WO1998015580A1 - Monoklonale antikörper gegen einen komplex aus humanem act und einer serinprotease - Google Patents

Monoklonale antikörper gegen einen komplex aus humanem act und einer serinprotease Download PDF

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WO1998015580A1
WO1998015580A1 PCT/EP1997/005556 EP9705556W WO9815580A1 WO 1998015580 A1 WO1998015580 A1 WO 1998015580A1 EP 9705556 W EP9705556 W EP 9705556W WO 9815580 A1 WO9815580 A1 WO 9815580A1
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Christa HÜBNER-PARAJSZ
Hartmut Schetters
Rosemarie Kientsch-Engel
Thomas Meier
Martin Kaufmann
Andreas Gallusser
Rolf Deeg
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Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
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    • G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate

Definitions

  • the present invention relates to monoclonal antibodies (MAK) which specifically bind a complex of ⁇ 1-antichymotrypsin (ACT) and a serine protease, in particular prostate-specific antigen (PSA) and which have essentially no cross-reactivity to non-complexed ACT and non-complexed serine proteases.
  • MAK monoclonal antibodies
  • ACT ⁇ 1-antichymotrypsin
  • PSA prostate-specific antigen
  • the prostate-specific antigen is a glycoprotein with a molecular weight of 33 kDa. It is formed in the prostate epithelial cells and is part of the seminal fluid. PSA has the enzymatic activity of a neutral serine protease.
  • the main function of the PSA is to cleave the Se inogeline I and II as well as the fibronectin, gel-like proteins that block the sperm motility as essential components of the ejaculate. Through the hydrolysis of these proteins, PSA liquefies the semen coagulum, thus enabling sperm mobility.
  • serpins serine protease inhibitors
  • the majority of the immunologically detectable PSA is bound to ⁇ l-antichymotrypsin (60-95%) in the serum. Further complexes are formed with ⁇ 2-macroglobulin, ⁇ l-antitrypsin, inter- ⁇ -trypsin inhibitor and protein C inhibitor.
  • ⁇ l-Antichymotrypsin is a glycoprotein with a molecular weight of approx. 69 kDa and a carbohydrate content.
  • ACT plays an important role in controlling inflammation. ACT also forms complexes with chymotrypsin, cathepsin G and glandular kallikrein hK2. ACT occurs in human serum in a concentration 10,000 times higher than PSA (on a molar basis).
  • the PSA-ACT complex is the main form of the immunologically detectable total PSA in the serum.
  • Prostate cancer in many cases leads to an increase in the serum PS A level.
  • PSA is not a cancer-specific marker, especially in the low concentration range.
  • the screening tests available to date for the possible presence of prostate carcinoma in a patient were always tests for the detection of total PSA.
  • PSA is usually found in very low concentrations in the serum of male persons, a so-called "cut-off" must be defined in such a test. PSA values above this cut-off are taken as an indication of the presence of prostate carcinoma.
  • the PSA concentration increases with increasing age of the patient, values of 4 to 6 ng / ml have been used in the test for the detection of the total PSA cut-off. As a result, some patients who had early prostate carcinoma were not included in these screening tests.
  • WO 92/01936 describes a method for the detection of PSA-ACT in which a combination of the antibody 2E9, which binds uncomplexed PSA and also PSA in a complex with ACT, and an antibody against ACT is used.
  • the object was achieved by a monoclonal antibody against a complex of human ACT and a serine protease which has essentially no cross-reactivity with free, non-complexed human ACT and free, non-complexed serine proteases.
  • the object was achieved by a MAK against a complex of ACT and a serine protease which has essentially no cross-reactivity with free human ACT and free serine proteases and which has a significantly higher affinity and specificity for PSA-ACT than for other serine protease ACT Has complexes, in particular to chymotrypsin-ACT and cathepsin-G-ACT.
  • the monoclonal antibody can be used in all tests known to those skilled in the art for the detection of a protein.
  • the test can be carried out in one step, that is to say without an additional washing step to remove the excess ACT.
  • screening tests in which a large number of samples are to be tested in as quick a sequence as possible, this is a decisive advance over the previously possible tests, which all contained a washing step to remove the excess ACT.
  • the monolonal antibodies according to the invention against a complex of human ACT and a serine protease have essentially no cross-reactivity with free human ACT and free serine proteases.
  • Substantially no cross-reactivity is understood to mean a cross-reactivity which, in the test for the detection of the ACT-serine protease complex, does not influence free ACT or free serine protease.
  • How high the tolerated cross-reactivity to individual components can be depends on the concentration in which this component can occur in human serum. Since ACT occurs in a very large excess, the cross-reactivity in this case may only be negligible, that is to say far below 1%.
  • the monoclonal antibodies according to the invention in particular have a higher affinity and specificity for PSA-ACT than for the other serine protease ACT complexes.
  • the affinity for PSA-ACT is preferably at least 10 times higher, particularly preferably 50 times or higher.
  • the monoclonal antibodies according to the invention preferably have an affinity for PSA-ACT of at least 10 7 l / mol, particularly preferably of at least 10 9 l / mol.
  • an affinity of 10 10 l / mol which is unusually high for monoclonal antibodies, could even be determined.
  • Such high affinity monoclonal antibodies against PSA-ACT are outstandingly suitable for one-step residues, in which a relatively short incubation of the sample with the monoclonal antibody usually takes place. The binding of this high affinity monoclonal antibody to PSA-ACT takes place very quickly.
  • the monoclonal antibodies according to the invention can belong to all possible Ig classes.
  • the monoclonal antibodies belong to the IgGl class.
  • the coupling of further components such as binding partners for binding the antibody to a solid phase in heterogeneous immunoassays, or for example labels such as enzymes etc., can preferably be carried out on IgGl antibodies.
  • the cleavage to antibody fragments is also unproblematic with the IgGl class.
  • the term monoclonal antibody means both the complete antibody and all fragments thereof common in immunoassays and other uses, such as F (ab ') 2 and Fab fragments. Also included are those antibodies which were produced by changing the monoclonal antibodies as long as the antigen binding property was not decisively influenced.
  • genetic engineering measures can be used to replace parts of the monoclonal antibodies normally produced in mice by corresponding human antibody sequences in order to minimize non-specific binding in the immunoassay.
  • Methods for producing such chimeric monoclonal antibodies are known to the person skilled in the art, for example from Antibody Engineering, J. Mc Cafferty, HR Hoogenboom and DJ. Chiswell, The Practical Approach Series, Series Editor: BD Harnes, Oxford University Press, known in 1996.
  • the monoclonal antibodies according to the invention can be deposited, for example, from the cell lines MAK ⁇ PSA-ACT> M 4.6.374, MAK ⁇ PSA-ACT> M 4.3.2 and MAK ⁇ PSA-ACT> M 6.13.64, deposited on September 19, 1996. at the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig).
  • MAK ⁇ PSA-ACT> M 4.6.374 DSM ACC 2281;
  • MAK ⁇ PSA-ACT> M 6.13.64 DSM ACC 2282;
  • MAK ⁇ PSA-ACT> M 4.3.2 DSM ACC 2283).
  • the invention further relates to antibodies, preferably monoclonal antibodies, which bind in an equivalent manner to serine protease-ACT complexes, such as the monoclonal antibodies 4.6.374, 4.3.2 and 6.13.64. Binding in an equivalent manner is understood to mean that these antibodies recognize the same epitope as the deposited monoclonal antibodies. This can be determined, for example, by multi-binding tests on the BIAcore ® .
  • the monoclonal antibodies according to the invention can be prepared in a manner known per se by immunization with PSA-ACT of human origin in suitable experimental animals and subsequent fusion of the spleen cells of the immunized animals with myeloma cells.
  • the yield of serine protease ACT-specific monoclonal antibodies was however very low. By using exclusively female experimental animals, the yield of PSA-serine protease-specific antibodies could be increased. Even here, about 70% of the monoclonal antibodies still had high cross-reactivity with ACT and about 30% had high cross-reactivity with PSA. Well below 1% of the total of the antibodies obtained had the required specificity for the serine protease inhibitor complex or the PS A-ACT complex.
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • lymph node cells from immunized animals (preferably the mouse and the rat) can also be used.
  • lymphocytes (PBL, spleen cells, lymph node cells) from human donors (such as prostate tumor patients, lactating women, patients with PSA-secreting cells / tissues) who have developed antibodies or autoantibodies against PSA-ACT can also be used.
  • Such anti-PS A-ACT-producing lymphocytes can be immortalized either by fusion with a human myeloma line or by EB V (Epstein Barr virus) transformation to antibody-producing hybridoma cells (Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology, AM Campbell, Elsevier Verlag 1991; Monoklonale Antikö ⁇ er, JH Peters, H. Baumgarten, Springer Verlag 1990; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, ed. Lawrence B. Schook, Marcel Dekker Verlag 1987).
  • Another object of the invention is the use of the monoclonal antibodies according to the invention for the detection of serine protease-ACT complexes, in particular of PSA-ACT in samples, preferably human samples such as plasma, serum, blood, seminal fluid, prostate fluid, seminal vesicle Liquid, saliva, cerebrospinal fluid, women's milk, cysts, tissue homogenates, tissue sections, biopsy material.
  • samples preferably human samples such as plasma, serum, blood, seminal fluid, prostate fluid, seminal vesicle Liquid, saliva, cerebrospinal fluid, women's milk, cysts, tissue homogenates, tissue sections, biopsy material.
  • the invention therefore furthermore relates to a method for determining a complex of human ACT and serine proteases by incubating the sample with at least one monoclonal antibody according to the invention.
  • All common methods known to the person skilled in the art for the detection of a protein such as, for example, competitive tests according to the IEMA principle or direct tests such as sandwich tests, are suitable.
  • homogeneous tests which are suitable for the detection of a protein can also be used. Examples include nephelometric or turbidimetric tests such as latex agglutination tests or TINIA (turbidimetric inhibition immunoassays).
  • test reagents are in the liquid phase
  • all common dry test formats that are suitable for the detection of a protein can also be used.
  • the test components are applied to a carrier.
  • Such dry tests are described, for example, in EP-A 0 186 799.
  • Another object of the invention is a test for the detection of PSA-ACT by incubating the sample with a monoclonal antibody according to the invention which has a higher affinity for PSA-ACT than for the other serine protease ACT complexes.
  • This MAK preferably has an affinity for PSA-ACT that is at least 10 times, particularly preferably at least 50 times higher.
  • the invention therefore relates to a method for determining PSA-ACT by incubating the sample with at least a monoclonal antibody according to the invention and an antibody which is directed against PSA.
  • PSA-specific antibodies are known and have been used since 1985 in diagnostic tests for the detection of PSA or ⁇ -seminoprotein. By combining these two antibodies, PSA-ACT is specifically detected. Which of the two antibodies is present in the sandwich test customary in this case in marked form or bound to the solid phase is the same.
  • PSA belongs to the kallikreine family, a protease group that has high homologies with one another. They are bound by inhibitors, the so-called serine protease inhibitors, to which ACT belongs.
  • PSA-Se ⁇ in complexes have an epitope, a so-called neo-epitope, which is not present on the free inhibitors that have not bound a protease.
  • PSA-ACT complexes or the kallikrein-Se ⁇ in complexes in general are eliminated from the blood circulation via receptors which recognize this neo-epitope.
  • the neo-epitope is described, for example, in Perlmutter et al., J. Biol. Chem. 265, No. 28, 16713-16716, 1990; Perlmutter et al., Proc. Natl. Acac. Be. USA, 87, 3753-3757, 1990 and Joslin et al, J. Biol. Chem. 268, No. 3, 1886-1893, 1993.
  • Another object of the invention is therefore a method for determining PSA-ACT by incubating the sample with a receptor of PSA-ACT, which binds the neo-epitope described in more detail above, and an antibody, preferably a monoclonal antibody, which is directed against PSA . It is the same whether the receptor or the antibody is present in labeled form or bound to the solid phase.
  • Se ⁇ in protease receptors cells are first cultivated which express the desired receptor.
  • the receptor is detected, for example, with a Zeil ELISA as described by Hashemi et al., J. Lab. Clin. Med. 109 (1987), 434-440.
  • Hep G2 cells in flat-bottomed culture vessels (Costar) in one Sown density of 2 x 10 4 cells / ml. D'MEM with 10% fetal calf serum (FCS) is used as the culture medium.
  • FCS fetal calf serum
  • ACT-PSA (Scripps Laboratories) is added to a final concentration of 10 ⁇ g / ml in D'MEM / 1% RSA and left for 10 minutes at 4 ° C. for complexation with the receptor. After washing twice with D'MEM / 1% RSA, the cells are incubated with an anti PSA monoclonal antibody which is labeled with peroxidase (1 U / ml) for 30 minutes at 4 ° C. The cells are then washed twice with D'MEM / 1% RSA. For detection, the cells are incubated with substrate (TMB).
  • TMB substrate
  • Hep G2 cells which show a high expression of the receptor, are grown in T 150 culture bottles and the cell layers formed are harvested by carefully scraping off the cells. Cells from multiple culture vessels are combined to arrive at a total of 10 9 cells. The cells are then lysed by incubation with 1% Triton X100 in PBS. After centrifugation at 10,000 xg for 10 minutes, the cell supernatant is separated and the precipitate with the core and cell membrane fractions is resuspended in 1 M sodium chloride in PBS. After centrifugation at 10,000 xg for 10 minutes, the cell supernatant is collected and stored at -20 ° C. This receptor preparation can be used for the characterization of the receptor in ELISA procedures.
  • Hydrophobic chromatography is carried out to further purify the crude receptor extract.
  • the activity of the individual fractions is detected by an ELISA, as described above, and the fractions with receptor activity are combined.
  • the NH 2 terminus of the receptor molecule is then applied using known methods. sequenced and the cDNA fished from a gene bank. For this purpose, the cleaned recipe repair is first separated by SDS-PAGE. The protein bands are cut out and eluted.
  • the receptor activity of the individual bands is detected by competition using a cell ELISA.
  • the NH2 terminus of the active band is then sequenced using known methods.
  • the nucleic acid sequence is derived from the amino acid sequence and corresponding oligoprimers are synthesized.
  • a second degenerate primer from the untranslated region in front of the poly A region is also used for PCR amplification, using Hep G2 DNA as a template.
  • the amplified sequence approximately 45 nucleotides
  • positive clones are identified and purified.
  • the DNA is characterized by restriction analysis and Southern blots.
  • An EcoRI-Xbal fragment is subcloned in Bluescript SK. Sequence analysis of the clone and deduction of the amino acid sequence prove the receptor specificity.
  • this oligonucleotide a DNA is identified in a cDNA bank, for example of fetal liver in ⁇ DR2 (Clontech Cat. No. HL 115 lx), which correlates with the receptor sequence.
  • the identified clones are purified and analyzed with primers from the vicinity of the B AMHI-Xbal region in ⁇ DR2 using PCR.
  • the phage suspension is used as a template.
  • the plasmid pDR2 is isolated and subjected to a restriction analysis with B AMHI and Xbal.
  • the double-stranded DNA insert is sequenced with an auto-sequencer (ABI 373) according to standard instructions for color-labeled dioxynucleoside triphosphate terminators and “walking primers” (Sanger et al., PNAS (1977) 74, 5463-5467).
  • the receptor DNA is then isolated and an expression system is constructed.
  • the cDNA which contains the open reading frame for the receptor, is cloned into the plasmid pSV15.JD.LL between the restriction sites Cla I and Sal I.
  • the vector pSV15.JD.LL.SERC is obtained.
  • the plasmid contains a short leader sequence upstream of the receptor gene. This leader sequence allows a high translation rate and fast purification. To Induction of the tryptophan promoter initiates high intracellular production.
  • the expression plasmid is used, for example, to transform E. coli 44C6 using the CaCl 2 heat shock method according to Mandel et al., J. Mol. Biol. 53 (1970), 159-162.
  • the cells transformed in this way are grown at 37 ° C. in LB medium with 50 ⁇ g / ml carbenicillin to an optical density of 2-3 at 600 nm.
  • the suspension is diluted 20-fold with M9 medium with 0.49% casamino acids and 50 ⁇ g / ml carbenicillin.
  • Cultivation is continued for one hour at 30 ° C. with aeration and indolyl-3-acrylic acid is added to a final concentration of 50 ⁇ g / ml. After further culturing for 15 hours, the cells are harvested.
  • the plasmid is linearized with Not I and CHO cells are transferred by electroporation (Andreason, J. Tissue Culture Meth. ⁇ 5_ (1993), 56). The cells are transferred to DHFR selection medium. After 2 weeks, individual clones are transferred to 96 microtiter plates. Expression is measured using a competitive ELISA.
  • the receptor Following the expression of the receptor, it is isolated, purified, characterized and the use as a binding partner in an immunoassay evaluated.
  • the culture supernatant of the transfected CHO cells is collected and applied to a Cibachromblue-Sepharose column / 100 volume parts cell supernatant / 1 volume part column material).
  • the column is washed with 5 parts by volume of application buffer without urea and then with 10 mM phosphate buffer pH 7.4 with 2 M urea (5 parts by volume).
  • the recombinant receptor is eluted with 10 mM phosphate buffer pH 7.4, 2 M urea and 1 M NaCl.
  • the fractions containing receptor are applied to a Wheatgerm lectin column. After washing with 5 Volumes of application buffer, the receptor is eluted with 10 mM phosphate buffer pH 7.4, 2 M urea and 0.5 M N-acetyl-D-glucosamine.
  • the combined receptor-containing fractions are adjusted to 0.04% C 2 E 8 and 0.1% TFA.
  • the proteins are separated with two consecutive linear acetonitrile gradients (0-30% and 30-60% in 0.04% C ⁇ 2 Eg and 0.1% TFA).
  • the fractions are analyzed using SDS-PAGE.
  • the receptor-containing fractions are combined and diluted with 2 volumes of 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 and 150 M aCl and dialyzed against 6 volumes of the dilution buffer in an ultrafiltration chamber (connection size 30,000) and concentrated.
  • the concentrate is adjusted to 0.01% and Tween ® 80 purified in the same buffer to remove aggregates and fragments by means of gel chromatography.
  • the fractions containing the receptor are sterile filtered (0.22 ⁇ filter) and stored at 4 ° C.
  • the receptor expressed in E. coli is isolated as follows.
  • the E. coli cells are homogenized in 10 volumes of buffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8) and centrifuged at 5000 x g for 30 minutes.
  • the cells are taken up in 10 volumes of buffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8), for example passed through a microfluidizer and centrifuged.
  • the cell pellet is frozen at -70 ° C or used directly.
  • the cell pellet is resuspended in 20 mM Tris-HCl, 8 M guanidine hydrochloride and 25 mM DTT, pH 8 and stirred at 4 ° C. for 12 hours to solubilize the receptor molecules. After solubilization, the solution is centrifuged at 30,000 xg for 30 minutes. The clear cell supernatant is obtained and this solution is purified on a G200 Sephadex column (gel chromatography column) in 20 mM Na phosphate buffer with 10 mM DTT, pH 6. The fractions containing the receptor are pooled (detection of the protein via SDS-PAGE). These fractions are, as described above, on a C4 reversed Phase column separated.
  • the fractions containing the receptor are combined again and the receptor is renatured.
  • the solution is diluted with 9 volumes of renaturation buffer (5 mM EDTA, 2% CHAPS detergent, 25% glycerol, 5 mM oxidized glutathione and 1 mM reduced glutathione, pH 8.3) and dialyzed at 4 ° C. for 4 days.
  • renaturation buffer 5 mM EDTA, 2% CHAPS detergent, 25% glycerol, 5 mM oxidized glutathione and 1 mM reduced glutathione, pH 8.3
  • the solution is adjusted to 0.2% TFA, filtered through a 0.45 ⁇ filter and adjusted to 10% acetonitrile. This is followed by a C4 reversed phase column as described above.
  • the receptor-containing fractions are dialyzed against an isotonic buffer (10 mM Na phosphate buffer, 150 mM NaCl and 0.01% Tween ® 80, pH 74) and stored at 4
  • the recombinant receptor thus produced can be used as a binding partner, either wall-bound or labeled, for the determination of PSA-Se ⁇ in complexes in immunoassays, as described above.
  • the tests according to the invention for the detection of PSA-ACT are outstandingly suitable for screening a large amount of sample in order to obtain an indication of the presence of a prostate carcinoma. It has been shown that by using the test according to the invention, the cut-off can be reduced compared to the cut-off previously used in tests for the detection of total PSA. Even in areas below the usual cut-off values, the test according to the invention can still be used to find a comparatively certain differentiation between normal patients and high-risk patients. At the same time, however, patients who have early prostate carcinoma who have not been recorded in the tests customary to date are also increasingly being recorded.
  • the cut-off values in the test according to the invention are significantly lower than the corresponding cut-off values for total PSA.
  • the cut-off value for PSA-ACT is ⁇ 70% of the cut-off value for PSA, preferably ⁇ 60% (in ng / ml). With the same specificity (95% against BPH), the cut-off value for total PSA is, for example, 10.05 ng / m, the cut-off value for PSA-ACT is 5.70 ng / ml.
  • Interleukin 6 (100 U / ml) is added to the medium as the growth factor. After about 10 days, the primary cultures are tested for specific antibody synthesis (see Examples 2). Primary cultures which show a positive reaction with PSA-ACT and show no cross-reaction with non-complexed PSA and non-complexed ACT and with all other serum components are cloned in 96-cell culture plates using fluorescence-activated cell sorters. Interleukin-6 (100 U / ml) is added to the medium as a growth additive.
  • the hybridoma cells obtained are sown at a density of 1 ⁇ 10 5 cells per ml in RPMI 1640 medium with 10% FCS and for 7 days in a fermenter (from Thermodux, Wertheim / Main, model MCS-104XL, order no 144-050) increased. Concentrations of on average 100 ⁇ g monoclonal antibodies per ml are reached in the culture supernatant. This antibody is purified from the culture supernatant by methods customary in protein chemistry (for example according to Methods in Enzymology 121 (1986), 587-695).
  • Example 2
  • Streptavidin-coated MTP are coated with “capture antibodies” that bind PSA and PSA-ACT.
  • the incubation then takes place with the analyte PSA-ACT (in a)) or PSA (in b)).
  • the incubation takes place with the Anti-PSA-ACT antibodies to be tested
  • the bound antibodies are detected using an anti-mouse IgG POD in the usual way by reacting a substrate.
  • MTP coated with recombinant streptavidin (MicroCoat, Penzberg, Order No. 12-K 96 N, batch MC 289) with 10 ⁇ g / ml biotinylated Fab fragment of the monoclonal antibody 1 or monoclonal antibody 2 (both monoclonal antibodies recognize non-complexed PSA and PSA in the complex) coated in PBS plus 0.5% Crotein C (100 ⁇ l per well, 10 min incubation at room temperature with shaking) and then 3 times with 0.9% NaCl / 0.05% Tween 20 washed.
  • 100 ⁇ l of the antibody solution to be examined (in the culture supernatant) is placed in a coated well and incubated for 1 hour at room temperature with shaking. After washing three times with 0.9% sodium chloride / 0.05% Tween 20, 100 ⁇ l of a POD-labeled Fab fragment of a polyclonal antibody from the sheep against mouse Fc ⁇ is used to detect bound antibodies from the sample (Boehringer Mannheim GmbH, ID number 1431323, corresponding to 25 mU / ml), incubated for 1 hour at room temperature with shaking and then washed 3 times with 0.9% sodium chloride / 0.05% Tween® 20.
  • test described under a is used to incubate with non-complexed PSA instead of with PSA-ACT.
  • MTP coated with recombinant streptavidin from MicroCoat, Penzberg, order no. 12-K 96 N, batch MC 289 with 10 ⁇ g / ml biotinylated Fab fragment of the monoclonal antibody 1 or the monoclonal antibody 2 ( Both monoclonal antibodies recognize non-complexed PSA and PSA in the complex) coated in PBS plus 0.5% Crotein C (100 ⁇ l per well, 10 min incubation at room temperature with shaking) and then 3 times with 0.9% NaCl / 0.05 % Tween®20 washed.
  • 100 ⁇ l of the antibody solution to be examined (in the culture supernatant) is placed in a coated well and incubated for 1 hour at room temperature with shaking. After washing 3 times with 0.9% sodium chloride / 0.05% Tween® 20, 100 ⁇ l of a POD- labeled Fab fragment of a polyclonal antibody from the sheep against mouse Fc ⁇ (Boehringer Mannheim GmbH, ID number 1431323, corresponding to 25 mU / ml) was added, incubated for 1 hour at room temperature with shaking and then 3 times with 0.9% Sodium chloride / 0.05% Tween 20 washed.
  • the antibody to be examined is preincubated with ACT in excess in the test described under a). If the measurement signal remains unchanged high, there is no cross reaction, if the measurement signal is lowered, there is a cross reaction.
  • MTP coated with recombinant streptavidin from MicroCoat, Penzberg, order no. 12-K 96 N, batch MC 289 with 10 ⁇ g / ml biotinylated Fab fragment of the monoclonal antibody 1 or the monoclonal antibody 2 (both monoclonal Antibodies recognize non-complexed PSA and PSA in the complex) coated in PBS plus 0.5% Crotein C (100 ⁇ l per well, 10 min incubation at room temperature with shaking) and then 3 times with 0.9% NaCl / 0.05% Tween ® 20 washed.
  • the antibody to be tested for cross-reaction is tested with a concentration series of 0, 10 ⁇ g, 50 ⁇ g, 100 ⁇ g / ml ACT (from Athens, Athens, order no. 16-16-012400, batch AX 9501) preincubated.
  • the preincubation is carried out in uncoated 96 mm MTP wells for 1 h at room temperature with shaking.
  • the antibody to be examined is preincubated with human, female sera in the test described under a). If the measurement signal remains unchanged high, there is no cross reaction, if the measurement signal is lowered, there is a cross reaction.
  • MTP coated with recombinant streptavidin from MicroCoat, Penzberg, order no. 12-K 96 N, batch MC 289 with 10 ⁇ g / ml biotinylated Fab fragment of the monoclonal antibody 1 or the monoclonal antibody 2 (both monoclonal Antibodies recognize non-complexed PSA and PSA in the complex) coated in PBS plus 0.5% Crotein C (100 ⁇ l per well, 10 min incubation at room temperature with shaking) and then 3 times with 0.9% NaCl / 0.05% Tween ® 20 washed.
  • the antibody to be tested for cross reaction is pre-incubated with a series of concentrations (1: 1 to 1:10) of human, female sera (a mixture of four PSA-negative donors).
  • the preincubation is carried out in uncoated 96 mm MTP wells for 1 h at room temperature with shaking.
  • the affinity constants and the rate constants of the association and dissociation of the antibodies produced were determined using BIAcore ® from the company
  • Pharmacia Biosensor (BIA stands for Biospecific Interaction Analysis). The measuring principle is based on the "Surface Plasmon Resonance". The measurement is carried out on a biosensor, the so-called sensor chip.
  • a polyclonal rabbit antibody against the Fc ⁇ part of mouse IgG is coupled via its amino groups to the surface of a sensor chip (CM5, Pharmacia Biosensor) coated with carboxmethylated dextran.
  • CM5 Sensor Cibshammer
  • a solution of the antibody to be determined is passed over this sensor chip, the antibody being bound to the immobilized capture antibody by non-covalent interaction forces.
  • the antigen to be examined is passed over the sensor chip, which is then bound to the antibody immobilized via the capture antibody by likewise non-covalent interaction forces.
  • the binding of the individual components increases the mass density on the surface of the sensor chip, which the device converts into a proportional measurement signal.
  • the rate constants of the association and dissociation and the affinity constant can be calculated from the change in time of the signal, the sensorgram.
  • the antibody-antigen complexes can be detached again without affecting the capture antibodies bound to the surface with simple means, so that further binding experiments can be carried out on the same sensor chip under identical conditions.
  • CM5 Pharmacia Biosensor
  • a solution of the Antikö ⁇ ers (BIA certified Rabbit anti Mouse Fc ⁇ , Pharmacia Biosensor) with a concentration of 60 ⁇ g / ml in 10 mM sodium acetate buffer pH 5.0 with a flow rate of 5 ⁇ l / min passed over the sensor chip previously activated with NHS / EDC.
  • the antibodies are then added, so that the mass bound to the surface increases by at least 600 resonance units.
  • the binding of the antigens to the antibodies is monitored at a flow rate of 10 ⁇ l / min and the rate constants of the association and the dissociation for the binding to the antibodies are calculated from the sensor programs using software from the manufacturer (BIAevaluation 2.1, Pharmacia Biosensor).
  • PSA-ACT was measured by replacing the detection antibody of the Enzymun-Test® PSA with the antibody 4.6.374 (according to its POD label) specific for PSA-ACT and otherwise following the instructions on the package insert.
  • the distribution of the P SA values in the three collectives is shown in Table 3. 90% of healthy people, 38% of BPH patients and 16% of carcinoma patients were below the usual cut-off value of 4 ng PSA / mL. Subjects with a PSA above the cut-off are given further examinations; while those whose PSA levels are below the decision value are considered prostate healthy.
  • PSA-ACT limit of 3 ng / ml is used instead of PSA 4 ng / ml, 90% of healthy people are below this value, but in this case 3 additional prostate carcinoma patients are correctly recognized (see Table 4).
  • reagent 1 40 mmol / 1 sodium phosphate buffer, pH 7.4 / 0.2% (w / v) bovine serum albumin / 1.2 ⁇ g / ml bio tinylated monoclonal anti-PSA antibody MIO, Fab fragment, incubated in streptavidin-coated Enzymun ® universal tubes and then washed.
  • reagent 2 40 mmol 1 sodium phosphate buffer, pH 7.4 / 0.2% (w / v) bovine serum albumin / 0.1% bovine IgG / monoclonal anti-PSA-ACT antibody, clone 4.6.374, (Fab) 2 '-POD conjugate, 95 mU / ml
  • the color development was carried out with 700 ⁇ l substrate solution (1 mg / ml ABTS ® / 0.5 mg / ml sodium perborate / citrate-phosphate buffer) for 30 min and was measured at 422 nm in the photometer.
  • the PSA-ACT contents were measured in 40 sera from healthy women and in 18 sera from patients with various inflammations.
  • the PSA-ACT level was on average 0.01 ng / ml ( ⁇ 0.03 ng / ml standard deviation), while in the inflammatory group on average 0.03 ( ⁇ 0.04) ng PSA-ACT / ml was found.
  • t PSA and f PSA were determined using the respective Enzymun ® tests and PSA-ACT according to Example 5.
  • the PSA content was below 20 ng / ml in both groups.
  • an ROC evaluation was carried out (Zweig, MH, Clin. Chem. 39 (1993) 561-577: "Receiver-Operating Characteristic (ROC) Plots: A Fundamental Tool in Clinical Medicine ”) and the corresponding values for sensitivity and specificity can be read from the respective curves.
  • the area under the ROC curve was calculated, which is a measure of the discriminatory ability of a parameter to differentiate between the corresponding tumor and benign disease population. The larger this area, the more likely it is that an unknown sample will be correctly assigned.
  • the sensitivity of the detection of prostate carcinoma to benign prostatic hyposplasia with the same specificity of 95% when measuring the PSA-ACT was 40% compared to 29% for t PSA.
  • the area under the curve also increased from 0.709 to 0.748 if you look at PSA-ACT instead of t PSA.
  • the third can be calculated after measuring the first two parameters and this result can be compared with the measured values of the third parameter. After determining t PSA and f PSA with the respective Enzymun ® tests, their difference was calculated and the correlation with the PSA-ACT measured according to Example 5 was determined.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper gegen einen Komplex aus humanem ACT und einer Serinprotease, bevorzugt ACT-PSA, die im wesentlichen keine Kreuzreaktivität zu freiem, nicht komplexiertem humanem ACT und freiem, nicht komplexiertem PSA aufweisen, sowie diagnostische Testverfahren zum Nachweis von Serinprotease-ACT-Komplexen, insbesondere PSA-ACT, unter Verwendung dieser mono-klonalen Antikörper.

Description

Monoklonale Antikörper gegen einen Komplex aus humanem ACT und einer Serinprotease
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind monoklonale Antikörper (MAK), die spezifisch einen Komplex aus αl-Antichymotrypsin (ACT) und einer Serinprotease, insbesondere Prostata-spezifisches Antigen (PSA) binden und im wesentlichen keine Kreuzreaktivität zu nicht komplexiertem ACT und nicht komplexierten Serinproteasen aufweisen. Diese mono- klonalen Antikörper können zum Nachweis von ACT-Serinproteasen-Komplexen insbesondere von PSA-ACT verwendet werden.
Das Prostata-spezifische Antigen ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 33 kDa. Es wird in den Prostataepithelzellen gebildet und ist ein Bestandteil der Samenflüssig- keit. PSA hat die enzymatische Aktivität einer neutralen Serinprotease.
Die Hauptfunktion des PSA besteht in der Spaltung der Se inogeline I und II sowie des Fibronektins, gelartiger Proteine, die als wesentliche Komponenten des Ejakulats die Beweglichkeit der Spermien blockieren. Durch die Hydrolyse dieser Proteine bewirkt PSA die Verflüssigung des Samenkoagulums und ermöglicht so die Mobilität der Spermien.
Das enzymatisch aktive PSA wird im Serum durch verschiedene Inhibitoren, sog. S erpine (= Serinproteaseninhibitoren) durch Bildung von kovalenten Komplexen inaktiviert. Die Hauptmenge des immunologisch nachweisbaren PSA ist im Serum an αl-Antichymotrypsin (zu 60-95 % ) gebunden. Weitere Komplexe werden mit α2-Makroglobulin, αl-Anti- trypsin, Inter-α- Trypsininhibitor und Protein C-Inhibitor gebildet. Daneben kommt noch ein enzymatisch inaktives PSA vor, das nicht mehr mit Serpinen komplexiert. αl-Antichymotrypsin ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 69 kDa und einem Kohlenhydratanteil. Als eine der Hauptinhibitoren in der akuten Phase spielt ACT eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Entzündungen. ACT bildet auch Komplexe mit Chymotrypsin,Cathepsin G und glandulärem Kallikrein hK2. ACT kommt im Humanserum in 10.000-fach höherer Konzentration vor als PSA ( auf molarer Basis ).
Der PSA-ACT-Komplex ist neben freiem PSA die Hauptform des immunologisch nachweisbaren Gesamt-PSA im Serum. Prostatakrebs fuhrt in vielen Fällen zu einer Erhöhung des Serum-PS A-Spiegels. Da sich jedoch auch bei benigner Prostatahyperplasie leicht erhöhte PSA-Serumwerte finden, ist PSA vor allem im niedrigen Konzentrationsbereich kein krebsspezifischer Marker. Bei den bisher erhältlichen Screeningtests auf das mögliche Vorliegen eines Prostatacarcinoms in einem Patienten handelte es sich immer um Tests zum Nachweis von totalem PSA. Da PSA im Serum von männlichen Personen normalerweise in sehr niedrigen Konzentrationen vorkommt, muß in einem solchen Test ein sogenannter „Cut-Off' definiert werden. PSA-Werte die über diesem Cut-Off liegen, werden als Hinweis auf das Vorliegen von Prostatacarcinom gewertet. Da die PSA-Konzentration mit zunehmendem Alter der Patienten steigt, wurden bisher bei dem Test zum Nachweis des totalen PSA Cut-Off Werte von 4 bis 6 ng/ml benutzt. Das hatte zur Folge, daß einige Patienten, die ein Prostatacarcinom im Frühstadium besaßen, nicht in diesen Screeningtesten erfaßt wurden.
Bereits in der japanischen Offenlegungsschrift 62-46263 wurde gefunden, daß bei Patienten mit malignem Prostatatumor erhöhte Werte an komplexiertem PSA, im Vergleich zu Patienten mit benigner Prostatahyperplasie auftreten. In dieser Offenlegungsschrift wurde ein Immunoassay beschrieben, der durch die Kombination eines Antikörpers gegen γ-Semino- protein (γ-Seminoprotein ist identisch mit PSA; siehe Schaller et al., Eur. J. Biochem. 170, 1987, 111-120 und Nakamura, Cancer 74, 1994, 1655-1659) und eines Antikörpers gegen αi-Antitrypsin nachweist. In der WO 92/01936 wird eine Methode zum Nachweis von PSA-ACT beschrieben, bei der eine Kombination des Antikörpers 2E9, der unkomplexiert.es PSA und auch PSA im Komplex mit ACT bindet, und eines Antikörpers gegen ACT eingesetzt wird.
Es existieren weiterhin diagnostische Tests zum Nachweis von freiem, nicht komplexiertem PSA und Gesamt-PSA, d.h. der Summe aus freiem und komplexiertem PSA. Alle diese Tests enthalten Antikörper, die im Falle des Nachweises von freiem PSA nur PSA in nicht komplexierter Form oder im Falle des Nachweises von Gesamt-PSA PSA in komplexierter und freier Form erkennen.
Der Nachweis von ACT in komplexierter Form mit Serinproteinasen, insbesondere der Nachweis von PSA-ACT gelang, wie oben beschrieben, bisher nur mit Hilfe eines Sandwich-Testes mit zwei Antikörpern, wovon der eine Antikörper gegen PSA und der andere Antikörper gegen ACT gerichtet war. Da ACT in Humanserum in ca. 10.000-fachem Überschuß gegenüber PSA, und somit auch dem Komplex aus PSA und ACT vorkommt, ist es nicht auszuschließen, daß durch diesen hohen Überschuß an ACT der Test negativ gestört wird. Insbesondere ist es unerläßlich, bei diesen bisher bekannten Tests zum Nachweis von PSA-ACT mindestens einen Waschschritt zum Entfernen von überschüssigem ACT vor der Zugabe des ACT-spezifischen Antikörpers in das Testprozedere einzufügen. Eine Ein- schrittestführung, die bei vielen automatisierten diagnostischen Tests angestrebt wird, ist damit nicht möglich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, einen verbesserten Test zum Nachweis von PSA-Serinproteasen, insbesondere PSA-ACT bereitzustellen, der möglichst nicht durch die im Serum vorkommenden hohen ACT-Konzentrationen gestört wird, und der es erlaubt, ein möglichst sensitives Screening zum Nachweis eines Prostatacarcinoms durchzufuhren.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen monoklonalen Antikörper gegen einen Komplex aus humanem ACT und einer Serinprotease der im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit freiem, nicht komplexiertem humanem ACT und freien, nicht komplexierten Serinproteasen aufweist. Insbesondere wurde die Aufgabe gelöst durch einen MAK gegen einen Komplex aus ACT und einer Serinprotease, der im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit freiem humanem ACT und freien Serinproteasen aufweist, und der eine wesentlich höhere Affinität und Spezifität zu PSA-ACT als zu anderen Serinprotease-ACT-Komplexen, insbesondere zu Chymotrypsin-ACT und Cathepsin-G-ACT aufweist.
Der monoklonale Antikörper kann in allen dem Fachmann geläufigen Tests zum Nachweis eines Proteins verwendet werden. Bei der bevorzugten Testfuhrung mit zwei Antikörpern (Sandwich-Test) kann der Test einstufig, also ohne zusätzlichen Waschschritt zum Entfernen des überschüssigen ACT durchgeführt werden. Besonders für Screeningtests, bei denen eine Vielzahl von Proben in möglichst rascher Folge getestet werden sollen, ist dies ein entscheidender Fortschritt gegenüber den bisher möglichen Tests, die alle einen Waschschritt zum Entfernen des überschüssigen ACT enthielten.
Die erfindungsgemäßen monolonalen Antiköφer gegen einen Komplex aus humanem ACT und einer Serinprotease besitzen im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit freiem humanem ACT und freien Serinproteasen. Unter im wesentlichen keine Kreuzreaktivität wird eine Kreuzreaktivität verstanden, die im Test zum Nachweis des Komplexes ACT- Serinprotease keine Beeinflussungen durch freies ACT oder freie Serinprotease bewirkt. Wie hoch die noch tolerierte Kreuzreaktivität gegen einzelne Komponenten sein kann, hängt davon ab, in welcher Konzentration diese Komponente im Humanserum vorkommen kann. Da ACT in einem sehr großen Überschuß vorkommt, darf in diesem Fall die Kreuzreaktivität nur verschwindend gering, d.h. weit unter 1% liegen. Im Falle der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper konnte mit den zur Verfugung stehenden Methoden keine Kreuzreaktivität nachgewiesen werden. Zum Nachweis der Kreuzreaktivität wurde das BIAcore®-System der Firma Pharmacia benutzt. Antiköφer mit einer Afϊinitätskonstante von weniger als 10s 1 mol zu den getesteten Substanzen zeigten keine nennenswerte Bindung und damit keine nachweisbare Kreuzreaktivität in diesem System. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer zeigten gegenüber nicht komplexiertem PSA, Chymotrypsin und Cathepsin G im BIAcore® keine Kreuzreaktivität. Um die Kreuzreaktion mit allen in humanem Serum vorkommenden, möglicherweise störenden Substanzen zu übeφrüfen, wurde für diesen Fall dem Screening-Test humanes Serum zugesetzt. Damit keine ACT-PSA-Komplexe vorhanden sind, wurde ein humanes, weibliches Serum benutzt. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer zeigen keine nachweisbare Kreuzreaktivität mit anderen in diesem Serum vorkommenden Bestandteilen.
Da PSA-ACT den klinisch relevantesten Serinproteasen- ACT-Komplex darstellt, besitzen die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer insbesondere eine höhere Affinität und Spezifität zu PSA-ACT als zu den anderen Serinprotease-ACT-Komplexen. Bevorzugt ist die Affinität zu PSA-ACT mindestens lOfach höher, besonders bevorzugt 50fach oder höher. Mittels dieser spezifischen monoklonalen Antiköφer gegen PSA-ACT ist es möglich, einen Einschrittest zum Nachweis von PSA-ACT zu gestalten, der durch das nicht komplexierte PSA undACT nicht oder nicht klinisch signifikant gestört wird.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer besitzen bevorzugt eine Affinität zu PSA- ACT von mindestens 107 1/mol, besonders bevorzugt von mindestens 109 l/mol. Bei einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer konnte sogar eine für monoklonale Antiköφer ungewöhnlich hohe Affinität von 1010 l/mol festgestellt werden. Solche hochaffinen monoklonalen Antiköφer gegen PSA-ACT sind hervorragend für Einschritteste geeignet, bei denen gewöhnlich eine relativ kurze Inkubation der Probe mit dem monoklonalen Antiköφer erfolgt. Die Bindung dieses hochaffinen monoklonalen Antiköφer an PSA-ACT erfolgt sehr rasch.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer können allen möglichen Ig-Klassen angehören. Bevorzugt gehören die monoklonalen Antiköφer der IgGl-Klasse an. Die Kopplung von weiteren Komponenten wie beispielsweise Bindepartner zur Bindung des Antiköφers an eine Festphase bei heterogenen Immunoassays, oder beispielsweise Markierungen wie Enzyme usw. kann bevorzugt an IgGl-Antiköφern erfolgen. Auch die Spaltung zu Anti- köφer-Fragmenten ist bei der IgGl-Klasse unproblematisch. Erfindungsgemäß wird unter der Bezeichnung monoklonaler Antiköφer sowohl der vollständige Antiköφer als auch alle bei Immuntests und sonstigen Verwendungen gängigen Fragmente davon, wie F(ab')2 und Fab-Fragmente verstanden. Umfaßt sind auch solche Antiköφer, die durch Veränderung der monoklonalen Antiköφer hergestellt wurden, solange die Antigenbindeeigenschaft nicht entscheidend beeinflußt wurde. Beispielsweise können durch gentechnologische Maßnahmen Teile der normalerweise in Mäusen hergestellten monoklonalen Antiköφer durch entsprechende humane Antiköφersequenzen ersetzt werden, um unspezifische Bindungen im Immunoassay zu minimieren. Verfahren zur Herstellung solcher chimären monoklonalen Antiköφer sind dem Fachmann beispielsweise aus Antibody Engineering, J. Mc Cafferty, H.R. Hoogenboom und DJ. Chiswell, The Practical Approach Series, Series Editor: B.D. Harnes, Oxford University Press, 1996 bekannt.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer können beispielsweise aus den Zellinien MAK<PSA-ACT>M 4.6.374, MAK<PSA-ACT>M 4.3.2 und MAK<PSA-ACT>M 6.13.64, hinterlegt am 19.9.1996. bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig) hergestellt werden. (MAK<PSA-ACT>M 4.6.374 = DSM ACC 2281; MAK<PSA-ACT>M 6.13.64 = DSM ACC 2282; MAK<PSA-ACT>M 4.3.2 = DSM ACC 2283).
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Antiköφer bevorzugt monoklonale Antiköφer, die in äquivalenter Weise an Serinproteasen-ACT-Komplexe binden, wie die monoklonalen Antiköφer 4.6.374, 4.3.2 und 6.13.64. Unter in äquivalenter Weise binden wird verstanden, daß diese Antiköφer das gleiche Epitop wie die hinterlegten monoklonalen Antiköφer erkennen. Dies kann beispielsweise durch Multi Binding- Versuche am BIAcore® festgestellt werden.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer können in an sich bekannter Weise durch Immunisierung mit PSA-ACT humanen Ursprungs in geeigneten Versuchstieren und anschließender Fusion der Milzzellen der immunisierten Tiere mit Myelomzellen hergestellt werden. Die Ausbeute an Serinproteasen-ACT spezifischen monoklonalen Antiköφer war jedoch sehr gering. Durch die Verwendung von ausschließlich weiblichen Versuchstieren konnte die Ausbeute an PSA-Serinprotease-spezifischen Antiköφern erhöht werden. Selbst hier besaßen noch cirka 70% der monoklonalen Antiköφer eine hohe Kreuzreaktivität zu ACT und ca. 30% eine hohe Kreuzreaktivität zu PSA. Weit unter 1% der insgesamt erhaltenen Antiköφer besaßen die erforderliche Spezifität für den Serinprotease-Inhibitor- Komplex bzw. den PS A-ACT-Komplex.
Neben Milzzellen als Lymphozyten-Quelle können auch PBL ( Periphere Blut Lymphozyten ) oder Lymphknoten-Zellen von immunisierten Tieren (bevorzugt der Maus und der Ratte) verwendet werden.
Alternativ können auch Lymphozyten (PBL, Milzzellen, Lymphknoten-Zellen) von humanen Spendern (wie Prostata-Tumor-Patienten, laktierenden Frauen, Patienten mit PSA-sezernierenden Zellen / Geweben ), die Antiköφer oder Auto-Antiköφer gegen PSA- ACT entwickelt haben, immortalisiert werden. Solche anti-PS A-ACT-produzierende Lymphozyten können entweder durch Fusion mit einer humanen Myelomlinie oder durch EB V ( Epstein Barr - Virus ) -Transformation zu Antiköφer-produzierenden Hybridoma- Zellen immortalisiert werden (Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology, A. M. Campbell, Elsevier Verlag 1991; Monoklonale Antiköφer, J.H. Peters, H. Baumgarten, Springer Verlag 1990; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, ed. Lawrence B. Schook, Marcel Dekker Verlag 1987).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer zum Nachweis von Serinprotease-ACT-Komplexen, insbesondere von PSA-ACT in Proben, bevorzugt humanen Proben wie beispielsweise Plasma, Serum, Blut, Seminalflüssigkeit, Prostata-Flüssigkeit, Seminal-Vesikel-Flüssigkeit, Speichel, Liquor, Frauen-Milch, Zysten, Gewebe-Homogenate, Gewebeschnitte, Biopsiematerial.
Da die erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer spezifisch den Komplex aus Serinproteasen und humanem ACT erkennen, wobei davon auszugehen ist, daß alle erfindungsgemäßen MAK ein Epitop erkennen, das nur in diesem Komplex, nicht jedoch in freien Serinproteasen und freiem humanem ACT vorkommt, ist es möglich, alle gängigen Test- konfigurationen, die zum Nachweis eines Proteins geeignet sind, zu verwenden. Der Fachmann ist daher nicht mehr wie bisher ausschließlich auf einen Zweischritt-Sandwichassay beschränkt, der zudem vor der Inkubation des humanen ACT-spezifischen Antiköφers einen Waschschritt unbedingt beinhalten mußte.
Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung eines Komplexes aus humanem ACT und Serinproteasen durch Inkubation der Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer. Alle gängigen, dem Fachmann geläufigen Methoden zum Nachweis eines Proteins, wie beispielsweise kompetitive Teste nach dem IEMA-Prinzip oder direkte Teste wie Sandwich-Teste, sind geeignet. Neben heterogenen Testen bei denen die Assaykomponenten an eine Festphase gekoppelt sind und eine Trennung von fester und flüssiger Phase erfolgt, können auch homogene Teste, die zum Nachweis eines Proteins geeignet sind, verwendet werden. Beispiele hierfür sind nephelometrische oder turbidimetrische Tests wie Latexagglutinationstests oder TINIA (turbidimetrische Inhibitions-Immunoassays). Neben den sogenannten Naßtesten, bei denen die Testreagenzien in flüssiger Phase vorliegen, können auch alle gängigen Trockentestformate, die zum Nachweis eines Proteins geeignet sind, verwendet werden. Bei diesen Trockentests oder Teststreifen sind die Testkomponenten auf einem Träger aufgebracht. Solche Trockentests sind beispielsweise beschrieben in EP-A 0 186 799.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Test zum Nachweis von PSA-ACT durch Inkubation der Probe mit einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer, der eine höhere Affinität zu PSA-ACT als zu den anderen Serinproteasen- ACT-Komplexen aufweist. Bevorzugt besitzt dieser MAK eine mindestens 10- besonders bevorzugt eine mindestens 50fache höhere Affinität zu PSA-ACT.
Bei Verwendung einer Kombination aus mehreren Antiköφern im Test, von denen einer ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antiköφer ist, ist es möglich, PSA-ACT spezifische Teste auch bei Verwendung eines monoklonalen Antiköφers, der alle Serinproteasen- ACT- Komplexe etwa gleich gut erkennt, zu gestalten. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von PSA-ACT durch Inkubation der Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antiköφer und einem Antiköφer, der gegen PSA gerichtet ist. Solche PSA spezifischen Antiköφer sind bekannt und werden bereits seit 1985 in diagnostischen Tests zum Nachweis von PSA bzw. γ-Seminoprotein eingesetzt. Durch die Kombination dieser beiden Antiköφer wird PSA-ACT spezifisch nachgewiesen. Welcher der beiden Antiköφer bei dem in diesem Fall üblichen Sandwich-Test in markierter Form oder an die Festphase gebunden vorliegt, ist gleich.
Anstelle des monoklonalen Antiköφers spezifisch für den Komplex aus ACT und einer Serinprotease, insbesondere des ACT-PSA-Komplexes ist es auch möglich, einen Rezeptor für PSA-ACT in Kombination mit dem Antiköφer gegen PSA einzusetzen. PSA gehört zur Familie der Kallikreine, einer Proteasegruppierung, die hohe Homologien untereinander aufweisen. Sie werden von Inhibitoren, den sogenannten Seφinen (Serine Protease Inhibitors) gebunden, zu denen ACT gehört. Diese PSA-Seφin-Komplexe besitzen ein Epitop, ein sogenanntes Neo-Epitop, das auf den freien Inhibitoren, die keine Protease gebunden haben, nicht vorhanden ist. Die Eliminierung dieser PSA-ACT-Komplexe bzw. allgemein der Kallikrein-Seφin-Komplexe aus der Blutzirkulation erfolgt über Rezeptoren, die dieses Neo-Epitop erkennen. Das Neo-Epitop ist beispielsweise beschrieben in Perlmutter et al., J. Biol. Chem. 265, No. 28, 16713-16716, 1990; Perlmutter et al., Proc. Natl. Acac. Sei. USA, 87, 3753-3757, 1990 und Joslin et al, J. Biol. Chem. 268, No. 3, 1886-1893, 1993. Die Rezeptoren für PSA-ACT bzw. Kallikrein-Seφine wurden bei Hep G2-Zellen nachgewiesen (Joslin et al. 1993) und können hieraus isoliert werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von PSA-ACT durch Inkubation der Probe mit einem Rezeptor von PSA-ACT, der das oben näher beschriebene Neo-Epitop bindet, und einem Antiköφer bevorzugt einem monoklonalen Antiköφer, der gegen PSA gerichtet ist. Ob der Rezeptor oder der Antiköφer in markierter Form oder an die Festphase gebunden vorliegt, ist dabei gleich.
Zur Herstellung der Seφin-Protease-Rezeptoren werden zunächst Zellen gezüchtet, die den gewünschen Rezeptor exprimieren. Der Nachweis des Rezeptors erfolgt beispielsweise mit einem Zeil ELISA wie von Hashemi et al., J. Lab. Clin. Med. 109 (1987), 434-440 beschrieben. Hierzu werden Hep G2 Zellen in Flachbodenkulturgefäßen (Costar) in einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml ausgesäht. Als Kulturmedium wird D'MEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) genutzt. Die Hep G2 -Zellen werden bis zu 70 % Gesamtmenge wachsen und anschließend unfixiert gelassen. ACT-PSA (Scripps Laboratories) wird bis zu einer Endkonzentration von lOμg/ml in D'MEM/1 % RSA zugefügt und zum Komplexieren mit dem Rezeptor für 10 Minuten bei 4°C stehengelassen. Nach zweimaligem Waschen mit D'MEM/1% RSA werden die Zellen mit einem anti PSA monoklonalen Antiköφer, der mit Peroxidase markiert ist (1 U/ml) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen zweimal mit D'MEM/1% RSA gewaschen. Zur Detektion werden die Zellen mit Substrat (TMB) inkubiert.
Zur Isolierung des Rezeptors werden Hep G2-Zellen, die eine hohe Expression des Rezeptors zeigen, in T 150 Kulturflaschen gezüchtet und die sich gebildeten Zellschichten durch vorsichtiges Abschaben der Zellen geerntet. Zellen mehrerer Kulturgefäße werden vereint, um zu einer Gesamtmenge von 109 Zellen zu gelangen. Anschließend werden die Zellen durch Inkubation mit 1% Triton X100 in PBS lysiert. Nach Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 Minuten, wird der Zellüberstand separiert und das Präzipitat mit den Kern- und Zellmembranfraktionen in 1 M Natriumchlorid in PBS resuspendiert. Nach Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 Minuten wird der Zellüberstand gesammelt und bei -20°C aufbewahrt. Diese Rezeptoφräparation kann für die Charakterisierung des Rezeptors in ELISA- Verfahren eingesetzt werden. 20 μg dieses rohen Rezeptorextraktes wird auf Flachboden-Mikro- titeφlatten für 1 Stunde bei Raumtemperatur beschichtet. Nach Waschen mit PBS/0,1 % Tween®20 und Nachbeladen mit PBS/1% RSA wird der PSA-ACT-Komplex zugegeben und die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden gewaschen und danach mit einem Peroxidase-markierten anti-PSA Antiköφer inkubiert. Die gebundene Peroxidase-Aktivität wird danach mit einem geeigneten Peroxidase-Farbsubstrat beispielsweise ABTS® nachgewiesen.
Zur weiteren Aufreinigung des rohen Rezeptorextraktes wird eine hydrophobe Chromatographie durchgeführt. Die Aktivität der einzelnen Fraktionen wird, wie oben beschrieben, mit einem ELISA nachgewiesen und die Fraktionen mit Rezeptoraktivität vereinigt. Anschließend wird der NH2-Terminus des Rezeptormoleküls nach bekannten Methoden an- sequenziert und die cDNA aus einer Genbank gefischt. Hierzu wird die aufgereinigte Re- zeptoφreparation zunächst durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteinbanden werden ausgeschnitten und eluiert. Die Rezeptoraktivität der einzelnen Bande wird mittels eines Zell- ELISA durch Kompetition nachgewiesen. Der NH2-Terminus der aktiven Bande wird anschließend mittels bekannter Methoden ansequenziert. Aus der Aminosäuresequenz wird die Nukleinsäuresequenz abgeleitet und entsprechende Oligoprimer synthetisiert. Ein zweiter degenerierter Primer aus der nicht translatierten Region vor der poly A-Region wird ebenfalls zur PCR Amplifikation genutzt, wobei Hep G2 DNA als Template genutzt wird. Mit Hilfe der amplifizierten Sequenz (ca 45 Nukleotide) werden positive Klone identifiziert und aufgereinigt. Die DNA wird durch Restriktionsanalyse und Southern Blots charakterisiert. Ein EcoRI-Xbal Fragment wird in Bluescript SK subkloniert. Die Sequenzanalyse des Klons und die Ableitung der Aminosäuresequenz beweist die Rezeptorspezifität. Mit Hilfe dieses Oligonukleotids wird eine DNA in einer cDNA Bank beispielsweise von foetaler Leber in λDR2 (Clontech Cat. No. HL 115 lx) identifiziert, die mit der Rezeptorsequenz korreliert. Die identifizierten Klone werden aufgereinigt und mit Primern aus der Nähe der B AMHI-Xbal Region in λDR2 mit PCR analysiert. Die Phagensuspension wird als Template genutzt. Das Plasmid pDR2 wird isoliert und einer Restriktionsanalyse mit B AMHI und Xbal unterzogen. Das doppelsträngige DNA-Insert wird mit einem Auto- sequenzer (ABI 373) sequenziert nach Standardvorschriften für Farb-markierte Di- desoxynukleosid-Triphosphatterminatoren und „walking primer" (Sanger et al., PNAS (1977) 74, 5463-5467).
Danach wird die Rezeptor-DNA isoliert und ein Expressionssystem konstruiert. Hierzu wird die cDNA, die den offenen Leserahmen für den Rezeptor enthält, in das Plasmid pSV15.JD.LL zwischen den Restriktionsstellen Cla I und Sal I kloniert. Der Vektor pSV15.JD.LL.SERC wird erhalten.
a) Expression in E. coli
Das Plasmid enthält eine kurze Leader- Sequenz stromaufwärts des Rezeptorgens. Diese Leader- Sequenz erlaubt eine hohe Translationsrate und eine schnelle Aufreinigung. Nach Induktion des Tryptophan Promotors wird eine hohe intrazelluläre Produktion initiiert. Das Expressionsplasmid wird genutzt, um beispielsweise E. coli 44C6 mit Hilfe der CaCl2-Hitzeschock-Methode nach Mandel et al., J. Mol. Biol. 53 (1970), 159-162 zu transformieren. Die so transformierten Zellen werden bei 37°C in LB Medium mit 50 μg/ml Carbenicillin bis zu einer optischen Dichte von 2-3 bei 600 nm wachsen gelassen. Die Suspension wird 20fach mit M9 Medium mit 0,49 % Casaminosäuren und 50 μg/ml Carbenicillin verdünnt. Für eine Stunde wird bei 30°C und Belüftung weiterkultiviert und Indolyl-3-acrylsäure bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugegeben. Nach weiterem Kultivieren für 15 Stunden werden die Zellen geerntet.
b) Expression in CHO oder andere Sängerzellen
Das Plasmid wird mit Not I linearisiert und CHO Zellen durch Elektroporation (Andreason, J. Tissue Culture Meth. \5_ (1993), 56) transferiert. Die Zellen werden in DHFR Selektionsmedium transferriert. Nach 2 Wochen werden individuelle Klone in 96er Mikrotiteφlatten transferriert. Die Expression wird mittels kompetitivem ELISA gemessen.
c) Die Expression kann ebenfalls im Baculovirus-System nach bekannten Methoden erfolgen
Anschließend an die Expression des Rezeptors wird dieser isoliert, aufgereinigt, charakterisiert und die Verwendung als Bindepartner in einem Immunoassay evaluiert. Hierzu wird der Kulturüberstand der transfizierten CHO Zellen gesammelt und auf eine Cibachromblue-Sepharose-Säule /100 Volumenanteile Zellüberstand/ 1 Volumenanteil Säulenmaterial) aufgebracht. Die Säule wird mit 5 Volumenanteilen Applikationspuffer ohne Harnstoff und anschließend mit 10 mM Phosphatpuffer pH 7,4 mit 2 M Harnstoff (5 Volumenanteile) gewaschen. Der rekombinante Rezeptor wird mit 10 mM Phosphatpuffer pH 7,4, 2 M Harnstoff und 1 M NaCl eluiert. Die Rezeptor-enthaltenden Fraktionen werden auf eine Wheatgerm-Lectin-Säule aufgebracht. Nach Waschen mit 5 Volumentanteilen Applikationspuffer wird der Rezeptor mit 10 mM Phosphatpuffer pH 7,4, 2 M Harnstoff und 0,5 M N-Acetyl-D-Glucosamin eluiert.
Die vereinigten Rezeptor-haltigen Fraktionen werden auf 0,04 % Cι2E8 und 0,1 % TFA eingestellt. Mittels einer C4-Reversed-Phase-Säule werden die Proteine mit zwei konsekutiven linearen Acetonitrilgradienten (0-30 % und 30-60 % in 0,04 % Cι2Eg und 0,1 % TFA) separiert. Die Fraktionen werden mittels SDS-PAGE analysiert. Die Rezeptor-haltigen Fraktionen werden vereinigt und mit 2 Volumen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 und 150 M aCl verdünnt und gegen 6 Volumen des Verdünnungspuffers in einer Ultrafiltrationskammer (Anschlußgröße 30.000) dialysiert und konzentriert.
Das Konzentrat wird auf 0,01 % Tween®80 eingestellt und im selben Puffer zur Entfernung von Aggregaten und Bruchstücken mittels Gelchromatographie aufgereinigt. Die rezeptorhaltigen Fraktionen (Nachweis durch SDS-PAGE) werden sterilfiltriert (0,22 μ Filter) und bei 4°C aufbewahrt.
Der in E. coli exprimierte Rezeptor wird folgendermaßen isoliert. Die E. coli Zellen werden in 10 Volumen Puffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8) homogenisiert und 30 Minuten bei 5000 x g zentrifügiert. Die Zellen werden in 10 Volumen Puffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8) aufgenommen, beispielsweise durch einen Mikrofluidizer passiert und zentrifügiert. Das Zellpellet wird bei -70°C eingefroren oder direkt weiterverwendet.
Das Zellpellet wird in 20 mM Tris-HCl, 8 M Guanidinhydrochlorid und 25 mM DTT, pH 8 resuspendiert und zur Solubilisierung der Rezeptormoleküle 12 Stunden bei 4°C gerührt. Nach Solubilisierung wird die Lösung 30 Minuten bei 30.000 x g zentrifügiert. Der klare Zellüberstand wird gewonnen und diese Lösung auf einer G200 Sephadexsäule (Gelchromatographiesäule) in 20 mM Na-Phosphatpuffer mit 10 mMDTT, pH 6 aufgereinigt. Die rezeptorhaltigen Fraktionen werden vereinigt (Nachweis des Proteins über SDS-PAGE). Diese Fraktionen werden, wie oben beschrieben, an einer C4-Reversed- Phase-Säule aufgetrennt. Die rezeptorhaltigen Fraktionen werden wiederum vereinigt und der Rezeptor renaturiert. Hierzu wird die Lösung mit 9 Volumen Renaturierungs- Puffer (5 mMEDTA, 2 % CHAPS-Detergenz 25 % Glycerin, 5 mM oxidiertem Glutathion und 1 mM reduziertem Glutathion, pH 8,3) verdünnt und 4 Tage bei 4°C dialysiert. Nach Renaturierung wird die Lösung auf 0,2 % TFA eingestellt, durch einen 0,45 μ Filter filtriert und auf 10 % Acetonitrile eingestellt. Danach folgt eine C4- Reversed-Phase-Säule nach obigen Angaben. Die rezeptorhaltigen Fraktionen werden gegen einen isotonischen Puffer (10 mM Na-Phosphatpuffer, 150 mM NaCl und 0,01 % Tween®80, pH 74,) dialysiert und bei 4°C aufbewahrt.
Der so hergestellte rekombinante Rezeptor kann als Bindepartner, entweder wandgebunden oder markiert, zur Bestimmung von PSA-Seφin-Komplexen in Immunoassays eingesetzt werden, wie oben beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Tests zum Nachweis von PSA-ACT insbesondere die Einschritt- Tests eignen sich hervorragend zum Screenen einer großen Probenmenge, um einen Hinweis auf das Vorliegen eines Prostatacarcinoms zu erhalten. Es hat sich gezeigt, daß durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Tests der Cut-Off im Vergleich zum bisher üblichen Cut-Off bei Tests zum Nachweis des totalen PSA erniedrigt werden kann. Auch in Bereichen unter den bisher üblichen Cut-Off- Werten kann mit dem erfindungsgemäßen Test noch eine vergleichsweise sichere Differenzierung zwischen Normalpatienten und Risikopatienten gefunden werden. Gleichzeitig werden aber vermehrt auch Patienten erfaßt, die ein Prostatacarcinom im Frühstadium besitzen, die bei den bisher üblichen Tests nicht erfaßt wurden. Die Cut-Off- Werte bei dem erfindungsgemäßen Test liegen deutlich niedriger als die entsprechenden Cut-Off-Werte für totales PSA. Der Cut-Off-Wert für PSA-ACT liegt bei < 70 % des Cut-Off-Wertes für PSA, bevorzugt bei < 60 % (in ng/ml). Bei gleicher Spezifität (95 % gegen BPH) liegt der Cut-Off-Wert für totales PSA beispielsweise bei 10,05 ng/m, der Cut- Off-Wert für PSA-ACT bei 5,70 ng/ml.
Bei den Patienten, die Werte über dem Cut-Off dieses erfindungsgemäßen Tests besitzten, wird zur Unterscheidung von benignen Erkrankungen und Prostatacarcinomen ein zweiter Test zum Nachweis des freien PSA vorgenommen. Solche Tests sind bereits seit 1985 erhältlich. Das Verhältnis von freiem PSA zu PSA-ACT wird bestimmt. Liegt das Verhältnis oberhalb von 0,1 bis 0,17 so ist dies ein starkes Indiz für das Vorliegen eines Carcinoms.
Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand der vorliegenden Erfindung verdeutlichen.
Beispiel 1
Herstellung monoklonaler Antikörper gegen PSA-ACT
a) Immunisierung von Mäusen
12 Wochen alte, weibliche Balb/c-Mäuse werden mit 100 μg PSA-ACT (Fa. Centro, San Diego, Product Code CB 3075-01, Lot 50 10 70) zusammen mit dem Adjuvans CFA (Komplettes Freund' sches Adjuvans) intraperitoneal erstimmunisiert. Nach 6 Wochen folgen drei weitere Immunisierungen intraperitoneal in monatlichen Abständen. Dabei wird jeder Maus 100 μg PSA-ACT zusammen mit UFA (Inkomplettes Freund' sches Adjuvans) verabreicht. Anschließend erfolgen die letzten Immunisierungen intravenös mit je 100 μg PSA-ACT in PBS-Puffer am 3. und 2. Tag und letzten Tag vor der Fusion.
b) Fusion und Klonierung
Die Fusion von Milzzellen der gemäß a) immunisierten Mäuse mit Myelomzellen erfolgt in Anlehnung an Galfre, Methods in Enzymology 73, 1981, 3. Dabei werden ca. 1 x 108 Milzzellen der immunisierten Maus mit 2 x 107 Myelomzellen (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580) gemischt und abzentrifugiert (10 min bei 300 g und 4°C). Die Zellen werden dann einmal mit RPMI-1640-Medium ohne fötales Kälberserum (FKS) gewaschen und bei 400 g in einem 50 ml Spitzröhrchen erneut abzentrifugiert. Anschließend wird 1 ml PEG (Polyethylenglykol) (Molekulargewicht 4000, Merck, Darmstadt) dazugegeben, und durch Pipettieren gemischt. Nach 1 min im Wasserbad bei 37°C werden 5 ml RPMI 1640 ohne FKS zugetropft, durchmischt, auf 50 ml mit Medium (RPMI 1640 + 10% FKS) aufgefüllt und anschließend zentrifügiert. Die sedimentierten Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS aufgenommen und in Hypoxanthin- Azaserin-Selektions-Medium (100 mmol/1 Hypoxanthin, 1 μg/ml Azaserin in RPMI 1640 + 10% FKS) eingesät. Als Wachstumsfaktor wird dem Medium Interleukin 6 (100 U/ml) zugegeben. Nach ca. 10 Tagen werden die Primärkulturen auf spezifische Antiköφersynthese getestet (siehe Beispiele 2). Primärkulturen, die mit PSA-ACT eine positive Reaktion zeigen und mit nicht komplexiertem PSA und nicht komplexiertem ACT sowie mit allen anderen Serumbestandteilen keine Kreuzreaktion aufweisen, werden mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsorter in 96er-Zellkultuφlatten kloniert. Hierbei wird dem Medium als Wachstumszusatz Inter- leukin-6 (100 U/ml) zugegeben.
Auf diese Weise wurden die in Tabelle I aufgeführten, hinterlegten Zellinien / Klone erhalten.
Tabelle 1
Klon IgG- Subklasse
4. 3. 2 Ig Gl
6. 13. 64 Ig Gl
4. 6. 374 Ig Gl
c) Immunglobulingewinnung aus den Zellkulturüberständen
Die erhaltenen Hybridomzellen werden mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro ml in RPMI 1640-Medium mit 10% FKS eingesät und 7 Tage lang in einem Fermenter (Fa. Thermodux, Wertheim/Main, Modell MCS-104XL, Best.-Nr. 144-050) vermehrt. In dem Kulturüberstand werden Konzentrationen von durchschnittlich 100 μg monoklonaler Antiköφer je ml erreicht. Die Reinigung dieses Antiköφers aus dem Kulturüberstand erfolgt nach proteinchemisch üblichen Methoden (z.B. gemäß Methods in Enzymology 121 (1986), 587 - 695). Beispiel 2
Screening-Test auf anti-PSA-ACT-Antikörper
Streptavidin-beschichtete MTP werden mit „Fang-Antiköφern" beschichtet, die PSA und PSA-ACT binden. Danach erfolgt die Inkubation mit dem Analyten PSA-ACT (bei a)) oder PSA (bei b)). Danach erfolgt die Inkubation mit dem zu testenden anti-PSA-ACT-Anti- köφer. Abschließend werden die gebundenen Antiköφer mittels eines anti-Maus-IgG-POD in üblicher Weise durch Umsetzung eines Substrates nachgewiesen.
a) Bestimmung der Spezifität mit PSA-ACT
Um die Spezifität der Antiköφer im Kulturüberstand der Hybridomzellen zu bestimmen, werden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, Best.-Nr. 12-K 96 N, Charge MC 289) mit 10 μg/ml biotinyliertem Fab-Fragment des monoklonalen Antiköφers 1 oder des monoklonalen Antiköφers 2 (beide monoklonalen Antiköφer erkennen nicht komplexiertes PSA sowie PSA im Komplex) in PBS plus 0,5 % Crotein C beschichtet (100 μl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und anschließend 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05% Tween 20 gewaschen.
Danach wird mit 100 ng/ml PSA-ACT (Fa. Scripps, San Diego, Kat. Nr. P 0624, Charge 66 15 64 oder Fa. Centro, San Diego, Kat. Nr. CB 30 75 01, Charge 50 10 70) gelöst in PBS plus 0,5 % Crotein C inkubiert ( 100 μl pro well, 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur). Anschließend wird 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05%» Tween 20 gewaschen.
Im nächsten Schritt wird 100 μl der zu untersuchenden Antiköφer-Lösung ( im Kulturüberstand ) in ein beschichtetes well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9 % Natriumchlorid / 0,05% Tween 20 wird zum Nachweis von gebundenem Antiköφer aus der Probe jeweils 100 μl eines POD- markierten Fab-Fragments eines polyklonalen Antiköφers aus dem Schaf gegen Maus-Fcγ (Boehringer Mannheim GmbH, Ident.-Nr. 1431323, ensprechend 25 mU / ml) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 x mit 0,9% Natriumchlorid / 0,05% Tween® 20 gewaschen.
Schließlich werden jeweils 100 μl / well ABTS®-Lösung (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und 1204530) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.
b) Bestimmung der Reaktivität / Kreuzreaktion mit PSA
Um die Reaktivität / Kreuzreaktion mit PSA zu bestimmen wird im unter a) beschriebenen Test mit nicht komplexiertem PSA, statt mit PSA-ACT inkubiert.
Dazu werden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, Best. -Nr. 12-K 96 N, Charge MC 289) mit 10 μg/ml biotinyliertem Fab-Frag- ments des monoklonalen Antiköφers 1 oder des monoklonalen Antiköφers 2 (beide monoklonalen Antiköφer erkennen nicht komplexiertes PSA sowie PSA im Komplex) in PBS plus 0,5 % Crotein C beschichtet (100 μl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und anschließend 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05% Tween®20 gewaschen.
Danach wird mit 50 ng/ml PSA (Fa. Scripps, San Diego, Kat. Nr. P 0714, Charge 98 43 64 ) gelöst in PBS plus 0,5 % Crotein C inkubiert ( 100 μl pro well, 1 Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur). Anschließend wird 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05% Tween® 20 gewaschen.
Im nächsten Schritt wird 100 μl der zu untersuchenden Antiköφer-Lösung (im Kulturüberstand ) in ein beschichtetes well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9 % Natriumchlorid / 0,05% Tween® 20 wird zum Nachweis von gebundenem Antiköφer aus der Probe jeweils 100 μl eines POD- markierten Fab-Fragments eines polyklonalen Antiköφers aus dem Schaf gegen Maus-Fcγ (Boehringer Mannheim GmbH, Ident.-Nr. 1431323, ensprechend 25 mU / ml) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 x mit 0,9% Natriumchlorid / 0,05% Tween 20 gewaschen.
Schließlich werden jeweils 100 μl / well ABTS®-Lösung(Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und 1204530) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.
c) Bestimmung der Reaktivität mit ACT
Um die Reaktivität mit ACT zu bestimmen wird im unter a) beschriebenen Test der zu untersuchende Antiköφer mit ACT im Überschuß vorinkubiert. Bleibt das Meßsignal unverändert hoch, liegt keine Kreuzreaktion vor, ist das Meßsignal erniedrigt, liegt eine Kreuzreaktion vor.
Dazu werden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, Best.-Nr. 12-K 96 N, Charge MC 289) mit 10 μg/ml biotinyliertem Fab-Fragments des monoklonalen Antiköφers 1 oder des monoklonalen Antiköφers 2 (beide monoklonalen Antiköφer erkennen nicht komplexiertes PSA sowie PSA im Komplex) in PBS plus 0,5 % Crotein C beschichtet (100 μl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und anschließend 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05% Tween® 20 gewaschen.
Danach wird mit 100 ng/ml PSA-ACT (Fa. Scripps oder Fa. Centro) gelöst in PBS plus 0,5 % Crotein C inkubiert ( 100 μl pro well, 1 Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur). Anschließend wird 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05% Tween 20 gewaschen.
Der auf Kreuzreaktion zu prüfende Antiköφer wird mit einer Konzentrationsreihe von 0, 10 μg, 50 μg, 100 μg / ml ACT (Fa. Athens, Athen, Best. Nr. 16-16-012400, Charge AX 9501) vorinkubiert. Die Vorinkubation erfolgt in unbeschichteten 96er-MTP-wells für 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln.
Von dieser Lösung (Antiköφer + ACT im Überschuß) wird im nächsten Schritt 100 μl in ein beschichtetes well gegeben und 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9 % Natriumchlorid / 0,05% Tween 20 wird zum Nachweis von gebundenem Antiköφer aus der Probe jeweils 100 μl eines POD-markierten Fab-Fragments eines polyklonalen Antiköφers aus dem Schaf gegen Maus-Fcγ (Boehringer Mannheim GmbH, Ident.-Nr. 1431323 ensprechend 25 mU / ml) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 x mit 0,9% Natriumchlorid / 0,05% Tween® 20 gewaschen.
Schließlich werden jeweils 100 μl / well ABTS®-Lösung (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und 1204530) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.
d) Bestimmung der Reaktivität mit anderen Serumbestandteilen
Um die Reaktivität mit anderen Serumkomponenten zu bestimmen wird im unter a) beschriebenen Test der zu untersuchende Antiköφer mit humanen, weiblichen Seren vorinkubiert. Bleibt das Meßsignal unverändert hoch, liegt keine Kreuzreaktion vor, ist das Meßsignal erniedrigt, liegt eine Kreuzreaktion vor.
Dazu wurden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, Best.-Nr. 12-K 96 N, Charge MC 289) mit 10 μg/ml biotinyliertem Fab-Fragments des monoklonalen Antiköφers 1 oder des monoklonalen Antiköφers 2 (beide monoklonalen Antiköφer erkennen nicht komplexiertes PSA sowie PSA im Komplex) in PBS plus 0,5 % Crotein C beschichtet (100 μl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und anschließend 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05% Tween® 20 gewaschen. Danach wird mit 100 ng/ml PSA-ACT (Fa. Scripps oder Fa. Centro) gelöst in PBS plus 0,5 % Crotein C inkubiert ( 100 μl pro well, 1 Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur). Anschließend wird 3 x mit 0,9 % NaCl / 0,05% Tween® 20 gewaschen.
Der auf Kreuzreaktion zu prüfende Antiköφer wird mit einer Konzentrationsreihe ( 1 : 1 bis 1 : 10 ) von humanen, weiblichen Seren (einer Mischung von vier PS A-negativen Spenderinnen) vorinkubiert. Die Vorinkubation erfolgt in unbeschichteten 96er-MTP-wells für 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln.
Von dieser Lösung (Antiköφer + weibliche Humanseren) wird im nächsten Schritt 100 μl in ein beschichtetes well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9 % Natriumchlorid / 0,05% Tween® 20 wird zum Nachweis von gebundenem Antiköφer aus der Probe jeweils 100 μl eines POD-markierten Fab- Fragments eines polyklonalen Antiköφers aus dem Schaf gegen Maus-Fcγ (Boehringer Mannheim GmbH, Ident.-Nr. 1431323 ensprechend 25 mU / ml) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 x mit 0,9%o Natriumchlorid / 0,05% Tween® 20 gewaschen.
Schließlich werden jeweils 100 μl / well ABTS®-Lösung (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und 1204530) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.
Alle hinterlegten monoklonalen Antiköφer zeigten eine starke Reaktivität zu PSA-ACT. Mit diesen Testmethoden konnte bei keinem der hinterlegten monoklonalen Antiköφer eine klinisch relevante Reaktivität zu PSA, ACT und anderen Serumbestandteilen nachgewiesen werden. Die hinterlegten monoklonalen Antiköφer wurden bei einem Screening von mehreren tausend monoklonalen Antiköφer gefunden, von denen ca. 70% stark mit ACT und ca. 30% stark mit PSA kreuzreagierten. Beispiel 3
Bestimmung der Afϊinitätkonstanten sowie der Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und Dissoziation der produzierten Antikörper
Die Bestimmung der Affinitätkonstanten sowie der Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und Dissoziation der produzierten Antiköφer erfolgte mit BIAcore ® der Firma
Pharmacia Biosensor (BIA steht für Biospezifische Interaktions Analyse). Das Messprinzip beruht auf der "Surface Plasmon Resonance". Die Messung wird auf einem Biosensor, dem sog. Sensorchip durchgeführt. Hierbei wird auf die mit carboxmethyliertem Dextran beschichtete Oberfläche eines Sensorchips (CM5, Pharmacia Biosensor) ein polyklonaler Kaninchen-Antiköφer gegen den Fcγ-Teil von Maus-IgG über seine Aminogruppen ko- valent gekoppelt. Über diesen Sensorchip wird eine Lösung des zu bestimmenden Antiköφers geleitet, wobei der Antiköφer durch nichtkovalente Wechselwirkungskräfte an den immobilisierten Fangantiköφer gebunden wird. Im folgenden wird das zu untersuchende Antigen über den Sensorchip geleitet, welches dann durch ebenfalls nichtkovalente Wechselwirkungskräfte an den über den Fangantiköφer immobilisierten Antiköφer gebunden wird.
Durch die Bindung der einzelnen Komponenten erhöht sich die Massendichte auf der Oberfläche des Sensorchips, die vom Gerät in ein proportionales Messignal umgewandelt wird. Aus der zeitlichen Änderung des Signals, dem Sensorgramm, lassen sich die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und Dissoziation und daraus die Affinitäts-konstante berechnen.
Die Antiköφer-Antigen-Komplexe lassen sich ohne Beeinträchtigung der an die Oberfläche gebundenen Fangantiköφer mit einfachen Mitteln wieder ablösen, so daß an demselben Sensorchip weitere Bindungsexperimente unter identischen Randbedingungen durchgeführt werden können. Zur Kopplung des Fangantiköφers an den Sensorchip (CM5, Pharmacia Biosensor) wird eine Lösung des Antiköφers (BIA certified Rabbit anti Mouse Fcγ, Pharmacia Biosensor) mit einer Konzentration von 60 μg/ml in 10 mM Natriumacetat-Puffer pH 5.0 mit einer Flußrate von 5 μl/min über den zuvor mit NHS/EDC aktivierten Sensorchip geleitet.
Danach werden die Antiköφer zugegeben, so daß eine Zunahme der an die Oberfläche gebundenen Masse von mindestens 600 Resonanzeinheiten erfolgt. Die Bindung der Antigene an die Antiköφer werden bei einer Flußrate von 10 μl/min verfolgt und die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und der Dissoziation für die Bindung an die Antiköφer aus den Sensorgrammen mit Hilfe einer Software des Herstellers (BIAevaluation 2.1, Pharmacia Biosensor) berechnet. Die Affinitätskonstante berechnet sich nach Ka = kon/koff Die so ermittelten Werte der erfindungsgemäßen Antiköφer mit PSA-ACT, Chymotrypsin-ACT und CathepsinG-ACT als Antigene sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt. Sowohl mit nicht komplexiertem PSA, Chymotrysin, Cathepsin G als auch mit freiem humanem ACT als Antigen kann keine Bindung nachgewiesen werden, d.h. die Affinitats- konstante zu diesen Verbindungen ist kleiner als 10^ l/mol.
Tabelle 2
PSA-ACT Chymotrypsin-ACT CathepsinG-ACT
Klon kon koff Ka kon koff Ka kon koff Ka l/mol*s 1/s ymol l/mol*s 1/s l/mol l/mol*s 1/s l/mol
10
4.6.374 1*105 1*10'5 1*10 1*105 3*10"* 3*108 1*105 5*10"5 2*108
4.3.2 3*104 9* 10-4 4*107 8*104 3*10"3 3*107 1*105 1*10"3 9*107
6.13.64 5*104 2*10'3 2*107 1*105 3*10"3 3*107 1*105 2*10"3 8*107
4.1.358 5*104 6*10"3 9*106 5*104 6*103 9*106 8*104 2*10"3 5*107
4.9.358 5*104 6*10"3 9*106 5*104 6*10"3 9*106 8*104 2*10"3 4*107
Beispiel 4
Screening zum Nachweis eines Verdachts auf Prostatacarcinom
a) Screeningtest
Es wurden Kollektive aus 276 gesunden Männern, 456 Patienten mit benigner Prostata- hypeφlasie (BPH) und 348 Patienten mit nachgewiesenem Prostatacarcinom (PCa) untersucht.
Im Serum wurde das gesamte PSA mit dem Enzymun-Test PSA bestimmt. Außerdem wurde PSA-ACT gemessen, indem der Nachweisantiköφer des Enzymun-Test® PSA durch den für PSA-ACT spezifischen Antiköφer 4.6.374 (nach dessen POD-Markierung) ausgetauscht und sonst nach der Vorschrift des Beipackzettels verfahren wurde.
b) Ergebnis
Die Verteilung der P SA-Werte in den drei Kollektiven ist aus Tabelle 3 ersichtlich. Unter dem üblichen Cut-off-Wert von 4 ng PSA / mL lagen 90 % der Gesunden, 38 % der BPH- Patienten und 16 % der Carcinompatienten. Probanden, deren PSA- Wert über dem Cut-off liegt, werden weiteren Untersuchungen zugeführt; während diejenigen, deren PSA-Konzen- tration unter dem Entscheidungswert liegen, als Prostata-gesund betrachtet werden.
Verwendet man statt PSA 4 ng/ml die Grenze von PSA-ACT bei 3 ng/ml , so liegen wieder 90%o der Gesunden unterhalb dieses Wertes, während aber in diesem Fall 3 zusätzliche Prostatacarcinompatienten richtig erkannt werden (siehe Tabelle 4).
Durch den Austausch des Screeningparameters wurde also bei derselben Spezifität gegenüber dem Normalkollektiv eine höhere Sensitivität in der Carcinomgruppe erreicht. Tabelle 3
Cut-off: PSA 4 ng/ml
Figure imgf000029_0001
Tabelle 4
Cut-off: PSA-ACT 3 ng/ml
Gesunde BPH PCa
Gesamtzahl der Werte 276 456 348
Anzahl der Werte im Bereich
PSA-ACT < 3 ng/mL 248 158 51
PSA-ACT > 3 ng/mL 28 298 297
Anteil (%) der Werte im Bereich
PSA-ACT < 3 ng/mL 89,9 34,6 14,7
PSA-ACT > 3 ng/mL 10,1 65,4 85,3 Beispiel 5
Immunoassay zur Bestimmung von PSA-ACT
a) Durchführung des Immunoassays am ES 300 (Boehringer Mannheim GmbH)
50 μl Serumprobe bzw. PSA-ACT-Standard wurden für 1 Stunde mit 700 μl Reagenz 1 (40 mmol/1 Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 / 0,2 % (w/v) Rinderserumalbumin / 1,2 μg/ml bio- tinylierter monoklonaler anti-PSA-Antiköφer MIO, Fab Fragment, in Streptavidin-be- schichteten Enzymun®-Universaltubes inkubiert und anschließend gewaschen.
Danach wurden 700 μl Reagenz 2 (40 mmol 1 Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 / 0,2 % (w/v) Rinderserumalbumin / 0, 1 % Rinder-IgG / monoklonaler anti-PSA- ACT- Antiköφer, Klon 4.6.374, (Fab)2'-POD-Konjugat, 95 mU/ml) zugefügt und nach 30 min Inkubation gewaschen.
Die Farbentwicklung erfolgte mit 700 μl Substratlösung (1 mg/ml ABTS® / 0,5 mg/ml Natriumperborat/Citrat- Phosphatpuffer) während 30 min und wurde bei 422 nm im Photometer gemessen.
Fig. 1 zeigt eine typische Eichkurve.
b) Relevante Kreuzreaktionen im Test
In dem unter a) beschriebenen Testsystem wurde als Probe ein Frauenserum verwendet, in dem kein endogenes PSA meßbar war. Diesem Serum wurde in separaten Aliquots gereinigtes ACT (Fa. Serva) bzw. Chymotrypsin-ACT-Komplex (jeweils 50 μg/ml) zugesetzt. Dieselben Zusätze wurden einem Humanserum mit erhöhtem endogenen PSA-Gehalt zugefügt. Desweiteren wurde statt Serum eine Lösung von 22 ng/ml freiem PSA in Phosphatpuffer zum Test verwendet.
Die in diesen Proben gemessenen PS A-ACT-Gehalte sind aus Tabelle 5 ersichtlich. Die gemessene Kreuzreaktion für PSA und ACT im Test war in allen Fällen <0,003 % und keiner der Zusätze führte zu einem für die Beurteilung der Probe verfälschenden PSA-ACT-Er- gebnis.
c) Messung von Seren gesunder Frauen und von Frauen mit verschiedenen Entzündungen
Mit dem unter a) beschriebenen Test wurden die PSA-ACT-Gehalte in 40 Seren gesunder Frauen und in 18 Seren von Patientinnen mit verschiedenen Entzündungen gemessen. In der ersten Gruppe war der PSA-ACT-Spiegel im Mittel 0,01 ng/ml (± 0,03 ng/ml Standardabweichung), während bei der Entzündungsgruppe im Mittel 0,03 (± 0,04) ng PSA-ACT/ml gefunden wurde.
Dies belegt, daß andere ACT-Komplexe, z.B. das bei Entzündungen erhöhte Cathepsin G- ACT, oder andere natürlich vorkommende ACT-Protease-Komplexe, nicht zu Störungen im Test führen.
Tabelle 5
Figure imgf000031_0001
Beispiel 6
Sensitivität und Spezifität der Identifikation von Prostatacarcinom
In einem Kollektiv von 48 Seren von Patienten mit benigner Prostatahypeφlasie (BPH) und von 45 Patienten mit Prostatacarcinom wurde t PSA und f PSA mit den jeweiügen Enzymun®Tests und PSA-ACT nach Beispiel 5 bestimmt. Der PSA-Gehalt lag in beiden Gruppen unter 20 ng/ml. Um eine Aussage zur Diskriminierung des Prostatacarcinoms gegenüber BPH zu erhalten, wurde eine ROC- Auswertung durchgeführt (Zweig, M.H., Clin.Chem. 39 (1993) 561-577:"Receiver-Operating Characteristic (ROC) Plots: A Fundamental Tool in Clinical Medicine") und an den jeweiligen Kurven die korrespondierenden Werte für Sensitivität und Spezifität abgelesen. Außerdem wurde die Fläche unter der ROC-Kurve berechnet, die ein Maß für das Diskriminanzvermögen eines Parameters darstellt, zwischen dem entsprechenden Tumor- und benignem Erkrankungskollektiv zu unterscheiden. Je größer diese Fläche ist, desto wahrscheinlicher ist die korrekte Zuordnung einer unbekannten Probe.
Tabelle 6: Ergebnis der ROC- Auswertung.
Parameter Fläche unter Bei Spezifität 95% Kurve ergibt sich
Sensitivität (%) t PSA 0,709 29
PSA-ACT 0,748 40 fPSA 0,438 9
ROC-Auswertung im Bereich 0 - 20 ng PSA/ml BPH: n=48, PCa: n=45 Die Sensivität des Erkennens von Prostatacarcinom gegenüber der benignen Prostatahypeφlasie war bei derselben Spezifität von 95% bei Messung des PSA-ACT 40 % gegenüber 29 % bei t PSA. Auch die Fläche unter der Kurve erhöhte sich von 0,709 auf 0,748 wenn man statt t PSA das PSA-ACT betrachtet.
Die Messung von freiem PSA als singulärem Parameter erscheint wegen der niedrigen Sensitivität nicht sinnvoll. Die Fläche unter der f PSA-Kurve war ebenfalls deutlich niedriger als diejenigen der beiden übrigen Parameter.
Beispiel 7
Korrelation von berechneten und gemessenen PSA-ACT-Werten
Unter der Annahme, daß sich das immunologisch erfaßbare Gesamt-PSA aus den beiden Hauptkomponenten f PS A und PSA-ACT zusammensetzt, kann nach Messung der beiden ersten Parameter der dritte berechnet und dieses Ergebnis mit den gemessenen Werten des 3. Parameters verglichen werden. Nach Bestimmung von t PSA und f PSA mit den jeweiligen Enzymun®Testen wurde deren Differenz berechnet und die Korrelation zu dem nach Beispiel 5 gemessenen PSA-ACT ermittelt.
Tabelle 7: Korrelation von gemessenem und berechnetem PSA-ACT-Gehalt
Figure imgf000034_0001
Über alle 264 Werte stimmte der gemessene und berechnete PSA-ACT-Gehalt mit r=0,974 sehr gut überein und war in den Einzelgruppen überall größer als 0,946. Dies zeigt, daß der PSA-ACT-Test mit dem neuen monoklonalen Antiköper ein sehr plausibles Ergebnis erzielt.

Claims

Patentansprüche
1. Monoklonale Antiköφer gegen einen Komplex aus humanem ACT und einer Serinprotease, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit nicht komplexiertem humanem ACT und freien Serinproteasen nachweisbar besitzen.
2. Monoklonale Antiköφer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine höhere Affinität und Spezifität zu PSA-ACT als zu anderen Serinproteasen- ACT- Komplexen aufweist.
3. Monoklonale Antiköφer nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine mindestens lOfach höhere Affinität zu PSA-ACT als zu Chymotrypsin- ACT und Cathepsin-G-ACT aufweisen.
4. Monoklonale Antiköφer nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß sie keine Kreuzreaktivität zu anderen Bestandteilen in humanem Serum aufweisen.
5. Monoklonale Antiköφer nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie keine Kreuzreaktivität zu anderen Bestandteilen von Proben humanen Ursprungs wie Plasma, Serum, Blut, Seminalflüssigkeit, Prostata-Flüssigkeit, Seminal- Vesikel-Flüssigkeit, Speichel, Liquor, Frauen-Milch, Zysten, Gewebe-Homogenate, Gewebeschnitte und Biopsie-Material aufweisen.
6. Monoklonale Antiköφer nach einem der Ansprüche 1- 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Affinität zu PSA-ACT von mehr als 107 l/mol besitzen.
7. Monoklonale Antiköφer nach einem der Ansprüche 1- 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Affinität zu PSA von mehr als 109 l/mol besitzen.
8. Monoklonale Antiköφer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie von einer der Zellinien MAK<PSA-ACT>M 4.6.374, MAK<PSA-ACT>M 4.3.2 oder MAK<PS A-ACT>M 6.13.64 mit den Hinterlegungsnummern DSM ACC 2281, DSM ACC 2283 und DSM ACC 2282 produziert werden.
9. Antiköφer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in äquivalenter Weise binden, wie die monoklonalen Antiköφer, die von den Zellinien MAK<PS A-ACT>M 4.6.374, MAK<PSA-ACT>M 4.3.2 und MAK<PSA-ACT>M 6.13.64 mit den Hinterlegungsnummern DSM ACC 2281, DSM ACC 2283 und DSM ACC 2282 produziert werden.
10. Monoklonale Antiköφer nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß sie vom IgGl -Typ sind.
11. Monoklonale Antiköφer nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Immunisierung eines geeigneten Versuchstieres, anschließender Fusion der Milzzellen des immunisierten Tieres mit Myelomzellen erhalten wurden.
12. Verwendung der monoklonalen Antiköφer gemäß einem der Ansprüche 1-11, in einem diagnostischen Test zum Nachweis von PSA-ACT.
13. Verfahren zur Bestimmung eines Komplexes aus ACT und Serinproteasen durch Inkubation der Probe mit mindestens einem monoklonalen Antiköφer nach einem der Ansprüche 1-11.
14. Verfahren zur Bestimmung von PSA-ACT durch Inkubation der Probe mit mindestens einem monoklonalen Antiköφer nach einem der Ansprüche 2 oder 3.
15. Verfahren zur Bestimmung von PSA-ACT durch Inkubation der Probe mit mindestens einem monoklonalen Antiköφer nach einem der Ansprüche 1-11 und einem Antiköφer gegen PSA.
16. Sreeningtest zum Nachweis des Vorliegens eines Prostatacarcinoms, dadurch gekennzeichnet, daß in der Probe der Komplex aus humanem ACT und PSA durch Inkubation mit mindestens einem monoklonalen Antiköφer nach einem der Ansprüche 1 - 11 nachgewiesen wird und zum Ausschluß der nicht malignen Proben ein Cut-Off von 2,2 - 3,2 ng PSA-ACT/ml gesetzt wird.
17. Screeningtest nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Test zum Nachweis des Komplexes aus humanem ACT und PSA ohne Waschschritt zum Entfernen von überschüssigem ACT durchgeführt wird.
18. Verfahren zur Bestimmung von PSA-ACT durch Inkubation der Probe mit mindestens einem Rezeptor gegen das Neo-Epitop von PSA-ACT und einem Antiköφer gegen PSA.
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