WO1996031224A1

WO1996031224A1 - Immunosuppressant

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Publication number: WO1996031224A1
Application number: PCT/JP1996/000959
Authority: WO
Inventors: Masahiro Nagamuta
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-08
Publication date: 1996-10-10
Anticipated expiration: 1997-10-07
Also published as: EP0856314A4; JPH08333262A; AU5163196A; EP0856314A1; AU693337B2

Description

明細書

免疫抑制剤

技術分野

本発明は、免疫抑制剤、該免疫抑制剤が移人された免疫抑制動物およびその作成方法、並びに該免疫抑制剤を用いた疾患の治療方法又は予防方法に関する。背景技術

臓器移植においては、近年免疫抑制剤が広く臨床で用いられている。

しかしながら、これらの製剤は、免疫系に対し非特異的に作用し、外来からの感染のみならず、悪性腫瘍の誘発など内在性の疾患発症などの副作用を発現する危険性をもっていることから、使用の対象となる疾患が非常に限定される。従つて、目的とする抗原に対して特異的に抑制効果を誘導する薬剤が必要とされている o

抗原特異的免疫抑制の誘導方法として、脾臓由来の細胞と抗原を、 1 -ェチル - 3 - ( 3—ジメチルァミノプロピル）一カルボジィミド（E C D I ) を介して結合させ、静脈内より移植することにより Tリンパ球の反応性を低下させる方法が報告されている（M.K. Jenkins, J. Exp. Med. , vol.165, 302 (1987))。しかしながら、この方法では E C D I処理時に併発する自己抗原の変性や、 E CD Iの化学的結合により自己又は外来性物質において新たな抗原性が発揮されることで、自己免疫疾患の発症が懸念される。また、残存する E C D Iによる予期しない生体反応が誘導されることも予想され、このような点で副作用が発現する可能性がある。また、免疫抑制を誘導する担当細胞が明らかになっておらず、さらに抗体産生に与える影響について検討されていない（M.K.Jenkins et al., J. Exp. Med. , vol.165,302-319， (1987))。

一方、近年 Bリンパ球細胞が免疫抑制的作用の誘導を担当する細胞である可能性が報告された (Hori, S. S. , J. Immunol, vol.143, 1447 (1989))。これまで、 Bリンパ球細胞は抗原を細胞内に取り込み断片化した後、主要組織適合遺伝子複合体（MHC) 抗原と共に同細胞上に提示することで、むしろ Tリンパ球細胞を活性化し免疫系を賦活化すると考えられてきた。ところが、 Bリンパ球細胞表在性抗原に結合性をもつ異種動物で作成した抗体を投与することで、異種動物由来の抗体に対する抗体産生能が抑制されることが報告され、 Bリンパ球細胞が抗体産生抑制作用をも合わせ持つことが間接的に証明された（E. E. Eyron, J. Exp. Med ■ vol. 175, 131 (1992) ； S. C. Morr i s, J. Immunol, vol. 152, 3768 (1994) ； S. C. Morr i s, J. Immunol, vol. 152, 3777 (1994))。ただし、免疫抑制を誘導できる抗原物質は異種動物由来の抗体であり、かつ、 I g D、 C D 23又は C R 1を認識するものに限定される。さらに、この系では B細胞が実際に免疫抑制誘導の担当細胞であるかどうかの直接的な証明はなされていない。

Fuchs, E. J. (Sc i ence, vo l . 258, 1156, (1992) ) らは、 Bリンパ球細胞が免疫抑制を誘導する担当細胞であることを直接的に証明した。即ち、特定の抗原を発現するマウス由来の Bリンパ球細胞を、同抗原が発現しないマウスに移入することで、同抗原を認識する細胞障害性 T細胞の誘導が抑制されることを報告した。ただし、この系では、他の任意の抗原においては抗体産生抑制作用の誘導は困難であり、あくまでも Bリンパ球細胞表面上に存在する、一部の抗原に対してのみ抑制が誘導できると解釈され、また特定抗原に対する抗体産生能については不明な点が多い。

従って、 Bリンパ球細胞が任意の抗原に対し、免疫抑制作用を誘導できることは全く知られていない。発明の開示

本発明は、抗原に対して免疫反応を抑制することが可能な Bリンパ球細胞を含む免疫抑制剤を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題に基づき、抗原特異的な免疫抑制作用を示す薬剤について鋭意研究を重ねた結果、抗原と共に培養、又は抗原を細胞内に取り込ませるようにする処理（以下「接触処理」という）を施した Bリンパ球細胞をヒト又は動物に移入することで、該 Bリンパ球細胞が抗原特異的な T細胞反応および抗体産生に対し優れた抑制作用を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、抗原と接触処理することにより得られる B リンパ球細胞 (以下「抗原処理 Bリンパ球細胞」という）を含んでなる免疫抑制剤である。さらに、本発明は、抗原、抗原を封入若しくは付着せしめたリボソーム（以下

「抗原含有リボソーム」ともいう）又は抗原と Bリンパ球細胞結合性物質との結合物、或いはこれらのうち少なくとも二種以上の混合物を Bリンパ球細胞と接触処理することにより得られる抗原処理 Bリンパ球細胞を含んでなる免疫抑制剤であ O o

上記免疫抑制剤は、動物体内から取り出して免疫抑制作用を誘導させた Bリンパ球を該動物体内に移人して該動物の免疫を抑制させるために使用することがで

¾る。

本発明において「接触処理」とは、例えば抗原又は抗原と B リンパ球細胞結合性物質との結合物（以下「抗原— Bリンパ球細胞結合性物質結合物」ともいう）を、 Bリンパ球細胞とともに適当な培養液中で培養するか、抗原含有リボソームと Bリンパ球細胞とを細胞融合処理するか、マイクロインジクション等により抗原を Bリンパ球細胞中に注入するといつた処理等をいう。

ここで、抗原としては、例えば組織適合抗原などの細胞および組織由来抗原、アレルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原（食品由来抗原、抗原性を示すことが予想される薬剤若しくは製剤中に共存する物質、又は人工臓器関連物質 ) 等が挙げられる。

B リンパ球細胞結合性物質としては、例えば抗体、抗体の一部又は架橋剤が挙げられる。

抗原一 Bリンパ球細胞結合性物質としては、前記抗原と前記 Bリンパ球細胞結合性物質との化合物等のほか、遺伝子工学的手法により、抗原遺伝子と B リンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遺伝子を発現させて得られたものなどが挙げられる。

さらに、本発明は、前記免疫抑制剤を動物に移入することを特徴とする免疫抑制動物の作成方法である。

さらに、本発明は、前記免疫抑制動物の作成方法により作成された免疫抑制動物である。動物としては、例えば、実験動物が挙げられる。

さらに、本発明は、前記免疫抑制剤をヒトに投与することを特徴とする疾患の治療方法又は予防方法である。本発明の免疫抑制剤は、移植拒絶、アレルギー、自己免疫疾患又は移植片対宿主病などに対して使用される。

さらに、本発明は、抗原を封入又は付着せしめた該抗原含有リボソーム又は抗原と Bリンパ球細胞結合性物質との結合物である。かかるリボソーム若しくは結合物は、それぞれ単独で又は両者を混合して形成された組成物であってもよい。なお、本発明において、抗原と B リンパ球細胞結合性物質との結合物の 1つとして、抗原遺伝子と Bリンパ球細胞結合性物質の遗伝子とを含む遗伝子を発現させて得られたものも含まれる。

また、前記の抗原含有リボソーム、抗原一 Bリンパ球細胞結合性物質結合物及び抗原遺伝子と Bリンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遺伝子の発現産物等は、本発明の抗原処理 Bリンパ球細胞を作製するための抗原（後出の「広義の抗原」）として使用できるものである。

さらに、本発明は、 B リンパ球細胞と接触処理することにより該 B リンパ球細胞に免疫抑制作用を誘導することができる抗原である。 Bリンパ球細胞としては、動物体内より得られたものが挙げられる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の免疫抑制剤は、抗原そのもの、抗原含有リボソーム、抗原一 Bリンパ球細胞結合性物質結合物、或いはこれらのうちの少なくとも二種以上の混合物を、 Bリンパ球細胞と接触処理することにより作製することができる。

( 1 ) Bリンパ球細胞の単離

B リンパ球細胞（以下「B細胞」ともいう）は、ヒト又は動物の、骨髄などの一次リンパ器官、血液、脾臓若しくは腸間膜などを含むリンパ節などの二次リンパ器官又は各種臓器若しくは組織に存在する。そこで、これらの組織中から以下の方法により B細胞を単離する。

すなわち、ヒト若しくは動物から採取した血液、又は動物を開腹して採取された脾臓若しくは腸間膜を適当な細胞培養液、例えば M E M、又はゥシ胎児血清（ F C S ) 若しくはゥシ血清アルブミン（B S A ) を含む R P M I— 1 6 4 0培地に懸濁する。腸間膜リンパ節を含む各所属リンパ節についてはハサミで細切後、脾臓については摘出したままの状態で、また、各種臓器、組織についてはコラゲナーゼや D N a s eなどの酵素処理又は E D T Aなどのキレート剤で処理した後に、それぞれ金属メッシュにのせ、上から軽く圧迫することで内部のリンパ球細胞を組織外に追い出す。細胞の生存率を高めるために酵素処理はできるだけ锾ゃかな条件で行うのが好ましい。金属メッシュを通過した細胞を軽くピベッティングした後、約 100 X Gで遠心し上清を得、沈渣の組織断片や細胞の会合体を除くことで単細胞化したリンパ球を得る。

次に、上記血液又は単細胞化した細胞懸濁液からの通常のリンパ球分離方法、例えば、 Fi col l密度勾配遠心分離法等により、リンパ球分画を得る。但し、このリンパ球分離操作は必ずしも必要としない。得られたリンパ球含有懸濁液から、通常のネガティブセレクション若しくはポジティブセレクション又はこれらの組み合わせなどによる B細胞分離方法により B細胞を得る。

例えば、ネガティブセレクションにおいては、リンパ球含有懸濁液に抗 Thy- 1 抗体、抗 C D 4十 C D 8抗体などの抗 T細胞抗体を加え低温で結合させ、その後細胞毒性の低い捕体を添加して 37°Cで反応させて T細胞を除去する。補体添加後の培養時間は通常 30〜40分間で行い得るが、必要最小限の時間で行うことが望ましい。又は、リンパ球含有懸濁液にマグネチックビーズに結合させた抗 T細胞抗体を加え反応させた後、磁石により T細胞を除去する。又は、リンパ球含有懸濁液に蛍光標識した抗 T細胞抗体を加え反応させた後、フローサイトメータ一により T細胞を除去する。

—方、ポジティブセレクションにおいては、リンパ球含有懸濁液にマグネチックビーズに結合させた、若しくは蛍光標識した抗 B細胞抗体を用い、上述のようにそれぞれ磁石又はフローサイトメータ一により B細胞を分離する。

いずれの手法においても、必要な場合を除いて低温処理を行い、細胞をより良い状態に保つことが好ましい。このようにして得られた残りの懸濁液（B細胞分画）中には少数の樹枝状細胞が存在することが予想される。樹枝状細胞が抗原に対する抗体産生を増強させる作用があることから、樹枝状細胞の混在が免疫抑制作用に大きく影響を及ぼすと考えられる。従って、できる限り樹枝状細胞を取り除く作業を行うことが好ましい。例えば、 B細胞を含む懸濁液を Sephadex G-10 カラムに 2度かけることで、樹枝状細胞やマクロファージを除くことができる。

B細胞はカラムに吸着せずに流出するので、溶出した非付着性の細胞を B細胞として得る。

尚、動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ブタ、サル等の実験動物が挙げられる。

(2) 抗原

1) 本発明において、「抗原」とは、生体に免疫応答を引き起こす活性（抗原性）の有無を問わず、免疫抑制の目的となる任意の抗原をいう。好ましくは Bリンパ球と直接接触処理することにより、該細胞に免疫抑制作用を誘導することができる抗原が使用できる。具体的には、例えば組織適合抗原など細胞及び組織由来抗原、アレルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原（食品由来抗原、抗原性を示すことが予想される薬剤若しくは製剤中に共存する物質、又は人工臓器関連物質、又はそれらの変性物（例えば熱変性物等）；以下「原因抗原」を「原因物質」ともいう）などが挙げられる。

細胞及び組織由来抗原とは、宿主の持っていない対立遺伝子の産物全般をいう。特に、主要組織適合抗原（MHC抗原）や非主要組織適合抗原が中心的な対象となる。 MHC抗原とは、移植片拒絶反応はもとより、生体の免疫反応に関係した機能を営む抗原系である。該抗原系には、 HLA抗原、 H_ 2抗原、 RT 1抗原、 Hm— 1抗原、 GPLA抗原、 RLA抗原、 DLA抗原、 FLA抗原、 S L A抗原、 C y LA抗原、 R h L A抗原などが含まれ、それぞれヒ卜、マウス、ラット、シシリアンハムスター、モルモット、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ブタ、カニクィザル、ァ力ゲザルの MH C抗原などを意味する。

アレルギーの原因物質には環境，花粉抗原、真菌抗原、食物抗原、人工抗原等が含まれ、例えば、環境 '花粉抗原としてはダニ、ハウスダスト、スギ花粉、ブタクサ等、真菌抗原としてはカンジダ、アルテルナリア、ァスペルギルス、クラドスポリゥム、ぺニシリウム等、食物抗原としては卵白、牛乳、大豆、小麦粉、ソバ粉、サバ、イワシ、アジ、ェビ、力二、ブタ肉、牛肉、トリ肉等、人工抗原としては薬剤、人工臓器等が挙げられる。また、自己免疫疾患の原因物質としては以下の表 1に記載のとおり、疾患の原因となる自己抗体の対応抗原が挙げられる表 1

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a . Addison Λ idiopathic Addison's disease

9 . St mate infertitity 着重

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1. S 5^.5t≤§fl*iii autoimmune oophoritis 卵 a a^B月m ¾Ρ

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13. 3 行性糸！？体炎

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6. Sjogren Sf^U SM» (SS-A, SS-β). IgG. 外分泌上皮

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8. tt† /WBリウマチ rheumatoid arthritis IgG. M (RANA, ssONA).

9. 若年†1M リウマチ juvenile rheumatoid arthritis IgG. 核物

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0. 全身 system ic scleroderm a 核 i (核小体の polymerase 1, . Scl-70 topoisomerase 1)

1. CREST 核 ttW (中心 β)

2. ； ft"o SiR^lfllRW m ixed connective tissue disease 核物 (U 1-RNP) 但し、「抗原」とは上記した通りであるが（狭義の抗原を意味する）、上記抗原をリポソーム表面に付着させたもの若しくはリポソーム内に封入したもの、又は上記抗原を B細胞結合性物質に結合させた結合物なども抗原を含んだものであり、広義には抗原の意味である。したがって、以下本発明では特に示さない限り、「抗原」には抗原そのものの他、抗原含有リボソーム又は抗原一 Bリンパ球細胞結合性物質結合物のそれぞれ単独のものに限定されるものではなく、これらのうちの少なくとも二種類以上の混合物も含まれる。

従って、本発明では、上記抗原、抗原含有リボソーム又は抗原— Bリンパ球細胞結合性物質結合物をそれぞれ単独で用いる場合に限定されるものではなく、これらのうちの少なくとも二種類以上の混合物をも用いることができる。

2) 本発明では、上記抗原含有リボソームを使用することができる。

リボソームとは、一般には脂質人工膜の一種であり、多くのリン脂質、グリセ口糖脂質を少なくとも 50%以上の水に、その脂質固有のゲル一液晶相転移温度以上で懸濁すると自動的に脂質二重層から成る閉鎖小胞が形成される。リポソームは、生物的に分解可能な素材を含む閉鎖小胞で、内部の水層や脂質二分子層に種々の物質を保持させることが可能であることより、マイク口カプセルとしてリポソームを利用しょうとする試みも盛んである。

本発明においてリポソームは上述した如き抗原含有リポソームの作製に利用され、作製された抗原含有リポソームは B細胞と接触処理することにより本発明の抗原処理 Bリンパ球とすることができる。

本発明では、リポソームに抗原を封入又は付着させる方法については従来の公知技術を用いることができ、例えば、 C a— E D T A法等が挙げられる。リポソ —ムに付着又は封入された抗原を B細胞と接触させるための方法については後述する。

3) さらに、本発明では、本発明の抗原処理 B細胞を作製するにあたり、抗原一 B細胞結合性物質結合物を使用することができる。

抗原一 B細胞結合性物質結合物としては、例えば、上記抗原に、 B細胞に結合性の物質を結合させた物質、または、抗原遺伝子と Bリンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遺伝子を発現させて得られたもの（遺伝子工学的手法により発現させて得られる物質）が挙げられる。

B細胞結合性の物質としては、例えば、抗 I gM抗体、抗 I gD抗体、抗 CD 23抗体、抗 CR 1抗体等若しくはこれら抗体の一部（F a b, F c等）または架橋剤が挙げられる。架橋剤とは、その両端のうちの一方の端が B細胞、他方の端が抗原に結合することができる物質であれば特に限定はなく、例えば、スクシンィミジル 4- (N-マレイミドメチル）シクロへキサン-卜カルボキシレート（SMCC) 、スルホスクシンィミジル 4-(N-マレイミドメチル）シクロへキサン-卜カルボキンレート（Sulfo-SMCC)、 N-スクシンィミジル 3- (2-ピリジルジチォ）プロピオネート（SPDP)などの二官能性の化合物が挙げられる。抗原と B細胞結合性物質との結合物（抗原 - B細胞結合性物質結合物）の例として、例えば、抗原と抗 I g M抗体との結合物、抗原と抗 I gD抗体との結合物、抗原と SMC Cとの結合物、抗原と S PD Pとの結合物などのように、上記抗原から選ばれる群と、上記 B 細胞結合性物質から選ばれる群とを任意に組み合わせることができる。

上記抗原と上記 B細胞結合性物質とを結合させるための方法としては、例えば上記抗原又は上記 B細胞結合性物質に、 S - acetylmercaptosuccinic anhydride等の SH基導入剤を用いて SH基を導入し、更に上記の架橋剤（例えば SMC C) 等を用いて両者を結合させる、といった一般によく知られた方法が利用可能である。

遺伝子工学的手法により発現させて得られる物質とは、目的の抗原遺伝子と B 細胞に結合性の物質の遺伝子との連結遺伝子（天然または合成のいずれによっても得ることができる）を発現ベクターにつなぎ、宿主菌内で大量に発現させ精製して得られるものをいう。例えば、抗原の遺伝子の上流に、 B細胞表面抗原抗体遗伝子を導入して、それを発現させて得られるタンパク質などが挙げられる。その作製方法は以下の通りである。

即ち、抗原遺伝子と B細胞結合性物質の遗伝子（例えば B細胞表面抗原抗体遗伝子）との連結遺伝子（天然又は合成により、両者とも従来からの公知技術を用いて得ることができる）を発現ベクターに揷人し、発現プラスミドを構築する。次に、前記連結遺伝子を含む DN Aの全部又は一部を適当な制限酵素によって切り出し、これを適当なプロモーターの下流につないだ後、これを形質転換可能な宿主に導入することにより形質転換させる。ここで使用されるベクター D N Aとしては、プラスミドベクター、ウィルスベクタ一等が挙げられ、宿主としては、酵母、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。そして、前記形質転換体を一般に使用されている培地で培養し、その培養物（培養液、培養菌体若しくは培養細胞又は培養上清液）を集め、通常行われている方法によって精製すればよいなお、培養後の培養上清液については、遠心分離等を行って形質転換体を除くことにより、又は、集めた形質転換体を例えば緩衝液に懸濁させた後、凍結、融解処理、煮沸処理等を行い、遠心分離することにより、得ることができる。得られた培養物から抗原と B細胞結合性物質との結合物（遺伝子組換え型）を分離、精製するには、通常知られている蛋白質の精製方法に従えばよい。例えば、塩析法、遠心分離法、各種クロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わせて精製が行われる。

各種クロマトグラフィーとしては、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー等が挙げられる。また、精製品の純度及びおよその分子量の確認は S D S (ラウリル硫酸ナトリゥム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ウェスタンブロット法等を用いて行われる。

4) なお、組織適合抗原などの細胞および組織由来抗原に対する免疫抑制を行うことは、例えば臓器移植時の拒絶反応や骨髄移植時の移植片対宿主病（G V H D ； Graf t vs. hos t d i sease) を治療又は予防するのに有用であり、アレルギー原因物質（スギ花粉等）に対する免疫抑制を行うことは、例えば花粉によるァレルギー性鼻炎を治療又は予防するのに有用であり、食品タンパク質抗原（卵白ァルブミン等）に対する免疫抑制を行うことは、食品アレルギーを治療又は予防するのに有用である。また、人工抗原（薬剤等）に対する免疫抑制を行うことは、薬剤アレルギー、薬剤性自己免疫疾患などを治療又は予防するのに有用である。

( 3 ) B細胞と抗原の接触処理

本発明の免疫抑制剤は、抗原と B細胞を接触処理することにより得ることができる。本発明において B細胞と抗原の接触処理とは、例えば、 ① B細胞と抗原を適当な培養液中で培養したのち B細胞を回収すること、 ②細胞融合法、例えば抗原を付着又は内包するリボソーム（抗原含有リボソーム）と B細胞を接触させて細胞融合させたのち融合細胞を回収すること、或いは③マイクロインジヱクションにより B細胞内に抗原を注入し抗原が注入された B細胞を回収すること、を意味する。 ①及び②のごとく処理されたものは、抗原が B細胞表面に付着したのち細胞内に取り込まれるか、或いは直接的に取り込まれる等して、いずれも結果的には抗原が細胞内に取り込まれるものと考えられる。

この接触処理のうち、抗原そのものを B細胞と接触処理する場合、又は抗原一 Bリンパ球細胞結合性物質結合物を B細胞と接触処理する場合は、一般に行われている細胞培養法により行うことができ、抗原が付着若しくは封入されたリポソーム（抗原含有リボソーム）と B細胞とを接触処理する場合は、該リボソームと B細胞とを一般に行われている細胞融合法により行うことができる。

以下に具体的な手法を説明する。

1 ) 培養による方法

上記（1 )により調製された B細胞を、上記（2)に記載の抗原とともに培養し、 B 細胞に抗原を接触させて、抗原の B細胞への付着又は取り込みを行う。

培養は、以下のとおり行う。

B細胞を培地（例えば 10% F C Sを含む R P M 1 - 1 6 4 0培地）中に懸濁し、抗原を添加して培養する。 B細胞と抗原との混合比率は特に限定されず、適宜定めることができる。培養時間（B細胞に抗原を感作させる時間）は 90分〜 18時間であるが、抗原の種類やその性状に応じて適宜時間を調節することができる。また、培養は、通常行われている条件で行うことができ、例えば 5 %C0₂ 濃度、 37°Cで行うことができる。具体的には、例えば、 1 10⁷個 4 1111 ( 10% F C S を含む R P M I - 1 6 4 0培地）の細胞浮遊液を調製し、これに抗原である卵白アルブミン（O V A ) 50 /z g/ml を添加し、 90分培養する（ 5 % CG₂ , 37°C ) 。一定時間培養した後、 B細胞及び抗原が含まれた培養液を洗浄し、抗原を除去する。洗浄は、 300〜400 X Gで 5〜10分間遠心分離を行い、上清を除き、抗原を含まない M E M培地などに再浮遊する。

このように処理することにより、抗原は B細胞に付着したのち B細胞に取り込まれるなどして本発明の抗原処理 B細胞となる。

2) 細胞融合による方法

細胞融合による方法の一例としては、専らリボソームを用いる場合の接触処理手段である。すなわち、上記（1)により調製された B細胞と、上記（2)に記載の抗原を付着又は封入させて得られるリポソ一ムとを融合させて、抗原の B細胞への付着又は取り込みを行う。あるいは、抗原を封入又は付着させたリボソーム若しくは赤血球と細胞とを融合させる方法又は抗原抗体反応を利用する方法が挙げられる。

例えば、 C a _EDTA法によるリボソームへの抗原の封入又は付着を行った後、これをグリセロール処理により B細胞と融合させる。すなわち、ホスファチジルセリン 5〃M、コレステロール 5 Mを P B S 1 mlに懸濁し、超音波処理を 60分間行う。終濃度 2mMとなるように CaCl₂ を加え、 37°Cに 60分間保温する。生じたシリンダー（白沈）を、遠心（2500XG, 10分）で集める。抗原を含む溶液 0.5 mlを加え、攪拌する。 EDTA— N a (NaOHを加え、 pH7.4 とする） 15m Mを加え攪拌する。 37°Cに 30分保温することでリボソームが形成される。これを P B Sにて 2回洗浄（48，000XG， 20分）し、 P B Sなどに懸濁する。 MEM培地に浮遊させ、 37°Cに保温した B細胞に直接リボソーム懸濁液を加え、 37°Cにて 30分保温する。培地を 25%グリセロールとなるように調製し、 4分間処理する。その後、 MEM培地で 2回洗浄し、新しい培地に移す。

このように抗原がリポソーム内に封入されるか、リボソーム上に付着することなどにより、抗原含有リポソームが作成される。

3) マイクロインジェクションによる方法

マイクロインジヱクションによる方法は、専ら抗原を B細胞内に取り込ませるために行われる手段である。すなわち、公知の方法により直接 B細胞内に抗原を導入する。

(4) 免疫抑制方法

上記のように処理して得られた B細胞（抗原処理 Bリンパ球細胞）を、ヒト又は動物に移入することによりヒト又は動物の免疫抑制を行う。

「移入」とは、抗原との培養後洗浄により該抗原を除去して得られた B細胞（抗原処理 Bリンパ球細胞）を、静脈注射、点滴静注等により静脈から注入すること、又は組織内に直接移植することなどをいう。移入には、 1回の移入に限らず、複数回の移入、即ち再移入も含まれる。尚、本発明では、「移植」と「移入」を同義で用いることもある。

「ヒト又は動物」は、上記（1)で B細胞を採取したヒ卜又は動物と同一であつても異なっていてもよく、自己であると、同種同系であると、同種異系であるとを問わない。

このように免疫抑制されたヒ卜又は動物は、上記（3)で用いられた抗原に対してのみ免疫抑制効果を発揮する。従って、免疫抑制を行った免疫機能以外の免疫機能は抑制されないので、従来の免疫抑制剤のように、アレルギーの治癒には貢献するが感染症を引き起こしてしまう等の不都合は生じない。例えば、本発明の免疫抑制剤が花粉と共に培養して得られた B細胞を含む場合は、花粉に対してのみ免疫応答を抑制していわゆる花粉症の予防、治療に有効である一方、その他の免疫機能を抑制しないので感染症等の合併症を予防することができる。

ここで、免疫抑制が行われたか否かの確認は、抗体産生量又は T細胞などのリンパ球機能を測定することにより行うことができる。抗体量の測定は、通常の方法、例えば E L I S A法により行うことができる。 T細胞機能の測定は、通常の方法、例えば T細胞の増殖能をアイソトープの取り込み法で、また、 T細胞からのサイトカイン産生量を専用キット又はバイオアツセィにより行うことができる o

( 5 ) 免疫抑制剤

本発明の免疫抑制剤は、主として臓器移植後の拒絶反応若しくは G V H D、ァレルギ一又は上記表 1に記載した免疫疾患等の治療又は予防に有効である。

本発明の免疫抑制剤を投与する方法としては非経口投与が挙げられ、非経口投与には、注射、例えば静脈注射、点滴静注、組織内注射等を含む。また、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明の免疫抑制剤の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量（有効 B細胞数）は、 10 〜10^{1 ()}細胞 /kg体重/日であり、 1 日 1回から数回に分けて 1 日以上投与される o

本発明の免疫抑制剤を非経口投与する場合には、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有し、要時調製する。図面の簡単な説明

図 1は、抗 OVA抗体の産生量の低下を示す図である。

図 2は、抗 OVA抗体の産生量の低下を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。

〔実施例 1〕 B細胞の調製

5〜11週齢の C57/BL6 雌性マウスの脾臓を取り出し、培養液（MEM培地）の入ったプラスチックシャーレ内で圧迫することで脾臓内リンパ球を追い出す。ピペットにより軽くサスペンドした後、金属メッシュを通過させ、約 100XGで遠心分離を行い、沈渣を除くことで単細胞化させた細胞浮遊液を調製した。約 300 X Gで遠心分離を行い、上清を取り除くことで細胞の洗浄を 2〜 3回繰り返して行った。最終的に単細胞化された細胞を、 1 %B S Aを含む R PM 1 - 1 6 4 0 に懸濁した。該細胞浮遊液に抗 Thy- 1抗体（1CN immunoBiologicals 社製）を加え 3)分間 4 °Cで反応させ、次に補体（Cedarlane 社製）を添加し 37°Cにて 30〜40 分間培養し、 Tリンパ球細胞を除去した。次に、得られた細胞溶液を Sephadex G -10 (Pharmacia 社製）カラムに 2度かけた。カラムに付着する細胞を取り除き、カラムから溶出する非付着性の細胞を B細胞として得た。

〔試験例 1〕

ここで、以下の通り本発明の免疫抑制剤の試験例を挙げ、その薬理効果（免疫抑制活性）について説明する。

上記実施例 1で得られた B細胞約 1 X10⁷個 Z匹を遠心分離により洗浄した後、 10%F C Sを含む R PM 1 - 1 6 4 0培地に浮遊させ、抗原である OVAを最終濃度 50/ig/mlとなるように添加し、 37°Cで 90分間培養した。 300〜400xGで 5 〜10分間遠心分離を行い、上清を除き、新たな培地（MEM) を加えて細胞を再浮遊させた後、再び遠心分離を行った。この遠心分離操作を 2〜3回繰り返し、洗浄を行った。この洗浄操作により OVAを除去した。

得られた B細胞 3 X 10⁶個を MEM培地に懸濁し、これをマウスに静脈より移植した。移植 4日および約 18日後、同抗原 200 g、 100 をそれぞれ静脈内投与により一次感作、二次感作を行なった。各感作後 1〜 2週間目に血中抗 OVA 抗体量を測定した。抗体量は、波長 492nm における吸光度（Α_49ί ) を指標とした。

尚、抗体産生抑制率は以下の式により算定した。抗体産生抑制率（％) = 〔陽性対照群一 A_4S2 試験群） / (A ₂ 陽性対照群一 A₄₉₂ 陰性対照群）〕 X 100 陽性対照群には、抗原感作された B細胞（抗原と接触処理した B細胞）を移植せず OVA (soluble)のみを免疫したマウスの血清希釈液を用いた。また、陰性対照には無処置マウスの血清希釈液を使用した。

その結果、一次、二次免疫いずれの反応においても、 B細胞を移植せずに抗原感作した陽性対照マウスでは、非常に高い抗 0 V A抗体の産生が認められたのに対し、予め抗原処理した B細胞（抗原処理 B細胞、即ち本発明の免疫抑制剤）を移植したマウスでは、抗 OVA抗体産生が抑制された。特に、二次免疫反応においては約 95%の抑制率が認められた。結果を表 2に示す。

表 2

a) : EL ISA法による波長 492nmの吸光度

b) : 血清希釈倍率 50倍

c)：血淸希釈倍率 250倍

d) : 抗体産生抑制率

〔試験例 2〕

上記実施例 1により得られた B細胞を遠心分離により洗浄した後、 10% F C S を含む R PM 1 — 1 6 4 0培地に浮遊させ、抗原である OVA (異なる 2ロット

(No. P89301, No. P91501) を使用；生化学工業（株）製）を最終濃度 50 g/mlとなるように添加し、 37°Cで約 18時間培養した。 300〜400 x Gで 5〜10分間遠心分離を行い、上清を除き、新たな培地（MEM) を加えて細胞を再浮遊させた後、再び遠心分離を行った。この遠心分離操作を 2〜 3回繰り返し、洗浄を行った。この洗浄操作により OVAを除去した。

得られた B細胞 6 X10⁵個を MEM培地に懸濁し、これをマウスに静脈より移植した。移植 4 日および約 19日後、同抗原 200 g、 100 /zg をそれぞれ静脈内投与により一次感作、二次感作を行なった。各感作後 1〜 2週間目に血中抗 OVA 抗体量を測定した。抗体量は、波長 492mn における吸光度（Α_{< β 2} ) を指標とし陽性対照及び陰性対照については、前記と同様である。結果を図 1に示す。

一次、二次免疫いずれの反応においても、 B細胞を移植せずに抗原感作した陽性対照マウスでは、高い抗 OVA抗体の産生が認められた（図 1の # 7〜9) 。これに対し、予め抗原処理した B細胞（本発明の免疫抑制剤）を移植したマウスでは、半数例（6匹中 3匹）で抗 OVA抗体産生が抑制された（図 1の # 1〜6 ) 。なお、図中、 # 1〜3及び # 4〜6は、異なるロッ卜の OVA (それぞれ生化学工業（株） lot No. P89301 ， No. P91501 ) で B細胞を処理しており、 #10は陰性対照（無処置マウスの血清希釈液を使用したもの）である。

〔試験例 3〕

OVA (Egg albumin, 5x crystalized; 生化学工業 lot no. P89301) を低温下で PBS (-)に 1 mg/ml となるように溶解し、 0.22 m のポアサイズのミリポアフィルターで濾過滅菌した後、静置したまま 18時間 70°Cにてィンキュベー卜することで OVA重合体を作成した。ただし、この条件下では、非重合体（分子量的に未変化体）も共存していることが SDS- PAGEによる解析で確認されている力特に分離操作は行っていない。得られた重合体を培地にて希釈した後、 B細胞浮遊液に最終濃度が 50 g/mlに相当するように添加し、 in vitroで 37°C、 90分間インキュベー卜することでパルスラベルを行った。 300〜400x Gで 5〜10分間遠心分離を行い、上清を除き、新たな培地（MEM) を加えて細胞を再浮遊させた後、再び遠心分離を行った。この遠心分離操作を 2〜3回繰り返し、洗浄を行った。この洗浄操作により OVAを除去した。

以下、試験例 2と同様に、波長 492nm における吸光度（A₄g₂) を指標として抗体量を測定した。陽性対照及び陰性対照については、前記と同様である。

結果を図 2に示す。

図 2より、熱変性させた抗原（OVA重合体；図 2の「□」）により処理された B細胞においても、無処理の B細胞（図 2の「◊」）と比較して抗体の産生が抑制されることが示された。産業上の利用の可能性

本発明により、特定の抗原に対して免疫反応を起こさない免疫抑制剤が提供される。本発明の免疫抑制剤は、臓器移植における拒絶反応、骨髄移植における移植片対宿主病（GVHD) を抑制する治療や、アレルギーの予防などに使用できる ο

Claims

請求の範囲

1 . 抗原と接触処理することにより得られる抗原処理 Bリンパ球細胞を含んでなる免疫抑制剤。

2 . 抗原、抗原を封入若しくは付着せしめたリボソーム又は抗原と Bリンパ球細胞結合性物質との結合物、或いはこれらのうち少なくとも二種以上の混合物を Bリンパ球細胞と接触処理することにより得られる抗原処理 Bリンパ球細胞を含んでなる免疫抑制剤。

3 . 抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請求項 1記載の免疫抑制剤。

4 . 抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請求項 2記載の免疫抑制剤。

5 . Bリンパ球細胞結合性物質が、抗体、抗体の一部又は架橋剤である請求項 2 又は 4記載の免疫抑制剤。

6 . 抗原と Bリンパ球細胞結合性物質との結合物が、抗原遺伝子と Bリンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遗伝子を発現させて得られたものである請求項 2又は 4記載の免疫抑制剤。

7 . Bリンパ球細胞結合性物質が、抗体又は抗体の一部である請求項 6記載の免疫抑制剤。

8 . 請求項 1〜 7のいずれかに記載の免疫抑制剤を動物に移入することを特徴とする免疫抑制動物の作成方法。

9 . 動物が実験動物である請求項 8記載の免疫抑制動物の作成方法。

10. 請求項 8又は 9記載の免疫抑制動物の作成方法によつて作成された免疫抑制動物。

11. 請求項 1〜7のいずれかに記載の免疫抑制剤をヒ卜に投与することを特徴とする疾患の治療方法。

12. 請求項 1〜7のいずれかに記載の免疫抑制剤をヒ卜に投与することを特徴とする疾患の予防方法。

13. 疾患が、移植拒絶、アレルギー、自己免疫疾患又は移植片対宿主病である請求項 11記載の治療方法。

14. 疾患が、移植拒絶、アレルギー、自己免疫疾患又は移植片対宿主病である請求項 12記載の予防方法。

15. 抗原を封入又は付着せしめた該抗原含有リボソーム。

16. 抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請求項 15記載のリボソーム。

17. 抗原と B リンパ球細胞結合性物質との結合物。

18. 抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請求項 17記載の結合物。

19. Bリンパ球細胞結合性物質が、抗体、抗体の一部又は架橋剤である請求項 17 記載の結合物。

20. 抗原遺伝子と Bリンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遺伝子を発現させて得られた、抗原と Bリンパ球細胞結合性物質との結合物。

21. 抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請求項 20記載の結合物

22. B リンパ球細胞結合性物質が、抗体又は抗体の一部である請求項 20又は 21記載の結合物。

23. 請求項 15若しくは 16記載のリポソームおよび Z又は請求項 17〜22のいずれかに記載の結合物を含む組成物。

24. Bリンパ球細胞と接触処理することにより該 Bリンパ球細胞に免疫抑制作用を誘導することができる抗原。

25. B リンパ球細胞が、動物体内より取り出されたものである請求項 24記載の抗原。

26. 免疫抑制剤が、動物体内から取り出して免疫抑制作用を誘導させた B リンパ球を該動物体内に移入して該動物の免疫を抑制させるために使用するものである、請求項 1 ~ 7のいずれかに記載の免疫抑制剤。