WO1998023162A2 - Verfahren zur herstellung von frischhalte-backwaren - Google Patents

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WO1998023162A2
WO1998023162A2 PCT/EP1997/006331 EP9706331W WO9823162A2 WO 1998023162 A2 WO1998023162 A2 WO 1998023162A2 EP 9706331 W EP9706331 W EP 9706331W WO 9823162 A2 WO9823162 A2 WO 9823162A2
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WO
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enzyme
amylase
alpha
baked goods
dough
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Erwin Schuster
Bruno Sprössler
Jürgen HOFEMEISTER
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Roehm GmbH Darmstadt
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Roehm GmbH Darmstadt
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of baked goods from cereal products using enzymes, with the aim of preventing the baked goods from becoming stale.
  • the bread crust becomes leathery or rubbery.
  • Starch is an essential ingredient in baked goods; it is present in the dough in the form of grains coated with protein.
  • the starch is gelatinized by the baking process and absorbs a lot of water while the protein coagulates.
  • the firmness of the crumb increases, which is still perceived as an advantage in the first four hours.
  • the cutting ability and chewing properties improve for the time being. It is believed that the unbranched starch fraction, ie the amylose, crystallizes first, and with further storage the branched fraction of the starch, the amylopectin.
  • the crust loses its crust when stored. It is believed that recrystallization releases water, diffuses it outward from the crumb and moisturizes the crust. Therefore, the crust becomes tough and leathery.
  • the loss of flavor of the stale bread could be explained, among other things, by the inclusion of the flavoring substances in the starch helix.
  • the crumb is softer from the start.
  • Agents of choice are emulsifiers such as lecithin, lysolecithin, diacetyl tartaric acid esters or mono- and diglyceride esters, which are added to the dough and produce a particularly soft crumb structure from the start. It is also postulated that the mono- and diglyceride esters on the one hand absorb the water released during recrystallization, and on the other hand, by association with the amylose, disturb its recrystallization to such an extent that it can no longer run off completely.
  • fungal alpha amylase for example from Aspergillus oryzae
  • Aspergillus oryzae is also aimed in this direction. It attacks damaged starch grains, degraded this increases the viscosity of the dough and provides fermentable sugar. The result is a high volume of the finished baked goods, which goes hand in hand with a softer crumb: A particularly soft crumb does not allow the process of solidification as aging to be so clearly apparent.
  • enzymatic hydrolysis of the starch should take place at the gelatinization temperature, ie above about 70 ° C. These temperatures are easily reached and exceeded in the baking process.
  • the dilemma of the enzymatic treatment is, however, that only a partial hydrolysis may take place: not too little and not too high. If the degree of hydrolysis is too low, this does not lead to a fresh-keeping effect. It is given if, for example starch-splitting enzymes with too low thermal stability, such as the fungal alpha-amylase mentioned above. Here the enzyme has already lost its activity when the gelatinization begins in the course of the temperature load of the baking process, so that the hydrolysis of the starch is too low.
  • bacteria-alpha-Amy e.g. from Bacillus subtilis or Bacillus stearothermophilus leads to high degrees of hydrolysis. They are very thermostable and are hardly deactivated during the baking process, they even have an effect in the cooling phase. The result is an excessive degradation of the starch, which is expressed in a moist, sticky crumb. The desired partial hydrolysis of the starch is difficult to control by precise dosing of this enzyme alone.
  • No. 4,416,903 proposes to make the known fungal alpha-amylase usable for the purpose of keeping fresh by embedding it in a sugar medium stabilizing against thermal stress. The process does not require no emulsifier or added sugar and cannot be used for a number of baked goods where added sugar is undesirable.
  • PCT application WO 89/08403 also relates to the use of fungal alpha-amylase in fresh bread keeping.
  • acid-stable fungal alpha-amylase which in the slightly acidic medium of the dough still shows sufficient effect even at the elevated temperatures of the baking process, ie splits starch up to a certain degree of hydrolysis.
  • the enzyme is isolated from black spore Aspergillus strains and has a pH optimum of 3 to 5 at 60 to 70 ° C.
  • the enzymes should thus at least partially survive the baking process and are therefore still present in the finished baked goods in an active state. It is important in food technology that enzymes are present in the inactivated state in the ready-to-eat product, but this is not certain here and is a disadvantage. The effect of these enzymes is likely to be a quantitatively limited cleavage into the low-molecular fragments, which improve water retention and at the same time prevent the residual starch from recrystallizing. The reaction runs up to the beta limit dextrin and stops there. Another disadvantage is that the cleavage products are exclusively sugar, which is sometimes undesirable for reasons of taste.
  • EP 412 607 also proposes thermostable exoglucanases such as beta-amylases or amyloglucosidases to prevent staling. They can be supplemented or replaced by alpha-1,6-endoglucanases such as pullulanase.
  • the enzymes are effective between 80 and 95 ° C during baking and their inactivation at the end of the baking process it is not save. The choice of these specificities is intended above all to selectively hydrolyze the amylopectin component, and the reaction can also go beyond the limit dextrin. This also raises the problem of precise dosing of the enzyme.
  • the task to solve the bread freshness problem therefore consists in a targeted enzymatic partial hydrolysis of the starch.
  • the following requirements should also be met:
  • the enzyme addition should be dose tolerant
  • the cleavage products should cause the least possible change in taste, in particular they should not consist exclusively of sugar.
  • the object is achieved by using an alpha-amylase which differs from the prior art in origin, specificity and thermostability.
  • This alpha amylase is produced by Thermoactinomyces vulgaris. Production of the enzyme
  • Alpha-amylase from Thermoactinomyces vulgaris was disclosed in DD 288 395. Their production by fermentation of Thermoactinomyces vulgaris, as well as their use for the cleavage of starch to form hydrolysates which are rich in maitose and maltotrios, are described here.
  • the enzyme has an isoelectric point of 5.57. a pH optimum between 4 and 6 and a relatively low thermal stability. After 20 minutes of thermal exposure of the enzyme in aqueous solution at 70 ° C, no activity is found. Its split pattern is exceptional. It is described in DD 287 732: In the hydrolysis of native wheat starch, soluble products consisting of 4.3% glucose, 54.5% maltose, 20.5% maltotriose and the remainder soluble starch fragments are obtained. A characteristic of the alpha-amylase according to the invention is therefore a content of 50 to 60% by weight of maltose in the soluble cleavage products in the hydrolysis of wheat starch.
  • the enzyme produced according to the production process for the cultivation of Thermoactinomyces vulgaris described in the above DD patents can be used directly for the purposes of the present invention, namely in the process for producing baked goods with improved freshness.
  • Hansen et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1994), 44 (3), p. 245-252 will be different Properties of this enzyme are described, such as the molar mass and the K m value.
  • the amino acid sequence is also documented, as is the fact that the proteinase contained in Thermoactinomyces vulgaris is able to split the alpha-amylase into two fragments, both of which are active in the sense of the invention.
  • Thermoactinomyces vulgaris is not a particularly productive strain for the production of alpha-amylase. Therefore, successful attempts have already been made to produce this enzyme by genetic engineering.
  • the isolation of the alpha-amylase gene from Thermoactinomyces vulgaris is described, its base sequence is documented and the expression of the gene in Escherichia coli and Bacillus subtilis is treated.
  • B. subtilis is a particularly effective host organism.
  • the Thermoactinomyces vulgaris gene was introduced into the host organism using a gene construct with a B. subtilis plasmid as a vector. The latter is then cultivated in a suitable nutrient medium based on carbon, nitrogen and inorganic salts. Since the enzyme yield in the genetic engineering process of production is significantly better, this is preferred.
  • Baked goods primarily mean those that are produced with the addition of yeast. These are e.g. White bread, wheat and rye mixed bread or whole grain bread.
  • the enzyme can be added to the flour used to make the baked goods. It can also be contained in the baking agent added to the flour or dough. Often you mix it directly into the dough. It must be in the dough when the baking process begins.
  • the fresh olefin enzyme according to the invention should be added in an amount which is effective for preventing staling.
  • the weight of enzyme is selected so that the value for V is between 0.8 and 1.5 ml Depending on the type of flour and the desired baking product, 20 to 20,000 AZ are used per 100 kg of flour. 100 to 10,000 AZ are preferred. 300 to 3000 AZ per 100 kg of flour are particularly preferred.
  • the freshness-keeping enzyme according to the invention can be added on its own as the only enzymatic active substance.
  • other enzymes such as other alpha-amylases, glucosidases, proteinases, lipases, lipoxygenases, hemicellulases (pentosanases, xylanases), oxidases or transglutaminases can also be added.
  • the addition of baking xylanase has proven to be particularly effective. It increases the baking volume particularly effectively and leads to a remarkably soft crumb.
  • this enzyme renders some of the insoluble pentosans water-soluble or at least water-swellable, so that these ingredients can take over the function of water absorption and thereby the freshness-keeping effect of the enzyme according to the invention is enhanced.
  • Xylanases are added in dosages of 1000 to 20,000 xylanase units per 100 kg of flour, advantageously together with the alpha amylase from Thermoactinomyces vulgaris.
  • the activity unit for xylanase is defined as follows: 1 xylanase unit is the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol xylose from soluble xylan in 1 minute at 30 ° C.
  • the xylose can be determined photometrically, for example with p-hydroxybenzoic acid hydrazide. It is also not necessary to do without the other customary additives in bread making, such as emulsifiers or preservatives known per se.
  • Thermoactinomyces vulgaris alpha amylase according to the invention can advantageously be combined with the additives customary in baking, such as other enzymes and / or baking emulsifiers, hydrocolloids and preservatives.
  • a dough is made from 1500 g of flour, 870 ml of water, 45 g of yeast, 30 g of salt and 5 g of ascorbic acid in a spiral kneader (Kemper brand). Kneading is carried out for 2 min at a lower level 1 and 6 min at a higher level 2. Any enzyme is added to the water phase at the beginning of the kneading process.
  • the dough temperature is 26-27 ° C.
  • the dough for the production of white bread is divided into 4 x 600 g pieces, placed in the mold and cooked for 75 minutes at 32 ° C and 80% relative humidity, then baked at 230 ° C.
  • the crumb strength is determined on fresh bread - after it has cooled, i.e. after about three hours, after 24 hours and after four days with a compressimeter. Lower numbers mean a softer crumb and thus better freshness.
  • the device measures the compressibility of the Breadcrumb. It shows the force in divisions of scale that is necessary for indenting the crumb to a given depth.
  • a bread slice 15 mm thick is placed in the device and centered under the stamp. With the right screw the scale D is set to zero.
  • a depth of penetration of 3 mm is set for fresh bread and 1.5 mm for old bread (storage time 1 to 4 days).
  • the motor is started, which presses in the stamp with the help of a thread.
  • the engine is switched off and the force applied is read off on scale J.
  • the scale parts correspond approximately to the weight in grams with which the stamp pressed in the crumb.
  • Example 2 with 1.3 g of Thermoactinomyces vulgaris alpha amylase (TV-A) /

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Backwaren aus Getreideprodukten unter Verwendung von Enzymen, mit dem Ziel, das Altbackenwerden der Backwaren zu verhindern. Dazu wird dem Teig eine Thermoactinomyces vulgaris alpha Amylase zugesetzt, welche eine gezielte Teilhydrolyse der Stärke ermöglicht und dabei deren Retrogradation weitgehend verhindert und gleichzeitig durch den Backvorgang desaktiviert wird.

Description

Verfahren zur Herstellung von Frischhalte- Backwaren
BESCHREIBUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Backwaren aus Getreideprodukten unter Verwendung von Enzymen, mit dem Ziel, das Altbackenwerden der Backwaren zu verhindern.
Stand der Technik
Die Verhinderung des Altbackenwerdens oder, positiv ausgedrückt: die Sicherung der Frischhaltung von Backwaren ist ein Problem seit Brot gebacken wird. Bislang haben sich zwar die Vertriebsstellen für Backwaren, die Bäckereien und auch die Verbraucher damit abgefunden und darauf eingestellt, daß z.B. Brötchen am gleichen Tag verkauft und gegessen werden müssen. Eine Verlängerung der Frischhaltung um mehrere Tage wäre erstrebenswert und würde das Konsumverhalten und die Verteilungsstrategie für dieses wichtige Grundnahrungsmittel entscheidend ändern.
Im Zuge der Innovationsoffensive der Lebensmitteltechnologie in den letzten Jahren hat sich die Enzymtechnoiogie dieses Problems angenommen und bereits eine Reihe von Lösungen vorgeschlagen. Der Vorgang des Altbackenwerdens ist sehr komplex und wird keinesfalls vollständig verstanden. Auch das Erscheinungsbild des Effektes ist mehrschichtig. Es werden folgende störende Phänomene beobachtet:
1. Eine Zunahme der Festigkeit der Krume. Das Brot wird hart.
2. Die Brotkruste wird ledrig oder gummiartig.
3. Verlust an Brotaroma. Sogar eine negative Geruchsnote kann auftreten.
Die Fachwelt ist sich einig, daß das Altbackenwerden der Backwaren mit der Retrogradation der Stärke und mit der damit verbundenen Änderung des Wasserhaltevermögens zusammenhängt. Stärke ist ein wesentlicher Inhaltsstoff von Backwaren, sie liegt im Teig in Form von mit Protein umhüllten Körnern vor. Durch den Backvorgang verkleistert die Stärke und nimmt viel Wasser auf, während das Protein koaguliert. Unmittelbar nach dem Backen beginnt die Stärke unter Wasserabgabe zu re kristallisieren (= zu retrogradieren). Die Festigkeit der Krume nimmt zu, was in den ersten vier Stunden noch als Vorteil empfunden wird. Die Schnittfähigkeit und die Kaueigenschaften verbessern sich vorerst. Man nimmt an, daß zuerst die unverzweigte Stärke-Fraktion, also die Amylose kristallisiert, bei weiterer Lagerung auch die verzweigte Fraktion der Stärke, das Amylopektin. Die Krume versteift sich dabei, wird im Laufe der Zeit immer zähelastischer, später trockener und härter: das Brot ist altbacken geworden. Die Kruste dagegen verliert beim Lagern die Rösche. Man nimmt an, daß durch die Rekristallisation Wasser frei wird, dieses aus der Krume nach außen diffundiert und die Kruste durchfeuchtet. Daher wird die Kruste zäh und ledrig.
Der Aromaverlust des altbackenen Brotes könnte unter anderem durch Einschluß der Aromastoffe in die Stärkehelix erklärt werden.
Es ist unbestritten, daß die ursächliche Schlüsselreaktion für alle diese Erscheinungen des Altbackenwerdens die Stärkeretrogradierung ist. Diese zu unterdrücken oder zu umgehen ist Gegenstand einer Reihe von Schutzrechten und Veröffentlichungen.
Eine Strategie, die starke Verfestigung der Krume bei Lagerung wenigstens teilweise zu verhindern, ist schon lange bekannt: Man stellt die Krume von vornherein weicher ein. Mittel der Wahl sind Emulgatoren, wie Lecithin, Lysolecithin, Diacetylweinsäureester oder Mono- und Diglyceridester, die dem Teig zugesetzt werden und von Anfang an eine besonders weiche Krumenstruktur erzeugen. Es wird auch postuliert, daß die Mono- und Diglyceridester einerseits das bei der Rekristallisation freiwerdende Wasser aufnehmen, andererseits durch Assoziation an der Amylose deren Rekristallisation soweit stören, daß sie nicht mehr vollständig ablaufen kann.
Auch der Einsatz von Pilz-alpha-Amylase, z.B. aus Aspergillus oryzae, zielt in diese Richtung. Sie greift geschädigte Stärkekörner an, erniedrigt dadurch die Viskosität des Teiges und stellt fermentierbare Zucker bereit. Die Folge ist ein hohes Volumen der fertigen Backware, das mit einer weicheren Krume einhergeht: Eine besonders weiche Krume läßt den Vorgang des Verfestigens beim Altern nicht so deutlich hervortreten.
Abgesehen davon, daß das frische Brot zu weich ist, verhindert diese Strategie nicht oder zu wenig die Entwicklung einer gummiähnlichen Konsistenz der Krume, sowie die anderen Brotfehler des Altbackenwerdens.
Daher ist eine weitere Strategie, nämlich die Verhinderung der Retrogradierung durch eine teilweise enzymatische Hydrolyse der beiden Stärkefraktionen erfolgversprechender. Man nimmt an, daß die bei der Hydrolyse der Stärke entstehenden Bruchstücke zu kurz sind um re kristallisieren zu können. Die Bruchstücke assoziieren an die verbliebene hochmolekulare Stärke und verhindern weitgehend auch deren Rekristallisation.
Eine enzymatische Hydrolyse der Stärke soll nach Ansicht der Fachwelt möglichst bei der Verkleisterungstemperatur, also oberhalb von etwa 70°C stattfinden. Diese Temperaturen werden im Backpozeß ohne weiteres erreicht und überschritten. Das Dilemma der enzymatischen Behandlung ist indes, daß nur eine teilweise Hydrolyse stattfinden darf: nicht zu gering und nicht zu hoch. Ein zu geringer Hydrolysegrad führt nicht zu einem Frischhalteeffekt. Er ist gegeben, wenn man z.B. stärkespaltende Enzyme mit zu niedriger Thermostabilität, wie die oben erwähnte Pilz-alpha-Amylase einsetzt. Hier hat das Enzym bereits seine Aktivität eingebüßt, wenn im Zuge der Temperaturbelastung des Backprozesses die Verkleisterung anfängt, sodaß die Hydrolyse der Stärke zu gering ist.
Die Verwendung von Bakterien-alpha-Amy lasen, z.B. aus Bacillus subtilis oder Bacillus stearothermophilus führt zu zu hohen Hydrolysegraden. Sie sind sehr thermostabil und werden während des Backprozesses kaum desaktiviert, sie wirken sogar in der Abkühlphase nach. Die Folge ist ein zu weitgehender Abbau der Stärke, der sich in einer feuchten, klebrigen Krume äußert. Durch eine genaue Dosierung dieses Enzyms allein läßt sich die gewünschte Teilhydrolyse der Stärke schwer in den Griff bekommen.
Es stellt sich somit die Aufgabe, die Stärke nur bis zu einem bestimmten Hydrolysegrad abzubauen, mit der Maßgabe einer ausreichenden Dosierungstoleranz für die Enzymzugabe.
In US 4 416 903 wird vorgeschlagen, die bekannte Pilz-alpha-Amylase durch Einbettung in ein gegen thermische Belastung stabilisierendes Zuckermedium für die Zwecke der Frischhaltung zu verwendbar zu machen. Das Verfahren kommt nicht ohne Emulgator- und Zuckerzsatz aus und kann für eine Reihe von Backwaren, wo Zuckerzusatz unerwünscht ist, nicht eingesetzt werden.
Die PCT Anmeldung WO 89/08403 betrifft ebenfalls den Einsatz von Pilz- alpha-Amylase in der Brotfrischhaltung. Hier wird vorgeschlagen, eine säurestabile Pilz-alpha-Amylase zu verwenden, die im leicht sauren Medium des Teiges auch bei den erhöhten Temperaturen des Backprozesses noch ausreichend Wirkung zeigt, d.h. Stärke bis zu einem bestimmten Hydrolysegrad spaltet. Das Enzym wird aus schwarzsporenden Aspergillusstämmen isoliert und hat ein pH-Optimum von 3 bis 5 bei 60 bis 70 °C.
Generell muß bei den oben beschriebenen Verwendungen der Pilz-alpha- Amylasen mit relativ hohen Enzymdosagen gearbeitet werden, um einen Effekt zu erzielen.
In US 4 654216 wird versucht, das Problem der Brotfrischhaltung durch eine spezielle Spezifität des verwendeten Enzyms zu lösen. Es wird - zusammen mit Bakterienamylase oder Malzamylase - eine Pullulanase eingesetzt. Sie soll vorwiegend das verzweigte Amylopectin spalten und so die Wirkung der Amylasen unterstützen. Da die verwendeten Enzyme thermostabil sind, besteht hier weiterhin das Problem einer punktgenauen Enzymdosierung, die in der Praxis zu Schwierigkeiten führen muß.
Ein Lösungsweg, der ebenfalls über die Spezifität des verwendeten Enzyms läuft, wird in der PCT-Anmeldung WO 91/04669 beansprucht. Hier werden maltogene Exoamylasen, auch beta-Amylasen genannt, für die Verhinderung des Altbackenwerdens vorgeschlagen. Diese Enzymspezies spaltet aus Stärkemolekülen ausschließlich Maltose ab. Es werden zwei verschiedene beta-Amylasen aus Bacillus angeführt. Deren Quelle und Herstellung sind in EP 234 858 und US 4604 355 beschrieben. Da diese Enzyme sehr thermostabil sind, - beide Enzyme behalten nach einer 30 minütigen thermischen Belastung von 80°C noch über 50 % ihrer Aktivität - ist anzunehmen ,daß ihre Wirkung zeitlich nicht begrenzt ist, daß sie also während des gesamten Backprozesses und darüber hinaus wirken. Die Enzyme dürften so zumindest zum Teil den Backprozeß überleben und dadurch in aktivem Zustand auch noch in der fertigen Backware enthalten sein. In der Lebensmitteltechnologie legt man Wert darauf, daß Enzyme im verzehrbereiten Produkt in inaktiviertem Zustand vorliegen, was hier aber nicht sicher gegeben und von Nachteil ist. Die Wirkung dieser Enzyme dürfte in einer quantitativ begrenzten Spaltung in die niedermolekularen Bruchstücke bestehen, die das Wasserhaltevermögen verbessern und gleichzeitig die Rekristallisation der Reststärke verhindern. Die Reaktion läuft bis zum beta-Grenzdextrin und bleibt dort stehen. Nachteilig ist auch, daß die Spaltprodukte ausschließlich Zucker sind, was fallweise aus Geschmacksgründen unerwünscht ist.
Auch in EP 412 607 werden zur Verhinderung des Altbackenwerdens thermostabile Exoglucanasen wie beta-Amylasen oder Amyloglucosidasen vorgeschlagen. Sie können durch alpha-1,6- Endoglucanasen wie z.B. Pullulanase ergänzt oder ersetzt werden. Auch hier sind die Enzyme während des Backens zwischen 80 und 95°C wirksam, und ihre vollständige Inaktivierung am Ende des Backprozesses ist nicht sicher. Durch die Wahl dieser Spezifitäten soll vor allem die Amylopektinkomponente selektiv hydrolysiert werden, wobei die Reaktion auch über das Grenzdextrin hinaus gehen kann. Damit erhebt sich auch hier das Problem einer punktgenauen Dosierung des Enzyms.
Aufgabe und Lösung
Die Aufgabe zur Lösung des Brotfrischhalteproblems besteht somit in einer gezielten enzymatischen Teilhydrolyse der Stärke. Folgende Forderungen sollen zusätzlich erfüllt werden:
1. Zur Erzielung des Effekts sollen keine hohen Enzymdosagen notwendig sein
2. Die Enzymzugabe soll dosierungstolerant sein
3. Nach dem Backprozeß soll das Enzym vollständig desaktiviert sein
4. Die Spaltprodukte sollen eine möglichst geringe Geschmacksveränderung bewirken, insbesondere sollen sie nicht ausschließlich aus Zucker bestehen.
5. Das Brotaroma soll möglichst erhalten bleiben.
Die Aufgabe wird durch Verwendung einer alpha-Amylase, die sich in Herkunft, Spezifität und Thermostabi lität vom Stand der Technik unterscheidet, gelöst. Diese alpha-Amylase wird von Thermoactinomyces vulgaris produziert. Herstellung des Enzyms
Alpha-Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris wurde in DD 288 395 offenbart. Es wird hier ihre Herstellung durch Fermentation von Thermoactinomyces vulgaris, sowie ihre Verwendung zur Spaltung von Stärke unter Bildung maitose- und maltotriosereicher Hydrolysate beschrieben.
Das Enzym hat einen isoelektrischen Punkt von 5.57. ein pH-Optimum zwischen 4 und 6 und eine relativ geringe Thermostabi lität. So wird nach 20 minütigen thermischen Belastung des Enzyms in wäßriger Lösung bei 70°C keine Aktivität mehr gefunden. Außergewöhnlich ist sein Spaltmuster. Es ist in DD 287 732 beschrieben: Bei der Hydrolyse von nativer Weizenstärke werden lösliche Produkte bestehend aus 4.3 % Glucose, 54.5% Maltose, 20.5% Maltotriose und als Rest lösliche Stärkefragmente erhalten. Somit ist ein Kennzeichen der erfindungsgemäßen alpha-Amylase ein Gehalt von 50 bis 60 Gew.% an Maltose in den löslichen Spaltprodukten bei der Weizenstärke-Hydrolyse.
Das nach den in den obigen DD-Patenten beschriebenen Herstell verfahren der Kultivierung von Thermoactinomyces vulgaris produzierte Enzym kann direkt für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, nämlich in dem Verfahren zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung verwendet werden. In Hansen et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1994), 44(3), p. 245-252, werden verschiedene Eigenschaften dieses Enzyms beschrieben, wie z.B. die Molmasse und der Km-Wert. Auch die Aminosäuresequenz wird dokumentiert, sowie die Tatsache, daß die in Thermoactinomyces vulgaris enthaltenen Proteinase die alpha-Amylase in zwei Bruchstücke zu spalten vermag, die beide im Sinne der Erfindung aktiv sind.
Es hat sich aber gezeigt, daß Thermoactinomyces vulgaris kein besonders produktiver Stamm zur Erzeugung von alpha-Amylase ist. Daher wurden bereits erfolgreiche Versuche unternommen, dieses Enzym gentechnisch herzustellen. In Arbeiten von z.B. Hofemeister et al., Appl. Environ. Microbiol. (1994), 60(9), p. 3381 - 3389, wird die Isolierung des alpha-Amylase Gens aus Thermoactinomyces vulgaris beschrieben, seine Basensequenz dokumentiert und die Expression des Gens in Escherichia coli und Bacillus subtilis behandelt. B. subtilis ist ein besonders effektiver Wirtsorganismus. Das Thermoactinomyces vulgaris-Gen wurde mit Hilfe eines Genkonstrukts mit einem B. subtilis-Plasmid als Vektor in den Wirtsorganismus eingeschleust. Letzterer wird dann in einem geeigneten Nährmediumt auf Basis Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen kultiviert. Da die Enzymausbeute beim gentechnischen Verfahren der Herstellung deutlich besser ist, wird dieses bevorzugt.
Anwendung des Enzyms
Im Vergleich zum Stand der Technik war es unerwartet, daß eine alpha- Amylase mit obigen Eigenschaften, nämlich mit dem oben genannten Spaltmuster bei der Stärkehydrolyse, das etwa zwischen dem einer alpha- Amylase und einer beta Amylase liegt, sowie mit einer so geringen Thermostabi lität so hervorragende Effekte bei der Brotfrischhaltung bewirkt. Die Wirkung ist unabhängig von der Art der Backwaren,
Unter Backwaren sind in erster Linie solche gemeint, die unter Zusatz von Hefe hergestellt werden. Es sind dies z.B. Weißbrot, Weizen-und Roggen-Mischbrote oder Vollkornbrote.
Das Enzym kann bereits dem Mehl zugemischt werden, das für die Herstellung der Backwaren verwendet wird. Es kann auch im Backmittel enthalten sein, das dem Mehl oder dem Teig zugegeben wird. Häufig mischt man es aber direkt dem Teig zu. Es muß auf jeden Fall im Teig enthalten sein, wenn der Backprozeß beginnt. Das erfindungsgemäße Frischalteenzym soll in einer Menge zugesetzt werden, die zur Verhinderung des Altbackenwerdens wirksam ist. Die Enzymmenge wird üblicherweise über die Enzymaktivität definiert. Letztere kann z.B. in AZ-Einheiten angegegeben werden. 1 AZ-Einheit entspricht der Enzymaktivität pro Gramm Enzympräparat, welche unter den gegebenen Bedingungen (pH=5, 20 °C, 6%ige Lösung von löslicher Stärke als Substrat) die Spaltung einer 0.75 mMol Oligosaccharid äquivalenten Anzahl glykosidischer Bindungen katalysiert. Siehe auch Willstätter, Waldschmidt-Leitz und Hesse, Z. f. physiol. Chem., Bd. 126, Seite 143, 1922. Die Analyse wird folgendermaßen durchgeführt: In eine 50 ml-Weithalsflasche gibt man 5.5 ml 6 %ige Stärkelösung (Merck, Best. Nr. 1252), die durch kurzzeitiges Erhitzen praktisch vollständig gelöst und die mit Natriumacetatpuffer auf pH=5 eingestellt worden war. Sie wird auf 20 °C temperiert. Dann gibt man 2ml der zu bestimmenden Enzymiösung unter Schwenken zu und läßt das Reaktionsgemisch genau 15 min bei 20 °C stehen. Genau zu diesem Zeitpunkt wird die Reaktion mit 0.5 ml 1 n Salzsäure unterbrochen. Dann gibt man dem Reaktionsansatz 10 ml 0.1 n Jodlösung und sofort 20 ml 0.1 n Natronlaugelösung zu. Nach gründlichem Rühren läßt man den Ansatz 20 min stehen. Anschließend gibt man 5.2 ml 1 n Schwefelsäure zu und titriert mit 0.1 n Natriumthiosulfatlösung auf farblos. Parallel dazu erstellt man einen Blindwert, indem man die Enzymiösung durch reines Wasser ersetzt.
Die Differenz zwischen Haupt- und Blindwert ergibt den Verbrauch an 0.1 n Jodlösung (V) in ml, der in die Berechnung der AZ- Aktivität folgendermaßen eingeht.
0.0011288 x V2 + 0.23736 x V
AZ = x 0.96
Einwaage in g
Die Enzymeinwaage wird so gewählt, daß der Wert für V zwischen 0.8 und 1.5 ml liegt Je nach Art des Mehls und dem angestrebten Backprodukt werden pro 100 kg Mehl 20 bis 20 000 AZ eingesetzt. Bevorzugt sind 100 bis 10 000 AZ. Besonders bevorzugt sind 300 bis 3000 AZ pro 100 kg Mehl.
Das erfindungsgemäße Frischhalteenzym kann für sich allein als einzige enzymatische Wirksubstanz zugesetzt werden. Selbstverständlich können aber auch andere Enzyme wie z.B. weitere alpha-Amy lasen, Glucosidasen, Proteinasen, Lipasen, Lipoxygenasen, Hemicellulasen (Pentosanasen, Xylanasen), Oxidasen oder Transglutaminasen zugesetzt werden. Als besonders wirksam erweist sich in diesem Zusammenhang der Zusatz von backwirksamer Xylanase. Sie erhöht das Backvolumen besonders wirkungsvoll und führt zu einer auffallend weichen Krume. Es wird postuliert, daß dieses Enzym einen Teil der unlöslichen Pentosane wasserlöslich oder zu mindest wasserquell bar macht, diese Inhaltsstoffe somit die Funktion der Wasseraufnahme übernehmen können und dadurch die Frischhaltewirkung des erfindungsgemäßen Enzyms verstärkt wird. Xylanasen werden in Dosagen von 1000 bis 20000 Xylanase- Einheiten pro 100 kg Mehl zugesetzt, vorteilhaft zusammen mit der alpha Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris. Die Aktivitätseinheit für Xylanase ist folgendermaßen definiert: 1 Xylanase-Einheit ist jene Enzymmenge, die in 1 Minute bei 30 °C 1 μmol Xylose aus löslichem Xylan freisetzt. Das Substrat Xylan stammt aus Haferspelzen und wird zur Analyse in 0.25 %iger Lösung bei pH=4.5 eingesetzt. Die Bestimmung der Xylose kann z.B. mit p- Hydroxybenzoesäurehydrazid fotometrisch erfolgen. Auch auf die anderen üblichen Zusatzstoffe bei der Brotherstellung, wie z.B. an sich bekannte Emulgatoren oder Konservierungsstoffe braucht nicht verzichtet werden.
Vorteilhafte Wirkungen
Bei den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Backwaren wird ein vozüglicher Frischhalteeffekt beobachtet. So kann z.B. Weißbrot auch nach vier Tagen Lagerung als frisch bezeichnet werden: Die Krume bleibt weich und saftig, die Kruste wird nicht ledrig. Zur Erzielung des Effekts sind keine hohen Enzymdosagen notwendig. Auch die Dosierungstoleranz ist gut: Selbst bei mehrfacher Überdosierung tritt nicht der von der thermostabilen Bakterien-alpha-Amylase her bekannte Brotfehler einer klebrigen, feuchten Krume auf. Das erfindungsgemäße Enzym ist nach dem Backprozeß vollständig desaktiviert und kann durch eine Aktivitätsmessung in der fertigen Backware nicht mehr nachgewiesen werden. Obwohl die im Teig vorhandenen Stärkefraktionen eine Teilhydrolyse erfahren haben, also eine Reihe niedermolekularer, zuckerähnlicher Reaktionsprodukte entstanden sein muß, wird keine Geschmacksveränderung in Form einer Zunahme der Süße beobachtet. Insgesamt bleiben die Weichheit der Krume, sowie Geschmack und Geruch über längere Lagerung einwandfrei erhalten Die erfindungsgemäeß Thermoactinomyces vulgaris alpha Amylase kann mit den beim Backen üblichen Zusatzstoffen, wie anderen Enzymen und/oder Backemulgatoren, Hydrokolloiden und Konservierungsstoffen vorteilhaft kombiniert werden.
BEISPIELE
Durchführung von Backversuchen
Aus 1500 g Mehl, 870 ml Wasser, 45 g Hefe, 30 g Salz und 5 g Ascorbinsäure wird in einem Spiralkneter (Marke Kemper) ein Teig bereitet. Dabei wird 2 min auf niedriger Stufe 1 und 6 min auf höherer Stufe 2 geknetet. Eine etwaige Enzymzugabe erfolgt zu Beginn des Knetvorganges in die Wasserphase. Die Teigtemperatur beträgt 26-27°C. Nach einer Teigruhe von 20 min wird der Teig zur Herstellung von Kasten- Weißbrot jeweils in 4 mal 600 g-Stücke geteilt , in die Form eingebracht und 75 min bei 32 °C und 80 % relativer Luftfeuchte gegart, anschließend bei 230 °C gebacken. Die Krumenfestigkeit wird am frischen Brot - nachdem es abgekühlt ist, also etwa nach drei Stunden, nach 24 Stunden und nach vier Tagen mit einem Compressimeter bestimmt. Niedrigere Zahlen bedeuten dabei eine weichere Krume und damit eine bessere Frischhaltung.
Beschreibung der Compressimeter-Messung
Es wird ein Compressimeter der Fa. F. Watkins Corporation, West Caldwell, USA, verwendet. Das Gerät mißt die Kompressibilität der Brotkrume. Es zeigt die Kraft in Skalenteilen an, die für das Eindrücken der Krume bis zu einer gegebenen Tiefe notwendig ist. Eine Brotscheibe von 15 mm Dicke wird in das Gerät eingelegt und dabei unter dem Eindrückstempel zentriert. Mit der rechten Schraube wird die Skala D auf null gestellt. Für frisches Brot stellt man eine Eindringtiefe von 3 mm ein, für altes Brot (Lagerzeit 1 bis 4 Tage) 1.5 mm. Zur Messung wird der Motor angestellt, der mit Hilfe eines Fadenzuges den Stempel eindrückt. Ist die gewünschte Eindringtiefe, die auf Skala D angezeigt wird, erreicht, schaltet man den Motor ab und liest die aufgewendete Kraft auf Skala J ab. Die Skalenteile entsprechen etwa dem Gewicht in Gramm, mit dem der Stempel die Krume eingedrückt hat.
Niedrige Zahlen bedeuten eine weiche Krume und damit auch die bessere Frischhaltung.
Beispiel 1 bis 3
Nach obiger Backvorschrift wird mit folgenden Enzymzusätzen gebacken:
Beispiel 1: ohne Enzymzusatz (=Vergleichsbeispiel)
Beispiel 2: mit 1.3 g Thermoactinomyces vulgaris alpha Amylase (TV-A)/
/100 kg Mehl mit einer Aktivität von 785 AZ pro Gramm
Beispiel 3 mit 2,6 g Thermoactinomyces vulgaris alpha Amylase (TV-A)/
/100 kg Mehl mit einer Aktivität von 785 AZ pro Gramm Die Messung des Frischhalteeffektes wurde mit dem Compressimeter in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.
Tabelle 1 : Compressimeter-Messungen
Figure imgf000020_0001
Ergebnis:
Deutlich erkennt man die bessere Kompressibilität und damit die höhere Weichheit der Krume nach Zusatz von Thermoactinomyces vulgaris alpha Amylase selbst nach vier Tagen. Die Einsatzmengen, bezogen auf 100 kg Mehl, betrugen in Beispiel 2...1020 AZ, in Beispiel 3...2040 AZ.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung,
dadurch gekennzeichnet,
daß dem Mehl, das für die Herstellung der Backwaren verwendet wird oder dem Backmittel, das dem Mehl oder dem Teig zugegeben wird, oder dem Teig vor dem Backprozeß alpha-Amylase, die aus Thermoactinomyces vulgaris stammt, zugesetzt wird, wobei dem Teig 20 - 20 000 AZ- Aktivitätseinheiten des Enzyms bezogen auf 100 kg Mehl zugesetzt werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym von einem Wirts-Organismus, der das Gen der alpha-Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris enthält, produziert wurde.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym von einem Bacillus subtilis-Stamm, der das Gen der alpha- Amylase aus Thermoactinomyces vulgaris enthält, produziert wurde.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß an dem Teig zusätzlich ein oder mehrere der an sich bekannten Backenzyme wie Proteinasen, Amylasen, Hemicellulasen, Oxidasen und Transglutaminasen zugesetzt werden.
5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß dem Teig zusätzlich Xylanasen in einer Dosierung von 1000 bis 20 000 Xylanase-Einheiten zugesetzt werden.
6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß dem Teig zusätzlich an sich bekannte Backemulgatoren zugesetzt werden.
7. Mehl zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alpha-Amylase, die aus Thermoactinomyces vulgaris stammt, enthalten ist.
8. Backmittel zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alpha- Amylase, die aus Thermoactinomyces vulgaris stammt, enthalten ist.
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