WO1996028181A1 - Method of preventing tpo adsorption and stable tpo-containing composition - Google Patents

Description

明 柳 窨

Τ Ρ Ο の 吸着防止方法お よ び安定 な Τ Ρ 0 含有組成物 発明の 背景

発明の技術分野

本発明 は、 糖鎖部を 有 し て い る Τ Ρ Ο タ ン パ ク 質 を 含有す る 組成物 に 関 し 、 特に 、 容器壁上への吸着 ま た は 会合、 重合 な ど に よ る 活性成分の損失、 力価低下を 防止す る 安定 な T P 0 含有 組成物に 関す る も の で あ る 。 本発明 は ま た 、 該組成物を 含有す る 容器壁上への T P 0 の吸着 に よ る 力価低下を 防止す る た め の 方法に関す る 。

従来技術の 開示

ヒ ト T P O ( th ronibopo i e t i n) は 、 サ イ ト 力 イ ン の レ セ プ タ — ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー の一つ で あ る M p 1 の リ ガ ン ド と し て ク ロ ー ニ ン グ さ れた タ ン パ ク 質で あ る （ d_e Sauvageら 、 Na t u r e (London) 369巻、 533- 565 頁、 （1994)、 B a r t I e y, T. D. ら 、 Ce l l 77 巻、 11 Π- 1124 頁、 （19 ) ) 。 こ れ ら の M p 1 リ ガ ン ド は いずれ も 血小板減少症の動物 （ ヒ ト 、 マ ウ ス 、 ィ ヌ ） の血 淸ゃ血漿中 に 検出 さ れ、 巨核球形成や 血小板形成への関与が確 認 さ れて い る 。

血小板減少症の治療剤の 開発を念頭に お い て 、 本 出願人 も 、 ラ ッ 卜 骨髄 よ り 高度 に純化 し た 巨核球前駆細胞か ら の 巨核球生 成を 促進す る 活性 を 指標 に し て、 血小板減少症の ラ ッ ト 血漿 よ り ラ ッ ト T P O を精製 し 、 そ の部分 ア ミ ノ 酸配列 に 基づ い て、 ラ ッ ト T P O c D N A 、 さ ら に 【ま ヒ 卜 T P O c D N A を ク ロ ー ニ ン グ し 、 遗伝子組換え技術 に よ っ て大量 に 均一な ヒ 卜 T P O を取得す る こ と に成功 し た （ H. M i y a z a k ί ら 、 Ex p. H e m a t o I . 22巻、 838 頁、 （ 19 ) ) 。 本出願人が取得 に 成功 し た こ の ヒ ト T P O は、 前述の ヒ 卜 M p 1 の リ ガ ン ド と し て取得 さ れ た 因子 と 同一の ァ ミ ノ 酸配列 を有す る こ と が判明 し て い る （配列表 ： 配列番号 1 ) 。

本発明者 ら は、 該 ヒ ト T P O を制 ガ ン 剤や免疫抑制剤の投与 あ る い は放射線照射や B M T に よ っ て骨髄抑制の起 き た 血小板 減少症の マ ウ ス に 投与 し た と こ ろ 、 血小板減少阻止効果、 血小 板増加促進効果、 さ ら に は、 造血機能の 亢進が認め ら れ、 本発 明の T P 0 が こ れ ら の 血小板減少症 に 有効で あ る こ と を見 い だ し て い る 。 T P O は、 そ の高活性ゆ え に極め て微量で使用 さ れ、 活性成 分 と し て通常 0 . O S it g Z k g 体重〜 l m g Z k g 体重、 好 ま し く は 0 . S jt g Z k g 体重〜 5 0 i/ g / k g 体重 を 、 病状 性別及 び投与経路 に 応 じ て、 一 日 数回程度投与 さ れ得 る 。 従 つ て、 極め て微量で製剤化す る こ と が要求 さ れ る が、 こ の 場合、 製剤容器 （バ イ ア ル、 ア ン プ ル等） への 吸着 に よ る 力価低下、 点滴静注時 に輸液 と 配合す る 場合の 輸液瓶、 点滴 ラ イ ン へ の 吸 着損失が無視で き な い。

そ こ で、 本発明者 は、 糖鎖部を 有 し て い る T P O タ ン パ ク 質 を 製剤化あ る い は輸液配合す る 際の 力価低下防止を 目 的 と し て 吸着を 防止す る よ う な 安定 な T P O 含有組成物を 得 る べ く 、 種 々 の検討を行 っ た。 そ の結果、 糖鎖部を 有 し て い る T P O タ ン パ ク 質 に 、 薬学的 に 許容 さ れ る タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体 界面活性剤、 ポ リ ビニ ル ア ル コ ー ル を 添加す る こ と が有効で あ る こ と を見 い だ し 、 本'発明 を完成 し た。

発明の 要約

本発明 は、 糖鎖部を 有す る T P O タ ン パ ク 質を 含有す る 組成 物中 に 、 タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 界面活性剤、 ポ リ ビ ニ ル ア ル コ ー ルか ら な る 群 よ り 選ばれ る 少 な く と も 1 種の 薬学 的 に許容 さ れ る 添加剤を含有 さ せ る こ と を 特徴 と す る 、 該組成 物を含有す る 容器壁上への T P 0 の 吸着 に よ る 力価低下 を 防止 す る た め の方法を提供す る 。

ま た 、 本発明 は、 糖鑌部を 有 し て い る T P O タ ン パ ク 質 と 、 薬学的 に許容 さ れ る タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 界面活性 剤、 ポ リ ビニ ノレ ア ル コ ー ルか ら な る 群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種の 添加剤 を含有す る こ と を特徴 と す る T P O 含有組成物を 提供す る 。

図面の簡単な 説明

図 1 は、 E L I S A 法に よ り 決定 さ れ た 、 T P O U - 332) / C H 0 の 濃度 と 吸収値 （ 0/650nm) と の 関係 を示す標準曲線で あ る

図 2 は 、 種 々 の 濃度の ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン （ H S A ) を 添加 し た と き の、 Τ Ρ Ο (1- 332) Z C H O の 回収率の経時変化 を 示 す。

発明 の詳細 な 説明

本発明 に お け る Τ Ρ 0 と は、 純度が高 く 、 単離 さ れた糖 タ ン パ ク 質で あ ればそ の製法 に よ る 由来 は 問わ な い が、 配列番号 1 に 記載の ア ミ ノ 酸配列か ら な る ポ リ べ プチ ド と 糖鎖部を有す る 糖 タ ン パ ク 質が用 い ら れ る 。 あ る い は、 配列番号 1 に 示 さ れ た ア ミ ノ 酸配列の う ち 、 T P O 活性を保持す る 限 り に お い て そ の 一部が改変 （置換、 欠失、 挿入、 お よ び ま た は 付加） さ れて い る よ う な ァ ミ ノ 酸配列 か ら な る ポ リ べ プチ ド と 糖鎖部を 有す る 糖 タ ン パ ク 質 も 本発明の T P O と し て用 い る こ と がで き る 。

別の言 い方をすれば、 ア ミ ノ 酸配列が実質的 に 配列番号 1 に 示 さ れた ァ ミ ノ 酸配列で あ る よ う な ポ リ べ プチ ド と 糖鎖部 を 有 す る 糖 タ ン パ ク 質を も 用 い る こ と がで き る こ で言 う 「実質

'的 に配列番号 1 に 示 さ れ た ア ミ ノ 酸配列」 と は 、 配列番号 1 に 示 さ れ た ァ ミ ノ 酸配列 に 加え て 、 Γ Τ Ρ Ο 活性を保持す る 限 り に お い て 、 配列番号 1 に 示 さ れた ア ミ ノ 酸配列の 一部 に 置換、 欠失、 挿入、 お よ び ま た は 付加 な どがあ る ア ミ ノ 酸配列」 を 含む こ と を 意味す る 。

本出願人 は、 ヒ ト T P 0 の C 末端側 に つ い て は 配列番号 1 に 示 さ れた ア ミ ノ 酸配列の 1 5 2 位 ま で欠失 さ せ て も 活性を保持 し て い る こ と 、 N 末端側 に つ い て は 6 位 ま で欠失 さ せ て も 活性 を保持 し て い る こ と を確認 し て い る 。 具体的 な デ ー タ に つ い ァ は表 1 に 示 し た 誘導体 活性の 有無

1 - 2 3 1 位 +

1 _ 2 1 1 位 +

1 - 1 9 1 位 +

1 — 1 7 1 位 +

1 - 1 6 3 位 +

1 一 1 5 7 位 +

1 - 1 5 6 位 +

1 — 1 5 5 位 +

1 — 1 5 4 位 +

1 — 1 5 3 位 +

1 — 1 5 1 位 +

1 一 1 5 0 位

7 一 1 6 3 位 +

8 - 1 6 3 位

3 — 2 3 1 位

従 っ て、 本発明の T P O と し て は、 配列番号 1 に示 さ れ た ァ ミ ノ 酸配列の 7 位か ら 1 5 1 位の ァ ミ ノ 酸配列 を 含み、 かつ T P O 活性を有す る 糖 夕 ン パ ク 質 も 含 ま れ る 。 よ り 具体的 に は配 列番号 1 に 示 さ れた ア ミ ノ 酸配列 の う ち 、 1 位か ら 2 3 1 位、 位か ら 2 位、 1 位か ら 1 9 1 位、 1 位か ら 1 7 1 位、 1 位か ら 1 6 3 位、 1 位 5 7 位、 1 位か ら 1 5 6 位、 1 位力、 ら 1 5 5 位、 1 位か ら 1 5 4 位、 1 位か ら 1 5 3 位、 1 位 か ら 1 5 1 位お よ び 7 位力、 ら 1 6 3 位 か ら な る ポ リ べ プ チ ド と 糖鎖 部を有す る 糖 タ ン パ ク 質が本発明 の T P O と し て挙 げ ら れ る 。

更 に は 、 上 記 7 位 か ら 1 5 1 位 の 配列 内 部 ま た は 外部 に 、 T P O 活性を損な わ な い範囲で、 少な く と も 1 つ の ア ミ ノ 酸の 置換、 欠失、 挿入、 お よ び ま た は付加を 有 し て い る ア ミ ノ 酸 配列か ら な る ポ リ ベ プチ ド と 糖鎖部を有す る 糖 夕 ン パ ク 質 も 本 発明の T P O に 含 ま れ る 。

本発明の T P 0 を更 に例示す れば、 少な く と も 、 配列番号 1 の ア ミ ノ 酸配列を 有す る ヒ 卜 T P O の 1 位の セ リ ン 残基力 ァ ラ ニ ン残基 に 、 かつ 3 位の ァ ラ ニ ン 残基がバ リ ン残基 に 置換 さ れ た糖 タ ン パ ク 質、 2 5 位の ア ル ギニ ン残基が ァ ス パ ラ ギ ン残基 に 置換 さ れ た糖 タ ン パ ク 質、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基力 ト レ オ ニ ン 残基 に 置換 さ れた糖 タ ン パ ク 質、 2 5 位の ア ル ギニ ン 残基 が ァ ス ギ ン 残基 に 、 か つ 2 3 1 位 の グ ル 夕 ミ ン 酸残基 が リ ジ ン 残基 に 置換 さ れ た 糖 夕 ン パ ク 質 、 更 に こ れ ら の 糖 夕 ン パ ク 質 の C 末 端 に T h r S e r I 1 e G 1 y T y r P r o T y r A s p V a l P r o A s p T y r A l a G 1 y V a 1 H i s H i s H i s H i s H i s H i s の ポ リ ペ プ チ ド が 付 加 さ れ た 糖 夕 ン パ ク 質 を 挙 げ る こ と が で き る

更 に は 、 配 列 番 号 1 の ア ミ ノ 酸 配 列 に 対 し 、 少 な く と も

3 3 位の ヒ ス チ ジ ン 残基 が 欠 失 し た 糖 タ ン パ ク 質 、 6 位 の グ リ シ ン 残基 が欠 失 し た 糖 タ ン パ ク 質 、 7 位 の ア ル ギ ニ ン 残基 が 欠失 し た 糖 タ ン パ ク 質 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残基 の 間 に ト レ オ ニ ン 残 基 が挿 入 さ れ た 糖 夕 ン パ ク 質 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残基 の 間 に ァ ラ ニ ン 残基 が挿 入 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質 、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残基 の 間 に グ リ シ ン 残基 が 挿 入 さ れ た 糖 夕 ン パ ク 質、 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残基 と 3 4 位 の プ ロ リ ン 残 基 の 間 に ダ リ シ ン 残基 が挿 入 さ れ 、 かつ 3 8 位 の プ ロ リ ン 残基 が セ リ ン 残基 に 置 換 さ れ た 糖 夕 ン パ ク 質 、 6 位 の グ リ シ ン 残基 7 位 の ア ル ギ ニ ン 残基 の 間 に ァ ス パ ラ ギ ン 残基 が挿 入 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質、 6 位 の ダ リ シ ン 残基 と 7 位 の ア ル ギ ニ ン 残基 の 間 に ァ ラ ニ ン 残基 が挿 入 さ れ た糖 夕 ン パ ク 質

6 位 の ダ リ シ ン 残 基 と 7 位 の ア ル ギ ニ ン 残基 の 間 に グ リ シ ン 残基 が挿入 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質 を 挙 げ る こ と が で き る 。 ま た 、 少 な く と も 、 1 2 9 位 の ロ イ シ ン 残基 が ア ル ギ ニ ン 残基 に 置 換 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質、 1 3 3 位 の ヒ ス チ ジ ン 残 基 力く ア ル ギ ニ ン 残基 に 置換 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質 、 1 4 3 位 の メ チ ォ ニ ン 残基 が ア ル ギ ニ ン 残基 に 置 換 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質 、 8 2 位 の グ リ シ ン 残基 力 ロ イ シ ン 残 基 に 置 換 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質、 1 4 6 位 の グ リ シ ン 残基 力 ロ イ シ ン 残基 に 置換 さ れ た糖 夕 ン パ ク 質、 1 4 8 位 の セ リ ン 残基 が プ ロ リ ン 残基 に 置 換 さ れ た 糖 夕 ン パ ク 質 、 5 9 位 の リ ジ ン 残基 が ア ル ギ ニ ン 残基 に 置 換 さ れ た 糖 夕 ン ぺ ク 質 、 5 位 の グ ル タ ミ ン が ア ル ギ ニ ン 残基 に 置 換 さ れ た 糖 タ ン パ ク 質が 挙 げ ら れ る 。

ま た 、 本 発 明 の 丁 P 0 と し て は 、 配列 番 号 1 に 示 さ れ る ア ミ ノ 酸配 列 を 有す る ヒ ト T P 0 お よ び前述の 誘 導 体 の 一 2 位 に メ チ ォ ニ ン 残 基 、 か つ 位 に リ ジ ン 残基 が付加 さ れ た糖 夕 ン パ ク 質、 一 1 位 に メ チ ォ ニ ン 残基 が 付加 さ れ た糖 タ ン パ ク 質 も 含 ま れ る 。

本発 明 の T P O は 、 c D N A 、 染色体 D N A 、 ま た は 化学 合 成 に よ り 得 ら れ る D N A を 含む組換え ベ ク タ ー で、 形質転換 さ れ た宿主細胞か ら 分離 · 精製 し て得 ら れ た も の で あ る こ と が好 ま し い。 宿主 と し て は、 真核生物 （例え ば、 酵母、 昆虫、 哺乳 動物） 細胞を 用 い る こ と がで き る 。 哺乳動物細胞の 例 と し て は 、 C O S 細胞、 チ ャ イ ニ ー ズ ハ ム ス タ ー 卵巣 （ C H O ) 細胞、 X 63. 6. 5. 3. 細胞、 C - 127細胞、 B H K ( Ba by Hams t e r K i d n e y ) 細胞、 ヒ ト 由 来細胞 （例 え ば、 He La細胞） 等 を が挙 げ ら れ る 。 酵母の例 と し て は、 パ ン 酵母 ( S a c c h a r 0 m y c e s c e r e v i s i a e ) や メ タ ノ ー ル資化性酵母 （ P i c h i a p a s t o r i s ) 等が挙 げ ら れ る 。 昆虫細胞の 例 と し て は 、 蚕培養細胞 （例 え ば、 S f 21細胞） 等が 挙げ ら れ る 。

本発明の安定 な T P 0 含有組成物を 得 る た め に 使用 し 得 る 添 加剤 と し て は、 タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 界面活性剤、 ポ リ ビニ ル ア ル コ ー ル な どが挙げ ら れ る れ ら の 添加剤 は 、 例え ばガ ラ ス 製、 樹脂製等の容器、 チ ュ ー ブ （例 え ば点滴 ラ イ ン ） 等への T P O の吸着を 防止す る も の で あ れば、 そ の種類を 問わ な いが、 例 え ば下記の も の が挙 げ ら れ る 。

タ ン パ ク 質 と し て は、 ヒ 卜 血清 ア ル ブ ミ ン 、 ゼ ラ チ ン 、 牛血 清 ア ル ブ ミ ン 、 カ ゼイ ン 、 コ ラ ー ゲ ン 、 ヒ ト 血清 グ ロ ブ リ ン な ど が利 用 で き る 。

セ ル ロ ー ス 誘導体 と し て は 、 メ チ ル セ ノレ ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル セ ノレ ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ ェ チ ル セ ノレ ロ ー ス な ど が 利 用 で き る 。

界 面 活性 剤 と し て は 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン 硬 化 ヒ マ シ 油 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ヒ マ シ 油、 ポ リ ソ ル べ 一 ト 8 0 や モ ノ ラ ウ リ ン 酸 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ル ビ 夕 ン （ 別 名 ： ポ リ ソ ル べ 一 卜 2 0 ) な ど の ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ノレ ビ タ ン 脂肪酸エ ス テ ル 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ポ リ オ キ シ プ ロ ピ レ ン グ リ コ — ノレ 、 モ ノ ォ レ イ ン 酸 ソ ノレ ビ タ ン な ど の ソ ル ビ タ ン 脂肪酸 エ ス テ ル 、 シ ョ 糖 モ ノ ラ ウ リ ン 酸 エ ス テ ル な ど の シ ョ 糖脂肪酸エ ス テ ル 、 塩 化 べ ン ゼ ト ニ ゥ ム 、 塩 化 ベ ン ザ ル コ ニ ゥ ム な ど の 芳 香 族 四 級 ァ ン モ ニ ゥ ム 塩 、 カ プ リ ノレ 酸 ナ ト リ ウ ム 、 亜硫酸 ナ ト リ ウ ム な ど が利 用 で き る 。

本 発 明 に お い て 用 い ら れ る こ れ ら の 添 加剤 は 、 T P 0 含 有組 成物 を 水 溶 液 と し た 場合 に 0 . 0 0 1 〜 1 0 % の 濃度範囲 で 使 用 さ れ う る 。 ま た 、 本 発 明 に お い て 用 い ら れ る 添 加 剤 は 、 一 般 に 活 性 成 分 と し て の T P O タ ン パ ク 質 1 重 量 部 に 対 し 、 0 . 0 2 重最部 〜 1 0 ， 0 0 0 重置部 の 範 囲 内 で 使用 す る こ と が望 ま し い。 更 に 本発明 の T P 0 含有組成物 は、 そ の 製剤化の 目 的 に 応 じ て希釈剤、 可溶化剤、 防腐剤、 酸化防止剤、 賦形剤 お よ び等張 化剤等を含有す る こ と がで き る 。 本発明 の安定 な T P 0 含有組成物 は 注射 な どの 非経 口 、 経肺 経鼻、 お よ び経 口 を含め た種 々 の投与経路 に 応 じ た 剤形 と し て 溶液剤、 懸濁剤、 錠剤、 丸剤、 カ プセ ル剤、 顆粒剤、 凍結乾燥 製剤 な どが例示 さ れ る 。 T P 0 と 本発明 に 係わ る 添加剤が必ず し も 当初か ら 同一の 組成物中 に共存 し た 状態で与え ら れ る 必要 がな く 、 そ れ ぞれを別 々 に 用 意 し 、 用 時 に 両者 を 混合す れば よ い よ う な 組成物剤形 も 可能で あ る 。 以下、 実験例、 実施例 に よ っ て 本発明 を具体的 に 説明 す る 。 実 施 例

以下の実験例 で使用 す る T P 0 の酵素免疫測定法 は以下の と お り で あ る 。 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い た固相酵素免疫定量法

( E L I S A 法） 固相抗体 と し て 、 ヒ ト T P O の HT- 1領域 （配列番号 1 の 8 位 〜 2 8 位の ア ミ ノ 酸配列 に 相 当） を 認識す る 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ノレ 抗体 （ L 3- 1の サ ブ ク ロ ー ン L 3 -卜 54 ) を 、 50 in M 炭 酸塩 バ ッ フ ァ ー （pH 9. 2) に て 2 G ; g/m lに 調製 し 96ゥ エ ル マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト （Nu nc- l mmuno P l a t e M a it i S o r p™ _x 1 n t e r M e d社製、 C a . N o . 4 - 424 M ) の 各 ゥ エ ル に 50〃 ! ずつ 分注

C T S - 96、 ァ ドバ ン テ ッ ク 東洋株式会社製） で搜拌サ し 各 ゥ エ ル の底面 に 固相抗体 を ゆ き わ た ら せ た 。 プ レ ー ト シ一ノレ （ SUM ON 社製、 Ca. No. MS - 30020 ) で シ ー ル し 37°C で 2 時間、 或い は 4°C でー晚静置 し て 固相抗体を プ レ ー 卜 に 吸着 さ せ た。 次 に 20 mM T r i s -H C 1 /0. 5M N a C 1 /0. \ % Twe e n 20 (p H 7. 5) の洗浄バ ッ フ ァ ー で洗浄後、 4 倍希釈 B l oc k Ac e ( 大 日 本製薬株式会社製、 Ca. No. UK- Β ) を 300 w I /ウ エ ノレ加え 、 プ レ ー ト シ 一 ノレ で シ ー ノレ し 37て で 1 時間 . 或 い は 4 でー晚静置 し て ブ ロ ッ キ ン グ処理 し た。 洗浄 バ ッ フ ァ 一 で 4 回洗浄後、 10倍希釈 B I Q c k A c e で希釈 し た 被検体 ま た は標準 と す る 濃度既知 TP0 を各 ゥ エ ル に 添加 し 、 マ イ ク 口 プ レ ー 卜 ミ キ サ ー撹拌後、 プ レ ー ト シ 一 ル で シ一ノレ し Π で 2 時間、 或い は でー晚静置 し て反応 さ せ た。 反応終了後、 洗浄バ ッ フ ァ ー で 4 回洗浄 し た。 次 に 、 ヒ ト T P 0 の H T - 2領域 (配列番号 1 の 4 7 位〜 6 2 位の ァ ミ ノ 酸配列 に 相当 ） を 認辧 す る 抗 ヒ 卜 T P O モ ノ ク ロ ー ナ ノレ抗体 （ U - 1の サ ブ ク ロ ー ン L4-1-31, 1 次抗体） を ピオ チ ン 標識 し 、 10倍希釈 B l oc k Ac e で 500ng/ra lに 希釈 し て各 ゥ エ ル に 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で 撹拌後、 プ レ ー ト シ一ノレ で シ ー ノレ し 37 で 2 時 間、 或い は ί °C でー晚静置 し て反応 さ せ た。 反応終了後、 洗浄 バ ッ フ ァ ー で 4 回 洗 浄 し 、 ペ ル ォ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ア ビ ジ ン

( Ul t raAv i d i n ^TM - Ho r s e r a d i sh Pe r ox i d a s e 、 L e i n c o T e r h n o 1 o g i e s 社製、 Ca. No. Al G6) を 10倍希釈 B l oc k Ac e で 2GQ0倍希釈 し て各 ゥ エ ル に 50 ^ 1 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹 拌後、 プ レ ー ト シ ー ルで シ ー ル し て 37 で 1 時間反応 さ せ た。 反応終了後、 洗浄バ ッ フ ァ ー で 4 回洗浄 し た後、 ペ ルォ キ シ ダ ー ゼ用発色キ ッ 卜 （ SUM ON 社製、 Ca. No. ML- 1120T) の T M B Z 発色剤 に 1/1 Q0 容の基質液を加え た発色剤 を 各 ゥ エ ル に 100 1 添加 し マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌後、 プ レ ー ト シ 一 ルで シ ー ル し て室温下で反応 さ せ た。 約 30分後 に 反応停止液を 各 ゥ エ ル に 100 I 加え、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌 し て発色反応を停止 し た。 E U S Α プ レ ー ト リ 一 グ ー （ T H E R M 0 m a X、 Mo l e c u l a r De v i c e s 社製） で 45Q/650nm の 波長の 吸収 を 測定 し た

後 述 の 参 考例 に 記載の 方法 で 得 ら れ る 、 濃度既知 の T P 0 ( 1 - 332 ) / C H0 に よ る 吸収値 を も と に 標準 曲線 を 作製 し た (図 1 参照） 。

な お、 こ こ で用 い る 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ 一 ナ ノレ抗体を 産生 す る ハ イ プ リ ド ー マ L 4 - 1の サ ブ ク ロ ー ン -卜 31 ) 及 び U - 1 の サ ブ ク ロ ー ン （ L 3 - 1 - 54 ) は 、 1 9 9 4 年 1 2 月 2 7 日 付 け で 曰 本国の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 に そ れぞれ受託番号 F E R M B P — 4 9 5 6 、 F E R M B P — 4 9 5 5 と し て寄託 さ れて い る 。 上記サ ブ ク ロ ー ン は ま た 、 中 国寄託機関 （ C C T C C) に 、 そ れぞれ Mo u s e - M。 u s e y b r i d o m a L 4 - 1 - 31 と し て受託番号 C C T C C - で、 ま た Mci u s e - M o u s e h b r i d om a L 3 - 1 - 5 と し て受託番号 C C T C C - C 95 Q 02 で寄託 さ れ て い る 。

< 実験例 1 >

0 m M ト リ ス バ ッ フ ( P H 7 . 5 ) に ヒ ト 血清 ァ ノレ ブ ミ ン 0. 005 % , 0. 01 % , 0. 02 % , 0. 05 % , 0. 1 % , 0. 2 % , 0. 5 % と な る よ う に 含 有せ し め た も の を 用 意 し 検 体試料 と し た 他 に 対照試料 と し て、 1 0 m M ト リ ス バ ッ フ ァ ー （ p H

7 . 5 ) の み を 用意 し た

各試料 1 0 0 0 μ 1 を加え た ガ ラ ス 製試験管 に 後述の 参考例 6 一 に記載の方法で得 ら れ る T P O 3 // g を 含む溶液 5 n 1 を 加 え 、 室 温 に て 放 置 し た 。 0 . 5 分 、 1 時 間、 2 時 間後 に 1 0 ^ 1 ずつ採取 し 、 E L I S A 法 に て溶液中の T P O 量 を 測 定 し 、 期待値 に 対す る 回収率を求 め た

そ の 結果を 図 2 に 示す。 図中、 B L A N K は 1 0 m M 卜 リ ス バ ッ フ ァ 一 （ p H 7 . 5 ) の み の 場 合、 H S A は ヒ 卜 血清 ア ル ブ ミ ン を 示す。 図 よ り 、 ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン が吸着防止効果を 示す こ と が判明 し た

< 実験例 2 >

表 2 に 示す各種添加剤を 0 % の 濃度で 1 0 m M 卜 リ ス バ ッ フ ァ ー （ ρ Η 7 · 5 ) に 溶解 し た も の 1 0 0 0 〃 1 を 加え た ガ ラ ス 製試験管 に 後述の参考例 に 記載の 方法で得 ら れ る Τ Ρ 0

[ Τ Ρ 0 (1-332 C Η 0 ] 3 ju g を 含 む溶液 2 . を 加え 、 E L I S A 法 に よ り 2 4 時間放置後の 回収率 を 測定 し た 結果を表 2 に 示す

O 96/28181

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表 2 添加物 （ 添加 濃 度 l m g Z m l ) IsJ収 率 % ) ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン 8 3 . 3 精製 ゼ ラ チ ン （ タ イ プ A ) 1 0 8 . 8 精製 ゼ ラ チ ン （ タ イ プ B ) 8 5 . 3 メ チ ル セ ル ロ ー ス 8 7 . 9 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル セ ノレ ロ ー ス 8 6 . 2 ヒ ド ロ キ シ ェ チ ゾレ セ ル ロ ー ス 7 3 ， 7 ポ リ ビ ニ ル ア ル コ ー ル （$分けん化物） 8 7 . 7 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン 硬 化 ヒ マ シ 油 6 0 7 5 . 2 ポ リ ソ ル ベ ー ト 8 0 8 1 . 5 モノラウリン ¾ ホ ° リ才キシエチレン'ノルヒ' 夕ン 8 3 . 0 ホ。 リォキシエチレン （160 ) ホ。 リオキシプ Dヒ。 レン （ 30 )グリコール 8 1 . 6 モ ノ ォ レ イ ン 酸 ソ ル ビ タ ン 1 1 8 . 8 シ ョ 糖 モ ノ ラ ウ リ ン 酸 エ ス テ ル 7 8 . 3 塩 化 べ ン ゼ ト ニ ゥ ム 1 2 0 . 4 カ プ リ ノレ 酸 ナ ト リ ウ ム 6 9 . 9 亜硫酸 ナ ト リ ゥ ム 7 5 . 5 無 添 加 5 9 . 1 表か ら 明 ら か な よ う に 、 ガ ラ ス 製試験管 に接触 し た と き に み ら れ る T P 0 の 吸着を 各種添加剤が防止す る こ と が判明 し た。 組成物の実施例 を 以下 に 示す

ぐ 実施例 1 >

P H 6 . 0 の 5 m M リ ン 酸 緩 衝 液 1 0 m l 中 に T P O

1 0 0 0 g > ヒ ト 血清 ァ ノレ ブ ミ ン 0 . 0 2 5 g 、 塩化 ナ ト リ ゥ ム 8 7 . 6 6 m g を含む水溶液を無菌的 に 調製 し 、 1 m l ず つ バ イ ア ル に 分注 し 密封す る

< 実施例 2 >

実施例 1 に お け る ヒ ト 血清 ア ル ブ ミ ン 0 . 0 2 5 g に ザ え て 精製ゼ ラ チ ン （ タ イ プ B ) 0 . l g を用 い 、 同様 に し て製剤 を 調製 し た

< 実施例 3 >

P H 6 . 0 の I m M ク ェ ン 酸緩衝 液 1 0 m l 中 に T P O

2 5 0 0 g > ポ リ ソ ノレ べ ー ト 8 0 0 m g 、 ソ ル ビ ト ー ル

0 . 5 g を含む水溶液を無菌的 に 調製 し 、 l m 】 ずつ バ イ ァ ル に 分注 し 密封す る 。

ぐ 実施例 4 >

P H 6 . 5 の l O m M 卜 リ ス 緩 衝液 1 0 m l 中 に T P O 2 5 0 0 g ポ リ オ キ シ エ チ レ ン 硬化 ヒ マ シ 油 6 0 0 m g 、 塩化 ナ ト リ ウ ム 8 8 2 m g を含む水溶液を無菌的 に調 製 し 、 1 m 1 ずつ バ イ ア ル に 分注 し 密封す る 。

以下、 参考例 と し て 本発明 の有効成分で あ る T P 0 の 製造例 を示す

< 参考例 〉 T P O ( 1 - 332 ) / CH0 の製造例

( 1 ) C H O 細胞 （ dh i r— 株、 Ur l a u bと Ch s i n ; P r o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA； 7 7 卷 4 2 1 6 頁、 1 9 8 0 年） を 6 径 の プ レ ー ト （ Fa l c on社製） 中 1 0 % 牛胎児血清を 含む α 最小必須 培地 （ α - MEM ( — ） 、 チ ミ ジ ン 、 ヒ ポ キ サ ン チ ン 添加） で培養 増殖 さ せ、 こ れを リ ン 酸 カ ノレ シ ゥ ム 法 （ C e 11 p h t 、 フ ア ル マ シ ァ 社製） に よ っ て 、 プ ラ ス ミ ド P D E F 2 0 2 - h T P 0 - P 1 で形質転換 し た。

す な わ ち 、 配列番号 2 の c D N A イ ン サ ー ト 部分 を 含む p D E F 2 0 2 - h T P 0 - P I プ ラ ス ミ ド 1 0 u g に バ ッ フ ァ ー

2 0 \ お よ び Η₂ 0 2 0 1 1 を 加え混合 し た の ち 室温で 1 0 分間放置 し た。 つ ぎ に 、 こ の溶液 に バ ッ フ ァ ー Β ： 1 2 0 ^ 1 を加え 、 再度混合 し た の ち 、 室温で 3 0 分間放置 し た。 こ の DNA 溶液を前述の プ レ ー ト に滴下 し た の ち 、 C0₂ イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中で 6 時間培養 し た。 プ レ ー 卜 か ら 培地を 除去 し a MEM ( - ) に て 2 回洗浄後 、 1 0 % ジ メ チ ノレ ス ノレ フ ォ ォ キ シ ド含有 α - MEM ( ― ) を添加 し 、 室温で 2 分間処理 し た。 次 い で 1 0 %透析牛胎児血清含有非選択培地 （ α - MEM ( ― ) 、 ヒ ポ キ サ ン チ ン 、 チ ミ ジ ン 添加） を 添加 し て 2 日 間培養 し た の ち 、 1 0 %透析牛胎児血清含有選択培地 （ a -MEM ( - ） 、 ヒ ポ キ サ ン チ ン 、 チ ミ ジ ン 無添加） で の選択を お こ な っ た。 選択 は細胞 を ト リ プ シ ン 処理 し た後、 6 cm径 プ レ ー ト 1 枚あ た り を 、 0 cm径 プ レ ー 卜 5 枚 あ る い は 2 4 ゥ エ ル プ レ ー ト 2 0 枚 に 分割 し た の ち 、 2 日 ご と に選択培地 に て培地交換を行 い な が ら 培養 を 続行す る こ と に よ り 実施 し た 。 細胞が増殖 し て き た プ レ ー ト ぁ る い は ウ エ ノレ に つ い て は そ の 培養上清中 の ヒ ト T P 0 活性 を 測 定 し た。 培養上清中 に ヒ ト T P O 活性の認め ら れ た も の に つ い て は新 し い プ レ ー ト あ る い は ウ エ ノレ に 2 5 πΜの メ ソ ト レ キ セ 一 ト を含む選択培地で 5 に 細胞を分割 し 、 培養 を続行す る と に よ り メ ソ ト レ キ セ ー 卜 に 耐性の細胞 を増殖 さ せ て ク ロ ー ニ ン グを行 っ た

な お 、 C Η 0 細 胞 の 形質転換 は C Η 0 細胞 に 対 し ρΗΤ Ρ - 1と pMG lを 同時形質転換 （ t o- t r a n s f e c t i o ii ) す る こ と に よ つ て も 行 う こ と がで き る 。

プ ラ ス ミ ド p D E F 2 0 2 — h T P O — P l に よ っ て形質転 換 さ れた C H O 細胞株 （ CHO- DUKXB11 ) は 1 9 9 5 年 1 月 3 1 日 付で 日 本国の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 に 受託番号 F E R M B P — 4 9 8 8 と し て、 ブ タ ペ ス ト 条約 下 で国際寄託 さ れて い る 。 上記 C H O 細胞株 は ま た 、 中国寄託 機関 （ C C T C C) に 、 C H 0 28Z 1 ノ 1 3 — C 6 と し て受託番 号 CCTCC- C95004で寄託 さ れて い る 。

( 2 ) ヒ ト T P O 産生 C H O 細胞株の培養 お よ び ヒ ト T P O の 精製

TX 耐性化を繰 り 返 し て 得 ら れ た ヒ 卜 T P O 産生 C H O 細胞 株 （ CH028/1/1/3 - C6株、 4 0 0 ηΜ ΜΠ耐性） は以下 の よ う に し て実施 し た。 細胞を 4 0 0 nM MT) (お よ び 10% FCS を 含む DMEM/F -12 培地 （ G 1 BC0 社） を用 い て培養増殖 さ せ た。 こ の細胞を ト リ ブ シ ン 溶 液 を 用 い て 剥 離 し た の ち 、 2 QGni l の 同 培地 を 含 む Fa l c on社製 ロ ー ラ ー ボ ト ル （ Fa l c on300 ) に l x l O ⁷ 個の钿 胞 を接種 し 37て で l rpm の 回転速度で 3 日 間培養 し た。 3 日 後， 培 養 液 を 吸 引 除去 し 、 50m lの PBS で細胞 を リ ン ス し た の ち 、 400 nM MTX お よ び 10% 卩 CS を 含 ま ず、 2 / g/m lイ ン シ ュ リ ン 、 10 ^ M 硫酸銅を 含む ！) MEM/F- 12 培地 （ G 1 BC0 社） を 300m l 加 え - 37 で l rpmの回転速度で 4 日 間培養 し 、 4 曰 後そ の 培養上澝 を 回収 し た （ハ ー べ ス ト 1 ) 。 更 に上記生産培地を 3QQm l 加 え 、 同様に 37て で l f praの 回転速度で 4 日 間培養 し 、 4 日 後 そ の培養 上淸を 回収 し た （ ハ ー べ ス ト 2 ) 。

双方を あ わせ て得 ら れた C H O細胞無血清培養上清約 22G L を 0. 5 /i m フ イ ノレ タ ー （ 日 本 ポ ー ル社製、 F UTER CARTR I DGE) で濂過 し 、 こ れを 限外濂過 （ F TRON 社製、 CENTRASETTETM OMEGA 30 k cu t ) で濃縮かつ 溶媒を ΠηιΜリ ン 酸 カ リ ゥ ム 緩衝液 ( H6. 8 ) に 置換 し 、 容量を約 5 し と し た。 こ れ に 蛋 白 質分解 酵素阻害剤で あ る E- 64 (ペ プチ ド研） を最終濃度 10 // M と な る よ う に 加え、 予 め lOmMリ ン酸カ リ ウ ム 緩衝液 （ pH6. 8 ) で平衡 化 し て お い た S P S e p h a r 0 s e F F カ ラ ム （ フ ァ ノレマ シ ア 社製、 直 径 11 c m , べ ッ ド高 10 c m ) に 流速 10 D m I / m i m で添加 し た。 そ の後 平衡化緩衝液で洗浄 し た後、 0. 3M塩化 ナ ト リ ゥ ム を 含む lQmMリ ン酸 カ リ ウ ム緩衝液 （ pH6. 8 ) ΠΟΟπιΙで溶出 し た。 こ の 溶出 液 に 3 gの 硫酸 ア ン モ ニ ゥ ム を加え 、 1200Qx g で 20分遠心後、 上 淸 を 1. 2 M硫酸ア ン モ ニ ゥ ム を含む 10mMリ ン 酸 カ リ ゥ ム 緩衝液 ( P H 6. 8 ) で 平 衡化 し て お い た M a c r 0 P r e p Me t hy l 1Π Cカ ラ ム ( B i o-Ra d 社製、 直径 6cni, べ ッ ド高 30 c m ) に 流速 100 m I /m i ra で 添加 し た。 添加終了後、 平衡化緩衝液で洗浄 し た後、 0. 5 M硫 酸 ア ン モ ニ ゥ ム を 含む l GmMリ ン 酸 カ リ ウ ム 緩衝液 （ PH6. 8 ) 700ml で溶出 し た。 こ の溶出液 に プ ロ パ ノ ー ルを 80ml加え た 後 S0URCE15RPC カ ラ ム （ フ ア ル マ シ ア 社製、 直径 3. 5cm, べ ッ ド高 10cm) に 流速 16 m I /m i mで添加 し た。 添加終了後、 10 % プ ロ パ ノ ー ルを含む l QmM卜 リ ス 緩衝液 （ pH7. 5 ) (展開溶媒 A ) で洗浄 後、 展開溶媒 A 力、 ら 80% プ ロ パ ノ ー ル を含む lOniMト リ ス 緩衝液 ( H7. 5 ) (展開溶媒 B ) で プ ロ パ ノ ー ノレ濃度が 70 % に な る ま で 60分間の 直線 グ ラ ジ ェ ン 卜 で溶 出 し た。 直線 グ ラ ジ ェ ン ト を '始め て か ら 25分付近の画分 192m l を 回収 し 、 こ れを 2 回 に わ け て P B S で平衡化 し て お い た S u p e r d e X 200 p g カ ラ ム （ フ ア ル マ シ ァ 社製、 直径 10 c D1 , べ ッ ド高 56 c m ) に 供 し 、 流速 40 m I /m i mで溶 出 し た。 溶出液を SDS- PAGEで分析 し た と こ ろ 、 T P O と 思わ れ る 分子量約 dGG-lGOOQOの分子 は、 保持時間 - 52 分付近 に 得 る こ と がで き 、 単一な バ ン ド で あ る こ と が確認で き た。 さ ら に ウ ェ ス タ ー ン 分析 に よ り 、 こ の タ ン パ ク 質力 T P O であ る こ と を確認 し た。 こ の サ ン プルの一部を取 り 、 N 末端ア ミ ノ 酸分折 お よ び ア ミ ノ 酸組成分析を行 っ た結果、 非常 に高度 に 精製 さ れ、 配列番号 1 の ァ ミ ノ 酸配列 1 位〜 3 3 2 位を 有す る T P O が約 230 mg 得 ら れ た こ と がわ か っ た。 配列表

配列番号： 1

配列の長さ ： 332

配列の型： アミノ酸

配列の種類： 夕ンパク質

起源： ヒ ト (H omo S a p i e n sリ

配列

Se r Pro A I a Pro Pro Ala Cys Asp Leu A r g Va I Leu Se r Ly s Leu Leu

1 5 10 15

Arg Asp Ser His Va I Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro GI u Va I

20 25 30

His Pro Leu Pro Thr Pro Va I Leu Leu Pro Ala Va I Asp P e Ser Leu

35 40 45

GI y Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala G! n Asp lie Leu

50 55 60

Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Va 1 Met Ala Ala Arg Gl y Gin 65 70 75 80

Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser G 1 y Gin

85 90 95

Val A r g Leu Leu Leu Gly A I a Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu

100 105 110

Pro Pro Gin Gly Ar g Thr Thr A I a His Lys As Pro As n A 1 a lie Phe

115 120 125

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu A rg G 17 Lys Va I A rg P e Leu Met Leu

130 135 HO

Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160

Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Va 1 Leu Thr Leu As n Glu Leu Pro Asn

165 170 175

οεε sze

O "19 "19 ^η3Ί USY uj[) J SS S !H J i Hi on si£ οιε sos

JI (丄 USY nai nsq OJJ i3§ OJJ jqi OJJ jqj, OJ j Bjy as ojd dsy

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O ssz oez

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5H OH ί 19 o id a 11 u|j) dsy n3 J3$ 8jy i¾s ^JU "19 ^USV ^η3Ί ^η3Ί ί 19 ^0Jd

S02 00Z S6I

3| I si] B I v ny a i 19 «!D «19 ^dU ⁿU ^η3Ί 』³S ^ ID ^J1U

061 S8I 081

Ji|丄 v B|V J3S B|V JU a usV "I9 naq ί |g § Ji|l 3 V

- S 2 -

I818Z/96 OAV6df/XDJ 配列番号： 2

配列の長さ ： 1086

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー ：直鎖伏

配列の種類： c DN A t o m R N A

起源： ヒ ト （H om o S a i e n s)

組織の種類：肝臓

配列

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA 24

ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 72 Met Gl u Leu Th r G i u Leu Leu Leu Va 1 Va 1 Me t Leu Leu Leu Th r Ala

-20 -15 -10

AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 120 Arg Leu Th r Leu Se r Se r Pro Ala Pro Pro A 1 a Cy s Asp Leu Arg Va 1 -5 1 5 10

CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 168 Leu Se r Ly s Leu Leu Arg Asp Se r His Va I Leu His Se r Ar Leu Se r

15 20 25

CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT 216 Gin Cys Pro Gl u Va 1 His Pro Leu Pro Thr Pro Va I Leu Leu Pro Ala

30 35 40

GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 264 Yal Asp Phe Ser Leu Gl Glu Trp Lys Thr Gin Met Gl u Glu Thr Lys

45 50 55

GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 312 Ala Gin A p l ie Leu G I y A 1 a Va I T r Leu Leu Leu Glu G 1 y Va I Met 60 65 70 75

GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 360

V09 1VV Oil 313 VV9 3V3 VIV ODV 3YV 913 ；) V丄 303 3IV WD 0V9 on

n 91 l a § 2』v "S u sy n 31 Oi<J 3 I [ si i B I v 3 jy 9 913 D31 DDV 331 33V VV3 OVV 913 313 丄 3ί) 130 1XV 9VV 339 VDV DIJ,

S6I 061

ί 10 ϋ|9 «19 丄 "1 mi nsi 3 り!） 3 JV M V J 3S y

969 V39 DVD DVD 901 9VV 9ID 丄丄〕 3：)；) I3V 丄っ V V9V ODD VOI ODD

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8H I3V Oil OVV V3V 0V9 311 911 V9D iOi IOV 30V OVV VOO DID DV9 DVV

Oil S9I 091

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- 8 3 -

S£900/96df/X3d I8I8Z/96 OAV

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 糖 鎖部を有す る T P O タ ン パ ク 質 と 、 タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 界面活性剤、 ポ リ ビニ ル ア ル コ ー ルか ら な る 群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種の薬学的 に 許容 さ れ る 添加剤 と を 含む こ と を特徴 と す る T P O 含有組成物。

2 . T P O 含 有組 成 物 を 水 溶 液 と し た 場 合 に 、 該添加剤 が 0 · 0 0 1 〜 1 0 %で あ る 請求項 1 に 記載の T P O 含有組成物

3 . 該 タ ン パ ク 質 が 、 ヒ ト 血 清 ア ル ブ ミ ン 、 お よ び Z ま た は ゼ ラ チ ン であ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に 記載の 丁 P 0 含有組成物。

4 . 該 セ ル ロ ー ス誘導体力く 、 メ チ ル セ ル ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル セ ノレ ロ ー ス 、 ヒ ド ロ キ シ ェ チ ノレ セ ノレ ロ ー ス か ら な る 群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に 記載の T P O 含有組成物。

5 . 該界面活性剤が、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン硬化 ヒ マ シ 油、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ヒ マ シ 油 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ソ ゾレ ビ タ ン 脂 肪酸エ ス テ ル 、 ポ リ オ キ シ エ チ レ ン ポ リ オ キ シ プ ロ ピ レ ン グ リ コ ー ル 、 ソ ル ビ タ ン 脂肪酸エ ス テ ル 、 シ ョ 糖脂肪酸エ ス テ ル 、 芳香族四級 ア ン モ ニ ゥ ム 塩、 力 プ リ ル酸ナ ト リ ウ ム 、 亜硫酸 ナ ト リ ゥ ム か ら な る 群 よ り 選ばれ る 少な く と も 1 種 で あ る こ と を 特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に 記載の T P 0 含有組成物。

6 . 糖鑌部を有す る T P O タ ン パ ク 質を 含有す る 組成物中 に タ ン パ ク 質、 セ ル ロ ー ス 誘導体、 界面活性剤、 ポ リ ビニ ル ア ル コ ー ルか ら な る 群 よ り 選ばれ る 少 な く と も 1 種の 薬学的 に 許容 さ れ る 添加剤を含有 さ せ る こ と を特徴 と す る 、 該組成物を 含有 す る 容器壁上への T P 0 の吸着に よ る 力価低下を 防止す る た め の方法。