WO1998027111A1 - Vacuna para la inmuno-castración reversible de mamíferos - Google Patents
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Definitions
- the present invention is related to the field of Genetic Engineering and Biotechnology and in particular to the use of a GnRH derived peptide for the immunocastration of mammals.
- GnRH Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly
- a glycine amino acid residue is found at position 6.
- Glycine is the smallest of the amino acids and causes flexibility in the polypeptide chain.
- the replacement of glycine with proline, a residue that confers rigidity, can influence the increase in the immune response. In addition this change cause it that this peptide is foreign to the immune system, stimulating the production of antibodies.
- the production of antibodies against GnRH is achieved by conjugating GnRH to an appropriate carrier protein.
- This conjugation can be done by chemical or genetic engineering methods.
- two carrier proteins widely used for these purposes the BSA protein and an epitope of the tetanus toxoid.
- BSA is conjugated by a known chemical method, tetanus toxoid epitope and GnRh variants are synthesized in a single peptide using two glycine residues as separators.
- chemical synthesis is used because the size of the peptide so permits, if the carrier protein were large, the most feasible route would be by Genetic Engineering, inserting the GnRH variants as part of its amino acid sequence. .
- This procedure is possible to do with virtually any protein, hence it is necessary that the present invention be protected against any protein that may include the sequence of the peptide in question, whether obtained by chemical synthesis or genetic manipulation.
- Boc- protecting group was carried out in all cases with 37.5% trifluoroacetic acid (TFA) in dichloromethane (DCM).
- TFA trifluoroacetic acid
- DCM dichloromethane
- the neutralization of the free aminos was carried out with 5% N, N-ethyldiisopropylamine in DCM.
- the activation method was used with N, N '-diisipropylcarbodiimide (DIC) in si tu, with the exception of the amino acids Asn and Gln that were activated with DIC and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) in N , N-dimethylformamide (DMF).
- the peptide-resin was treated with the HF mixture (90%): Anisole (10%) for 60 min. at 0 °.
- the crude product was washed with ether, extracted with a 30% acetic acid solution in water and lyophilized.
- the peptides were finally characterized by RP-HPLC on a VYDAC C-18 column (4.6x100) mm and by mass spectrometry using the FAB as an ionization method in a JEOL HX-110HF equipment.
- the peptides were purified by the same procedure but on a preparative VYDAC C-18 column.
- the synthesized peptides were: a) QH SYGLRPG, identified as GnRH sequence corresponding to the gonadotropin-releasing hormone, which is structurally conserved in several mammalian species including the pig. b) QH SYGLRPGGGQYIKANSKFIGITEL, identified as GnRH-TT, where gonadotropin-releasing hormone is conjugated in the N-terminal to an epitope of tetanus toxin
- Figure 2 shows the chromatograms of the GnRH (figure 2a), GnRHml (figure 2b), GnRHTT (figure 2c) and GnRH lTT (figure
- the conjugation of the peptides to BSA was performed by the following protocol: - Weigh the same amount of BSA ⁇ bovine serum albumin, Sigma) as peptide (3 mg).
- Animals A total of fifteen hybrid male pigs from different litters were randomly assigned to five groups of three animals each for the treatment described below.
- Vaccination The five groups were vaccinated the first time between 11 and 12 weeks of age and received a revaccination 8 weeks later. On both occasions each animal was injected intramuscularly into the neck with 2 mL of vaccine. All animals were sacrificed 8 weeks after the second immunization. The first group of animals was vaccinated only with PBS IX and CFA and was used as a negative control of the experiment.
- a second and third group were vaccinated with GnRH-BSA and with GnRH-TT respectively and were used as positive controls considering that GnRH is the endogenous hormone.
- a fourth and a fifth group were vaccinated with the new GnRHml peptide conjugated to BSA (GnRHml-BSA) and the tetanus toxin epitope (GnRHml-TT) respectively.
- the vaccination schedule lasted four months (January - April 1996).
- testicular and epididymal tissue were fixed for histology. After fixing the middle part of each transverse and sagittal section of these tissues, paraffin inclusion and cutting of 5 ⁇ m thick sections were carried out. Staining was performed by the hematoxylin and eosin method.
- Figure 1 Testicles of the placebo groups (left), GnRH-TT (center) and GnRHml-TT (right). The effect produced in the two groups conjugated to the tetanus toxin is evident. Between these two groups, a greater effect of the GnRHml-TT variant can also be observed.
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Abstract
La presente invención esta relacionada con el campo de la Ingeniería y la Biotecnología y en particular con el uso de un péptido derivado de la GnRH para la inmuno-castración de mamíferos. En mamíferos, se ha ensayado la vacunación con la hormona liberadora de la gonodatropina (GnRH, siglas en ingles), con el fin de provocar una respuesta inmune que neutralice la actividad de dicha hormona. La presente invención se refiere al uso de una variante de la GnRH de mamíferos que presenta un cambio de un residuo glicina por un residuo prolina en la posición 6: Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly. Este cambio ha mostrado inducir una respuesta inmune superior a la de la GnRH natural, cuando ambas están acopladas a una misma proteína portadora, en experimentos realizados en cerdos. Este mismo resultado es de esperar en cualquier otro mamífero ya que esta hormona es conservada en todas las especies.
Description
VACUNA PARA LA INMUNO-CASTRACIÓN REVERSIBLE DE MAMÍFEROS
Sector técnico
La presente invención esta relacionada con el campo de la Ingeniería Genética y la Biotecnología y en particular con el uso de un péptido derivado de la GnRH para la inmunocastración de mamíferos. Técnica anterior
En animales domésticos, como perros, gatos, cerdos y vacunos, es frecuente la conveniencia de prevenir la reproducción. Los métodos más frecuentemente usados son la castración y la administración de esferoides . Ambos métodos tienen inconvenientes, el primero requiere de personal especializado para llevarse a cabo y es irreversible y el segundo provoca efectos secundarios. Por estas razones se ha ensayado la inmuno-castración de animales con el uso de péptidos análogos a la GnRH conjugados con proteínas, con el objetivo de levantar anticuerpos que neutralicen la función de la GnRH. Divulgación de la invención.
La secuencia aminoacidica de GnRH de gran número de especies es conocida. Todas las secuencias de mamíferos reportadas hasta hoy presentan la siguiente secuencia aminoacidica:
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly Por lo que esta es referida en la literatura como la GnRH de mamíferos. En la mayoría de las secuencias conocidas, incluyendo secuencias de aves, peces y reptiles, en la posición 6 se encuentra un residuo aminoacidico glicina. La glicina es el menor de los aminoácidos y provoca flexibilidad en la cadena polipeptidica. La sustitución de glicina por prolina, un residuo que confiere rigidez, puede influir en el aumento de la respuesta inmune. Además este cambio provocarla
que este péptido resulte ajeno para el sistema inmune, estimulando la producción de anticuerpos.
La producción de anticuerpos contra la GnRH se logra conjugando la GnRH a una proteina portadora apropiada. Esta conjugación se puede realizar por métodos químicos o de Ingeniería Genética. En nuestro caso hemos seleccionado para la conjugación dos proteínas portadoras ampliamente usadas con estos fines, la proteina BSA y un epitope del toxoide del tétanos. La BSA se conjuga por un método químico conocido, el epitope del toxoide del tétanos y las variantes de GnRh se sintetizan en un solo péptido utilizando dos residuos glicina como separadores. En este caso se utiliza la síntesis química por que el tamaño del péptido asi lo permite, en caso de que la proteina portadora fuera de gran tamaño la via más factible seria por Ingeniería Genética, insertando las variantes de la GnRH como parte de su secuencia aminoacidica. Este procedimiento es posible hacerlo prácticamente con cualquier proteina, de aqui que sea necesario que la presente invención quede protegida contra cualquier proteina que pueda incluir la secuencia del péptido en cuestión, ya sea obtenida por síntesis química o por manipulación genética.
Novedad y ventajas de la solución propuesta.
Anteriormente se han introducido cambios en la posición 6 de la GnRh introduciendo D-aminoácidos y compuestos análogos a aminoácidos (Rivier et al., U.S Patent 4,215,038, Vale, Jr . Et al., US Patent 4,410,514). La novedad de esta invención consiste en la sustitución del aminoácido glicina en la sexta posición de la GnRH por un L-aminoácido prolina, o sea un aminoácido que se encuentra de forma natural en las proteínas. Esta variante ha demostrado ser más efectiva que la GnRH natural cuando ambas están conjugadas a la misma proteina. El hecho de introducir un aminoácido que ocurre de
forma natural nos da además la posibilidad de incluir esta variante en construcciones genéticas, algo imposible en variantes que incluyan D-aminoácidos o compuestos análogos.
Ejemplos de realización Ejemplo 1
Síntesis de los péptidos :
Todos los péptidos fueron sintetizados utilizando la estrategia Boc- en fase sólida sobre la resina 4-metil- benzhidrilamina (resina MBHA de la casa comercial BACHEM, Suiza) . Los aminoácidos protegidos fueron suministrados por BACHEM. La protección de los grupos reactivos de las cadenas laterales de los aminoácidos fue la siguiente: Arg(Tos), Asp(OBzl), Cys (4-MeBzl) , Glu(OBzl), Lys (2-C1-Z) , Trp(CHO), Tyr (Cl2"Bzl) , Thr(Bzl) y Ser(Bzl). La Asn, la Gln y la Pro se utilizaron sin protección en las cadenas laterales.
La síntesis se realizó siguiendo los pasos que se relacionan a continuación:
Paso veces x min Lavados con diclormetano l x l
Desprotección del grupo Boc- del 1 x 30 a ino terminal
Lavados con diclormetano 2 x 1
Lavados con 2-propanol 2 x 1
Lavados con diclormetano 2 x 1
Neutralización de los grupos aminos 3 x 2 Lavados con diclormetano 2 x 1
Reacción de acoplamiento 1 x 60
Lavados con N, N-dimetilformamida 2 x 1 Lavados con diclormetano l x l
Se repiten los pasos hasta completar la secuencia
Eliminación de las protecciones de las cadenas laterales y recuperación del péptido
La desprotección del grupo protector Boc- se realizó en todos los casos con ácido trifluoroacético (TFA) al 37.5% en diclorometano (DCM) . La neutralización de los aminos libres se llevó a cabo con N, N-etildiisopropilamina al 5 % en DCM. Para la reacción de acoplamiento de cada residuo se utilizó el método de activación con N, N ' -diisipropilcarbodiimida (DIC) in si tu , a excepción de los aminoácidos Asn y Gln que fueron activados con DIC y 1-hidroxybenzotriazol (HOBt) en N,N-dimetilformamida (DMF) .
La eliminación de las protecciones de las cadenas laterales y la liberación del péptido de la resina se realizaron en un equipo especial para este fin. El procedimiento empleado fue el conocido como "Low-High" HF. En la primera parte del procedimiento (Low HF) , el sistema péptido protegido-resina se trató con la mezcla HF (25%) : DMS ( 65% ) :p-Cresol ( 10% ) durante 120 min. a 0°. En el caso de los péptidos con Trp en la secuencia, la mezcla se sustituyó por HF(25%) :DMS (60%) :EDT (10%) :p-Cresol (5%) . Posterior a este tratamiento el péptido-resina se lavó con éter dietilico, diclorometano y 2-propanol varias veces y se secó al vacio. En la segunda parte (High HF) , el péptido-resina se trató con la mezcla HF ( 90% ) : Anisol ( 10% ) durante 60 min. a 0°. El producto crudo se lavó con éter, se extrajo con una solución de ácido acético al 30% en agua y se liofilizó.
Los péptidos se caracterizaron finalmente por RP-HPLC en una columna VYDAC C-18 (4.6x100) mm y por espectrometría de masas usando el FAB como método de ionización en un equipo JEOL HX- 110HF. La purificación de los péptidos se realizó por el mismo procedimiento pero en una columna VYDAC C-18 preparativa .
Los péptidos sintetizados fueron: a) QH SYGLRPG, identificado como GnRH secuencia correspondiente a la hormona liberadora de gonadotropina, la cual es estructuralmente conservada en varias especies de mamíferos incluyendo al cerdo. b) QH SYGLRPGGGQYIKANSKFIGITEL, identificado como GnRH-TT, donde la hormona liberadora de gonadotropina esta conjugada en el N-terminal a un epitope de la toxina del tétanos
(residuos 830-844) (Panina-Bordingnon et al, 1989) utilizando dos glicinas como separadores. c) QH SYPLRPG, nuevo péptido análogo de la GnRH, identificado como GnRHml, donde la GnRH tiene un cambio en la posición número 6 del aminoácido glicina por una prolina. d) QHWSYPLRPGGGQYIKANSKFIGITEL, identificado como GnRHml-TT. En este caso el péptido análogo GnRHml está conjugado en el
N-terminal al mismo epitope y de igual forma que el péptido
GnRH-TT.
En la figura 2 se pueden observar los cromatogramas de los péptidos GnRH (figura 2a) , GnRHml (figura 2b), GnRHTT (figura 2c) y GnRH lTT (figura
2d) .
PREPARACIÓN DE LOS CONJUGADOS
La conjugación de los péptidos a BSA se realizó por el siguiente protocolo: - Pesar igual cantidad de BSA {bovine serum albumin , Sigma) que de péptido (3 mg) .
- Disolver la BSA en 0,5 mL de 0,1 M de Na2C03 en tubo de ensayo.
- Disolver aparte los 3 mg de péptido en 0,5 mL de 0,1 M de Na2C03 en tubo de ensayo.
- Añadir con agitación lenta y poco a poco 3 μL de Glutaraldehido al 25 % (grado I, Sigma) a la BSA
resuspendida y posteriormente el péptido resuspendido gota a gota .
- Llevar hasta 1,5 mL con 0,1 M de Na2C03.
- Mezclar con agitación lenta y protegido de la luz durante 12 horas a 25°C.
- Dializar contra PBS IX durante 12 horas a 4°C.
- Llevar el volumen hasta 3 mL con PBS IX.
- Repartir 1 mL (1 mg de péptido conjugado) para cada jeringuilla de 5 mL. - Adicionar 1 mL de Adjuvante Completo de Freund (Sigma) en la primera inmunización y 1 mL de Adjuvante Incompleto para la segunda ..
- Mezclar con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente . - Conservar el inmunógeno a 4°C hasta su empleo. Ejemplo 2
Formulación de la vacuna y vacunación.
Para la elaboración de las vacunas se empleó en cada caso 1 mg de péptido resuspendido en 1 mL de PBS IX y emulsificado con 1 mL del Adjuvante Completo de Freund (CFA) . Un mg de los péptidos GnRH-TT y GnRHml-TT equivale a 0,4 mg de GnRH y GnRHml respectivamente. La emulsión agua en aceite estable se logró por agitación con el empleo de un agitador con impelente . En todos los casos los inmunógenos se prepararon momentos antes de la vacunación.
La segunda vacunación realizada 8 semanas después de la primera tenia la misma composición pero esta vez emulsificada con Adjuvante Incompleto. Animales : Un total de quince cerdos machos híbridos procedentes de camadas diferentes fueron asignados al azar a cinco grupos de tres animales cada uno para el tratamiento que a continuación se describe.
Vacunación: Los cinco grupos fueron vacunados la primera vez entre las 11 y 12 semanas de nacidos y recibieron una revacunación 8 semanas más tarde. En ambas ocasiones cada animal fue inyectado intramuscularmente en el cuello con 2 mL de vacuna. Todos los animales fueron sacrificados 8 semanas después de la segunda inmunización. El primer grupo de animales fue vacunado solamente con PBS IX y CFA y se utilizó como control negativo del experimento. Un segundo y tercer grupo se vacunaron con GnRH-BSA y con GnRH-TT respectivamente y se emplearon como controles positivos teniendo en cuenta que GnRH es la hormona endógena. Un cuarto y un quinto grupo fueron vacunados con el nuevo péptido GnRHml conjugado a BSA (GnRHml-BSA) y al epitope de la toxina del tétanos (GnRHml-TT) respectivamente. El esquema de vacunación duró cuatro meses (enero - abril del996) . Ej mplo 3
Evaluaciones realizadas durante el esquema de vacunación. Comenzando desde el dia 0 y cada 4 semanas hasta momentos antes del sacrificio se realizó la medición de los testículos y se verificó el peso de cada animal. Al mismo tiempo se tomaron muestras de suero por punción del seno retro-orbital para la determinación de los títulos anti-GNRH. Además en la semana 16 se comprobó durante tres días el desarrollo de los reflejos primarios de la cópula: acercamiento, monta, erección y eyaculación. La estimulación de los verracos se realizó, en unos casos con una cerda en celo natural y en otros con una cerda a la cual se le indujo el celo con gonadotropina sérica.
a) Tabla 1. Medición de los testículos:
b) Tabla 2. Peso corporal de los cerdos
nd- no determinado.
c) Tabla 3. Incremento del peso corporal de cada grupo durante el tiempo del experimento.
d) Tabla 4. Resultados de la comprobación del desarrollo de los reflejos primarios de la cópula en los cerdos inmunizados .
a) reflejo de acercamiento: - B (bueno) ,
- B(*), significa acercamiento agresivo,
- R (regular) ,
- M (malo) , significa que no hubo acercamiento, b) reflejo de monta: - B (bueno), significa buen reflejo,
- R (regular) , significa que el intento de monta fue pobre,
- M (malo), significa que no hubo monta.
Ejemplo 4
Evaluaciones realizadas después del sacrificio. Después del sacrificio, los testículos extirpados y separados de los epididimos fueron medidos y pesados, mientras que los epididimos fueron solamente pesados. Dos muestras de tejido testicular y epididimal fueron fijadas para histología. Después de haber fijado la parte del medio de cada sección transversal y sagital de estos tejidos, se procedió a la inclusión en parafina y al corte de secciones de 5 μm de espesor. La tinción se realizó por el método de hematoxilina y eosina.
a) Tabla 5. Medición de los testículos y pesaje de los epididimos y testículos.
De los resultados de la tabla anterior podemos calcular la relación peso de los testiculos/peso del animal para cada testículo, obteniendo los siguientes valores y sus medias.
Tabla 6. Relación peso de los testiculos/peso del animal.
Al calcular las probabilidades asociadas al test de Student para cada par de grupo de valores obtenemos la siguiente matriz de probabilidades:
Tabla 7. Probabilidades asociadas al test de Student par los valores de la tabla 6.
Nota: existe diferencia significativa cuando el valor de la probabilidad asociada es menor que 0.05.
Observándose que no existen diferencias estadísticamente significativas entre el grupo placebo y las dos variantes de GnRH conjugada a la BSA. Por el contrario, entre cualquiera de estos tres grupos y los grupos conjugados al epitope de la toxina del tétanos si existen diferencias estadísticamente significativas. Y al comparar estos dos últimos grupos entre si encontramos también diferencias significativas, siendo la media de la variante GnRHml la mas pequeña entre todos los grupos y por lo tanto la que tiene un mayor efecto en la reducción del tamaño de los testículos.
Lo mismo hacemos para los epididimos, obteniendo:
Tabla 8. Relación pesos de los epididimos/peso del animal
Al igual que el caso de los testículos obtenemos la siguiente matriz de probabilidades:
Tabla 9. Probabilidades asociadas al test de Student par los valores de la tabla 8.
En el caso de los epididimos se repite el mismo resultado que con los testículos. No existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupo placebo y los grupos conjugados a BSA, pero si entre estos y los dos grupos conjugados al péptido de la toxina del tétanos y los dos grupos asociados a la toxina del tétanos presentan diferencias significativas entre si (ver figura 2), lo que implica que el cambio del residuo glicina.
Como se puede observar los resultados obtenidos con los péptidos GnRH y GnRHml conjugados a BSA son muy similares a ü los obtenidos para el grupo control negativo o placebo. Esto pudiera explicarse teniendo en cuenta que la homología existente entre la albúmina bovina y la porcina es muy
elevada (80%), por lo que ésta seria reconocida como propia por los cerdos .
Al comparar el grupo GnRHml-TT con el placebo se observa una reducción en el peso del epididimo de 2,3 veces, una reducción de 5,0 veces en el peso de los testículos, y una reducción total de 3,8 veces. Al comparar los resultados del grupo GnRH-TT con el placebo se observa una reducción en el peso del epididimo de 1,6 veces, una reducción de 2,8 veces en el peso de los testículos, y una reducción total de 2,4 veces.
A modo de conclusión podemos decir que estamos en presencia de un nuevo péptido análogo de GnRH el cual resulta ser entre 1,4 y 1,8 veces más efectivo que la propia hormona endógena estando ambos conjugados al epitope universal de la toxina tetánica.
Descripción de las figuras .
Figura 1: Testículos de los grupos placebo (izquierda), GnRH- TT (centro) y GnRHml-TT (derecha) . Es evidente el efecto producido en los dos grupos conjugados a la toxina del tétanos. Entre estos dos grupos también se puede observar un mayor efecto de la variante GnRHml-TT.
Figura 2 . Cromatogramas de los péptidos a) GnRH, b) GnRHml, c) GnRHTT y d) GnRHmlTT. En todos los casos se utilizó una columna de fase reversa C18 VYDAC (4,6 x 100 mm) con un gradiente de 5-60 % de acetonitrilo (0,05 % de TFA) en agua (0,1 % de TFA) en 35 min. Los péptidos se detectaron a una longitud de onda de 226 nm.
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
(i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
(B) DIRECCIÓN: Ave. 31 entre 158 y 190, Playa (C) CIUDAD: Ciudad de La Habana
(D) PROVINCIA: Ciudad de La Habana
(E) PAÍS: Cuba
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 10600
(G) TELEFON: 53 7 218466 (H) TELEFAX: 53 7 218070/336008
(ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PREPARADO VACUNAL PARA LA INMUNO-CASTRACIÓN REVERSIBLE DE MAMÍFEROS.
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1
(iv) FORMA DE LECTURA COMPUTARIZADA:
(A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk
(B) COMPUTADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO)
(vi) DATOS DE SOLICITUD DE PRIORIDAD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: CU 120/96
(B) FECHA DE SOLICITUD: 17-DEC-1996
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LENGTH: 10 aminoácidos
(B) TIPO: aminoacídica
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptidica (iii) HYPOTHETICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Mutante de la hormona deliveradora de Gonadotropina. (C) AISLAMIENTO: Mamíferos
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 1
Glu His Trp Ser Tyr Pro Leu Arg Pro Gly 1 5 10
Claims
1. Un péptido que inhibe la liberación de gonadotropina caracterizado porque contiene la secuencia aminoacidica: Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly
2. Un péptido según la reivindicación 1 caracterizado porque está compuesto solo de L-aminoácidos .
3. Un péptido o proteina caracterizado porque contiene como parte de su secuencia aminoacidica la secuencia descrita en la reivindicación 1.
4. Un preparado vacunal caracterizado porque contiene un péptido o proteina como los descritos en las reivindicaciones 1, 2 y 3, que sea utilizado para la inmunocastración de mamíferos.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR9713735-9A BR9713735A (pt) | 1996-12-17 | 1997-12-17 | Vacina para imunocastração reversìvel de mamìferos |
| EP97947684A EP0959079A1 (en) | 1996-12-17 | 1997-12-17 | Vaccine for the reversible immunocastration of mammals |
| CA002275440A CA2275440A1 (en) | 1996-12-17 | 1997-12-17 | Vaccine for the reversible immunocastration of mammals |
| AU53975/98A AU736538B2 (en) | 1996-12-17 | 1997-12-17 | Vaccine preparation for the reversible immunocastration of mammals |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU1996120A CU22627A1 (es) | 1996-12-17 | 1996-12-17 | Preparado vacunal para la inmuno-castración reversible de mamíferos |
| CU120/96 | 1996-12-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO1998027111A1 true WO1998027111A1 (es) | 1998-06-25 |
Family
ID=5459402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/CU1997/000008 Ceased WO1998027111A1 (es) | 1996-12-17 | 1997-12-17 | Vacuna para la inmuno-castración reversible de mamíferos |
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