WO1996041644A1

WO1996041644A1 - Oral remedy for rheumatoid arthritis and functional food

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Publication number: WO1996041644A1
Application number: PCT/JP1996/001623
Authority: WO
Inventors: Takashi Matsumoto; Yasuki Taguchi; Kotaro Fujita; Akio Ametani; Syuichi Kaminogawa; Tatsuyoshi Nakagami
Original assignee: Nippon Meat Packers Inc
Current assignee: NH Foods Ltd
Priority date: 1995-06-13
Filing date: 1996-06-13
Publication date: 1996-12-27
Anticipated expiration: 1997-12-13
Also published as: CA2224709C; EP0834321A1; DE69627855T2; CA2224709A1; EP0834321A4; EP0834321B1; US6010722A; DE69627855D1

Description

m 糸田 » 経口慢性関節リゥマチ治療剤及び機能性食品技術分野

本発明は経口慢性関節リゥマチ治療剤及び機能性食品に関する。よリ詳細には、変性させた I I型コラーゲンを含有し、慢性関節リウマチの治療 · 予防に有用な薬剤及び機能性食品に関する。背景技術

慢性閲節リウマチ（Rheumatoid Arthritis, 以下、 R Aという）は罹患患者の多い慢性疾患の一つであり、結合組織に炎症をきたす全身的な疾患である。当該疾患は、主に関節の滑膜に非特異的炎症を起 1 、全身の多発性関節炎の病像を呈し、軟骨や骨の損傷をきたす。

R Aの発病メカニズムは充分に解析されていないが、リンパ球抗原（H L A) 一 D R 4が関係し、活性化 T細胞が関与する自己免疫疾患であると考えられている（Lancet 341» 283, 1993)。 I I型コラーゲンが軟骨中の主要構造蛋白であることや実験動物に I I型コラーゲンを投与するとリウマチ関節炎と形態的に類似した症状を起すことから、 I I型コラーゲンが本疾患の自己抗原の一つであると考えられている（J. Exp. Med. 146, 857, 1977; Lab. Invest. 54, 26， 1986)。

R Aに対する治療剤としては、抗リウマチ剤（金塩製剤、 D-ベニシラミン等）、非ステロイド剤、免疫抑制剤などが汎用されているが、これらの薬剤の投与により十分な効果が得られないようなときには、強い抗炎症作用と免疫抑制作用を有しているステロイド剤が用いられる。

上記の薬剤による R Aの治療は対症療法的であリ、根治的な治療法とはいえない。また、ステロイド剤は重篤な副作用を引き起こすおそれがあるので、その使用に際しては十分な注意をはらい、常に減量や使用中止を考慮する必要性のあることが指摘されている。最も望ましい R Aの治療法は、疾患特異的なメカニズムに基づいて関節の炎症を軽減することであり、使ム

用される薬剤は毒性のないことが望ましい。

このような観点から、免疫寛容に基づく R Aの治療法が注目されている。免疫寛容とは、ある条件下に抗原で動物を処理しておくと、次にこの抗原で適切な免疫操作を行っても、抗体産生などの免疫応答が起こらない現象であり、免疫寛容を導く物質は免疫寛容原と称される。免疫寛容による R Aの治療法としては、 I I型コラーゲン又はその部分配列を有するペプチドを免疫寛容原として用い、このペプチドを新生児ラッ卜に静脈ないし腹腔内投与すると、 R Aの発症を抑制することができることが報告されている (J. Exp. Med. 170, 1999， 1989; J. Immunology 15i, 500, 1993)。

上記の方法においては、免疫寛容原は静脈ないし腹腔内投与されているが、静脈ないし腹腔内投与による免疫寛容原の投与は煩雑であるのみならず、免疫寛容原のペプチドを R A患者に連続的に静脈ないし腹腔内投与する場合には、 R A患者に重篤なアレルギー反応やショックなどを引き起こすことも想定きれる。そこで、より簡便で且つ安全な投与方法による R A の治療法が望まれている。

また、医薬品としてのみならず、日常的な食物の摂取を通して R Aの治療 ·予防を図ることができればよリ好ましく、 R Aの治療 ·予防を目的とする機能性食品も求められている。

このような観点から、安全性が高く且つ簡便な投与方法による R Aの治療法が切望されており、経口免疫寛容による R Aの予防 ·治療が検討されている。経口免疫寛容、ひろくは粘膜免疫寛容は、抗原が経口的に腸管等の粘膜を通って入った場合、その抗原に対して全身の免疫応答が失われる現象であり、経口免疫寛容においては、抗原が経口的に腸管等の粘膜を通じて吸収されるとき、パイエル板、腸管上皮細胞及びこれと隣接するリンパ球、門脈、肝臓などのいろいろの器官と機能による作用を受けるので、ァレルギ一反応ゃショックなどを引き起こすことが少なく、ァレルギ一や臓器移植における免疫抑制療法として試みられている。

また、抗原が経鼻的に投与された場合にも、上記のような消化管粘膜を通じた吸収と共に、気道または肺などの粘膜を通じて吸収がなされるので、その抗原に対しての全身性免疫応答が失われる免疫寛容現象が生じる。経口免疫寛容による R Aの予防に関して、ゥシ関節由来未変性 I I型コラ一ゲンを経口投与（胃内投与）されたマウスにおいて、コラーゲン誘導性関節炎（C I A ) の発症が抑制されたことが報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7443， 1986)。しかし、この報文では、加熱変性された I I型コラーゲンでは、 C I A発症の抑制効果は認められなかったことが記載されている。また、 I I型コラーゲンの経口免疫寛容原性に関し、加熱処理することにより、免疫原性（抗原性又はアレルギー発症能）を低下させることができるが、免疫寛容原性は未変性のものと同程度か又はそれより低下することが報告されている（J. Clin. Invest. , 69, 673-683， 19 82 ; J. Immun. , 140， 1477-1484， 1988)。

また、最近に発行された米国特許第 5, 399, 437号には、 I I型ホール ·コラ一ゲンを経口投与することからなるリゥマチ性関節炎の治療方法が開示されている。

本発明者等はこの経口免疫寛容に注目し、鋭意研究を重ね、 I I型コラーゲンの加熱変性条件を検討してきた。その結果、上記の報文の記載に反し、熱変性 I I型コラーゲンは経口免疫寛容原として有用であり、 R Aの発症を抑制できることを見出した。即ち、上記文献に記載の熱変性条件ではコラ一ゲンの熱変性が不十分であり、更に過酷な条件で熱変性して調製した I I 型コラーゲンは未変性 I I型コラーゲンよリ高い経口免疫寛容原性を有することが判明した。

また、アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で I I型コラーゲンを処理し、得られた I I型コラーゲンの変性物（断片化物）が未変性 I I型コラーゲンよリ高い経口免疫寛容原性を有することが判明した。

本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、 R Aの予防 ·治療に有用な経口薬剤及び機能性食品を提供することを目的とする。発明の開示

上記の課題を解決するためになされた本発明は、酸性もしくはアル力リ性条件下に熱変性させた I I型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた I I型コラーゲンを有効成分として含有する経口慢性関節リウマチ治療剤である。

また、本発明の他の発明は、酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させた I I型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた I I型コラーゲンを含有する機能性食品である。

本発明で用いられる変性 I I型コラーゲンは、高い経口免疫寛容原性を有するので、本発明の治療剤を投与又は本発明の機能性食品を摂取することにより、免疫応答が抑制され、 R Aの治療及び予防を行うことができる。なお、本発明においては、便宜上、「経口」には、通常の経口の他、経鼻、経腸及び経粘膜も含まれるものとする。図面の簡単な説明

図 1は、実験例 4における C I Αの発症率を示す図である。

図 2は、実験例 5における C I Aの発症指数を示す図である。

図 3は、実験例 5における C I Aの発症足の割合を示す図である。

図 4は、実験例 6における、 I I型コラーゲンに対する抗体のサブクラス別の抗体産生量を示す図である。

図 5は、実験例 8における I I型コラーゲン熱変性物の電気泳動写真である。発明を実施するための最良の形態

本発明の経口慢性閬節リゥマチ治療剤及び機能性食品は、熱変性させた I I型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた I I 型コラーゲンを含有することからなる。

—般に、コラーゲン分子は、一 G l y— X— Y— （X及び Yはアミノ酸残基）の繰り返しからなるアミノ酸約 1 0 0 0残基（分子量約 1 0万）のポリペプチド鎖（α鎖）が 3本撚リ合わされてできている。現在までに発見されているコラーゲン分子の種類は 1 9種（ I型〜 X I X型）あり、その内、 I I型コラーゲンは 3本の α 1 ( I I) 型ポリペプチド鎖で構成され、関節軟骨、椎間板髄核、眼ガラス体などに多く含まれている。

本発明において、原料となる I I型コラーゲンの精製 ·単離は慣用の方法に準じて行うことができ、例えば、 II型コラーゲンを含有する生体組織を、ペプシン、プロナーゼなどの蛋白分解酵素を用いて限定分解し、塩分別沈殿法などで精製することにより調製することができる（J. Exp. Med. 146, 857-868, 1977; Arthrilis Rheum. 22， 1344， 1979; J. Immunol. 124, 2912, 1980など参照）。また、既に市販されている II型コラーゲンを用いることもできる。 II型コラーゲンの由来は特に限定されず、例えば、ゥシ、ブタ、ャギ、ヒッジ、ゥマ、ヒト、サル、ゥサギ、マウス、ラッ卜等の哺乳類、ニヮトリ、シチメンチヨウ、ダチョウ等の鳥類、カメ、へビ等の爬虫類、マグロ、カツォ、サケ、サメ、エイ等の魚類など由来のコラーゲンが例示される。

更には、上記の各種動物の II型コラーゲンのアミノ酸配列に関する知見に基づいて化学合成された II型コラーゲン、又は遺伝子組換技術によリ作製された II型コラーゲンを用いることもできる。

本発明における熱変性 II型コラーゲンは、酸性条件下又はアルカリ性条件下に II型コラーゲンを熱変性することにより調製される。後記実験例に示されるように、かかる熱変性によリ II型コラーゲンは断片化される。熱変性条件は、加熱温度及び加熱時間により適宜調整し得るが、通常、 6 0°C以上で且つ 1 0分間以上の条件が適用され、好ましくは 65°C以上で 1 5分間以上、より好ましくはオートクレープ処理（例えば、 1 2 1で、 1 5分間程度）が利用される。

酸性条件としては、例えば、クェン酸、酢酸、塩酸などの有機又は無機酸類を用いた溶液が例示され、好ましい pH範囲としては 5. 5以下、より好ましくは 2. 0〜4. 5が例示される。アルカリ性条件としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールァミンなどの無機又は有機塩基を用いた溶液が例示され、好ましい pH範囲としては 9. 5以上、より好ましくは 1 0. 0〜1 2. 0が例示される。

好ましい熱変性条件としては、 II型コラーゲンの無機酸又は有機酸水溶液を、 6 5°C以上、好ましくは 1 00°C程度で、 1 5分間以上、好ましくは 20分間程度加熱するか；ォ一トクレーブを用いて、 1 1 0°C程度で 3 0分間以上、好ましくは 2〜1 0時間程度加熱するか、 1 20°C程度で 1 5分間以上、好ましくは 2 0分間加熱する方法が挙げられる。

なお、後記実験例に示されるように、かかる熱変性 Π型コラーゲンは、 I I型コラーゲン α 1鎖よリ低分子量の限定分解物を含有している。

本発明における他の変性 I I型コラーゲンは、アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性（断片化）させた I I型コラーゲンである。

アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性（断片化）する手段としては、種々の物質及びその切断部位が知られており、それら変性薬剤の市販品を利用することができる。その一例を示せば、次のとおりである（なお、切断部位は丄で示す）。化学薬剤としては、ヒドロキシルァミン： AsiU G ly、蟻酸： Asp Pro、酢酸： Asp丄 Pro、 B N P S—スカトール： Trp丄、 o—ョードゾベンゾ酢酸： Trp などが例示できる。酵素としては、キモ卜リブシン： Trp I及び Tyr 1及び Phe I、コラゲナーゼ： Pro—X J. Gly-P ro、ェンドプロテナーゼ Lys-C： Lys i , トロンビン： Arg— Gly— Pro— Arg i、卜リプシン： Arg丄及び Lys丄などが例示できる。

なお、これらの薬剤は単独または 2種以上を組み合わせて使用することもできる。また、上記の薬剤の使用は常法に準じて行うことができ、また使用量、反応温度等の条件も常法に準じて適宜設定することができるが、 I I型コラーゲンを 3 0 °C以上で且つ 1 0分間以上加温して、 α ΐ (I I) 型ポリべプチド鎖の 3本が撚リ合わさつてなる I I型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に上記の薬剤を作用させるのが好ましい。

更に、変性（断片化）後に使用した薬剤を除去又は失活させる場合、当該方法は当業者に周知の方法で行うことができ、例えば、加熱、透析、限外濾過、イオン交換体処理、 ρ Η調整などが例示される。

かくして熱変性された I I型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた I I型コラーゲン（以下、便宜上、これらを合わせて、変性 I I型コラーゲンという）は、そのまま本発明の治療剤又は機能性食品に利用することができ、また慣用のペプチド精製法（例えば、塩析、透析、ゲル濾過、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ等）を用いて精製した後に使用してもよい。また、凍結乾燥などの手段により粉末化して使用してもよい。上記の変性 II型コラーゲンは、免疫原性が低減されていると共に、未変性の II型コラーゲンに比べて免疫寛容原性が向上しているという特長を有する。更に、生体成分である II型コラーゲンの変性物であることから、安全性が高いと推定される。これらの点については、後記の実験例に示されるように、変性 II型コラーゲンを経鼻投与したマウスを未変性 II型コラーゲンで免疫しても、 C I Aの発症率、発症指数及び発症足の割合の上昇が著しく抑制 ·遅延された。

また、 20 O/z gのような高投与量で熱変性 II型コラーゲンを経鼻投与した場合、抗原特異的抗体（ I gG l、 I gG 2 a及び I gG 2 b) の産生は抑制されていると共に、炎症性のサイ卜力インである I FN— γの産生も抑制されていた。このような現象は、アナジー（anergy)又はクローン麻痺として知られている。

また、熱変性 II型コラーゲンの 0. 2 (又は 2もしくは 20) という少量を吸入させた場合、 I g G 1の産生は維持されているが、炎症反応と関係があるとされている I gG 2 a及び I gG2 bの産生が抑制されていた。更に、抗炎症性のサイト力インである I L一 1 0の産生が増強されていた。このような状態は、アクティブ *又はパイスタンダ一 ·サブレツシヨンとして知られている。

更に、本発明者等は、本発明の変性 II型コラーゲンは、加熱処理や薬剤処理によリ低分子量化すると共に II型コラーゲン分子の螺旋型立体構造が崩壊した構造を有すると考えている。 Bリンパ球によって造られる抗体は、 II型コラーゲンの螺旋状の立体構造を認識して結合するので、本発明者等は、螺旋構造を破壊した変性 Π型コラーゲンは、未変性 II型コラーゲンに比べて副作用などが少なく、安全であると考えている。

なお、 II型コラーゲンの変性方法は上記の例に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。例えば、製造工程上で加熱殺菌を必要とする製品（例えば、食肉加工食品、水産加工食品等の食品、牛乳等の乳製品、果汁、茶等の飲料、液状医薬品、経腸輸液等の医薬品など）において、原料に未変性 II型コラーゲンを添加し、加熟処理により熱変性 II型コラーゲンを生成させることにより、製品中に熱変性 II型コラーゲンを含有させてもよい。また、 I I型コラーゲンを含有する原材料（例えば、家畜などの関節軟骨等）から、熱水抽出法により熱変性 I I型コラーゲン含有物

(例えば、スープ等）を調製することもできる。

本発明の R A治療剤は、上記の変性 I I型コラーゲンを有効成分とするものであり、 R Aの治療 ·予防を目的として経口投与（経鼻投与、経腸投与及び経粘膜投与をも含む）される。

投与に際しては、有効成分を経口投与に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与され、このような製剤としては、例えば、経口剤（例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤など）、吸入剤、坐薬、経腸輸液等が挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキス卜リン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシェチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ァルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。

本発明の R A治療剤において、有効成分の投与量は、患者の年齢、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態等にょリ、適宜選択 ·決定されるが、例えば、 1 日当り 0.05 μ g〜5 g / k g体重程度とされ、 1 日数回に分けて投与してもよい。

また、本発明の機能性食品は、前記の変性 I I型コラーゲンを含有することからなり、そのまま、又は種々の栄養分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、 R Aの治療及び予防に有用な機能性食品（又は食品素材）として食される。例えば、上述した適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形して食用に供してもよく、また種々の食品（例えば、ノ、ム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、パター、粉乳など）に添加して使用されたり、水、果汁、牛乳、清涼飲料等の飲物に添加して使用してもよい。

かかる機能性食品の形態における変性 II型コラーゲンの摂取量は、年齢、体重、症状、疾患の程度、食品の形態等により、適宜選択 ·決定され、例えば、 1日当り 0.05μ g〜5gZk g体重程度とされるが、変性 II型コラ一ゲンは多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、それ以上の量を摂取してもよい。産業上の利用可能性

前述のように、 R Aの発病メカニズムは II型コラーゲンを抗原とする自己免疫疾患であると考えられいる。本発明で用いられる変性 II型コラーゲンは、高い経口免疫寛容原性を有するので、本発明の治療剤を投与又は本発明の機能性食品を摂取することにより、免疫応答が抑制され、 RAの治療及び予防を行うことができる。従って、本発明によれば、 RAの予防を図ることができると共に既に発病している R Aの治療に利用することができる。更に、経口投与（経鼻投与、経腸投与及び経粘膜投与をも含む）や経口摂取により R Aの治療 ·予防を図ることができ、簡便性且つ安全性に優れる。実施例

以下、実施例及び実験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

実験例 1

熱変性コラーゲンの調製

ゥシ由来 II型コラーゲンのクェン酸溶液（pH 3. 0) を、 6 5°Cで 1 5分間の加熱又はオートクレープ中で加熱（ 1 2 1 °C、 1 5分間）して変性させ、変性コラーゲンを得た。

以下、便宜上、 6 5°Cで 1 5分間変性させた II型コラーゲンを「変性コラーゲン A」と、オートクレープ（ 1 2 1°C、 1 5分間）で変性させた II 型コラーゲンを「変性コラーゲン B」と称する。実験例 2

ァミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で処理することによる変性（断片化） II型コラーゲンの調製

ゥシ由来 II型コラーゲンを 0. 1 M炭酸アンモニゥム溶液に分散させ (濃度； 1 mgZm 1 ) 、 50 °Cで 30分間加熱した。これにトリプシン

(TPCK-Trypsin, Sigma社製）を加え（II型コラーゲンに対して 2 %)、 37 °C 1時間作用させた。そして、 1 2N HC 1を添加して pH 3. 0に調整し、 4°Cにて 1晚放置して酵素反応を停止させた。その後に、限外濾過 (Centriprep3, アミコン社製）を行い、 II型コラーゲンの未切断物及びトリプシンを取り除いて、酵素で変性（断片化）した II型コラーゲンを調製した。以下、便宜上、上記に準じて卜リブシンで変性した II型コラーゲンを「変性コラーゲン C」と称する。実験例 3

C I A (コラーゲン誘導性関節炎）発症抑制試験（1)

①方法

DBAZ1系マウスに免疫 7日前にゥシ由来変性コラーゲン A、 B及び Cの 1 OmMクェン酸溶液（コラーゲン含量： 200 g) を鼻腔よリ麻酔下にて吸入させた。 0日目に未変性 II型コラーゲンとフロインド完全ァジュパントで免疫し、更に 2 1 日目に未変性 II型コラーゲンとフロインド不完全アジュパントで追加免疫して、 C I Aを発症させた。なお、比較例及び対照として、上記の変性コラーゲンに代えて、未変性 II型コラーゲン 200 g (比較例）、 1 0mMクェン酸（対照）を吸入させた。

②結果

各群の C I A発症日数を比較し、 Mann-Wiitney u検定を行った。その結果を表 1に示す。表 1に示されるように、未変性 II型コラーゲンでは免疫寛容現象は認められないが、変性コラーゲン A、 B及び Cにおいては C I Aの発症が遅延し、明確な免疫寛容が認められた。また、オートクレープを用いて過酷な条件下に変性を施された変性コラーゲン Bの方が、また 5 0°Cで 30分間加温し、 α 1 (II)型ポリペプチド鎖の 3本が撚リ合わさつてなる II型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解きほぐした後に、アミノ酸配列のうちアルギニン及びリジンの C末端を特異的に認識し、切断する卜リブシンを作用させて得られた変性コラーゲン Cの方が、変性コラーゲン Aよりも免疫寛容原性は強いことが判明した。

表 1

a ： p<0. 02， b : pく 0. 005 実験例 4

C I A発症抑制試験（2)

①方法

DBA/ 1系マウスに免疫 3 1 日前から 1 日前までトリ由来変性コラーゲン A及び Bの凍結乾燥粉末を餌と混合（4%) して給餌した。 C I Aの発症は実験例 2と同様な方法で行った。なお、比較例及び対照として、上記コラーゲンに代えて、未変性 II型コラーゲン（比較例）及びカゼイン (対照）を同量餌に混合して給餌した。

②糸ロ

各群の C I A発症率（％) を観察日ごとに比較し、 Mann-Whitney u検定を行った。その結果を図 1に示す。なお、 C I A発症率（％) は、各マウスの四肢において、少なくとも関節炎評価 1以上の肢を一つでも認めるとき、これを関節炎マウスとみなし、この関節炎マウス匹数を各群マウス匹数で割ったものを C I A発症率（％) とした。

図 1に示されるように、未変性 II型コラーゲン、変性コラーゲン A及び

Bにおいて有意（p<0. 0 1 ) に C I Aの発症が抑制され、明確な免疫寛容が認められた。また、未変性 II型コラーゲンよりも変性コラーゲン A の方が免疫寛容原性は強く、更にオートクレープを用いて過酷な条件下に変性を施された変性コラーゲン Bの方が変性コラーゲン Aよリも免疫寛容原性が強いことが判明した。実験例 5

変性 II型コラーゲン経鼻投与による C I A発症抑制試験（投与量の影響）

①方法

DBAZ1系マウスに免疫 7日前にゥシ由来変性コラーゲン Bの 0. 2、

2、 20及び 200 g (何れも 1 OmMクェン酸溶液）を鼻腔より麻酔下にて吸入投与した。 0日目に未変性 II型コラーゲン（200 z g) とフ口インド完全アジュバント（D I F CO製）で免疫し、更に 2 1 日目に未変性 II型コラーゲン（ 200 μ _β) とフロインド不完全アジュパント（D I FC〇製）で追加免疫して、その日以降の C I A発症の様子を観察した。なお、対照として、上記の変性コラーゲン Bに代えて、 1 OmMクェン酸のみを吸入させた。

②結果

試験結果を図 2及び図 3に示す。図 2は発症指数の変化を示し、ここで発症指数とは、関節炎の症状（足の腫れ）を常法に従って各足ごとに 0〜 3までの評点で評価し、各マウスについて 4足の評点を合計して合計点を求め、各マウスの合計点の平均値をとつたものである。また、図 3は発症足の割合（％) であり、関節炎を発症した足を合計し、全体の足の数で除して得た割合である。

図 2及び図 3に示されるように、対照（即ち、変性コラーゲン Bを事前 5

に経鼻投与せずに、 0日目及び 2 1 日目に未変性 II型コラーゲンで免疫した試験群）では、追加免疫直後から経時的に C I Aの発症指数及び発症足の割合が上昇した。

それに対して、変性コラーゲン Bを 2 00 μ g吸入させた場合には、対照に比べて明らかに、 C I Aの発症指数及び発症足の割合の上昇は著しく抑制、遅延された。この抑制傾向は、 2 0及び 2 μ gの変性コラーゲン B を吸入させた場合にも、用量依存的に認められた。

また、 0. 2 ^ gの変性コラーゲン Bを吸入させた場合には、 200 μ gを吸入させた場合と同程度に、 C I Aの発症指数及び発症足の割合の上昇が著しく抑制、遅延された。実験例 6

変性 II型コラーゲン経鼻投与が血清中の抗 II型コラーゲン抗体価（サブクラス）に及ぼす影響

本試験では、変性 II型コラーゲン経鼻投与が抗体（サブクラス）プロフアイルに及ぼす影響を調べた。即ち、 I g Gのサブクラス I g G 2 aと I g G 2 bはそれぞれ炎症反応に不可欠な補体との結合能があるので、関節炎の症状と関係があるとされている。

また、 I g G 2 aの産生は、閲節炎発症中の閲節滑膜中に多く存在する T細胞（Th 1タイプ）の産生する I FN— γとも密接な関係がある。すなわち、特定の抗原に対する血清中の I g G 2 a産生量の低下は、当該抗原に対する Th 1タイプの反応が全身性に低下していることを示唆するものと考えられている。

①方法

供試血清の採取

上記実施例 5の実験に平行して、免疫後 2 8日目（即ち、追加免疫後 7 日目）に試験マウス及び対照マウスから採血し、血清を採取した後、下記の方法で抗 II型コラーゲン抗体価（サブクラス）を測定した。 E L I SAによる I g Gサブクラスの測定

プレート（M a x i s o r p、 NUNC製）に未変性 II型コラーゲン ( ゥエル）を吸着させ、 P B S— Twe e nで洗挣した後に、適宜希釈したマウスの血清を加えた。 P B S— Twe e nで洗浄し、その後にアルカリフォスファターゼ標識したゥサギ抗マウス抗体（抗マウス I g G 1、抗マウス I g G 2 a、又は抗マウス I g G 2 b、何れも Z YMED 製）を加えた。 P B S— Twe e nで洗浄し、その後に基質溶液（パラ二卜口フエノール 2リン酸、東京化成製）を加えた。 3 0分間放置後、 5 N N a OHを加えて、反応を停止させ、 4 0 5 rimにおける吸光度を測定した。

その結果を図 4に示す。

②結果

対照（即ち、変性コラーゲン Bを事前に経鼻投与せずに、 0日目及び 2 1 日目に II型コラーゲンで免疫した試験群）では、 I g G l、 I g G 2 a 及び I g G 2 bが産生されていた。その結果は、図 2及び 3に示す C I A の発症指数及び発症足の割合の上昇と対応していた。

それに対して、変性コラーゲン B 2 0 0 μ gを吸入させた場合には、対照に比べて明らかに、 I g G l、 I g G 2 a及び I g G 2 bの産生が抑制されていた。その結果は、図 2及び 3に示す C I Aの発症指数及び発症足の割合の上昇の抑制と対応していた。

また、変性コラーゲン B 2 0、 2又は 0. 2 μ _§を吸入させた場合には、対照に比べて、 I g G 1の産生は抑制されていなかった。一方、 I g G 2 a及び I g G 2 bの産生は、対照に比べて抑制されていた。特に、 0. 2 μ gを吸入させた場合の I g G 2 a及び I g G 2 bの産生の抑制の程度は、 2 0 O gを吸入させた場合と同程度であり、図 2及び 3に示す C I Aの発症指数及び発症足の割合の上昇の抑制と対応していた。

これらのことから、変性コラーゲン Bの 2 0、 2又は 0. 1 μ g (特に、 0. 2 μ g) の投与は、補体との結合能から、関節炎の症状に関与するとされる I g G 2 a及び I g G 2 bの産生を抑制するという効果を奏する。さらには、変性コラーゲン Bの 2 0、 2又は 0. 2 ^ gの投与は、 I g G ο

1の産生能自体は抑制しないので、外来異物を認識し排除する機能を有する抗体産生能自体を抑制することはないという効果を奏する。実験例 7

変性 II型コラーゲンを経鼻投与したマウスより分離したリンパ球の産生するサイト力イン（変性 II型コラーゲン刺激の影響）

本試験では、炎症と関連するとして知られているサイト力イン（ I FN 一 γと I L— 1 0) を測定し、変性 II型コラーゲン刺激の影響を調べた。なお、 TGF—；9や I L一 1 0は抗炎症性（抑制性）のサイトカインとして知られており、実際の RAにおいても重要な免疫学的調節機能を果たすとも報告されている（J. Exp. Med. 179, 15617-15627, 1994)。

①方法

リンパ球の分離と培養

前記実験例 5の実験と同様に、 DBAZ1系マウスに免疫 7日前にゥシ由来変性コラーゲン Bの 0、 0. 002、 0. 02、 0. 2、 2、 20及び 200 μ gを鼻腔より麻酔下にて吸入させた。そして、 0日目に未変性

II型コラーゲン（1 00 μ g) とフロインド完全アジュパン卜（D I FC

〇製）をマウス足踱部に免疫した。

そして、 1 0日目に、膝下リンパ節を摘出し単一細胞懸濁液を調製し、 96穴プレート（FALCON製）に播腫した（ 1 X 1 0^ε/ゥエル）。各ゥエルに無血清培地（X- vivo20、 BIOWHITTAKER製）を加え、さらに II型コラーゲン（最終濃度； 500 μ _£//πι 1) を加え、 5%C0₂条件下で

3日間培養し、培養上清を得た。

同様に、 II型コラーゲンを添加せずに培養し、又は II型コラーゲンを添加せずにコンカナパリン A (最終濃度； 5 yu g/m l) を添加して培養し、それぞれの培養上清を得た。なお、コンカナパリン Aは T細胞のマイ卜一ジェンであリ、全ての T細胞に抗原非特異的に刺激を与えるため、陽性対照として用いた。

サンドイッチ EL I SAによるサイトカインの測定

プレート（Maxisorp、 NUNC製）に抗マウスサイト力イン · ラット単クローン抗体（抗マウス I L— 1 0抗体： J E S 5— 2 A 5、抗マウス I FN— γ抗体： R A— 6 A 2、いずれも PHARMINGEN製）をコーティング（ 5 0 μ 1 ウエル）し、 P B S— Twe e ηにて洗浄し、 3 %B SA加 P B S— Twe e nにてブロックした。そして、適宜希釈した上記の培養上清を加えた。

P B S -Twe e nにて洗浄した後に、ピオチン標識した抗マウスサイ卜力イン · ラッ卜単クローン抗体（抗マウス I L一 1 0抗体： S XC— 1、抗マウス I FN— γ抗体： XMG 1. 2、いずれも PHARMINGEN製）を加えた。

P B S -Twe e nで洗浄した後に、アビジン化アルカリフォスファターゼ（ZYMED製）を加えた。更に P B S— Twe e nで洗浄し、その後に基質溶液（パラニトロフエノール 2リン酸、東京化成製）を加えた。 6 0分間放置後、 5 N N a OHを加えて、反応を停止させ、 4 0 5 n m における吸光度を測定し、 I FN— γ又は I L一 1 0の産生量を測定した。対照（変性コラーゲン Β投与量 0) に対する I FN— γ又は I L— 1 0の産生量の傾向を表 2に示す。

表 2

T T 対照に対して明らかに産生が促進される。

† 対照に対して産生が促進される傾向にある,

対照に対して差異が認められない。 I：対照に対して抑制される傾向にある。

1 I ：対照に対して明らかに産生が抑制されている。

②結果

培地にコンカナパリン Aを添加した場合（陽性対照）には、マウスより採取したリンパ球の均一な増殖が観察された。一方、 II型コラーゲンを培地に添加した場合には、コラーゲンに反応するリンパ球がコロニーを形成して増殖した。このコラーゲン反応性のリンパ球におけるサイトカイン産生を測定したところ、次のような結果が得られた。

I FN— γについては、変性コラーゲン Βの 200 ^ を吸入させたマウスより採取したリンパ球を II型コラーゲンとともに培養した場合には、変性コラーゲン Bを吸入させなかったマウス（対照）より採取したリンパ球を同様に培養した場合に比べて、炎症を増悪させる I FN— γの産生が抑制されていた。

I L- 1 0については、変性コラーゲン Βの 0. 002、 0. 02、 0. 2又は 2 μ gを吸入させたマウスよリ採取したリンパ球を II型コラーゲンとともに培養した場合には、変性コラーゲン Bを吸入させなかったマウス (対照）より採取したリンパ球を同様に培養した場合に比べ、抗炎症作用を有する I L一 1 0の産生が促進されていた。特に、変性コラーゲン Bの 0. 2又は 0. 02 μ gを吸入させたマウスより採取したリンパ球を II型コラーゲンとともに培養した場合には、 I L一 1 0の産生が促進されていた。実験例 8

熱変性物の検討

熱変性物の性状を検討するために、 1 OmMクェン酸水溶液（pH 3.

0) に、トリ由来 II型コラーゲンを 0. 1、 0. 3及び 1. 0%となるように溶解し、 6 5°C2 0分間、 1 00°C 20分間及びオートクレープ（ 1 20°C20分間）の加熱変性を行い、得られた変性液を電気泳動に付した。その結果を図 5に示す。図 5において、 Aはオートクレープ（ 1 20°C2 0分間）処理コラーゲン、 Bは 1 00°C20分間処理コラーゲン、 Cは 6 5°C20分間処理コラーゲン、 Dは未変性のコラーゲンを示し、各サンプルの 3つのレーンは左側から 0. 1、 0. 3及び 1. 0%のコラーゲン濃度である。また、左右両端のレーンは分子量マーカーである。

図 5に示されるように、未変性 II型コラーゲンは α 1鎖（MW : 100,00 0)のみから構成されているが、加熱変性により低分子量成分が増加し、 1 00°C20分間及びォートクレーブ（ 1 20°C 20分間）の加熱変性を行つた場合には、 ct l鎖は消失していた。このことから、限定分解された低分子成分が免疫寛容原として作用していることが示唆された。

ゥシ由来 II型コラーゲンについて、同様な実験を行ったところ、図 5と同様な電気泳動パターンが得られた。

また、ゥシ由来変性コラーゲン Cについて、同様な電気泳動実験を行つたところ、 α 1鎖が消失するとともに、オートクレープ（ 1 20° (：、 20 分間）処理物よりも更に低分子化され、分子量 10,000以下の成分として検出された。このことから、限定分解された低分子成分が免疫寛容原として作用していることが示唆された。実験例 9

実験例 1におけるクェン酸溶液に代えて水酸化ナトリゥム溶液（Ρ Η 1 1. 0) を用いる以外は実験例 1と同様にして熱変性を行い、熱変性 II型コラーゲンを調製した。実施例 1

ゥシ由来変性コラーゲン A 0 5 m g

ステアリン酸マグネシウム 5 m g

コーンスターチ 20 m g

1 74 5 m g

常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、打錠成型し、錠剤を得た _: 実施例 2

ニヮトリ由来変性コラーゲン B 0. 5 mg ステアリン酸マグネシウム 5 mg 乳糖 1 94. 5 mg

常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、ゼラチン硬カプセルに充填し、カプセル剤を得た。実施例 3

ゥシ由来変性コラーゲン C 0. 5 m g

ステアリン酸マグネシウム δ m g

乳糖 1 94. 5 mg

常法に準じ、上記の組成からなる混合物を、ゼラチン硬カプセルに充填し、カプセル剤を得た。実施例 4

天然果汁（濃縮果汁還元）に、ゥシ由来変性コラーゲン Bを天然果汁 2 O Oml当り 0. 5mgの割合で混合した後、常法に準じて殺菌し、ァセブティック包装して、果汁製品を得た。実施例 5

ウインナソーセージ用練り肉に、ゥシ由来変性コラーゲン Bを当該練り肉 1 5 g当り 30 μ gの割合で混合した後、常法に準じてソーセージケ一シングに充填し、燻煙し、殺菌し、冷却後に包装し、ウインナソーセージを得た。実施例 6

ゥシ由来変性コラーゲン Bに代えて、ゥシ由来変性コラーゲン Cを用いる以外は実施例 4と同様にしてウインナソーセージを得た。実施例 7

ニヮ卜リ胸骨軟骨（通称、ャゲン軟骨） 1 50 gに水 1 000 m 1を加え、タマネギ、ニンジン、パセリ、セロリ、ショウガなどの香味野菜、及び粒コショウを加えて、煮立て、弱火にて 3時間加熱した。冷却後、ストレーナ一で濾過し、塩、コショウで調味し、トリスープを得た。

なお、同スープについて、電気泳動実験を行ったところ、図 5の Bと同様の泳動像が観察された。また、抗卜リ I I型コラーゲン · ゥサギ抗体を用いて、ウェスタンブロッテイング実験を行ったところ、染色像が観察された。これらのことから、当該トリスープ中には、変性 I I型コラーゲンが含有されていることが判明した。

Claims

請求の範囲

1. 酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させた II型コラーゲン又はァミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた 11型コラーゲンを有効成分として含有する経口慢性関節リゥマチ治療剤。

2. 熱変性させた II型コラーゲンが、 II型コラーゲンを 6 0°C以上で且つ 1 0分間以上の熱変性を行って得たものである請求の範囲 1記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。

3. 熱変性条件が、 pH 2. 0〜4. 5又は 1 0. 0〜 1 2. 0、 1 00 〜1 20°C、 1 5分間〜 1 0時間である請求の範囲 2記載の経口慢性関節リウマチ治療剤。

4. アミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた 11型コラーゲンが、 II型コラーゲンを 30°C以上で且つ 1 0分間以上加温して、 α ΐ (II) 型ポリペプチド鎖の 3本が撚リ合わさつてなる 11型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に、アミノ酸配列を特異的に認識し、切断する薬剤を作用させて得たものである請求の範囲 1記載の経口慢性関節リゥマチ治療剤。

5. II型コラーゲンが、ゥシ、ブタ、ャギ、ヒッジ、ゥマ、ヒ卜、サル、ゥサギ、マウス、ラット等の哺乳類、ニヮトリ、シチメンチヨウ、ダチヨウ等の鳥類、カメ、へビ等の爬虫類、マグロ、カツォ、サケ、サメ、エイ等の魚類由来である請求の範囲 1記載の経口慢性関節リゥマチ治療剤。

6. 製剤形態が、経口投与製剤、経鼻投与製剤、経腸投与製剤又は経粘膜投与製剤である請求の範囲 1記載の経口慢性関節リゥマチ治療剤。

7. 酸性もしくはアルカリ性条件下に熱変性させた II型コラーゲン又はァミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた 11型コラーゲンの有効量をヒ卜に経口投与することからなる慢性関節リゥマチの治療方法。

8. 経口慢性関節リウマチ治療剤を製造するための、酸性もしくはアル力リ性条件下に熱変性させた II型コラーゲン又はアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた II型コラーゲンの使用。

9. 酸性もしくはアル力リ性条件下に熱変性させた II型コラーゲン又はァミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた II型コラーゲンを含有する機能性食品。

10. 熱変性させた II型コラーゲンが、 II型コラーゲンを 60°C以上で且つ 1 0分間以上の熱変性を行って得たものであり；またアミノ酸配列を特異的に認識する薬剤で変性させた II型コラーゲンが、 II型コラーゲンを 30°C以上で且つ 1 0分間以上加温して、 α ΐ (II) 型ポリペプチド鎖の 3本が撚リ合わさつてなる 11型コラーゲンの螺旋状の立体構造を解き、その後に、アミノ酸配列を特異的に認識し、切断する薬剤を作用させて得たものである請求の範囲 9記載の機能性食品。