WO1997040827A1 - Verwendung von ethylendiamindisuccinat zur herstellung eines arzneimittels mit antiviralen eigenschaften - Google Patents

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WO1997040827A1
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Hans Wilhelm Doerr
Kai Uwe Bindseil
Lutz MÜLLER-KUHRT
Holger Rabenau
Jindrich Cinatl
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]

Definitions

  • the invention relates to the use of ethylenediamine disuccinate including compatible salt-forming ions and the protonated form for the manufacture of a medicament with antiviral properties which also has an immunosuppressive effect.
  • (S, S) -N, N '-ethylenediamine disuccinate is described in detail in the publication by Takaaki NISHIKIORI et al. (1984), The Journal of Antibiotics, Vol. 37, No. 4: 426-427.
  • (S, S) - N, N'-ethylenediamine disuccinate can be obtained from actinomycetes and can also be prepared synthetically (JA Neal and NJ rose (1968), Inorg. Chem. Vol. 7; 2405-2412). It inhibits phospholipase C and D. If (S, S) - N, N'-ethylenediamine disuccinate is administered intraperitoneally to mice, the antibody production and the DTH reaction (delayed type hypersensitivity) are suppressed.
  • CMV cytomegaloviruses
  • the viruses are ubiquitous. The infection of the population varies from 30% to 85%, yes 95%. The infection runs inconspicuously in adults with a functional immune system and shows at most unspecific symptoms, such as fatigue and slightly increased body temperature.
  • CMV infections focus on pulmonary diseases, inflammation of the arteries and gastrointestinal disorders. In AIDS patients, CMV infections cause most deaths.
  • Foscarnet is an antiviral substance with selective activity against human viruses of the herpes group, such as herpes simplex, varicella zoster, Epstein-Barr and cytomegaloviruses as well as hepatitis viruses.
  • the antiviral effect is based on the inhibition of viral enzymes, such as DNA polymerases and reverse transcriptases.
  • Foscarnet has a virostatic effect on cytomegaloviruses, but the viruses cannot be eliminated (Lutz Schneider (1991), Pharmaceutical Newspaper, Vol. 136, No. 46, 33-36).
  • An essential problem of the cytomegalovirus infection is the necessity of the sometimes lifelong long-term treatment of the patients.
  • Ganciclovir is described in the publication by Lutz Schneider (1990), Pharmazie, Vol. 135, No. 37, 2396 to 2400.
  • Ganciclovir is one of the nucleoside antimetabolites derived from 2'-deoxiguanosine. It carries an acyclic side chain instead of the 2'-deoxyribose and differs from aciclovir only by an additional hydroxymethyl group in the side chain.
  • Ganciclovir is approved for the treatment of life or eyesight-threatening cytomegalovirus infections in patients with acquired immunodeficiency or medicinal immunosuppression, for example after organ transplants.
  • ganciclovir is also effective in other human pathogenic herpes viruses (HSV 1 and 2, Varicella zoster and Epstein-Barr), its use is prohibited because of the high rate of side effects such infections. Ganciclovir leads to neutropenia, and it has also been observed that mice develop tumors during the treatment. Another disadvantage is that the cytomegaloviruses have recently become more resistant to this substance (Stanat et al. (1991), Lancet, Vol. 337: 1292-1293).
  • WO 94/22438 (DINU, filing date: December 29, 1993) describes diethylenetriaminepentaacetic acid for the treatment of herpes simplex, varicella zoster, encephalomyelitis, polyradiculomiritis, multiple sclerosis, but not of cytomegaloviruses.
  • Immunosuppressants such as cyclosporin A or tacrolimus, have been used successfully in organ transplants to avoid or mitigate rejection reactions. The disadvantage of this is of course the susceptibility of the treated patients to serious complications caused by viral and bacterial infections. Infection with cytomegaloviruses is particularly worth mentioning in this context.
  • the technical problem underlying the invention is to provide a compound with an antiviral effect which also has an immunosuppressive effect.
  • the substance to be used according to the invention is significantly more effective in terms of its antiviral activity. Compared to the substance desferrioxamine, the substance according to the invention is more effective by a factor of 30.
  • the antiviral effect of the substance according to the invention can be modulated by adding iron (II) and iron (III) ions. Antiviral activity is reduced by a factor of 2 to 3, but is not completely eliminated. Thus it becomes obvious that the formation of iron chelate has an observable effect when acting as an antiviral agent, but it is also evident that this effect alone is not sufficient to explain the antiviral effect.
  • the substance according to the invention can be used very selectively against cytomegaloviruses. Concentrations of the substance according to the invention which have an antiviral effect have no effect on cell growth. The therapeutic index is therefore very high. The substance according to the invention is therefore of great clinical importance.
  • cytomegaloviruses can be used against cytomegaloviruses, but has no influence on certain other viruses, such as adenoviruses (ATTC strain: GB type 3), varicella zoster viruses (ATCC strain: Maclntyre) and herpes simplex viruses (HSV -Vero) has.
  • adenoviruses ATCC strain: GB type 3
  • varicella zoster viruses ATCC strain: Maclntyre
  • HSV -Vero herpes simplex viruses
  • the invention further comprises the ethylene diamine succinate according to the invention and its salts and / or acid groups.
  • the salts inevitably result from the environment and the physical state of the substance.
  • (S, S) -N, N '-ethylenediamine disuccinate in which the cations from the group of magnesium (II) -, aluminum (III) -, calcium (II) -, manganese (II) -, iron (II) -, iron (III) -, cobalt (II), nickel (II) -, copper (II) -, zinc (II) - ions and further lithium, potassium and sodium ions are selected or mixtures thereof previously mentioned ions are. Lithium, manganese (II), calcium (II), potassium and sodium ions are also particularly preferred.
  • the (S, S) -N, N'-ethylenediamine disuccinate is preferred, in which the salts comprise organic cations.
  • (S, S) -N, N '-ethylenediamine disuccinate in which the cations from the group of the primary; secondary or tertiary amines (e.g. ethanolamine, diethanoiamine, triethanolamine, morpholine, glucamine, N, N-dimethylglucamine and N-methylglucamine), lysine, arginine or ornithine are selected or the cations are mixtures of the cations mentioned above.
  • secondary or tertiary amines e.g. ethanolamine, diethanoiamine, triethanolamine, morpholine, glucamine, N, N-dimethylglucamine and N-methylglucamine
  • lysine, arginine or ornithine are selected or the cations are mixtures of the cations mentioned above.
  • a mixture of organic and inorganic salts is included in the invention.
  • the substance (S, S) -N, N'-ethylenediamine disuccinate is preferred as a medicament if it forms a composition with pharmacologically acceptable auxiliaries and carriers.
  • auxiliaries and carriers are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980).
  • the compositions can be prepared by known methods.
  • the (S, S) -N, N'-ethylenediamine disuccinate according to the invention has pharmacological properties and can therefore be used as an active pharmaceutical ingredient.
  • the invention also includes a medicament containing the (S, S) -N, N '-ethylenediamine disuccinate.
  • the substance (S, S) -N, N'-ethylenediamine disuccinate according to the invention has an activity against cytomegaloviruses.
  • the substance according to the invention shows an antiviral inhibition (IC 50 value) at concentrations of 4 ⁇ g / ml. Higher concentrations can be used without disturbing the test system.
  • the substance according to the invention can thus be used in a concentration of 0.5 to 100 ⁇ g / ml.
  • test results of this in vitro test show that the substance according to the invention can be used as a medicament or for medical treatment. These test results can easily be transferred from the in vitro test system to an in vivo system, since the antiviral test system is an established test set-up which serves to detect the antiviral activity (Gerna et al., (1992) Antiviral. Res. Vol. 19: 333-345). EDDS can therefore be used according to the invention for the treatment or prevention of cytomegalovirus infections, the substance also acting as an immunosuppressant. It can be used as an inhibitor in mammals, especially humans, for the treatment of the aforementioned disease.
  • the invention further provides
  • a pharmacological composition for the treatment or prevention of cytomegaloviruses which comprises a substance according to the invention and at least one pharmaceutical auxiliary and / or carrier.
  • Different doses are suitable for the therapeutic effect. They depend, for example, on the salts used, on the host, on the type of administration and on the type and severity of the conditions to be treated.
  • the daily doses range from 1 to 500 mg per kg. Include body weight.
  • a recommended daily dose is in the range from 1 to 50 mg per kg of body weight, a dose of 5 to being most preferred 30 mg per kg body weight.
  • this dose is expediently administered in partial doses up to four times a day. Satisfactory results can be expected if the substance according to the invention is administered subcutaneously or intravenously. Oral administration is also possible.
  • Antiviral activity cells and viruses used
  • HFF Human foreskin fibroblasts
  • EMEM Eagle's minimal essential medium
  • the CMV laboratory strain AD169 is used.
  • the viruses are propagated in EMEM culture medium with a 4% addition of fetal calf serum (maintenance medium).
  • the virus titer is determined by determining what are known as immediate early antigen forming units (I.E.F.U.) which are formed in the preservation medium (Gerna et al. (1992), Antiviral. Res., Vol. 19: 333-345).
  • IC 50 value represents the concentration of active ingredient which lowers the production rate of the antigen by 50%.
  • the sub- punches have an IC 50 value of 4 ⁇ g / ml ⁇ 1 ⁇ g / ml.
  • the cell vitality is measured in an HFF cell culture using an MTT assay.
  • the result is expressed by the TC 50 value, which is the concentration at which 50% of the cells tested are still vital. It is 435 ⁇ g / ml in HFF cells for the substances according to the invention.
  • the quotient TC S0 / IC 50 is formed from both values in order to determine the therapeutic index. In the substances according to the invention, this is 109 (Gerna et al. (1992) Antiviral Res. Vol. 19: 333-345).
  • lymphocyte cultures were prepared in mixed lymphocyte cultures (MLC) or with 1% phytohaemaglutinin (PHA) in a total volume of 200 ⁇ l culture medium. 18 to 20 hours before the measurement, 0.1 ⁇ Ci methyl [ 3 H] thymidine (NEN, Germany) was added. Radioactively labeled DNA was harvested on filter membranes (Schleicher & Schüll, Germany). The radioactivity was quantified using a scintillation counter (Zinsser, Germany). The PBL sample affects peripheral blood lymphocytes as a control standard.
  • MLC mixed lymphocyte cultures
  • PHA phytohaemaglutinin

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Abstract

Verwendung von (S,S)-N,N'-Ethylendiamindisuccinat (EDDS) der Formel (I), wobei M = H+ und/oder irgendein pharmazeutisch annehmbares Kation darstellt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionen gegen Cytomegalieviren mit immunsuppressiven Eigenschaften.

Description

Verwendung von Ethylendiamindisuccinat zur Herstellung eines Arzneimittels mit antiviralen Eigenschaften
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Ehtylendiamin- disuccinat einschließlich verträglicher salzbildender Ionen und der protonierten Form zur Herstellung eines Arzneimittels mit antiviralen Eigenschaften, das auch immunsuppressive Wirkung aufweist.
(S,S) -N,N' -Ethylendiamindisuccinat wird ausführlich in der Publikation von Takaaki NISHIKIORI et al. (1984) , The Journal of Antibiotics, Vol. 37, Nr. 4: 426 - 427 beschrieben. (S,S)- N,N' -Ethylendiamindisuccinat kann aus Aktinomyceten gewonnen werden und läßt sich ebenfalls synthetisch herstellen (J. A. Neal and N. J. rose (1968) , Inorg. Chem. Vol. 7; 2405 - 2412) . Es inhibiert die Phospholipase C und D. Wird (S,S)- N,N' -Ethylendiamindisuccinat Mäusen intraperitoneal ver¬ abreicht, wird die Antikörperproduktion und die DTH-Reaktion (delayed type hypersensitivity) unterdrückt . Die Blastogenese der B-Zellen und T-Zellen wird in vitro supprimiert . Jedoch wird keine antimikrobielle Wirkung in dieser Publikation beschrieben. Die Toxizität bei Mäusen ist relativ gering. Die Cytomegalieviren (CMV) bilden eine Gruppe artverwandter Viren, die zu den Herpes Viren zählen (Lutz Schneider (1990) , Pharmazeutische Zeitung, Vol. 135, Nr. 27, 2396 - 2400) . Nach einer Erstinfektion verbleiben die Viren latent im Körper. Erst wenn das Immunsystem durch eine medikamentöse oder durch Krankheit bedingte Immunsuppression geschwächt wird, werden die Viren reaktiviert. Den Namen erhielten die Viren, weil sie histopathologisch nachweisbare Riesenzellen mit rand¬ ständigem großen Kern und Viren als Einschlußkörper ver¬ ursachen.
Die Viren sind ubiquitär. Die Durchseuchung der Population schwankt von 30% bis 85%, ja 95%. Die Infektion verläuft bei Erwachsenen mit einem funktionstüchtigen Immunsystem un¬ auffällig und zeigt höchstens unspezifische Symptome, wie Abgeschlagenheit und leicht erhöhte Körpertemperatur.
Bei immungeschwächten Erwachsenen stehen bei CMV-Infektionen pulmonale Erkrankungen, Adernetzhaut-Entzündungen und Magen- Darm-Erkrankungen im Vordergrund. Bei AIDS-Patienten ver¬ ursachen CMV-Infektionen die meisten Todesfälle.
Da mit steigendem Alter auch die Inzidenz der CMV-Infektionen steigt, wird augenblicklich diskutiert, inwieweit die Cyto¬ megalieviren an der arteriellen Plaque-Bildung beteiligt sind. Die Viren sind in der Lage, Endothelzellen der Gefä߬ wände zu schädigen.
Verschiedene Substanzen werden zur Behandlung gegen das Cytomegalievirus diskutiert.
In der Publikation von J. Cinatl et al . (1994) , Antiviral Research, Vol. 25: 73 - 77 wird Desferrioxamin beschrieben, das Eisenchelate bildet. Diese Substanz kann in in vitro- Versuchen gegen Herpes simplex-Viren, Varicella zoster-Viren, Epstein-Barr-Viren und humane Cytomegalieviren erfolgreich eingesetzt werden. Dabei wird die Wirkung der Substanz auf eine Chelatbildung mit den Eisen-Ionen zurückgeführt. Weiter¬ hin soll auch die zelluläre Ribonukleotid-Reduktase inhibiert werden. Jedoch sind die bisherigen Befunde zum Teil in der Theorie widersprüchlich. Die Substanz zeigt eine geringe Toxizität .
Foscarnet ist eine antivirale Substanz mit in Zellkulturen nachgewiesener selektiver Aktivität gegen Humanviren der Herpes-Gruppe, wie zum Beispiel Herpes simplex, Varicella zoster, Epstein-Barr und Cytomegalie-Viren sowie Hepatitis- Viren. Die antivirale Wirkung beruht auf einer Hemmung viraler Enzyme, wie DNA-Polymerasen und reversen Trans- kriptasen. Auf Cytomegalieviren wirkt Foscarnet virostatisch, jedoch können die Viren nicht eliminiert werden (Lutz Schneider (1991), Pharmazeutische Zeitung, Vol. 136, Nr. 46, 33 - 36) . Eine wesentliche Problematik der Cytomegalievirus- Infektion stellt die Notwendigkeit der bisweilen lebenslangen Dauerbehandlung der Patienten dar. Nachteilig ist weiterhin, daß die Cytomegalieviren in der letzten Zeit resistenter gegen diese Substanz geworden sind (Stanat et al . (1991), Antimicrob. Agents, Chemother. , Vol. 35, Nr. 11: 2191 - 2197 und Knox et al. (1991), Lancet, Vol. 337: 1292 - 1293) .
Ganciclovir wird in der Publikation von Lutz Schneider (1990) , Pharmazie, Vol. 135, Nr. 37, 2396 bis 2400 beschrieben. Ganciclovir gehört zu den Nucleosid-Antimeta- boliten, die sich vom 2' -Desoxiguanosin ableiten. Es trägt anstelle der 2' -Desoxyribose eine acyclische Seitenkette und unterscheidet sich von Aciclovir nur durch eine zusätzliche Hydroxymethlygruppe in der Seitenkette. Ganciclovir ist zugelassen zur Behandlung lebens- oder augenlichtbedrohender Cytomegalieviren-Infektionen bei Patienten mit erworbener Immunschwäche oder medikamentöser Immunsuppression zum Beispiel nach Organtransplantationen. Obwohl Ganciclovir auch bei anderen menschenpathogenen Herpesviren (HSV 1 und 2, Varicella zoster und Epstein-Barr) wirksam ist, verbietet sich wegen der hohen Nebenwirkungsrate die Verwendung bei derartigen Infektionen. Ganciclovir führt dabei zu Neutro- penie, weiterhin wurde beobachtet, daß Mäuse Tumoren unter der Behandlung ausbildeten. Nachteilig ist weiterhin, daß die Cytomegalieviren in der letzten Zeit resistenter gegen diese Substanz geworden sind (Stanat et al . (1991) , Lancet, Vol. 337: 1292 - 1293) .
In der WO 94/22438 (DINU, Anmeldetag: 29. Dezember 1993) wird Diethylentriaminpentaessigsäure zur Behandlung von Herpes simplex, Varicella zoster, Encephalomyelitis, Polyradiculo- neuritis, multiple Sklerose, nicht jedoch von Cytomegalie¬ viren beschrieben. Immunsuppressiva, wie Cyclosporin A oder Tacrolimus werden erfolgreich bei Organtransplantationen eingesetzt, um Abstossungsreaktionen zu vermeiden oder abzumildern. Nachteilig ist dabei natürlich die Anfälligkeit der behandelten Patienten für schwerwiegende Komplikationen, die durch virale und bakterielle Infektionen bedingt sind. Insbesondere ist in diesem Zusammenhang die Infektion mit Cytomegaloviren zu nennen.
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem ist es, eine Verbindung mit antiviraler Wirkung bereitzustellen, die auch eine immunsuppressive Wirkung besitzt .
Es war anzunehmen, daß die erfindungsgemäß zu verwendende Substanz ähnlich wie Diethylentriaminpentaessigsäure (Aisen and Listowsky (1980) Annu. Rev. Biochem., Vol. 49: 357 - 393) wegen seines stark hydrophilen Charakters nicht in die Zelle eindringen und deshalb nur freie, d. h. nicht in die Zelle inkorporierte Metalle oder Ionen komplexieren kann. Von zum Beispiel Desferrioxamin ist dagegen bekannt, daß es in die Zelle einzudringen vermag. Da die Virusvermehrung aus dem Inneren der Zelle heraus erfolgt, mußte davon ausgegangen werden, daß ein hemmender Wirkstoff auch in die Zelle ein¬ dringen muß, um wirksam zu werden. Überraschenderweise ist jedoch gemäß in vitro-Versuchen in der Zellkultur die er¬ findungsgemäße Substanz dennoch wirksam. Insbesondere überraschend war der Effekt, daß EDDS neben der antiviralen Wirkung - auch eine immunsuppressive Wirkung entfaltet . Die immunsuppressive Wirkung äußert sich in der Inhibierung der durch Phytohaemagglutin stimulierten Lympho- cytenproliferation.
Fig. 1 zeigt die konzentrationsabhängige Inhibition der Lymphocytenproliferation. Dabei wird zwischen 30 μM und 100 μM (entsprechend nicht toxischer Konzentrationen) EDDS eine fast quantitative Inhibition erzielt.
Gegenüber der Substanz Diethylentriaminpentaessigsäure ist die erfindungsgemäße, zu verwendende Substanz hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität deutlich wirksamer. Gegenüber der Substanz Desferrioxamin ist die erfindungsgemäße Substanz um den Faktor 30 wirkungsvoller.
Weiterhin ist überraschend, daß lediglich die erfindungs¬ gemäße Substanz (S,S-Form) als Medikament einsetzbar ist. Nicht dagegen sind die anderen Formen einschließlich der Modifikationen (Propylen und Glutamat) gegen Cytomegalieviren erfolgreich einsetzbar.
Der antivirale Effekt der erfindungsgemäßen Substanz läßt sich durch Zusetzen von Eisen(II)- und Eisen(III) -Ionen modulieren. Die antivirale Aktivität wird um etwa den Faktor 2 bis 3 herabgesetzt, jedoch nicht vollständig aufgehoben. S.omit wird offensichlich, daß die Eisenchelatbildung einen beobachtbaren Effekt bei der Wirkung als antivirales Mittel aufweist, jedoch wird auch offensichtlich, daß dieser Effekt allein nicht ausreicht, um die antivirale Wirkung zu er¬ klären.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß die er¬ findungsgemäße Substanz sehr selektiv gegen Cytomegalieviren einsetzbar ist. Konzentrationen an erfindungsgemäßer Substanz, die antiviral wirksam sind, haben keinen Einfluß auf das Zellwachstum. Der therapeutische Index ist also sehr hoch. Somit hat die erfindungsgemäße Substanz eine hohe klinische Bedeutung.
Ungewöhnlich ist, daß die erfindungsgemäße Substanz gegen Cytomegalieviren einsetzbar ist, jedoch keinen Einfluß auf bestimmte andere Viren, wie Adenoviren (ATTC-Stamm: GB Typ 3) , Varizella zoster-Viren (ATCC-Stamm: Maclntyre) und Herpes simplex-Viren (HSV-Vero) hat.
Die Erfindung umfaßt weiterhin das erfindungsgemäße Ethylen- diaminsuccinat und dessen Salze und/oder sauren Gruppen. Die Salze ergeben sich zwangsläufig durch die Umgebung und den Aggregatzustand der Substanz.
Bevorzugt ist das (S,S) -N,N' -Ethylendiamindisuccinat, bei dem die Salze Kationen aus der Gruppe mit den Ordnungszahlen 3-5, 11-13, 19-29, 37-49 oder 55-81 umfassen oder Gemische der zuvor aufgezählten Kationen umfassen.
Stärker bevorzugt ist das (S,S) -N,N' -Ethylendiamindisuccinat, bei dem die Kationen aus der Gruppe von Magnesium(II) - , Aluminium(III) - , Calcium(II) - , Mangan(II)-, Eisen(II)-, Eisen(III)-, Cobald(II), Nickel (II)-, Kupfer(II)-, Zink (II)- Ionen und weiterhin Lithium-, Kalium- und Natrium-Ionen ausgewählt sind oder Mischungen dieser zuvor genannten Ionen sind. Besonders bevorzugt sind weiterhin Lithium-, Mangan (II)-, Calcium(II) - , Kalium- und Natrium-Ionen.
Daneben ist das (S,S) -N,N' -Ethylendiamindisuccinat bevorzugt, bei dem die Salze organische Kationen umfassen.
Mehr bevorzugt ist das (S, S) -N,N' -Ethylendiamindisuccinat, bei dem die Kationen aus der Gruppe der primären; sekundären oder tertiären Amine (z. B. Ethanolamin, Diethanoiamin, Triethanolamin, Morpholin, Glucamin, N,N-Dimethylglucamin und N-Methylglucamin) , Lysin, Arginin oder Ornithin ausge- wählt sind oder die Kationen Gemische der zuvor angeführten Kationen sind.
Eine Mischung aus organischen und anorganischen Salzen wird von der Erfindung mitumfaßt.
Als Medikament ist die Substanz (S, S) -N,N' -Ethylendiamin¬ disuccinat bevorzugt, wenn sie eine Zusammensetzung mit pharmakologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen bildet. Derartige Hilfs- und Trägerstoffe sind in Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) beschrieben. Die Zusammensetzungen können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Daε erfindunsgemäße (S, S) -N,N' -Ethylendiamindisuccinat besitzt pharmakologische Eigenschaften und ist deshalb als pharmazeutischer Wirkstoff verwendbar. Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Arzneimittel, das das (S,S) -N,N' -Ethylendiamin¬ disuccinat enthält .
Insbesondere zeigt die erfindungsgemäße Substanz (S,S)-N,N'- Ethylendiamindisuccinat eine Wirkung gegenüber Cytomegalie¬ viren.
Die erfindungsgemäße Substanz zeigt eine antivirale Hemmung (IC50-Wert) bei Konzentrationen von 4 μg/ml. Höhere Kon¬ zentrationen sind anwendbar, ohne das Testsystem zu stören. Somit ist die erfindungsgemäße Substanz in einer Kon¬ zentration von 0,5 bis 100 μg/ml einsetzbar.
Die Versuchsergebnisse dieses in vitro-Tests zeigen, daß die erfindungsgemäße Substanz als Arzneimittel oder zur medizinischen Behandlung verwendet werden kann. Diese Ver¬ suchsergebnisse lassen sich von dem in vitro-Testsystem auf ein in vivo-System problemlos übertragen, da es sich bei dem antiviralen Testsystem um eine etablierte Versuchsanordnung handelt, die zum Nachweis der antiviralen Aktivität dient (Gerna et al . , (1992) , Antiviral. Res. Vol. 19: 333 - 345) . EDDS kann erfindungsgemäß deshalb zur Behandlung bzw. Präven¬ tion von Cytomegalievirus-Infektionen eingesetzt werden, wobei die Substanz auch als Immunsuppressivum wirkt . Sie kann als Inhibitor bei Säugern, insbesondere bei Menschen, zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankung verwendet werden.
Die Erfindung liefert weiterhin
(i) die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz (zur Herstellung eines Medikamentes) als Immun¬ suppressivum und/oder zur Behandlung von Cytomega¬ lieviren bzw. Prävention;
(ii) ein Verfahren zur Behandlung von Cytomegalieviren, welches Verfahren eine Verabreichung einer (S,S) - N,N' -Ethylendiamindisuccinat-Menge umfaßt, wobei die Ethylendiamindisuccinat-Menge einem Patienten gegeben wird, der ein solches Medikament benötigt;
(iii) eine pharmakologische Zusammensetzung zur Be¬ handlung oder Prävention von Cytomegalieviren, die eine erfindungsgemäße Substanz und wenigstens einen pharmazeutischen Hilfs- und/oder Trägerstoff umfaßt.
Für die therapeutische Wirkung sind unterschiedliche Dosen geeignet . Sie hängen beispielsweise von den verwendeten Salzen, vom Wirt, von der Art der Verabreichung und von der Art und der Schwere der zu behandelnden Zustände ab.
Im allgemeinen sind jedoch bei Tieren zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 1 bis 500 mg pro kg. Körpergewicht umfassen. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise dem Menschen, liegt eine em¬ pfohlene tägliche Dosis im Bereich von 1 bis 50 mg pro kg Körpergewicht, am meisten bevorzugt ist eine Dosis von 5 bis 30 mg pro kg Körpergewicht. Zum Beispiel wird diese Dosis¬ zweckmäßigerweise in- Teildosen bis viermal täglich verab¬ reicht. Zufriedenstellende Resultate sind zu erwarten, wenn die erfindungsgemäße Substanz subkutan oder intravenös verabreicht werden. Auch die orale Verabreichung ist möglich.
Beispiele
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, insbesondere die vorteilhaften Wirkungen der Substanz, ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken ist.
Antivirale Aktivität: Verwendete Zellen und Viren
Menschliche Vorhautfibroblasten (human foreskin fibroblasts, HFF) werden in einem Nährmedium aus Eagle's minimal essential medium (EMEM) mit 10%-igem Zusatz von fötalem Kälberserum angezüchtet .
Es wird der CMV-Labor-Stamm AD169 eingesetzt. Die Viren werden in EMEM-Nährmedium mit 4%-igem Zusatz von fötalem Kälberserum vermehrt (Erhaltungsmedium) . Der Virustiter wird durch Bestimmung von sogenannten immediate early antigen forming units (I.E.F.U.) ermittelt, die in dem Erhaltungs¬ medium gebildet werden (Gerna et al. (1992), Antiviral. Res. , Vol. 19: 333 - 345) .
Antivirale Wirkung
Die antivirale Wirkung der Substanzen auf die Vermehrung von Cytomegalieviren wird durch verschiedene Parameter bestimmt:
In einem ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) -Test wird die Produktion an CMV-Late Antigenen ermittelt. Ausgedrückt wird dieses Ergebnis durch den IC50-Wert, der die Kon¬ zentration an Wirkstoff repräsentiert, die die Produktions¬ rate des Antigens um 50% senkt. Die erfindungsgemäßen Sub- stanzen haben einen IC50-Wert von 4 μg/ml ± 1 μg/ml.
Die Zellvitalität wird in einer HFF-Zellkultur unter Ver¬ wendung eines MTT-Assays gemessen. Ausgedrückt wird das Ergebnis durch den TC50-Wert, das ist die Konzentration, bei der 50% der getesteten Zellen noch vital sind. Sie beträgt in HFF-Zellen für die erfindungsgemäßen Substanzen 435 μg/ml.
Aus beiden Werten wird der Quotient TCS0/IC50 gebildet, um den therapeutischen Index festzustellen. Dieser liegt bei den erfindungsgemäßen Substanzen bei 109 (Gerna et al . (1992) Antiviral Res. Vol. 19: 333 - 345) .
Tabelle der Meßwerte:
Figure imgf000012_0001
Höchste geprüfte Stoffkonzentration X für den Patienten erreichbare Dosis nicht ermittelbar
Synthese aller Derivate des N,N' -Diamindisuccinates und Glutamats nach J. A. NEAL und N. J. ROSE (1968), Inorg. Chem. , Vol. 7: 2405 - 2412. Immunsuppressive Wirkung
Für den Proliferationsassay wurden Lymphozytenkulturen in gemischten Lymphozytenkulturen (MLC) angesetzt oder mit 1% Phytohämaglutinin (PHA) in einem Gesamtvolumen von 200 μl Kulturmedium angesetzt. 18 bis 20 Stunden vor der Messung wurden 0,1 μCi Methyl- [3H] -Thymidin (NEN, Deutschland) hinzugefügt. Radioaktiv markierte DNA wurde auf Filter¬ membranen (Schleicher & Schüll, Deutschland) geerntet. Die Radioaktivität wurde mit einem Scintillation-Zähler quantifi¬ ziert (Zinsser, Deutschland) . Die Probe PBL betrifft peri- phere Blutlymphozyten als KontrollStandard.

Claims

A n s p r ü c h e
Verwendung von ( S , S ) -N , N ' - Ethylendiamindi succinat ( EDDS ) der Formel I
Figure imgf000014_0001
wobei M = H4 und/oder irgendein pharmazeutisch annehm¬ bares Kation darstellt, zur Herstellung eines Arznei¬ mittels zur Behandlung von Infektionen gegen Cytomega¬ lieviren mit immunsuppressiven Eigenschaften.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei EDDS eine Inhibition der Phytohaemagglutin stimmulierten Lymphocytenpro- liferation bewirkt.
Verwendung von EDDS nach mindestens einem der Ansprüche 1 und/oder 2, wobei M das Wasserstoffion und/oder ein Kation aus der Gruppe mit den Ordnungszahlen 3-5, 11- 13, 19-29, 37-49 oder 55-81 umfaßt oder Gemische davon umfaßt .
Verwendung von EDDS nach Anspruch 3, wobei die Kationen aus der Gruppe von Magnesium(II)- , Aluminium(III) - , Calcium(II) - , Mangan(II)-, Eisen(II)-, Eisen(III)-, Cobald(II)-, Nickel (II)-, Kupfer(II)-, Zink (II) -Ionen und weiterhin Lithium-, Kalium- und Natrium-Ionen ausgewählt sind oder Mischungen dieser zuvor genannten Ionen sind.
5. Verwendung von EDDS nach mindestens einem der Ansprüche 1 und/oder 2, wobei M organische Kationen umfaßt.
6. Verwendung von EDDS nach Anspruch 5, wobei die Kationen aus der Gruppe der primären, sekundären oder tertiären Amine, Lysin, Arginin oder Ornithin ausgewählt sind oder die Kationen Gemische der zuvor angeführten Kationen sind.
7. Verwendung von EDDS nach einem der vorherigen An¬ sprüche, wobei das EDDS eine Zusammensetzung mit pharmakologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen bildet.
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