WO1996011938A1 - Oligonucleotide and carcinostatic agent containing the same as active ingredient - Google Patents

Oligonucleotide and carcinostatic agent containing the same as active ingredient Download PDF

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cells
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Ken-Ichi Matsuo
Yoshikazu Sugimoto
Norio Masuko
Yuji Yamada
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Taiho Pharmaceutical Co Ltd
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Taiho Pharmaceutical Co Ltd
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide useful for the treatment and prevention of human cancer or its induction.
  • the antisense method is the target salt (15-30 igS3 ⁇ 43 ⁇ 43 ⁇ 4) This is a method of introducing into oligonucleotide ⁇ i vesicles and inhibiting cancer ftiS ⁇ ⁇ translation or translation.
  • the antisense method is classified into the antigene method and the anti-messenger method according to its purpose: ⁇ IJ.
  • Anti-messenger method targets messenger RNA: ⁇ 4. This is because a single-phased oligonucleotide is formed on the target- * IRNAOT to form a two-chain by Watson-click binding, and splicein Perform target RNA targeting with Plh or W ⁇ IS-specific RNA ⁇ S ⁇ in step 3: m. This: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ can target all RNA molecules, unlike the Antigene method. For this reason, many studies have been reported for the purpose of treating many pains, such as the c-myc gene (Nature, 328, 445-449, (1987)).
  • messenger RNA ⁇ T is produced in cells in a Jt ⁇ -like amount (particularly for cancer-causing factors), many antisense molecules are required to provide cells with. Therefore, it is considered that j is difficult at present, even if the potency is recognized at the cultured cell level.
  • the anticipation method forms an antisense by winding antisense on the target DNA.
  • the antigenic method is intended for the purpose of spreading into cells. Deemed suitable.
  • the essential element of this antigene method is kneeling in the free dustin connection. The formation of this Hoogsteen bond requires the presence of the S ⁇ iJ (homopurine Z homopyrimidine B ⁇ ij) of the Principle that is the subject of the DNA. I have.
  • an object of the present invention is to use this antigene method to selectively act on cancer cells and to use a useful oligonucleotide such as ⁇ W or a derivative thereof to induce cancer using an E3 ⁇ 4 * ⁇ ⁇ derivative. Prevention and treatment, and also a method to suppress the transcription of p120. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found that the dikH child ⁇ 120 is not found in most of the and ⁇ ma fabrics, but is found in various types of fibers (Cancer Research). ) ⁇ 8, 1244-1251 (1988)), we found that by specifically suppressing the expression of P120, it was possible to suppress cancer cell growth ⁇ ⁇ ⁇ . , And furthermore, 1353 Since the homopurine Z homopyrimidine region is formed in the homopyrimidine moiety, the anti-sense method is used to wrap the homopyrin homopyrimidine moiety with antisense triplets or sense elements to form HM ⁇ . The present invention has been found to show an effect superior to the anti-messenger method targeting liposome.
  • the present invention relates to an oligonucleotide having at least 15 3 ⁇ 4s of ⁇ ss ⁇ y and z described in No. 1 or a complementary g ⁇ of the 3 ⁇ 43 ⁇ 4a ⁇ , or a derivative thereof ife ⁇ . It is a method for preventing and treating cancer, which is intended to be administered to humans.
  • the present invention further obstructs a method of suppressing the transcription of p120 fe using an oligonucleotide that can be formed in the homopurine z homopyrimidine region of P120.
  • the oligonucleotide of the present invention corresponds to the homopurine Z homopyrimidine region of ⁇ 1 ⁇ P 1 20 ⁇ fe ⁇ translation initiation ⁇ J:
  • the thirteenth position is thymine, which may be used as such or may be replaced with adenine to make it puriner. That is, W in S ⁇ U No. 1 is thymine or adenine, and SEQ ID No. 2 is a homobrin library obtained by substituting W for A.
  • the oligonucleotide of the present invention has the number 1
  • the ⁇ ⁇ ⁇ product of the present invention comprises, in the same authentic product, 1 S Lh or a combination of each oligonucleotide having the number 1 W of ⁇ and ⁇ and their complementary oligonucleotides or a combination thereof. It can contain oligo nucleotides, and the mixing ratio of each oligonucleotide can be ffl.
  • the ⁇ product of the present invention is composed of a g ⁇ ffl carrier of a quasi-oligonucleotide and ⁇ ⁇ and is particularly useful for 'preventing or reversing cancer'.
  • Oligonucleotides of the present invention are generally prepared by using commercially available DNA The ability to fit together is possible. At this time, regarding phosphodiesters, methylphosphoate ( ⁇ a Patent No. 4
  • the oligonucleotide in the present invention has the effect of suppressing the expression of the p120 protein, similarly to this oligonucleotide, and its phosphodiestero bond is converted into a methylphosphoate bond or phosphorothioate. Or 5 'or 3' combined with DNA intercalator or lipophilic ⁇ Pg.
  • the oligonucleotide of the present invention has a strong t effect, an effect of suppressing p120 protein, and can be ⁇ ffl as a ⁇ S ⁇ in control.
  • oligonucleotide of the present invention in using the oligonucleotide of the present invention as g3 ⁇ 4 in humans, various administration forms can be adopted depending on the purpose of prevention or treatment.
  • oral preparations It may be any of a drug, an external preparation (eg, a patch such as a pad U, a table U, an ointment, a cream, a lotion, etc.), a ⁇ L nasal drop, etc., each of which is at the same time ⁇ ] « « It can be done by the method of translating.
  • agent according to the present invention ⁇ !, and add ⁇ ⁇ ⁇ agent, crumbling shelves, mmi ⁇ m ⁇ i ⁇ inversion, etc. i3 ⁇ 4t can.
  • excipients may be those which are converted in the art, such as m-sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium, potassium, marine cellulose, and fiber.
  • IJ includes water, ethanol, prono, 'nol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethyl cellulose, hydroxybutyral cellulose, hydroxypropyl starch, Methylcellulose, ethylcellulose, silk lacquer, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone, etc .; disintegrating agents include Wei starch, sodium alginate, powdered powder, Thorium, calcium, sodium laurinoresa, monoglyceride stearate,? LH, etc .; Named lakes are refined talc, stearin, borax, polyethylene glycol, etc .; ⁇ are sucrose, deemed, citric acid, etc.
  • Oral liquid is the invention ⁇ ! , Dwarf, buffering agent, stabilization b3 ⁇ 4, dwarf, etc., and can be converted to internal medicine, syro-U, elixir I, etc. by ordinary methods. These may be those listed in ⁇ 1.
  • the buffer include sodium citrate and the like, and examples of stable agents include tragacanth, gum arabic, and seratin.
  • the preparation of the preparation can be carried out by adding a pH regulator, a buffer, a stable agent, im, topical, etc. to the compound of the present invention according to a conventional method to obtain a subcutaneous, intramuscular and intravenous lake preparation.
  • Examples of the pH-adjusting mouthwash of ⁇ include sodium citrate, sodium, sodium phosphate and the like.
  • Stable! There are sodium pyrophosphate, EDTA, thioglycone, thiolactic acid, etc.
  • As the local ⁇ there can be mentioned, for example, assassin prosthesis fiber lidocaine.
  • Examples include sodium chloride and glucose.
  • the shelves are used in the industry for the application of ⁇ , such as polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglyceride, etc., and, depending on the case, the interface iSWJ such as Tween ( ⁇ trademark). After the addition, it can be manufactured by an ordinary method.
  • ⁇ such as polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglyceride, etc.
  • the interface iSWJ such as Tween ( ⁇ trademark).
  • the ointment may be prepared by mixing and inverting the so-called “inverted”, “amu”, “mmu” or “health J” as needed according to the present invention.
  • liquid paraffin, white petrolatum, beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin, etc. can be mentioned.
  • the lakes include methyl paraoxybenzoate, parahydroxybenzoyl and propinoca paraoxybenzoate.
  • an ordinary ointment, cream, gel, base, etc. may be applied in a conventional manner.
  • cotton, swoosh, lee Decorative, ⁇ iBW ⁇ softened beer, polyethylene or polyurethane film or foam sheet is suitable.
  • the present invention ⁇ may be administered in the form of a capsule in a liposome, and 3 ⁇ 4S ⁇ may be dispersed in fat tt® in a hard child composed of a viscous aqueous concentric layer, or may be administered in another form. It may be contained in the form of m3 ⁇ 4a ⁇ ⁇ ⁇ can be in both water and fat tt or in H3 ⁇ 4 in a form called ribosome transfusion, depending on its solubility.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 2 ⁇ may be, for example, a phospholipid such as lecithin, a steroid such as cholesterol, a somewhat ionic interface, or a Stt agent such as dicetylphosphoric acid, stearylamine, or phosphatidic acid and Z or other substances that are toxic.
  • the diameter of the ribosome is between about 15 nm and about 5 microns.
  • the ⁇ Jt of the oligonucleotide of the present invention in »J is preferably a force that varies depending on» J 3 ⁇ 41 to 70 fiS% 3 ⁇ 4JS.
  • the administration method according to the present invention is not particularly limited, and may be appropriately determined depending on each SIS ⁇ swelling, the age of the patient, IJ and other conditions, the degree of symptoms, and the like.
  • an injection is administered alone or mixed with a normal replenisher such as glucose or amino acid, and then administered intravenously. Further, it is administered intraarterially, intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intracutaneously as required. J is in the rectum, and ointment is in the oral mucosa.
  • the dosage of the oligonucleotide of the present invention can be selected depending on the usage, the age of the patient, IJ and other conditions, the state of the symptoms, and the like.
  • the usual dose is 0.1 to 100 mg / kg / day, preferably 0.1 to 100 mg / kg / day, according to the present invention.
  • the present invention can be administered once a day or divided into 2 to 4 doses.
  • FIG. 1 shows the infrared absorption spectrum of the oligonucleotide represented by No. 2.
  • Figure 2 shows the oligonucleotide designated by the number 2. Torr.
  • FIG. 3 shows the killing of pi 20 sense and antisense oligonucleotides in HeLa cells by the oligonucleotchi K. anti-messenger method of the present invention. Indicates cells ⁇ .
  • FIG. 4 shows the ⁇ W in p120 protein produced by the method of the present invention, Oligonucleotide S and Anti messengerger, and p120 produced by the antisense oligonucleotide.
  • the homopurine Z homopyrimidine in the P 120 ⁇ ⁇ upper ⁇ node region was selected as Hfi ⁇ e ⁇ .
  • the antisense DNA ⁇ ⁇ ⁇ was reversed, consisting of almost homobrin.
  • Oligonucleotides designed in this way were prepared using / S-cyanoethyl compound, or commercially available automatic DNA compound (by Applied Biosystems, Inc.). An oligonucleotide represented by No. 2 was synthesized.
  • antisense oligonucleotides AACTTGCGCCCCATGGTA
  • sense oligonucleotides TACCATGGGGCGCAAGTT
  • the 3 ⁇ 4 * ffl vesicle activity of the oligonucleotide obtained in i 1 was determined by using human endometrial pain He La cells in culture medium. That is, 5 XI 0 2 Z100 1 well (we 11) HeLa cells were seeded in a 96-well dish, cultured for 2 days, and 4 M ribofectin and various oligonucleotides, which had been SiE for 1 hour in advance. 3 ⁇ 4 was reduced to 100/1 «1. In addition, the cells were counted using crystal violet for 3 days. Figure 3 shows the results.
  • the oligonucleotide of the present invention (P120 triplex), which forms DNAHfi ⁇ , is an antisense oligonucleotide (p120 triplex) consisting of an 18-don pair corresponding to the p12 initiation codon.
  • Antisense and sense oligonucleotide (p120 sense) t jt evidently strong L, indicating vesicle detachment.
  • the fluctuation of the P120 protein was examined by the Western blot method. That is, HeLa cells were cultured for 2 days in a 24-well plate, treated with oligonucleotides according to the method described in Example 1, and further cultured for 7 hours. After that, the cells were recovered by trypsin-EDTA, and a cell remnant was obtained using 50 mM Tris buffer (pH 7.5 / 0.05% SDS). After removing the protein from each sample, one protein extract was subjected to SDS-PAGE. 3 ⁇ 4®l3 ⁇ 4S white matter was transferred to a nitrocellulose membrane, and the amount of p120 protein in each sample was measured using an anti-p120 monoclonal antibody.
  • the ai agent was prepared according to
  • Capsules were prepared in a ⁇ iese combination ratio according to a conventional method.
  • the oligonucleotide of the present invention or its induction suppresses the transcription of cancer-specific P120 fe ?, which spreads to cancer cells by its formation, and thus suppresses the expression of P120 protein. It can suppress the growth and prevent cancer with low side effects.

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Description

明細害
オリゴヌクレオチ F¾びこれを ¾ ^とする制 «^PJ 飾分野
本発明はヒト癌の治 び予防に有用なォリゴヌクレオチド又はその誘^に 関する。 背景技術
、 多くの癌^ が発見さ 徐々にではあるカ壙化の辦が明らか になりつつある。 その結果、 多く
Figure imgf000003_0001
り引き起こされる一種 の遗 ίέΐ^であること力《示された。変異した異飾胞はもともと正^ ffl胞由来で あるため、体内で異物として認識されにくく、 またその生物学あるいは生化学的 性質も他の生物の による とは異なりそれほど大きくな
従って癌に関する種々の翻、 治療法及び！^が開発されている力 これらは 癌細胞に射る選択 く癌細胞ばかりでなく、 正 ma^¾び正細胞にも影 響を与え、 如何に ¾な翻とはいえ、 その副作用のために (^カ^しく制限さ れているのカ 状である。
これに対し では核 びその誘 を用 、た特定の遗 の発現制繊が p発されつつあり、 瘙は、 ±1己したように遗 em であるため、 特定の遗好、 特に癌化因子を標的とした 、 その発現制御による癌細胞特異的な効力は に期待できる。
その一つの手段としてアンチセンス法がある。 これは、 標的とする遣 ίέίの塩
Figure imgf000003_0002
（1 5— 3 0 igS¾¾¾) オリゴヌクレオ チド^ i胞内に導入し、癌ィ ftiS^©転 あるいは翻訳を阻害する方法である。 アンチセンス法は、 その檫的^?によりアンチジーン法と、 アンチメッセンジャ 一法に:^ IJされている。
アンチメッセンジャー法は、 メッセンジャー RN Aを標的とする:^ 4である。 これは、 標的一 * IRNAOTに対し、相 をもつオリゴヌクレオチ ドを し、 ワトソン一クリック結合による二 ^を形成させて、 スプライシン グゃ 3»の P lhあるい W^IS 特異的 RNA^S^による標的 RNAの を 行う: mである。 この:^ ¾は、 するアンチジーン法とは異なりすベての RN A分子を標的にできる。 そのため、 c一 my c遗伝子（ネイチヤー （Na t u r e)， 328, 445 - 449, (1987) )等多くの痛 ΚΙ¾¾ί ^を檫的と した研¾ ^報告されている。 し力、し、 メッセンジャー RNA^Tは細胞内に Jt^ 的多量に するため（特に癌化因子の ）、 細胞に を与えるために必要 になるアンチセンス分子も多く必要になる。 そのため、培養細胞レベルでは効力 力、'認められても、 j は現時点では困難であると考えられて 、る。
これに対してァンチジ一ン法は、 檫的遗 fei D N A二 fi^に対してァンチセン ス好を巻きつかせて を形成させる。
Figure imgf000004_0001
ンチジ ーン法はメッセンジャー RNAを標的とするアンチメッセンジャー法と異なり、 細胞内に雜する檫的の ゆな 、ため、現飾でのォリゴヌクレオチドの生体 内安定性等を考慮した 、 臨 ¾S用により適した と考えられる。 このアン チジーン法に必須である 成はフ一ダスティ一ン結合に膝している。 こ のフーグスティーン結合の形成には、 DN Aのニ魏のうち ^が舰したプリ ン¾¾の S^iJ (ホモプリン Zホモピリミジン B^ij)をもつ'要があること力 J明 している。
従って、本発明の目的は、 このアンチジーン法を利用し、癌細胞に選択的に作 用し^ W等の 物として有用なォリゴヌクレオチド又はその誘 該 E¾*§^物を用いた癌の予防 ·治 法、 更に p 120遺^の転写を抑制する 方法を することにある。 発明の開示
力、かる実情に鑑み本発明者らは、瘙ィ kH子 ρ 120はほとんどの龄、正 ma 織には ¾しないが、各種 ©¾繊には しているという知見（キャンサーリ サーチ （Cancer Res. ) ±8, 1244— 1251 (1988) )に 基づき 意研究を行った結果、 この P 120の発現を特異的に抑制することで癌 細胞の増殖 ¾ ^的に抑制すること力河能であり、 さらに当該遗 制 に際しては、
Figure imgf000004_0002
1353 /- 1 3 3 7にホモプリン Zホモピリミジン領^^することからこのホモブ リン ホモピリミジン部分にアンチセンス 3子あるいはセンス 子を巻きつ力、せ て HM^を形成させるァンチジ一ン法がメッセンジャー R N Aを標的とするァン チメッセンジャー法よりも優れた効果を示すことを見いだし、 本発明を^した。 すなわち本発明は 番号 1記載の ^ss^yおよび zまたは該 ¾¾a ^の相補 g ^の少なくとも した 1 5個の ¾sを有するォリゴヌクレオチド又はその誘 ^ これを ife^とする 物およ 物をヒトを含 ϋ¾¾¾¾ι に投与することを^ mとする癌の予防 ·治療方法を するものである。
本発明は、 更に、 P 1 2 0遣 のホモプリン zホモピリミジン領域において 成可能なオリゴヌクレオチドを用いた p 1 2 0遗 fe?の転写を抑制する 方法を難するものである。 この方法は p 1 2 0遗 の転写カ聊制されるため、 P 1 2 0蛋白質の^ * 制され癌細胞に ¾fる^ ffl胞活性を示すものである。 本発明のオリゴヌクレオチドは、 ±1己 P 1 2 0遗 fe^翻訳開始^ J:流一 1 3 5 3 /- 1 3 3 7のホモプリン Zホモピリミジン領域に対応するもので、 そのホモ プリン領域の一 1 3 4 0番目はチミンであるが、 それはそのままでもよいし、 又 はプリン力く するようにアデニンに置き換えてもよい。すなわち、 S^U番号 1 における Wはチミン又はアデニンであり、配列番号 2は Wを Aに置換したホモブ リン リである。 そして、本発明のォリゴヌクレオチドは 番号 1
Figure imgf000005_0001
であるホモピリミジン領域 S^ij (Β^ϋ番号 2の相補配列はホモピリミジン で ある） も包含する。 また、 本発明の 番号 1およびその相 ¾B^Uの各オリゴヌ クレオチドは少なくとも した ¾Sを 1 5個有していれば、 ホモプリン Zホモ ピリミジン領域と HSi^成可食な となる。
本発明の Ε ^ζ物は、 同一の誠物内に 番号 1の Wが Τのものと Αのも のの各ォリゴヌクレオチドおよびそれらの相捕ォリゴヌクレオチドを または 組み合わせて 1 S Lhのォリゴヌクレオチドを含有させること力でき、 各ォリゴ ヌクレオチドの配合割合 して^ fflし得る。
本発明の^^物は、 黼己ォリゴヌクレオチドと^の g ^ffl担体から構成 さ 特に癌の予防'治翻に有用である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常、 ^の手段に従い市販の DN A合^ 置により合^ ること力、'できる。 またこの際、 ホスホジエステ; については、 細胞内取り込み び安定性の面から、 メチルホスホエート (^a特許第 4
5 1 1 7 1 3号） やホスホロチォエート^ (特酔1— 5 0 3 3 0 2号） に置 き換えてもよい。 これらの 、ずれもまた市販の D N A合 置で合成可能である。 また、 この を含むオリゴヌクレオチドの 5 ' 又は 3 ' ¾4Sに DNAインタ 一力レーター等^合して DN Aに る結合力を向上させたり、 コレステロ一 ル等の脂溶性化^!^合することにより、細胞内取り込みを させることも 可能である。 DNAィンタ一力レーターとしてはァクリジンもしくはその誘^ (W0 9 2 / 2 0 6 9 8 )カ げられる。
従って、 本発明におけるォリゴヌクレオチドの誘^としては、 このォリゴヌ クレオチドと同様に p 1 2 0蛋白質の発現抑制効果を有し、 そのホスホジエステ ノ 合がメチルホスホエート結合又はホスホロチォエート に変換されたもの、 5 '又は 3 ' に DNAインターカレーターや脂溶性化 ^P g合したもの等 力 げられる。
本発明ォリゴヌクレオチドは、 強 t、„ 果、 p 1 2 0蛋白質の 抑制効 果を有し、 制翻の ¾S ^として^ fflできる。
本発明のォリゴヌクレオチドを g¾としてヒトを含も に用いるに当た つては、 予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能であり、該形態と しては、 例えば、 経口剤、謝剤、 i 外用剤（例えばパッ U、 テー U等 の貼付剤、軟膏剤、 クリーム剤、 ローション等）、 ^L 点鼻剤などのいずれ でも良く、 これらは、 各々当 ¾に^]««の翻方法により Ιϊϋできる。
経口用固形翻を調製する は、 本発明化^!に 剤、 に応じ ·α¾^ 剤、 崩棚、 mmi ^ m^i铺翻等を加えた後、 常法により翻、 u m u m カブセゾ^等を i¾tすることができる。 そのような添 加剤としては、 当該分野で H¾的に翻されるものでよく、例えば、 剤とし ては、 m 白糖、塩化ナトリウム、 ブドウ糖、 デンプン、 麵カルシウム、 力 ォリン、 艦晶セルロース、繊等が；結^ IJとしては、水、 エタノール、 プロ ノ、'ノール、単シロップ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチン液、 カルボキシメチ ルセルロース、 ヒドロキシブ口ピルセルロース、 ヒドロキシプロピルスターチ、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 シ工ラック、 リン酸カルシウム、 ポリビ ニルピロリドン等が；崩糊としては魏デンプン、 アルギン酸ナトリウム、 力 ンテン末、
Figure imgf000007_0001
トリウム、 カルシウム、 ラウリノレサナトリウム、 ス テアリン酸モノグリセリド、？ LH等が；滑湖としては精製タルク、 ステアリン 魏、 ホウ砂、 ポリエチレングリコール等が；^ としては白糖、做、 クェ ン酸、 等力 げられる。
経口用液 は、 本発明化^！に矮^』、緩衝剤、 安定ィ b¾、 矮^等を加 えて、 常法により内服翻、 シロッ U、 エリキシノ I ^等として^ iすることが できる。 この としては ±1己に挙げられたもので良く、緩衝剤としては クェン酸ナトリウム等が、安定イ^!としてはトラガント、 アラビアゴム、 セラチ ン等カ^げられる。
¾ ί剤を調製する^は、本発明化^に常法により p H調節剤、緩衝剤、 安 定ィ 、 im, 局所^ 等を添加すれば、 皮下、筋肉内及ひ 脈内用湖 剤とすること力くできる。 この^^の p H調 及 銜剤としてはクェン酸ナト リゥム、 ナトリウム、 リン酸ナトリゥム等カ げられる。安定ィ!^としては ピロ亜難ナトリウム、 E DTA、 チォグリコ一ノ ¾、 チォ乳酸等カ^げられる。 局所^^としては驢プロ力イス纖リドカイン等カ举げられる。
としては、 塩化ナトリウム、 ブドウ糖など力 示できる。
棚は、 本発明化^!に当業界において^ Πの翻用担 例えばポリエチレ ングリコール、 ラノリン、 カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、 さらに' に応じてツイーン （^商標）のような界面 iSWJ等を加えた後、 常法により製 造することができる。
軟膏剤は、 本発明化^!に通常謂される翻、 安 、 mmu 保赫 J等が 必要に応じ TB2合さ により混合、翻化すればよい。翻としては、 流 動パラフィン、 白色ワセリン、 サラシミツロウ、 ォクチルドデシルアルコール、 パラフィン等カ げられる。保湖としては、 パラォキシ安息香酸メチル、 パラ ォキシ安息 ¾ェチル、 パラォキシ安息香酸プロピノ カ げられる。
貼付剤を する齢には、通常の に調 膏、 クリーム、 ゲル、 ベー スト等を常法により塗布すれば良い。 としては、綿、 スフ、 ィ から なる飾、 ^iBWゃ軟 化ビエル、 ポリエチレン、 ポリウレタン等のフィルム あるいは発泡体シートが適当である。
さらに、 本発明化^ (はリポソーム内にカブセル化されて投与されてもよく、 ¾S ^が脂肪 tt®に粘 の水性同心層からなる難子内に分散されるか、 又 は別の形 s i½して含有される! m¾a ^物であってもよい。 ¾化^はそ の溶解性に依存して、水 及び脂肪 tt の両方に してもよ 又は H¾に リボソーム翻液と呼ばれる形 してもよい。 ¾τκ½βは、 例えばリン脂 質例えばレシチン、 ステロイド例えばコレステロール、幾分イオン性の界面? Stt 剤例えばジセチルホスフヱ一ト、 ステアリルァミン、 又はホスファチジン酸及び Z又 (ϋ^性のその他の物質からなる。 リボソームの直径は Η¾に約 1 5 nmな いし約 5ミクロンの範囲内である。
»J中における本発明オリゴヌクレオチドの^ Jtは »Jにより種々異なる力 ¾1 常 1〜7 0 fiS%¾JSとすること力、'好ましい。
本発明翻の投与方法は特に制限されず、 各 SIS^膨態、 患者の年齢、 IJそ の他の条件、 症状の程度等により適宜決定すればよい。例えば、注射剤は単独で 又はブドウ糖、 アミノ酸等の通常の補液と混合し T 脈内投与さ さらに'要 に応じ職で動脈内、 筋肉内、 皮内、 皮下もしくは難内投与される。 Jは直 腸内に、 また軟膏剤は 、 口腔内粘膜等に^?される。
本発明のォリゴヌクレオチドの投与量は、 用法、 患者の年齢、 IJその他の条 件、 症状の體等により ¾ ¾択できる。通常の投与量は、本発明化^!を 0. 0 1〜1 0 0 O m gZk gZ日雖、好ましくは 0. 1〜5 0 O mg/k g/日 である。 これら本発明 は 1日に 1回又は 2〜4 に分けて投与するこ と力、'できる。 図面の簡単な説明
第 1図は 番号 2で示されるォリゴヌクレオチドの赤外吸収スぺクトルを示 す。第 2図は 番号 2で示されるオリゴヌクレオチ
Figure imgf000008_0001
トル を示す。第 3図は、 本発明ォリゴヌクレオチ K¾びァンチメッセンジャ一法によ る p i 2 0センス、 アンチセンスオリゴヌクレオチドの H e L a細胞に ¾fる殺 細胞 ^を示す。第 4図は、 本発明ォリゴヌクレオチ Sびァンチメッセンジャ 一法による p 120センス、 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる p 120蛋 白 に る ¾Wを^"。
発明を^ るための の形態
以下、 錢例、纖例及び翻例を挙げて本発明をさらに翻に説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
m 1 オリゴヌクレオチドの設叶及び
P 120遗^上^ ^節領域に するホモプリン Zホモピリミジン を Hfi^^^e ^として選択した。 また細胞内で安定に Hfiiiを形成させるため に、 アンチセンス DNAの Β^ϋは、 ほぼホモブリンから成る逆 にした。 このようにして設計したォリゴヌクレオチドは/ S—シァノエチル合^を用 L、た 市販の自動 DNA合^置 （アプライドーバイオシステム社 ¾ によって、
Figure imgf000009_0001
番号 2で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。赤外吸収スぺクトル（KB r 法）のチャートを第 1図に、 核磁 鳴スぺクトル（D2 0中、 270MHz) のチャートを第 2図に示す。
また、 アンチメッセンジャー法による対照オリゴヌクレオチドとして P 120 コドン （AUGサイト） に対応する 18¾S対（ー4〜+14)力、ら成 るアンチセンスオリゴヌクレオチド （AACTTGCGCCCCATGGTA)、 及びセンスオリゴヌクレオチド（TACCATGGGGCGCAAGTT)を合 成した。
例 1
i 1で得たォリゴヌクレオチドの ¾*ffl胞活性を培縣でヒト子宮体痛 H e La細胞を用い^した。すなわち、 96穴シャーレに 5 XI 02個 Z100 1 ウヱル （we 1 1)の HeLa細胞をまき、 2日間培 «¾、予め で 1時 間 SiEしておいた 4〃Mリボフヱクチンと各種オリゴヌクレオチド^ ¾を 100 /1«1した。 さらに、 3日間培 クリスタルバイオレット により細胞 数を した。 その結果を第 3図に示す。 こ 果から DNAHfi^を形 ^る 本発明オリゴヌクレオチド（P 120トリプレックス） は、 p 12 開始コ ドンに対応する 18驢対から成るアンチセンスオリゴヌクレオチド（p 120 アンチセンス）及びセンスオリゴヌクレオチド （p 120センス） t jtベ明らか に強 L、棚胞離を示すこと力 る。
謙例 2
Figure imgf000010_0001
制に していることを、証明するためにウェスタンブロッ卜法により P 120 蛋白質の変動を検討した。すなわち、 24穴プレートにて HeLa細胞を 2日間 培 «^、 ^例 1で示した方法でオリゴヌクレオチド ½理を行い、 さらに 7時間 培養した。 その後、 細胞をトリブシン一 EDTAにより回収し可 !^ (50m Mトリスバッファー pH7. 5/0. 05%SDS) を用い細胞難出液を得た。 各サンプルの蛋白を 後、一 の蛋白抽出液を SDS— PAGEにより職 泳動した。 ¾®l¾S白質をニトロセルロース膜に転写し、 抗 p 120モノクロ一 ナル抗体により各サンプル中の p 120蛋白量を »した。 コントロール実験と して、 細胞の增敏状況による の少ない GAPDH (グリセルアルデヒドリン 酸デヒドロゲナーセ）のウェスタンブロットを同様の^で行った。 その結果、 第 4図に示すように 0. 5 Mの本発明ォリゴヌクレオチド（p 120 トリプレ ックス）纏により、 ほぼ ¾ ^に p 120蛋白質の発現カ 制されていた。 この 時、 GAPDH¾¾Sに全く変化が求められないことより、 本発明オリゴヌクレ ォチドは p 120遗 ^転写を特異的に阻害することで、 p 120蛋白の^ を引き起こし、 結果的に第 3図に示 く細胞 を現すものと考えられる。 翻例 1 m
本発明化^! 5mg
膝用蒸留水
1ァンプル中 5 m 1
±iese合割合で、 に従い ai剤を調製した c
mm 2 力プセ
本発明化^！ 1 Omg
？ Utl 5 Omg
トウモロコシデンブン 47mg
結晶セルロース 5 Omg タルク 2mg
ステアリン酸マグネシゥム 1 m g
1カプセル当たり 1 6 Omg
±iese合割合で、 常法に従いカプセル剤を調製した。
翻例 3 \
本発明化^! Omg
ウイテツブゾール W— 35
—(鶴商標、 ダイナマイトノーベル ttHD― 1 38 Omg
1個当たり 1 400mg 産 の利用可
本発明のォリゴヌクレオチドまたはその誘^は、 ^成により癌細胞に 広く する癌特異的な P 1 20遗 fe?の転写を抑制し、 ひいては P 1 20蛋白 質の発現を抑制するため、 聽増殖を抑制し、 副作用の低い癌の予防'治棚と すること力できる。
J表
番号： 1
の長さ： 1 7
の型：繊
鎖の数：一棚
トポロジー：直鎖状
se^の種頃：他の 合成オリゴヌクレオチド
アンチセンス： Y e s
： GAAWGGAGGA GGAGAAA 17
,番号： 2
ϋの長さ： 1 7
画：核酸
鎖の数：ー
トポロジー：虐銷状
B^IJの ：他の TO 合成オリゴヌクレオチド
アンチセンス： Y e s
： GAAAGGAGGA GGAGAAA 17

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 番号 1言 B«¾の ^の少なくとも連睫した 1 5個の ¾Sを有するォ リゴヌクレオチド又はその誘 ^0
2. 1 7個の を有することを とする請求の範囲第 1堀己載のォリゴヌ クレオチド又はその誘 ¾ *o
3. Wが Αである請求の範囲第 1 ¾1己載のォリゴヌクレオチド又はその誘¾^
4. 1 7個の ½Sを有することを とする請求の範囲第 3項記載のォリゴヌ クレオチド又はその誘^。
5. ,番号 1記載の^ S^Uの相 の少なくとも した 1 5個の ¾S を有するォリゴヌクレオチド又はその誘^。
6. 請求の範囲第 1項〜第 5項言 a¾のォリゴヌクレオチド又はその誘¾ ^の少 なくとも 1種を とする ^物。
7 · 癌の予防 ·治^ ljであることを■とする請求の範囲第 6項記載の 且 成物。
8. 請求の範囲第 6項言己載の 物の治^ をヒトを含む哺? 11；物 に投与することを とする癌の予防 ·治療方法。
9. p 1 2 0遗 ίδ^のホモプリン ホモ.ピリミジン領域において ΗΜί ^成可 能なオリゴヌクレオチドを用いた p 1 2 0遗 feiの転写を抑制する方法。
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