WO1997047639A1 - Photocleavable cyclic oligonucleotide - Google Patents

Photocleavable cyclic oligonucleotide Download PDF

Info

Publication number
WO1997047639A1
WO1997047639A1 PCT/JP1997/001959 JP9701959W WO9747639A1 WO 1997047639 A1 WO1997047639 A1 WO 1997047639A1 JP 9701959 W JP9701959 W JP 9701959W WO 9747639 A1 WO9747639 A1 WO 9747639A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
cyclic
group
photocleavable
linear
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1997/001959
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirofumi Shiono
Hirofumi Kodama
Makiko Kojima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Laboratory of Molecular Biophotonics
Original Assignee
Laboratory of Molecular Biophotonics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratory of Molecular Biophotonics filed Critical Laboratory of Molecular Biophotonics
Priority to AU29802/97A priority Critical patent/AU2980297A/en
Priority to EP97924356A priority patent/EP0855403A1/en
Priority to JP10501432A priority patent/JP3100166B2/ja
Priority to US09/011,551 priority patent/US5919917A/en
Publication of WO1997047639A1 publication Critical patent/WO1997047639A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to oligonucleotides cyclized by photocleavable groups.
  • Oligonucleotides are actively used as probes for recognizing and detecting specific sequences in nucleic acid detection, as primers for PCR, which is an important technique in genetic engineering, and in the field of gene therapy in recent years.
  • the above-mentioned antisense oligonucleotide is required to have not only a hybridization ability but also its stability in a living body.
  • some attempts have been made to control genetic information using antisense oligonucleotides (eg, Zamecnick, Stephenson et al., Proc. Natl. Acad. ScI., USA, 75, 280-284). (1978)),
  • the oligonucleotides used for this purpose are usually of natural origin and often have very low resistance to nucleases, and are subject to undesirable degradation reactions in vivo. Becomes Accordingly, various modified oligonucleotides have actually been developed to compensate for these disadvantages.
  • an oligonucleotide having a phosphorothioate bond such as S-oligo (S-01igo) (DeClercq et al., Science 165, 1137-1139 (1969)) which can be easily synthesized by an automatic DNA synthesizer and have relatively high nuclease resistance (Wickstrom et al., J. Biol. Biophys. Meth., 1397-102 (1986) ) )It is known. It is an oligonucleotide having a methylphosphonate bond and is called MP-oligo (MP-01igo) (Miller et al., Biochemistry, 18, 5134-5142 (1979)).
  • MP-oligo MP-01igo
  • the above-mentioned S-oligo is a racemic mixture having many isomers having a chiral center at the phosphate bond, and has a drawback of low affinity for RNA or DNA (Cosstick et al., Biochemistry 24, 1988). 3630-3638 (1985)), and has the disadvantage that it does not have sufficient in vivo stability (that is, resistance to nuclease).
  • MP-oligo is a racemic mixture similar to S-oligo, has the disadvantage of low affinity for RNA or DNA, and has a low solubility in water due to the lack of charge on the phosphate moiety. There are drawbacks.
  • the conventionally known antisense oligonucleotide has the disadvantage that once introduced into a living body, its activity expression (eg, concentration, location, time) cannot be controlled at all.
  • FIG. 1 shows an example of the enzymatic cyclic oligonucleotide according to the present invention, in which a black square represents a photocleavable group, and a base sequence A is a base sequence capable of hybridizing with a target base sequence T. Is shown.
  • FIG. 2 shows that the photocleavable cyclic oligonucleotide (indicated by a small square) according to the present invention shown in FIG. 1 is introduced into a cell and diffused, and then the photocleavable group is irradiated by irradiating the-part of the cell with light. Is cleaved, converted to a linear oligonucleotide, and FIG. 2 is a diagram showing that the cells hybridize and express antisense activity.
  • FIG. 3 shows an example of the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention, in which a black square represents a photocleavable group, a base sequence A represents a base sequence capable of hybridizing with the target base sequence T, Nucleotide sequence B shows a nucleotide sequence capable of interacting with nucleotide sequence S in the evening.
  • FIG. 4 shows that the photocleavable cyclic oligonucleotide (indicated by a small square) according to the present invention shown in Fig. 3 is introduced into cells, diffuses, and then interacts with the target nucleic acid to form a complex.
  • FIG. 3 is a diagram showing that when a part of a cell is irradiated with light, the photocleavable group is cleaved, converted into a linear oligonucleotide, and hybridized with the evening DNA to express antisense activity. .
  • Figure 5 shows that two types of oligonucleotides are linked by a phosphate group by a nitrobenzyl-type photocleavable group, and that the bond is converted into a phosphate group and a nitrosophenyl derivative by light irradiation.
  • Figure 6 shows that two kinds of oligonucleotides are linked by a phosphate group by a nitrobenzyl-type photocleavable group, and the bond is converted into a phosphate group and a two-port sophenyl derivative by light irradiation.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of the synthesis of a phosphoramidite reagent according to the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing a synthesis example of another phosphoramidite reagent according to the present invention.
  • FIG. 9 shows an example of a method for preparing the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present study, in which a 5'-terminal phosphorylation of a photocleavable ⁇ -introduced oligonucleotide is converted to a template oligonucleotide to which biotin is bound.
  • FIG. 3 is a view showing that the DNA is hybridized with a nucleotide and circularized by a DNA ligase reaction.
  • FIG. 10 is a diagram showing a nuclease resistance test for linear or linear oligonucleotides according to the present invention.
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of polyacrylamide gel electrophoresis of the photocleavage reaction of the cyclic or linear oligonucleotide according to the present invention.
  • FIG. 12 is a photograph showing the results of polyacrylamide gel electrophoresis of the photocleavage reaction of the cyclic or linear oligonucleotide according to the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of HPLC analysis of the linear oligonucleotide (2) before light irradiation.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of HPLC analysis of the linear oligonucleotide (2) after light irradiation.
  • FIG. 15 is a diagram showing photocleavage of the linear oligonucleotide (2) by light irradiation.
  • FIG. 16 is a diagram showing photocleavage of the linear oligonucleotide (8) by light irradiation.
  • FIG. 17 shows the results of HPLC showing the complex formed by the interaction between the cyclic oligonucleotide according to the present invention and the target nucleic acid.
  • FIG. 18 shows the results of HPLC indicating a hybridized product formed by the interaction between the linear oligonucleotide according to the present invention and the target nucleic acid. Disclosure of the invention
  • the present inventors have been made in view of the above-mentioned drawbacks of the conventional modified antisense oligonucleotide, and have solved these drawbacks, have sufficiently high affinity for RNA or DNA, and have sufficient in vivo.
  • the present inventors have found an antisense oligonucleotide having a novel structure having both nuclease resistance and completed the present invention.
  • the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention is an oligonucleotide that hybridizes to a target DNA or RNA, and further has a structure that is circularized by a photocleavable group.
  • the photocleavable group is a group having a group conventionally known as a photocaged reagent. Specific bonds are broken by specific light irradiation.
  • the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention after being introduced into a living body, takes a sufficient time to a predetermined position in the living body without undergoing a nuclease degradation reaction due to its cyclic structure. It becomes possible to spread. Further, after a predetermined time, by irradiating appropriate light, the photocleavable group is photolyzed, a specific bond is cleaved, and the oligonucleotide having a cyclic structure becomes a linear oligonucleotide. It is capable of hybridizing with RNA or DNA.
  • a complex is formed by interacting with a part of the base sequence of the target DNA or RNA.
  • it can effectively exert its activity as an antisense oligonucleotide.
  • the present invention provides a cyclic oligonucleotide linked by at least one photocleavable group in the molecule.
  • the present invention also provides the above-described cyclic oligonucleotide, wherein the photocleavable group has a structure represented by the following formula.
  • the present invention provides the above-described cyclic oligonucleotide, wherein the photocleavable group has a structure represented by the following formula.
  • the present invention provides the above-described cyclic oligonucleotide, wherein the cyclic oligonucleotide is composed of 10 to 200 bases. Further, the present invention provides the above-described cyclic oligonucleotide, wherein the cyclic oligonucleotide comprises 30 to 100 bases. Furthermore, the present invention is characterized in that the cyclic oligonucleotide has a first base sequence capable of hybridizing with at least a part of the base sequence of the evening nucleic acid by cleavage of the photocleavable group. And a cyclic oligonucleotide as described above.
  • the present invention provides a method according to the present invention, wherein the cyclic oligonucleotide is capable of hybridizing with at least a part of a base sequence of a base nucleic acid of the target nucleic acid by cleavage of the photocleavable group;
  • the cyclic oligonucleotide has the second nucleotide sequence forming a complex with the target nucleic acid, and provides the above-mentioned ⁇ -shaped oligonucleotide.
  • the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention is an oligonucleotide having a circularized structure with at least one photocleavable group. Furthermore, the base sequence of the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention has a part of a base sequence capable of hybridizing complementarily to a nucleic acid (DNA, RNA, etc.) which is a target at night. Further, the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention has a base sequence capable of forming a complex with a target nucleic acid as a part thereof.
  • One of preferred examples of the photocleavable ⁇ -oligonucleotide according to the present invention has a structure as schematically shown in FIG. 1, and is a specific cyclized with a photocleavable group.
  • the oligonucleotide has a base sequence (a base sequence that becomes linear after photocleavage and can be hybridized to the target nucleic acid as an antisense oligonucleotide, and is represented by base sequence A in FIG. 1).
  • base sequence A in FIG. 1 base sequence that becomes linear after photocleavage and can be hybridized to the target nucleic acid as an antisense oligonucleotide
  • base sequence A base sequence A in FIG. 1
  • FIG. 2 when such a photocleavable cyclic oligonucleotide was introduced into the portion where the nucleic acid was present in the evening, its cyclic structure made it resistant to various nucleases.
  • the photocleavable group of the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention is cleaved to form a linear oligonucleotide.
  • a linear oligonucleotide is capable of hybridizing to a specific base sequence of a nearby target nucleic acid, and can exert the action of an antisense oligonucleotide.
  • the linear oligonucleotide that does not hybridize with the target nucleic acid is rapidly hydrolyzed by a nuclease present in the vicinity.
  • FIG. 3 Another example of the preferred structure of the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention further includes, as schematically shown in FIG. 3, a specific base sequence circularized with a photocleavable group (after photocleavage).
  • an oligonucleotide having a base sequence capable of interacting with the nucleic acid in a circular state indicated as base sequence B in FIG. 3
  • such a photocleavable cyclic oligonucleotide has resistance to various nucleases due to its circular structure when introduced into the portion where the target nucleic acid is present. However, it diffuses sufficiently to the vicinity of the target nucleic acid without undergoing hydrolysis, and further interacts with a part of the nucleic acid (shown as base sequence S in FIG. 3) to form a complex. It becomes possible to do it.
  • the photocleavable group of the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention is cleaved to obtain a linear oligonucleotide.
  • Such a linear oligonucleotide can effectively hybridize to a specific base sequence of an overnight get nucleic acid that is extremely close to form the complex, and the effect of the antisense oligonucleotide can be effectively prevented. It can be effectively demonstrated.
  • the type and the number of bases of the base sequence B capable of interacting with each other are not particularly limited, but preferably have a longer base number than the base sequence A.
  • the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention has a group which is photocleavable by light irradiation in the molecule. Such a photocleavable group undergoes photocleavage upon irradiation with light, and as a result, the cyclic structure becomes linear and the activity as an antisense oligonucleotide appears (see FIGS. 1 and 3).
  • such a photocleavable group binds the 5 'and 3' ends of a single linear oligonucleotide containing a base sequence to act as an antisense oligonucleotide to form a cyclic structure, At least one of the bonds is cleaved by light irradiation. Therefore, in the present invention, the structure usable for that purpose is not particularly limited, and may be any functional group having the above properties.
  • a functional group conventionally known as a photocaged reagent is one of those which can be preferably used. Kind. In the present invention, it is preferable that the functional group forms a phosphate bond.
  • the photocleavable group having the functional group has a functional group that can be incorporated into a molecule by an ordinary oligonucleotide automatic synthesizer (for example, based on the amidite method).
  • an ordinary oligonucleotide automatic synthesizer for example, based on the amidite method.
  • a nitrobenzyl type having the following structure is preferably used.
  • this structure has a structure in which one of the phosphate esters is selectively cleaved by irradiation with an appropriate light to form a phosphate moiety and a moiety having a nitrosophenyl derivative. It is known to separate.
  • a phosphoamidite reagent having the following structure is used. Can be used.
  • test jewels can be prepared, for example, by the synthesis method shown in FIGS. 3-chloro-N, N-diisopropylamino- (2-cyanoethoxy) ph osphine (la) and 3-chloro-N, N-diisopropylamino- (2-cyanoethoxy) ph osphine , 1-0-Dimethoxytrityl-2- (o-nitrophenyl)-1,2-Ethanediol (0-dimethoxytrity 2- (0-nitrophenyl) -l, 2- ethanediol) (lb) The phosphoramidite reagent [1- (o-ditrophenyl) -12-dimethoxytrityloxy] ethoxy N, N-diisopropylamino-2-cyanoethoxyphosphine ([o-nitrophenyl) -2-dimethoxytrityloxy] e thoxy
  • the resulting phosphoramidite reagent can be used as it is as a reagent for an automatic synthesizer by the amidite method.
  • the base sequence of the cyclic oligonucleotide according to the present invention is not limited. I However, the molecule is photocleaved at the portion of the photocleavable group introduced into the cyclic oligonucleotide to give a linear oligonucleotide, but the base sequence after the cleavage is:
  • the nucleotide sequence can be arbitrarily selected so as to hybridize to the target RNA or DNA (the target nucleic acid) and to act as an antisense oligonucleotide.
  • a base sequence capable of forming a complex by interacting with the target nucleic acid while maintaining the cyclic structure is a base sequence complementary to a part of the base sequence in the evening get, and may be any number of bases capable of interacting (for example, hybridization).
  • the type and number of such bases can be selected as appropriate, but are preferably those having 10 to 200 bases, more preferably 30 to 100 bases.
  • the oligonucleotide portion containing 15 to 30 bases which is generally used as an antisense nucleic acid, and, if necessary, a base portion capable of interacting with the get nucleic acid, if necessary. It becomes possible to synthesize a cyclic photocleavable oligonucleotide having the same.
  • ligase binding is preferably used. Is done. This can be achieved by phosphorylating the 5 'terminus and performing a normal ligase reaction using an appropriate template. At this time, the preparation of an oligonucleotide as a template for the ligase reaction can also be easily obtained by using an ordinary automatic synthesizer or the like.
  • the ligase reaction is not particularly limited, but, for example, the use of a template oligonucleotide linked to biotin facilitates post-treatment. FIG.
  • FIG. 9 shows an example of the preparation of the cyclic oligonucleotide according to the present invention.
  • other methods for synthesizing short cyclic oligonucleotides include, for example, preparing an oligonucleotide phosphorylated at the terminal 5 and a template, forming a heavy chain, and cyclizing it with BrCN-imidazole. (Prakash, G and Kool, ET, J. Chem. Soc., Chem. Commun., (1991) 1161-1163).
  • the photocleavage reaction of the cyclic oligonucleotide having a photocleavable group according to the present invention is not particularly limited.
  • conditions such as the wavelength and intensity of irradiation light are well known, and those conditions can be used as they are.
  • the irradiation light may be applied to the entire sample or to a part of the sample. When light irradiation is performed at a specific position in a part of the sample, as shown in FIG. 2 or 4, antisense activity is exhibited only at a specific position.
  • the organic solvent layer was washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 6.7 g of a red oil.
  • the obtained crude product was purified by silica gel column chromatography (0.5 mL triethylamine-containing form eluent), and 6.0 g of the target product, 11-dimethylethoxytrityl 12- (o-nitrophenyl) -11 , 2-Ethanediol -0-dimethoxytriity1-2- (onitropheny1) -1,2-ethanediol) (lb) was obtained.
  • Model 394 (Applied Biosystems, Model 394), (2) was synthesized using the reagent (1) synthesized above (the group described as X), and (8) was synthesized above. Using the reagent () (the group described as Y in the formula), it was synthesized by the usual amidite method.
  • phosphate was added to the 5 'end by the amidite method using an automatic DNA synthesizer, and for (4), Furthermore, biotin was added to the 5 'end by an amidite method using an automatic DNA synthesizer.
  • oligonucleotide was subjected to post-treatments such as deprotection by ammonia treatment (30% NH 4 OH, 1 hour at room temperature, 8 hours at 55 ° C.), and further crudely purified by Oligo-PakSP (Millipore). After ((4) only) After desalting with NAP-25 column manufactured by Pharmacia, the mixture was concentrated by centrifugation.
  • Each oligonucleotide was purified by ion exchange or by HPLC using reversed phase HPLC (LC-10A, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the 70-mer oligonucleotide 5′-pCGCAAGCTTCGCCCG CACCGATCGC-X-GCCAAGCGCGCAATTAACCCCCTTCCCAACAGTTGCTCAAACCGC-3 ′ containing the photocleavable group X was synthesized and purified by the same method using a DNA automatic synthesizer. Preparation of circular oligonucleotide.
  • the linear oligonucleotide (2), (3), or (8) obtained above was used as 10 ⁇ 1 (100 pmol / z 1), and (4) was used as 10 ⁇ 1 (100 pmol / z) as a template for cyclization.
  • l ultrapure water 89 30 1
  • T4 DNA ligase buffer (Takara Shuzo) lml mix, and leave at 27 ° C for 30 minutes, then leave at 16 ° C for several minutes.
  • DNA Ligase 50 ⁇ l (Takara Shuzo, 350Uni t / 1) was added and left as it was for 4 hours.
  • a nuclease resistance test was performed using a linear oligonucleotide (2) purified by HPLC, which does not contain a photocleavable group, and a cyclic oligonucleotide (2 '). Linear, Circular for circular oligonucleotide).
  • the nucleases used were: 1 Exomicleasel ll, Ex Four types of onuc lease V, Exonuc lease VII, incoming Exonuc lease, and (2) three types of endonucleases: SI Nuclease, Mung Bean Nuclease, and BAL 31 Nuclease.
  • an oligonucleotide (Linear, Circular) was added to a 15 ⁇ 1 exonuclease reaction solution (Exonuc 1 ease III, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgC12, 10 mM 2-mercaptoethanol; Exonuc lease V, 66.7 mM glycine-NaOH (pH 9.4), 30 mM MgC12, 8.3 mM 2-mercaptoethanol, 0.5 mM ATP; Exonuc lease VII, 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM potassium phosphate (pH 7.6), 8.3 mM EDTA, lOmM 2-mercaptoethanol; ⁇ Exonuc lease, 67 mM glycine-K0H (pH9.4), 2.5 mM MgC12, 0.05 BSA), add about 15 pmol each, and enzymes (ExonucleaseIII, 90U; Exonu
  • an oligonucleotide (linear; linear, circular; circular) was mixed with a 150 ⁇ 1 end nuclease reaction solution (SI Nuclease, 30 m sodium acetate (pH 4.6), 280 mM NaCl, ImM ZnSO ,; Mung Bean Nuclease, Add about 150 pmol each to 30 mM sodium acetate (pH 5.0), 100 mM Na CI, 5, glycerol; BAL 31 Nuclease, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 600 mM NaCl, 12 mM MgCh, ImM EDTA, and add enzyme (SI Nuclease, 0.5 U; Mung Bean Nuclease, 1 U; BAL 31 Nuclease, 0.2 U) was added.
  • SI Nuclease 30 m sodium acetate (pH 4.6), 280 mM NaCl, ImM ZnSO ,
  • reaction solution was incubated at 37 ° C (S1, Mung Bean) or 30 ° C (BAL31) to react. At 0, 2, and 5 minutes after the start of the reaction, 50 1 aliquots of the reaction solution were taken, transferred to a new tube containing 0.5 M EDTA, and the enzyme reaction was completely stopped.
  • the cyclic oligonucleotide (2 ′) is cleaved at the photocleaved portion when exposed to light, and a single linear 4 Omer oligonucleotide is generated.
  • the two-terminal sophenyl group is bound to the 5 'end of the oligonucleotide.
  • (2), (2 was dissolved in TE buffer at a concentration of 50 pmol / 10 1 and irradiated with a xenon lamp (USHIO, 300W, no filter, room temperature) for 30 minutes, then analyzed with 20% PAGE did.
  • the cyclic oligonucleotide (8 ') is cleaved at the photocleaved portion when exposed to light, and a single linear 40-mer oligonucleotide is formed.
  • a ditrosophenyl group is bound to the 5 'end of the oligonucleotide.
  • (8), (8,) were dissolved in TE buffer at a concentration of 50 pmol / 10 1 and irradiated with a xenon lamp (USHI 0, 300 W, no filter, room temperature) for 30 minutes, and analyzed by 20-PAGE .
  • One of the oligonucleotides synthesized in the present invention is: Sequence length: 41, Sequence type: Nucleic acid, Number of chains: Single strand, Topology: Linear, Sequence type: DNA, Sequence : PCGCAAGCTTC XGCCAAGCGC GCAATTAACC CCTCAAACCG C (where pC indicates cytosine phosphorylated at the 5 ′ end, and X indicates an unspecified nucleotide).
  • Sequence length 40, Sequence type: nucleic acid , Number of strands: Single strand, Topology: Linear, Sequence type: DNA, Sequence: pCGCAAGCTTC GCCAAGCGCG CAATTAACCC CT CAAACCGC, and Length of sequence: 40, Type of sequence: Nucleic acid, Number of chains: Single-stranded, Topology: Cyclic, Sequence type: DNA, Sequence: CGCAAGCTTC GCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC having a cyclic structure, Sequence length: 20, Sequence type: Nucleic acid, Chain type Number: single strand, topology: linear, sequence Type: DNA, Sequence: BiotinGAAGCTTGCG GCGGTTTGAG (BiotinG indicates biotinylated guanine), Sequence length: 30, Sequence type: Nucleic acid, Number of chains: Single strand, Topology: Linear, Sequence Type: DNA, Sequence: pGCCAAGCGCG CAATTAACCC C
  • sequence length 71
  • sequence type nucleic acid
  • number of strands single strand
  • topology ⁇ 3 ⁇ 4 chain
  • sequence type DNA
  • sequence characteristics location: 1
  • E Other information: Phosphorylation at the 5 'end Sequence: CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATC GCXGCCA AGCGCGCAAT TAACCCCCTT CCCAACAGTT GCTCAAACCG C (where X indicates an unspecified nucleotide).
  • sequence length 71
  • sequence type nucleic acid
  • number of strands single strand
  • topology cyclic
  • sequence type DNA
  • sequence characteristics sequence: CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATCGCXGCCA AGCGCGCAAT TAACCCCCTT CCCAACAGTT GCTCAA ACCG C (Where X indicates an unspecified nucleotide).
  • the evening gate (100 ⁇ M) was mixed with 36 ⁇ 1, and the cyclic oligonucleotide (100 ⁇ M) was combined with 36 ⁇ 1, 10xBuffer (0.1M NaCl, 10mM phosphate buffer, pH7.0) 12 ⁇ L, formamide 30 ⁇ 1, ultrapure water 36 ⁇ 1 (total 150 ⁇ 1), and annealed under the following conditions (95 ° C for 5 minutes, then 50 ° C for 20 minutes) After room temperature).
  • 10xBuffer 0.1M NaCl, 10mM phosphate buffer, pH7.0
  • the change in absorbance at 260 nm of the resulting solution was measured against a change in temperature (at 30 ° C / hour, the temperature was raised from 3 CTC to 85 ° C).
  • the inflection point of the temperature-absorbance change curve was defined as the melting point in accordance with the method of measuring the melting point of nucleic acid (the temperature at which a double strand changes to a single strand under certain conditions) which is usually used.
  • the obtained melting point was 61 ° C for the cyclic oligonucleotide and 67 ° C for the single-stranded oligonucleotide for comparison.
  • the product of the stable complex based on the interaction between the 4-oligocyclic oligonucleotide and the single-stranded oligonucleotide was separated and confirmed by anion exchange HPLC.
  • Buffer A A 20mM Tris-HCU pH9.0
  • Buffer B 1.0 M NaCl in Buffer A
  • FIG. 17 clearly shows the presence of a peak (30 minutes) due to the complex of the target and the cyclic oligonucleotide at a different position from the target only (24.5 minutes) and the cyclic oligonucleotide only (24.3 minutes).
  • FIG. 18 shows that at the position different from that of the target only (24.5 minutes) and the single-stranded oligonucleotide alone (24.1 minutes), a peak (25.3 minutes) due to the hybrid of the target and the cyclic oligonucleotide was found. It is shown.
  • the difference in retention time is based on the structure in the solution of the target and the cyclic oligonucleotide, and the ionicity is based on the structure of the hybrid form (complete duplex formation) between the target and the cyclic oligonucleotide. It suggests that it is different from ionicity.
  • the photocleavable cyclic oligonucleotide according to the present invention is Due to the cyclic structure of the above, it is less likely to undergo a nuclease degradation reaction in the living body, and can be diffused to a predetermined position in the living body in a sufficient time. Further, after a predetermined time, by irradiation with an appropriate light, the photocleavable group is photocleaved, and a specific bond is cleaved. As a result, the oligonucleotide having a circular structure becomes a linear oligonucleotide, which can be hybridized with the target DNA or MA.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • X is a group that bonds to 1- or 2- (o-nitrophenyl group) ethanediol and a phosphate ester.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • X is a group that bonds to 1- or 2- (0-nitrophenyl) ethanediol and a phosphate ester.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

明細書 光開裂性環状ォリゴヌクレオチド 技術分野
本発明は、 光開裂性基により環状化されたォリゴヌクレオチドに関する。 背景技術
オリゴヌクレオチドは、 核酸の検出において特異的配列を認識し検出するため のプローブとして、 また遺伝子工学の重要な手法である P C R法のためのプライ マーとして、 更には近年の遺伝子治療の分野で活発に研究開発されているアンチ センス法におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、 生物および医療の分 野で非常に重要で有用な物質であることが知られている。
上記のォリゴヌクレオチドがそれぞれの機能を ¾揮するためには、 いずれもォ リゴヌクレオチドの有する塩基配列部の相補配列へのいわゆるハイブリダィゼー シヨン能力を必要としている。
さらに、 上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、 ハイブリダィゼ —シヨン能力のみならず、 その生体内での安定性も要求される。 例えばアンチセ ンスオリゴヌクレオチドを用いた遺伝情報の制御についての試みがいくつかなさ れてきているが （例えば、 Zamecnick, Stephenson等、 Proc . Natl . Acad. Sc i . , US A， 75 , 280-284( 1978) )、 この目的で使用されるオリゴヌクレオチドは通常天然 由来のもので、 ヌクレア一ゼに対しては極めて低い耐性しかもたないものが多く、 生体内で望ましくない分解反応を受けることが問題となる。 従って、 実際これら の欠点を補うような種々の修飾オリゴヌクレオチドが開発されている。
例えば、 ホスホロチォェ一ト（phosphorothioate )結合を有するオリゴヌクレオ チドであり、 S -オリゴ (S-01igo) (DeClercq等、 Science 165 , 1137-1139( 1969) ) と呼ばれているものであって、 DNA自動合成機で容易に合成され得るものであり、 比較 的ヌクレアーゼ耐性がある (Wickstrom等、 J.Biol . Biophys.Meth. , 13 97-1 02( 1986 ) )ことが知られている。 また、 メチルホスホネート（methylphosphonate) 結合を有 するオリゴヌクレオチドであり、 M P -オリゴ（MP- 01igo)(Mi l ler等、 B iochemistry, 18, 5134- 5142( 1979) )と呼ばれているものであって、 天然型の DM のリン酸結合の酸素のうちの 1つをメチル基に置き換えることにより、 ヌクレア —ゼ耐性を有すると共に、 リン酸部の電荷が無くなり膜透過性が比較的良くなる ものである。
しかし、 上記 S-オリゴは、 リン酸結合部にキラル中心を持つ多くの異性体をも つラセミ混合物であり、 RNAまたは DNAとの親和性が低いという欠点があり（Cosst ick等、 Biochemistry 24， 3630-3638( 1985 ) ), さらに十分な生体内での安定性 (すな わち、 対ヌクレア一ゼ耐性） も有していないという欠点がある。
また、 MP-オリゴも、 S-オリゴ同様のラセミ混合物であり、 RNAまたは DNAとの 親和性が低いという欠点があり、 さらにリン酸部の電荷が無いことから水への溶 解性が低いという欠点がある。
さらには、 従来知られているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 一度生体内 に導入された後は、 全くその活性発現 （例えば濃度、 及び場所、 時間） に関して は制御不可能であるという欠点がある。 図面の簡単な説明
図 1は本発明に係る光閧裂性環状ォリゴヌクレオチドの 1例を示すものであり、 黒四角は、 光開裂基を、 塩基配列 Aは、 ターゲットの塩基配列 Tとハイブリダィ ズ可能な塩基配列を示す。
図 2は図 1に示す本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチド （小さな〇で 示す） が、 細胞内に導入され、 拡散した後、 細胞の -部を光照射されることで光 開裂性基が開裂し、 直鎖状オリゴヌクレオチドに変換され、 ターゲッ ト D N Aと ハイプリダイズしてアンチセンス活性を発現することを示す図である。
図 3は本発明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドの 1例を示すものであり、 黒四角は、 光開裂基を、 塩基配列 Aはターゲッ トの塩基配列 Tとハイブリダィズ 可能な塩基配列を、 塩基配列 Bは夕一ゲッ トの塩基配列 Sと相互作用可能な塩基 配列を示す。
図 4は図 3に示す本究明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチド （小さな〇で 示す） が、 細胞内に導入され、 拡散した後、 ターゲット核酸と相互作用して、 複 合体を形成し、 さらに細胞の一部を光照射されることで光閧裂性基が開裂し、 直 鎖状オリゴヌクレオチドに変換され、 夕ーゲヅ 卜 D N Aとハイブリダィズしてァ ンチセンス活性を発現することを示す図である。
図 5はニトロベンジル型光閧裂性基により、 2種類のォリゴヌクレオチドがリ ン酸エステル基で結合されており、 その結合が、 光照射によりリン酸基と、 ニト ロソフヱニル誘導体になることを示す図である。
図 6はニトロベンジル型光閧裂性基により、 2種類のォリゴヌクレオチドがリ ン酸エステル基で結合されており、 その結合が、 光照射によりリン酸基と、 二卜 口ソフエニル誘導体になることを示す図である。
図 7は本 ¾明に係る、 ホスホアミダイ ト試薬の合成例を示す図である。
図 8は本発明に係る、 他のホスホアミダイ ト試薬の合成例を示す図である。
9は本究明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドの調製法の一例を示すも のであり、 光開裂性 ¾を導入したオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端をリン酸化した ものを、 ピオチンが結合したテンプレートオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ させ、 D N Aリガーゼ反応により環状化することを示す図である。
図 1 0は本発明に係る璟状または直鎖状ォリゴヌクレオチドについてのヌクレ ァーゼ耐性試験を示す図である。
図 1 1は本 ¾明に係る環状または直鎖状オリゴヌクレオチドについての光開裂 反応のポリアクリルアミ ドゲル電気泳動の結果を示す写真であり、 レーン 1 ：直 鎖状 40mer( 2 )、 2 ：直鎖状 40mer( 2 )を光照射したもの、 3 ：合成 30mer( 5 )、 4 ： 環状 40mer( 2，）、 5 ：環状 40mer(2' )を光照射したもの、 6 ：合成 40mer(6 )を示す。 図 1 2は本発明に係る環状または直鎖状ォリゴヌクレオチドについての光開裂 反応のポリアクリルアミ ドゲル電気泳動の結果を示す写真であり、 レーン 1 ：直 鎖状 40mer( 8)、 2 ：直鎖状 40mer(8 )を光照射したもの、 3 ：合成 30mer( 5 )、 4 ： 環状 40mer(8，）、 5 ：環状 40mer(8' )を光照射したもの、 6 ：合成 40mer(6 )を示す。 図 1 3は直鎖状ォリゴヌクレオチド（2 )の光照射前の H P L C分析 結果を示す 図である。
図 1 4は直鎖状ォリゴヌクレオチド（2 )の光照射後の H P L C分析 結果を示す 図である。
図 1 5は直鎖状ォリゴヌクレオチド（2 )の光照射による光閲裂を示す図である。 図 1 6は直鎖状オリゴヌクレオチド（8)の光照射による光開裂を示す図である。 図 1 7は本発明に係る環状オリゴヌクレオチドと夕ーゲッ ト核酸の相互作用に より形成される複合休を示す H P L Cの結果である。
図 1 8は本発明に係る直鎖状ォリゴヌクレオチドと夕ーゲッ ト核酸の相互作用 により形成されるハイブリダィズ体を示す H P L Cの結果である。 発明の開示
本発明者は、 上記説明した従来の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの有す る欠点に鑑みなされたもので、 これら欠点を解消し、 RNAまたは DNAとの親和性が 十分高く、 しかも生体内で十分なヌクレア一ゼ耐性を兼備する新規構造を冇する アンチセンスオリゴヌクレオチドを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、 ターゲットたる DNAまたは RNAに対してハイプリダイズするオリゴヌクレオチドであって、 さらに、 光閧裂性基により環状化されている構造を有するものである。 ここで上記光閧裂 性基とは、 従来より光ケィジド試薬として知られている基を有するものであり、 特定の光照射により、 特定の結合が切断されるものである。
従って、 本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、 生体内に導入され た後、 その環状構造のため、 ヌクレア一ゼ分解反応を受けることなく、 生体内の 所定の位置へ十分な時間をかけて拡散することが可能となるものである。 さらに、 所定の時間後に、 適当な光を照射することにより、 上記光開裂性基が光分解し、 特定の結合が切断され、 環状構造であったォリゴヌクレオチドが直鎖状ォリゴヌ クレオチドとなり、 ターゲットたる RNAまたは DNAとハイブリダイズ可能となるも のである。
さらには、 ターゲット D N Aまたは R N Aの存在する領域に拡散した後、 夕一 ゲット D N A、 または R N Aの一部の塩基配列と相互作用することにより複合体 を形成し、 光照射により光分解して直鎖状となりアンチセンスオリゴヌクレオチ ドとしての活性を効果的に発揮し得るものである。
より詳しくは、 本発明は、 分子中に少なくとも 1つの光開裂性基で結合された 環状オリゴヌクレオチドを提供するものである。
また、 本発明は、 前記光開裂性基が、 次式に示す構造を有することを特徴とす る前記記載の環状オリゴヌクレオチドを提供するものである。
,〔5' -オリゴヌクレオチド -3' ] ド- 3·」！
Figure imgf000007_0001
さらに、 本発明は、 前記光開裂性基が、 次式に示す構造を有することを特徴と する前記記載の環状オリゴヌクレオチドを提供するものである。
|〔3' -ォリゴヌクレォチ ド - 5'〕,
Figure imgf000008_0001
また、 本発明は、 前記環状オリゴヌクレオチドが 1 0 ~ 2 0 0個の塩基からな ることを特徴とする前記記載の環状オリゴヌクレオチドを提供するものである。 また、 本発明は、 前記環状オリゴヌクレオチドが 3 0〜 1 0 0個の塩基からな ることを特徴とする前記記載の環状ォリゴヌクレオチドを提供するものである。 さらに、 本発明は、 前記環状オリゴヌクレオチドが、 前記光開裂性基の開裂に より、 夕ーゲッ ト核酸の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列とハイブリダィズ 可能な第 1の塩基配列を有することを特徴とする前記記載の環状ォリゴヌクレオ チドを提供するものである。
また、 本発明は、 前記環状オリゴヌクレオチドが、 前記光開裂性基の開裂によ り夕一ゲッ ト核酸の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列とハイブリダイズ可能 な第 1の塩基配列と、 前記環状オリゴヌクレオチドが、 ターゲット核酸と複合体 を形成する第 2の塩基配列を有することを特徴とする前記記黻の璟状ォリゴヌク レオチドを提供するものである。 究明を実施するための最良の形態
本発明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドは、 少なくとも 1つの光開裂性 基により環状化構造を有するオリゴヌクレオチドである。 さらに、 本発明に係る 光開裂性環状オリゴヌクレオチドの塩基配列は、 夕一ゲヅ トたる核酸 （D N A、 R N A等） に相補的にハイプリダイズ可能な塩基配列をその一部に有するもので ある。 さらに、 本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、 ターゲッ トた る核酸と複合体を形成可能な塩基配列をその一部に有するものである。
本発明に係る光開裂性璟状ォリゴヌクレオチドの好ましい例の 1つとしては、 図 1に模式的に示されるような構造を有するものであり、 光開裂性基で環状化さ れた特定の塩基配列 （光開裂後に直鎖状となり、 ターゲッ ト核酸へアンチセンス オリゴヌクレオチドとしてハイプリダイズ可能な塩基配列、 図 1では塩基配列 A で表されている） を有するオリゴヌクレオチドである。 図 2に示されるように、 係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドが夕一ゲッ卜核酸の存在する部分へ導入さ れた際、 その環状構造のために種々のヌクレア一ゼに対して耐性を有し、 加水分 解を受けることなく十分夕ーゲッ ト核酸の近傍へ拡散することが可能となる。 さ らに、 望ましい位置及び時間に、 また望ましい強度の光を照射することにより本 究明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドの光開裂性基が開裂し、 直鎖状のォ リゴヌクレオチドとなる。 係る直鎖状オリゴヌクレオチドは、 近傍に存在する夕 —ゲッ ト核酸の特定の塩基配列にハイブリダィズすることが可能となり、 アンチ センスオリゴヌクレオチドの作用を発揮し得るものである。 この際、 ターゲッ ト 核酸とハイブリダィズしない該直鎖状ォリゴヌクレオチドは速やかに近傍に存在 するヌクレアーゼにより加水分解される。
本発明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドの好ましい構造の他の例はさら に、 図 3に模式的に示されるように、 光開裂性基で環状化された特定の塩基配列 (光開裂後に直鎖状となり夕一ゲヅ ト核酸へアンチセンスオリゴヌクレオチドと してハイブリダィズ可能な塩基配列、 図 3においては塩基配列 Aと表されている） と、 環状状態で夕一ゲッ 卜核酸と相互作用可能な塩基配列 （図 3では塩基配列 B と表されている） を有するオリゴヌクレオチドである。 図 4に示されるように、 係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、 夕一ゲッ ト核酸の存在する部分へ導入 された際、 その環状構造のために種々のヌクレア一ゼに対して耐性を有し、 加水 分解を受けることなく十分夕ーゲッ ト核酸の近傍へ拡散し、 さらに夕一ゲッ 卜核 酸の一部 （図 3では塩基配列 Sと表されている） へ相互作用して複合体を形成す ることが可能となる。 この場合、 望ましい位置及び時間に、 また望ましい強度の 光を照射することにより本発明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドの光閧裂 性基が開裂し、 直鎖状のオリゴヌクレオチドとなる。 係る直鎖状オリゴヌクレオ チドは、 前記複合体形成のため極めて近傍に存在する夕一ゲット核酸の特定の塩 基配列に効果的にハイブリダィズすることが可能となり、 アンチセンスオリゴヌ クレオチドの作用を効果的に発揮し得るものである。 上記相互作用可能な塩基配 列 Bの種類及び塩基数は特に制限はないが、 塩基配列 Aよりも長い塩基数を有す ることがより好ましい。
以下本発明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドの構造上の特徴を説明する (光開裂性甚）
本発明に係る光開裂性環状ォリゴヌクレオチドは、 その分子内に光照射により 光開裂する基を有するものである。 係る光開裂性基は光照射により光開裂し、 そ の結果環状構造が直鎖状となりアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての活性が 現われるものである （図 1、 3参照） 。
従って、 係る光閧裂性基は、 アンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する べき塩基配列を含む 1本の直鎖状オリゴヌクレオチドの 5， 及び 3 ' 末端を結合 し、 環状構造を形成するものであり、 該結合の少なくとも 1つが、 光照射により 開裂するものである。 従って、 本発明において、 その目的に使用可能な構造は特 に限定されることなく、 上記性質を有する官能基であればよい。 例えば、 従来よ り、 光ケイジド試薬として知られている官能基は好ましく使用可能なものの 1種 類である。 本発明においては、 さらに、 当該官能基がリン酸エステル結合を形成 するものが好ましい。
さらには、 該官能基を有する光開裂性基が、 通常のオリゴヌクレオチド自動合 成機 （例えばアミダイ ト法に基づく） により分子内に取り込まれるための官能基 を有することが必要である。 上記の 2つの機能を有する光開裂性基としては、 例 えば、 以下のような構造を有するニトロべンジル型のものが好適に使用される。 図 5、 及び図 6に示されるように、 この構造は、 適当な光の照射を受けて選択 的にリン酸エステルの 1つが切断され、 リン酸部分と、 ニトロソフエ二ル誘導体 を有する部分とに分れることが知られている。
従って、 図 5、 6に示されるニトロべンジル型の光閧裂性基を、 アミダイ ト法 を用いてオリゴヌクレオチドの任意の位置に導入するためには、 例えば以下の構 造を有するホスホアミダイ ト試薬が使用可能である。
この試桀はそれぞれ、 例えば、 図 7、 8に示される合成方法で調製することが 可能である。 すなわち、 3—クロ口一 N , N—ジイソプロビルァミノ一 （2—シ ァノェ卜キシ) ホスフィ ( 3-chloro-N,N-di isopropylamino-( 2-cyanoethoxy)ph osphine )( la)及び、 1—0—ジメ トキシトリチル—2— ( o—ニトロフエニル） - 1 , 2一エタンジオール（卜 0- dimethoxytrity卜 2- ( 0- nitrophenyl )-l，2- ethan ediol )( lb)の反応により、 該ホスホアミダイ ト試薬 [ 1— ( o—二トロフエニル） 一 2—ジメ トキシトリチルォキシ] ェ卜キシー N , N—ジイソプロビルアミノー 2—シァノエトキシホスフィ ン ( [卜（o-nitrophenyl )- 2- dimethoxytrityloxy] e thoxy - N， N - d i i sopropy 1 ami ηο-2-cyanoethoxyphosph ine) ( 1 )が合成され得る 0 同 様の方法で実施例に示された方法により（ )が合成可能である。
得られるホスホアミダイ ト試薬はそのまま、 アミダイ 卜法による自動合成機の 試薬として使用され得るものである。
(環状オリゴヌクレオチド）
本発明に係る環状オリゴヌクレオチドの塩基配列については限定されない。 し かし、 この環状ォリゴヌクレオチド中に導入される光開裂性基の部分で分子が光 開裂し、 直鎖状のォリゴヌクレオチドを与えることになるがこの閧裂した後の塩 基配列が、 夕ーゲットたる RNAまたは DNA (夕一ゲヅ 卜核酸） にハイブリダィズし、 アンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用し得るように塩基配列を任意に選択 することが出来るものである。
さらに、 環状構造を保持したまま、 ターゲッ ト核酸と相互作用し、 複合体を形 成し得る塩基配列を含むものである。 係る塩基配列は夕一ゲッ 卜の一部の塩基配 列と相補的な塩基配列であり、 相互作用 （例えば、 ハイブリダィゼ一シヨン） 可 能な塩基数であればよい。 係る塩基の種類と数は適時選択可能であるが、 好まし くは 1 0〜2 0 0塩基数、 より好ましくは 3 0 ~ 1 0 0塩基数のものである。 係 る範囲の塩基数の場合は、 通常アンチセンス核酸として使用される 1 5〜3 0塩 基数のオリゴヌクレオチド部分を含み、 かつ必要ならば、 夕一ゲッ卜核酸に相互 作用可能な塩基部分を有する環状光開裂オリゴヌクレオチドを合成することが可 能となる。
さらに、 本発明においては、 上記得られる直鎖状 （光開裂性基を含むもの、 含 まないもの） オリゴヌクレオチドを、 環状化するためには、 特に制限はされない が、 リガーゼによる結合が好ましく使用される。 このためには、 5 ' 末端をリン 酸化し、 さらに、 適当なテンプレー卜を用いて、 通常のリガ一ゼ反応をおこなう ことで可能となる。 この際リガーゼ反応のためのテンプレー卜としてのオリゴヌ クレオチドの調製もまた、 通常の自動合成機等を用いて容易に得ることができる。 また、 該リガーゼ反応についても特に制限はないが、 例えば、 テンプレートォ リゴヌクレオチドにピオチンを結合して使用することは、 後処理が容易となる。 図 9においては、 本発明に係る環状ォリゴヌクレオチドの調製の一例を示した。 また、 短い環状オリゴヌクレオチドの合成には、 他の方法、 例えば、 5， 末端 をリン酸化したオリゴヌクレオチドと、 テンプレートを用意し、 重鎖を形成さ せ、 それを B r C N-ィミダゾールで環状化を行うことで可能である （Prakash，G and Kool, E.T., J. Chem.Soc.,Chem.Commun.，（ 1991 )1161- 1163)。
さらに、 固相合成法により環状ォリゴヌクレオチドを合成することも可能であ ¾(Napoh,L.D. ,Montesarchio,D. ,Piccialli ,G.， Santacroce,C. , Mayol,L. ,Gal eone,A. , Messere,A. , Gazetta Chimica Italiana 121(1991 )505 - 508)。
(光開裂反応）
本発明に係る光閧裂性基を有する環状オリゴヌクレオチドの光開裂反応について は、 特に制限はない。 例えばニトロべンジル型の官能基については、 照射光の波 長、 強度等の条件はよく知られており、 その条件をそのまま使用可能である。 さらに、 照射光は試料全体に照射しても、 一部にしぼって照射してもよい。 試 料の一部の特定の位置にしぼって光照射する際には、 図 2、 又は 4にも示されて いるが、 特定の位置でのみアンチセンス活性が ¾現することとなる。 実施例
以下実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、 本発明はその要旨を超えな い限り以下の実施例に限定されるものではない。
3—クロロー N, N—ジイソプロビルアミノー （2—シァノエ卜キシ） ホスフィ ン (3 - chloro - N,N- diisopropylamino - (2 - cyanoethoxy)phosphine)(la)の合成。
窒素ガス導入用管、 磁気攪拌器、 滴下ロートを備えた反応装置中で、 窒素ガス 雰囲気下、 3-ジクロロ一 （2—シァノエトキシ） ホスフィン（3-dichloro- (2-c yanoethoxy)phosphine)27.0gを無水ジェチルェ一テル 80m 1に溶解し、 これを — 15°Cに冷却した。 十分に攪拌しつつ無水ジェチルエーテル 30 m 1に溶解したジ イソプロピルアミン 31gをゆっくりと滴下した。 そのまま 18時間攪拌後、 析出し たジィソプロピルァミン塩酸塩を濾過分別した。
溶媒を減圧で留去した後、 粗生成物を淡黄色透明油状物として得た。 これを減 圧蒸留 （108— 115°C/0.1mmHg) により分離精製した （22g、 ガスクロマトグラ フによる純度は 95%以上） 。 1HNMR (JEOL JNM— PMX60、 重クロ 口ホルム） による構造解析： 53.6-4.2 (4H、 m、 シァノエトキシ基のエチレン） 、 2.9 (2H、 t、 イソプロピル基のメチン） 、 1.3 (12H、 d、 イソプロビル基のメ チ ル） 。 o—二トロフェニルー 1 , 2—エタンジオール（0- nitrophenyl- 1,2-ethanediol) のジメ トキシトリチル（dimethoxytrityl)化。
100mlフラスコに、 磁気攪袢器及び滴下ロートを備えた反応装置に、 一二 トロフエ二ルー 1， 2—ェ夕ンジオール 2.5 gと、 無水ピリジン 50m 1を加え、 5 °Cに冷却しつつ、 ジメ トキシトリチルクロリ ド 4.6gを加えた。 18時間攪拌し て反応させ た後、 大部分のピリジンを減圧留去し、 残留物に酢酸ェチル 100ml 及び、 飽和 食塩水 100mlを加えた。 有機溶媒層を飽和重曹水、 飽和食塩水で洗 浄し、 無水 硫酸ナトリウムで乾燥し、 溶媒を減圧で留去し赤色油状物 6.7gを得 た。 得られ た粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフ （0.5°トリエチルァ ミン含有クロ口ホルム溶出液） により精製し、 6.0gの目的物、 1一〇—ジメ ト キシトリチル 一2— （o—ニトロフエニル） 一1, 2—エタンジオール -0- di methoxy tr i ty 1 -2- ( o-n i tropheny 1 ) - 1， 2-ethanediol ) ( lb)を得た。 1 H N M R (J EOL J NM-PMX 60、 重クロ口ホル ム） による構造解析： （56.9-8.1 (17H、 m、 ジメ トキシトリチル基のフエニル、 ニトロフエニル基のフエ二ル） 、 4.0 (6H，s，ジメ 卜キシフエ二ル基メ トキシ） 、 3.8 (1H、 t、 メチン基） 、 3.4 (2 H、 d、 メチレン） 。
[ 1一（ o—二トロフエニル）一 2—ジメ 卜キシトリチルォキシ] エトキシ一 N, N—ジィソプロビルアミノ一 2—シァノエトキシホスフィン （Π- (o-nitropheny 1 )-2-dimethoxytrityloxy] ethoxy-N , N-di isopropylamino-2-cyanoethoxyphosph ine) (1)の合成。 上記得られた 1ー0—ジメ トキシトリチル一2— (o—二トロフエニル） 一 1 , 2—エタンジオール 6. Ogと、 トリエチルァミン 3. lgを無水塩化メチレン 50ml に溶解し、 5°Cに 冷却しつつ、 無水塩化メチレン 10mlに溶解した 3—クロロー N, N—ジイソプロビルアミノー （2—シァノエトキシ） ホスフィン 3.6gを滴 下した。 1時間反応させた後、 反応液に酢酸ェチル 150mlを加え、 飽和食塩水 で 3回洗浄した。 後、 溶媒を留去して得られた粗生成物を、 シリカゲルカラムク ロマ卜グラフ （へキサン/酢酸ェチル 2:1 (0.5%卜リエチルァミン含有） 溶出液） により精製し、 8.9 gの目的物 （逆相による HPL Cによる純度 98%) を得た。 ^NMR (JEO L JNM-PMX 60, 重クロ口ホルム） による構造解析： (56.8-8.1 (17H、 m、 ジメ トキシトリチル基フエニル、 二トロフエニル基フエ二 ル） 、 4.0 (lH，t，メチン基） 、 3.7 (6H，s，ジメ トキシフエ二ル基のメチル基） 、 3.3-3.6 (6H,m，シァノエトキシ基のメチレン、 ニトロフエニルェ夕ンジオールの メチレン基） 、 2.3 (2H、 t、 イソプロピル基のメチン） 、 1.2 (12H、 d、 イソプ 口ピル基のメチル
) 。 分子量 （TOF- MS、 669.30) (計算値 669.76) 。 o -二トロフェニル- 1， 2-エタンジォ一ノレ （o—nitrophenyl— 1,2— ethanediol)の tert-ブチルジメチルシリル（ tert- butyldimethylsi lyl )ィ匕
暗室中で窒素雰囲気下、 攪袢装置を備えた反応容器にジクロロメタン 100ml、 ト リエチルァミン 10ml、 ジメチルァミノピリジン 5mg、 及び o -ニトロフエ二ルー 1 , 2—エタンジオール 10.0gを加えて混合し、 得られた溶液を 5 °Cに冷却した。 さ らに、 この溶液に、 tert-プチルジメチルシリルクロライ ド 9.8gを数回に分けて 添加し、 約 3時間攪拌した。 反応の終了は TLCにより追跡し、 原料の消失を認 めて反応終了とした。 TLC上で反応生成物の純度を確認し、 さらに精製するこ となく次のステップに使用した。 1- 0-tert-ブチルメチルシリル- 2-(o-二卜口フエノル）- 1 ,2 -エタンジオール （卜 0- tert-butyldimethylsilyl-Z-Co-nitrophenyD-l ^-ethanedioDcO v' ^ 卜キシ卜 リチル（dimethoxytrityl化）
上記反応液にそのままトリェチルァミン 10mlを加え、 さらに室温でジメ トキシ トリチルクロライ ド 18.6gを数回に分けて添加した。 そのまま一夜攪拌反応を続 け、 T L Cにより反応の終了を確認した。 溶媒を減圧で留去し、 得られた残渣に 酢酸ェチル 200mlを加え、 さらに水、 飽和食塩水でト分洗浄して乾燥し、 溶媒を 減圧で除き 21gの油状物を得た。 得られた残渣をクロ口ホルムを溶出液とするシ リカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、 22.0gの油状物を得た。 NMR (JE0LJNM-PMX60, 重クロ口ホルム中、 c5 (ppm) ) による構造解析結果： 6.6-7.8 ( 17H,m，ジメ 卜キシトリチル基フエニル、 二トロフエ二ル¾フエ二ル） 、 5.5( 1H、 t,メチン基） 、 3.9(2H，d,メチレン基） 、 3.8(6H，s,ジメ トキシメチル基のメチル 基） 、 1.0( 9H, s, tert-プチルジメチルシリル基 tert-ブチル基） 、 0. l (6H，s，tert - ブチルジメチルシリル基メチル基） 。 l-0-tert-ブチルジメチルシリル- 2-0-ジメ トキシトリチル -2- ( 0-二ト口フエニル） - 1， 2-ェタンジオール （ 1-0- tert-butyldimethylsi ly卜 2-0-dimethoxytrity 2_ (o-nitrophenyl )-1 ,2-ethanediol )の脱 tert-ブチルジメチルシリル（ tert-butyld imethylsilyl ) ィ匕
常温で、 磁気攪拌装置を備えた反応装置に卜 0-tert -プチルジメチルシリル- 2- ジメ トキシ卜リチル - 2-(o-二トロフエニル） -1 , 2-ェ夕ンジオール 21. Og及びテト ラヒドロフラン 100mlをとり、 激しく攪拌しながらテトラプチルアンモニゥムフ ルオリ ド 2.6gを数回に分けて添加した。 そのまま、 約 1時間攪拌を続け、 反応終 了を TLCにより確認した後、 反応液を濃縮して反応を終了した。 残留物に酢酸ェ チルを加え、 水及び飽和食塩水により洗浄し、 乾燥後溶媒を減圧下除き油状残渣 18gを得た。 これにクロ口ホルムを溶出液としたシリカゲルカラムクロマトグラ フィ一により精製し、 油状生成物 16. Ogを得た。
「2-ジメ トキシトリチルォキシ -2-(o-ニトロフエニル） ] エトキシ -NJ-ジイソ プロピルァミノ- 2-シァノエ卜キシホスフィン 「2-dimethoxytrityloxy-2- (0- nit rophenyl)! ethoxy- , N-di isop opy iamino-2-cyanoethoxy phosphine) ( 1， ) 暗室条件下、 攪拌装置を備えた反応装置にジクロロメタン 100ml、 トリェチル アミン 7.0g、 及び卜ジメ トキシトリチル -l-(o-二ト口フエニル） -1,2 -エタンジ オール 16. Ogを、 室温で 3-クロロ- N，N-ジィソプロビルアミノ- 2-シァノエトキシ ホスフィン 8.5gのジクロロメタン溶液を滴下した。 反応は速やかに進行し、 約 30 分で完了した。 溶媒を減圧で除き、 残渣を酢酸ェチルに溶解し、 水及び飽和食塩 水で洗浄して、 後乾燥した。 溶媒を減圧で除き、 粗生成物 19gを得た。 へキサン- 酢酸ェチル （2:1)を溶出液としたシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィ 一により精製し、 生成物 （ 1， ） llgを得た。 'HNMR (JE0LJNM-PMX60, 重クロ口 ホルム中、 d(ppm)) による構造解析結果： 6.6- 7.9(17H，m,ジメ トキシトリチル 基フエニル、 ニトロフエニル基フエニル） 、 5.4(1H、 t,メチン基） 、 3.9(2H,d， メチレン基） 、 3.7(6H,s,ジメ トキシトリチル基のメチル基） 、 3·3-3·6(4Η，πι，シ ァノエトキシ基のメチレン） 、 2.3(2H，t,イソプロビル ¾メチン）、 1.3(12H,d,ィ ソプロビル基のメチル。 質量分析 （島 KOMPACT MALDI IV)、 669.51
(計算値 669.76) 直鎖状ォリゴヌクレオチドの合成。
5 ' 一 pCGCAAGCTTC - X - GCCAAGCGCGCAATTAAC CCCT CAAAC CGC- 3 ' (2)、 5 ' -pCGCAAGCTTCGCCA A GCGCGCAATTAACCCCTCAAACCGC- 3' (3)、 5' ービ ォ チン一 GAAGCTTGCGGCGGTTTGAG— 3 ' (4)、 5 ' -pGC C AAGCGCGCAATTAACCCCTCAAACCGC- 3 ' (5)、 5 ' - pGCCAAGCGCGCAATTAACCCCTCAAACCGCCGC AAGCTTC— 3， （6)、 5， - p C G C A A G C T T C p - 3 ' (7)、 5， 一 pCGCAAGCTTC— Y - GCCAAGCGCGCAATTAACCCCT CAAAC CGC- 35 (8)の合成には、 アプライ ドバイオシステム社製モデル 394 (Applied Biosystems, Model394)により、 （2)については上で合成した試 薬（1)を用いて （式中、 Xとして記載されている基） 、 （8)については上で合成し た試薬（ )を用いて （式中、 Yとして記載されている基） 通常のアミダイ ト法に より合成した。
オリゴヌクレオチド（2)、 (3), (5)、 （6)、 （7)についてはさらに DNA自動合 成機でアミダイ ド法により 5' 末端にリン酸甚を付加し、 （4)についてはさらに 、 DNA自動合成機でアミダイ ド法により 5' 末端にピオチンを付加した。
得られたオリゴヌクレオチドは、 アンモニア処理 （30%NH4OH、 室温 1 時間、 55°C8時間） により脱保護基等の後処理を行い、 さらに、 Oligo-PakSP (ミリポア社製） により粗精製した後 （（4)のみ） フアルマシア社製 NAP-25カラ ムによる脱塩後、 遠心濃縮した。
それぞれのオリゴヌクレオチドの精製はイオン交換あるし、は逆相による H P L C (島津製作所製， LC一 10A) を用いた HPLCで行った。
同様に、 上記光開裂基 Xを含む 70merォリゴヌクレオチド 5' -pCGCAAGCTTCGCCCG CACCGATCGC-X-GCCAAGCGCGCAATTAACCCCCTTCCCAACAGTTGCTCAAACCGC-3'を同じ方法 で DN A自動合成機により合成し、 精製した。 環状オリゴヌクレオチドの調製。
上記得られた直鎖状オリゴヌクレオチド（2)、 （3)、 または（8)を 10〃 1 (100pm ol/z 1) 、 環状化用テンプレ一卜として（4)を 10〃 1 (100pmol/ l) 、 超純水 89 30 1、 T 4DNAリガ一ゼ緩衝液（宝酒造） lmlを混合し、 27°Cで 30分遮光放置 し、 続いて 16°Cで遮光数分放置してから、 T4 DNA Ligase50〃l(宝酒造、 350Uni t/ 1 )を加え、 そのまま 4時間放置した。 遠心濃縮後、 NAP-25カラムによる脱 塩操作の後、 ふたたび遠心濃縮し、 アビジンをコートした磁気ビーズ （DYNAL製、 DYNABEADS M280 Streptavidine) により環状化用テンプレートを除去した。 精製 は、 H P L Cによる分取を行い、 的とするフラクションを集め脱塩した。 使用 した H P L C条件は、 以下の通りである。 得られた環状オリゴヌクレオチドをそ れそれ（2，）、 (3，）、 及び (8' )とする。
カラム、 TOSOH TSKgel DNA-NPR4.6鹂 0x7.5顧
流量、 l . Oml/min
カラムオーブン温度、 37°C
緩衝液 A、 20mM Tris-HClpH9
緩衝液 B、 緩衝液 A中に 1.0M NaCl
グラジェント、 A/B ） 60/40から 40/60まで 3 0分
得られた環状オリゴヌクレオチドについて、 20¾ポリアクリルアミ ドゲル電気 泳動 （以下 PAGEと略する） で分析すると、 直鎖状 40merのオリゴヌクレオチドと 環状 40merのォリゴヌクレオチドの移動度がそれぞれ異なった。 環状ォリゴヌク レオチドの方が直鎖状に比べて少し移動度が大きいことが確認された。
同様に、 上記合成した 70mer直鎖状オリゴヌクレオチドも、 同様の操作により リガ一ゼ反応により環状化し、 環状化オリゴヌクレオチドを得た。 P A G Eによ る分析において、 直鎖状 70merと、 環状 70merオリゴヌクレオチドの移動度が異な ることが確認された。 環状ォリゴヌクレオチドのヌクレァ一ゼ耐性実験
光開裂性基を含まない、 H P L Cで精製した直鎖状ォリゴヌクレオチド（ 2 )と、 環状オリゴヌクレオチド（2' )を用い、 ヌクレア一ゼ耐性試験を行った （以後、 直 鎖状オリゴヌクレオチドを Linear，環状オリゴヌクレオチドを Circularとする） 。 使用したヌクレア一ゼは、 ①ェキソヌクレアーゼとして、 Exomicleasel l l , Ex onuc lease V, Exonuc lease VII, 入 Exonuc leaseの 4種類、 ②エンドヌクレア一 ゼとして、 SI Nuclease, Mung Bean Nuclease, BAL 31 Nucleaseの 3種類であつ た。
実験は以下の手順で行った （図 10参照） 。
①ェキソヌクレア一ゼ耐性試験：
まず、 オリゴヌクレオチド （Linear, Circular)を 15〃 1のェキソヌクレア一ゼ 反応液 ( Exonuc 1 ease III,50mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM MgC12, lOmM 2 -メルカプ 卜エタノール; Exonuc lease V,66.7mM グリシン- NaOH(pH9.4), 30mM MgC12, 8.3 mM 2 -メルカプトエタノール， 0.5mM ATP; Exonuc lease VII, 50mM Tris-HCl(pH7. 9), 50mM リン酸カリウム（pH7.6)， 8.3mM EDTA, lOmM 2-メルカプトエタノール； λ Exonuc lease, 67mM グリシン- K0H(pH9.4), 2.5mM MgC12, 0.05 BSA) に各 15 pmol程度加え、 酵素 （ExonucleaseIII，90U; Exonuc lease V, 3.8U; Exonuc lease
VII, 5U; λ Exonuc lease, 2.5U) を添加した。 それぞれの反応液を 37°Cの恒温 層で 30分間インキュベートした後、 20%PAGE (20mA, 40分， 染色ェチジゥ ムブロミ ド（EtBr)30分） にかけ、 Linear と Circularの分解の度合いを調べた。
②エンドヌクレァ一ゼ耐性試験：
まず、 オリゴヌクレオチド （直鎖状； Linear，環状； Circular)を 150〃 1のェ ンドヌクレアーゼ反応液 （SI Nuclease, 30m 酢酸ナトリゥム（pH4.6), 280mM N aCl, ImM ZnSO,； Mung Bean Nuclease, 30mM酢酸ナトリウム（pH5.0), lOOmM Na CI, 5¾ グリセロール; BAL 31 Nuclease, 20m Tris-HCl(pH8.0), 600mM NaCl, 12mM MgCh, ImM EDTA) に各 150pmol程度加え、 酵素 (SI Nuclease, 0.5U; Mung Bean Nuclease, 1U; BAL 31 Nuclease, 0.2U) を添加した。 反応液は 37°C (S 1, Mung Bean) あるいは 30°C (BAL31) でインキュベートして反応させた。 反応 開始後、 0,2，5分後に反応液を50 1ずっ分取し、 の 0.5M EDTAが入った新 しいチューブに移し変え、 酵素反応を完全に停止させた。
反応終了後の反応液を、 HPLC (T0S0H TSKgel DNA-NPR, 溶媒 A:20mM Tr is - HCl(pH9.0 ) , 溶媒 B : A中に 1M NaClをグラジェント A/B = 100/0から 40/60まで 60分間） で分析し、 Linearと Circularの分解の程度を調べ、 H P L C分析から得 られた変化を表 1にまとめた。 表 1
SI Nucleaseを用いた場合
-Linear - 時問 親ピークの面積 ピーク面積合 | 親ビーク比率 親ビーク減少度 (min) Vxsec ) (40-52min) (40-52min) (%)
0 195.07 201.68 96.72%
2 127.82 178.83 71.47% 26. 11%
5 66.04 208.51 31.67% 67.26%
- Circular - 時間 親ピークの面積 ピーク面積合計 親ピーク比率 親ピーク減少度 (min) (mVxsec ) (40-52min) (40-52min) (%)
0 137.77 138.56 99.43
2 79.72 81.91 97.33% 2.11%
5 49.96 54.44 91.77% 7.70¾
Mung Bean Nucleaseを用いた場合
-Linear - 時間 親ピークの面積 ビーク面積合計 親ビーク比率 親ピーク減少度 (min) (mVxsec) (40-52min) (40-52min) (%)
0 275.52 281.17 97.99%
2 205.09 258.38 79.38% 18.99% 5 145.43 287.89 50.52% 48.45%
- Circular - 時間 親ビークの面積 ビーク面積合計 親ピーク比率 親ピーク減少度 (min) (mVxsec) (40-52min) (40-52min) (¾)
0 183.06 190.16 96.
2 144.50 153.76 93.98% 2.38% 5 96.17 107.98 89.06% 7.49%
BAL31 Nucleaseを用いた場合
- Linear - 時間 親ビークの面積 ピーク面積合計 親ピーク比率 親ピーク減少度
(min) (mVxsec) (40-52min) (40-52min) (¾)
0 54.97 87.62 62.74¾
2 12.93 122.95 10.52% 83.24¾ 5 4.44 186.08 2.38¾ 96.20%
- Circular - 時間 親ピークの面積 ピーク面積合計 親ビーク比率 親ビーク減少度 (min) (mVxsec ) (40-52iin) (40-52min)
0 102.89 107.65 95.57%
2 60.76 67.32 90.25% 5.57%
5 23.94 30.34 78.91% 17.44%
以上の結果をまとめると以下の様な一般的な傾向を認めることができる, ェキソヌクレアーゼ Circular Linear
Exonucleasel l l ( + )
Exonuc lease V +
Exonuc lease VI I
AExonuclease エンドヌクレア一ゼ
SI Nuclease 15分までに完全分解 5分で完全分解
Mung Bean Nuclease 30分後でも残る 30分で完全分解
BAL 31 Nuclease 10分で完全分解 5分で完全分解 すなわち、 ェキソヌクレア一ゼ耐性を試験した酵素では、 環状オリゴヌクレオ チドは分解されなかった。 すなわち、 PAGEにおいてバンドに変化は見られず、 環 状オリゴヌクレオチドには、 これらのェキソヌクレア一ゼに対する耐性があるこ とが明らかである。
また、 エンドヌクレアーゼ耐性を試験したすべてのエンドヌクレア一ゼで、 Li near と Circularで分解の程度に差が見られた。 従って、 オリゴヌクレオチドを 環 状化することにより、 ェンドヌクレア一ゼに対する耐性が得られることは明 らかである。
光開裂性基を含む直鎖状及び環状ォリゴヌクレオチドの光照射
以下のォリゴヌクレオチドについて光照射実験を実施した。
•光開裂性基 Xを有する直鎖状 4 Omerオリゴヌクレオチド（2)
• (2)が光照射を受ける際に生成する 5， 末端リン酸化 3 Omerのオリゴヌクレオ チド（5)
•光開裂性基 Xを有する環状 4 Omerオリゴヌクレオチド（2， )
- (2' )が光照射を受けたときに生成する、 5， 末端リン酸化 40 merオリゴヌク レオチド（6)
ここで、 （2)は 1 Omerオリゴヌクレオチドと 30 merオリゴヌクレオチドを光 開裂性基 Xで結合しているため、 光照射により 1 Omerと 3 Omerに分れることに なる。 また、 光開裂された部分では、 1 Omer生成物の 3' 末端にニトロソフエ ニル基、 3 Omer生成物の 5 ' 末端にリン酸基が残ることになる。
さらに、 環状オリゴヌクレオチド（2' )は、 光照射を受けると光開裂された部分 で切断され、 1本の直鎖状 4 Omerオリゴヌクレオチドが生成することとなるが、 この 1本鎖直鎖状オリゴヌクレオチドの 5， 末端には二ト口ソフエニル基が結合 していることとなる。 （2)，（2 を 50pmol/10 1の濃度で TE緩衝液に溶解し、 キ セノン ランプ （USHIO,300W，フィル夕一なし、 室温） に 30分照射した後、 20%PAG Eにて分析した。
この結果 （図 1 1 )、 （2) (レーン 1 ) の光照射後の生成物 （レーン 2) は、 (5) (レーン 3) とほぼ同じ位置にくることがわかり、 （2，） （レーン 4) の光照 射後の生成物 （レーン 5) は（6) (レーン 6) とほぼ同じ位置にくることがわか つ Ί乙。
さらに以下のオリゴヌクレオチドについて光照射実験を実施した。
-光閧裂性基 Yを有する直鎖状 40 merォリゴヌクレオチド（ 8 ) . (2)が光照射を受ける際に生成する 5 ' 末端リン酸化 3 Omerのオリゴヌクレオ チド（5)
•光閧裂性基 Xを有する環状 4 Omerオリゴヌクレオチド（8' )
• (8' )が光照射を受けたときに生成する、 5， 末端リン酸化 4 Omerオリゴヌク レオチド（6)
ここで、 （8)は 1 Omerオリゴヌクレオチドと 3 Omerオリゴヌクレオチドを光 開裂性基 Yで結合しているため、 光照射により 1 Omerと 3 Omerに分れることに なる。 また、 光開裂された部分では、 1 Omer生成物の 5' 末端にニトロソフエ ニル基、 3 Omer生成物の 3， 末端にリン酸基が残ることになる。
さらに、 環状オリゴヌクレオチド（8' )は、 光照射を受けると光開裂された部分 で切断され、 1本の直鎖状 40 merォリゴヌクレオチドが生成することとなるが、 この 1本鎖直鎖状ォリゴヌクレオチドの 5 ' 末端には二トロソフヱニル基が結合 していることとなる。 （8),(8，）を 50pmol/10 1の濃度で TE緩衝液に溶解し、 キ セノン ランプ （USHI0，300W，フィルタ一なし、 室温） に 30分照射した後、 20¾PAG Eにて分析した。
この結架 （図 1 2) 、 (8) (レーン 1 ) の光照射後の生成物 （レーン 2) は、 (5) (レーン 3) とほぼ同じ位置にくることがわかり、 （8，） （レーン 4) の光照 射後の^成物 （レーン 5) は（6) (レーン 6) とほぼ同じ位置にくることがわか つた。
従って、 光照射により直鎖状及び環状のォリゴヌクレオチドがそれぞれ光開裂 性基の部分で切断されたことが明かである （図 1 1及び図 1 2) 。
直鎖状ォリゴヌクレオチド（2)の光照射前及び後の HP L C分析結果 （カラム ： TOSOH TSKgel DNA-NPR 4.6mmi x7.5cm, カラム温度： 37°C、 流速： 0.75ml/min、 緩衝液 A： 20mMTris-HClpH9.0, 緩衝液 B： Aに 1.0MNaC104添加、 グラジェント ： A/ B = 95/5から 65/35まで 45分、 検出： 260nmUV) を図 13及び 14に示した。 こ れより 、 （2) l体は 25.621分の保持時間で単一ビークあつたが、 光照射後に、 14. 744分 及び、 24.427分の保持時間を有する 2つのビークになった。 24.427分のピ —クはオリゴヌクレオチド（5 )によるビーク （24.382分） と -致する。 従って、 以上の 結果から、 オリゴヌクレオチド（2)は図 1 5及び 1 6に示すように光開裂 したことが示された。 同様にォリゴヌクレオチド（8)は図 1 6に示すように光閧 裂した。
なお、 本発明において合成されたオリゴヌクレオチドは、 1つは、 配列の長さ ： 41、 配列の型：核酸、 鎖の数： 1本鎖、 トポロジー：直鎖状、 配列の種類： D N A、 配列： pCGCAAGCTTC XGCCAAGCGC GCAATTAACC CCTCAAACCG C (ここで pCは、 5 ' 末端をリン酸化したシトシンを、 また Xは不特定のヌクレオチドを示す） で あ り、 また、 配列の長さ ： 40、 配列の型：核酸、 鎖の数： 1本鎖、 トポロジー ：直鎖状、 配列の種類： D N A、 配列： pCGCAAGCTTC GCCAAGCGCG CAATTAACCC CT CAAACCGCであり、 また、 配列の長さ ： 40、 配列の型：核酸、 鎖の数： 1本鎖、 ト ポロジ一：サイクリック、 配列の種類： D N A、 配列： CGCAAGCTTC GCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGCであって環状構造を有しているもの、 配列の長さ ： 20、 配列 の型：核酸、 鎖の数： 1本鎖、 トポロジー：直鎖状、 配列の種類： D N A、 配列： BiotinGAAGCTTGCG GCGGTTTGAG (BiotinGはピオチン化したグァニンを示す） であり、 配列の長さ ： 30、 配列の型：核酸、 鎖の数： 1本鎖、 トポロジー：直鎖 状、 配列の種類： DNA、 配列： pGCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC (ここで pGは 5 ' 末端をリン酸化したグァニンを示す） であり、 配列の長さ ： 40、 配列の型： 核酸 、 鎖の数： 1本鎖、 トポロジー：直鎖状、 配列の種類： DNA、 配列： pGCCM GCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC CGCAAGCTTC (ここで pGは 5， 末端をリン酸化した グァニンを示す） であり、 配列の長さ ： 10、 配列の型：核酸、 鎖の数： 1本鎖、 トポロジー：直鎖状、 配列の種類： DNA、 配列： pCGCAAGCTTCp (ここで pCは、 5， 末端をリン酸化したシトシンを、 Cpは 3 ' 末端をリン酸化したシ卜シンを示す） である。 さらに、 配列の長さ ： 71、 配列の型：核酸 、 鎖の数： 1本鎖、 卜ポロ ジー： Π¾鎖状、 配列の種類： D N A、 配列の特徴、 存在位置： 1 特徴を決定 した方法： E 他の情報： 5'末端をリン酸化 配列： CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATC GCXGCCA AGCGCGCAAT TAACCCCCTT CCCAACAGTT GCTCAAACCG C (ここで Xは不特定の ヌクレオチドを示す） 。 さらに、 配列の長さ ： 71、 配列の型：核酸、 鎖の数： 1 本鎖、 トポロジー：サイクリック、 配列の種類： DNA、 配列の特徴、 配列： CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATCGCXGCCA AGCGCGCAAT TAACCCCCTT CCCAACAGTT GCTCAA ACCG Cである （ここで Xは不特定のヌクレオチドを示す） 。 環状ォリゴヌクレオチドと 1本鎖核酸との相互作用
相補的配列を有する 1本鎖 4 Omerオリゴヌクレオチド （ターゲッ ト） として、 5 ' -GCGGTTTGAGGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGAA GCTTGCG-3' を使用し、 係る塩基配列を環状にした環状 4 Omerォリゴ ヌクレオチドを調製した。
上記夕一ゲヅ ト（100〃M) を 36〃 1と、 上記環状オリゴヌクレオチド（100〃M) を 36〃 1とを、 10xBuffer(0.1M NaCl，10mMリン酸緩衝液、 pH7.0)12〃 l、 ホルム アミ ド 30〃 1、 超純水 36〃 1 (合計 150〃 1) 中で混合したものを以下の条件で アニーリング （95°Cで 5分間後、 50°Cで 20分保持した後室温） した。
得られた溶液の 260nmでの吸光度変化を、 温度変化 （30°C/時間で、 3 CTC から 85°Cへ昇温） に対し測定した。
比較として、 上記夕ーゲッ 卜と相補的な塩基配列を有する 4 Omer*の 1本鎖ォ リゴヌクレオチドを用いて同様の測定を行つた。
上記の条件下で、 環状オリゴヌクレオチドも、 1本鎖オリゴヌクレオチドも、 ターゲッ トと混合することにより温度-吸光度変化が観測された。 ここでは、 通 常用いられている核酸の融点 （ある条件下で 2本鎖から 1本鎖になる温度） の測 定方法に準じて、 温度-吸光度変化曲線の変曲点を融点とした。 得られた融点は、 環状ォリゴヌクレオチドの場合は、 6 1 °Cであり、 比較としての 1本鎖ォリゴヌ クレオチドの場合は 67°Cであった。 P T/JP97/01959 この結果は、 上記 4 Omerの環状ォリゴヌクレオチドが、 1本鎖ォリゴヌクレ ォチドと同様に、 ターゲッ トと強く相互作用し、 その生成物は、 通常の 2本鎖形 成と近似した構造を有するものであることを示唆している。
上記 4 Omerの環状ォリゴヌクレオチドと 1本鎖ォリゴヌクレオチドとの相互 作用に基づく安定な複合体の生成物を、 陰イオン交換 H P L Cにより分離確認し た。
HP LC分析条件：陰イオン交換 HP LC
カラム 東ソ一 TSKgel DNA-NPR 4.6mmoix7.5cm
カラム温度 37°C
バッファ一 A = 20mM Tris-HCU pH9.0
バッファ一 B= バッファ一 A中で 1.0M NaCl
グラジェント A/B ( ) 80/20から 20/80まで 10分。
流速 0.8ml/min
検出波長 260M
図 17には、 ターゲッ トのみ （24.5分） 、 環状オリゴヌクレオチドのみ （24.3 分） とは異なる位置に夕一ゲッ トと環状オリゴヌクレオチドとの複合体によるピ ーク （30分） の存在が明確に示されている。 さらに、 図 18には、 ターゲッ トの み （24.5分） 、 1本鎖オリゴヌクレオチドのみ （24.1分） とは異なる位置に夕一 ゲッ トと環状オリゴヌクレオチドとのハイブリッド体によるピーク （25.3分） が 示されている。 保持時間の差は、 ターゲッ トと環状オリゴヌクレオチドとの複合 休の溶液中の構造に基づくイオン性が、 夕ーゲットと環状ォリゴヌクレオチドと のハイプリッ ド体 （完全 2本鎖形成） の構造に基づくイオン性と異なるものであ ることを示唆している。 産業上の利用可能性
本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、 生体内に導入された後、 そ の環状構造のため、 生体内でのヌクレアーゼ分解反応を受けることが少なく、 生 体内の所定の位置へ十分な時間をかけて拡散することが可能となる。 さらに、 所 定の時間後に、 適当な光を照射することにより、 上記光開裂性基が光開裂し、 特 定の結合が切断される。 これにより環状構造であったオリゴヌクレオチドが直鎖 状オリゴヌクレオチドとなり、 夕一ゲッ トたる DNAまたは MAとハイブリダィズ可 能となるものである。
従って、 本発明に係る構造を有する光開裂性環状オリゴヌクレオチドを生体内 に導入し、 任意の場所 （例えば、 1つの特定の細胞やある特定の位置） へ拡散す るのに十分な時間後、 特定の位置へ光照射を行い、 該光が照射された時および場 所にのみアンチセンスオリゴヌクレオチドが発現し、 遺伝子制御可能とするもの である。
【配列表】
配列番号： 1
配列の長さ ： 41
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： D N A
配列の特徴
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報： 5'末端をリン酸化；
は、 1又は 2— ( o—二トロフエニル基） エタンジオールとリン酸エステル 結合する基である。
配列
CGCAAGCTTC XGCCAAGCGC GCAATTAACC CCTCAAACCG C 配列番号： 2
配列の長さ ： 40
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： D N A
配列の特徴
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報： 5'末端をリン酸化 配列
CGCAAGCTTC GCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC 配列番号： 3
配列の長さ ： 40
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
卜ポロジ一：サイクリック
配列の種類： D N A
配列
CGCAAGCTTC GCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC 配列番号： 4
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： ； D N A
配列の特徴
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報： 5'末端をピオチン化
配列
GAAGCTTGCG GCGGTTTGAG 配列番号： 5 配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： D N A
配列の特徴
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報： 5'末端をリン酸化
配列
GCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC 配列番号： 6
配列の長さ ： 40
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： DNA
配列の特徴
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報： 5'末端をリン酸化
配列
GCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC CGCAAGCTTC 配列番号： 7 配列の長さ ： 10
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： D N A
配列の特徴
存在位置： 1、 10
特徴を決定した方法： E
他の情報： 1番目シ卜シンの 5'末端、 および 10番目シトシンの 3'末端がリン酸 化
配列
CGCAAGCTTC 配列番号： 8
配列の長さ ： 71
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： D N A
配列の特徴
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報： 5'末端をリン酸化
Xは、 1又は 2— （o—ニトロフエニル基） エタンジオールとリン酸エステル 結合する基である。
配列 CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATCGCXGCCA AGCGCGCAAT TAACCCCCTT CCCAACAGTT GCTCAAACCG C 配列番号： 9
配列の長さ ： 41
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：サイクリック
配列の種類： D N A
他の情報：
は、 1又は 2— （o—ニトロフエニル基） エタンジオールとリン酸エステル 結合する基である。
配列
CGCAAGCTTC XGCCAAGCGC GCAATTAACC CCTCAAACCG C 配列番号： 10
配列の長さ ： 70
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：サイクリック
配列の種類： D N A
配列の特徴
配列
CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATCGCGCCAA GCGCGCAATT AACCCCCTTC CCAACAGTTG CTCAAACCGC 配列番号： 11
配列の長さ ： 71
配列の型：核酸
鎖の数： 1本鎖
トポロジー：サイクリック
配列の種類： D N A
他の情報：
Xは、 1又は 2— ( 0—ニトロフエニル基） エタンジオールとリン酸エステル 結合する基である。
配列
CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATCGCXGCCA AGCGCGCAAT TAACCCCCTT CCCAACAGTT GCTCAAACCG C

Claims

請求の範囲
1 . 分子中に少なくとも 1つの光閧裂性基で結合された環状オリゴヌクレオチド c
2 . 前記光閧裂性基が、 次式に示す構造を有することを特徴とする請求項 1に記 載の環状ォリゴヌクレオチド。
Figure imgf000036_0001
3 . 前記光開裂性基が、 次式に示す構造を有することを特徴とする請求項 1に記 載の璟状ォリゴヌクレオチド。
0
II 0\\
|〔3' -ォリゴヌクレォチド-5'〕ー0—？ー0 0—〔3'-オリゴヌクレオチド- 5'
ΟΗ
0H
4 . 前記環状オリゴヌクレオチドが 1 0〜2 0 0個の塩基からなることを特徴と する請求項 1に記載の環状ォリゴヌクレオチド。
5 . 前記環状ォリゴヌクレオチドが 3 0〜 1 0 0個の塩基からなることを特徴と する請求項 1に記載の環状ォリゴヌクレオチド。
6 . 前記環状オリゴヌクレオチドが、 前記光開裂性基の開裂により、 ターゲッ ト 核酸の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列とハイプリダイズ可能な第 1の塩基 配列を有することを特徴とする請求項 1に記載の環状ォリゴヌクレオチド。
7 . 前記環状オリゴヌクレオチドが、 前記光開裂性基の開裂によりターゲッ ト核 酸の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列とハイプリダイズ可能な第 1の塩基配 列と、 前記環状オリゴヌクレオチドが、 ターゲット核酸と複合体を形成する第 2 の塩基配列を有することを特徴とする請求項 1に記載の環状ォリゴヌクレオチド。
PCT/JP1997/001959 1996-06-10 1997-06-09 Photocleavable cyclic oligonucleotide Ceased WO1997047639A1 (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU29802/97A AU2980297A (en) 1996-06-10 1997-06-09 Photocleavable cyclic oligonucleotide
EP97924356A EP0855403A1 (en) 1996-06-10 1997-06-09 Photocleavable cyclic oligonucleotide
JP10501432A JP3100166B2 (ja) 1996-06-10 1997-06-09 光開裂性環状オリゴヌクレオチド
US09/011,551 US5919917A (en) 1996-06-10 1997-06-09 Photocleavable circular oligonucleotides

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8/170632 1996-06-10
JP17063296 1996-06-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997047639A1 true WO1997047639A1 (en) 1997-12-18

Family

ID=15908482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1997/001959 Ceased WO1997047639A1 (en) 1996-06-10 1997-06-09 Photocleavable cyclic oligonucleotide

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5919917A (ja)
EP (1) EP0855403A1 (ja)
JP (1) JP3100166B2 (ja)
AU (1) AU2980297A (ja)
WO (1) WO1997047639A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19935756A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-08 Mologen Forschungs Entwicklung Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
EP1493824A1 (en) * 2003-07-02 2005-01-05 Consortium National de Recherche en Genomique (CNRG) Method for detection of mutations in DNA
WO2012021749A1 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Celula, Inc. Genotyping dna
JP7832608B2 (ja) * 2021-03-18 2026-03-18 アフィニティ （シャンハイ） バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド 環状化合物ライブラリおよびその構築方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2675803A1 (fr) * 1991-04-25 1992-10-30 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
JPH0856679A (ja) * 1994-07-18 1996-03-05 Hoechst Ag Ｒｎａ切断性又はｒｎａ結合性オリゴヌクレオチド

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5430136A (en) * 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) * 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
ES2282988T3 (es) * 1993-09-08 2007-10-16 La Jolla Pharmaceutical Company Moleculas plataforma de valencia no polimericas,.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2675803A1 (fr) * 1991-04-25 1992-10-30 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
JPH0856679A (ja) * 1994-07-18 1996-03-05 Hoechst Ag Ｒｎａ切断性又はｒｎａ結合性オリゴヌクレオチド

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCH. INT. PHYSIOL. BIOCHEM., Vol. 87, No. 5, (1979), J. PIETTE, "Guanine Alteration and Production of Strand Breaks in DNA Photosensitized by Proflavine", p. 1050-1051. *
J. AM. CHEM. SOC., Vol. 117, No. 37, (1995), P. ORDOUKHANIAN et al., "Design and Synthesis of Aversatile Photocleavage DNA Building Block. Application to Phototriggered Hybridization", p. 9570-9571. *
NUCLEIC ACIDS RES., Vol. 21, No. 18, (1993), M. PUTTARAJU et al., "A Circular Trans-Acting Hepatitis Delta Virus Ribozyme", p. 4253-4258. *
PHOTOCHEM. PHOTOBIOL., Vol. 62, No. 1, (1995), G. CONDORELLI et al., "Molecular Mechanism of Drug Photosensitization 7. Photocleavage of DNA Sensitized by Suprofen", p. 155-161. *
See also references of EP0855403A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19935756A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-08 Mologen Forschungs Entwicklung Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation

Also Published As

Publication number Publication date
AU2980297A (en) 1998-01-07
JP3100166B2 (ja) 2000-10-16
EP0855403A1 (en) 1998-07-29
EP0855403A4 (ja) 1998-08-12
US5919917A (en) 1999-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5955599A (en) Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages
JP4584986B2 (ja) ２−アリールプロピル部分を含む１本鎖及び２本鎖オリゴヌクレオチド
US5252723A (en) Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds
MXPA96004355A (en) Oligonucleotides and used modified intermediaries in nucleic acids therapeuti
JPH09511250A (ja) 核酸治療に有用な修飾オリゴヌクレオチド及び中間体
JPH08508513A (ja) リン含有共有結合をつくる方法およびその中間体
WO1998008858A1 (en) Improved reagents and process for synthesis of oligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages
JP2000507928A (ja) ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法
CA2878945A1 (en) Chiral control
JPH05506014A (ja) オリゴヌクレオチド類似体
EP0552185A1 (en) Synthesis of oligonucleotides
EP4185707B1 (en) Base-modified nucleotides as substrates for tdt-based enzymatic nucleic acid
US5571937A (en) Complementary DNA and toxins
JPH09506248A (ja) キメラオリゴヌクレオシド化合物
JP2009523746A (ja) 光切断可能なリンカーを用いたオリゴヌクレオチド合成
JPH09503494A (ja) カーバメートヌクレオシド間結合を有するビルディングブロックおよびそれから誘導される新規なオリゴヌクレオチド
JPH09505307A (ja) 多キラル合成フォスホネートオリゴマー類
WO1997047639A1 (en) Photocleavable cyclic oligonucleotide
CN101238213B (zh) 使用扭转嵌入核酸(TINA)稳定并选择性地形成Hoogsteen型三链体和双链体以及制备TINA的工艺
Yang et al. Synthesis and duplex stabilization of oligonucleotides consisting of isonucleosides
JPWO1997047639A1 (ja) 光開裂性環状オリゴヌクレオチド
WO1996039414A1 (en) Novel base protecting groups for oligonucleotide synthesis
US6509459B1 (en) Base protecting groups and rapid process for oligonucleotide synthesis
US5639875A (en) Methods for H-phosphonate syntheis of oligonucleotides using triphosgene
JP2022521510A (ja) ホスホノアセテートギャップマー型オリゴヌクレオチド

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09011551

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997924356

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997924356

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1997924356

Country of ref document: EP