiteren Sinne Outer-Envelope-Muta- tionen, die u.a. eine funktioneile Veränderung der Per¬ meabilitäts-Barriere der Outer-Membrane bewirken.
Es stehen unterschiedliche antiepidemische Marker zur Ver¬ fügung, mit denen die Impfstämme in Abhängigkeit von der vorgesehenen Applikationsform versehen werden können. Die zur Zeit bekannten antiepidemischen Marker werden in Ab¬ hängigkeit von der Veränderung, die sie in der in der Outer-Membrane des ImpfStammes bewirken, in drei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe umfaßt die sogenannten anti¬ epidemischen Hst-Marker. Der Einbau eines Hst-Markers be¬ wirkt, daß ein Impfstamm hochsensibel gegenüber Galle, Aniondetergenzien, Makrolid-Antibiotika und anderen Noxen wird. Aufgrund der hohen Sensibilität gegenüber Galle kommt es zu einer verminderten Ausscheidung mit Fäces zu¬ rückzuführen auf die bereits im Darmlumen eintretende In- aktivierung der Impfstamme. Eventuell ausgeschiedene le¬ bende ImpfStammbakterien besitzen in der Außenwelt als Folge der fehlenden Permeabilitäts-Barriere in der Outer- - 6 -
Membrane gegen Tenside und Makrolide und anderen Noxen nur eine verkürzte Überlebenszeit. Die Bildung von Infektket¬ ten bei Verwendung von mit Hst-Markern versehenen Impf¬ stämmen ist damit nahezu auszuschließen. Allerdings können mit Hst-Markern versehene Impfstämme zumindest bei Einsatz der üblichen Impfstoffdosen nur parenteral appliziert wer¬ den. Bei oraler Applikation wird die Virulenz aufgrund der hohen Gallesensibilität so stark beeinflußt, daß eine aus¬ reichende immunogene Antwort nur bei Einsatz extrem hoher Impfstoffdosen erzielt werden kann. Für eine orale Appli¬ kation bietet es sich daher an, die Impfstämme mit einem antiepidemischen Marker aus einer der beiden weiteren be¬ kannten Gruppen zu versehen. Unter die eine Gruppe fallen die sogenannten Rbt-Marker (reversion to bile tolerance) . Der Rbt-Marker kann durch Mutation aus dem Hst-Marker ge¬ wonnen werden. Er verleiht dem Impfstamm ebenso wie der Hst-Marker eine antiepidemische Potenz. Im Unterschied zu dem Hst-Marker ist der mit einem Rbt-Marker versehene Impfstamm jedoch tolerant gegenüber Galle und kann daher ohne den Impfeffekt einschränkende Reduktion der Virulenz oral appliziert werden. Das gleiche gilt für die weitere Gruppe, die sogenannten Rtt-Marker (reversion to tenside tolerance) . Der Rtt-Marker kann durch Mutation aus dem Rbt-Marker gewonnen werden. Der mit dem Rtt-Marker verse¬ hene Impfstamm ist tolerant gegenüber Tensiden und besitzt gleichzeitig aufgrund der verbleibenden hohen Sensibilität gegenüber Makroliden und anderen Noxen eine ausreichende antiepidemische Potenz. Auch der Rtt-Marker-Stamm kann problemlos oral appliziert werden.
Unter Zugrundelegen der vorgenannten Informationen und Veröffentlichungen lassen sich Lebendimpfstoffe herstellen, die alle erforderlichen Bedingungen erfüllen. Die Anpas-
EHSATZBLATT (REGEL 26) - 7
sung an den jeweiligen Wirt kann dabei z.B. durch Tier¬ versuchsreihen erfolgen.
Es verbleibt ein weiteres Problem. Auch bei Beachtung aller Vorsichtsmaßnahmen ist nicht auszuschließen, daß z.B. mit der Impfung der Tiere oder der Herstellung der Impfstoffe befaßten Personen mit den zwar attenuierten aber nach wie vor pathogenen Salmonella-Impfstammen in Berührung kommen. Bei gesunden Personen besteht kaum Ge¬ fahr, daß eine Infektion ausgelöst wird. Handelt es sich jedoch um Personen, deren Immunsystem geschwächt ist (z.B. im Falle einer HIV-Infektion), dann kann der Kontakt mit derartigen Impfstämmen zu einer Salmonelleninfektion füh¬ ren.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ausgehend von dem be¬ kannten Stand der Technik einen Lebendimpfstoff gegen Sal- onella-Infektionen zu schaffen, der optimal für den zu immunisierenden Wirt attenuiert ist, bei oraler oder pa- renteraler Immunisierung diesem eine die Wildstamm-Aus¬ scheidung reduzierende Immunität vermittelt und dessen Einsatz insbesondere im Hinblick auf immungeschwächte Per¬ sonen kein oder nur ein geringes Risiko darstellt. Weiter¬ hin ist es die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung optimal an den jeweiligen Wirt angepaßter Salmonella-LebendimpfStoffe anzugeben, das mit deutlich weniger Tierversuchen auskommt als herkömmliche Verfahren. Schließlich soll die Erfindung insbesondere Salmonella- Lebendimpfstämme für für Hühner geeignete Lebendimpfstoffe bereitstellen.
Zur Lösung dieser Aufgabe werden in den unabhängigen An¬ sprüchen 1 und 2 ein spezieller Lebendimpfstoff, in dem
ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26) unabhängigen Anspruch 10 ein spezielles Verfahren zur Her¬ stellung von Salmonella-LebendimpfStoffen und in dem unab¬ hängigen Anspruch 20 Lebendimpfstamme vorgeschlagen.
Anspruch 1 bezieht sich auf die Verwendung eines an sich bekannten Salmonella-LebendimpfStammes (siehe z.B. EP 0 263 528) zur Herstellung eines speziellen Lebendimpf¬ stoffes. Die bekannten Salmonella-Lebendimpfstamme weisen neben einem Attenuierungs-Marker (z.B. Auxotrophie-Marker oder Stwd-Marker) einen Envelope-Marker auf, der ihnen eine antiepidemische Potenz (verminderte Ausscheidung durch den Wirt bzw. reduzierte Überlebensrate in der Außenwelt) verleiht. Der dort eingesetzte Envelope-Marker bewirkte weiterhin, daß die Impfstämme gegenüber Makrolid- Antibiotika sensibilisiert sind. Diese Antibiotika-Sensi- bilisierung wurde bislang lediglich zur Selektion geeig¬ neter Envelope-Mutanten, also bei der Herstellung der Impfstamme, eingesetzt. Erfindungsgemäß wurde nun erstmals erkannt, daß die Makrolid-Sensibilität der mit einem Envelope-Marker versehenen Impfstämme auch beim Einsatz der daraus hergestellten Impfstoffe als Sicherheitsfunk¬ tion eingesetzt werden kann. Der Impfstoff ist so auszu¬ legen, daß er im Falle einer von ihm verursachten Infek¬ tion eines anderen Wirtes eine effektive therapeutische Behandlung des infizierten Wirtes mittels Makroliden er¬ möglicht. Dieses Ziel läßt sich relativ einfach dadurch erreichen, daß zur Herstellung des Impfstoffes nur derar¬ tige (mit einem Envelope-Marker versehene) Impfstamme aus¬ gewählt werden, deren Vermehrung durch Gabe vertretbarer Dosen von Makrolid-Antibiotika kontrolliert werden kann.
Die gemäß Anspruch 1 in einer speziellen Verwendung ein¬ gesetzten, bekannten Salmonella-Lebendimpfstamme weisen - 9 -
aufgrund ihres Envelope-Markers eine Sensibilität gegen¬ über Makroliden auf. Neben Envelope-Mutationen, die eine erhöhte Empfindlichkeit für hydrophobe Antibiotika (Makro¬ lide z.B. Erythromycin) aufweisen, werden jedoch weitere Envelope-Mutanten beschrieben (u.a. Hancock, R.E.W. : Ann. Rev. Microbiol. 1984, 38, 237-264), die bezüglich einer Sensibilität für hydrophile-, hydrophobe und polykatio- nische Antibiotika vereinzelt differente Permeabilitäten aufweisen. Derartige Envelope-Marker haben bislang keine Bedeutung bei der Herstellung von bakteriellen Lebend¬ impfstoffen.
Der unabhängige Anspruch 2 bezieht sich erstmals auf Sal¬ monella-LebendimpfStoffe, zu deren Herstellung mindestens ein attenuierter Lebendimpfstamm eingesetzt wird, der mit einem Envelope-Marker versehen ist, der dem Impfstamm eine erhöhte Sensibilität gegenüber einem speziellen therapeu¬ tisch wirksamen Antibiotikum mit Ausnahme von Makroliden verleiht. Die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Sal¬ monella-LebendimpfStoffes verwendeten Lebendimpfstamme sind also mit einem Envelope-Marker versehen, der ihnen in der Regel eine antiepidemische Potenz (Unterbrechung der Infektkettenbildung), ggf. eine Sensibilität gegenüber Makrolid-Antibiotika, jedenfalls aber eine erhöhte Sensi¬ bilität gegenüber einem anderen speziellen therapeutisch wirksamen Antibiotikum verleiht. Die Impfstamme lassen sich durch Einsatz des ausgewählten speziellen therapeuti¬ schen Antibiotikums relativ einfach nachweisen, so daß die Herstellung eines mit einem geeigneten Envelope-Marker versehenen Impfstammes keine größere Schwierigkeit dar¬ stellt. Es versteht sich, daß im Hinblick auf eine even¬ tuell erforderliche Therapierbarkeit einer durch den Impf¬ stoff hervorgerufenen ungewollten Infektion in erster Li-
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nie derartige Antibiotika ausgewählt werden, die eine gute Wirksamkeit gegenüber den eingesetzten Salmonella-Serova- ren aufweisen.
Es versteht sich weiterhin, daß die ausgewählten Lebend¬ impfstämme von prädominanten Serovaren stammen.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Lebend¬ impfstoffes gemäß der Ansprüche 1 und 2 sind in den Unter¬ ansprüchen 3 bis 9 angegeben.
Wie oben bereits ausgeführt, gibt es unterschiedliche Mög¬ lichkeiten der Attenuierung von Lebendimpfstoffen. Eine Möglichkeit besteht darin, einen Auxotrophie-Marker (z.B. Asp") in den Impfstamm einzubauen. Vorteilhafterweise wird gemäß Anspruch 3 der Impfstamm zur Attenuierung mit minde¬ stens einer chromosomalen Antibiotika-Resistenzmutation versehen. Unter dem Begriff chromosomale Antibiotika-Re¬ sistenzmutation fallen im wesentlichen die eingangs be¬ schriebenen Stwd-Marker. Es hat sich herausgestellt, daß durch Einsatz ausgewählter Stwd-Marker bzw. durch gezielte Kombination mehrerer derartiger Marker die Attenuierungs- höhe des ImpfStammes optimal einstellbar ist. Bei der Aus¬ wahl derartiger chromosomaler Antibiotika-Resistenzmuta¬ tionen zur Attenuierung der Impfstamme muß jedoch darauf geachtet werden, daß diese die durch den Envelope-Marker bewirkte erhöhte Sensibilität gegenüber dem therapeutisch wirksamen Antibiotikum nicht ausschließt. Sinnvollerweise wird bei der Entwicklung des Impfstammes daher zunächst festgelegt, welches therapeutisch wirksame Antibiotikum gegebenenfalls zur Therapierbarkeit des Impfstammes einge¬ setzt werden soll. In Abhängigkeit davon wird dann der bzw. die chromosomale Antibiotika-Resistenzmutation zur - 1 1 -
Attenuierung des ImpfStammes ausgewählt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist der Envelope-Marker so ausgewählt, daß er dem Impfstamm (neben einer antiepidemischen Potenz und ggf. einer Makrolid- Sensibilität) eine erhöhte Sensibilität gegenüber einem Antibiotikum aus der Gruppe der Chinolone, Chloramphelico- le oder Tetracycline verleiht. Als besonders vorteilhaft hat sich ein Envelope-Marker erwiesen, der dem Impfstamm eine erhöhte Sensibilität gegenüber dem zur Zeit gegen Salmonellen wirksamsten Antibiotikum Ciprofloxacin vermit¬ telt. Insbesondere bei der Herstellung des letztgenannten ImpfStammes ist vorteilhaft, zur Attenuierung eine Stoff- wechseldrift-Mutation vorzusehen, die eine Streptomycin- und/ oder Rifampicin-Resistenz aufweist. Diese Antibioti¬ ka-Resistenzen interferieren nicht mit einer möglichen Sensibilität des Impfstammes gegenüber dem Antibiotikum Ciprofloxacin.
Je nach gewünschtem Wirkungsspektrum kann der erfindungs¬ gemäße Salmonella-Lebendimpfstoff aus einem oder mehreren Impfstämmen unterschiedlicher (prädominanter) Serovare der O-Gruppen B (z.B. Salmonella typhimurium), D (z.B. Salmo- nella enteritidis), C (z.B. Salmonella infantis) und E (z.B. Salmonella anatum) als Mono-, Bi-, Tri- oder Tetra- Vakzin hergestellt werden. In diesem Zusammenhang wird auf die in Anspruch 8 angegebenen Vakzine verwiesen, die be¬ sonders geeignet sind.
Ein weiteres, bereits oben gestreiftes Problem besteht da¬ rin, daß aufgrund unterschiedlicher Empfänglichkeiten für jeden Wirt ein spezieller, angepaßter Lebendimpfstoff vor¬ gesehen werden muß. In diesem Zusammenhang wird auf den bereits im Handel erhältlichen Salmonella typhimurium- Impfstoff Zoosaloral "Dessau" verwiesen, der bei einmali¬ ger oraler Gabe Kälber ausreichend immunisiert, Hühner da¬ gegen erst nach dreimaliger oraler Impfung gegen eine i.p. Toxoinfektion schützt (Linde, K. et al.: Vaccine 1990, 8, 278-282). Bezüglich der Wirtsspezies-abhängigen Empfäng¬ lichkeit für Salmonella typhimurium ergibt sich in etwa die Rangfolge Mäuse > Kälber > Hühner. Daraus folgt, daß z.B. Salmonella typhimurium-Impfstamme für Küken oder Hüh¬ ner zur Kompensation der geringeren Empfänglichkeit einen (im Vergleich zu Mäusen) geringeren Attenuierungsgrad be¬ sitzen müssen. Es kann davon ausgegangen werden, daß dies sinngemäß auch für andere Salmonella-Serovare mehr oder weniger zutrifft.
Es hat sich herausgestellt, daß die Generationszeiten von Salmonella-Lebendimpfstammen i.d.R. mit ihrer Attenuie- rungshöhe korrelierbar sind. Diese Korrelation zwischen Generationszeit und Attenuierungshöhe tritt insbesondere dann ein, wenn die Impfstamme zur Attenuierung mit einer chro osomalen Resistenzmutation versehen sind.
Das Verhältnis zwischen Generationszeit und Attenuierungs¬ grad erlaubt es, relativ zuverlässig für einen speziellen Wirt geeignete Impfstämme auch ohne vorherige Tierversuche auszuwählen. In diesem Zusammenhang schlägt Anspruch 9 einen zur Immunisierung von Küken und Hühnern geeigneten Lebendimpfstoff vor, der aus mindestens einem attenuierten Impfstamm hergestellt ist, dessen Generationszeit in etwa zwischen 28 bis 34 Minuten beträgt. Impfstamme mit solchen Generationszeiten weisen einen die geringe Empfindlichkeit von Küken/Hühnern für z.B. Salmonella typhimurium und an¬ dere Salmonella-Serovare kompensierenden niedrigeren (im Vergleich zu Impfstammen für Kälber oder Mäuse) Attenuie- rungsgrad auf.
Wie eingangs bereits ausgeführt, ist ein effektiver Salmo¬ nella-Impfstoff insbesondere im Hinblick auf die Wirtsspe¬ zies Küken/Hühner interessant. Den bislang hinterlegten/ publizierten Salmonella typhimurium Stwd-Mutanten fehlt ein direkter Bezug zu dieser Wirtsspezies. Gemäß der An¬ sprüche 8 und 9 werden nun Impfstoffe vorgestellt, deren Impfstämme im Hinblick auf Küken/Hühner optimal attenuier- bar oder bereits attenuiert sind. Es wird in diesem Zusam¬ menhang der Impfstamm S.tm Nal 2/Rif-9/Rtt hervorgehoben, der optimal für Küken/Hühner attenuiert ist. Das gleiche gilt für einen Impfstamm S.tm Nal 2/Rif 9, der im Zusam¬ menhang mit dieser Anmeldung nicht hinterlegt worden ist, aber dennoch Erwähnung finden soll. Die zitierten Impf¬ stämme haben eine Generationszeit von etwa 32 Minuten. Aus dieser Tatsache wurde das "Attenuierungs-Äguivalent Gene¬ rationszeit" für die Auswahl optimal attenuierter anderer Stämme des gleichen oder der anderen Serovare abgeleitet. Allerdings werden die bei der Auswahl von für Hühner/Küken geeigneter Impfstämme geeigneten Generationszeiten über einen Bereich von 28 bis 34 Minuten gefächert. Diese Fächerung entspricht der Tatsache, daß die Küken/ Hühner eine unterschiedliche Empfänglichkeit für differente Stämme bzw. stamm-abhängige Virulenzunterschiede der je¬ weiligen Serovare aufweisen können. Mit wenigen Versuchs¬ reihen lassen sich aus vorselektierten Impfstämmen, die Generationszeiten zwischen 28 bis 34 Minuten aufweisen, diejenigen selektieren die optimal für Küken/Hühner atte¬ nuiert sind. Vorteilhafterweise können so zumindest die ansonsten für die Vorselektion erforderlichen Tierversuche entfallen. - 14
Weiterhin ist es auch insbesondere im Hinblick auf den möglichen Wirt Küken/Hühner interessant, wenn, wie erfin¬ dungsgemäß vorgeschlagen, ein Salmonella-Lebendimpfstoff eingesetzt wird, der einen Impfstamm mit erhöhter Sensibi¬ lität gegenüber einem speziellen therapeutischen wirksamen Antibiotikum enthält. Hühner sind nämlich im Vergleich zu anderen Wirtsspezies z.B. Menschen, Kälber oder Ferkel, relativ kurzlebig. In der Regel werden sie nach einer ver¬ gleichsweise kurzen Aufzuchtphase geschlachtet und kommen als Gefrier- oder Frischfleisch in den Verkauf. Da die Impfung zumeist noch nicht sehr lange zurückliegt, ist da¬ von auszugehen, daß zum Zeitpunkt der Schlachtung in den Hühnern noch lebende Salmonella-ImpfStammbakterien vorhan¬ den sein können. Diese können dann in die Außenwelt gelan¬ gen. Für die Normalpopulation sind die in Frage kommenden geringe Keimzahlen der stabil attenuierten Impfstämme be¬ deutungslos. Hier kann also die Gefahr einer Infektketten¬ bildung nahezu ausgeschlossen werden. Allerdings können in Einzelfällen auch abwehrgeschwächte Risikopatienten (z.B. HlV-Personenkreis) infiziert werden und mit klinischen Symptomen reagieren. Insbesondere im Hinblick auf diesen Personenkreis ist es erforderlich, daß eine durch den Impfstamm hervorgerufene Infektion rasch und unproblema¬ tisch unter Kontrolle gebracht werden kann. Im Hinblick darauf ist der Einbau einer Sensibilität gegenüber thera¬ peutisch wirksamen Antibiotika als Sicherheits- und Thera- piemarker somit eine sinnvolle, alle theoretischen Beden¬ ken ausschließende Alternative.
Der Prototyp eines derartigen Sicherheits- und Therapie- markers ist der sogenannte Ssq-Marker. Mit dem Ssq-Marker versehene Impfstämme besitzen eine Supersensibilität ge¬ genüber Chinolonen, insbesondere gegenüber Ciprofloxacin, das das zur Zeit gegenüber Salmonellen wirksamste Anti¬ biotikum darstellt. Auch der Ssq-Marker ist wie die ein¬ gangs beschriebenen Hst-, Rbt- und Rtt-Mutationen eine Envelope-Mutante und besitzt damit gleichfalls - in Abhän¬ gigkeit des jeweiligen Ssq-Markers von seiner Galle- und Anionen-Detergent-Toleranz bzw. Sensibilität - eine mehr oder weniger ausgeprägte antiepidemische Potenz.
Die Erfindung beschränkt sich nicht nur auf die Schaffung von besonders sicheren Lebendimpfstoffen. Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines im Hinblick auf einen speziellen Wirt optimal attenuierten Lebendimpfstoffes anzugeben, das weitgehend ohne Tierver¬ suche auskommt.
Dieses Ziel wird mit einem Verfahren mit den in Anspruch 10 angegebenen Merkmalen erreicht. Das Prinzip dieses Ver¬ fahrens beruht darauf, daß eine Attenuierung von Impf¬ stämmen (insbesondere beim Einbau von Stwd-Markern) zu einer Verlängerung der GenerationsZeiten gegenüber dem Wildtyp führt. Es wurde bereits weiter oben ausgeführt, daß die verlängerten Generationszeiten einen Rückschluß auf den Attenuierungsgrad der Impfstamme erlauben können. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren reicht es daher aus, wenn einmalig (z.B. in einem Tierversuch) die bestimmte verlängerte Generationszeit eines für einen Wirt geeigne¬ ten ImpfStammes ermittelt wird. Die ermittelte verlängerte Generationszeit kann dann als Richtwert bei der späteren Selektion weiterer Impfstamme (vom gleichen Serotyp) ein¬ gesetzt werden oder sogar als Attenuierungs-Äquivalent auf andere Serotypen der gleichen Gattung übertragen werden.
Zur Herstellung eines optimal auf Küken/Hühner abgestimm- ten Impfstoffes wird z.B. ein Impfstamm ausgewählt, dessen Generationszeit gegenüber dem Wildstamm (22 Minuten) auf etwa 28 bis 34 Minuten verlängert ist. Der eingesetzte Impfstamm kann dabei z.B. aus einem Wildstamm erhalten werden, der zunächst mit einer Streptomycin(Sm)- oder Na- lidixinsäure (Nal)-Markierung versehen wird. Dadurch wird eine GenerationsZeitverlängerung von 22 auf 25 bis 29 Minuten bewirkt. Anschließend wird als weiterer, die Gene¬ rationszeit verlängernder Marker ein Rifampicin (Rif)-Mar¬ ker eingebaut.
Bezüglich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen des Ver¬ fahrens wird auf die Unteransprüche 14 bis 19 verwiesen. Im wesentlichen fassen diese Ansprüche die unterschied¬ lichen Möglichkeiten zusammen, die sich in bezug auf die Auswahl der Serovare, der zur Attenuierung verwendeten Stwd-Marker und die Reihenfolge des Marker-Einbaues er¬ geben.
Gemäß der aufgeführten wesentlichen Merkmale des Verfah¬ rens kann ein Impfstoff hergestellt werden, in dem man
- im ersten Schritt von Salmonella-Wildstämmen Stwd-Mutan¬ ten eines bestimmten Antibiotika-Resistenz Phänotyps mit um drei bis sechs Minuten verlängerter Generationszeit isoliert, zwecks Herstellung von Stämmen mit geringer bis mäßiger Attenuierung,
- im zweiten Schritt von solchen gering bis mäßig attenu- ierten Einmarker-Stämmen erneut Stwd-Mutanten eines an¬ deren Antibiotika-Resistenz-Phänotyps mit wiederum um zusätzlich drei bis sechs Minuten verlängerter Genera¬ tionszeit isoliert, wodurch man einen Set von Impfstamm- Kandidaten mit abgestuft verlängerten GenerationsZeiten von etwa 28 bis 34 (Wildstamm etwa 22) Minuten erhält.
ERSÄTZB π (REGEL 26) - 17 -
- was bei S.tm am i.p. Mäusemodell (da der Logarithmus der LD50 linear mit der (verlängerten) Generationszeit kor- reliert) abgestuften LD5(-*-Werten von etwa 105 bis 107 (Wildstamm etwa 101) cfu entspricht -, dann mit den ein¬ zelnen S.tm Impfstammen dieses Sets < 36 Stunden alte Küken einmal oral mit 109 cfu immunisiert, nach zwei Wo¬ chen die immunisierten Tiere oral mit 10*** cfu Wildstamm infiziert; und nunmehr im Hinblick auf die Wechselbezie¬ hung "maximal mögliche(r) Generationszeit-Verlängerung/ Attenuierungsgrad bei noch bestehender optimaler Reduk¬ tion der Wildstamm-Ausscheidung" den S.tm Nal 2/Rif 9 mit einer (verlängerten) Generationszeit von etwa 32 Mi¬ nuten (und einer i.p. LD5Q Maus von etwa 106 cfu) als Prototyp-Impfstamm favorisiert, zwecks Festlegung des "Attenuierungs-Äquivalenz (verlängerte) Generationszeit" für andere Stämme des gleichen Serovars bzw. Serovare mit nur mäßiger oder fehlender Virulenz für Mäuse.
- im dritten Schritt zur Impfstamm-Optimierung/-Akzeptanz- Erhöhung in die mittels Stwd-Mutation attenuierten Zwei- marker-Impfstamme einen Ssq "Sicherheits-/und Therapie"- Marker einbaut, welcher die Sensibilität für Ciprofloxa¬ cin (Chloramphenicol, Doxycyclin, etc.) um etwa das Vierfache erhöht und gleichzeitig geringgradig die Aus¬ scheidung und Überlebensfähigkeit in der Außenwelt redu¬ ziert.
Die angegebene Reihenfolge kann beliebig variiert und auch auf Noxen-Resistenz-Phänotypen: DD-WP 235 828 zurückge¬ griffen werden.
Die Erfindung betrifft schließlich auch noch spezielle Sal onella-Impfstamme, die gemäß Anspruch 20 Generations¬ zeiten von 28 bis 32 Minuten aufweisen sowie Varianten dieser Impfstamme, die höher bzw. geringerer attenuiert sein können und Generationszeiten zwischen 28 und 34 Minu¬ ten aufweisen. Anspruch 22 schließlich betrifft die Ver¬ wendung derartiger Impfstämme zur oralen Immunisierung von Küken sowie oralen oder parenteralen Immunisierung von Hühnern gegen Salmonella-Infektionen.
Die in den Ansprüchen und nachfolgenden Beispielen aufge¬ führten (sowie hinterlegten) Salmonella-Impfstämme (mit und ohne Ssq-Marker) stehen als Beispiel für alle nach gleichem Prinzip herstellbaren ImpfStammkandidaten mit abgestuften Attenuierungsgraden. Sie sind zur Herstellung immunogener Lebendimpfstoffe, insbesondere für Küken/Hüh¬ ner nach an sich bekannten Vermehrungsverfahren geeignet. Bezüglich der speziell angegebenen mit Ssq-Marker versehe¬ nen Impfstamme (Hinterlegungs-Nr. 8433, 8435, 9362, 8434, 8441, 8432) werden GenerationsZeiten von etwa 32 Minuten angegeben. Weitere spezielle Stämme mit Ssq-Markern haben Generationszeiten von 28 Minuten (Hinterlegungs-Nr. 9361) und 30 Minuten (Hinterlegungs-Nr. 9360). Diese Genera¬ tionszeitangaben sind nicht als einengende Begrenzung auf¬ zufassen. Bei stamm-abhängiger Virulenz (Invasivität/Kolo- nisierungs-Aktivitäts)-Unterschieden sind ggf. auch Gene¬ rationszeiten von 28 bis 34 Minuten als Attenuierungs- Äquivalent denkbar.
In der nachfolgenden Tabelle werden die für die unter¬ schiedlichen Serovare favorisierten Salmonella-Impfstämme noch einmal aufgeführt. - 19 -
Salmonella Impfstämme Labor- Hinterlegungs Serovar Klon Nummer Nummer typhimurium Ssq/Sm 60/Rif 42 4242 DSM 8433 enteritidis Ssq/Sm 24/Rif 12 4266 DSM 8435
Ssq/Sm 24/Rif 12 k 4298 DSM 9362 Ssq/Sm 24/Rif 12 g 4297 DSM 9361 Ssq/Sm 24/Rif 3 4296 DSM 9360 infantis Ssq/Sm 153/Rif 7 4289 DSM 8434 anatum Ssq/Sm 81/Rif 21 4279 DSM 8441 typhimurium Nal 2/Rif 9/ Rtt 4223 DSM 4232
Die Mikroorganismen wurden hinterlegt bei:
DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Mascheroder Weg 1 B D-38124 Braunschweig
Die Erfindung soll im folgenden anhand mehrerer Ausfüh¬ rungsbeispiele näher erläutert werden.
ERSÄTZBLÄΓT(REGEL26) Ausführungsbeispiele Material und Methoden
Verwendete Stämme
- Wildstämme
. S.typhimurium (S.tm) 415 (Metschnikow-Institut, Moskau) i.p. LD50 Maus < 101 cfu, Generationszeit etwa 22 Minuten . S.enteritidis (S.ent) 318 (Prof. Seibitz, Universität Leipzig) i.p. LD50 Maus etwa 105"0 cfu, Generationszeit etwa 22 Minuten . S.infantis (S.inf) (Dr. Beer, Veterinär-Untersuchungsamt Chemnitz)
Generationszeit etwa 22 Minuten . S.anatum (S.ana) (Dr. Beer, Veterinär-Untersuchungsamt Chemnitz)
Generationszeit etwa 22 Minuten
- Wildstämme mit neutraler Nalidixinsäure- und Streptomycin-Resistenz- markierung für den Nachweis der reduzierten Ausscheidung bei immuni¬ sierten Kücken/Hühnern
. S.tm Nal/Sm, Generationszeit etwa 22,5 Minuten
. S.ent Nal/Sm, Generationszeit etwa 22,5 Minuten
. S.inf Nal/Sm, Generationszeit etwa 22,5 Minuten
. S.ana Nal/Sm, Generationszeit etwa 22,5 Minuten
- Impfstämme als Beispiel auch für andere Zwei- oder Dreimarker-Mutan- ten mit geringerer (oder höherer) Attenuierung / entsprechend weni¬ ger oder mehr verlängerter Generationszeit
. S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42, Generationszeit etwa 31 Minuten
Labor-Nr. 4242; Hinterlegungs-Nr. DSM 8433 . S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12, Generationszeit etwa 32 Minuten
Labor-Nr. 4266; Hinterlegungs-Nr. DSM 8435 . S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k, Generationszeit etwa 32 Minuten
Labor-Nr. 4298; Hinterlegungs-Nr. DSM 9362 . S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, Generationszeit etwa 28 Minuten
Labor-Nr. 4297; Hinterlegungs-Nr. DSM 9361 S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3, Generationszeit etwa 30 Minuten Labor-Nr. 4296; Hinterlegungs-Nr. DSM 9360 S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7, Generationszeit etwa 31 Minuten Labor-Nr. 4289; Hinterlegungs-Nr. DSM 8434 S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21, Generationszeit etwa 32 Minuten Labor-Nr. 4279; Hinterlegungs-Nr. DSM 8441 S. tm Nal 2/Rif 9/ Rtt, Generationszeit etwa 32 Minuten Labor-Nr. 4223; Hinterlegungs-Nr. DSM 8432 als Prototyp-Impfstamm (mit optimaler Attenuierung für Kücken/ Hühner) zur Festlegung des "Attenuierungs-Aquivalenz verlänger¬ te) Generationszeit".
ERSÄTZBLAIT (REGEL 26) - 22 -
Nährmedien
- Nähragar (SIFIN, Berlin-Weißensee)
- Tryptose phosphate broth (Difco, USA)
Antibiotika
- Nalidixinsäure (CHINOIN, Budapest , Wildstämme MHK 6,2 μg/ml
- Streptomycin (Jenapharm , Wildstämme MHK 6,2 μg/ml
- Rifampicin (UBM, Bukarest , Wildstämme MHK 12,5 μg/ml
- Ciprofloxacin (Bayer , Wildstämme MHK 0,05 μg/ml
- Chloramphenicol (Berlin-Chemie , Wildstämme MHK 2,0 μg/ml
- Doxycyclin (Jenapharm , Wildstämme MHK 4,0 μg/ml
- Erytromycin (Abbott , Wildstämme MHK 60,0 μg/ml
Versuchstiere und Haltunqsbedinqungen
Hähnchenkücken von Brauneilegern aus verschiedenen Brüte¬ reien wurden in Käfigen zu 5 - 10 Tieren gehalten und mit Putenaufzuchtfutter sowie Wasser ad libitum gefüttert.
Orale Immunisierung
Gruppen zu je 10 Kücken erhielten innerhalb 36 Stunden nach dem Schlüpfen oder (zum Zwecke des Vergleiches und Ermittlung des optimalen Immunisierungsalters) am vierten Lebenstag einmal oral 109 cfu, teilweise 108 cfu, des jeweiligen ImpfStammes in den Schlund appliziert. Die Immunisierung unter Praxisbedingungen ist auch über das Trinkwasser möglich. (Nach vorausgegangenem Wasserentzug für 4 Stunden wird eine Trinkwassermenge von 2ml/Kücken binnen 3 Stunden aufgenommen.
Orale Infektion
Zwei bis vier Wochen nach der oralen Immunisierung erhiel¬ ten die Kücken oral mittels Pipette 106 (oder 107) cfu des jeweiligen neutral markierten homologen Wildstammes. Nachweis der Ausscheidung des/der
- Impfstamme S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7 und S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21: Nährmedien mit 100 μg Rifampicin und 200 μg Strepto- mycin/ml
- ImpfStammes S.tm Nal 2/Rif 9 ohne und mit Rtt-Marker: Nährmedien mit 100 μg Rifampicin und 12,5 μg Nalidixin- säure/ml
- neutral Nal/Sm markierte Wildstämme:
Nährmedien mit 100 μg Nalidixinsäure und 200 μg Strepto- mycin/ml
Pro Kückengruppe und Untersuchungstag wurden jeweils fünf frische Kotproben in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und zusätzlich die Verdünnungen 10"1 bis 10~4 hergestellt.
- Quantitative Bestimmung: Von der Originalsuspension und den Verdünnungen wurden 0,1 ml auf Nähragar mit je 1 % Lactose und Saccharose, 0,015 % Bromthymolblau (Bestim¬ mung der Coli/Enterobakterien-Keimzahlen) sowie parallel auf das gleiche Medium mit den entsprechenden Antibioti¬ ka ausgespatelt. Als quantitatives Maß für die Ausschei¬ dung bzw. die bei immunisierten Kücken im Vergleich zu den Kontrollen eingetretene Reduktion der Salmonella-Ko- lonisierung, wurde die Zahl der Salmonella-Kolonien zur Zahl der Enterobakterien-Kolonien als Promille-Wert be¬ rechnet.
- Qualitative Bestimmung: Der verbleibenden Originalsus¬ pension wurde Antibiotika-Bouillon zugesetzt. Nach 24 Stunden 37°C Bebrütung erfolgte die Abimpfung auf Nähr¬ agar mit den jeweiligen Antibiotika-Zusätzen. Die Bestätigung der angezüchteten Salmonellen erfolgte serologisch, biochemisch und durch Bestimmung der Marker.
Als quantitatives Maß für die Ausscheidung bzw. die bei immunisierten Kücken im Vergleich zu den Kontrollen einge¬ tretene Reduktion der Salmonella-Kolonisierung, wurde die Zahl der Salmonellen-Kolonien zur Zahl der Enterobakte- rien-Kolonien als Promille-Wert berechnet.
Beispiel 1
S.tm: Isolierung von spontanen chromosomalen Antibiotika- Resistenz-Klonen als (Nal-Stwd Ein- und) Nal/Rif-Stwd Zweimarker-Impfstamme mit abgestuft verlängerten Genera¬ tionszeiten zwischen etwa 29 bis 34 (Wildstamm etwa 22) Hinuten zwecks Isolierung eines Prototyp-Impfstammes für die Festlegung des "Attenuierungs-Aquivalenz (verlängerte) Generationszeit" für Stämme des gleichen Serovars bzw. Serovare mit nur mäßiger (S.ent) oder fehlender (S.inf und S.ana) Häusevirulenz
109 (und 10-**-0) cfu des Wildstammes werden auf Nähragar mit 100 μg (oder in zwei Schritten über 50 μg und nachfolgend 400 μg) Nalidixinsäure/ml gespatelt und etwa zwei Tage bei 37"C incubiert. Die Resistenz-Klone werden über Nähragar passagiert, auf erhaltene Resistenz kontrolliert und im Vergleich zum Wildstamm die weniger oder mehr verminderte Extinktion (Spekol mit Röhrchenansatz, Zeiss-Jena, Wellen¬ länge 650 nm, Startkeimzahl 107 cfu, Bebrütung im Schüt- tel-Wasserbad für 3 Stunden bei 37°C) bestimmt. Von geeig¬ net erscheinenden Klonen wird im Abbott MS-2 Testsystem die Generationszeit gemessen. Vom Klon Nal 2 mit einer Ge¬ nerationszeit von etwa 28 (Wildstamm etwa 22) Minuten wer¬ den, wie oben beschrieben, auf Nähragar mit 400 μg Rif- ampicin/ml Resistenz-Klone gewonnen, von diesen Genera¬ tionszeit bestimmt und die Nal 2/Rif-Klone mit abgestuft verlängerten Generationszeiten zwischen etwa 29 und 34 Minuten für die Festlegung des Richtwertes (verlängerte) "Generationszeit als Attenuierungs-Äquivalent" herangezo¬ gen (siehe Beispiel 3).
Beispiel 2
Nachweis erhaltener Kolonisierungsaktivität der neutral Nal/Sm markierten S.tm, S.ent, S.inf und S.ana Wildstämme bei 17 bis 25 Tage alten Kücken
Kücken im Alter von 17 bis 25 Tage erhielten oral mittels Pipette 106 (107) cfu der neutral markierten Wildstämme. Über einen Zeitraum von zehn bis 15 Tagen wurde die quantitative Salmonella-Kolonisierungsdichte im Vergleich zur Enterobakterien-Keimzahl ermittelt.
Bei dem gewählten Infektionsmodell (Dosis 106 bis 107 cfu) erfolgt nach oraler Infektion entweder bereits nach 24 Stunden die Ausscheidung der neutral markierten Wildstämme mit hohen Keimzahlen oder die Salmonella-Keimzahlen errei¬ chen schrittweise ihre höchsten Werte im Kot erst zwischen dem dritten und sechsten Tag (Maximalwerte bei 50 Promil¬ le-Anteil an der Gesamt-Enterobakterien-Flora) . Nach acht bis zehn Tagen fällt die Salmonella-Koloniezahl auf einen 1,0 bis 0,1 Promille-Anteil der Enterobakterien-Flora ab und bleibt in dieser Größenordnung über eine längere Zeit bestehen.
Diese Kolonisierungs-Dynamik beweist, daß die neutral Nal/Sm markierten Wildstämme zur Erfassung einer reduzier-
ERSArZBLÄTT(REGEL26) ten Wildstamm-Kolonisierung bei immunisierten Kücken ge¬ eignet sind.
Beispiel 3
Festlegung des S.tm Nal 2/Rif-Prototyp-ImpfStammes mit optimal/em (verlängerter) Generationszeit/Attenuierungs- grad für Kücken/Hühner an Hand der Relation maximal mögli¬ che(r) Generationszeit-Verlängerung/Attenuierungsgrad bei noch optimaler Reduktion der Wildstamm-Ausscheidung, zwecks Ermittlung des "Attenuierungs-Aquivalenz (verlän¬ gerte) Generationszeit" für Stämme des gleichen Serovars bzw. Serovare mit mäßiger oder fehlender Virulenz für Mäuse
Kücken im Alter von 36 Stunden wurden einmal oral mit 109 cfu der verschiedenen Stämme aus dem Set von S.tm Zweimarker-Impfstammen mit zwischen 29 und 34 Minuten abgestuften Generationszeiten immunisiert und nach zwei Wochen oral mit 106 cfu des Wildstammes belastet. Parallel wurden Kontroll-Kücken gleichen Alters oral infiziert.
Im Vergleich zu den Kontrollen scheiden die immunisierten Kücken, welche die Impfstamme mit abgestuften Generations¬ zeiten zwischen 29 bis 32 Minuten erhielten, den Wild¬ stamm, insbesondere in den ersten fünf bis zehn Tagen nach dem oralen Challenge, deutlich vermindert aus (gemessen am Promille-Anteil der Enterobakterien-Besiedlungsdichte) . Die Differenzen betragen (mit der Zeit abnehmend) bis zu zwei Zehnerpotenzen. Ab sechsten bis zehnten Tag nach der oralen Belastung gleichen sich die Salmonellen-Besied- lungsdichten bei immunsisierten Kücken denen von den Kon¬ trollen (im 0,1 Promille-Bereich der Enterobakterien-Keim- zahlen) an. In Einzelfällen zeigen allerdings immunsierte Kücken eine verminderte Ausscheidung in der Größenordnung von einer log-Stufe auch noch nach dem zehnten Tag.
Bei Impfstammen mit GenerationsZeiten > 33 Minuten ist die Wildstamm-Ausscheidung vergleichsweise geringer reduziert, wobei die Differenz zu den Kontrollen in der Regel eine Zehnerpotenz nicht überschreitet.
Auf Grundlage der Relation: "Maximal mögliche(r) Genera¬ tionsz.eit-Verlängerung/Attenuierungsgrad bei noch optima¬ ler Reduktion der Wildstamm-Ausscheidung", wurde der S.tm Nal 2/Rif 9 mit einer Generationszeit von etwa 32 Minuten (und einer i.p. LD5Q Maus von etwa 106 cfu) als Prototyp¬ impfstamm ermittelt und seine (verlängerte) Generations¬ zeit von etwa 32 Minuten als Richtwert "Attenuierungs- Äquivalent" eingesetzt.
Beispiel 4
Erkennung/Nachweis des für Kücken/Hühner optimal atte- nuierten Salmonella typhimurium Klons S.tm Nal 2/Rif 9 (i.p. D50 Maus etwa 106-0 (Wildstamm etwa 101) cfu; Gene¬ rationszeit als Attenuierungs-Äquivalent von etwa 22 auf 32 Minuten verlängert) als zu favorisierenden Impfstamm über die durch i.p. und orale Immunisierung vermittelte gleichhohe Schutzwirkung gegen eine Toxoinfektion; (im Hinblick auf die sinngemäße Übertragung dieser Gesetz¬ mäßigkeiten auf weitere "Enteritidis"-Salmonellen):
a) Vortest zum Nachweis der extrem differierenden Empfäng¬ lichkeit von Kücken/Hühnern und Mäusen für Salmonella typhimurium durch Bestimmung der i.p. LD50-Werte von S.tm Wildstamm und S.tm Nal 2/Rif 9 Impfstamm für Kücken und Mäuse
Die unterschiedlichen i.p. LD^g-Werte für Mäuse und Zwei-Tage Kücken von S.tm Wildstamm und dem S.tm Nal 2/Rif 9 Impfstamm sowie zusätzlich der i.p. LD5Q- ert des Wildstammes für Kücken im Alter von 17 Tagen, sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
S.tm Wildstamm und S.tm Nal 2/Rif 9 Impfstamm: Vergleichende i.p. LD5Q- Werte bei Mäusen und Kücken
Zwei-Tage 17-Tage ICR Kücken Kücken Mäuse S.tm (cfu) (cfu) (cfu)
Wildstamm. 106 108 ιoi
Nal 2/Rif 9 107 n.t. 106
Die LDsQ-Werte für Kücken und Mäuse in Tabelle 1 ver- deutichen die geringere Empfänglichkeit der Kücken für S.tm, welche durch einen geringeren Attenuierungsgrad der Impfstamme kompensiert werden muß.
Erkennung des für Kücken/Hühner optimal attenuierten Salmonella typhimurium ImpfStammes (ohne und mit Rtt- Marker als Impfstamm-optimierende Envelope-Mutation) über die durch i.p. und orale Immunisierung vermittelte gleichhohe Schutzwirkung gegen eine Toxoinfektion
Als Kriterium "optimale Attenuierung" dienten die durch einmalige
- i.p. Immunisierung am zweiten Tag nach dem Schlüpfen mit dem Impfstamm S.tm Nal 2/Rif 9 und dem für Kücken überattenuierten Stämmen S.tm Pur" (i.p. LD50 Maus 107-5 cfu) und Zoosaloral (i.p. LD50 108,2 cfu): sie¬ he Tabelle 2
- orale Immunisierung binnen £ 36 Stunden oder am vier¬ ten Tag nach dem Schlüpfen mit S.tm Nal 2/Rif 9; S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt; sowie dem für Kücken überattenuier¬ ten Kälber Impfstoff Zoosaloral: siehe Tabelle 3 erreichbaren gleichen Schutzwerte gegen eine zwei Wo¬ chen später erfolgende etwa LD^-Toxoinfektion.
Tabelle 2 Tabelle 3
Erreichbare Immunität ge¬ Erreichbare Immunität gegen gen eine Toxoinfektion eine Toxoinfektion bei ein¬ bei einmaliger i.p. Immu¬ maliger oraler Immunisierung nisierung am zweiten Le¬ mit 109 cfu der Impfstämme benstag mit 106 cfu von und dem für Kücken überatte- Mutanten unterschiedli¬ nierten Zoosaloral; Belastung cher Attenuierungshöhe; am 16. Lebenstag mit i.p. Belastung am 16. Lebens¬ 3xl08 cfu S.tm Wildstamm tag mit i.p. 3xl08 cfu (Mittelwert aus vier Versu¬ des Wildstammes (Mittel¬ chen) wert aus drei Versuchen) orale Immunisierung am S.tm- 2.d 4.d
Impfstamm/ mit i.p. Belastung Teststamm (cfu) Letalität (%)
i.p.Immunisierung:10° cfu Nal 2/ 109 23 35
S.tm i.p. Belastung Rif 9 108 27 n.t.
Impfstamm/ Letalität
Teststamm ( ) Nal 2/ ιo9 24 40 Rif 9 Rtt 108 26 n.t.
Figure imgf000032_0001
Pur-81 25 Zoosal¬ 109 42 60
Zoosaloral 30 oral 108 47 65
Kontrolle 75 Kontrolle 75
Die Tabelle 2 zeigt, daß die einmalige i.p. Immunisierung mit allen Impfstämmen die Letalität einer unphysiologi¬ schen Toxoinfektion von etwa 75 % auf < 30 % senkt. Wie Tabelle 3 ausweist, wird diese Letalitätssenkung —— im Gegensatz zum Zoosaloral und Stoffwechseldrift-Mutanten mit Generationszeiten > 33 Minuten und i.p. LD50 > lO^-5 cfu →— auch durch die einmalige orale Immunisierung mit dem Impfstamm S.tm Nal 2/Rif 9 (ohne und mit Rtt-Marker) erreicht. D.h. dieser Impfstamm ist demzufolge für Kücken optimal attenuiert.
Weitere Informationen der Tabelle 3 zeigen die
- überatte uierung des Kälberimpfstoffes Zoosaloral
- bezüglich des Schutzes gegen eine Toxoinfektion weniger effektive Immunisierung am vierten Lebenstag. Dies ist vermutlich Folge der am vierten Lebenstag höheren Kolo¬ nisationsresistenz, welche die Translokations- und Pene¬ trationsraten der Impfstamme beeinflussen dürfte.
Beispiel 5
S.tm, S.ent, S.inf und S.ana: Isolierung von spontanen Antibiotika-Resistenz-Klonen als (Ein- und) Zweimarker Impfstämme mit optimaler Attenuierung für Kücken/Hühner mit Hilfe des "Attenuierungsäquivalenz (verlängerte) Generationszeit" (siehe auch Beispiel 1)
10*2 bis 10-**-0 cfu der Wildstämme werden auf Nähragar mit 400 μg Streptomycin/ml gespatelt und etwa zwei Tage bei 37°C incubiert. Die Resistenz-Klone werden über Nähragar passagiert, anschließend auf erhaltene Resistenz kontrol¬ liert, im Vortest die im Vergleich zum Wildstamm weniger oder mehr verminderte Extinktion (Spekol mit Röhrchenan¬ satz, Zeiss-Jena, Wellenlänge 650 nm, Startkeimzahl 107 cfu, Bebrütung im Schüttelwasserbad für drei Stunden bei 37°C) bestimmt (siehe Beispiel 1) und bei geeignet er-
ERSÄTZBLÄTT(REGEL26) scheinenden Klonen die Generationszeit mittels des Abbott MS-2 Testsystems gemessen. Von Klonen mit um drei bis sechs Minuten verlängerter Generationszeit werden im zwei¬ ten Schritt sinngemäß wie oben beschrieben Rifampicin-Re- sistenz-Klone (Nähragar mit 400 μg Rifampicin/ml) gewon¬ nen, von diesen die Generationszeit bestimmt und Sm/Rif- Klone mit einer Generationszeit von etwa 28 bis 32 Minuten als Zweimarker-Impfstamme favorisiert. (Die Verwendung der Sm-Stwd-Attenuierung anstelle der Nal-Stwd ist vorteil¬ haft, da der Ssq-Marker (siehe Beispiel 6) als Envelope- Mutation —— in z.B. Sm/Rif Impfstammen (bei Verzicht auf eine Nal-Stwd-Attenuierung als Gyrase-Mutation) auch gegen das derzeit wirksamste Antibiotikum Ciprofloxacin eine Supersensibilität vermittelt).
Beispiel 6
Zusätzlicher Einbau eines Impfstamm-optimierenden/-Akzep- tanz-erhöhenden Ssq("Sicherheits-/ und Therapie")-Markers in die Wild- bzw. Impfstamme
Eine frische Kultur wird in PBS suspendiert und mit 100 μg/ml N-Methyl-N -Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNG, ZIMET- Jena) bis zur Überlebensrate von etwa 10 % behandelt. Nun¬ mehr wird für zwei Stunden bei 37°C in Nährbouillon mit 0,4 μg Chloramphenicol bebrütet und nachfolgend die klas¬ sische Behandlung mit 1000 IU Penicillin/ml durchgeführt. Durch Stempeltechnik werden Klone mit fehlendem Wachstum auf Nähragar mit 0,4 μg Chloramphenicol (0,01 μg Cipro¬ floxacin, 1,0 μg Doxycyclin)/ml gewonnen. Als Ssq (Super- sensitivity to quinolones)-Stämme werden solche Klone de¬ finiert und als Impfstamm-optimierender/-Akzeptanz-er- höhender Sicherheits- und Therapie-Marker genutzt, welche - auf Nähragar mit 0,4 μg Chloramphenicol, 0,01 μg Cipro¬ floxacin oder 1,0 μg Doxycyclin (sowie meist 30 μg Ery- thromycin)/ml nicht wachsen
- eine anzustrebende Reversionshäufigkeit von < 10~7 auf¬ weisen.
Die Reversionshäufigkeit der Envelope-Mutation wird besser auf Nähragar mit 20 oder 30 μg Erythromycin/ml bestimmt, da bei den hohen Keimzahlen sich auf Cipro loxacin, Chlor¬ amphenicol oder Doxycyclin das Restwachstum zu einer um etwa zwei Stufen höheren Konzentration hin verschiebt.
Klone mit Ssq-Marker, welche durch Mutagen-Behandlung keine oder eine nur unwesentliche, Ko-Mutation bedingte, Generationszeitverlängerung/Attenuierung erfahren, sind als Impfstamme geeignet.
Beispiel 7
Erkennung der für Kücken/Hühner optimal attenuierter S. typhimurium, S. enteritidis, S. infantis und S. anatum Impfstamme über den Nachweis der erhaltenen bzw. restli¬ chen Invasivität der Stoffwechseldrift (Stwd) Einmarker- Mutanten und Zweimarker-Impfstämme für Kücken
< 36 Stunden alte Kücken werden mit 109 cfu der jeweiligen Wildstämme, Stwd-Einmarker-Mutanten bzw. Stwd-Zweimarker- Mutanten oral infiziert. Nach fünf und acht Tagen werden die Kücken getötet, die steril entnommene Leber homogeni¬ siert, auf Nähragar ausgestrichen und das restliche Mate¬ rial mit Nährbouillon versetzt. Die gewachsenen Kolonien bzw. Kulturen werden auf 0-Gruppen-Identität und Marker geprüft. Nach fünf Tagen liegen bei S.typhimurium und S.enteritidis die Keimzahlen/Gramm Leber in der Größenordnung um 103 cfu, nach acht Tagen im Bereich um 102 cfu. Demgegenüber bewegen sich nach fünf Tagen bei S.infantis und S. natum die Keimzahlen im Grenzbereich der quantitativen Erfassung um 10***- bis < 102 cfu und nach acht Tagen gelingt der Nach¬ weis oft nur noch über die Anreicherung. Diese für S.infantis und S.anatum gefundenen niedrigeren Keimzah¬ len/Gramm Leber korrelieren offensichtlich mit der von Methner, U. (Dissertation Universität Leipzig, Veterinär¬ medizinische Fakultät, 1991) berichteten Beobachtung, daß S.infantis für Hühner vermindert invasiv ist.
Die generell erhaltene Invasivität der favorisierten Impf¬ stämme (und Einmarker-Mutanten) , welche — gemessen an den angezüchteten Koloniezahlen —— nicht ganz die Werte der homologen Wildstämme erreicht, ist für den Impferfolg offensichtlich essentiell (Barrow, P.A. et al. Res. Micro- biol., 1990, 141, 851-853).
Beispiel 8
Ermittlung der prozentualen Häufigkeit und Dauer der Aus¬ scheidung des ImpfStammes S.tm Nal 2/Rif 9 ohne und mit Rtt-Marker nach oraler Immunisierung von < 36 Stunden alten Kücken und des S.tm Nal 2/Rif 9 nach oraler Immuni¬ sierung von vier Tage alten Kücken:
Die prozentuale Häufigkeit in den untersuchten Kotproben und die maximal nachweisbare Ausscheidungsdauer des Impf¬ stammes ohne und mit Rtt-Marker in Abhängigkeit vom Alter der Kücken bei der oralen Immunisierung ist in Abbildung 1 aufgezeichnet. Abbildung 1
Häufigkeit (Prozentsatz positiver Proben nach Anreiche¬ rung) und Dauer (letztmalig positiver Befund, Nachweis¬ grenze etwa 10 Keime/Gramm Kot) der Ausscheidung der Impf¬ stämme S.tm Nal 2/Rif 9 ohne ( • ) und mit Rtt-Marker
( Λ — — ) nach einmaliger oraler Immunisierung < 36 Stunden alter Kücken mit 109 cfu sowie mit S.tm Nal 2/Rif 9 (Einzel-Meßwerte nicht eingetragen. ( ■ )) am vier¬ ten Lebenstag. (Mittelwerte aus drei bis fünf Versuchen)
Prozentualer Anteil postärer Kotprobeπ
Figure imgf000037_0001
"T'™τ~,γ— ^"T- T→"
10 IS .20 2S 30
Tage πβert Jm υnisjerυng
ERSATZBLATT (REGE 26) Der Abbildung 1 sind folgende Fakten zu entnehmen
- Bei Immunisierung binnen < 36 Stunden nach dem Schlüpfen wird der S.tm Nal 2/Rif 9 über die geprüften 32 Tage hinaus ausgeschieden. Nach Einbau des Rtt-Markers wird drei Wochen nach der Immunisierung der Impfstamm nur noch selten nachgewiesen.
- Bei der Immunisierung am vierten Tag wird der S.tm Nal 2/ Rif 9 (ohne Rtt-Marker), offensichtlich bedingt durch die in diesem Alter bereits vorhandene, über Anaerobier ver¬ mittelte Kolonisationsresistenz, nach dem 18. Tag nur noch gelegentlich nachgewiesen.
- Analog hierzu ist die prozentuale Häufigkeit positiver Anreichungskulturen. Bezogen auf die orale Immunisierung binnen 36 Stunden gelingt der Nachweis von S.tm Nal 2/ Rif 9 am 13. Tag noch in etwa 90 % der Proben, beim mit dem Rtt-Marker optimierten Impfstamm sind nur noch etwa 40 % der Kotproben positiv.
Die Kolonisierungsdynamik der als Impfstämme favorisierten S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, S.inf Ssq/ Sm 153/Rif 7 und S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21 wurde dadurch cha¬ rakterisiert, daß, nach oraler Applikation von 109 cfu bin¬ nen 36 Stunden nach dem Schlüpfen, der Anteil des jewei¬ ligen Salmonella-ImpfStammes an der Enterobakterien-Flora in den abgesetzten Kotproben über einen Zeitraum von zwei Wochen untersucht wurde. Dabei zeigten die favorisierten Impfstamme (s.o.) ein dem Impfstamm S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt vergleichbares Ausscheidungsverhalten. Beispiel 9
Reduktion der quantitativen Ausscheidung homologer neutral Nal/Sm markierter Wildstämme bei immunisierten Kücken im Vergleich zu Kontrollen
Die im Alter von < 36 Stunden mit den Impfstammen S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt, S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3, S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7 bzw. S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21 monovalent oral immunisierten Kücken wurden parallel zu gleichaltrigen Kontrollen am 17. Lebenstag mit 106 (teilweise 107) cfu des jeweils homologen Wildstammes infiziert.
Im Vergleich zu den Kontrollen scheiden die immunisierten Kücken den Wildstamm, ■«—in Übereinstimmung zu den mit S.tm
Prototyp-Impfstamm Nal 2/Rif 9 erzielten Ergebnissen , insbesondere in den ersten fünf bis zehn Tagen nach dem oralen Challenge, deutlich vermindert aus (gemessen am Pro¬ mille-Anteil der Enterobakterien-Besiedlungsdichte) . Die Differenzen betragen (mit der Zeit abnehmend) bis zu zwei Zehnerpotenzen. Ab sechsten bis zehnten Tag nach der oralen Belastung gleichen sich die Salmonellen-Besiedlungsdichten bei den immunisierten Kücken denen von den Kontrollen (im 0,1-Promille-Bereich der Enterobakterien-Keimzahlen) an. In Einzelfällen zeigen allerdings immunisierte Kücken eine verminderte Ausscheidung in der Größenordnung von einer log-Stufe auch noch nach dem zehnten Tag.
Eine vollständige Eliminierung der Sal onellen beim infi¬ zierten Einzeltier ist kaum zu erwarten, da, bis auf S.gallinarum pullorum, diese Erreger bei Hühnern sich offensichtlich wie eine "Normalflora" verhalten. Die stark reduzierte Ausscheidung bei immunisierten Kücken/Hühnern, in Verbindung mit Hygienemaßnahmen, dürfte jedoch mittel¬ fristig zu Salmonella-freien Hühnerbeständen führen.
Beispiel 10
Erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Detergentien
Die Impfstamme S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, S.ent Ssq/Sm 24/ Rif 3, S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7, S.ana Ssq/Sm 81/ Rif 21, S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt zeigen im Vergleich zu Wild¬ stämmen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber anionischen Detergentien, insbesondere Natriumdodecylsulfat (SDS). So zeigen die Impfstamme auf geeigneten (zweckmäßigerweise proteinfreien) Nährmedien bei einer Konzentration von 0,5 mg SDS/ml kein Wachstum, während die Wildstämme bei 5 mg SDS/ml wachsen.
In physiologischer Kochsalzlösung suspendierte Impfstämme werden durch 5 mg SDS/ml bei Zimmertemperatur innerhalb von 30 min zu ca. 90 % lysiert, Wildstämme zeigen dagegen le¬ diglich eine Lysisrate von ca. 10 %.
Aus diesen Beobachtungen kann auf eine erhöhte Empfindlich¬ keit bzw. verkürzte Überlebensfähigkeit der Impfstamme in der Umwelt und insbesondere bei hygienischen Reinigungsma߬ nahmen geschlossen werden. Beispiel 11
Abtrennung der Impfst mme von Wildstämmen:
Die Abtrennung von Wildstämmen erfolgt beim
- S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12, S.ent Ssq/ Sm 24/Rif 12k, S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g, S.ent Ssq/Sm 24/ Rif 3, S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7 und S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21 durch ihre Resistenz gegen 100 μg Rifampicin und 200 μg Streptomycin/ml Nähragar sowie das fehlende Wachstum auf Nähragar mit 0,4 μg Chloramphenicol (oder 0,01 μg Cipro¬ floxacin, 1 μg Docycyclin bzw. 30 μg Erythromycin)/ml.
- S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt durch seine Resistenz gegen 100 μg Rifampicin und 12,5 μg Nalidixinsäure*/ml Nähragar sowie durch das fehlende Wachstum auf Nähragar mit 30 μg Erythromycin/ml.
(Die geringere Nalidixinsäure-Resistenz des Rtt-Stammes gegenüber dem Nal 2/Rif 9 Ausgangsstamm ist Folge der die Permeabilität der outer membrane veränderten (nach¬ träglich eingebauten) Rtt-Mutation) .
Beispiel 12
Massenkultur, Präparation und Anwendung der Impfstamme:
Zur Herstellung der Lebendimpfstoffe werden die (Zweimar- ker-Impfstamme ohne Ssq-Marker oder)Dreimarker-Impfstamme mit Ssq-Marker in einem geeigneten Vollmedium als Flüssig¬ kultur bis zum Ende der logarithmischen Phase gezüchtet. Die Bakteriensuspensionen werden mit einem üblichen Stabi¬ lisator versetzt und lyophilisiert.
Die so erhaltenen Impfstoffe werden in der Regel als einma¬ lige orale Dosis von 108 bis 109 cfu an < 36 Stunden alte Kücken verabfolgt. Hühner erhalten vor der Legeperiode eine in der Regel einmalige Immunisierung/Boosterung oral mit 109 cfu parenteral mit etwa 108 cfu.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens eines attenuierten immunogenen Salmonella-LebendimpfStammes, der mit einem eine Sensi¬ bilität gegenüber Makrolid-Antibiotika verleihenden Marker (Envelope-Marker) versehen ist, zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes für einen bestimmten Wirt, der im Falle einer von ihm verursachten Infektion eines an¬ deren Wirtes eine effektive therapeutische Behandlung des infizierten Wirtes mittels Makroliden ermöglicht.
2. Salmonella-Lebendimpfstoff, hergestellt aus mindestens einem attenuierten immunogenen Lebendimpfstamm, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstamm mit einem Envelope- Marker versehen ist, der dem Impfstamm, neben einer ge¬ gebenenfalls vorliegenden Makrolid-Sensibilität, eine erhöhte Sensibilität gegenüber einem speziellen thera¬ peutisch wirksamen Antibiotikum mit Ausnahme von Makro¬ liden verleiht.
3. Lebendimpfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Impfstamm zur Attenuierung mit minde¬ stens einer chromosomalen Antibiotikaresistenzmutation versehen ist, welche die erhöhte Sensibilität gegenüber den therapeutisch wirksamen Antibiotikum nicht aus¬ schließt.
4. Lebendimpfstoff nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Envelope-Marker dem Impfstamm eine erhöhte Sensibilität gegenüber einem Antibiotikum aus der Gruppe der Chinolone, Chloramphericole oder Tetra- cycline verleiht.
5. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich¬ net, daß der Envelope-Marker dem Impfstamm eine erhöhte Sensibilität gegenüber dem Antibiotikum Ciprofloxacin verleiht.
6. Lebendimpfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da¬ durch gekennzeichnet, daß der Impfstamm zur Attenu¬ ierung eine Strepto ycin-Resistenz und/oder Rifampicin- Resistenz Stoffwechseldrift-Mutation aufweist.
7. Lebendimpfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, da¬ durch gekennzeichnet, daß er mindestens einen Impfstamm eines Serovars der O-Gruppen B (z.B. Salmonella typhi¬ murium), D (z.B. Salmonella enteritidis), C (z.B. Sal¬ monella infantis) und E (z.B. Salmonella anatum) als Mono-, Bi-, Tri- oder Tetra-Vakzin enthält.
8. Lebendimpfstoff nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich¬ net, daß die
- Mono-Vakzine aus dem Impfstamm S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42 (Nr.4242; Hinterlegungs-Nr. DSM 8433) oder S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt (Nr. 4223; Hinterlegungs-Nr. DSM 8432) oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12 (Nr. 4266; Hinterlegungs- Nr. DSM 8435) oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k (Nr. 4298; Hinterlegungs-Nr. DSM 9362) oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g (Nr. 4297; Hinterlegungs-Nr. DSM 9361) oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3 (Nr. 4296; Hinterlegungs-Nr. 9360) besteht,
Bi-Vakzine aus einem obigen S.tm Impfstamm und dem S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12 oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k oder S.ent/Ssq/Sm 24/Rif 12g oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3 bestehen,
ERSATZβLArr(REGEL26) Tri- oder Tetra-Vakzine wahlweise aus einem obigen S.tm Impfstamm; S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12 oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g oder S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3; S.inf Ssq/Sm 153/Rif (Nr. 4289; Hinterlegungs-Nr. DSM 8434) und/ oder S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21 (Nr. 4279; Hinterlegungs-Nr. DSM 8441) bestehen.
9. Lebendimpfstoff zur oralen Immunisierung von Kücken so¬ wie oralen oder parenteralen Immunisierung/Boosterung von Hühner gegen Salmonella-Infektionen, hergestellt aus mindestens einem attenuierten immunogenen Impf¬ stamm, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der zur Herstellung ausge¬ wählte Impfstamm eine Generationszeit von etwa 28 bis 34 Minuten hat.
10. Verfahren zur Herstellung eines optimal in seiner Attenuierungshöhe auf den Wirt abgestimmten Salmonella- LebendimpfStoffes, hergestellt aus mindestens einem attenuierten, immunogenen Salmonella-Lebendimpfstamm, dadurch gekennzeichnet, daß Impfstamme mit einer für den Wirt geeignet verlängerten Generationszeit als Attenuierungsäquivalent eingesetzt werden, wobei die bestimmt verlängerte Generationszeit eines für einen Wirt geeigneten ImpfStammes (Serotyp) einmalig in ei¬ ner Untersuchung ermittelt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in der Voruntersuchung die für den Wirt geeignet verlängerte Generationszeit ausgehend von einem Set mit abgestuft gelängerten GenerationsZeiten bestimmt wird und als geeigneter Impfstamm derjenige aufgrund der Relation maximal mögliche Attenuierung/verlängerte Generationszeit und noch optimale Reduktion der Wild¬ stammausscheidung selektiert wird und gegebenenfalls dessen verlängerte Generationszeit als Attenuierungs¬ äquivalent auf andere Serotypen der gleichen Gattung übertragen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 zur Herstellung ei¬ nes optimal auf Kücken oder Hühner abgestimmten Impf¬ stoffes, dadurch gekennzeichnet, daß ein Impfstamm ausgewählt wird, dessen Generationszeit gegenüber dem Wildstamm von etwa 22 Minuten auf etwa 28 bis 34 Minu¬ ten verlängert ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Impfstamm aus einem Wildstamm er¬ halten wird, der zunächst mit einer Streptomycin (Sm)- oder Nalidixinsäure (Nal)-Markierung versehen wird, die eine Generationszeitverlängerung von 22 auf 25 bis 29 Minuten bewirkt und dann als weiterer Generations¬ zeit verlängernder Marker ein Rifampicin (Rif)-Marker eingebaut wird, und aus den dann erhaltenen Klonen diejenigen mit einer Generationszeit von 28 bis 34 Mi¬ nuten als geeignete Impfstämme isoliert werden und nach Auswahl eines Impfstammes aus diesem Impfstamm mit an sich bekannten Methoden der Impfstoff herge¬ stellt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Salmonella-Servovare z.B. Sal¬ monella typhimurium (S.tm), Salmonella enteriditis (S.ent), Salmonella infantis (S.inf) und Salmonella anatum (S.ana) verwendet werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß von den Sm-Rif-Stoffwechseldrift-Kombinationen bei
- S.tm ein Impfstamm mit der Generationszeit von etwa 31 Minuten (und einer i.p. LD50 Maus von etwa 105 (Wildstamm etwa 101) cfu)
- S.ent ein Impfstamm mit der Generationszeit von etwa 28 Minuten (und einer i.p. LD5Q Maus von etwa 107 (Wildstamm etwa 105) cfu)
- S.inf ein Impfstamm mit der Generationszeit von etwa
31 Minuten
- S.ana ein Impfstamm mit der Generationszeit von etwa
32 Minuten
als eine für Kücken/Hühner optimal attenuierte Vakzine eingesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß in den Sm/Rif-Impfstamm ein die Sensibilität für Ciprofloxacin (Chloramphenicol, Doxy¬ cyclin, etc.) um etwa das Vierfache erhöhender und gleichzeitig geringgradig die Ausscheidung und Überle- bensfähigkeit in der Außenwelt reduzierender Envelope- Marker eingebaut wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der die Sensibilität für Ciprofloxacin erhöhende Marker entweder in den Wildstamm oder in den Sm/Rif-Zweimarker-Impfstamm über Mutagenese und nach¬ folgend klassischem Penicillin-Screening in Gegenwart von 0,5 μg Chloramphenicol/ l eingebaut wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reihenfolge des Marker-Einbau¬ es beliebig variiert wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Vakzine Impfstamme ohne Enve¬ lope-Marker Anwendung finden.
20. Salmonella-Impfstämme mit Generationszeiten von 28 bis 32 Minuten.
21. Salmonella-Impfstämme nach Anspruch 20 mit Hinterle¬ gungs-Nr. 8432, 8433, 8434, 8435, 9360, 9361, 9362 und/ oder 8441 und deren höher oder geringer attenuierten Varianten mit GenerationsZeiten zwischen 28 und 34 Mi¬ nuten.
22. Verwendung der Impfstamme gemäß Anspruch 20 oder 21 als Lebendimpfstoffe gemäß Anspruch 1 oder 2 zur ora¬ len Immunisierung von Kücken sowie oralen oder paren- teralen Immunisierung/ Boosterung von Hühnern gegen Salmonella-Infektionen.
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