WO1998029453A1

WO1998029453A1 - Cell membrane-directed drugs

Info

Publication number: WO1998029453A1
Application number: PCT/JP1998/000002
Authority: WO
Inventors: Shinichi Kuriyama; Takashi Hasegawa
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1998-01-05
Publication date: 1998-07-09
Anticipated expiration: 1999-06-27
Also published as: EP0965597A4; US20030220490A1; EP0965597A1; US6500646B1; CA2276091A1

Description

明細書細胞膜指向性薬剤技術分野

本発明は、リン脂質、好ましくは細胞表層を形成する脂質二重層の構成成分に含まれるリン脂質であって、脂質二重層の外層に含まれる割合が細胞が正常でない時に増加するリン脂質、例えば損傷を受けた、変性した、または活性化された時等に増加するリン脂質、に特異的な親和性を有するぺプチドと生理活性物質とが結合した薬剤、生理活性物質がぺプチドである場合に薬剤のァミノ酸配列をコードするデォキシリボ核酸（D N A ) 及びこれら薬剤の製造方法に関する。

本発明は、また、リン脂質、好ましくは細胞表層を形成する脂質二重層の構成成分に含まれるリン脂質であって、脂質二重層の外層に含まれる割合が細胞が正常でない時、例えば損傷を受けた、変性した、または活性化された時、等に増加するリン脂質、さらに好ましくはホスファチジルセリン若しくはホスファチジルエタノ一ルァミン、より好ましくはホスファチジルセリンに特異的な親和性を有する新規べプチド及びそのべプチドをコ一ドする D N Aに関する。

本発明の薬剤及び新規ペプチドは、血液凝固障害、炎症及び免疫応答を伴う疾患の予防及び治療剤として有用である。背景技術

今日、有用性の高い薬剤の創出に関わる研究は盛んに行われている力、その一つとして、体内に投与した薬剤の標的作用部位に到達する割合を高めて無効になる量を減らそうとする試みが知られている。これは、薬剤を部位選択的に集積させようとする試み、いわゆるターゲッティングの試みである。この代表的な方法の一つとして抗原抗体反応を利用する方法を挙げることができる。例えばその一例として、アドリアマイシン（ADM) を含有するリボソームに腫瘍細胞特異的な抗体（2 1 B 2) の F (a b' ) ₂ 断片を結合させたィムノリボソームを作製し、腫瘍細胞へ A DMを集積させる方法（ I . Uy ama e t a 1. , J pn. J. Can c e r Re s. , Vo l. 85， 434 (1 994) ) を挙げることができる。もう一つの代表的な方法は、ポリペプチドからなる受容体とそのリガンドとの結合反応を利用する方法である。その一例として、ホスフォリパーゼ八₂ (PLA₂ ) の C末端に GPnb/GPma受容体に結合性を有する R G Dポリぺプチド配列を付与することによって、血小板の膜表面上に P L A₂ を集積させる方法（A. C. A. P. A. B e k k e r s e t a 1. ， I h r ombo s i s ana Ha emo s t a s i s, Vo l. 74， 1 1 38 ( 1 995 ) ) を挙げることができる。この他の例としては、細胞表面上に存在するへパリンに対して親和性を有するぺプチドをスーパ一ォキシドジスムタ一ゼ（SOD) や補体制御因子に結合させて、 SODを細胞表面上へ集積させる方法（M. I nou e e t a l. , J. B i o l. Ch em. , Vo l. 266, 1 6409 ( 1 99 1 ) ) や、補体制御因子を細胞表面上へ集積させる方法（国際特許出願公開公報 WO/ 96 / 3496 5 ) が報告されている。

一方、それ自身は何ら生理活性を有しないが、標的作用部位に選択的に集積することにより、生理活性因子が標的作用部位に結合することを競争反応的に阻害するペプチドが知られている。その一例として、細胞表面上に存在する受容体に選択的に結合することによりリガンドが受容体に結合するのを阻害するポリペプチドを挙げることができる。その一例として、抗 TN F aモノクロ一ナノレ体の inJ思 Sfii識部位 (c omp l eme n t a r y d e t e rm i n g r e g i o n : C DR) 由来のポリべプチド断片が、 TNF が受容体に結合するのを阻害することが挙げられる（E. Do r i n g e t a 1. , Mo l e c u l a r I mmu n o 1 o g y, Vo l. 3 1， 1 059 ( 1 99 4) ) 。他の一例としては、リン脂質であるホスファチジルセリンに選択的に結合することにより血液凝固反応の進展に関与する因子がリン脂質と結合するのを P且害するポリべプチドで、ヒト F a c t 0 r!IC 2領域末端の 30アミノ酸からなるポリべプチド（国際特許出願公開公報 WO/ 9 0 /1 5 6 1 5 ) や、ホスファチジルセリン認識抗体の C D R由来の 1 2アミノ酸からなるポリぺプチド (特許出願公開公報特開平 5— 92992 ) が挙げられる。

有用性の高い薬剤の創出に関る他の例としては、遺伝子工学的手法により、生理活性を有するぺプチドに新たな生理活性機能を付与する試みが知られている。例えば血液凝固反応を抑制することが知られている TMでは、組織ブラスミノ一ゲンァクチべ一夕一（t PA) 等のフイブリン溶解酵素を TMペプチドに結合させた TM誘導体（特許出願公表公報特表平 4 - 505554 ) , 特定のァミノ酸配列を TMぺプチドの C末端に結合させてアンチトロンビン mの活性を増強する作用及び血小板凝集抑制作用を付与した TM誘導体（特許出願公開公報特開平 6 - 2 7 9 4 9 7 ) などの作出が報告されている。発明の開示

現在、副作用を有するために、その使用量を制限せざるを得ない薬剤が多数知られている。例えば、抗血液凝固剤としてへパリンゃァンチトロンビン mが使用されているが、これらの物質は、出血傾向などの副作用を有するため、その使用を制限せざるを得な L、場合がある。

薬剤を投与する場合、一般に、一定の効果を得るために一定量以上の投与が必要となる場合があり、患者にとって副作用が深刻な問題となる場合がある。また、薬剤の大量投与は患者の経済的負担を増加させることにつながる場合が少なくない。したがって、薬剤として服用した時の副作用を軽減させることが可能で、かつ、患者の経済的負担を増加させることなくより広範に使用することが可能と期待される、少量でも十分に効果を示す活性の高い薬剤の開発が望まれている。

かかる状況において、本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定のリン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とを結合させて作出した特定のリン脂質に親和性を有する薬剤は、特定のリン脂質への集積性が向上しその作用効果が著しく高まることを見出した。さらに、この作用効果の著しい高まりが特定のリン脂質に依存することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明第 1の態様は、リン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とを含有する薬剤である。該薬剤は、好ましくは所望のリン脂質に親和性を有する部分と生理活性を有する部分とを併せ持つ新規な物質を有する薬剤であり、本来天然に存在する形態と異なる意味から、キメラ物質又は異種融合物質を有する薬剤である。ここで、前記リン脂質に対する親和性、若しくはリン脂質に親和性を有する部分は、リン脂質に親和性を有する物質に由来し、生理活性若しくは生理活性を有する部分は、生理活性物質に由来することが好ましい。具体的には、特定のリン脂質、好ましくはホスファチジルセリン若しくはホスファチジルエタノールァミン、より好ましくはホスファチジルセリン、に親和性を有する物質と生理活性物質とを含有して成る薬剤である。ここで、特定のリン脂質に親和性を有する物質はべプチド若しくはべプチドを含有するものであることが好ましく、そして該ペプチドは、下記の一般式で表わされる配列を有するもの、好ましくは該配列からなるものである。なお、本明細書に記載の配列は、いずれもその特性を損なわない限り、その構成要件の一部に置換、欠失、付加及び挿入等が行われてもよい。具体的には配列がアミノ酸配列であればその活性を損なわずに 1以上のアミノ酸が置換、欠失、付加及び挿入等がされていてもよい。

(A 1 ) n , - (A 2 ) n ₂ - (A 3 ) n ₃

(ただし、上記一般式において、 A 1は配列番号 1若しくは配列番号 1 0に記載のァミノ酸配列を示し、 A 2及び A 3はそれぞれ配列番号 2及び配列番号 3に記載のアミノ酸配列を示し、また、 η , 、 η ₂ 及び η ₃ はそれぞれ A 1、 A 2及び A 3の繰り返し回数であってそれぞれ 0〜5、 1〜5及び 0〜5であり、好ましくは、 ru 力く 0若しくは 1、 n ₂ 力《1、 2若しくは 3、 n ₃ が 0若しくは 1である。）

さらに好ましくは、リン脂質に親和性を有する物質が少なくとも下記のいずれかの配列を有する。

(A 1) 1 一 (A2) , 一 (A3) , [配列番号 8若しくは配列番号 9]

(A2) , - (A3) , [配列番号 5]

(A2) ₂ - (A3) , [配列番号 6]

(A2) 3 - (A3) , [配列番号 7]

(A2) 2 己列番号 22]

本発明第 1の態様の薬剤は、生理活性物質として好ましくはべプチドを、具体的には血液凝固反応系に関与する因子、線溶系に関与する因子、免疫応答反応に関与する因子、細胞障害を抑制する因子、蛋白分解酵素の活性を阻害する因子、及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも 1つを、より好ましくは血液凝固反応を抑制する因子、線溶系を亢進する因子、補体活性化反応を抑制する因子、活性酸素による細胞障害を抑制する因子、蛋白分解酵素の活性を阻害する因子及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも 1つを、さらに好ましくは TM、 UTIの第二領域、 MCP、 UT I及びそれらの改変体からなる群から選ばれる少なくとも 1つを、特に好ましくは、配列番号 4若しくは配列番号 23〜25のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する。本発明第 1の態様の薬剤は、生理活性物質と特定のリン脂質に親和性を有する物質とを含有する形態において、好ましくはべプチド結合を介する結合を含み、さらに好ましくは、リン脂質に親和性を有する物質の N末端ァミノ酸と生理活性物質の C末端アミノ酸、若しくはリン脂質に親和性を有する物質の C末端アミノ酸と生理活性物質の N末端ァミノ酸とがべプチド結合を介する結合を含み、より好ましくはリン脂質に親和性を有する物質の N末端ァミノ酸と生理活性物質の C 末端ァミノ酸とがべプチド結合を介して結合している形態を含む。

本発明第 2の態様は、下記の一般式で表されるァミノ酸配列を有するぺプチドを提供する。

(A 2) n₂ 一 (A3) n₃

ただし、 A 及び A 3はそれぞれ配列番号 2及び配列番号 3に記載のァミノ酸配列であり、 n₂ は A 2の繰り返し回数であって 2若しくは 3、 n₃ は A3の繰り返し配列であって 0若しくは 1である。

さらに好ましくは、該ぺプチドのァミノ酸配列が下記のいずれかの配列を有する。

(A2) ₂ - (A3) , [配列番号 6]

(A2) - (A3) , 己列番号 7]

(A2) ₂ [配列番号 22 ] 本発明第 3の態様は、本発明第 1の態様の薬剤若しくは該薬剤のぺプチド部分のァミノ酸配列をコードする DN Aを提供する。

本発明第 4の態様は、本発明第 2の態様のぺプチドのァミノ酸配列をコ一ドする DNAを提供する。

本発明第 5の態様は、本発明第 1の態様の薬剤の製造方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の DNAを得るための PCRに用いた DNAプライマ一を示す図面である。

図 2は、本発明の DNAを得るための P CRに用いた DNAプライマーを示す図面である。

図 3は、ヒト TMc DNAのクローニング及びヒト TM発現べクタ一の構築過程を示す図面である。

図 4は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM発現ベクタ一、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域発現べクタ一、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒ卜 UT I発現べクタ一及びホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト MCP発現べクタ一を構築する際に用いた合成 D N Aを示す図面である。

図 5は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM発現ベクター、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域発現べクタ一、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT I発現べクタ一及びホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト MCP発現ベクターを構築する際に用いた合成 D N Aを示す図面である。

図 6は、本発明の発現ベクター pMl 350の構築過程を示す図面である。図 7は、本発明の発現ベクター pMl 357の構築過程を示す図面である。図 8は、本発明の発現べクタ一 pMl 356の構築過程を示す図面である。図 9は、本発明の発現べクタ一 pMl 354の構築過程を示す図面である。図 1 0は、本発明の発現べクタ一 pM 1 355の構築過程を示す図面である。

図 1 1は、本発明の各種ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト T Mと未修飾可溶型ヒト TMとのプロテイン C活性化を促進する能力を比較した結果を示す図面である。図の縦軸は、プロテイン C活性化促進作用の相対活性を表す。

図 1 2は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (r s TMC 2) のプロテイン C活性化を促進する能力が、ホスファチジルセリンに特異的であることを示す図面である。白カラムは未修飾可溶型ヒト TM (r sTM) を示し、黒カラムはホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (r s TMC 2) を示す。図中、横軸の PC、 PA、 PE及び PSはリポソ一ムの成分を表し、それぞれホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールァミン及びホスファチジルセリンである。また、 L i p 0 (一）は、リボソーム非存在の場合を表す。一方、縦軸は、プロテイン C活性化促進作用の相対活性を表す。

図 13は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TMのリン脂質に対する結合性がホスファチジルセリンに特異的であることを示す図面である。図中、白カラムは未修飾可溶型ヒト TM (r s TM) を表し、斜線を施したカラム及び黒カラムはホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (各々、 r sTMTd、 r s TMC 2) を表す。また、図面の横軸は、ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンとから成るリボソーム中のホスファチジルセリン含有率を表記したものであり、縦軸は結合量（吸光度）を示したものである。

図 1 4は、本発明の発現べクタ一 pM 1 358の構築過程を示す図面である。

図 1 5は、本発明の発現べクタ一 pM 1 2 1 3の構築過程を示す図面である。図 1 6は、本発明の発現ベクター p M 1 3 8 0の構築過程を示す図面である。

図 1 7は、本発明の発現ベクター p M 1 3 7 0の構築過程を示す図面である。

図 1 8は、本発明の発現べクタ一 p M 1 3 7 1の構築過程を示す図面である。

図 1 9は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有するヒト U T Iと未修飾ヒト U T I との活性酸素産生を抑制する能力を比較した結果を示す図面である。図面の縦軸は活性酸素の産生量（単位時間当りの吸光度の変化率）を示したものである。

図 2 0は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有するヒト U T Iの第二領域（r R— 0 2 0 C 2 , 図中：會）と大腸菌で発現させたヒ卜 U T Iの第二領域（図中：〇）とのプロトロンピナ一ゼ活性を阻害する能力を比較した結果を示す図面である。図面の横軸は、 r R— 0 2 0 C 2及び大腸菌で発現させたヒト U T Iの第二領域の濃度をトリプシン阻害活性単位で表記したものであり、縦軸はプロトロンピナ一ゼ活性の残存率を示したものである。

図 2 1は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有するヒト U T Iの第二領域（ r R— 0 2 0 C 2 ) のプロトロンピナ一ゼ活性を阻害する能力が、ホスファチジルセリンに特異的であることを示す図面である。図中の白カラムは r R— 0 2 0を、斜線を施したカラムは r R— 0 2 0 C 2をそれぞれ表す。また、図面の横軸は，ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンとから成るリポソ一ム中のホスファチジルセリン含有率を表記したものであり、縦軸はプロトロンピナーゼ活性の阻害率を示したものである。

図 22は、本発明の発現べクタ一 pM 1 390の構築過程を示す図面である。発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明の「リン脂質」とは、生理活性物質を特定の部位に集積させるために意図される所望のリン脂質であって、細胞表層を形成する脂質二重層の構成成分に含まれるリン脂質であり、脂質二重層の外層に含まれる割合力く、細胞が正常でない時、例えば損傷を受けたり変性したり活性化された時等に増加するリン脂質である。より具体的には、例えば、血液凝固反応が進展している時、炎症若しくは免疫担当細胞による細胞の活性化、障害及び Z若しくはアポト一シス等のいわゆる免疫応答反応が進展している時、活性酸素による細胞の障害反応が進展している時若しくは蛋白分解酵素による細胞の活性化及び/若しくは障害反応が進展している時等に増加するリン脂質である。このようなリン脂質の代表的例として、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールァミン（A l an J. Schro i t e t a 1. ， B i o ch im. B i o p h y s . Ac t a, Vo l. 1071, 3 13 ( 1991 ) ) を挙げることができ、また好ましくはホスファチジルセリンである。

本発明の「親和性を有する」とは、何らかの相互作用をすることを指す。「相互作用」とは、互いに結合すること、複合体を形成すること、互いに分子を認識すること、一定の方向へ移動及び Z若しくは集まろうとすること、分子の形状を変化させること及び互いに反応することが含まれる。また、互いに結合する場合その結合様式に何ら制限はなく、例えば静電的結合及び疎水結合等に代表される非共有結合であってもよいし、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合及びべプチド結合等に代表される共有結合であってもよい。

すなわち、本発明第 1の態様は、リン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質を含有する物質若しくは組成物、好ましくは薬剤であって、特定のリン脂質が共存する条件下でその作用効果が高まることを特徴とする物質若しくは組成物、好ましくは薬剤である。

ここで、「リン脂質が共存する条件下」とは、人為的に作り出された環境及び自然環境が含まれる。人為的に作り出された環境とは例えばリン脂質、血液、細胞、生体組織及びそれらの破砕物力《試験管内若しくはチューブ内等の容器内に含まれている状態等が含まれ、自然環境とは例えば血管や脳、臓器など生体内のあらゆる部分等が含まれる。

なお、本発明で言う「ペプチド」はそのアミノ酸配列の長さに何ら制限はなく、アミノ酸数が 2のいわゆるジペプチドからアミノ酸数が 1， 0 0 0以上にも及ぶポリぺプチドまでを包含する。

本発明の、リン脂質に親和性を有する物質とは、特定のリン脂質に親和性を有する限り、その物質を構成する分子、形状に何ら制限はないが、好ましくはぺプチドで、さらに好ましくは以下のァミノ酸配列からなるぺプチドである。

(A 1 ) n！ - (A 2 ) n ₂ - (A 3 ) n ₃ ここで、 A 1は配列番号 1若しくは配列番号 1 0に記載のァミノ酸配列、 A 2 及び A 3はそれぞれ配列番号 2及び配列番号 3に記載のァミノ酸配列である。但し、 A 1は配列番号 1のァミノ酸配列の全てを若しくは一部を包含すればよい。例えば配列番号 1 0に記載のァミノ酸配列を包含すればよいが、好ましくは配列番号 1のアミノ酸配列全てがよい。配列番号 2中の X a aは Th r若しくは L e uである。 A3は配列番号 3のァミノ酸配列の一部若しくは全てを包含すればよい。また、 n, 、 n₂ 及び n₃ はそれぞれアミノ酸配列 A 1、 A 2及び A 3 の繰り返し回数を表す任意の数であって、 n, は好ましくは 5以下さらに好ましくは 0若しくは 1、 n₂ は好ましくは 1以上さらに好ましくは 1、 2若しくは 3、 n₃ は好ましくは 5以下さらに好ましくは 0若しくは 1である。

以上の配列の組合せは、上記べプチドが特定のリン脂質に対する親和性を有する限りその組合わせ方法に制限はないが、組合わせの好適例として、配列番号 5 〜 9及び配列番号 22に示したものを挙げることができる。

ただし、前述のアミノ酸配列は例示であり、本発明の特定のリン脂質に親和性を有するぺプチドは、特定のリン脂質に対する親和性を有する限りそのァミノ酸配列には制限はなく、必要に応じて前述のアミノ酸配列に置換、欠失、挿入や付加等をすることが可能である。さらに必要に応じて、修飾を施すことも可能である。また、前述のアミノ酸配列とは全く異なるアミノ酸配列のホスファチジルセリンに親和性を有するぺプチド、例えば、 F a c t o r X a等の血液凝固関連因子に含まれるホスファチジルセリンに親和性を有する G 1 a領域（y—カルボキシグルタミン酸残基で特徴付けられる領域）由来のぺプチド（Mann K. G. e t a 1. , B l o o d, Vo l . 7 6, 1 (1 9 9 0) ) 、 F a c t o r V由来のホスファチジルセリンに親和性を有するぺプチド (Thoma s L. 0. e t a 1. ， J . B i o l. C h e m. ， Vo l. 267, 4 1 89 (1 992) ) 、 Ann e x i nV由来のホスファチジルセリンに親和性を有するぺプチド（M. A. S w a i r j 0 e t a 1. , N a t u r e S t r u c t. B i o l . , V o l . 2 ,

968 ( 1 995 ) ) 等またはそれらの誘導体であってもよい。

本発明の薬剤において「生理活性物質」とは、生体内で薬理作用を示すものであればいずれでもよく、例えば、生理活性を有するペプチド、薬理作用を示す化学物質及びそれらの集合体及び封入体等が含まれ、好ましくはべプチドである。ここで、「生理活性を有するぺプチド」とは生体反応に関与するべプチドであれば、ずれのぺプチドであつてもよく、さらに必要に応じて修飾を施すことも可能である。好ましくは本来それ自体が細胞膜と何らかの相互作用をしているべプチド若しくは細胞内、細胞膜上、細胞表層及びその周囲に存在する物質と相互作用するペプチドで、その改変体、変異体や誘導体も含まれる。また、本来、非水溶性のペプチド、例えば一部の膜タンパク質、である場合は、必要に応じて水溶性となるように改変されたペプチドであってもよい。この好適な例として、例えば、血液凝固反応系に関与する因子、線溶系に関与する因子、免疫応答に関与する因子、細胞障害を抑制する因子及び蛋白分解酵素の活性を阻害する因子等が挙げられ、より好ましくは血液凝固反応を抑制する因子、線溶系を亢進する因子、補体活性反応を抑制する因子、活性酸素による細胞障害を抑制する因子及び蛋白分解酵素の活性を阻害する因子等が挙げられる。さらに詳しく例示すると、血液凝固反応系に関与する因子及び/または血液凝固反応を抑制する因子としては、 TM、 UT Iの第二領域、アンチトロンビン m (ATI) 、 T i s s u e F a c t o r P a t hwa y I n h i b i t o r (TF P I)等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体が含まれる。線溶系に関与する因子及び/若しくは線溶系を亢進する因子としては、 t PA、ゥロキナーゼ（UK) 等、及びこれらの改変体、変異体及び誘導体が含まれる。免疫応答反応に関与する因子としては補体活性化反応を抑制する因子である MC P及び De c ay-Ac c e l e r a t i ng Fa c t o r (D AF)等の補体制御因子等、免疫担当細胞由来の蛋白分解酵素を阻害する UT I及び UT Iの第二領域等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体が含まれる。活性酸素による細胞障害を抑制する因子及び Z若しくは蛋白分解酵素の活性を阻害する因子としては、 U T I、 U T Iの第二領域、 E l a f i n、 S e c r e t o r y Leukop ro t e a s e I nh i b i t o r (S L P I )等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体を挙げることができる。また、活性酸素による細胞障害を抑制する因子には s 0 D及び力夕ラーゼ等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体の活性酸素消去作用を有する因子も含まれる。これらの好適例においてさらに好ましくは、 TM、 UTIの第二領域、 MCP、 UTI並びにそれらの改変体、変異体及び誘導体、特に配列番号 4若しくは配列番号 23〜 25で表されるペプチドが好ましい。これらは例示であり、本発明の生理活性物質を何ら限定するものではない。

本発明の第 1の態様の薬剤において「薬理作用を示す化学物質」とは、生理活性を有するぺプチド以外の薬理作用を示す物質全ての中から選ばれる物質であつて、生体内で薬理作用を示す限り表記される分子式による制限はない。具体的には、人工的に合成した化合物、天然物及び微生物産生物質より分離して得た化学物質、核酸、糖及び脂質等が含まれ、それらの修飾物も含まれる。さらに詳しくは、免疫抑制物質であるシクロフォスフアミド、抗癌剤であるァクチノマイシン

D、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒアルロン酸、レシチン等を挙げることができるが、これらは単に一例であって、本発明の生理活性物質を限定するものではない。

生理活性を有する物質若しくは薬理作用を示す化合物の「集合体」とは、化学結合や物理的接着等によって、生理活性を有する物質若しくは薬理作用を示す化合物が一定量以上集積した状態にある物を含み、生理活性を有する物質若しくは薬理作用を示す化合物の「封入体」とは、リボソーム、マイクロカプセル若しくは高分子マトリックス内等に生理活性を有する物質若しくは薬理作用を示す化合物が包含されている状態にあるものを含む。

本発明薬剤第 1の態様の、リン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質が含有される形態は、特に限定されることはない。好ましくは、リン脂質に親和性を有する物質が有する特定のリン脂質に対する親和性と、生理活性物質の活性とがいずれも完全には損なわれることなく、リン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とが実質的に一体となって本発明の薬剤を形成している形態を指す。また、リン脂質に親和性を有する物質が有する特定のリン脂質に対する親和性と、生理活性物質の活性とがいずれも完全には損なわれることなく、リン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とが実質的に一体となって本発明の薬剤を形成している限り、混合物、組成物、複合体及び結合体等いずれの形態も含まれる。すなわち、両者が単に混合している状態であってもよいし、両者を含む組成物であってもよいし若しくは両者が互いに相互作用していてもよい。「相互作用」とは、互いに結合すること、複合体を形成すること、互いに分子を認識すること、一定の方向へ移動及び Z若しくは集まろうとすること、分子の形状を変化させること及び互いに反応することが含まれ、いずれかの形で直接若しくは間接的に結合していることが好ましい。また、互いに結合する場合その結合様式に何ら制限はなく、例えば静電的結合及び疎水結合等に代表される非共有結合であってもよいし、ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合及びべプチド結合等に代表される共有結合であってもよい。必要に応じて任意のアミノ酸配列を有するぺプチド若しくは任意の化合物等の適当なリンカ一及びアダプタ一、例えばピオチンとアビジンによる結合、抗体と抗原による結合若しくは受容体とそのリガンドによる結合等を介してもよく、さらに必要に応じて修飾が施されていてもよい。生理活性物質とリン脂質に親和性を有する物質の少なくとも一方がペプチドの場合は、該ペプチドにおける結合部位としては、 N末端、 C末端、側鎖に存在するァミノ基、カルボキシル基及びシスティン残基のチオール基等が含まれ、好ましくは N末端若しくは C末端である。特に、生理活性物質とリン脂質に親和性を有する物質の両者がぺプチドである場合はべプチド結合を介する結合を含むことが好ましく、さらに生理活性物質とリン脂質に親和性を有する物質の、ずれか一方の N末端と他方の C末端とがべプチド結合を介して結合している形態が好ましい。すなわち、キメラタンパク質、融合蛋白質などが例示される。この中でもリン脂質に親和性を有する物質の N末端と生理活性物質 C末端がぺプチド結合したものがより好ましい。これらの具体的な好ましい一例として、配列番号 4若しくは配列番号 2 3〜2 5から選ばれるアミノ酸配列の C末端に配列番号 5 ~ 9若しくは配列番号 2 2から選ばれるァミノ酸配列が連結したァミノ酸配列からなるべプチドを含有する本発明の薬剤を挙げることができる。本発明は、また、配列番号 6、 7及び 2 2のアミノ酸配列からなる若しくは該配列を含むホスファチジルセリンに親和性を有する新規べプチド及び当該べプチドを成分として含有する医薬品を提供する。当該医薬品は、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する新規ペプチドが、生理活性物質、その集合体若しくはその封入体と混合若しくは結合したものが含まれる。このホスファチジルセリンに親和性を有する新規べプチドが混合若しくは結合した生理活性物質、その集合体若しくはその封入体は正常でない細胞、例えば損傷を受けたり変性したり活性化された細胞の表面に選択的に集積する性質を有する。すなわち、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する新規べプチドが必要に応じて適当なリンカ一を介して結合した生理活性物質は正常でない細胞、例えば損傷を受けたり変性したり活性化された細胞の表面に選択的に集積する性質を有する。同様に、生理活性物質を含む封入体の骨格を構成する成分に親和性を有する物質で修飾した本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する新規べプチドを、生理活性物質を含む封入体と、混合若しくは反応して得られるホスファチジルセリンに親和性を有する新規ペプチドが表面に結合した生理活性物質を含む封入体は、正常でない細胞、例えば損傷を受けたり変性したり活性化された細胞の表面に選択的に集積する性質を有する。例示すると、生理活性物質がリボソーム内に含まれている場合、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する新規べプチドをホスファチジルエタノールアミン等の適当なリン脂質で修飾した後、リボソームと混合することにより得られる本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する新規ぺプチドがリポソ一ム表層に結合した薬剤は、損傷を受けたり変性したり活性化された細胞等の正常でな、細胞の表面に選択的に集積する性質を有する。一方、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する新規ペプチドは、血液凝固反応の進展に関与する生理活性因子が標的作用部位に結合することを競争反応的に阻害する薬剤として使用することも可能である。

本発明の DNAは、実質的に本発明の薬剤を構成するリン脂質に親和性を有する物質及び Z若しくは生理活性物質のぺプチドをコ一ドする塩基配列を有するものであればいずれでもよい。より具体的には、本発明は、以下の配列を含有する、好ましくは該配列から成る DN Aである。

(J 1) - (D 1) m> 一 (D 2) m₂ 一 (D 3) m₃ 一 (J 1) ここで、 J 1は生理活性を有するぺプチドのァミノ酸配列をコ一ドする DNA 配列で、 5' 末端若しくは 3' 末端の少なくともいずれか一方があればよい。また、 D l、 D 2及び D 3はそれぞれ A 1， A 2及び A 3で表されるペプチド 'をコードする D N A配列で、 D 1は配列番号 1 1若しくは配列番号 1 2、 D 2は配列番号 1 3若しくは配列番号 1 4、 D 3は配列番号 1 5に記載の D N A配列である。但し、 D 1は配列番号 1 1の DN A配列の翻訳枠が変化しない範囲でその全てを若しくは一部を包含すればよい。例えば配列番号 1 2の DN A配列を包含すればよいが、好ましくは配列番号 1 1の DN A配列全てがよい。配列番号 1 3 及び 1 4中の Mは A若しくは Cを表す。 D 3は配列番号 1 5の DN A配列の翻訳枠が変化しない範囲でその一部若しくは全てを包含すればよい。また、 m, . m₂ 及び m₃ はそれぞれ DNA配列 D 1、 D 2及び D 3の繰り返し回数を表す任意の数であって、 m, は好ましくは 5以下さらに好ましくは 0若しくは 1、 m₂ は好ましくは 1以上さらに好ましくは 1、 2若しくは 3、 m₃ は好ましくは 5以下さらに好ましくは 0若しくは 1である。以上の配列の組合せは、上記 DN Aから翻訳されるアミノ酸配列から成るぺプチドが本発明の薬剤である限りその組合わせ方法に制限はない。好適な例として、 J 1は例えば血液凝固反応系に関与する因子、線溶系に関与する因子、免疫応答に関与する因子、細胞障害を抑制する因子及び蛋白分解酵素の活性を阻害する因子等のァミノ酸配列をコ一ドする DNAが挙げられ、より好ましくは血液凝固反応を抑制する因子、線溶系を亢進する因子、補体活性化反応を抑制する因子、活性酸素による細胞障害を抑制する因子及び蛋白分解酵素の活性を阻害する因子等のァミノ酸配列をコ一ドする DN Aが挙げられる。さらに詳しく例示すると、血液凝固反応系に関与する因子及び Zまたは血液凝固反応を抑制する因子としては、 TM、 UT Iの第二領域、 ΑΤΠΙ、 TF Ρ I等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体が含まれる。線溶系に関与する因子または線溶系を亢進する因子としては、 t PA、 UK等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体が含まれる。免疫応答反応に関与する因子としては補体活性化反応を抑制する因子である MC P及び DAF等の補体制御因子等、免疫担当細胞由来の蛋白分解酵素を阻害する UT I、 UTIの第二領域等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体等が含まれる。活性酸素による細胞障害を抑制する因子及び/または蛋白分解酵素の活性を阻害する因子としては、 UTI、 UTIの第二領域、 SLP I等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体を挙げることができる。また、活性酸素による細胞障害を抑制する因子には S OD及び力タラ一ゼ等並びにこれらの改変体、変異体及び誘導体の活性酸素消去作用を有する因子も含まれる。より好ましい組合わせの代表例としては、配列番号 21若しくは配列番号 27〜 29のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 16〜20若しくは配列番号 26のヌクレオチド配列が連結したヌクレォチド配列からなる D N A配列を挙げることができる。

また、本発明第 4の態様のホスファチジルセリンに親和性を有する新規べプチドのアミノ酸配列をコードする D N Aの好適な例は、配列番号 1 7、 1 8 及び 2 6の D N A配列（それぞれ配列番号 6、 7及び 2 2のペプチドをコードする）である。

本発明は、また、本発明の D N Aを含む組換え D N A、例えばプラスミド、発現べクタ一を提供する。

周知のように、遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子からコードされるポリペプチドのァミノ酸配列を変えることなくその遺伝子配列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することができる。したがって、本発明の D N Aは、遺伝子コードの縮重に基づき、塩基配列の一個以上の塩基が置換された塩基配列を有していてもよい。特に、本発明のペプチドを遺伝子工学の手法を用いて製造する際に、特定の宿主細胞で使用頻度の高いコドンとなるように一個以上の塩基を置換した塩基配列を有していてもよい。なお、本発明においては、 D N Aの塩基配列は 5 ' 末端側から記載した。また、本発明において A、 G、 C及び Tは、デォキシアデ二ル酸、デォキシグァニル酸、デォキシシチジル酸及びチミジル酸をそれぞれ表す。

本発明の薬剤は、特定のリン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とを個々に作製した後、両者を混合あるいは結合させて得ることができる。ここで、特定のリン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とを混合あるいは結合させる方法は、特定のリン脂質に親和性を有する物質が有する特定のリン脂質に対する親和性と、生理活性物質の活性とがいずれも完全には損なわれることなく、特定のリン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とが実質的に一体となつて本発明の薬剤を形成している限りどのような方法であつてもよい。本発明の特定のリン脂質に親和性を有する物質は、好ましくはべプチドであり、下記より選ばれる少なくとも一つの工程を行うことを特徴とする方法によって得ることができる。

a) 当該ペプチドを化学合成して得る工程

b) 当該べプチドのァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を有する DN Aを得るェ程

c) ベクタ一に当該 DN Aを組み入れて、当該 DN Aを含む複製可能な組換え D N Aを得る工程

d) 当該組換え DN Aで宿主細胞を形質転換させて、当該ペプチドを発現し得る形質転換体を得る工程

e) 該形質転換体を培養して、当該ペプチドを産生せしめ、培養混合物から当該ぺプチドを回収する工程

本発明のァミノ酸配列を有するぺプチドを化学合成して得る方法は、例えば、自動べプチド合成機を用いて合成することにより得ることができる。

本発明のぺプチドをコ一ドする塩基配列を有する DN Aは、例えば以下の如く調製される。なお、特に明記しない限り、一般的な遺伝子工学の手法は、成書 (例んは、 Mo l e c u l a r C l o n i n , a l ab o r a t o r y manu a l, S e c ond e d i t i on, T. m a n i a t i s e t a 1. , Co l d Sp r i ng Ha r bo r L a bo r a t o r y P r e s s (1 989) ) に記載された方法に基づいて実施することが可能である。まず、ヒト細胞ゃヒト臓器より抽出した mRNAをもとに作製した c DNA、若しくは巿販のヒト c DNAライブラリーゃヒト染色体 DNAを铸型 D NAとする。次いで、既知の遺伝子（例えば、ヒト F a c t 0 r\l遺伝子）の塩基配列を参照し、自動 D N A合成機で化学合成した DNAプロ一ブを用いて铸型 DNAをスクリーニングし、所望のポリペプチドをコードする DNAを得る。特定のリン脂質に親和性を有するポリぺプチドをコードする D N Aは、また、自動 DNA合成機を用いた化学合成のみで得ることも可能である。特定のリン脂質に親和性を有するぺプチドをコ一ドする DN Aを得るための他の好ましい方法の一例は、 Po l yme r a s e Cha i n Re ac t i on (以下 P CR と記載する）を利用する方法である。すなわち、既知の遺伝子（例えば、ヒト F a c t 0 r观遺伝子）の塩基配列を参照し、必要に応じて塩基配列や制限酵素認識部位を付加した DNAプライマ一を化学合成し、前述の c DNAを铸型 DN Aとして PC Rを行い、所望の DN Aを得ることができる。なお、 PCR は成書（例えば、 PCR P r o t o c o l s, A Gu i d e t o me t hod s and app l i c a t i on s, Mi cha e l A. I. e t a 1. , Ac ademi c Pr e s s ( 1990 ) ) を参考として行うことができる。

当該 DNAをベクターに組入れる工程は、前述の成書に記載された遺伝子工学の一般的な手法に準じて実施することができる。すなわち、ベクタ一のクロ一二ングサイトを適当な制限酵素で消化し、そこへ必要に応じて制限酵素で消化した当該 DNAを、必要に応じてリンカ一等を用いて挿入すればよい。また、ここで使用するベクターとしては、使用する宿主内で複製可能なベクターであればいずれでも良いが、好ましくは、当該ペプチドを宿主内で発現させるために必要なプ口モータ一、リボソーム結合部位、シグナルペプチドをコードする DNA及び/ 若しくはポリ A付加シグナルを含有し、使用する宿主内で複製可能なベクタ一を選択する。使用するプロモータ一、リボソーム結合部位、シグナルペプチドをコードする DNA及びポリ A付加シグナルは、使用する宿主内で機能するすべてのプロモータ一、リボソーム結合部位、シグナルペプチドをコードする DNA 及びポリ A付加シグナルが使用可能であり、これらは化学的に合成する若しくは任意の細胞、使用する宿主、ウィルス、プラスミド若しくはファージ等から入手することが可能である。

得られた組換え DNAを宿主細胞に導入する工程は、成書（例えば、「新細胞工学実験プロトコ—ル」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、 1 99 1年）に記載された当該分野で一般的な方法、例えばコンビテントセル法、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法若しくはエレクトロポレーション法等に準じて実施することができる。得られた組換え D N Aを導入する宿主細胞は、 He La細胞、 COS細胞、 CHO細胞、酵母及び昆虫細胞等に代表される真核生物細胞であっても、また、大腸菌及び枯草菌等に代表される原核生物細胞であってもよく、本発明のぺプチドの発現に適した細胞を適宜選択して使用することができる。また、宿主細胞とベクターは、互いに機能し合い、当該ペプチドをコードする DNAを発現し得る組み合わせで使用するのが有用である。例えば、ベクターと宿主の組み合わせの好ましい例としては、 COS細胞若しくは CHO細胞とシミアンウィルス 40 (S V 40) の初期プロモータ一を含有するベクタ一、 EF— 1 αプロモータ一（EFプロモータ一）を含有するベクター若しくは S R αプロモーターを含有するベクター等、酵母サッカロミセスセレピシェと 3—ホスホグリセレ一トキナ一ゼ遺伝子のプロモーターを含有するべクター等若しくは大腸菌 Η Β 1 0 1と大腸菌由来トリブトファンプロモータ一を含有するベクタ一等の組み合せがあげられる。

発現用ベクターで形質転換された宿主は、微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞を培養する公知の一般的方法に準じて栄養培地を用、て培養することができる。形質転換された宿主によって生産される当該ペプチドは、多くの文献や成書（例えば、「新生化学実験講座 1 タンパク質 I」（日本生化学会編、東京化学同人、 1 9 9 0年））に記載された方法を参考にして、培養混合物から精製、単離及び回収することができる。すなわち、脱塩、濃縮、塩析、限外ろ過、イオン交換ク口マトグラフィ一、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一及びゲルろ過のうちから選ばれる少なくとも一つの方法を用いて当該べプチドを純粋な形で得ることができる。

生理活性を有するぺプチドは、前述の特定のリン脂質に親和性を有するぺプチドを得る方法と同様にして得ることができる。すなわち、例えばヒト ΤΜを、化学合成によって得ることも、遺伝子工学的手法を用いて得ることも若しくは両者を組み合わせて得ることもできる。

薬理作用を示す化学物質は化学合成で得ることができる。また、化学合成で得ることが困難であったり化学合成のための費用が非常にかかる場合には、天然物から抽出、分離及び精製したり、微生物を培養してその培養上清から分離及び精製して得ることも可能である。

本発明の薬剤が、生理活性物質とリン脂質に親和性を有する物質の両者がぺプチドであって、いずれか一方の N末端と他方の C末端とが、必要に応じて任意の長さのぺプチドをリンカ一として介在させて、ぺプチド結合により直鎖状に結合している場合は、下記より選ばれる少なくとも一つの工程を行うことを特徴とする方法によつて直接得ることができる。

a) 当該薬剤のァミノ酸配列を有するぺプチドを化学合成して得る工程 b) 当該薬剤のァミノ酸配列をコードする塩基配列を有する DN Aを得る工程 c) ベクタ一に当該 DN Aを組み入れて、当該 DNAを含む複製可能な組換え D N Aを得る工程

d) 当該組換え DNAで宿主細胞を形質転換させて、当該ペプチドを発現し得る形質転換体を得る工程

当該薬剤のァミノ酸配列を有するぺプチドは、例えば、自動べプチド合成機を用、た化学合成によって得ることができる。

当該薬剤のァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を有する DN Aは、例えば以下の如く調製される。なお、特に明記しない限り、一般的な遺伝子工学の手法は、成書（例えば、 Mo l e c u l a r C l on i ng, a l ab o r a t o r y manu a l, S e c ond e d i t i o n, T. m a n i a t i s e t a 1. , Co l d S r i n Ha r bo r L abo r a t o r y P r e s s ( 1 989 ) ) に記載された方法に基づいて実施することが可能である。まず、ヒト細胞若しくはヒト臓器より抽出した mRNAをもとに作製した cDNA、市販のヒト cDNAライブラリ一若しくはヒト染色体 DNAを铸型 DNAとする。次いで、既知の生理活性を有するペプチド遺伝子（例えば、ヒト TM遺伝子）の塩基配列を参照し、自動 DNA合成機で化学合成した DNAプローブを用いて铸型 DNAをスクリーニングし、生理活性を有するぺプチドのー部若しくは全てをコードする DNA (I) を得る。 DNA (I) は、また、自動 DN A合成機を用いた化学合成のみで得ることも可能である。同様に、特定のリン脂質に親和性を有するぺプチド（例えば、ヒト F a c t o r丽 C末端領域）をコードする DNA (II) を得ることができる。 DNA ( I ) 及び DNA (I I) を得るための他の好ましい方法の一例は、 PCRを利用する方法である。すなわち、既知の遺伝子（例えば、ヒト TM遺伝子ゃヒト F a c t 0 r 遺伝子）の塩基配列を参照し、必要に応じて塩基配列や制限酵素認識部位を付加した DN Aプライマ一を化学合成し、前述の c DNAを铸型 DNAとして PCR を行い、所望の DN Aを得ることができる。なお、 PCRは成書（例えば、 PCR P r o t o c o l s, A Gu i d e t o me t h o d s a n d a p p l i c a t i o n s, M i c h a e l A . I. e t a l. , Ac ademi c Pr e s s (1990) ) を参考として行うこと力くできる。以上のようにして得た DNA (I) と DNA (I I) とを必要に応じて制限酵素で消化し、さらに必要に応じて化学合成した DN Aリンカ一を介在させて結合させれば、本発明の薬剤をコ一ドする DNAを含む DNA断片を得ることができる。

ベクターに当該 D N Aを組み入れて当該 D N Aを含む複製可能な組換え D N A を得る工程、当該組換え DN Aで宿主細胞を形質転換させて当該薬剤を発現し得る形質転換体を得る工程及び該形質転換体を培養して当該薬剤を産生せしめ培養混合物から当該薬剤を回収する工程は、前述の特定のリン脂質に親和性を有するぺプチドを得る方法と同様に実施することができる。

本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する新規べプチドは、それを生理活性物質若しくはその集合体や封入体に結合させることによって、生理活性物質、その集合体若しくはその封入体を正常でない細胞、例えば、損傷を受けたり、変性したり若しくは活性化された細胞の表面に選択的に集積させることを可能にする手段を提供する。例えば、生理活性物質が封入体内に包含されたものである場合、特定のリン脂質に親和性を有する物質を、封入体の骨格を構成する成分に親和性を有する物質で修飾した後、生理活性物質を含む封入体と混合することにより、生理活性物質を含む封入体に当該特定のリン脂質に親和性を有する物質を表面に結合させて本発明の薬剤を得ることができる。好ましい例を例示すると、生理活性物質がリボソーム内に含まれている場合、特定のリン脂質に親和性を有する物質をホスファチジルェタノ一ルァミン等の適当なリン脂質で修飾した後、リボソームと混合することにより得られる特定のリン脂質に親和性を有する物質をリボソーム表層に結合させることにより、本発明の薬剤を得る方法を挙げることができる。

本発明の物質若しくは薬剤、例えば実施例に示される物質等には著しい毒性は認められなかった。

その他本発明の薬剤は、医薬用担体及び媒体、例えば滅菌水、生理食塩水、植物油、鉱油、高級アルコール、高級脂肪酸及び無害性有機溶媒等、さらには必要に応じて賦形剤、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、吸着防止剤、安定化剤、保存剤、保湿剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤及び無痛化剤等と適宜組み合わせて注射剤及び経口剤などの医薬組成物ゃキッ卜の形態をとることができる。本発明の薬剤は、好ましくは非経口的に、たとえば、静脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射若しくは皮下注射等により全身若しくは局部的に及び急速若しくは持続的に投与することができる。し力、しな力ら、本発明の薬剤の使用はこれらの投与方法に制限されるものではない。さらに、他の薬剤と併用してもよい。

また、本発明の薬剤の投与量は、当該薬剤の含有する生理活性物質により、また、患者の病態により適宜調節することができる。

本発明はまた、生理活性物質を部位選択的に集積させることによつてその作用効果を著しく上昇させるための新規な方法をも提供する。すなわち本発明は、特定のリン脂質に対する親和性を有する物質を所望の生理活性物質に結合させることにより、所望の生理活性物質を細胞表層へ集積させてその作用効果を高める方法を提供する。ここで、生理活性物質を集積させるための標的分子となるリン脂質は、あらゆる細胞が例外なく保持する細胞膜を構成する分子であるという点で、従来、薬剤をターゲッティングさせようとする時の標的分子とされてきた、細胞膜上に散在し必ずしも全ての細胞が保持するとは限らない前述の特定の抗原及びポリぺプチドからなる特定の受容体や特定の分子等とは根本的に異なる。したがって、あらゆる細胞、細胞から構成されるあらゆる組織及び臓器が本発明の薬剤における生理活性物質の活性が上昇する場所となり得る。そして、生理活性物質に付与された親和性が特定のリン脂質に対するものであれば、あらゆる細胞、細胞から構成されるあらゆる組織及び臓器のうち特定の細胞、組織や臓器において生理活性物質の活性を選択的に上昇させることが可能となる。すなわち本発明は、生理活性物質を正常でない細胞及び組織や臓器の表層に選択的に集積させてその作用効果を高めるという全く新しい概念に基づいた薬剤の送達方法若しくはドラッグデリパリ一システムを提供する。実施例に記載の通り、 T M、 U T I、 U T Iの第二領域若しくは M C Pにリン脂質に親和性を有するぺプチドを結合させたリン脂質に親和性を有する物質を作製した。この時、リン脂質に親和性を有する TM、リン脂質に親和性を有する U T I若しくはリン脂質に親和性を有する U T Iの第二領域ではその活性及びリン脂質に対する集積性が増加し、その作用効果が高まった。また、リン脂質に親和性を有する M C Pにおいても、成書 ( 「捕体学」、稲井眞彌（I N A I M. ) ら著、医歯薬出版株式会社、 1 9 8 2 ) に記載の補体依存性溶血の抑制作用の測定を行うことにより、活性の増加及びリン脂質に対する集積性の増加は確認できる。これらの実施例は、血液凝固反応が進展している部位、炎症や免疫担当細胞による細胞の活性化及び障害等のいわゆる免疫応答反応が進展している部位、活性酸素により障害を受けている部位及び蛋白分解酵素により細胞の活性化及び障害反応が進展している部位等における細胞、組織及び臓器の表層に生理活性物質を選択的に集積させてその作用効果を高める、という上述の全く新い、概念に基づいた薬剤の送達方法若しくはドラッグデリバリ一システムの例示である。すなわち、本発明により、血液凝固障害、炎症及び免疫応答反応を伴う疾患の予防及び治療剤として有用な薬剤、新規ペプチド、それらの製造に必要な D N A、及び当該薬剤の製造方法が提供される。また、本発明の薬剤は医薬品に限定されるものではなく、例えば臨床試薬または研究試薬等に使用できる。

以下に実施例をもって、本発明をいつそう具体的に説明するが、これらは実施の一例として示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は当該分野における慣例略号に基づくものである。

また、遺伝子組換えに関わる技術として、特に記載のない限り、「Mo 1 e c u l a r C l on i ng, a l a b o r a t o r y manu a l,

S e c ond e d i t i on」 (T. ma n i a t i s e t a 1. , Co l d Sp r i n g Ha r bo r La b o r a t o r y P r e s s (1 989) ) 、「A P r a c t i c a l Gu i d e t o M o 1 e c u 1 a r C l on i n g ( 2 n d Ed i t i on) 」 (B e r n a r dP e r b e t a 1. , J o h n W i l e y & S o n s ( 1 9 8 8) ) 、「PCR P r o t o c o l s, A Gu i d e t o me t ho d s and a p p l i c a t i on s」 (Mi c h a e l A. I. e t a 1. , Ac a d emi c P r e s s (1 990) ) 、「新細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、 1 9 9 1年）、「遺伝子工学ハンドブック」（村松正実ら（Mu r ama t s u M. ) 編、羊土社、 1 99 1年）等の書物ならびに試薬あるいは器具に添付のプロトコ一ルを採用して行った。

なお、実施例に開示する r sTMTd及び r sTMC 2の発現ブラスミドであるそれぞれ p M l 3 5 4及び pMl 3 5 7を有する大腸菌は、平成 8年 1 2 月 1 6日付で日本国茨城県つくば市東一丁目一番三号の工業技術院生命ェ学工業技術研究所に寄託し（それぞれ受託番号 P— 1 60 08及び受託番号 P— 1 6 0 0 9 ) 、さらに平成 9年 1 2月 8日付で原寄託から国際寄託に移管した（受託番号 FERM B P— 6 1 9 4及び受託番号 F ERM B P— 6 1 9 5 ) 。また、ヒト MC Pの発現プラスミドである pM 8 5 1を有する大腸菌は、平成 4年 1月 2 2日付で日本国茨城県つくば巿東一丁目一番三号の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し（受託番号 P— 1 2 7 1 5) 、さらに平成 5年 2月 1 8日付で原寄託から国際寄託に移管した（受託番号 FERM BP— 4 1 9 5) o

実施例 1

ホスファチジルセリンに親和性を有するぺプチドの化学合成

配列番号 5、 6及び 2 2のァミノ酸配列を有するぺプチドを、自動べプチド合成機（4 3 2 A型、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて固相合成した。なお、操作方法は特に明記しない限り、添付の操作マニュアルに従った。切り出し、脱保護反応を行い、エーテル中でペプチドを沈殿させた後、エーテルを除去して凍結乾燥した。これを 1 0 %ァセトニトリル、 0. 1 %トリフルォロ酢酸水溶液で溶解し、 C 1 8カラム（CAPCELLPACC 1 8 AG 1 2 0、資生堂社製）、高速液体クロマトグラフィー（6 2 5 L Cシステム、ウォーターズ社製）を用いて、 0. 1 %トリフルォロ酢酸及び 1 0 %〜6 0 %ァセトニトリル水溶液で直線濃度勾配法により精製した。

収量は、それぞれ 1 0mg、 6111 及び1 2mgであった。

実施例 2

ヒト TMcDNAのクロ一ニング及びヒト TM発現プラスミドの作製

ヒト胎盤約 2 0 gを材料として、グァニジンチオシァネ一ト法により全 RNA を抽出した。得られた RNAのうち 1 Omgを使用して、オリゴ dTセルロース (タイプ 7、フアルマシア社製）カラムに 2回通すことにより、ポリ A + RNA 約 90 gを精製した。次にこのポリ A + RNAを材料として 1本鎖 cDNAの合成を行った。すなわち、ポリ A + RNA 1 0 gより、常法にしたがってオリゴ dTをプライマーとして逆転写酵素により 1本鎖 c D N Aを作製した。

一方、既知のヒト TM遺伝子の塩基配列（K. S u z uk i e t a 1. , EMBO J. ， Vo l. 6, 1 89 1 (1 987) 、 R. W. J a c km a n e t a 1. , P r o c. N a t l . A c a d. S c i . USA,

Vo l. 84, 6425 ( 1 987 ) ) を参考として、ヒト TM遺伝子の塩基配列の一部に対応し、かつ 5' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DNAプライマー 6種（S 1 ~S 3及び A 1〜A 3、図 1及び図 2 ) を化学合成機 (38 1 A型、アプライドバイオシステムズ社製）にて作製した。なお、 S 3にはサイレントミューテ一シヨンにより制限酵素 Xh 0 I認識部位を導入した。また、 A 3は終止コドンに対応する DN A配列を含む。合成した DNAプライマ一は、 OPCカラム（アプライドバイオシステムズ社製）にて精製した。

次に、前述の 1本鎖 c DNAを铸型 DNAとし、化学合成した DN Aブライマ一を用いて表 1の反応液組成により PCRを行い、ヒト TMcDNAを 3つの部分に分割して増幅した（用いた DN Aプライマーと増幅される遺伝子との対応を表 2に示した。）。遺伝子増幅はサ一マルサイクラ一（P J 1 0 0 0 型、パーキンエルマーシータス社製）を用い、 9 4°Cで 1分、 5 5 °Cで 2 分、 7 2°Cで 3分の反応サイクルを 3 0回繰り返すことにより行い、反応終了後、反応液の一部を採り、ァガロース電気泳動により目的とするサイズの DN Aが増幅されていることを確認した。表 1 PCR反応液組成蒸留水 77 1 緩衝液" 1 0 1 dNTP混合液（2. 5 mM) 8 1 センスプライマ一（1 n g/i 1 ) 1 - 1 アンチセンスプライマー（1〃gZ〃 1) 1 1 铸型 DNA (約 20 n g/ 1 ) 2. 5111 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ（5 u n i t sZ H 1 ) 0. 5 1

1 00 z 1

*) 緩衝液： 0. 1M トリス塩酸（pH= 8. 3)

0. 5M 塩化カリウム

1 5 mM 塩化マグネシウム

表 2 センスプライマ- マ—の

組合わせと増幅遺伝子

反応液から増幅された遺伝子（フラグメント I〜！ I) をフノール · クロ口ホルム処理、エタノール沈殿により精製、回収した。フラグメント i、 π及び mはそれぞれ S a 1 I/B amH Hi nd IE/ Sa l I、 Ps t l/BamHI で制限酵素消化した後、常法に従ってクロ一ニング用ベクター pUC 1 18へサブクローニングし、 pひ C 1 18— F I、 pUC 1 18— FII、 pUC 1 18 - Finを各々得た。続いて、 pUC 1 18— F Iを H i n d ΙΠ/D d e Iで、 pU C I 18— 11を0(16 I/S a 1 Iで、また pUC l 18— FIEを Xho l/ E c oR Iで制限酵素消化し、常法に従ってァガロース電気泳動によりそれぞれ約 450 bp、約 650 bp、約 650 b pの DNA断片を分離、回収した。これら回収した 3種類の DNA断片と pUC 1 18の制限酵素 H i n dffi/E c o R I消化物とを常法に従ってライゲ一シヨンさせ、シグナルべプチドを含むヒト TMcDNA全長を含むプラスミド pUC l 18— TMを作製した（構築過程を図 3に示した）。また常法に従い、 c DN A部分の塩基配列を DN Aシークェンサ一（370 A、アプライドバイオシステムズ社製）にて決定したところ、ヒト TMc DNAであることが確認された。

次に、 p UC 1 1 8—TMを制限酵素 S a 1 I及び E c o R Iで消化し、ァガロース電気泳動により常法に従って約 1. 7 k b p長を有する DNA断片を分離、精製した。これを、哺乳動物細胞発現べクタ一 p c DL-SRa 29 6 (Y. Ta k e b e e t a l. , Mo l. C e l l. B i o l . , Vo l. 8, 466 (1988 ) ) のクロ一ニングサイト P s t I— E c oR I 間に、化学合成（既出）にて作製し OP。カラム（既出）にて精製した Ps t I —3& 1 1リンカ一（5' —丁〇0八丁〇〇八ー3' ) と共に揷入し、ヒト TM 発現ベクター p SRa— TMを構築した（構築過程を図 3に示した）。

実施例 3

ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TMを発現するプラスミドの作成

(1) pMl 350の作製

1本鎖 DNA4種（F 1〜F 4、図 4) を化学合成機（既出）で合成し、 F 1 と F 2及び F 3と F 4とをそれぞれ常法に従ってアニーリングさせ、 5' 末端に B sm I切断面 Z3' 末端に E c oR I切断面を有する約 30 b p長の DNAフラグメント A、及び 5' 末端に N s p V切断面 /3' 末端に EcoRI切断面を有する約 90 b p長の DNAフラグメント Bを得た。次に、実施例 2で作製した pUC 1 18— TMを制限酵素 B sml及び E c o R Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 6 kbpの DNA断片と、フラグメント Aとを常法に従ってライゲ一ションし、 pUC 1 1 8 -TMs u b 1を得た。続いて、この pUC l 1 8— TMs u b lを制限酵素 M 1 u I及び E c o R Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 8 k b pの DNA断片と、実施例 2で作製した p SRa— TMを制限酵素 M 1 u I及び E c oR Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 4 k b pの DNA断片とを常法に従ってラィゲーシヨンし、 p S R 一 TM s u b 1を得た。さらに、この p S R 一 TMs u b 1を制限酵素 N s p V及び E c o R Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 5. 2 kb pの DNA断片と、フラグメント Bとを常法に従つてライゲーシヨンし、 pMl 3 5 0を得た（構築過程を図 6に示した）。本ブラスミドは、配列番号 2 1のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 1 6のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる DN Aを含有し、これを用いれば、配列番号 4のァミノ酸配列の C末端に配列番号 5のァミノ酸配列が連結したァミノ酸配列からなるペプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (以下、 r s TM\iと記載）を生産することができる。

(2) pM 1 3 5 7の作製

既知のヒト F a c t 0 r VI遺伝子の塩基配列（Wi l l i am I . Wo o d e t a 1. ， Na t u r e, Vo l . 3 1 2， 3 3 0 ( 1 9 8 4 ) ) を参考として、ヒト F a c t o r\i遺伝子の塩基配列の一部に対応する DNAブライマ一 2種（S 4及び A 4、図 1及び図 2 ) 、及び、ヒト F a c t 0 r 1遺伝子の塩基配列の一部に対応し、かつ 5' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DNAプライマー 2種（S 5及び A 5、図 1及び図 2 ) の計 4種を化学合成機（既出）にて作製した。なお、 A 5は終始コドンに対応する DN A配列を含む。合成した DNAプライマ一は、 0 PCカラム（既出）にて精製した。

次に、実施例 2でヒト胎盤由来のポリ A + R N Aより作製した 1本鎖 c D N A を铸型 DNAとし、センスプライマ一及びアンチセンスプライマーとして各々化学合成した DNAプライマ一 S 4と A4とを用いて表 1と同様の反応液により P CRを行い、ヒト F a c t 0 r C 2領域を含む領域をコ一ドする c DNAを増幅した。遺伝子増幅はサ一マルサイクラ一（既出）を用い、 94°Cで 1分、 5 5 °Cで 2分、 72°Cで 3分の反応サイクルを 40回繰り返すことにより行い、反応終了後、反応液の一部を採り、ァガロース電気泳動により少なくとも目的とするサイズの D N Aが増幅されていることを確認した。

続いて、 P C Rによって得られた DN A断片を铸型 DN Aとし、センスプライマ一及びァンチセンスプライマーとしてそれぞれ化学合成した DN Aプライマー S 5と A 5とを用いて表 1と同様の反応液により P CRを行い、ヒト Fa c t o rHC 2領域をコードする c DN Aを選択的に増幅した。遺伝子増幅はサ一マルサイクラ一（既出）を用い、 94°Cで 1分、 5 5°Cで 2分、 72 °C で 3分の反応サイクルを 3 0回繰り返すことにより行い、反応終了後、反応液の一部を採り、ァガロース電気泳動により目的とするサイズの D N Aが増幅されていることを確認した。

反応液から増幅された遺伝子をフヱノール. クロ口ホルム処理、エタノール沈殿により精製、回収し、制限酵素 B sm I及び E c oR Iで消化して 5' 末端に B sml切断面ノ 3' 末端に E c oR I切断面を有する約 0. 5 kbp長の DN A断片を得た。次に、実施例 2で作製した pUC 1 1 8— TMを制限酵素 B sm I及び E c oR Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 6 k b p の DNA断片と、上記の約 0. 5 k b p長の DN A断片とを常法に従ってラィゲ一シヨンし、 pUC 1 18 -TMs u b 2を得た。続いて、この pUC 1 1 8— TMs ub 2を制限酵素 Ml u I及び N s p Vで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 1. 2kbpの DNA断片と、実施例 3— （1) で作製した pMl 350を制限酵素 Ml u I及び Ns p Vで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 5 kbpの DNA断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 PM 1 3 57を得た（構築過程を図 7に示した）。本プラスミドは、配列番号 21のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 20のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる DNAを含有し、これを用いれば、配列番号 4のァミノ酸配列の C末端に配列番号 9のァミノ酸配列が連結したァミノ酸配列からなるべプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (以下、 r sTMC2と記載）を生産することができる。

(3) pM 1356の作製

既知のヒト F a c t 0 rVDI遺伝子の塩基配列（既出）を参考として、ヒト Fa c t o r II遺伝子の塩基配列の一部に対応し、かつ 5 ' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DN Aプライマ一 1種（S6、図 1) を化学合成機（既出）にて作製した。合成した DNAプライマ一は、 OPCカラム（既出）にて精製した。

次に、実施例 3— (2) において DNAプライマー S 4と A 4とを用いた P C R反応によって増幅させたヒト F a c t 0 rMC 2領域を含む領域をコ一ドする DNA断片を铸型 DNAとし、センスプライマ一及びアンチセンスプライマ一としてそれぞれ化学合成した DNAプライマー S 6と、実施例 3— (2) で作製した DN Aプライマ一 A 5とを用いて表 1と同様の反応液により PCRを行い、ヒト Fa c t o rVIHC 2領域 C末端の 60アミノ酸をコ一ドする DN A断片を選択的に増幅した。遺伝子増幅はサ一マルサイクラ一（既出）を用い、 9 4 で 1分、 55^DCで 2分、 72 °Cで 3分の反応サイクルを 30回繰り返すことにより行い、反応終了後、反応液の一部を採り、ァガロース電気泳動により目的とするサイズの D N Aが増幅されていることを確認した。

反応液から増幅された遺伝子をフヱノール. クロ口ホルム処理、エタノール沈殿により精製、回収し、制限酵素 B sml及び E c oR Iで消化して 5' 末端に B sml切断面 3' 末端に E c oR I切断面を有する約 0. 2 kbp長の DN A断片を得た。次に、実施例 2で作製した p U C 1 1 8— TMを制限酵素 B s m I及び E c oR Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 6 kb p の DNA断片と、上記の約 0. 2 k b p長の DN A断片とを常法に従ってラィゲーシヨンし、 pUC 1 1 8 -TMs u b 3を得た。続いて、この pUC 1 1 8 -TMs u b 3を制限酵素 Ml u I及び N s p Vで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 9 kbpの DN A断片と、実施例 3— （1) で作製した pM 1 350を制限酵素 M 1 u I及び N s p Vで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 5 k b pの DNA断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 M 1 3 5 6を得た（構築過程を図 8に示した）。本プラスミドは、配列番号 2 1のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 1 9のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる DN Aを含有し、これを用いれば、配列番号 4のァミノ酸配列の C末端に配列番号 8のァミノ酸配列が連結したァミノ酸配列からなるべプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (以下、 r sTMC 2Dと記載）を生産することができる。

(4) pM 1 3 54の作製

1本鎖 DNA4種（F 5〜F 8、図 4) を化学合成機（既出）で合成し、 F 5 と F 6及び F 7と F 8とをそれぞれ常法に従ってアニーリングさせ、 5' 末端に N s p V切断面 Z3' 末端に E c oR I切断面を有する約 60 b p長の DNAフラグメント C、及び 5' 末端に Ns p V切断面 Z3' 末端に E c oR I切断面を有する約 90 b p長の DNAフラグメント Dを得た。次に、実施例 3— （1) で作製した p SRひ一 TMs u b 1を制限酵素 N s p V及び E c oR Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 5. 2 k b pの DNA断片と、フラグメント Cとを常法に従ってライゲ一ションし、 p SR 一TMs ub 2を得た。続いて、この p SR 一TMs ub 2を制限酵素 Ns pV及び E c oR Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 5. 3 kbpのDNA断片と、フラグメント Dとを常法に従ってライゲ一シヨンし、 pMl 354を得た（構築過程を図 9 に示した）。本プラスミドは、配列番号 2 1のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 1 7のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる D N Aを含有し、これを用、れば、配列番号 4のァミノ酸配列の C末端に配列番号 6のァミノ酸配列が連結したアミノ酸配列からなるペプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (以下、 r sTMTdと記載する）を生産することができる。

(5) pM 1 35 5の作製

実施例 3 - (4) で作製した p SRa— TMs ub 2を制限酵素 N s p V及び E c o R Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 5. 3 kbpのDN A断片と、実施例 3— （4) で調製したフラグメント Cとを常法に従ってラィゲーシヨンし、 p S R α— TM s u b 3を得た。続いて、この p SR 一 TMs u b 3を制限酵素 N s p V及び E c o R Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 5. 4 kbpの DNA断片と、実施例 3— （4) で調製したフラグメント Dとを常法に従ってライゲ一シヨンし、 pMl 3 55を得た（構築過程を図 1 0に示した）。本プラスミドは、配列番号 2 1のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 1 8のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる DNAを含有し、これを用いれば、配列番号 4のアミノ酸配列の C末端に配列番号 7のァミノ酸配列が連結したアミノ酸配列からなるペプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (以下、 r s TMT d— 3と記載）を生産することができる。

(6) M 1 358の作製

1本鎖 DNA2種（ 9及び？ 1 0、図 4) を化学合成機（既出）で合成し、 F 9と F 1 0を常法に従ってアニーリングさせ、 5' 末端に N s pV切断面 /3' 末端に E c oR I切断面を有する約 60 b p長の DNAフラグメント Eを得た。次に、このフラグメント Eと、実施例 3— (4) で作製した pMl 3 54 を制限酵素 Ns p V及び E c oR Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 5. 3 kbpの DNA断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 pM1 35 8を得た（構築過程を図 1 4に示した）。本プラスミドは、配列番号 2 1のヌクレオチド配列の 3' 側に配列番号 26のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる DNAを含有し、これを用いれば、配列番号 4のアミノ酸配列の C末端に配列番号 2 のァミノ酸配列が連結したァミノ酸配列からなるぺプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (以下、 r s TM TdDと記載）を生産することができる。

実施例 4

未修飾可溶型 TM発現プラスミドの作成

1本鎖 DNA2種（F 1 1及び F 1 2、図 5) を化学合成機（既出）で合成し、両者を常法に従ってアニーリングさせ、 5' 末端に B sm I切断面 /3' 末端に E c oR I切断面を有する約 20 b p長の DNAフラグメント Fを得た。次に、実施例 2で作製した p U C 1 18— TMを制限酵素 B s m I及び E c 0 R Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 6 kbpの DNA断片とフラグメント Fとを常法に従って、ライゲ一シヨンし、 pUC 1 18— s TMを得た。続いて、この pUC 1 1 8 - s TMを制限酵素 M 1 u I及び E c oR Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 8 kbpの DNA断片と、実施例 2で作製した p S R α— TMを制限酵素 Μ 1 u I及び E c 0 R Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 4 k b pの DNA断片とを常法に従つてライゲ一シヨンし、 pMl 399を得た。本プラスミドは、配列番号 21の塩基配列を有する DN Aを含有し、これを用いれば、配列番号 4の未修飾可溶型ヒト TM (以下、 r sTMと記載）を生産することができる。

実施例 5

r sTMH, r s TMC 2 , r s TMC 2 D, r sTMTd, r sTMTd -3, r s TMTdD及び r s TMの発現

本実施例 3及び実施例 4において作製したブラスミド pM1350、 pMl 3 57、 pM1 356、 pM1 354、 pM1 35 5、 0¥1 3 58及び ]^1 3 99を、各々 COS— 1細胞（ATCCCRL— 1 650 ) に DEAEデキストラン法 (L au r e n M. Somp ay r a c e t a 1. , P r o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA, Vo l. 78， 7575 (1 98 1) に記載の方法を一部改変）にてトランスフヱクシヨンし、ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM及び未修飾可溶型ヒト TMを発現した。すなわち、約 9 cm² の組織培養用プラスチック容器あたり約 3 X 1 0⁵ 個の細胞を播き、 1 0%牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（以下、 DMEMと記載する） 2m 1、 37 °Cで一日培養し、 2m 1の DMEMで 3回洗浄した後、上記プラスミドを l 〃 g、 5 0 mMトリス塩酸（p H 7. 4) 、 0. 2 mg Zm lの D E A Eデキストラン、 1 5 0 /Mクロ口キンを含む DMEM 0. 7mlで置き換えた。 37 °Cで 4時間培養後培養液を吸引除去し、 2mlの DMEMで 1回、 1 0%牛胎児血清を含む DMEMで 1回洗浄した後、 1 0 %牛胎児血清を含む DMEMを 2 m 1添加し 3 7 °C、 2 4時間培養した。その後、 0. 1 %B S Aを含む DMEMに換え、さらに 3 7°C、 7 2時間培養した後、培養上清を集めた。培養上清中には、各種ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (r s TMi、 r sTMC 2、 r s TMC 2 D、 r s TMTd、 r s TMTd— 3及び r s TMTdD) 及び未修飾可溶型ヒト T M ( r s TM) がそれぞれ 1〜 5 /z g/m 1含まれていた。

集めた培養液は、分画分子量 3万の限外ろ過膜を使用して脱塩、濃縮した。 pH7. 5に調整した後、 0. 1M Na C K ImMベンザミジン塩酸、 0. 5 mM C a C 12 及び 0. 5%トリトン X— 1 00を含む 0. 02 Mトリス塩酸緩衝液で予めコンディショニングした D I P—トロンビンーァガロース力ラムを通過させて、活性画分を吸着させた。次いで、コンディショニングに使用したものと同じ緩衝液で洗浄した後、 0. ImM EDTA、 lmMベンザミジン塩酸、 0. 5 %トリトン X— 1 0 0及び 0. l〜l MのN aC lを含む 0. 02 Mトリス塩酸緩衝液で直線濃度勾配法により活性画分を溶出し、精製された各種ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (r sTMVDk r sTMC2、 r sTMC2D、 r sTMTd、 r sTMTd - 3、 r s TMT dD)及び未修飾可溶型ヒト TM (r s TM) をそれぞれ得た。

実施例 6

リボソームの作成

金田安史（Kan e d a. Y) の方法（実験医学、 Vo l. 1 2， 1 8

4 ( 1 994 ) ) に準じて、各種リン脂質からなるリボソームを作製した。すなわち、クロ口ホルムに溶解したホスファチジルセリン（牛脳由来、シグマ社製）

10mg、ホスファチジルコリン（卵黄由来、シグマ社製） 10mg、ホスファチジルエタノールァミン（牛脳由来、シグマ社製） 10 mg若しくはホスファチジン酸（卵黄由来、シグマ社製） 1 Omgをナス型フラスコに個々に若しくは混合して、分取し、窒素ガス下で乾燥させた後、 1 OmMリン酸カリウム溶液

50 1及びテトラヒドロフラン 450 / 1を加えてナス型フラスコ中で再溶解した。このナス型フラスコを窒素ガス封入下で口一タリーエバポレーター（RE N— 1型、岩城硝子社製）に装着し、 45 °Cの湯浴中で回転させながら減圧乾燥してフラスコ内ガラス表面にリン脂質薄膜を形成させた。そこへ、 2 OmM

CaC l ₂ 、 0. 22M Na C 1を含む 30 mMトリスーイミダゾ一ル緩衝液（p H 8. 4) (以下、 T I BSと記載） 200〃 1を添加した後、ボルテックスミキサーによる激しい振とうを 30秒間行ってから 37°C恒温槽で 3 0秒間静置する操作を 8回繰り返した。超音波洗浄機（UT— 53型、シャープ社製）の水槽にフラスコを入れ、 5秒間超音波処理した後、再度ボルテックスミキサーによる激しい振とうを 3 0秒間行い、 T I B S (既出）を 3 0 0 1加えてシェーカー付き恒温槽で 30分間振とうしてリポソ一ム溶液を調製した。この溶液は、リン脂質としてのリボソームを 2 Omg/m l含んでいる。

実施例 7

プロティン C活性化の促進作用の測定

リン脂質非存在下でのプロテイン C活性化の促進作用の測定は、 T a k a h a s h iりの力法 (Th r omb o s i s and Ha emo s t a s i s, Vo l. 73， 805 ( 1 995 ) ) に準じて行った。すなわち、 T I BS (既出） 7 5〃 1、牛トロンビン（持田製薬社製）を 40 U/m 1含む T I BS 2 5 1及び実施例 5に記載の各種ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TMを発現させた COS— 1細胞培養上清を必要に応じて COS— 1細胞培養上清で希釈した 25 1若しくは未修飾可溶型ヒト TMを発現させた COS— 1 細胞培養上清を必要に応じて COS— 1細胞培養上清で希釈した 25 1を混合し、 37 °Cで 1 0分間加温した。そこへ、ヒトプロテイン C (アメリカンダイァグノスティカ社製）を 1 2 U/m 1含む T I B S 2 5 z 1を添加し、 3 7 °C で 1 0分間反応させた後、アンチトロンビン ΙΠ (ミドリ十字社製） 0. 1 5U/ m 1及びへパリン（持田製薬社製） 1 5 U/m 1を含む T I B S 1 00 / 1を加えてプロテイン C活性化反応を停止させた。停止反応を 37°Cで 1 0分間継続させた後、合成基質 S— 236 6 (第一化学薬品社製） 3. 2 mMを含む T I B S 2 5 0 1を添加し、 3 7 °Cで 5分間反応させた。続いて、 5 0 %酢酸水溶液 1. 5 m 1を加えて全ての反応を停止させ、活性化プロテイン Cによって切断された合成基質の濃度を、波長 40 5 nmで分光光度計（DU 640、ベックマン社製）により測定した。

一方、リン脂質存在下でのプロテイン C活性化促進作用の測定は上記の方法を一部変更して行った。すなわち、実施例 6で作製したホスファチジルセリンからなるリボソームを 6mgZm l及び 2%BSAを含む T I BS (既出） 75〃 1 を 37 °Cで 1時間加温し、リボソームに対するポリぺプチドの非特異的吸着をブロッキングした。そこへ、前述の方法によりリン脂質非存在下で測定したプロテイン C活性化の促進作用の値が同一となるよう実施例 5に記載の各種ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TMを発現させた C 0 S一 1細胞培養上清を必要に応じて C 0 S— 1細胞培養上清で希釈した 25 1若しくは未修飾可溶型ヒト TMを発現させた COS— 1細胞培養上清を必要に応じて COS— 1細胞培養上清で希釈した 25 1を加えて 37でで 2時間反応させ、続いて、牛トロンビン 40 U/m 1を含む T I B S 25〃 1を加えて 37。C、 1 0分間反応させた。そこへ、ヒトプロテイン Cを 1 2 U/m 1含む T I B S 2 5〃 1を添加し、 37°Cで 1 0分間反応させ、その後は前述の方法と同一の操作により、プ口ティン C活性化促進作用の測定を行った。但し、活性化プロテイン Cによって切断された合成基質の濃度の測定は、 40， 000回転で 1 5分間遠心分離操作してリボソームを除去した反応液について行った。その結果、図 1 1に示すように、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TMは、リン脂質存在下でそのプロテイン C活性化の促進作用が著しく高まることが明らかとなり、その程度は、 r s TMに比較して r s ΤΜϋで約 5倍、 r sTMC 2 Dで約 1 0倍、 r s TMTd、 r s T M T d D及び r s T M T d— 3で約 1 6〜 1 8倍、 r s TMC 2で約 50倍であった。（リボソーム非存在下でのプロティン C活性化促進作用の強さを 1として、ホスファチジルセリンからなるリポソ一ム存在下における相対的なプロティン C活性化促進作用の強さを示した。）実施例 8

特定のリン脂質に対する特異性（ 1 )

実施例 6で作製したホスファチジルセリン以外のリン脂質からなるリボソームを用いて、実施例 7に記載の方法に従って、ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM (r s TMC 2) 及び未修飾可溶型ヒト TM (r s TM) のプロテイン C活性化の促進作用を測定した。その結果、図 1 2に示したように、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TMは、ホスファチジルセリンからなるリボソーム存在下でのみ選択的にそのプロテイン C活性化の促進作用が著しく高まることが明らかとなった。（リボソーム非存在下でのプロティン C活性化促進作用の強さを 1として、各種リボソーム存在下における相対的なプロテイン C活性化促進作用の強さを示した。）

実施例 9

リン脂質との結合能の評価

9 6穴マイクロタイ夕一プレート（ I mmu 1 o n I、ダイナテック社製）に、ホスファチジルセリンを溶解させたエタノール若しくはホスファチジルコリンを溶解させたェタノ一ル 1 0 0〃 1を添加し、風乾させて 1穴あたり 1〃 gのリン脂質を固相化した。そこへ、 1 %83八及び0. 1 5M Na C 1 を含む 1 0 mMトリス塩酸緩衝液（ p H 7. 4 ) を 200〃 1添加し、 37 で 2時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除去後、実施例 5で作製した r s TMC 2を発現させた C 0 S— 1細胞培養上清に終濃度 1 % B S Aとなるよう 20 %B S A水溶液を添加したもの 1 00〃 1、同様に調製した 1 %B S A含有 r 8丁1^丁（1発現じ03— 1細胞培養上清若しくは1 %83 含有 s TM発現 C 0 S— 1細胞培養上清 1 00 1を加え、 4 °Cで 1 6時間反応させた。反応終了後は、成書 ( 「酵素免疫測定法（第 3版）」、石川栄治（I s h i k awa E. ) ら著、医学書院、 1 9 8 7 ) に記載の一般的方法に従って、 E n z yme Immuno A s s a y (E I A) によりリン脂質に結合した各種ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TM量及び未修飾可溶型ヒト TM量を測定した。すなわち、 1次抗体として抗ヒト TMモノクロナ一ル抗体（24 FM、セルビオ社製）、 2次抗体として西洋わさびバーオキシダ一ゼ標識抗マウス I gG抗体（P 0260、ダコ社製）を用い、テトラメチルベンジジンを発色基質としてその吸光度を波長 4 50 nmで分光光度計（NJ— 2 1 00 型、インタ一メッド社製）により測定した。その結果、図 1 3に示すように、ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト TMはホスファチジルセリンとのみ結合性を示し、その結合の程度と図 1 1に示されたリボソーム存在下でのプ口ティン Cの活性化促進作用の強さとが相関することが明らかとなつた。

実施例 1 0

UT I cDNAのクロ一ニング及び UT I発現プラスミドの作製

既知のヒト —マイクログロプリンをコ一ドする塩基配列（ K a u m e y e r , J . F. e t a l. , Nu c l. Ac i d s Re s. , Vo l. 14， 7839 ( 1 986 ) ) を参考として、ヒトひーマイクログロプリンシグナルペプチドをコードする遺伝子の塩基配列の一部に対応し、かつ 5' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DNAプライマ一（S 7、図 1) を化学合成機 (既出）にて作製した。また、既知のヒト U T I遺伝子の塩基配列（K a u m e y e r , J. F. e t a l. , u c l. Ac i ds Re s. , Vo l. 14， 7839 ( 1 986 ) ) を参考として、ヒト UT Iをコ一ドする遺伝子の塩基配列の一部に対応し、かつ 5' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DN A プライマ一（A6、図 2) を化学合成機（既出）にて作製した。なお、 A 6は終始コドンに対応する DNA配列を含む。合成した DNAプライマーは、 OPC力ラム（既出）にて精製した。

次に、市販のヒト肝臓由来の c DN A (クローンテック社製）を铸型 DNAとし、化学合成した DNAプライマー S 7と A 6を用いて表 1 (既出）の反応液組成により PCRを行い、ヒト α—マイクログロブリン cDNA及びその 3' 側に続くヒト UT I cDNAを増幅した。遺伝子増幅はサ一マルサイクラ一（既出）を用い、 94でで 45秒、 60 °Cで 45秒、 72 °Cで 2分 30秒の反応サイクルを 40回繰り返すことにより行い、反応終了後、反応液の一部を採り、ァガ口一ス電気泳動により目的とするサイズの DN Aが増幅されていることを確認した。

反応液から増幅された遺伝子をフヱノール' クロ口ホルム処理、エタノール沈殿により精製、回収し、 B amH I/H i n dmで制限酵素消化した後、常法に従ってクロ一ニング用べクタ一 pUC 1 19へサブクロ一ニングし、 pMl 21 2を得た（構築過程を図 15に示した）。また常法に従い、 cDNA部分の塩基配列を DNAシークェンサ一（既出）にて決定し、ヒ卜 α—マイクログロブリン cDNA及びその 3' 側に続くヒト UT I c DNAであることを確認した。次に、既知のヒト α—マイクログロブリンシグナルぺプチドをコ一ドする遺伝子の塩基配列及びヒト UT Iをコ一ドする遺伝子の塩基配列の一部を含み、かつ 5' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DNAプライマー（S 8、図 1) 、及び、ヒ卜 UT Iをコードする遺伝子の塩基配列の一部を含み、かつ 5' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DN Aプライマ一（A7、図 2) を化学合成機（既出）にて作製した。なお、 A 7は終始コドンに対応する DN A配列を含む。合成した DNAプライマ一は、 OPCカラム（既出）にて精製した。

続いて、これらの DNAプライマ一を用い、前述の pMl 212を铸型 DNA として表 1 (既出）の反応液組成により P CRを行い、ヒト α—マイクログロブリンシグナルペプチドを有するヒト UT I cDNAを増幅した。遺伝子増幅はサ一マルサイクラ一（既出）を用い、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72 °Cで 1分の反応サイクルを 25回繰り返すことにより行い、反応終了後、反応液の一部を採り、ァガロース電気泳動により目的とするサイズの DN Aが増幅されていることを確認した。

反応液から増幅された遺伝子をフヱノール · クロ口ホルム処理、ェタノ一ル沈殿により精製、回収し、 Xb a I/No t Iで制限酵素消化し、ァガロース電気泳動により常法に従って約 0. 5 k b p長を有する DN A断片を分離、精製した。これを、哺乳動物細胞発現べクタ一として知られている pEF— BOS (S. M i z u s h i ma e t a 1. , Nu c l e i c A c i d s R e s . ， V o l . 1 8， 5 3 2 2 ( 1 9 9 0 ) ) の改良型ベクターである p EF-BOS 2 Aのクロ一ニングサイト Xb a I— No t I間に挿入し、ヒ卜 UT I発現べクタ一 pM l 2 1 3を構築した（構築過程を図 1 5に示した）。 p E F— BOS 2 Aはヒトポリぺプチド鎖伸長因子 1 のプロモータ一領域及び S V 4 0のポリ A付加シグナル配列を有する。 p M 1 2 1 3は配列番号 2 8の塩基配列を有する DNAを含有し、これを用いれば、配列番号 2 4の未修飾 UT I (以下 r UT Iと記載する）を生産することができる。

実施例 1 1

ホスファチジルセリンに親和性を有する UT Iを発現するプラスミドの作成 1本鎖 DNA 2種（F 1 3及び F 1 4、図 5 ) を化学合成機（既出）で合成し、 F 1 3と F 1 4を常法に従ってアニーリングさせ、 5' 末端に E c oR I 切断面 Z3' 末端に H i n d HI切断面を有する約 7 0 b p長の DNAフラグメン卜 Gを得た。次に、フラグメント Gを常法に従ってクローニング用ベクター p UC 1 1 9のクローニングサイ卜 E c o R I — H i n d ΠΙ間にサブクローニングし、 p U C 1 1 9 — Mu 1 t iを得た。続いて、この p U C 1 1 9 一 Mu 1 t iを制限酵素 E c 0 4 7 IE及び No t Iで消化しァガ口一ス電気泳動で分離、回収した約 3. 2 k b pの DNA断片と、実施例 1 0で作製した pM l 2 1 3を制限酵素 E c 0 4 7 ΠΙ及び No t Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 5 k b pの DNA断片とを常法に従って、ライゲ一シヨンし、 p UC 1 1 9— UT I— s u b lを得た。

一方、既知のヒト UT Iをコードする塩基配列（既出）及びヒト F a c t 0 r 11をコードする塩基配列（既出）を参考として、ヒト UT Iをコードする遺伝子の塩基配列の一部及びヒト F a c t o r珊をコ一ドする遺伝子の塩基配列の一部に対応する DN Aプライマー（S 9、図 1) とヒト F a c t o rllをコ一ドする遺伝子の塩基配列の一部に対応し、かつ 5' 末端に適当な制限酵素認識部位を含む DNAプライマ一（A 8、図 2) を化学合成機（既出）にて作製した。なお、 A 8は終始コドンに対応する DNA配列を含む。合成した DNAプライマ一は、 0 PCカラム（既出）にて精製した。

次に、これらの DN Aプライマ一を用い、実施例 3— （2) で作製した pMl 3 5 7を铸型 DNAとして表 1 (既出）の反応液組成により PCRを行い、ヒト F a c t 0 r !C 2領域を含み、 5' 末端にヒト U T Iをコードする遺伝子の塩基配列の一部に対応する領域を有する約 0. 6 kb pの DNA断片を増幅した。遺伝子増幅はサ一マルサイクラ一（既出）を用い、 9 4°。で 1分、 5 5 で 2分、 Ί 2 °Cで 3分の反応サイクルを 3 0回繰り返すことにより行い、反応終了後、反応液の一部を採り、ァガロース電気泳動により目的とするサイズの DNA が増幅されていることを確認した。反応液から増幅された遺伝子をフノール · クロ口ホルム処理、エタノール沈殿により精製、回収し、制限酵素 B s g I及び No t Iで消化した後、前述の pUC 1 1 9一 UT I— s u b 1を制限酵素 B s g I及び No t Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 3. 1 kb p の DNA断片と常法に従ってライゲーシヨンし、 pUC l 1 9一 UT I— C 2— s u b 1を得た。続いて、この pUC 1 1 9 -UT I— C 2— s u b 1を制限酵素 E c o 4 7 ΠΙ及び No t Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 1. 0 kb pの DNA断片と、実施例 1 0で作製した pMl 1 3を制限酵素 E c 0 4 7 ΠΙ及び No t Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 0 k b pの DNA断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 pM 1 38 0を得た（構築過程を図 1 6に示した）。本プラスミドは、配列番号 28のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 20のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる D N Aを含有し、これを用いれば、配列番号 24のァミノ酸配列の C 末端に配列番号 9のァミノ酸配列が連結したァミノ酸配列からなるぺプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT I (以下、 rUT I C 2と記載する）を生産することができる。

実施例 1 2

r UT I及び r UT I C 2の発現と精製

本実施例 1 1及び実施例 1 0において作製したプラスミド pM l 3 8 0及び pM l 2 1 3をそれぞれ COS— 1細胞（既出）に DEAEデキストラン法（既出）にてトランスフヱクシヨンし、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT I及び未修飾ヒト UT Iを発現した。すなわち、約 9 cm² の組織培養用プラスチック容器あたり約 3 X 1 0⁵ 個の細胞を播き、 1 0%牛胎児血清を含むダルべッコ改変ィ一グル培地（既出） 2 mし 37 °Cで一日培養し、 2 m 1 の DMEMで 3回洗浄した後、上記プラスミドを 1 g、 5 0 mMトリス塩酸（pH7. 4) 、 0. 2mg/ml DEAEデキストラン、 1 50〃Mクロ口キンを含む DMEMO. 7mlで置き換えた。 37 °Cで 4時間培養後培養液を吸引除去し、 2mlの DMEMで 1回、 1 0 %牛胎児血清を含む DMEMで 1回洗浄した後、 1 0 %牛胎児血清を含む DMEMを 2m 1添加し 37°C、 24時間培養した。その後、 0. 1 %B S Aを含む DMEMに換え、さらに 37°C、 72 時間培養した後、培養上清を集めた。培養上清中には、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT I (r UT I C 2)及び未修飾ヒト UT I (rUT I) がそれぞれ 1〜 5 g/m 1含まれていた。

集めた培養液は、分画分子量 1万の限外ろ過膜を使用して脱塩、濃縮し、 10 mMリン酸緩衝液（pH7. 5)で予め平衡化した抗 UT I抗体ーセファロ一スカラムを通過させて活性画分を吸着させた。次いで、 0. 5MNa C lを含む 1 OmMリン酸緩衝液（pH7. 5) で洗浄した後、 0. 1Mクェン酸（pH 2. 0)及び 3Mチォシアン酸カリウムを含む 0. 1 Mクェン酸により活性画分を溶出した。溶出された活性画分を 1 OmMリン酸緩衝液（pH7. 5) に対して透析し、精製されたホスファチジルセリンに親和性を有するヒト U T I (r U T I C 2)及び未修飾ヒト UT I (r UT I) をそれぞれ得た。

実施例 13

UT Iの第二領域を発現するプラスミドの作製

1本鎖 DNA2種（F 1 5及び F 1 6、図 5) を化学合成機（既出）で合成し、 F 15と F 16を常法に従ってアニーリングさせ、 5' 末端に Eco 47 IE切断面 / 3' 末端に Ap a I切断面を有する約 70 b p長の DNAフラグメン卜 Hを得た。次に、本実施例 1 1で得た pUC 1 19— UTI— s ub lを制限酵素 E c 047 ΠΙ及び Ap a Iで消ィヒし、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 3. 4kbpの DNA断片と、フラグメント Hとを常法に従ってライゲ一ションし、 pUC 1 19— R— 020 - s u b 1を得た。続いて、この pUC 1 19 一 R— 020— s ub lを制限酵素 E c o 47 ΠΙ及び N o t Iで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 2kbpのDNA断片と、実施例 1 0 で作製した PM1213を制限酵素 Eco47 ΙΠ及び N o t Iで消化しァガ口一ス電気泳動で分離、回収した約 4. 0 k b pの DNA断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 pMl 3 7 0を得た（構築過程を図 1 7に示した）。 pMl 3 7 0は配列番号 2 7の塩基配列を有する DN Aを含有し、これを用いれば、配列番号 2 3で表される未修飾のヒト UT Iの第二領域の N末端に A 1 a— V a 1 -L e u-P r o-G l n— G l u - G l u - G l u - G l y - As p - G l y から成る 1 1ァミノ酸が付加したポリぺプチド（以下 r R一 0 2 0と記載する）を生産することができる。

実施例 1 4

ホスファチジルセリンに親和性を有する UT Iの第二領域を発現するプラスミドの作製

実施例 1 3で作製した PUC 1 1 9—R— 0 2 0— s u b lを制限酵素 B s I及び N o t Iで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 3. 3 k b p の DNA断片と、実施例 1 1で作製した pUC 1 1 9 -UT I -C 2 - s u b 1 を制限酵素 B s g I及び No t Iで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 5 k b pの DNA断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 p UC 1 1 9—R— 0 2 0— C 2— s ub lを得た。続いて、この pUC l 1 9— R— 0 2 0— C 2— s u b lを制限酵素 E c o 4 7 IE及び No t Iで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 8 kb pのDNA断片と、実施例 1 0 で作製した pMl 2 1 3を制限酵素 E c o 4 7 IE及び No t Iで消化しァガ口一ス電気泳動で分離、回収した約 4. 0 k b pの DNA断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 p M 1 3 7 1を得た（構築過程を図 1 8に示した）。本ブラスミドは、配列番号 2 7のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 2 0のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる D N Aを含有し、これを用、れば、配列番号 2 3のアミノ酸配列の N末端には A l a— V a l— L e u— P r o— G 1 n-G 1 u-G 1 u-G 1 u—G l y— As p— G l yから成る 1 1ァミノ酸配列が連結し、 C末端には配列番号 9のァミノ酸配列が連結したァミノ酸配列からなるペプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域（以下、 rR— 020 C 2と記載する）を生産することができる。

実施例 1 5

rR— 020及び rR— 020 C 2の発現と精製

本実施例 1 4及び実施例 1 3において作製したプラスミド pM l 3 7 1及び pMl 370を、それぞれ COS— 1細胞（既出）に DE A Eデキストラン法 (既出）にてトランスフヱクシヨンし、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域及び未修飾ヒト UT Iの第二領域を発現した。すなわち、約 9 cm² の組織培養用プラスチック容器あたり約 3 X 1 0⁵ 個の細胞を播き、 1 0 %牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（既出） 2m l、 3 7 °Cで一日培養し、 2 m 1の DMEMで 3回洗浄した後、上記プラスミドを 1 β g、 5 OmMトリス塩酸（pH7. 4) 、 0. 2mg/m 1 DEAEデキストラン、 1 50〃Mクロ口キンを含む DMEMO. 7mlで置き換えた。 37 °C で 4時間培養後培養液を吸引除去し、 2mlの DMEMで 1回、 1 0 %牛胎児血清を含む DMEMで 1回洗浄した後、 1 0%牛胎児血清を含む DMEMを 2ml 添加し 37°C、 24時間培養した。その後、 0. 1 %B S Aを含む DMEMに換え、さらに 37°C、 7 2時間培養した後、培養上清を集めた。培養上清中には、各種ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域（ r R— 020 C 2) 及び未修飾ヒト UT Iの第二領域（ r R— 020 ) がそれぞれ 1〜 5 g/m 1含まれていた。

集めた培養液は、分画分子量 3千の限外ろ過膜を使用して脱塩、濃縮し、 1 0 mMリン酸緩衝液（pH7. 5) で予め平衡化した抗 U T I抗体ーセファロ一スカラムを通過させて活性画分を吸着させた。次いで、 0. 5MNa C lを含む 1 OmMリン酸緩衝液（pH7. 5) で洗浄した後、 0. 1Mクェン酸（pH 2. 0) 及び 3Mチォシアン酸カリウムを含む 0. 1 Mクェン酸により活性画分を溶出した。溶出された活性画分を 1 0 mMリン酸緩衝液（p H 7. 5 ) に対して透析し、精製されたホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域（ r R— 020 C 2 ) 及び未修飾ヒト UT Iの第二領域（ r R— 020 ) をそれぞれ得た。

実施例 1 6

トリブシン阻害活性の測定

実施例 1 2及び実施例 1 5に記載のヒト UT I ( r UT I ) 及びヒト UT Iの第二領域（r R— 020 ) とホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT I (r UT I C 2) 及びホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域（r R— 020 C 2) を発現させた C 0 S— 1細胞培養上清 1 00 1に、 0. 1 %B SAを含む 0. 2 Mトリス塩酸緩衝液（p H 7. 8) (以下緩衝液 A) で希釈した牛トリプシン（シグマ社製） 200 B AE E U/m 1を 1 0 0 1添加し、 25°Cで 1 0分間反応させた後、蒸留水にて溶解した合成基質 L BAP A (ぺプチド研究所社製） 2 m g/m 1を含む基質溶液 1 0 0 / 1を添加し、 25°Cで 1 2分間反応させた。続いて、 5 0 %酢酸水溶液 1 00 1を加えて全ての反応を停止させ、残存するトリプシンによって切断された合成基質の濃度を、波長 4 0 5 nmで分光光度計（既出）により測定した。なお、コントロールとして、大腸菌で発現 ·精製した配列番号 2 3のアミノ酸配列からなるヒト U T Iの第二領域（特許出願公開公報特開平 5— 8 4 0 8 3 ) を用いた。

実施例 1 Ί

活性酸素産生抑制効果の測定

加藤らの方法（加藤克明（K a t 0 u K. ) ら、医学と薬学、 3 4巻、 4 9 9 ( 1 9 9 5 ) ) に準じて、チトクローム C還元法により白血球の活性酸素産生量を測定した。すなわち、ゥサギ腹腔より採取した白血球を、 2 mMグルコース、 5mM HE PESを含む生理食塩水（pH 7. 4) に l x l 0⁶ 個 Zm 1となるよう懸濁させたもの 0. 4 9m lに、 1 3 2〃Mチトクローム C、 2 mMグルコース、 2mM C a C 1₂ 、 5 mM H E P E S及び実施例 1 2に記載のホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT I (rUT I C 2) 若しくは未修飾ヒト U T I (r UT I) を発現させた C 0 S— 1細胞培養上清を含む生理食塩水（pH7. 4) を 0. 5m l加え、 3 7 °C、 3分間反応後、 1 m gZ m lのサイトカラシン E及び 1 0 mg/m 1のコンカナバリン Aをそれぞれ 5 1ずつ加え、波長 5 5 0 nmにおける吸光度の増加速度を分光光度計（既出）にて測定した。

その結果、図 1 9に示すように、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT I (r UT I C 2) は、未修飾ヒト UT I (r UT I) に比べて活性酸素産生抑制作用が高いことが明らかとなつた。実施例 1 8

プロトロンピナ一ゼ阻害効果の測定

プロトロンピナ一ゼ活性の測定は、 N e s h e i m， M. E. らの方法 (Th e J o u r n a l o f B i o l o g i c a l Ch emi s t r y, Vo l. 254， 1 0952 ( 1 9 79 ) ) を一部変更して行った。すなわち、 6 /M F a c t o r X a (アメリカンダイァグノスティカ社製）、 6 Μ F a c t o r V a (へマト口ジカルテクノ口ジ一社製）、 0. 1 5 MNa C 2mMCaC l ₂ 及び 0. 1 %B S Aを含む 50 mMトリス塩酸緩衝液（PH7. 4) (以下緩衝液 B) 1 00 1に、実施例 6と同様の操作により調製したホスファチジルセリン含有率 2 5 %、ホスファチジルコリン含有率 75 %からなるリボソーム（但し、リボソーム作製時には T I BSの代りに B S Aを含まない緩衝液 Bを用いて作製）をリン脂質として 36mgZm l含む緩衝液 B 25 z 1を添加し、 37 °Cで 1 0分間加温した。次に、実施例 1 5に記載のホスファチジルセリンに親和性を有するヒ卜 UT Iの第二領域（r R— 020 C 2) を発現させた C 0 S— 1細胞培養上清若しくは大腸菌で発現 ·精製した配列番号 23のアミノ酸配列からなるヒト UT Iの第二領域（既出）を必要に応じて C 0 S— 1細胞培養上清で希釈した 1 25 1を添加し、 3 7 °Cで 1 0分間加温した。そこへ、プロトロンビン（ェンザィムリサ一チラボラトリ一社製）を 6 0 Μ含む緩衝液 B 5 0 at Iを添加し、 3 7 °Cで 3 0分間反応させた後、 E DT A 1 0 mMを含む緩衝液 B 300 1を加えてトロンビン産生反応を停止させた。続いて、前述のトロンビン産生反応で得られた反応停止後の溶液 1 00〃 1を 37°Cで 1 0分間加温した後、 1. 5mM合成基質 S— 2238 (第一化学薬品社製）、 0. 1 5MNaC l、 l OmMEDTA及び 0. 1 %B S Aを含む 50 mMトリス塩酸緩衝液（PH7. 4) 1 00 1を添加し、 3 7 。Cで 1 0分間反応させた後、 50 %酢酸水溶液 1 00 1を加えて全ての反応を停止させ、産生されたト口ンビンによって切断された合成基質の濃度を、波長 4 05 nmで分光光度計（既出）により測定した。その結果、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有するヒト U T Iの第二領域（ r R— 020 C 2 ) は、大腸菌で発現 ·精製した配列番号 23のァミノ酸配列からなるヒト U T Iの第二領域（既出）よりも約 1 0倍高いプロトロンピナ一ゼ活性阻害効果を示すことが明らかとなった（図 20) 。なお、大腸菌で発現 '精製した配列番号 2 3のアミノ酸配列からなるヒト UT Iの第二領域（既出）と COS— 1細胞で発現させた未修飾ヒト UT Iの第二領域 (r R- 020 ) との間には、活性の差違は認められなかった。

実施例 1 9

特定のリン脂質に対する特異性（2)

実施例 6と同様の操作により調製したリボソームを用いて、実施例 1 8に記載の方法に従って、ホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域 (r R- 020 C 2) 及び未修飾ヒト UT Iの第二領域 (r R- 020 ) のプロトロンピナ一ゼ活性阻害効果を測定した。その結果、図 2 1に示したように、本発明のホスファチジルセリンに親和性を有するヒト UT Iの第二領域（r R— 0 20 C 2) は、ホスファチジルセリン特異的にプロトロンビナ一ゼ活性阻害効果が促進されることが明らかとなった。実施例 20

ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト M CPを発現するプラスミドの作成

1本鎖 DNA4種（F 1 7、 F 1 8、 F 1 9及び F 20、図 5) を化学合成機 (既出）で合成し、 F 1 7と F 1 8及び F 1 9と F 20をそれぞれ常法に従ってアニーリングさせ、 5' 末端に E c o 8 1 I切断面 /3' 末端に H i n dm切断面を有する約 60 b p長の DNAフラグメント I及び 5' 末端に N s p V切断面 /3' 末端に Kp n I切断面を有する約 90 b p長の DNAフラグメント Jを得た。次に、国際特許出願公開公報 WOZ 93 / 1 7 1 22に記載の pUC 1 9一 sMCP (D) を制限酵素 E c 08 1 I及び H i n dmで消化し、ァガ口一ス電気泳動で分離、回収した約 3. 6 k b pの DNA断片とフラグメント Iとを常法に従ってライゲーシヨンし、 pUC 1 9— sMCP (D) 一 C 2— s u b 1を得た。次に、この PUC 1 9— sMCP (D) -C 2 - s u b 1を制限酵素 S p h I及び Ns pVで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 3. 7 kb p の DNA断片と、実施例 3— (2) で作製した pMl 3 5 7を制限酵素 S ph I 及び Ns pVで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 0. 4 kbpの DNA断片とを常法に従ってライゲ一ションし、 pUC 1 9— sMC P (D) — C 2— s u b 2を得た。続いて、この pUC 1 9— sMCP (D) — C 2 -- s u b 2を制限酵素 Ns pV及び Kpn Iで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. 0 k b pの DN A断片とフラグメント Jとを常法に従ってライゲーシヨンし、 pUC 1 9— sMCP (D) 一 C 2を得た。更に、この pUC 1 9— sMCP (D) — C 2を制限酵素 E c oR I及び Kpn Iで消化し、ァガロース電気泳動で分離、回収した約 1. 5 kb pの DNA断片と、国際特許出願公開公報 WOZ 9 3 / 1 7 1 2 2に記載の p M 8 5 1を制限酵素 E c o R I及び Kp n Iで消化しァガロース電気泳動で分離、回収した約 4. O kbpの DNA 断片とを常法に従ってライゲ一シヨンし、 pM l 3 9 0を得た（構築過程を図 22に示した）。本ブラスミドは、配列番号 29のヌクレオチド配列の 3 ' 側に配列番号 20のヌクレオチド配列が連結したヌクレオチド配列からなる DN A を含有し、これを用いれば、配列番号 25のァミノ酸配列の C末端に配列番号 9 のァミノ酸配列が連結したアミノ酸配列からなるべプチドであるホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト M CP (以下、 r sMCP (D) C 2と記載する）を生産することができる。

実施例 2 1

r sMCP (D) 及び r sMCP (D) C 2の発現

本実施例 20において作製したプラスミド pMl 390及び国際特許出願公開公報 WOZ 9 3 / 1 7 1 2 2に記載の p M 8 5 1を、それぞれ C 0 S一 1 細胞（既出）に DEAEデキストラン法（既出）にて卜ランスフヱクションし、ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト MC P (r sMCP (D) C 2) 及び未修飾可溶型ヒト MC P (r sMC P (D) ) を発現した。すなわち、約 9 cm² の組織培養用プラスチック容器あたり約 3 X 1 0⁵ 個の細胞を播き、 1 0 %牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（既出） 2 m 1、 37 °Cで一日培養し、 2mlの DMEMで 3回洗浄した後、上記プラスミドを 1 1 %、 5 OmMトリス塩酸（pH 7. 4) 、 0. 2 m g/m 1の D E A Eデキストラン、 1 50 クロ口キンを含む DMEMO. 7m lで置き換えた。 37 °C で 4時間培養後培養液を吸引除去し、 2mlの DMEMで 1回、 1 0 %牛胎児血清を含む D MEMで 1回洗浄した後、 1 0 %牛胎児血清を含む D MEMを 2m l 添加し 37°C、 24時間培養した。その後、 0. 1 %BS Aを含む DMEMに換え、さらに 37°C、 72時間培養した後、培養上清を集めた。培養上清中には、各種ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト MC P (r sMC P (D) C 2) 及び未修飾可溶型ヒト MCP (r sMCP (D) ) がそれぞれ 1〜 5〃 g/m 1含まれていた。

集めた培養液は、国際特許出願公開公報 WO/ 9 3 / 1 7 1 22に記載の方法に従って精製し、ホスファチジルセリンに親和性を有する可溶型ヒト MCP (r sMCP (D) C 2) 及び未修飾可溶型ヒト MCP (r sMCP (D) ) をそれぞれ得た。

産業上の利用可能性

本発明によれば、血液凝固障害、炎症及び免疫応答を伴う疾患の予防及び治療剤として有用な薬剤、新規ペプチド、それらの製造に必要な DNA、及び当該薬剤の製造方法を提供することができる。

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130 配列番号： 2

配列の長さ： 1 8

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド（A2)

配列

Xaa Arg Tyr Leu Arg l ie Hi s Pro Gin Ser Trp Val Hi s Gin l ie Ala Leu Arg 1 5 10 15 但し、 Xaa は Thr 若しくは Leu 。配列番号： 3

配列の長さ： 1 2

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド (A3)

配列

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

1 5 10 配列番号： 4 配列の長さ： 4 9 7

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド（rsTM)

配列

Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Val Glu Hi s Asp Cys Phe

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gin l ie Cys Asp Gly

20 25 30 35

Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val Ala Ala Asp Val He Ser

40 45 50

Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp l ie Gly Leu 55 60 65 70

Gin Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe

75 80 85 90

Gin Trp Val Thr Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp

95 100 105

Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu

110 115 120 125

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130 135 140

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1 5 10 15

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

20 25 30 配列番号： 6

配列の長さ： 48

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド (Td)

配列

Thr Arg Tyr Leu Arg lie His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala Leu Arg 1 5 10 15

Leu Arg Tyr Leu Arg He His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala Leu Arg

20 25 30 35

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

40 45 配列番号： 7

配列の長さ： 66

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド (Td-3)

配列 Thr Arg Tyr Leu Arg lie His Pro Gin Ser Trp Val His Gin He Ala Leu Arg 1 5 10 15

Leu Arg Tyr Leu Arg lie His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala Leu Arg

20 25 30 35

Leu Arg Tyr Leu Arg lie His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala Leu Arg

40 45 50

Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

55 60 65 配列番号： 8

配列の長さ： 60

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド（C2D )

配列

Leu Phe Phe Gin Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gin Gly Asn Gin Asp Ser Phe 1 5 10 15

Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg He

20 25 30 35

His Pro Gin Ser Trp Val His Gin lie Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys

40 45 50

Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

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145 150 155 160 配列番号： 1 0

配列の長さ： 3 0

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド（A1)

配列

Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu

20 25 30 配列番号： 1 1

配列の長さ： 3 9 0

配列の型：核酸

配列の種類： c D NA t o mR N A (Dl)

配列

AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA GATTACTGCT 60 TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG ACTTCACCTC 120 CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG 180 GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT 240 ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA TCAGTGGACT 300

CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC CTTCACACCT 360

GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG 390 配列番号： 1 2

配列の長さ： 90

配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA (D l)

配列

CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC CTTCACACCT 60 GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG 90 配列番号 1 3

配列の長さ： 54

配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA (D2)

配列

ACTCGCTACC TTCGMATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGG 54 但し、 M は A若しくは C。配列番号 1 4

配列の長さ： 54 配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA (D2)

配列

CTGCGCTACC TTCGMATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGG 54 但し、 M は A若しくは C。配列番号 1 5

配列の長さ： 36

配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA (D3)

配列

ATGGAGGTTC TGGGCTGCGA GGCACAGGAC CTCTAC 36 配列番号 1 6

配列の長さ： 90

配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA ( ）

配列

ACTCGCTACC TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG 60 GTTCTGGGCT GCGAGGCACA GGACCTCTAC 90 配列番号： 1 7

配列の長さ： 1 44

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t o mRNA (Td)

配列

ACTCGCTACC TTCGCATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGCTGCGC 60 TACCTTCGAA TTCACCCCCA GAGTTGGGTG CACCAGATTG CCCTGAGGAT GGAGGTTCTG 120 GGCTGCGAGG CACAGGACCT CTAC 144 配列番号： 1 8

配列の長さ： 1 98

配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA (Td-3)

配列

ACTCGCTACC TTCGCATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGCTGCGC 60 TACCTTCGCA TTCACCCCCA GAGTTGGGTG CACCAGATTG CCCTGAGGCT GCGCTACCTT 120 CGAATTCACC CCCAGAGTTG GGTGCACCAG ATTGCCCTGA GGATGGAGGT TCTGGGCTGC 180 GAGGCACAGG ACCTCTAC 198 配列番号： 1 9

配列の長さ： 1 80

配列の型：核酸配列の種類： c D N A t o mR N A (C2D )

配列

CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC CTTCACACCT 60

GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA CCCCCAGAGT 120

TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA GGACCTCTAC 180 配列番号 2 0

配列の長さ： 4 8 0

配列の型：核酸

配列の種類： c D N A t o mR N A (C2)

配列

AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA GATTACTGCT 60 TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG ACTTCACCTC 120 CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG 180 GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT 240 ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA TCAGTGGACT 300 CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC CTTCACACCT 360 GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA CCCCCAGAGT 420 TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA GGACCTCTAC 480 配列番号： 2 1

配列の長さ： 1 4 9 1 配列の型：核酸

配列の種類： c D N A t o m R N A (rsTM)

配列

GCTCCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTCGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 6 L

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0881 03V30311V3 VOOOOOIOII 33300313V0 3030003010 IV3310V031 133V100303

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0921 OIVOIXIOOO VODVOOIOOX V0V1300VV0 1303010VD1 0130V1303V 003V0VV333

002 ί 0V00013V03 00V3010 3 OIOVOVOOVV 00111101V0 VOOOIOOVOV 30330V03V0 Z0000/86Jf/XDJ eswr/860A Ala Ala Cys Asn Leu Pro l ie Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala Phe He Gin Leu

1 5 10 15

Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys

20 25 30 35

Gin Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly

40 45 50

Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg Phe Ser Asn

55 60 65 配列番号： 2 4

配列の長さ： 1 4 7

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド（ r U T I )

配列

Ala Val Leu Pro Gin Glu Glu Glu Gly Ser Gly Gly Gly Gin Leu Val Thr Glu

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Glu Asp Ser Cys Gin Leu Gly Tyr Ser Ala Gly Pro Cys Met

20 25 30 35

Gly Met Thr Ser Arg Tyr Phe Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Cys Glu Thr Phe

40 45 50

Gin Tyr Gly Gly Cys Met Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Thr Glu Lys Glu Cys 55 60 65 70

8 o Leu Gin Thr Cys Arg Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro l ie Val Arg Gly Pro 75 80 85 90

Cys Arg Ala Phe l ie Gin Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val

95 100 105

Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gin Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr Ser Glu Lys

110 115 120 125

Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu Arg

130 135 140

Phe Ser Asn

145 配列番号： 2 5

配列の長さ： 2 7 9

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド（ r s M C P )

配列

Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu l ie Gly Lys Pro Lys Pro 1 5 10 15

Tyr Tyr Glu l ie Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys Gly Tyr Phe Tyr

20 25 30 35

He Pro Pro Leu Ala Thr Hi s Thr l ie Cys Asp Arg Asn Hi s Thr Trp Leu Pro

40 45 50

8 l Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr Cys Pro Tyr He Arg Asp Pro Leu 55 60 65 70

Asn Gly Gin Ala Val Pro Ala Asn Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gin Met His

75 80 85 90

Phe lie Cys Asn Glu Gly Tyr Tyr Leu lie Gly Glu Glu He Leu Tyr Cys Glu

95 100 105

Leu Lys Gly Ser Val Ala lie Trp Ser Gly Lys Pro Pro lie Cys Glu Lys Val

110 115 120 125

Leu Cys Thr Pro Pro Pro Lys He Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val

130 135 140

Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala Pro Gly 145 150 155 160

Pro Asp Pro Phe Ser Leu lie Gly Glu Ser Thr lie Tyr Cys Gly Asp Asn Ser

165 170 175 180

Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val Lys Cys Arg Phe Pro Val

185 190 195

Val Glu Asn Gly Lys Gin lie Ser Gly Phe Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala

200 205 210 215

Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr lie

220 225 230

Val Cys Asp Ser Asn Ser Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Gly 235 240 245 250 Pro Arg Pro Thr Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro 255 260 265 270

Glu Glu Gly lie Leu Asp Ser Leu Asp

275 配列番号： 26

配列の長さ： 1 08

配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA (TdD)

ACTCGCTACC TTCGCATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGCTGCGC 60 TACCTTCGAA TTCACCCCCA GAGTTGGGTG CACCAGATTG CCCTGAGG 108 配列番号： 27

配列の長さ： 204

配列の型：核酸

配列の種類： cDNA t o mRNA (UT I第二領域）

GCGGCCTGCA ATCTCCCCAT AGTCCGGGGC CCCTGCCGAG CCTTCATCCA GCTCTGGGCA 60 TTTGATGCTG TCAAGGGGAA GTGCGTCCTC TTCCCCTACG GGGGCTGCCA GGGCAACGGG 120 AACAAGTTCT ACTCAGAGAA GGAGTGCAGA GAGTACTGCG GTGTCCCTGG TGATGGTGAT 180 GAGGAGCTGC TGCGCTTCTC CAAC 204 配列番号： 28 配列の長さ： 4 4 1

配列の型：核酸

配列の種類： c D N A t o mR NA ( r U T I )

GCTGTGCTAC CCCAAGAAGA GGAAGGATCA GGGGGTGGGC AACTGGTAAC TGAAGTCACC 60 AAGAAAGAAG ATTCCTGCCA GCTGGGCTAC TCGGCCGGTC CCTGCATGGG AATGACCAGC 120 AGGTATTTCT ATAATGGTAC ATCCATGGCC TGTGAGACTT TCCAGTACGG CGGCTGCATG 180

GGCAACGGTA ACAACTTCGT CACAGAAAAG GAGTGTCTGC AGACCTGCCG AACTGTGGCG 240

GCCTGCAATC TCCCCATAGT CCGGGGCCCC TGCCGAGCCT TCATCCAGCT CTGGGCATTT 300

GATGCTGTCA AGGGGAAGTG CGTCCTCTTC CCCTACGGGG GCTGCCAGGG CAACGGGAAC 360

AAGTTCTACT CAGAGAAGGA GTGCAGAGAG TACTGCGGTG TCCCTGGTGA TGGTGATGAG 420

GAGCTGCTGC GCTTCTCCAA C 441 配列番号： 2 9

配列の長さ： 8 3 7

配列の型：核酸

配列の種類： c D N A t o mR N A ( r s M C P)

TGTGAGGA GCCACCAACA TTTGAAGCTA TGGAGCTCAT TGGTAAACCA AAACCCTACT 58 ATGAGATTGG TGAACGAGTA GATTATAAGT GTAAAAAAGG ATACTTCTAT ATACCTCCTC 118 TTGCCACCCA TACTATTTGT GATCGGAATC ATACATGGCT ACCTGTCTCA GATGACGCCT 178 GTTATAGAGA AACATGTCCA TATATACGGG ATCCTTTAAA TGGCCAAGCA GTCCCTGCAA 238 ATGGGACTTA CGAGTTTGGT TATCAGATGC ACTTTATTTG TAATGAGGGT TATTACTTAA 298 TTGGTGAAGA AATTCTATAT TGTGAACTTA AAGGATCAGT AGCAATTTGG AGCGGTAAGC 358

oo

Claims

請求の範囲

1. リン脂質に親和性を有する物質と生理活性物質とを含有する薬剤。

2. 前記リン脂質が細胞表層を形成する脂質二重層の構成成分に含まれるリン脂質であることを特徴とする請求項 1に記載の薬剤。

3. 前記リン脂質が細胞が正常でない時に細胞表層を形成する脂質二重層の外層に含まれる割合が増加するリン脂質であることを特徴とする請求項 1または 2 に記載の薬剤。

4. 前記リン脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールァミンである請求項 1〜3のいずれかに記載の薬剤。

5. 前記リン脂質がホスファチジルセリンである請求項 1〜4のいずれかに記載の薬剤。

6. 前記リン脂質に親和性を有する物質が下記の一般式で表わされる配列を有する請求項 1〜 5のいずれかに記載の薬剤。

(A 1 ) η , - (A 2) n₂ - (A 3) n₃

(ただし、 A 1は配列番号 1または配列番号 1 0に記載のァミノ酸配列、 A 及び A 3はそれぞれ配列番号 2及び配列番号 3に記載のァミノ酸配列、 n , 、 n ₂ 及び n ₃ はそれぞれ A 1、 A 2及び A 3の繰り返し回数であってそれぞれ 0〜5、 1〜5及び 0〜5である。）

7. 前記 n, が 0または 1、 n₂ が 1、 2または 3、 n₃ が 0または 1である請求項 6に記載の薬剤。

8. 前記リン脂質に親和性を有する物質が下記のいずれかの配列を有する請求項 6または請求項 7に記載の薬剤。

(A 1) , - (A2) , - (A3) ,

(A2) , - (A3) ,

(A 2) 一 (A3) ,

(A2) ₂

9. 前記リン脂質に親和性を有する物質が下記のいずれかの配列を有する請求項 6〜 8のいずれかに記載の薬剤。

(A 2) ₂ 一 (A3) ,

(A2) - (A3) ,

(A2) ₂

1 0. 前記生理活性物質がペプチドである請求項 1〜9のいずれかに記載の薬剤。

1 1. 前記ペプチドが血液凝固反応系に関与する因子、線溶系に関与する因子、免疫応答反応に関与する因子、細胞障害を抑制する因子及び蛋白分解酵素の活性を阻害する因子からなる群から選ばれる少なくとも 1つである請求項 1 0に記載の薬剤。

1 2. 前記ペプチドが血液凝固反応を抑制する因子、線溶系を亢進する因子、補体活性化反応を抑制する因子、活性酸素による細胞障害を抑制する因子及び蛋白分解酵素の活性を阻害する因子からなる群から選ばれる少なくとも 1つである請求項 1 0に記載の薬剤。

1 3. 前記ペプチドがトロンボモジュリン（ T M ) 、ゥリナス夕チン (UT I ) の第二領域、メンブレンコファクタ一プロティン（Memb r a n e C o f a c t o r P r o t e i n, MCP) s UT Iまたはそれらの改変体である請求項 1 0〜1 2のいずれかに記載の薬剤。

1 4. 前記べプチドが配列番号 4または配列番号 23〜 25のいずれかに記載のァミノ酸配列を有する請求項 1 0〜 1 3のいずれかに記載の薬剤。

1 5. 前記生理活性物質とリン脂質に親和性を有する物質とがペプチド結合を介して結合する請求項 1 0〜1 4のいずれかに記載の薬剤。

1 6. 前記リン脂質に親和性を有する物質の N末端アミノ酸と生理活性物質の C末端アミノ酸とがペプチド結合を介して結合している請求項 1 0〜1 5のいずれかに記載の薬剤。

1 7. 下記の一般式で表されるアミノ酸配列を有するぺプチド。

(A 2) n₂ 一 (A 3) n₃

(ただし、 A 2及び A 3はそれぞれ配列番号 2及び配列番号 3に記載のァミノ酸配列であって、 n₂ 及び n₃ はそれぞれ A 2及び A 3の繰り返し回数を表し、それぞれ 2または 3及び 0または 1である。）

1 8. 前記アミノ酸配列が下記のいずれかの配列を有する請求項 1 7に記載のぺプチド

(A2) ₂ - (A3) ,

(A2) 3 一 (A3) ,

(A2) 2

1 9. 請求項 1 5または 1 6に記載の薬剤のいずれかのァミノ酸配列をコ一ドする DNA。

2 0. 請求項 1 7または 1 8に記載のぺプチドのいずれかのァミノ酸配列をコードする DNA。

2 1. 請求項 1〜1 6のいずれかに記載の薬剤の製造方法。