WO1997005276A2 - Verfahren zur sequenzierung durch oligomerhybridisierung - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a new method for sequencing by oligomer hybridization.
  • a DNA fragment, the sequence of which is to be determined, is hybridized on such a hybridization matrix or an “oligomer chip”, under conditions which only permit specific double-strand formation.
  • the DNA fragment only binds to the oligomers whose complementary sequence corresponds exactly to a part (e.g. an octamer when using an "octamer chip") of its own sequence.
  • a part e.g. an octamer when using an "octamer chip”
  • the continuous sequence of the DNA fragment can be determined by suitable mathematical algorithms. This principle is shown by way of example in FIG. 1 for a 13 base long DNA fragment, the sequence of which is to be determined by octamer hybridization sequencing.
  • oligomers have a different bond strength depending on their sequence (Dissociation temperature), but must bind specifically and in full length to the DNA fragment to be determined under a single set of experimental hybridization temperatures. If high stringency is used, however, weakly binding oligomers do not bind to the DNA fragment, although their complementary sequence is contained there (false negatives). With low stringency, on the other hand, even partial areas of oligomers (eg only six or seven nucleotides of an octamer) bind with high binding strength, which leads to false positives. Due to the wide range of stability differences, both artifacts occur under most conditions.
  • a third solution for modulating the binding strength of the oligomers provides for hybridization in tetraalkylammonium salts, by means of which the stability differences between G: C and A: T base pairs are reduced (Wood et al., (1 985), Proc. Natl. Acad. Sei. 82, 1 585-1 588).
  • this effect is insufficient for short oligomers.
  • the use of high molar salt solutions hinders hybridization.
  • the object of the present application was therefore to bring the binding strength of all oligomers to a level in a method for sequencing by oligomer hybridization, the disadvantages described above being to be avoided.
  • the DNA / RNA hybrid oligomers are synthesized using the customary known methods which have been developed for the synthesis of pure DNA oligonucleotides, the necessary number of nucleotides only having to be doubled (DNA or RNA nucleotide of A, G, C and T).
  • the synthesis is preferably carried out in the commercially available devices or easily adapted devices known on the market.
  • the application of the individual oligomers for the production of the hybridization matrix is preferably carried out by individual transfer of certain amounts using a commercial robot to a specific position of a carrier.
  • Materials for the carrier are known to the person skilled in the art, preferably glass, polypropylene or silicon being used.
  • the oligomers are preferably bound to the support surface by way of commercially available linkers known to the person skilled in the art, which have optionally been chemically modified.
  • the synthesis building blocks are passed over the carrier in four parallel channels (one each for building blocks A, G, C, T with either deoxyribose or ribose sugar content).
  • these channels are perpendicular to their orientation in the first step.
  • four channels are used for the building blocks A, G, C, T for each individual channel of synthesis steps 1 and 2, as a result of which a total of 1 6 channels are used, first in one dimension, then in the second dimension.
  • the number of channels is quadrupled for each additional pair of synthesis steps.
  • this method is described in Southern et al., (1 992), Genomics 1 3, pp. 1008-1 01 7, to which reference is made here.
  • oligonucleotides are synthesized on the support using photoactivatable building blocks and photolithographic techniques.
  • the carrier is covered with a mask and irradiated with light. Only at the points where the mask has holes is the surface activated by the incidence of light. Only in this activated position can a DNA or RNA nucleotide be incorporated in the subsequent synthesis step.
  • a new mask with holes at another position is put on, the surface at this new position is activated with light and a new DNA or RNA nucleotide is inserted.
  • octamer chip a hybridization matrix to which octamers have been applied
  • the present invention was based on the following experiments on two different dodecamer sequences, upper case letters representing DNA nucleotides and lower case letters representing RNA nucleotides.
  • the following oligomers were produced:
  • Equal amounts of radiolabelled oligomer were mixed with single-stranded DNA containing the complementary sequence. There was no unspecific binding.
  • the single-strand DNA-oligomer mixture was applied to thin-layer plates. Thin-layer chromatography was carried out under hybridization conditions, with a temperature gradient applied across the direction of rotation. Under these conditions, free oligomer runs on the buffer run front, while bound oligomer remains at the starting point. A measurement of the radioactivity at the starting point enables the amount of bound oligomers to be quantified. This measurement method has been described in detail by Hoheisel et al., J. Biol. Chem. 1 65, p. 1 6656-1 6660 (1 990), to which reference is made here.
  • the above experiment also determined the dissociation temperature of the oligomer, i.e. the temperature at which 50% of the oligomer originally bound is still bound. It can be seen from FIGS. 2 and 3 that the stability of the double strand decreases linearly with an increasing number of changes from DNA to RNA nucleotide or from RNA to DNA nucleotide. Change is the number of alternations between DNA and RNA in a molecule. So there are 7 changes in the fragment "AgCtTgAg" and only 1 change in the fragment "AGCTTgag".
  • the dissociation temperatures of pure DNA oligomers on a "probe chip” must be determined by means of hybridizations with a DNA test fragment of a known sequence. Since you know from the start, To which oligomers of the "sample chip” the test fragment is allowed to bind and to which not (false positives), the dissociation temperature is determined from the oligomers to which the fragment was allowed to bind and has bound. This procedure is repeated with further DNA test fragments until the dissociation temperature has been determined from all oligomers of the chip.
  • the determined lowest dissociation temperature is assumed to be the one to which all oligomers should be adjusted in order to bring all oligomers to a level of binding strength. This is done by introducing RNA nucleotides into the corresponding oligomers during the synthesis of a new chip, ie, corresponding DNA / RNA changes are introduced and the dissociation temperature of the oligomer is reduced. It is preferred that the DNA / RNA hybrid oligomers have at least 2 changes from DNA to RNA or from RNA to DNA, very preferred are at least 4 changes. On this basis, a chip is obtained which is characterized by a uniform binding strength of all oligomers and is suitable for the sequencing of an unknown DNA fragment. It is also within the scope of the invention to apply and test RNA oligomers on a “probe chip” in order to later introduce DNA nucleotides for the production of the DNA / RNA hybrid oligomers.
  • Another, but not so precise, possibility of predicting the binding strength is a calculation method based on the base sequence. This method is described by Breslauer et al., (1 986), Proc. Natl. Acad. Be USA, 83, pp. 3746-3750 and can quickly provide an overview using computers.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA durch Oligomerhybridisierung, wobei als Hybridisierungsmatrix auf einem Träger aufgebrachte DNA-/RNA-Hybridoligomere und gegebenenfalls DNA-Oligomere und/oder RNA-Oligomere verwendet werden.

Description

Verfahren zur Sequenzierung durch Oligomerhybridisierung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Sequenzierung durch Oligomerhybridisierung.
Vor einigen Jahren hat sich neben der lang bekannten DNA-Sequenzierung durch Auftragen auf Gele, ein weiteres Verfahren entwickelt, nämlich die Sequenzierung durch Oligomerhybridisierung (vgl. z.B. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), S. 1 14-128 oder Bains et al., J. Theor. Biol. 135, (1988), S. 303-307). Für dieses Sequenzierungsverfahren wird ein vollständiger Satz kurzer Oligonukleotide bzw. Oligomere (z.B. alle denkbaren 65.536 Oktamere) in einem geordneten Raster auf ein Trägermaterial gebunden, so daß die Position jedes einzelnen Oligonukleotids bekannt ist. Auf solch einer Hybridisierungsmatrix bzw. einem "Oligomer-Chip" wird ein DNA-Fragment, dessen Sequenz man ermitteln will, hybridisiert, und zwar unter Bedingungen, die nur eine spezifische Doppelstrangbildung erlauben. Da¬ durch bindet das DNA-Fragment nur an die Oligomere, deren komplementäre Sequenz exakt einem Teil (z.B. einem Oktamer bei Verwendung eines "Oktamer- Chips") seiner eigenen Sequenz entspricht. Durch Detektion der Bindungspositio¬ nen des hybridisierten DNA-Fragments werden damit alle im Fragment vorhande¬ nen Oligomersequenzen bestimmt. Aufgrund der Überlappung benachbarter Oligo- mersequenzen kann durch geeignete mathematische Algorithmen die fortlaufende Sequenz des DNA-Fragments bestimmt werden. Beispielhaft ist dieses Prinzip in Fig. 1 für ein 13 Basen langes DNA-Fragment, dessen Sequenz durch Oktamerhy- bridisierungs-Sequenzierung bestimmt werden soll, gezeigt.
Ein Hauptproblem bei der praktischen Anwendung dieser Methode liegt darin, daß die Oligomere in Abhängigkeit ihrer Sequenz eine unterschiedliche Bindungsstärke (Dissoziationstemperatur) besitzen, aber unter einem einzigen Satz experimenteller Hybridisierungstemperaturen spezifisch und in voller Länge an das zu bestimmende DNA-Fragment binden müssen. Bei Verwendung hoher Stringenz binden jedoch schwach bindende Oligomere nicht an das DNA-Fragment, obwohl ihre komple¬ mentäre Sequenz dort enthalten ist (falsch Negative). Bei geringer Stringenz dagegen binden auch Teilbereiche von Oligomeren (z.B. nur sechs oder sieben Nukleotide eines Oktamers) mit hoher Bindungsstärke, wodurch falsch Positive entstehen. Durch die Breite der Stabilitätsunterschiede treten unter den meisten Bedingungen beide Artefakte auf. Zur Nutzung dieser Sequenzierungstechnik ist es deshalb notwendig, die Bindungsstärke aller Oligomere, unabhängig von ihrer Sequenz, auf ein Niveau zu bringen. Dies geschieht bisher dadurch, daß die Oligomerkonzentration variiert wird (Khrapko et al., ( 1 991 ) DNA Sequence 1 , S. 375-388). Dies hat jedoch den Nachteil, daß große technische Schwierigkeiten bei der Herstellung der Hybridisierungsmatrix auftauchen, da für jedes Oligomer zusätzlich eine spezifische Konzentration eingestellt werden muß. Ein zweiter Ansatz, um die Bindungsstärke aller Oligomere auf ein Niveau zu bringen, ist die Einführung von Basenderivaten, die zu einer Änderung der Stabilität der jeweiligen Basenpaarung führen. Daran ist nachteilig, daß viele unterschiedliche Derivate verwendet werden müssen und durch die Einführung der Derivate die Spezifität der Basenpaarung geändert wird. Eine dritte Lösung zur Modulation der Bindungsstärke der Oligomere sieht die Hybridisierung in Tetraalkylammoniumsalzen vor, durch die die Stabilitätsunterschiede zwischen G:C und A:T Basenpaare verringert werden (Wood et al., ( 1 985), Proc. Natl. Acad. Sei. 82, 1 585-1 588). Dieser Effekt ist jedoch für kurze Oligomere unzureichend. Außerdem behindert die Verwendung der hochmolaren Salzlösungen die Hybridisierung.
Aufgabe der vorliegenden Anmeldung war es deshalb, in einem Verfahren zur Sequenzierung durch Oligomerhybridisierung, die Bindungsstärke aller Oligomere auf ein Niveau zu bringen, wobei die oben beschriebenen Nachteile vermieden werden sollen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 . Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß durch Verwendung von DNA/RNA- Hybridoligomeren, ggfs. in Kombination mit DNA- und/oder RNA-Oligomeren, auf der Hybridisierungsmatrix bei der Sequenzierung von unbekannten DNA-Frag¬ menten, die Bindungsstärke (Doppelstrangstabilität) durch die Einflußnahme auf die Zuckerfaltung variiert werden kann, und zwar ohne eine Beeinflussung der Spezifi¬ tät der Basenpaarung. Gleichzeitig ist die Variation der Bindungsstärke durch Einsatz der DNA/RNA-Hybride unabhängig von der Basensequenz des Oligomers.
Die Synthese der DNA/RNA-Hybridoligomere erfolgt mit den üblichen bekannten Methoden, die zur Synthese reiner DNA-Oligonukleotide entwickelt wurden, wobei die notwendige Zahl an Nukleotiden nur verdoppelt werden muß (DNA- bzw. RNA- Nukleotid von A, G, C und T). Die Synthese erfolgt vorzugsweise in den auf dem Markt bekannten kommerziell erhältlichen Geräten oder leicht adaptierten Geräten. Die Aufbringung der einzelnen Oligomere zur Herstellung der Hybridisierungsmatrix- erfolgt vorzugweise über individuellen Transfer gewisser Mengen unter Verwen¬ dung eines kommerziellen Roboters an eine bestimmte Position eines Trägers. Materialien für den Träger sind dem Fachmann geläufig, wobei vorzugsweise Glas, Polypropylen oder Silicium eingesetzt werden. Die Bindung der Oligomere an die Trägeroberfläche erfolgt vorzugsweise über dem Fachmann bekannte kommerziell erhältliche Linker, welche gegebenenfalls noch chemisch modifiziert worden sind.
Es besteht aber auch die Möglichkeit der gleichzeitigen Synthese aller Oligomere auf dem Träger. Dafür werden die Synthesebausteine in vier parallelen Kanälen (je einer für die Bausteine A, G, C, T mit entweder Desoxyribose oder Ribose-Zucker- anteil) über den Träger geleitet. Im zweiten Syntheseschritt liegen diese Kanäle senkrecht zu ihrer Ausrichtung im ersten Schritt. Im dritten und vierten Schritt werden für jeden einzelnen Kanal der Syntheseschritte 1 und 2 vier Kanäle für die Bausteine A, G, C, T verwendet, wodurch insgesamt 1 6 Kanäle, erst in der einen Dimension, dann in der zweiten Dimension angewendet werden. Für jedes weitere Paar an Syntheseschritten wird die Zahl an Kanälen jeweils vervierfacht. Allgemein ist dieses Verfahren in Southern et al., ( 1 992), Genomics 1 3, S. 1008-1 01 7 beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird.
Ein weiteres Verfahren zur gleichzeitigen Synthese aller Oligomere auf dem Träger ist von Pease et al., ( 1994), Proc. Natl. Acad. Sei 91 , S. 5022-5026 beschrieben worden, worauf hier Bezug genommen wird. Dort werden unter Verwendung photoaktivierbarer Bausteine und photolitographischerTechniken die Oligonukleoti¬ de auf dem Träger synthetisiert. Der Träger wird mit einer Maske abgedeckt und mit Licht bestrahlt. Nur an den Stellen, an denen die Maske Löcher hat, wird die Oberfläche durch den Lichteinfall aktiviert. Nur an dieser aktivierten Position kann im nachfolgenden Syntheseschritt ein DNA- oder RNA-Nukleotid eingebaut wer¬ den. Für den folgenden Syntheseschritt wird eine neue Maske mit Löchern an einer anderen Position aufgelegt, die Oberfläche an dieser neuen Position mit Licht aktiviert und ein neues DNA- oder RNA-Nukleotid eingebaut.
In der Praxis hat es sich bewährt, für die Sequenzierung von DNA-Fragmenten bis zu 200 Basen eine Hybridisierungsmatrix, auf die Oktamere aufgebracht worden sind ("Oktamer-Chip") zu verwenden, während DNA von 200 Basen bis zu einer Kilobase Länge besser unter Verwendung eines "Decamer-Chips" sequenziert wird. Die Auswahl der geeigneten Größe der Oligomere obliegt dem Können eines Fachmanns und umfaßt vorzugsweise eine Tetramer- bis Dodecamer-Hybridi- sierungsmatrix.
Grundlage der vorliegenden Erfindung waren folgende Experimente an zwei ver¬ schiedenen Dodekamersequenzen, wobei Großbuchstaben DNA-Nukleotide und Kleinbuchstaben RNA-Nukleotide bedeuten. Es wurden folgende Oligomere herge¬ stellt:
XS-O TCTAGAGTCGAC
XS-1 7 TCTaGAGTcGAC
XS-42 TcTaGAgTcGaC
XS-67 TcTagagTcgac
XS-100 tetagagtegae SX-O GTCGACTCTAGA
SX-17 GTcGACTCTaGA
SX-42 gTcGaCTcTaGA
SX-58 gTcgacTcTagA
SX-83 gTcgactctagA
SX-100 gtcgactctaga
Es wurden jeweils gleiche Mengen radioaktiv markiertes Oligomer mit Einzelstrang- DNA gemischt, die die komplementäre Sequenz enthält. Unspezifische Bindung fand nicht statt. Das Einzelstrang-DNA-Oligomer-Gemisch wurde auf Dünnschicht¬ platten aufgebracht. Dünnschicht-Chromatographie fand unter Hybridisierungs- bedingungen statt, wobei quer zur Laufrichtung ein Temperaturgradient angelegt war. Unter diesen Bedingungen läuft freies Oligomer mit der Pufferlauffront, während gebundenes Oligomer am Ausgangspunkt zurückbleibt. Eine Messung der Radioaktivität am Ausgangspunkt erlaubt eine Quantifizierung der Menge gebunde¬ nen Oligomers. Detailliert ist diese Meßmethode von Hoheisel et al., J. Biol. Chem. 1 65, S. 1 6656-1 6660 (1 990) beschrieben worden, worauf hier Bezug genommen wird.
Durch obiges Experiment wurde u.aauch die Dissoziationstemperatur der Oligome¬ re bestimmt, d.h. die Temperatur bei der 50% des ursprünglich gebundenen Oligomers noch gebunden ist. Aus den Fig. 2 und 3 sieht man, daß mit zunehmen¬ der Zahl von Wechseln von DNA- zu RNA-Nukleotid bzw. von RNA- zu DNA- Nukleotid die Stabilität des Doppelstrangs linear abnimmt. Unter Wechseln ist die Zahl der Alternierungen zwischen DNA und RNA in einem Molekül zu verstehen. So finden in dem Fragment "AgCtTgAg" 7 Wechsel statt und in dem Fragment "AGCTTgag" nur 1 Wechsel.
Um die Bindungsstärke der Oligomere auf der Hybridisierungsmatrix ("Oligomer Chip") auf ein Niveau zu bringen, müssen die Dissoziationstemperaturen reiner DNA-Oligomere auf einem "Probe-Chip" mittels Hybridisierungen mit einem DNA- Testfragment bekannter Sequenz bestimmt werden. Da man von vornherein weiß, an welche Oligomere des "Probe-Chips" das Testfragment binden darf und an welche nicht (falsch Positive), bestimmt man von den Oligomeren an die das Fragment binden durfte und gebunden hat, die Dissoziationstemperatur. Diese Prozedur wiederholt man mit weiteren DNA-Testfragmenten bis von allen Oligome¬ ren des Chips die Dissoziationstemperatur bestimmt worden ist. Dann nimmt man die ermittelte niedrigste Dissoziationstemperatur als diejenige an, auf die alle Oligomere eingestellt werden sollen, um alle Oligomere auf ein Niveau der Bin¬ dungsstärke zu bringen. Dies geschieht durch Einführung von RNA-Nukleotiden in die entsprechenden Oligomere bei der Synthese eines neuen Chips, d.h man führt entsprechende DNA/RNA-Wechsel ein und erniedrigt die Dissoziationstemperatur des Oligomers. Bevorzugt ist, daß die DNA/RNA-Hybridoligomere mindestens 2 Wechsel von DNA zu RNA bzw. von RNA zu DNA aufweisen, ganz bevorzugt sind mindestens 4 Wechsel. Auf dieser Grundlage erhält man einen Chip, der sich durch eine einheitliche Bindungsstärke aller Oligomere auszeichnet und für die Sequenzie¬ rung eines unbekannten DNA-Fragments geeignet ist. Im Umfang der Erfindung liegt auch, auf einem "Probe-Chip" RNA-Oligomere aufzubringen und auszutesten, um später DNA-Nukleotide einzubringen zur Herstellung der DNA-/RNA-Hybridoli- gomere.
Eine andere, jedoch nicht so genaue, Möglichkeit zur Voraussage der Bindungs¬ stärke ist eine Berechnungsmethode auf Grundlage der Basensequenz. Diese Methode ist von Breslauer et al., (1 986), Proc. Natl. Acad. Sei USA, 83, S. 3746- 3750 beschrieben worden und kann unter Computereinsatz schnell einen Überblick liefern.
Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die Figuren beschrieben, von denen zeigen:
Fig. 1 Prinzip der Oligomerhybridisierungs-Sequenzierung
Fig. 2 Auftragung der Dissoziationstemperaturen der Oligomere der
XS-Reihe in Abhängigkeit von der Anzahl an Wechseln zwi¬ schen DNA- und RNA-Molekülen Fig. 3 Auftragung der Dissoziationstemperaturen der Oligomere der
SX-Reihe in Abhängigkeit von der Anzahl der Wechsel zwi¬ schen DNA- und RNA-Molekülen

Claims

Patentansprüche
1 ) Verfahren zum Sequenzieren von DNA durch Oligomerhybridisierung, da¬ durch gekennzeichnet, daß als Hybridisierungsmatrix auf einem Träger aufgebrachte DNA-/RNA-Hybridoligomere und gegebenenfalls DNA-Oligome¬ re und/oder RNA-Oligomere verwendet werden.
2) Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Glas, Polypropylen oder Silicium besteht.
3) Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hybridisierungsmatrix um eine Tetramer- bis Dodecamer-Matrix handelt.
4) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligomere unter Verwendung photoaktivierbarer Bausteine und photolithographischer Techniken auf dem Träger synthetisiert worden sind.
5) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligomere einzeln synthetisiert worden sind und dann mittels einem Linker auf die Trägeroberfläche aufgebracht worden sind.
6) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA/RNA-Hybridoligomere mindestens vier Wechsel von DNA zur RNA bzw. RNA zu DNA aufweisen.
PCT/DE1996/001386 1995-07-25 1996-07-25 Verfahren zur sequenzierung durch oligomerhybridisierung Ceased WO1997005276A2 (de)

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