WO1998045431A1 - Gene associe a la metastase cancereuse - Google Patents

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WO1998045431A1
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Masashi Morita
Hiroharu Arakawa
Masataka Ohta
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a protein associated with cancer metastasis and its gene.
  • cancer remains one of the leading causes of death in most developed countries, including Japan.
  • the malignancy of this cancer is manifested by the random growth of the cancer cells, the invasion of the cancer cells into surrounding organs, and metastasis to distant organs.
  • the majority of cancer deaths are due to recurrence due to metastasis, and if cancer metastasis / invasion can be suppressed, it is possible to completely cure the cancer by surgical removal.
  • treatment for localized cancer is considered to be almost established, how to deal with metastasis is the top priority for improving the outcome of cancer treatment. For this reason, analysis of genes involved in cancer cell invasion and metastasis and proteins that are gene products is very important in the development of new cancer treatment methods.
  • Murine IMC-HM cells which are highly metastatic liver cells isolated from mouse IMC cells by Arakawa et al., Spontaneously metastasize first to the liver by subcutaneous transplantation into the ventral subcutaneous mouse, and rapidly to the main organs throughout the body. Metastases kill the host about two weeks after transplantation.
  • the IMC-LM cells obtained by subculturing the parental IMC cells have almost no metastatic ability, the transplanted mice survive for at least 6 weeks after transplantation, and no metastatic foci at the macroscopic level are observed ( Arakawa, H. et al., Jap. J. Cancer Res., 87, 518-523, (199 6)).
  • mice IMC-HM cells have very similar genetic backgrounds, but they showed distinct differences in the ability to naturally metastasize to distant organs.
  • the present inventors paid attention to this fact, thought that genes that are key to their metastatic potential were expressed in mouse IMC-HM cells, and made use of the differential display method to detect mouse IMC-LM cells.
  • the present inventors succeeded in isolating two mouse cDNA fragments that are candidates for factors that induce cancer metastasis.
  • the present inventors also examined the relationship between the expression of isolated mouse cMA and cancer metastasis. Specifically, a vector that expresses the antisense mRNA of one of the isolated mouse cDNAs (mouse “CMAP”) was constructed, and the vector was expressed in IMC-HA1 cells derived from IMC-HM cells. Thus, a plurality of transformants having different antisense mRNA expression levels were prepared. Next, the transformant was transplanted into a mouse and examined for its metastatic potential. As a result, they found that the higher the expression level of the antisense mRNA, the lower the metastasis ability of the transformant.
  • the present inventors have produced a human cDNA (human “CMAP”) showing high homology with mouse CMAP by a polymerase chain reaction using a primer prepared based on the nucleotide sequence of the isolated mouse CMAP.
  • CMAP human cDNA
  • the isolation was successful.
  • the present inventors have found that a close relationship between the expression of the isolated protein and cancer metastasis has been confirmed, and thus, by using these proteins and genes, the screening of cancer metastasis inhibitors was found to be possible.
  • the present invention relates to novel proteins and genes involved in cancer metastasis, and a method for screening a cancer metastasis inhibitor using the same. More specifically, the present invention relates to (1) SEQ ID NO: 4, 6 Or a protein consisting of the amino acid sequence of any one of the above, or one or more of the amino acid sequences in the protein. A protein having an amino acid sequence in which a number of amino acids have been substituted, deleted, or added and having cancer metastasis activity;
  • a DNA that hybridizes with MA consisting of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, or 37, wherein the DNA encodes a protein having cancer metastasis activity;
  • a method for screening a compound having an activity of inhibiting cancer metastasis comprising:
  • the present invention relates to a novel cancer metastasis-related protein.
  • the nucleotide sequence of the cDNA named "CMAP” isolated by the present inventors is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Mouse “CMAP” cDNA is highly expressed in mouse IMC-HM cells, a cell line derived from mouse IMC cells that cause cancer metastasis, and is also derived from mouse IMC cells but has almost no cancer metastasis ability. It was isolated by differential display as a gene whose expression was not detected in the cells (see Example 1).
  • mice When the expression of mouse CMAP in various cancer cells was detected, except for IMC-HA1 cells, M-5076 cells, L5178Y cells, and P388, which mainly formed metastatic lesions in the liver when transplanted from the tail vein of mice, were used. Cells and L1210 cells. On the other hand, B-16-BL6 cells and Colon26 cells, in which expression of mouse “CAP” was hardly confirmed, induced strong lung metastases experimentally, but no liver metastasis was observed. All other cell lines in which mouse CMAP was below the detection limit were almost eliminated and regressed by tail vein transplantation into mice (see Example 7).
  • a cDNA having high homology with human “CMAP” (human “CMAP”) can be obtained from human spleen by polymerase chain reaction using a primer prepared based on the nucleotide sequence of mouse “CMAP” cDNA. CDNA) was isolated. The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 37, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 38. Human "CMAP” showed a high homology of 71.6% with the mouse CMAP in the amino acid sequence (see Example 8). This strongly suggests that human “CMAP” has the same function as mouse “CMAP”.
  • 16411 and “# 11.24413” both have the same nucleotide sequence except that the terminal lOObp differs before and after, and when encoding a protein of 131 and 126 amino acids with a different N-terminal 20-30 amino acids. it was thought.
  • the amino acid sequences of the proteins encoded by the “# 7.116411” cDNA and the “# 11.24413” cDNA are shown in SEQ ID NOs: 6 and 9.
  • “# 11.24413” was detected only in IMC-HAI cells and P388 cells derived from mouse IMC-HM cells in cancer cells, and in thymus, lung, spleen and slightly in peripheral blood in normal tissues (Example 6). See). This suggests that most normal tissues are processed to “# 7.16411”, and that “# 1 1.24413” is expressed only in special cells. “# 11.24413” may be a factor conferring specificity such as the rapid spread of IM C-HAI cells throughout the body. Based on these properties, these proteins have activity to inhibit cancer metastasis It can be used for screening compounds.
  • the protein of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art as a natural protein or as a recombinant protein using a genetic recombination technique.
  • the natural protein can be prepared, for example, by a method in which an extract of a cell or tissue in which the protein of the present invention is considered to be expressed is subjected to affinity chromatography using the antibody of the present invention described below. It is possible.
  • a recombinant protein can be prepared by culturing cells transformed with a DNA encoding the protein of the present invention, as described later.
  • the present invention also relates to proteins functionally equivalent to the above proteins (mouse “CMAP”, human “CMAP”, “# 7.16411”, and “# 11.24413”).
  • a method for isolating a functionally equivalent protein for example, a method for introducing an amino acid mutation into a protein is known to those skilled in the art. That is, those skilled in the art can use, for example, the Kunkel method (Kunkel, TA et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)), the double primer method (Zoller, MJ and Smith, M., Methods Enzymol.
  • the amino acid substitution in the above-mentioned protein (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6, 9, 38) is appropriately performed. It is possible to prepare modified proteins having equivalent functions. Amino acid mutations in proteins can also occur naturally.
  • the protein of the present invention also includes a variant in which the amino acid sequence is mutated from the native protein by amino acid substitution, deletion, addition, etc., and which has a function equivalent to that of the native protein. It is.
  • “functionally equivalent” means that the protein has cancer metastasis activity.
  • the metastasis activity of a protein for example, suppresses the expression or function of the protein in cells capable of metastasis.
  • the cells are transplanted into an animal body, and It can be detected by determining the metastatic potential of cancer (see Example 9).
  • Amino acid mutations in functionally equivalent proteins are usually within 10%, preferably within 10 amino acids, more preferably within 3 amino acids, and more preferably 1 amino acid, relative to the native protein.
  • a protein encoding a DNA encoding the protein and a DNA hybridizing with the DNA and a protein functionally equivalent to the protein described above are also included in the protein of the present invention.
  • “functionally equivalent” means that the protein has cancer metastasis activity, as described above.
  • Hybridization conditions for the isolation of functionally equivalent proteins are usually the following: hybridisation is performed with 6 x SSC S 40% formamide, 25.C and washing with 1 x SSC, 55 ° C ”. As preferable conditions, hybridization is performed at “6 ⁇ SSC, 40% formamide, 37.C”, and washing is performed at “0.2 ⁇ SSC, 55 ° C.”.
  • hybridization is performed at “6 ⁇ SSC, 50 ° formamide, 37 ° C”, and washing is performed at “0.1 ⁇ SS 62 ° C”.
  • SSC styrene-maleic anhydride
  • washing is performed at “0.1 ⁇ SS 62 ° C”.
  • the MA encoding the protein isolated by this is usually It has high homology with the nucleotide sequence of the cDNA encoding the protein (the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, or 37). High homology refers to at least 70%, preferably 80%, more preferably 90%, more preferably 95% or more sequence identity at the base level.
  • the present invention relates to the protein of the present invention (mouse “CMAP”, human “CMAP”,
  • the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can encode these proteins, and includes not only cDNA and genomic DNA but also synthetic DNA.
  • the DNA of the present invention can be isolated by a method known to those skilled in the art.
  • the cDNA is, for example, cMA encoding the protein of the present invention (for example, a cDNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 37) or a fragment thereof, an RNA complementary thereto, or synthetic O oligo nucleotides comprising a portion 3 2 labeled with a P, evening protein of the present invention is expressed to have cells or tissues, cDNA library derived from the sequence of the cDNA - screening by Haiburidizu to Can be.
  • an oligonucleotide corresponding to the nucleotide sequence of the cDNA can be synthesized, and cDNA derived from an appropriate cell or tissue can be amplified and cloned into type III by the polymerase chain reaction.
  • Genomic DNA is, for example, cDNA encoding the protein of the present invention.
  • a cDNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 37
  • a fragment thereof RNA complementary thereto, or a synthetic sequence containing a part of the sequence of the cDNA.
  • labeled oligo nucleotide, etc. 3 2 P it can be screened by Haiburidizu genomic DNA library.
  • the synthetic DNA is obtained by chemically synthesizing an oligonucleotide having a partial sequence of, for example, a cDNA encoding the protein of the present invention (for example, a cDNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 37).
  • a cDNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 37.
  • DNA ligase Khorana, HG et al., J. Biol. Chem. 251, 565-570 (1976); Goeddel DV et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 106-10 (1979).
  • the DNA encoding the protein of the present invention (for example, cDNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8, 37) is inserted into an appropriate expression vector, and the vector is
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein by culturing a transformant obtained by introducing it into an appropriate cell and purifying the expressed protein.
  • the host is Escherichia coli, plasmid vector pET-3 (Rosenberg, AH et al., Gene 56, 125-35 (1987)), pGEX-1 (Smith , DB and Johnson, KS, Gene 67, 31-40 (1988)).
  • the transformation of Escherichia coli is carried out by the Hanahan method (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983)) and the electroporation method (Dower, WJ et al., Nucl. Acids Res. 16, 6 127-6145 (1988)).
  • Recombinant protein is synthesized in the form of a fusion protein with a histidine residue at the N-terminus, glutathione S-transferase (GST), etc. It can be purified by binding to a resin (Smith, MC et al., J. Biol. Chem. 263, 7211-7215 (1988)).
  • GST glutathione S-transferase
  • Recombinant protein is synthesized in the form of a fusion protein with a histidine residue at the N-terminus, glutathione S-transferase (GST), etc. It can be purified by binding to a resin (Smith
  • pESP-1 (Lu, Q. et al., Gene 200, 135-144 (1997)) and the like are used. Yeast transformation is performed, for example, by the spheroplast method (Beach, D. and Nurse, P., Nature 290, 140 (1981)), the lithium acetate method (Okazaki, K. et al., Nucleic Acids Res. 18, 6485-64 89 (1990)).
  • GST glutathione S-transferase
  • the recombinant protein can be purified by binding to a GST affinity resin.
  • thrombin blood coagulation factor Xa
  • thrombin blood coagulation factor Xa
  • a vector such as pMSG (Clontech) is used.
  • the introduction of recombinant DNA into mammalian cells can be performed using the calcium phosphate method (Graham, FL and van derEb, AJ, Virology 52, 456-467 (1973)), the DEAE-dextran method (Sus sman, DJ and Milman, G., Mol. Cell. Biol.
  • the present invention also relates to a DNA that specifically hybridizes with the DNA of the present invention, and has a chain length of at least 15 nucleotides.
  • “specifically hybridizes” means that cross-hybridization does not occur with DNA encoding other proteins, preferably under stringent hybridization conditions.
  • Such DM can be used as a probe for detecting and isolating DNA encoding the protein of the present invention, and as a primer for amplification.
  • the present invention also relates to an antisense DNA against a DNA encoding the protein of the present invention or a part thereof.
  • Such antisense DNA is used to suppress the expression of the protein of the present invention.
  • the antisense DNA has a chain length of at least 15 bp or more, preferably 100 bp or more, in order to exert its antisense effect, and is usually shorter than 800 bp, preferably shorter than 600 bp.
  • the present invention also relates to an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the tongue of the present invention An antibody that binds to protein can be prepared by a method known to those skilled in the art (for example, see “New Biochemistry Experiment Lecture 1, Protein 1, 389-406, Tokyo Kagaku Dojin”). The preparation of the polyclonal antibody is performed, for example, as follows. Administer an appropriate amount of the above protein or peptide to immunized animals such as rabbits, guinea pigs, mice, and chickens. Administration may be with an adjuvant (FIA or FCA) that promotes antibody production. Administration is usually performed every few weeks. By performing immunization several times, the antibody titer can be increased.
  • FFA adjuvant
  • a polyclonal antibody can be prepared by subjecting this antiserum to, for example, ammonium sulfate precipitation, fractionation by anion chromatography, or affinity purification using protein A or immobilized antigen.
  • preparation of a monoclonal antibody is performed, for example, as follows. An immunized animal is immunized with the protein of the present invention or its partial peptide in the same manner as described above, and after the final immunization, a spleen or lymph node is collected from the immunized animal.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells contained in the spleen or lymph node are fused using polyethylene glycol or the like to prepare a hybridoma.
  • the desired hybridoma is screened, cultured, and a monoclonal antibody can be prepared from the culture supernatant.
  • the monoclonal antibody can be purified, for example, by ammonium sulfate precipitation, fractionation by anion chromatography, or affinity purification using protein A or immobilized antigen.
  • the antibody thus prepared is used for affinity purification of the protein of the present invention, as well as for examination of diseases (eg, cancer) caused by abnormal expression of the protein of the present invention, antibody treatment, and protein of the present invention. It can be used to detect the expression level of, for example.
  • human antibodies or human antibodies are preferred.
  • the human antibody is a mouse-human chimeric antibody
  • an antibody gene is isolated from a mouse cell that produces an antibody against the protein of the present invention, and the H chain constant region is recombined into a human IgE H chain constant region gene. It can be prepared by introduction into mouse myeloma cell line J558L (Neuberger, MS et al., Na ture 314, 268-270 (1985)).
  • human antibodies can be prepared by immunizing a mouse in which the immune system has been replaced with a human with the protein of the present invention.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound having an activity of inhibiting cancer metastasis using the protein of the present invention.
  • One embodiment of the screening method of the present invention includes (a) a step of bringing a test sample into contact with the protein of the present invention, and (b) a step of selecting a compound having an activity of binding to the protein of the present invention.
  • Test samples used for screening include, for example, purified proteins, expression products of genes (including libraries), extracts of tissues or cells, cell culture supernatants, synthetic low molecular compounds, and microbial metabolites. But not limited to these.
  • the test compound used for screening is appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include, but are not limited to, radiolabels and fluorescent labels.
  • the binding between the protein of the present invention and the test compound can be detected by a label attached to the compound bound to the protein of the present invention (for example, the amount of the binding is detected by radioactivity or fluorescence intensity).
  • a label attached to the compound bound to the protein of the present invention for example, the amount of the binding is detected by radioactivity or fluorescence intensity.
  • the repo overnight gene Binding can also be detected by detecting activity.
  • affinity purification using a column on which the protein of the present invention is immobilized various peptide display methods, for example, the fage display method (F. Parmly and GP Smith, Gene, 73, 305 (1988) ) are known.
  • another embodiment of the screening method of the present invention includes: (a) a step of bringing a test sample into contact with cells expressing the protein of the present invention; and (b) a step of bringing the protein of the present invention into contact with the test sample. Detecting the expression level of the protein using an antibody that binds to the protein of the present invention; and (c) detecting the protein level of the present invention in cells that are not contacted with the test sample. Selecting a compound that reduces the expression level of the protein of the present invention as compared with the expression level of the protein. Cells to be treated with a test sample in this screening method are not particularly limited as long as they express the protein of the present invention.
  • IMC-HM cells or cells derived therefrom M-5076 cells And L5178Y cells.
  • a purified protein, an expression product of a gene (including a library), a tissue or cell extract, a cell culture supernatant, a synthetic low-molecular compound, a microbial metabolite, and the like are used. Not restricted.
  • Many known methods can be used as a method for detecting the expression level of the protein of the present invention using an antibody. For example, methods such as ELISA method, immunoprecipitation method, and ⁇ stamp rotting method can be used.
  • an antibody is used after labeling as necessary.
  • Examples of the label include, but are not limited to, an enzyme label, a radiolabel, and a fluorescent label.
  • a molecule that specifically binds to the antibody of the present invention for example, a secondary antibody, protein A, or the like can be labeled and detected.
  • Screening can also be performed by detecting mRNA expression in addition to the method for detecting protein expression as described above. Detection of mRNA expression can be performed, for example, by RT-PCR. As a control, for example, G3PDH can be used.
  • Compounds isolated by these screening methods are candidates for compounds that inhibit the activity of the protein of the present invention. These compounds can be used as cancer metastasis inhibitors.
  • One mode of the method for confirming in vivo is as follows: (a) a step of bringing the compound isolated by the above-mentioned screening method into contact with a cell having cancer metastasis ability; (b) a step of bringing the cell into a test non-human mammal. Transplanting; and (c) detecting cancer metastasis in the test non-human mammal and determining whether the compound has an activity of suppressing cancer metastasis.
  • a mouse is used as a test animal as a cell having cancer metastasis ability, for example, mouse IMC-HM cells or Alternatively, cells derived therefrom are preferred. In this case, cells can be transplanted into mice by, for example, subcutaneous transplantation or tail vein transplantation. Cancer metastasis can be detected, for example, by the formation of metastatic foci in the liver.
  • Another embodiment of the method for confirming in vivo is a method of directly administering to mice.
  • This method comprises the steps of (a) administering the compound isolated by the above screening method to a test non-human mammal, (b) transplanting cells having cancer metastatic potential into the test non-human mammal, (C) detecting cancer metastasis in a test non-human mammal, and determining whether the compound has an activity of suppressing cancer metastasis.
  • Examples of the method for administering the compound include oral administration, intraperitoneal administration, tail vein administration, subcutaneous and intradermal administration, and intramuscular administration.
  • mouse IMC-HM cells or cells derived therefrom are suitable as cells having cancer metastasis ability.
  • Transplantation can be performed by, for example, subcutaneous transplantation, tail vein transplantation, or the like.
  • cancer metastasis can be detected, for example, by the formation of a metastatic focus in the liver.
  • Figure 1 is an electrophoresis photograph of CMAP expression in various tumor cells detected by Northern protein.
  • FIG. 2 is an electrophoresis photograph in which CMAP expression in normal tissues was detected by Northern blotting.
  • FIG. 3 is a diagram showing a comparison of the amino acid sequences of CMAP and human
  • RNA from IMC-HM and IMC-LM cells was performed using ISOGEN (Futtsubon Gene). That is, 1x10 'cultured cells in the logarithmic growth phase were collected and precipitated by centrifugation. After removing the supernatant of the culture solution by suction, lml of ISOGEN was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes to lyse the cells. To the mixture was added 0.2 ml of black-mouthed form, stirred vigorously for 15 seconds, allowed to stand at room temperature for several minutes, and then centrifuged at 12,000 g for 15 minutes at 4 ° C.
  • ISOGEN Full-Specific Gene
  • RNA RNA was separated, an equal volume of isopropanol was added, and the mixture was stirred, left at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged again at 12,000 g for 15 minutes with cooling.
  • the precipitate of MA was separated, rinsed with ethanol, and then dissolved in 50/1 sterilized purified water treated with DEPC (diethyl pyrocarbonate) to obtain a total A solution.
  • DEPC diethyl pyrocarbonate
  • MMLV-derived reverse transcriptase Superscript II (GIBCO BRL) and mRNA Fingerprinting Kit (clontech)
  • complementary single-stranded DNA was prepared using the obtained total RNA as type III.
  • 11 g of cDNA synthesis primer (oligo dT primer) was added to 2 g of total RNA, the total amount was adjusted to 51 with sterilized purified water treated with DEPC, and the mixture was kept at 70 ° C for 3 minutes and then quenched.
  • reaction buffer 5x first-strand buffer
  • 21 dNTP mix 5 mM each
  • lj 1 SuperscriptII 200 units / l
  • RNA fingerprinting based on the polymerase chain reaction was performed using this single-stranded cDNA solution.
  • Each of the single-stranded cDNA preservation solutions contains 20 l of P primer (Pl-10 / SEQ ID NO: 10 to 19) and 20 l of T primer (T1-9 / SEQ ID NO: 20 to 28) (CL0NTECH). Mix one by one, add the PCR master mix (171), add mineral oil (Sigma), and overlay.
  • a plate (20 ⁇ 40 cm) for a sequence gel was assembled using a speaker according to a conventional method.
  • the gel and buffer used were a glycerol-resistant 63 ⁇ 4 gel and glycerol-resistant buffer from United States Biochemical.
  • the PCR products amplified by the P-Brimer and the T-Bramer were each mixed with 21 reaction stop solutions, heated at 94 ° C for 2-3 minutes, and then cooled. This was added to a glycerol-tolerant gel 31 each and electrophoresed at 35 W for about 3 hours. After the electrophoresis, the gel was transferred onto filter paper and dried at 80 ° C for 2 hours using a gel dryer. The radioactivity in the gel was photographed by leaving it on a BAS2000 imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) and imaged with BAS2000.
  • IMC-HM cells genes having significantly different expression levels between IMC-HM cells and IMC-LM cells were searched. If its expression level is biased toward IMC-HM cells, it may be a candidate for a factor that induces metastasis. Conversely, if expression is biased in IMC-LM cells, it may be a candidate for a factor that suppresses metastasis.
  • two bands were identified from IMC-HM cells as candidates for factors that induce metastasis. One was from the P2 and T3 primer set and the other was from the P2 and T8 primer set. The former is “23-1” and the latter is “28-1” I named it.
  • IMC-HM cell-specific cDNA bands 23-1 and 28-1 were directly excised from the dried gel and boiled together with the gel in 401 sterile purified water for 10 minutes to elute the desired cDNA fragment. This small amount of cDNA fragment was reamplified as follows.
  • the PCR product of the cDNA has an A added at its 3'-end and can be cloned directly by a TA-type vector (with a T at the end). Therefore, the reamplified cDNA fragment was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen) by the following method. That is, the re-amplified PCR fragment was mixed with 10x ligation buffer (Invitrogen), pCR II vector (registered trademark, Invitrogen) (25 ⁇ g / ml), and sterilized purified water at 9 / l. T4 DNA ligase (Invitrogen) was mixed with each other, and left at 14 ° C overnight to insert cDNA.
  • 10x ligation buffer Invitrogen
  • pCR II vector registered trademark, Invitrogen
  • the vector without the insert reacts with X-Gal and turns blue, while the vector containing the cDNA turns white. According to this principle, ten white colonies were picked, re-cultured for sequencing, and simultaneously made replicas.
  • a plasmid was prepared from each transformant using the QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN) according to the following procedure.
  • Each transformant was cultured in 3 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin at 37 ° C. for about 8 hours, and collected by centrifugation.
  • the cells were lysed with 250-1 buffer-PI (QIAGEN), and 2501 buffer P2 (QIAGEN) was added and mixed. Further, Buffer P 3 (QIAGEN) with 350> 1 was added, mixed, and centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes. The supernatant was transferred to a QIAprep spin column (QIAGEN) and centrifuged at 10,000 xg for 1 minute.
  • QIAGEN QIAprep spin column
  • the nucleotide sequence of the cDNA was determined by the Daiichi-Mine-Toichi method (device used; ABI Model 377). The conditions vary depending on the purification state, concentration, etc. of plasmid ⁇ , which can be used as a base. In general, the sequence of 500-600 bases can be determined at a time by the dilute-to-mine method.
  • the pCRII vector has the M13 forward and reverse primer sites near the insertion site. Using each of the fluorescently labeled primers, both duplexes were read and sequenced.
  • the enzyme was diluted by mixing 25 1 AmpliTaq, 25 1 5x buffer, and 1251 purified water to prepare premixes for A, G, T and each.
  • 100-200 ng /// l of type I DNA11 and A and C premixes were mixed with 4 1 and type2 DNA2 / 1 with G and T premixes 8 1 and 2 separately.
  • the cycle sequencing reaction was performed with a Perkin Elmer 9600 at 96 ° C for 2 minutes, 25 cycles of 96 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds and 60 ° C for 4 minutes.
  • IMC_HM cells The establishment of a primary line of IMC_HM cells and IMC-LM cells was performed by the limiting dilution method. Each cell was rolled into a 96-well plate at 4 cells / l Owell, and 10 clones grown from single cells were obtained at random.
  • RT-PCR was performed as follows. The preparation of total RNA and the reverse transcriptase reaction were performed in the same manner as described above ((1) and (2) in Example 1). In order to amplify specific cDNA by PCR, single-stranded oligo DNA primers, "23-1 # 2 ⁇ ” (CAGMTCTGCTCATGCAGTC (SEQ ID NO: 29)), “23-1 # 2Rlj (CACTCCTTACTTTCCACCCC (SEQ ID NO: 30) )), "28-l # 3Fl” (AACAGCATTTCCCTA MGCTCGG (SEQ ID NO: 31)), and "28-1 # 3M” (TGGAAACTACTTCCCTGCTCCCA (SEQ ID NO: 32)).
  • 23-1 # 2 ⁇ CAGMTCTGCTCATGCAGTC (SEQ ID NO: 29)
  • 23-1 # 2Rlj CACTCCTTACTTTCCACCCC (SEQ ID NO: 30)
  • 28-l # 3Fl AACAGCATTTCCCTA MGCTCGG (SEQ
  • 23-belly 1 and 23-1 # 2R1, 28-1 # 3 ⁇ and 28-job 1 can amplify a part of the sequence of 23-1 # 2 and 28-1 # 3, respectively.
  • Single-stranded cDNA prepared from IMC-HM and IMC-LM-derived cells was subjected to PCR for type III using EX Taq DNA polymerase under the same conditions as in Example 1 (5) for 30 cycles.
  • the same level of amplification of the appropriate size cDNA was observed in clone cells derived from IMC-HM, and no signal was detected in clone cells derived from IMC-LM. Did not.
  • IMC-HM-derived cloned cells were One mouse was implanted subcutaneously. As a result, all of the IMC-HM-derived cloned cells killed the host 2-3 weeks after transplantation, and macroscopic findings showed remarkable cancer metastasis in the liver and spleen. I was not able to admit. Through observation of other morphology, in vitro proliferation ability, and the like, no significant difference was observed between IMC-LM-derived cells and IMC-HM-derived cells. IMC-HM-derived clone cell lines and IMC-LM-derived clone cell lines were selected one by one and named "IMC-HA1" and "IMC-LE5". The IMC-HA1 cells were deposited at the following depository.
  • PolyA RNA was prepared from IMC-HA1 and IMC-LE5 cells using a Messenger RNA Isolation Kit (STRATAGENE) as follows. Approximately 10 'cells were collected from 100 ml of the culture suspension and lysed with 5 ml of a denaturing solution (STRATAGENE) supplemented with 1 /?-Mercaptoethanol. 10 ml of an elution buffer (STRATAGENE) was added, and the mixture was centrifuged at 12,000 ⁇ g for 10 minutes.
  • STRATAGENE Messenger RNA Isolation Kit
  • the supernatant was mixed with 5 ml of oligo dT cellulose (0.04 g / ml) and gently stirred at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 700 ⁇ g for 3 minutes, the supernatant was removed and resuspended in 5 ml of a high-salt buffer (STRATAGENE). After repeating this washing operation twice, the cells were suspended in 5 ml of low-salt buffer (STRATAGENE). After filling a 2.5 ml push column (STR ATAGENE) with the cellulose suspension, the remaining polyA RNA was eluted with 400 ⁇ 1 of an elution buffer at 68 ° C.
  • the labeled probe was separated from unincorporated [[-] P] dCTP by a Sephadex G-50 spin column. was diluted with purified water, and the radioactivity of the probe was measured using a liquid scintillation counter.
  • a cDNA library derived from IMC-HAI cells was prepared by the following methods (a) to (e).
  • RNA was extracted from IMC-HA1 cells by the method described in Example 1 (1). However, in this case, the extraction probability of proteins, lipids, DNA fragments and the like was reduced by performing the IS0GEN extraction twice.
  • PolyA RNA was extracted from this total RNA as follows. Whatmann 3M was placed on the bottom of a 2.5 ml syringe and filled with 5 ml of oligo dT cellulose (0.04 g / ml) (STRATAGENE) to prepare a spin column. After the sample was added to the column and left at room temperature for 30 minutes, the column was washed three times with a high salt buffer and a low salt buffer (Clontech).
  • Xhol linker primer After blunting the reverse end of the Xhol linker primer with 5 U of Pfu DNA polymerase (STRATAGENE), ligate the EcoRI adapter with 4 U of T4 DNA ligase at 8 ° C for 1 hour, then ligate. The ends were phosphorylated with 10 U of T4 polynucleotide kinase.
  • One end of Xhol linker was cut by 120U Xhol treatment. At the EcoRI and Xhol sites, the cDNA was inserted into the ZAP Express Vector by T-MA reaction at 12 ° C using T4 MA ligase.
  • Phage packaging was performed using Gigapack Gold II (STRATAGENE), and the process completely followed the recommended protocol.
  • Phosphate-treated host bacteria with 50,000 plaques / plate are layered on top of 20 prepared NZY agar plates with 150 recites together with top agar and left at 37 ° C overnight. A plaque was formed.
  • the SM buffer from which the phage was sufficiently released was recovered and rinsed with 2 ml of SM buffer to recover. This was dispensed as a preservation solution for the cDNA library and stored frozen at -70 ° C. Thereafter, this storage solution was used for screening of the cDNA library.
  • NZY agar plates were prepared in a sterile square No. 2 petri dish. Infect the phage of the cDNA library with X-Blue MRF 'adjusted to 0D F0.5 to obtain 50,000 plaques / plate, overlay with LB top agar on a NZY agar plate, and leave at 37 ° C overnight did. After confirming the proper formation of plaque the next day, the mixture was cooled at 4 ⁇ for 2 hours, and the DNA in the plaque was transferred to Hybond N + membrane. After passing through the steps of denaturation, drying, and UV-crosslinking, the membrane was hybridized by the following procedure.
  • the membrane was immersed in a 2 ⁇ PIPES buffer, 50% formamide, 0.5% SDS, denatured salmon sperm DNA (100 g / ml) solution, and prehybridized at 42 ° C. for 1 hour.
  • 23-1 # 2 and 28-1 # 3 radiolabeled with [hi- "P] dCTP were prepared according to the method described above, and were added as probes to the above prehybridization solution.
  • the membrane was left overnight at 42 ° C. After hybridization, the membrane was washed with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS solution at 65 ° C. for 20 minutes 3 to 4 times. Images were printed at 1: 1 magnification with BAS2000, and the corresponding points on the plate were punched out with a sterilized P1000 chip with a truncated tip to elute the phage into the SM buffer.
  • the phage solution determined to be positive in the primary screening was further screened in the same step. However, a 10-fold dilution series of the phage solution was prepared and layered using a 100-thigh plastic dish instead of the sterile angle No. 2 dish. The phage at the point determined to be positive in the secondary screening was eluted into the SM buffer, and the insert was amplified using T7 and T3 primers. At this stage several inserts were recognized If so, screening was continued in the same steps.
  • phage clone # 9.3133 which specifically binds to 23-1 # 2, is converted to phage clones # 7.1641, # 8. 32, got # 11.2441.
  • ZAP Express can be directly excised as a pBK-CMV phagemid vector containing an insert directly in vivo in the presence of a helper phage (ExAssist helper phage).
  • the cloned phage was excised as a pBK-CMV phage mid-vector, cloned into XL0LR to form a colony on a kanamycin-containing LB plate, and cloned.
  • phage medicinal Yuichi clones # 9.331334, # 7.16411, # 8.323, and # 11.24413 were obtained.
  • the nucleotide sequence was partially determined by the dye primer method using the pBK-CMV phagemid vector containing these cDNAs. Specifically, the sequence was determined in the same manner as in Example 1 (6). However, the cycle sequencing reaction was performed using T3 primer (AATTAACCCTCACTAAAGGG / SEQ ID NO: 33) and T7 primer (GTMTACGACTCACTAT AGGGC / SEQ ID NO: 34). Furthermore, the primer used in RT-PCR and the primer of an appropriate sequence were designed in the insert of pBK-CMV phage middock, whose sequence was partially determined by the dye primer method. The sequence of the undefined region was further determined by the overnight method.
  • the PRI SM Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing Kit was used. Mix 250-500 ng of double-stranded DNA with 3.2 pmol of the primer and 8 ⁇ 1 of the above-mentioned premix to make the total volume 20 ⁇ 1, and make one cycle at 96 ° C for 2 minutes, then at 96 ° C for 10 seconds, A cycle sequence was performed at 50 ° C for 5 seconds and at 60 ° C for 4 minutes under 25 cycles. The conditions for electrophoresis and analysis were the same as those for the dye primer method.
  • clone # 9.331334 having a total length of 983 was obtained for 23-1 # 2 (SEQ ID NO: 3).
  • This sequence was a novel gene containing a translation region encoding 167 amino acids.
  • the amino acid sequence is approximately the same as that of bovine cystin B, an inhibitory protein for cathepsins.
  • the predicted amino acid was considered to have a hydrophobic N-terminus in # 7.16411, but was calculated to be hydrophilic in # 11.24413. 28 As with # 9.31334, the search results for the three types of sequences obtained using 8-1 # 3 are novel genes, and the protein considered to be encoded by # 7.16411 is human SLPI (secretary leukoprotease inhibitor). Showed partial homology close to 60%.
  • nucleotide sequences of these clones are as follows: SEQ ID NO: 5 (nucleotide sequence of clone # 7.16411), SEQ ID NO: 7 (nucleotide sequence of clone # 8.323), and SEQ ID NO: 8 (nucleotide sequence of clone # 11.24413). Indicated.
  • mouse CMAP The predicted amino acid sequence found in the translation region of # 9.31334 was designated as mouse CMAP.
  • # 9.31334 is referred to as mouse CMAP.
  • mice CMAP The expression of mouse CMAP in 12 mouse tumor cell lines was examined by RT-PCR (Riverse Transcription PCR) (Fig. 1). Total RNA was extracted from each cell line in the same manner as in Example 1 (1), and complementary single-stranded cDNA was prepared in the same manner as in Example 1 (2). Mouse CMAP was detected by PCR in the same manner as in Example 1 (5). The reaction was performed at 94 ° C for 2 minutes in 1 stroke, 94 ° C for 1 minute, 68 ° C for 2 minutes in 30 cycles, and 68 ° C for 5 minutes in 1 stroke. The primer was “23-l # 2Fl” (sequence No .: 29) and "23-l # 2Rl" (SEQ ID NO: 30) were used.
  • the dilution ratio of single-stranded cDNA, which becomes type ⁇ , should be 10-fold diluted when amplifying CMAP and 40-fold diluted when detecting control G3PDH. It was confirmed that the semi-quantitative condition was a linear relationship.
  • mouse CMAP was clearly expressed in M-5076 cells, L5178Y cells, P388 cells, and L1210 cells except for IMC-HA1 cells.
  • Anatomical macroscopic findings and pathological analysis confirmed that all of these cell lines formed metastases mainly in the liver when 1 ⁇ 10 5 cells were transplanted from the tail vein of mice.
  • B-16-BL6 cells and Colon26 cells which showed little expression of mouse CMAP, induced strong lung metastases experimentally, but did not show liver metastases.
  • all other cell lines in which mouse CMAP expression was below the detection limit were almost completely eliminated and regressed by tail vein transplantation into mice.
  • mice 15 tissues were surgically excised from 2-3 normal 5-week-old female CDF1 mice, and the tissues were crushed using polytron. Then, the expression of mouse CMAP was determined by RT-PCR as described above. Was confirmed (Fig. 2). As a result, the thymus, spleen, and intestinal membranes were clearly weaker than IMC-HA1 cells. Expression of mouse CMAP was observed in the lymph node. These results suggested that mouse CMAP also plays a physiological role in normal tissues, which may be closely related to the immune system.
  • Human spleen was selected as a source of type I DNA because mouse CMAP was expressed in spleen in normal mouse tissue.
  • Single-stranded cDNA was prepared in the same manner as in Example 1 (2) using 2 g of total RNA (OriGene) extracted from human spleen.
  • Eight primers (SEQ ID NOs: H-CMAP-1 to 8) were designed based on the sequences of N47763 and N56875.
  • Type I single-stranded cDNA was subjected to PCR in the same manner as in Example 1 (5) using the primers of H-CMAP-1 and H-CMAP-2.
  • the reaction conditions are as follows: 1 cycle at 94 ° C for 2 minutes, 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 90 seconds, 1 cycle at 72 ° C for 5 minutes, and more.
  • the process was performed continuously.
  • the thermal cycler used PEMIN ELMER 9600.
  • the nucleotide sequence of the amplified cDNA product of about 0.8 kb derived from human CMAP was directly obtained using primer H-CMAP-1-8 (SEQ ID NOs: 39 to 46) in the same manner as in Example 1 (6). Determined (SEQ ID NO: 37).
  • Human CMAP showed 65.9% homology with mouse CMAP.
  • Human CMAP was located at positions 83 to 583 in the nucleotide sequence, and its amino acid sequence (SEQ ID NO: 38) showed 71.6% homology with mouse CMAP. Therefore, it was strongly suggested that these two proteins may have almost the same functions.
  • SEQ ID NO: 38 amino acid sequence
  • the 84th N was theoretically highly likely to have a sugar added, and was considered to be a property not found in other nearby sequences.
  • CMAP retains a sequence similar to the previously reported cis amino acids, a number of characteristic amino acid residues were observed, suggesting that it may have properties different from those of known products. Was done.
  • metastasis requires a change in the quality or amount of expression of multiple overlapping genes. Therefore, even if one metastasis-related gene was induced into cells with low metastasis, it was considered difficult to confirm an increase in metastatic potential in mice. Therefore, a vector incorporating a sequence that complementarily offsets mouse CMAPmMA was introduced into IMC-HA1 cells, and a stably transformed cloned cell was constructed to examine the change in the metastatic potential in the actual mouse.
  • the pBK-CMV expression vector was treated with Nhe I and Kpn I restriction enzymes to prepare a linear vector from which the lac Z promoter and the multicloning site had been removed. Inserts were prepared by RT-PCR using total RNA from IMC-HA1 cells as material. As primers, CMAP-F1 (SEQ ID NO: 47) and CMAP-R1 (SEQ ID NO: 48) were used. These primers have Nhel and Kpnl restriction enzyme recognition sites added to their ends, and the amplified product 'Corresponds to the untranslated region and the entire translated region.
  • the amplified product of about 0.5 kb was treated with Nhel and Kpnl restriction enzymes, purified by QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN), and ligated to the previously prepared linear vector using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo).
  • QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit
  • pBK-AS-CMAP a vector that expresses antisense mRNA of mouse CMAP in cells, was constructed.
  • IMC-HA1 cells in the logarithmic growth phase were collected from 100 ml of the culture solution, and resuspended in EP buffer to prepare a cell suspension with a density of 4 ⁇ 10 ′ cells / ml.
  • Transformed cells were selected Cells were cloned by the limiting dilution method After obtaining about 50 cloned cells, cells with reduced mouse CMAP were screened by RT-PCR, resulting in 3 Cloned cells, 57C4, 53A9, and 53E9 The same operation was performed for the pBK-CM V vector without the insert to obtain a clone strain 18B5 that served as a vector control The expression of mouse CMAP mRNA in these cell lines was confirmed by the Northern method. As with the IMC-HA1 cells, the expression was approximately 49%, 32%, and 16% for the 57C4, 53A9, and 53E9 strains, respectively. No particular change was observed in the form and the like.
  • mice of the IMC-HA1 cell-derived clonal cell line with different expression of mouse CMAP mRNA was tested in three independent experimental systems.
  • each cell was transplanted subcutaneously 5x10 ⁇ 0, and the liver was removed on day 15 for observation and weight measurement, and the survival time was also investigated.
  • Study II as in Study I, but on day 3 after transplantation, the primary tumor mass was resected together with nearby lymph nodes. This experiment can mimic the micrometastases of IMC-HA1 cells in the liver.
  • Test III three lxlO cells were directly transferred from the tail vein, and the liver was removed on the 13th day.
  • mice CMAP mRNA is closely related to the formation of metastatic foci in the liver and the prolongation of life (Table 1).
  • the annotation “1)” in the table indicates “the number of mice surviving for 60 days / the number of mice tested”.
  • IMC-HA1 100 2.070 Sat 0.409 173 17.4 Sat 1.5 100 0/5
  • IMC-HA1 100 1.506 ⁇ 0.149 145 18.0 Sat 0.7 100 0/5
  • IMC-HA1 100 1.767 Sat 0.460 191 14.0 ⁇ 0.7 100 0/5
  • mice transplanted with the 53A9 strain, and half of the 53E9 strain survived more than 60 days without inducing liver metastasis.
  • a novel protein involved in cancer metastasis and a DNA encoding the protein have been provided. Also provided are a vector into which the DNA has been inserted, a transformant carrying the vector, and a method for producing a recombinant protein comprising a step of culturing the transformant. Also provided is a DNA for use in detecting, isolating, amplifying or suppressing expression of the gene. Furthermore, a method for screening a cancer metastasis inhibitor using the protein was provided. This has enabled the development of new cancer metastasis inhibitors.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Name Mus Musculus
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Name Mus Musculus
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Mus Musculus
  • IMC HA1 cell-derived cDNA library
  • AAG GAG TCC CAT GTC AGC AAA GCC CTG GTA CAG GTG GTG AAA GGC CTG 340 Lys Glu Ser His Val Ser Lys Ala Leu Val Gin Val Val Lys Gly Leu
  • Organism name Mus Mus cuius
  • Organism name Mus Musculus
  • IMC HA1 cell-derived cDNA library
  • Organism name Mus Musculus
  • Cys Glu Gly lie Cys Gly Lys Val Cys Leu Pro Pro Met
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name us Musculus
  • One library cDNA library derived from IMC-HA1 cells
  • GGCTCAGCAT TCACCGAGCT TTAGGGAAAT GCTGTTGGAG AGCAAATAAA TAAACGCATT 1080
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Mus Musculus
  • One library cDNA library derived from IMC-HA1 cells
  • CTGGACTCGT GCTCGGTGTG CTCTGGAAAC TACTTCCCTG CTCCCAGGCG TCCCTGCTCC 507 GGGTTCCATG GCTCCCGGCT CCCTGTATCC CAGGCTTGGA TCCTGTGGAC CAGGGTTACT 567 GTTTTACCAC TAACATCTCC TTTTGGCTCA GCATTCACCG AGCTTTAGGGAATGCGATGAAAAGGTCAGAAAA
  • Organism Name Mus Musculus
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name us Muscukus
  • AAA AAC CAG CAC CTG CGT CTG GAT GAC TGT GAC TTC CAA ACC AAC CAC 496 Lys Asn Gin His Leu Arg Leu Asp Asp Cys Asp Phe Gin Thr Asn His
  • Organism name Mus Muscukus
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書 癌転移関連遺伝子 技術分野
本発明は、 癌転移に関連するタンパク質およびその遺伝子に関する。 景技俯
診断法や治療法の目覚ましい発達にもかかわらず、 依然として癌はわが国をは じめほとんどの先進諸国における主要死亡原因の一つである。 この癌の悪性度は、 癌細胞の無秩序な増殖とともに、 癌細胞の周囲臓器への浸潤、 遠隔臓器への転移 により現される。 実際、 癌による死亡の大多数が転移による再発を原因とし、 癌 の転移 ·浸潤を抑制できれば、 外科的な摘出により癌を完治させることが可能で ある。 局在する癌に対する治療方法がほぼ確立したと考えられる現時点において は、 転移に対してどのように対処するかが癌治療の成績向上のための最優先課題 であるといえる。 このため、 癌細胞の浸潤や転移に関与する遺伝子及び遺伝子産 物であるタンパク質の解析は、 新たな癌の治療法の開発において非常に重要であ る。
現在まで、 多数の癌転移関連遺伝子の報告がなされている。 例えば、 マウス尾 静脈より移植した際に肺へのコロニー形成能が異なる K- 1735マウスメラノーマの 亜株間において、転移能とノーザンプロットでの発現が逆相関している因子として、 ディファレンシャルハイプリダイゼ一シヨン法により 「nm23」 が発見された。この 「nm-23」 の cDNAを高転移クローンに遺伝子導入すると実験転移能が低下すること が報告されている (Steeg,P. S. et al . ,J. Natl . Cancer Inst. , 80,200-204( 1988) 及び Leone A. et al. ,25- 35( 1991 )参照) 。 また、 ラヅト前立腺癌 R- 3327に由来す る低転移性細胞と高転移性細胞におけるディファレンシャルハイブリダィゼ一シ ヨン法により、 低転移性細胞株間において高発現する遺伝子が単離され、 該遺伝 子がフイブロネクチンをコードすることが報告されている。 また、 V- Ha-rasを発 現させ高転移性となつた複数のクローン細胞においてフイブロネクチンの mRNAの 発現が 4-8倍低下していることも報告されている (Schalken,J.A.et al., Cancer Res., 48,2042- 2046(1988)参照) 。 その他、 「KAII」 (Dong.J.T.et al. ,Sience,2 68,884-886(1995)、 stromelysin-3(Basset,p.et al., Nature, 348,699-704(1990), 「pGM21」 (Phillips, S.M.et al. , J. Natl. Cancer Inst.，82, 199-203(1990)等、 多 くの遺伝子が癌転移関連遺伝子として報告されてきた。
しかしながら、 これまでの報告の多くは、 標的遺伝子の発現を抑制した癌細胞 を用い、 該細胞の遊走能、 浸潤能の低下を指標とした検討にとどまつており、 実 際に動物を用いた評価系での抑制効果が認められたとの報告はなされていない。 発明の開示
本発明は、 癌転移に関与する新規なタンパク質および該タンパク質をコードす る DNAを提供することを課題とする。 また、 本発明は、 該 DNAが挿入されたべクタ 一、 該ベクターを保持する形質変換体、 該形質転換体を培養する工程を含む組み 換えタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。 また、 本発明は、 該遺 伝子の検出、 単離、 増幅または発現の抑制に用いられる DNAを提供することを課題 とする。 さらに、 本発明は、 癌転移に関与するタンパク質および遺伝子を利用し た癌転移阻害剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
荒川らによってマウス IMC細胞より分離された肝高転移性変異細胞であるマウス IMC- HM細胞は、マウスの腹側皮下への移植によってまず肝臓へと自然転移し次いで 全身の主たる臓器へと急速に転移して移植後 2週間前後でホストを死亡せしめる。 一方、その親株の IMC細胞を継代培養した IMC-LM細胞は転移能がほとんど認められ ず、移植したマウスは少なくとも移植後 6週間以上生存し、肉眼レベルでの転移巣は いっさい認められない （Arakawa,H.et al. , Jap. J. Cancer Res. ,87,518-523,(199 6)参照） 。これら 2種の細胞は遺伝子背景が非常に近いことが容易に想像されるが、 遠隔臓器への自然転移能の有無というかけ離れた性質の違いを示した。 本発明者 らはこの事実に着目し、 マウス IMC-HM細胞においてはその癌転移性の鍵を握る遺 伝子が発現していると考え、 ディファレンシャルディスプレイ法を利用してマウ ス IMC-LM細胞と比してマウス IMC-HM細胞において強い発現を示す遺伝子の単離を 試みた。 その結果、本発明者らは、 癌の転移を誘発する因子の候補となる 2つのマ ウス cDNA断片を単離することに成功した。 さらに、 これら cDNA断片をプローブと してマウス IMC- HA1細胞由来の cDNAライブラリーをスクリーニングを行い、 それら の全長 cDNAを単離することに成功した。
また、 本発明者らは単離したマウス cMAの発現と癌転移との関連を検討した。 具体的には、 単離したマウス cDNAの一つ （マウス 「CMAP」 ） についてそのアンチ センス mRNAを発現するベクターを構築し、 該ベクターを IMC-HM細胞由来の IMC - HA 1細胞内で発現させて、 アンチセンス mRNAの発現量が異なる複数の形質転換体を調 製した。 次いで、 該形質転換体をマウス体内へ移植してその癌転移能の検討を行 つた。 その結果、 アンチセンス mRNAの発現量が高い形質転換体ほど、 その癌転移 能が低下することを見出した。 また、 本発明者らは、 単離したマウス CMAPの塩基 配列を基に作製したプライマ一を利用したポリメラ一ゼ連鎖反応により、 マウス CMAPと高い相同性を示すヒト cDNA (ヒト 「CMAP」 ） を単離することに成功した。 さらに、 本発明者らは、 このように単離したタンパク質の発現と癌転移との間 に密接な関係が認められたことから、 これらタンパク質および遺伝子を利用する ことにより、 癌転移阻害剤のスクリーニングを行うことが可能であることを見出 した。
即ち、 本発明は、 癌転移に関与する新規なタンパク質および遺伝子、 並びにこ れらを利用した癌転移阻害剤のスクリ一ニング方法に関し、 より具体的には、 ( 1 ) 配列番号： 4、 6、 9、 または 3 8のいずれかに記載のアミノ酸配列か らなるタンパク質、 または該タンパク質中のアミノ酸配列において 1若しくは複 数のアミノ酸が置換、 欠失、 若しくは付加したアミノ酸配列からなり癌転移活性 を有するタンパク質、
(2) 配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 37のいずれかに記載の塩基配列か らなる DNAとハイブリダィズする DNAがコ一ドするタンパク質であって、 癌転移活 性を有するタンパク質、
(3) ( 1) に記載のタンパク質をコードする DNA、
(4) 配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 37のいずれかに記載の塩基配列か らなる、 （3) に記載の DNA、
(5) 配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 37のいずれかに記載の塩基配列か らなる MAとハイプリダイズする DNAであって、 癌転移活性を有するタンパク質を コードする DNA、
(6) (3) から （5) のいずれかに記載の DNAが挿入されたべクタ一、
(7) (6) に記載のベクターを保持する形質転換体、
(8) (7) に記載の形質転換体を培養する工程を含む、 （ 1) または （2) に記載の夕ンパク質の製造方法、
(9) (3) から （5) のいずれかに記載の DNAと特異的にハイブリダィズする DNAであって、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DM、
( 10) (3) から （5) のいずれかに記載の DNA若しくはその一部に対するァ ンチセンス DNA、
( 1 1) ( 1) または （2) に記載のタンパク質に結合する抗体、
( 12) 癌転移を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であ つて、
(a) ( 1) または （2) に記載のタンパク質に被検試料を接触させる工程、
(b) ( 1) または （2) に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物を 選択する工程、 を含む方法。
( 13) 癌転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であ つて、
(a) (1) または （2) に記載のタンパク質を発現する細胞に被検試料を接触 させる工程、
(b)被検試料を接触させた細胞における （1) または （2) に記載のタンパク 質の発現量を （11) に記載の抗体を用いて検出する工程、
(c)被検試料を接触させない細胞における （1) または （2) に記載のタンパ ク質の発現量と比較して、 （1) または （2) に記載のタンパク質の発現量を低 下させる化合物を選択する工程、 を含む方法、
に関する。
本発明は、 新規な癌転移関連タンパク質に関する。 本発明者らにより単離され た 「CMAP」 と命名された cDNAの塩基配列を配列番号： 3に、 該 cDNAによりコード されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 4に示す。 マウス 「CMAP」 cDNAは、 癌転移を引き起こすマウス IMC細胞由来の細胞株であるマウス IMC- HM細胞に高発現 し、 同じくマウス IMC細胞由来であるが癌転移能がほとんど認められない IMC-LM細 胞においては発現が検出されない遺伝子としてディファレンシャルディスプレイ 法により単離された （実施例 1参照） 。 種々の癌細胞におけるマウス CMAPの発現 を検出したところ、 IMC-HA1細胞以外では、マウスの尾静脈より移植した際に主と して肝臓における転移巣を形成した M- 5076細胞、 L5178Y細胞、 P388細胞、 L1210細胞 で発現していた。一方、 マウス 「C AP」 の発現がほとんど確認できなかった B-16 - BL6細胞と Colon26細胞は実験的に肺転移巣を強く誘導したが、 肝転移は認められ なかった。 マウス CMAPが検出限界下であったその他の細胞株はいずれもマウスへ の尾静脈移植によってほとんど排除され退縮した （実施例 7参照） 。 また、 マウ ス 「CMAP」 cDNAのアンチセンス mMAを種々のレベルで発現する複数の形質転換体 を調製して、 これらをマウス体内へ移植して、 インビボにおける癌転移能の検討 を行った結果、 アンチセンス mRNA量の発現量が高い形質転換体ほど、 その癌転移 能が低下した （実施例 9参照） 。 これら事実は、 マウス 「CMAP」 の発現が癌細胞 の転移と密接に関連していることを示唆するものである。
また、 本発明者らは、 マウス 「CMAP」 cDNAの塩基配列を基に作製したブライマ —を用いたポリメラ一ゼ連鎖反応によりヒト脾臓からマウス 「CMAP」 と高い相同 性を有する cDNA (ヒト 「CMAP」 cDNA) を単離した。 その塩基配列を配列番号： 3 7に、 該 cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 3 8に 示す。 ヒト 「CMAP」 は、 アミノ酸配列において、 マウス CMAPと 71.6%という高い 相同性を示した （実施例 8参照） 。このことは、 ヒト 「CMAP」 がマウス 「CMAP」 と 同様の機能を担っていることを強く示唆するものである。
また、 マウス 「CMAP」 と同様に、 マウス IMC-HM細胞と IMC-LM細胞を利用したデ ィファレンシャルディスプレイ法により、 マウス IMC-HM細胞に高発現する 3種類の cDNA(#7. 16411 , #8.323, #11.24413 )を単離した。 cDNAの塩基配列をそれそれ配列 番号： 5、 7、 8に示す。 これらの塩基配列を比較検討したところ #8.323のプロ セシングの違いによって 「#7. 16411」 と 「#11.24413」 が産生されることが強く示 唆された。 「#7. 16411」 と 「#11.24413」 はいずれも 5，末端側 lOObp前後が異なる以 外は同一の塩基配列を示し、 N-末端 20-30アミノ酸が異なる 131及び 126アミノ酸の タンパク質をコードすると考えられた。 「#7. 16411」 cDNAおよび 「#11.24413」 c DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 6および 9に示す。 種々 の癌細胞および正常細胞における 「#7. 16411」 および 「#11.24413」 の発現を検出 したところ、 「#7. 16411」 については発現レベルに差異こそあつたが調べたほと んどすべての癌細胞と正常組織で検出された。 しかし 「#11.24413」 に関しては癌 細胞ではマウス IMC-HM細胞由来の IMC- HAI細胞と P388細胞、 正常組織では胸腺、 肺、 脾臓そしてわずかに末梢血において検出されたのみであった （実施例 6参照） 。 このことから大半の正常組織では 「#7. 16411」 へのプロセシングが行われ、 「#1 1.24413」 は特殊な細胞でのみ発現していると考えられる。 「#11.24413」 は、 IM C-HAI細胞の全身への急速な広がりなどの特殊性を与えている因子であるかもしれ ない。 以上のような特性から、 これらタンパク質は癌転移を阻害する活性を有す る化合物のスクリーニングに利用することが可能である。
本発明のタンパク質は、 当業者に公知の方法により、 天然のタンパク質の他、 遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。 天然のタンパク質は、 例えば、 本発明のタンパク質が発現していると考えられる 細胞または組織の抽出液に対し、 後述する本発明の抗体を用いたァフィ二ティー クロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。 一方、 組換え タンパク質は、 後述するように本発明のタンパク質をコードする DNAで形質転換し た細胞を培養することにより調製することが可能である。
また、 本発明は、 上記タンパク質 （マウス 「CMAP」 、 ヒト 「CMAP」 、 「#7. 164 11」 、 および「#11.24413」 ) と機能的に同等なタンパク質に関する。 機能的に同 等なタンパク質を単離するための方法としては、 例えば、 タンパク質にアミノ酸 の変異を導入する方法が当業者に知られている。 即ち、 当業者であれば、 例えば、 Kunkel法 (Kunkel, T. A. et al . , Methods Enzymol . 154, 367-382 ( 1987)) 、 ダブルプライマ一法 （Zoller, M. J. and Smith, M.， Methods Enzymol . 154, 3 29-350 ( 1987) ) 、 カセッ ト変異法 (Wells, et al. , Gene 34, 315-23 ( 1985 )) 、 メガプライマ一法 （Sarkar, G. and So醒 er， S. S. , Biotechniques 8， 404-407
( 1990)) などを利用して、 上記したタンパク質 （配列番号： 4、 6、 9、 3 8に 記載のアミノ酸配列からなるタンパク質） 中のアミノ酸の置換などを適宜行い、 これら天然型のタンパク質と同等の機能を有する改変タンパク質を調製すること が可能である。 また、 タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。 このようにアミノ酸の置換、 欠失、 付加などにより天然型のタンパク質に対して アミノ酸配列が変異した変異体であって、 天然型のタンパク質と同等の機能を有 するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 タンパク質が癌転移活性を有することを指す。 タンパク質の癌転移活性は、 例え ば、 癌転移能を有する細胞において該タンパク質の発現若しくは機能を抑制し
(例えば、 アンチセンス技術を利用する） 、 該細胞を動物体内へ移植して、 その 癌転移能を判定することにより検出することができる （実施例 9参照） 。 機能的 に同等なタンパク質のアミノ酸の変異は、 天然型のタンパク質に対して、 通常、 10 %以内、 好ましくは 10アミノ酸以内、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内、 さらに 好ましくは 1アミノ酸である。
また、 機能的に同等なタンパク質を単離するための当業者に知られた他の方法 としては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 (Hanahan, D. and Meselson, . , Meth. Enzymol . 100, 333-342 ( 1983 )、 Benton, W. D . and Davis, R. W.， Science 1 96, 180-182 ( 1977) ) を利用する方法が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 上 記したタンパク質をコードする DNA配列 （配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 3 7 に記載の塩基配列） 若しくはその一部を基に、 これと相同性の高い DNAを単離して、 該 DNAから上記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることは通常行い うることである。 このように上記タンパク質をコ一ドする DNAとハイプリダイズす る DNAがコ一ドするタンパク質であって、 上記タンパク質と機能的に同等なタンパ ク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。 ここで 「機能的に同等」 とは、 上記 と同様に、 タンパク質が癌転移活性を有することを指す。 機能的に同等なタンパ ク質を単離するためのハイブリダィゼ一シヨンの条件としては、 通常、 ハイプリ ダイゼーシヨンを 「6 X SSCS 40 % ホルムアミ ド、 25 。C」 、 洗浄を 「1 x SSC、 55 °C」 で行う。 好ましい条件としては、 ハイブリダィゼーシヨンを 「6 X SSC、 40 % ホルムアミ ド、 37 。C」 、 洗浄を 「0.2 X SSC、 55 °C」 で行う。 さらに好ま しい条件としては、 ハイブリダィゼ一シヨンを 「6 X SSC、 50 ¾ ホルムアミ ド、 37 °C」 、 洗浄を 「0. 1 X SS 62 °C」 で行う。 なお、 当業者であれば、 SSCの希 釈率、 ホルムアミ ド濃度、 温度などの諸条件を適宜選択することで、 上記の条件 と同様のストリンジエンシーのハイブリダィゼ一シヨン条件を実現することがで きる。 機能的に同等なタンパク質を単離する生物としては、 例えば、 ヒト、 マウ ス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒヅジ、 ゥシ、 ィヌ、 ブ夕などが挙げられるが、 これらに 制限されない。 これにより単離されるタンパク質をコードする MAは、 通常、 上記 タンパク質をコードする cDNAの塩基配列 （配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 3 7に記載の塩基配列） と高い相同性を有する。 高い相同性とは、 塩基レベルで少 なくとも 70%以上、 好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 さらに好 ましくは 95%以上の配列の同一性を指す。
また、 本発明は、 上記本発明のタンパク質 （マウス 「CMAP」 、 ヒト 「CMAP」 、
「#7. 16411」 、 「#11.24413」 およびこれらタンパク質と機能的に同等なタンパク 質） をコードする DNAに関する。 本発明の DNAとしては、 これらタンパク質をコ一 ドしうるものであれば特に制限はなく、 cDNA、 ゲノム DNAの他、 合成 DNAも含まれ る。 本発明の DNAは当業者に公知の方法により単離することができる。 cDNAは、 例 えば、 本発明のタンパク質をコードする cMA (例えば、 配列番号： 3、 5、 7、 8、 3 7に記載の塩基配列からなる cDNA) あるいはその断片、 それらに相補的な RNA、 または該 cDNAの配列の一部を含む合成ォリゴヌクレオチドを3 2 Pなどで標識 し、 本発明の夕ンパク質が発現している細胞もしくは組織由来の cDNAライブラリ —にハイブリダィズさせることによりスクリーニングすることができる。 あるい は、 cDNAの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、 適当な細胞若しく は組織由来の cDNAを錡型にポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅し、 クローニングす ることもできる。 ゲノム DNAは、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする cDNA
(例えば、 配列番号： 3、 5、 7、 8、 3 7に記載の塩基配列からなる cDNA) あ るいはその断片、 それらに相補的な RNA、 または該 cDNAの配列の一部を含む合成ォ リゴヌクレオチドを3 2 Pなどで標識し、 ゲノム DNAライブラリーにハイブリダィズ させることによりスクリーニングすることができる。 あるいは、 cDNAの塩基配列 に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、 ゲノム DNAを鎵型にポリメラ一ゼ連鎖反 応により増幅し、 クロ一ニングすることもできる。 一方、 合成 DNAは、 例えば、 本 発明のタンパク質をコードする cDNA (例えば、 配列番号： 3、 5、 7、 8、 3 7 に記載の塩基配列からなる cDNA) の部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合 成し、 アニーリングさせて二本鎖にし、 DNAリガーゼで結合させることにより調製 することができる （Khorana, H. G. et al.， J. Biol. Chem. 251, 565-570 (19 76)； Goeddel D. V. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 106-10 (1979))。 これら DNAは、 組換えタンパク質の生産に有用である。 即ち、 上記本発明のタン パク質をコードする DNA (例えば、 配列番号： 3、 5、 7、 8、 37に記載の塩基 配列からなる cDNA) を適当な発現ベクターに挿入し、 該ベクタ一を適当な細胞に 導入して得た形質転換体を培養し、 発現させたタンパク質を精製することにより 本発明のタンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。 具体 的には、 宿主が大腸菌ェシエリシァ 'コリ （Escherichia coli) の場合、 プラス ミ ドベクタ一 pET- 3 (Rosenberg, A. H. et al.， Gene 56, 125-35 (1987))、 pG EX-1 (Smith, D. B. and Johnson, K. S.， Gene 67, 31-40 (1988)) などが用い られる。 大腸菌の形質転換は、 Hanahan法 （Hanahan, D.， J. Mol. Biol. 166, 5 57-580 (1983)) 、 電気穿孔法 （Dower, W. J. et al.， Nucl. Acids Res. 16, 6 127-6145 (1988)) などで行う。 組換えタンパク質は、 例えば、 N末端にヒスチジ ン残基の夕グ、 グル夕チオン Sトランスフェラ一ゼ （GST) などを結合した融合夕 ンパク質の形で合成し、 金属キレート樹脂、 GST親和性レジンに結合させることに より精製することができる （Smith, M. C. et al.， J. Biol. Chem. 263, 7211- 7215 (1988)) 。 融合タンパク質から目的タンパク質を分離するには、 トロンビン、 血液凝固因子 Xaなどで切断する。 宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス 'ボンベ
(Schizosaccharomyces pombe) の場合には、 ブラスミ ドベクタ一 pESP - 1 (Lu, Q. et al.， Gene 200, 135-144 (1997)) などが用いられる。 酵母の形質転換は、 例 えば、 スフエロプラスト法 （Beach, D. and Nurse, P., Nature 290, 140 (198 1)) 、 酢酸リチウム法 (Okazaki, K. et al.， Nucleic Acids Res. 18, 6485-64 89 (1990)) などにより行なわれる。 pESP- 1を用いた場合、 グル夕チオン Sトラン スフエラ一ゼ （GST) との融合タンパク質として合成されるため、 GST親和性レジ ンに結合させることより組換えタンパク質を精製できる。 融合タンパク質から目 的タンパク質を分離するには、 トロンビン、 血液凝固因子 Xaなどで切断する。 一 方、 宿主がほ乳動物細胞、 例えば、 チャイニーズハムスター卵巣由来細胞 CH0、 ヒ ト HeLa細胞などの場合、 pMSG (クロンテク社） などのベクタ一が用いられる。 ほ 乳動物細胞への組換え DNAの導入は、 リン酸カルシウム法 （Graham, F. L. and v an derEb, A. J. , Virology 52, 456-467 ( 1973 )) 、 DEAE-デキストラン法 （Sus sman, D. J. and Mi lman, G.， Mol . Cell . Biol . 4, 1641-1643 ( 1984) ) 、 リポ フエクシヨン法 （Feigner, P. L. et al .， Proc . Natl . Acad. Sci . USA M, 74 13-7417 ( 1987) ) 、 電気穿孔法 (Neumann, E. et al .， EMBO J. 1, 841-845 ( 19 82) ) などで行われる。 宿主が昆虫細胞の場合には、 バキュロウィルスべクタ一 p BacPAK8/9 (クロンテク社） などが用いられる。 昆虫細胞の形質転換は、 例えば、 バイオ/テクノロジ一 （Bio/Technology) ， 6, 47-55( 1980 ) ) などに記載の方法 に従って行なうことができる。
また、 本発明は、 上記本発明の DNAと特異的にハイブリダィズする DNAであって、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DNAに関する。 ここで 「特異的にハイブ リダィズする」 とは、 好ましくはストリンジェン卜なハイブリダィゼ一シヨン条 件下で他のタンパク質をコ一ドする DNAとクロスハイプリダイゼ一シヨンが起こら ないことを指す。 このような DMは、 本発明のタンパク質をコードする DNAを検出、 単離するためのプローブとして、 また、 増幅するためのプライマ一として利用す ることができる。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質をコードする DNA若しくはその一部に対す るアンチセンス DNAに関する。 このようなアンチセンス DNAは、 本発明のタンパク 質の発現を抑制するために利用される。 例えば、 癌転移能を有する細胞内で発現 させ、 本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、 該細胞の癌転移能を抑 制することが可能である。 アンチセンス DNAは、 そのアンチセンス効果を発揮する ために、 少なくとも 15bp以上、 好ましくは lOObp以上の鎖長を有し、 通常、 800bp より短く、 好ましくは 600bpより短い。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質に結合する抗体に関する。 本発明のタン パク質に結合する抗体は、 当業者に公知の方法 （例えば、 「新生化学実験講座 1 , タンパク質 1 , 389-406,東京化学同人」 参照） により調製することが可能である。 ポリクローナル抗体の調製は、 例えば、 以下の如く行う。 ゥサギ、 モルモット、 マウス、 ニヮトリなどの免疫動物に適量の上記タンパク質またはぺブチドを投与 する。 投与は、 抗体産生を促進するアジュバント （FIAや FCA) と共に行ってもよ い。 投与は、 通常、 数週間ごとに行う。 免疫を複数回行うことにより、 抗体価を 上昇させることができる。 最終免疫後、 免疫動物から採血を行うことにより抗血 清が得られる。 この抗血清に対し、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿や陰イオンク ロマトグラフィ一による分画、 プロティン Aや固定化抗原を用いたァフィ二ティ一 精製を行うことにより、 ポリクロ一ナル抗体を調製することができる。 一方、 モ ノクローナル抗体の調製は、 例えば、 以下の如く行う。 本発明のタンパク質もし くはその部分ペプチドを、 上記と同様に免疫動物に免疫し、 最終免疫後、 この免 疫動物から脾臓またはりンパ節を採取する。 この脾臓またはリンパ節に含まれる 抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、 ハイプリ ドーマを調製する。 目的のハイプリ ドーマをスクリーニングし、 これを 培養し、 その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。 モノク 口一ナル抗体の精製は、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿や陰イオンクロマトグラ フィ一による分画、 プロティン Aや固定化抗原を用いたァフィ二ティー精製により 行うことができる。 これにより調製された抗体は、 本発明のタンパク質のァフィ 二ティー精製のために用いられる他、 本発明のタンパク質の発現異常に起因する 疾患 （例えば、 癌） の検査や抗体治療、 本発明のタンパク質の発現量の検出など に利用することが可能である。 なお、 抗体治療に用いる場合、 ヒト型抗体もしく はヒト抗体であることが好ましい。 ヒト型抗体は、 例えば、 マウス一ヒトキメラ 抗体であれば、 本発明のタンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体 遺伝子を単離し、 その H鎖定 常部をヒト IgE H鎖定常部遺伝子に組換え、 マウス骨 髄腫細胞 J558Lに導入することにより調製できる （Neuberger, M. S. et al . , Na ture 314, 268-270 ( 1985 )) 。 また、 ヒト抗体は、 免疫系をヒトと入れ換えたマ ウスに本発明のタンパク質を免疫することにより調製することが可能である。 また、 本発明は、 本発明のタンパク質を利用した癌転移を阻害する活性を有す る化合物のスクリーニング方法に関する。 本発明のスクリーニング方法の一つの 態様は、 （a ) 本発明のタンパク質に被検試料を接触させる工程、 （b ) 本発明 のタンパク質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、 を含む。 スクリー ニングに用いる被検試料としては、 例えば、 精製タンパク質、 遺伝子 （ライブラ リーも含む） の発現産物、 組織もしくは細胞の抽出液、 細胞培養上清、 合成低分 子化合物、 微生物代謝産物などが用いられるが、 これらに制限されない。 スクリ —ニングに用いる被検化合物は、 必要に応じて適宜標識して用いられる。 標識と しては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識などが挙げられるが、 これらに制限されな い。 本発明のタンパク質と被検化合物との結合は、 本発明のタンパク質に結合し た化合物に付された標識により検出することができる （例えば、 結合量を放射活 性や蛍光強度により検出する） 。 また、 例えば、 TWOハイブリッドシステム （Zer vos et al . 'Cell 72,223-232( 1994), Fritz et al . , Nature 376, 530-533( 1995 ) ) を利用した場合には、 レポ一夕一遺伝子の活性の検出によっても結合を検出する ことができる。 本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングするため の具体的な方法としは、 上記の TWOハイブリッドシステム以外に、 当業者に公知の 多くの方法を用いることができる。 例えば、 本発明のタンパク質を固定したカラ ムを利用したァフィ二ティ一精製、 種々のペプチドディスプレイ法、 例えば、 フ ァ一ジディスプレイ法 (F.Parmly and G.P. Smith, Gene, 73, 305( 1988) ) などが知 られている。
また、 本発明のスクリーニング方法の他の態様は、 （a ) 本発明のタンパク質 を発現する細胞に被検試料を接触させる工程、 （b ) 被検試料を接触させた細胞 における本発明の夕ンパク質の発現量を本発明の夕ンパク質に結合する抗体を用 いて検出する工程、 （c ) 被検試料を接触させない細胞における本発明のタンパ ク質の発現量と比較して、 本発明のタンパク質の発現量を低下させる化合物を選 択する工程、 を含む。 このスクリーニング方法において被検試料で処理を行う細 胞としては、 本発明のタンパク質を発現する細胞であれば特に制限はないが、 例 えば、 IMC-HM細胞若しくはそれに由来する細胞、 M-5076細胞、 L5178Y細胞などが 挙げられる。 被検試料としては、 例えば、 精製タンパク質、 遺伝子 （ライブラリ 一も含む） の発現産物、 組織もしくは細胞の抽出液、 細胞培養上清、 合成低分子 化合物、 微生物代謝産物などが用いられるが、 これらに制限されない。 抗体を用 いて本発明の夕ンパク質の発現量を検出する方法としては、 公知の多くの方法を 利用することができる。 例えば、 ELISA法、 免疫沈降法、 ゥヱスタンプロティング 法などの方法が挙げられる。 本発明のタンパク質の検出には抗体は必要に応じて 標識して用いられる。 標識としては例えば、 酵素標識、 放射標識、 蛍光標識など が挙げられるが、 これらに制限されない。 本発明の抗体を標識せずに、 本発明の 抗体と特異的に結合する分子、 例えば、 二次抗体、 プロテイン Aなどを標識して検 出することも可能である。 なお、 上記のようにタンパク質の発現を検出する方法 以外に、 mRNAの発現を検出することによつても、 スクリーニングを行うことがで きる。 mRNAの発現の検出は、 例えば、 RT-PCRにより行うことができる。 対照とし ては、 例えば、 G3PDHなどを用いることができる。 これらスクリーニング方法によ り単離される化合物は、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物の候補とな る。 これら化合物には癌転移抑制剤としての利用が考えられる。
上記スクリーニング方法により単離された化合物の効果は必要に応じてィンビ ボにおいて確認することが好ましい。 インビボにおいて確認する方法の一つの態 様としては、 （a ) 上記スクリーニング方法により単離された化合物を癌転移能 を有する細胞に接触させる工程、 （b ) 該細胞を被検非ヒト哺乳動物に移植する 工程、 （c ) 被検非ヒト哺乳動物における癌転移を検出し、 化合物が癌転移を抑 制する活性を有するか否かを判定する工程、 を含む。 癌転移能を有する細胞とし ては、 被検動物としてマウスを用いる場合には、 例えば、 マウス IMC-HM細胞若し くはこれに由来する細胞が好適である。 この場合、 マウスへの細胞の移植は、 例 えば、 皮下移植、 尾静脈移植などの方法で行うことができる。 癌転移は、 例えば、 肝臓における転移巣の形成により検出することが可能である。
インビボにおいて確認する方法の他の態様としては、 直接マウスに投与する方 法である。 この方法は、 （a ) 上記スクリーニング方法により単離された化合物 を被検非ヒト哺乳動物に投与する工程、 （b ) 癌転移能を有する細胞を被検非ヒ 卜哺乳動物に移植する工程、 （c ) 被検非ヒト哺乳動物における癌転移を検出し、 化合物が癌転移を抑制する活性を有するか否かを判定する工程、 を含む。 化合物 の投与方法としては、 例えば、 経口投与、 腹腔内投与、 尾静脈内投与、 皮下およ び皮内投与、 筋肉内投与などの方法が挙げられる。 上記の方法と同様に、 癌転移 能を有する細胞としては、 被検動物としてマウスを用いる場合には、 例えば、 マ ウス IMC-HM細胞若しくはこれに由来する細胞が好適であり、 マウスへの細胞の移 植は、 例えば、 皮下移植、 尾静脈移植などの方法で行うことができる。 また、 癌 転移は、 例えば、 肝臓における転移巣の形成により検出することが可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 各種腫瘍細胞における CMAPの発現をノーザンプロテイングにより検出 した電気泳動写真である。
図 2は、 正常組織における CMAPの発現をノーザンブロティングにより検出した 電気泳動写真である。
図 3は、 CMAPとヒトフアミリ一2シス夕チンのアミノ酸配列の比較を示す図であ o
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 [実施例 1 ] 癌転移関連遺伝子のクローニング
( 1 ) IMC-HM及び IMC-LM細胞かちの総 RNAの抽出
IMC-HM及び IMC-LM細胞からの総 RNAの抽出は I SOGEN (二ツボンジーン社）を用いて 行った。すなわち対数増殖期の培養細胞を 1x10'個回収し、遠心操作にて沈殿させた。 培養液の上清を吸引除去後 lmlの ISOGENを加えて 5分間室温放置し細胞を溶解させ た。 0.2mlのクロ口ホルムを加え 15秒間激しく撹拌し、さらに数分室温放置後 12,00 0gで 15分間冷却（4°C)遠心分離した。 RNAを含む水層を分取し等量のィソプロパノー ルを添加して、 撹拌後、 室温で 10分間放置した後、再度 12, 000gで 15分間冷却遠心 分離した。 MAの沈殿を分取しさらにエタノールでリンスした後、 DEPC(Diethyl P yrocarbonate)処理した滅菌精製水 50〃1に溶解して総 A液とした。なお、 総 RNAを 調製した時の細胞 5x10'個を 5週齢の雌 CDF1マウスの腹側皮下に移植したところ、 I MC-H細胞のホスト内での動態は肉眼所見レベルでマウス肝臓内へ転移し、 2週間 でマウスを死亡させたが、 IMC- LM細胞では肝臓への転移は認められず、 マウスも 6週間生存した。
( 2 ) 逆転写酵素による一本鎖 cDNAの調製
MMLV由来の逆転写酵素 SuperscriptII(GIBCO BRL社）と mRNA Fingerprinting Ki t(clontech社）を用いて、得られた総 RNAを錡型として相補的な一本鎖 DNAを調製し た。 2 gの総 RNAに 1 1の cDNA合成ブライマ一（オリゴ dTプライマ一）を加え、 DEPC 処理した滅菌精製水によって全量を 5 1とし、 70°Cで 3分間保持した後急冷した。さ らに 2 zlの反応用緩衝液（5x第一鎖バヅファー）、 2 1の dNTPミヅクス（各 5mM)、 lj 1の SuperscriptII(200unit/ l)の合計 5 /1を混和した液を添加して、 42°Cで 1時 間、 エア一ィンキュベータ一中に放置した。反応終了後 72°Cで 10分間処理し、反応 液を滅菌精製水で 160倍希釈し- 20°Cで保存した。以降この一本鎖 cDNA液を用いてポ リメラ一ゼ連鎖反応 (PCR)を基本とする RNAフィンガープリンティングを行った。
( 3 ) PCRによる一本鎖 cDNAの増幅
5U/ /1の LA Taq DNAポリメラ一ゼ（宝酒造社）と TaqStart Antibody (登録商標、 C LONTECH社）原液を等量混和し室温に数分放置して 50x ポリメラ一ゼミックス （po lymerase mix) とした。 の 50x ポリメラ一ゼミヅクスに の lOxLA PCRバ ッファー （宝酒造社） 、13. 9 1の滅菌精製水、 0.2 1の dNTPミックス （CL0NTECH 社） （各 5mM)、0.5 lの [35S]dATPひ S(Amersham社）を混和して PCRマス夕一ミックス (master mix) とした。一本鎖 cDNA保存液 に 20χζΜの Pブライマ一（Pl-10/配列 番号： 10〜19)及び 20〃Mの Tプライマ一（T1-9/配列番号： 20〜28) (CL0NTECH社）各 1 1ずつを混合し、上記の PCRマスターミックスを 17 1添加してミネラルオイル ( Sigma社）を重層し、 94。Cで 5分間、 40°Cで 5分間、 68°Cで 5分間を 1サイクル、続いて 9 4°Cで 2分間、 40°Cで 5分間、 68°Cで 5分間を 2サイクル、さらに 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分 間、 68°Cで 2分間を 25サイクル、最後に 68°Cを 7分間の PCRを DNAサ一マルサイクラ一 PJ2000(PERKIN ELMER CETUS社）にて行い複数の遺伝子を一度に増幅した。
( 4 ) 電気泳動による PCR産物の分離
シークェンスゲル用のプレート（20x40cm)をスベ一サ一を用いて常法に従って組 み上げた。ゲル及びバッファ一は United States Biochemical社のグリセ口一ル耐 性 6¾ゲル、グリセロール耐性バッファーを用いた。 Pブラィマーと Tブラィマーによ り増幅された PCR産物 を各々 2 1の反応停止液と混合し、 94°Cで 2-3分間加熱 した後、 冷却処理した。これをグリセ口一ル耐性ゲルに 3 1ずつ添加し、 35Wで約 3 時間電気泳動した。泳動後、ゲルを濾紙上に移し取り、ゲルドライヤーにて 80°Cで 2 時間乾燥させた。ゲル中の放射活性は BAS2000用のイメージングプレート（富士写真 フィルム社）上にー晚放置して写し取り、 BAS2000にて画像化した。
この画像解析を通して IMC-HM細胞と IMC-LM細胞との間で発現量の著しく異なる 遺伝子を検索した。もしその発現量が IMC-HM細胞に偏っていれば転移を誘発する因 子の候補になるうる。逆に IMC-LM細胞に発現が偏っていれば転移を抑制する因子の 候補になるうると考えられる。その結果、 転移を誘発する因子の候補となる 2つの バンドを IMC- HM細胞から見だした。一つは P2と T3のプライマ一セットから、もう一 つは P2と T8のプライマ一セットから認められた。前者を 「23 - 1」 、後者を 「28 - 1」 と名付けた。
( 5 ) IMC-HM細胞特異的 cDNAバンドのクローニング
IMC-HM細胞特異的 cDNAバンド 23- 1と 28-1を乾燥後のゲルから直接切り出し、 40 1の滅菌精製水中でゲルごと 10分間煮沸し目的の cDNA断片を溶出させた。この微量 の cDNA断片を以下の様にして再増幅した。
5 1の 10x EX Taqバッファー （宝酒造社） と の dNTPミックス（各 2.5mM)、0. 5^ 1の EX Taq DNAポリメラーゼ （宝酒造社） （511/〃1 )、滅菌精製水31.5 1を混合 し PCR マス夕一ミックスとした。これに溶出した cDNAフラグメントを 7 1、そのバ ンドを検出した際に用いた Pプライマー、 Tプライマーそれそれ 2.5 1ずつ添加し、 ミネラルオイルを重層し、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 68°Cで 2分間を 20サイクルの PCRを DNAサ一マルサイクラ一 PJ2000(PERKIN ELMER CETUS社）にて行い目的の cDN Aフラグメントのみを特異的に増幅した。 PCR産物は 1%ァガロースゲルにてミュ一ビ ッド （コスモバイオ社） で 50V、1時間電気泳動しェチジゥムブ口マイ ド染色により 確認した。
一般に cDNAの PCR産物はその 3' -末端に Aの付加を受けており、 TAタイプベクター (末端に Tをもつ）によって直接クローニングされうる。そこで再増幅した cDNAフラ グメントを TAクローニングキヅ ト（Invitrogen社）を用いて以下の方法でクロー二 ングした。すなわち、再増幅した PCRフラグメント に 10x ライゲ一シヨンバッフ ァー （インビトロゲン社） を l〃l、pCR I Iベクター（登録商標、 Invitrogen社）（25η g/ml )を 、滅菌精製水を 9 / l、T4 DNAリガ一ゼ （インビトロゲン社） を 1 1ずつ 混和し、 14°Cで一晩放置して cDNAを挿入した。チューブ一本の OneShot INVひ F'コン ビテントセル（登録商標、 Inv i trogen社）に 0.5Mの^-メルカプトエタノールを 50 z 1添加して混合した。これに先の cDNAを結合反応後のベクターを 加え 42°Cで 30 秒間ィンキュベ一卜した。氷上で 2分間放置した後、 450 1の S0C培地を添加し 37°C で 1時間振とう培養した。 あらかじめ調製しておいた 50〃g/mlカナマイシン及び X -Gal含有 LBァガ一プレート上に先の形質転換操作後の液 100^ 1及び 200 / 1をひろ げ、 37°Cで一晩放置した。 インサートの無いベクターは X-Galと反応し青色を呈す るが、 cDNAが組込まれたベクタ一は白色を呈する。 この原理に従って白色のコロ ニーを 10個拾い、 配列決定用に再培養すると同時にレプリカを作製した。 各形質 転換株からは QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN社) を用いて以下の手順でブラ スミ ドを調製した。
各形質転換株を 3mlの 50〃g/mlカナマイシン含有 LB培地中で 37°C、約 8時間培養し 遠心操作により回収した。細胞を 250〃1のバッファ一 PI (QIAGEN社） で溶解し、 25 0 1のバッファー P2 (QIAGEN社） を加えて混和した。さらに 350> 1のバッファー P 3 (QIAGEN社） を加えて混和し 10，000xg、 10分間遠心分離した。上清を QIAprepスビ ンカラム （QIAGEN社） に移し、 1分間 10，000xgで遠心した。カラムをバッファー PB ( Q I AGEN社） で洗浄してヌクレア一ゼ活性を落とした後、 0.75mlのバッファ一 PE (QIAGEN社） で洗浄し TEバッファ一でカラム中のブラスミ ドを溶出、回収した。ブ ラスミ ドの濃度は日立分光光度計 (U— 3300)で A260値により算出した。
( 6 ) ケローン化された IMC-HM細胞特異的 cDNAフラグメン卜の配列決定 cDNAの塩基配列はダイ夕一ミネ一夕一法によって決定した（使用機器; ABI Model 377)。錡型となるプラスミ ドの精製状態、濃度等により条件は異なるが、一般にダ ィ夕一ミネ一夕一法で 500-600塩基の配列が一度で決定されうる。 pCR I Iベクタ一 は M13のフォワード及びリバースプライマ一サイ 卜が挿入部位近傍に存在する。 蛍 光標識したそれそれのプライマ一を用いて、二本鎖両方を読み合わせて配列を決定 した。 25 1の Ampl iTaq、 25 1の 5xバッファ一、 125 1の精製水を混和して酵素を 希釈し、 A、 G、Tそれそれにつきプレミックスを作製した。 A、Cは d/ddNTP、ダイブラ イマ一、 5xバッファー、希釈済み酵素をそれそれ 等量混和、 G、Tは 50 1をそれ それ混和した。 100-200ng/// lの錶型 DNA1 1と A、Cのプレミックスをそれそれ 4 1、 錶型 DNA2 / 1と G、Tのプレミックスをそれそれ 8 1それそれ別々に混ぜ反応させた。 サイクルシークェンシング反応は 96°Cで 2分間、さらに 96°Cで 10秒間、 50°Cで 5秒間、 60°Cで 4分間を 25サイクル、 Perkin Elmer9600により行った。 クローンニングした 10個ずつのプラスミ ドのうち、 無作為に 4クローンを選択し配列を決定したところ いずれも塩基配列が同一であった。 そこで 23-1から得られたクローンの 1つを 23 - 1#2とし、 28-1から得られたクローンを 28- 1#3とした。
次に 23-1#2(配列番号： 1 )と 28-1#3(配列番号： 2 )の決定した配列をコンビユーター により解析した。解析は Genetics Computer Group社のソフト Wisconsin Package Version8. 1を使用した。データべ一スは GenBankと EMBLについて FastAでホモロジ一 検索した。その結果今までに報告の無い新規の配列であることが明らかとなった。
[実施例 2 ] IMC-HM細胞及び IMC-LM細胞の性質を反映するクローナルラインの 樹立
IMC_HM細胞及び IMC-LM細胞のクロ一ナルラインの樹立を限界希釈法で行った。そ れそれの細胞を 4個/ lOwellとなるように 96穴プレートに捲き込み、単一細胞から増 殖したクローンを無作為に 10個ずつ得た。
これらの各クローンの 23- 1#2及び 28- 1#3の発現を簡便に検出するために次のよう に RT-PCRを行った。総 RNAの調製と逆転写酵素反応は前述の方法 （実施例 1の（ 1 )、 ( 2 ) ) と同様に行った。 PCRによる特異的な cDNAの増幅を行うために一本鎖オリゴ DNAプライマ一、 「23-1#2Π」 （CAGMTCTGCTCATGCAGTC (配列番号： 29 ) ) 、 「23- 1# 2Rlj (CACTCCTTACTTTCCACCCC (配列番号： 30 ) ) 、 「28-l#3Fl」 (AACAGCATTTCCCTA MGCTCGG (配列番号：31 ) ) 、 「28- 1#3M」 （TGGAAACTACTTCCCTGCTCCCA (配列番号： 3 2 ) ) をデザインした。
23-腹 1と 23- 1#2R1、 28- 1#3Πと 28-職 1によりそれそれ 23- 1#2、 28 - 1#3の配列 の一部を特異的に増幅しうる。 IMC-HMと IMC-LM由来細胞より調製した一本鎖 cDNAを 錡型に EX Taq DNAポリメラ一ゼにより実施例 1 ( 5 )と同様の条件で 30サイクル PCR した。その結果 23-1#2、 28-1#3ともに IMC-HM由来のクロ一ン細胞では全て同程度の 適性サイズ cDNAの増幅が認められ、 IMC- LM由来のクローン細胞では全くシグナルが 検出されなかった。
次に各クローン細胞のインビボでの転移能を確認するため 5xl0 固の細胞を CDF 1マウスに皮下移植した。その結果 IMC- HM由来クローン細胞はいずれも移植後 2-3週 間でホストを死亡させ、肉眼所見では著しい癌転移を肝臓と脾臓に認めたが、 IMC- LM由来細胞ではまったく癌転移巣は認められなかった。その他形態、インビトロで の増殖能などの観察を通しても IMC-LM由来細胞と IMC-HM由来細胞間にははつきり した差異は認められなかった。 IMC-HM由来クローン細胞株、および IMC- LM由来クロ ーン細胞株をそれそれ一株づっ選択し、 「IMC-HA1」 および 「IMC-LE5」 と命名し た。 なお、 IMC-HA1細胞は、 下記寄託機関に寄託した。
(ィ） 寄託機関の名称 ·あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 )
(口） 寄託日 （原寄託日） 平成 9年 4月 1曰
(ハ） 受託番号 生命研条寄第 6242号 （FERM BP-6242)
[実施例 3 ] ノーザンプロットによる IMC-HA1細胞及び IMC-LE5細胞におけるク ローン 23-1#2と 28-1#3の解析
クローン 23- 1#2と 28-1#3が polyA R のレベルで発現が異なるものかどうかを調 ベるためにノ一ザン解析を行った。 IMC- HA1及び IMC- LE5細胞からの polyA RNAの調 製は Messenger RNA Isolation Kit( STRATAGENE社）を用いて以下のように行った。 約 10'個の細胞を 100mlの培養懸濁液から回収し、 の/? -メルカプトェタノ一 ルを添加した 5mlの変性溶液 （denaturing solution) (STRATAGENE社）で溶解させ た。 10m 1の溶出 (elution) バッファー ( STRATAGENE社 )を加え、 12 , 0 OOxgで 10分間遠 心分離した。上清を 5mlのオリゴ dTセルロース（0.04g/ml )と混和し、室温で 15分間緩 やかに撹拌した。 700xgで 3分間遠心後上清を除去し、 5mlの高塩 （high- salt) バッ ファー（ STRATAGENE社）で再度懸濁した。この洗浄操作を 2回繰り返した後 5mlの低塩 ( low-salt) バッファ一（ STRATAGENE社）に懸濁した。 2.5mlのプッシュカラム（ STR ATAGENE社）にセルロースの懸濁液を充填した後、 68°Cの溶出バッファ一 400〃 1で残 つた polyA RNAを溶出した。 40 1の酢酸ナトリウム（3M)、 1.1mlの 10( ^エタノールを 加え混合後、 15，000rpmで遠心した。沈殿を 80%のエタノールでリンスし RNase不含 の TEバヅファー 40 1に溶解し polyA MA液とした。 A260の吸光度測定により濃度を 決定した。
次にノーザンブロッテイングのために Megaprime DNA label ling syste (Amers ham社）を用いて [ひ - "P]dCTPにより常法に従って 23- 1#2と 28- 1#3を直接放射標識し た。 lOOngの cDNAに 5 lのブライマーを加え全量を 33 1にし、 95°Cで 5分間加熱後室 温に放置した。これに 10 1のラベリングバッファ一（Amersham社）と 5/ lの [ひ-" P ] dCTP、 2 1のクレノウ DNAポリメラ一ゼ I ( lun i t/〃 1 ) ( Amersham社）を添加して 37 °Cで 10分間ィンキュベートした。 0.5Mの EDTA液を 3.5〃1添加して反応を終了した後、 セフアデヅクス G-50のスピンカラムによって標識済プローブと取り込まれなかつ た [ひ-" P ] dCTPとを分離した。カラムの溶出液を精製水で希釈し液体シンチレーショ ンカウンターでプローブの放射活性を測定した。
次いで、 ノーザンプロット解析を行った。 の polyA RNAを 1¾ァガロース、 lx MOPSバッファ一にて作製したゲルに添加し 50Vで 1.5時間電気泳動した。泳動後、 ゲ ルから Hybond N+ ( Amersham社 )に lOxSSCノ ッファーを介して核酸をー晚放置して転 写した。転写後メンブレンを風乾し、膜上の核酸を STRATALINKERにて UV固定した。 U V処理後、以下の様にハイプリダイゼ一ションした。
メンブレンをプレハイブリダィゼ一シヨン溶液 「5xデンハルト液、 50%ホルムァ ミ ド、2 SDS、変性サケ精子 DNA( 100 ig/ml )」 中に浸し、 42°Cで 1時間プレハイブリダ ィゼ一シヨンした。 [ひ- "P]dCTPで放射標識した 23-1#2及び 28-1#3をプローブとし て上記プレハイブリダィゼ一シヨン溶液に添加して 42°Cで一晩放置した。ハイプリ ダイゼーション後のメンプレンは 2xSSC、 0.1%SDS溶液で 50°C、 30分間の洗浄を 1回、 0.5xSSC、 0. 1¾SDS溶液で 50°C、 30分間の洗浄を 2回おこなった。放射活性の画像化は 既述の方法に従った。その結果 23- 1#2及び 28-1#3は共に IMC-HA1細胞からのバンド にのみハイプリダイズした約 l . lkb及び 0.7kbのバンドをそれそれ認めた。
[実施例 4 ] サザンプロットによる IMC-HA1細胞及び IMC-LE5細胞におけるクロ ーン 23-l#2と 28-l#3の解析
DNA Extraction Kit( STRATAGENE社）に従って IMC- HA1と IMC-LE5細胞から DNAを調 製し、 EcoRIで切断して 1¾ァガロース、 TAEバッファーで調製したゲルに 10 gずつ添 加、 50Vで電気泳動による分離を行って Hybond N+に転写しサザン解析したところ、 両者は全く同一のパンドパターンを認めた。 したがって 23- 1#2及び 28-1#3は共に IMC-HAIと IMC- LE5両方の細胞の遺伝子中には存在するが、 その発現は IMC-HAI細胞 に偏っていることが示唆された。
[実施例 5 ]クロ一ン 23- 1#2と 28-1#3の全長遺伝子のクロ一ニング
( 1 ) IMC-HA1細胞由来 cDNAラィブラリ一の調製
ZAP Express cDNA Synthesis Kit( STRATAGENE社）により IMC-HAI細胞由来 cDNAラ ィブラリーを以下の（a)〜（e)の方法で調製した。
(a)総 RNA、polyA RNA調製
実施例 1( 1 )に記載の方法で IMC- HA1細胞から総 RNAを抽出した。ただしここでは I S0GEN抽出を 2回行ってタンパク質、脂質、 DNA断片等の混入確率を軽減させた。この 総 RNAから以下の様にして polyA RNAを抽出した。 Whatmann 3Mを 2.5mlシリンジ底部 に置き、 5mlのオリゴ dTセルロース（ 0.04g/ml ) ( STRATAGENE社）を充填しスピンカラ ムを調製した。カラムにサンプルを添加し室温で 30分間放置後、高塩バッファ一及 び低塩ノ ソファ一（ c lontech社）でそれそれ 3回ずつ洗浄した。溶出バッファ一（ c 1 o ntech社 ) で溶出後、 1/5体積のサンプルバッファ一を添加してもう一度新しいカラ ムに充填し同一操作を繰り返した。ェタノール沈殿、リンス後 TEノ ッファーに溶解 して polyA RNA液とした。
(b)第一鎖 cDNA合成
5 /gの polyA RNA、170pmoleの Xholリンカ一プライマ一を混和して 70°Cで 5分間処 理し氷冷した。これに 10〃1の 5x 第一鎖バッファ一 と 5 1のジチオスレィ トール (dithiothreitol) ( 0.1M) (GIBCO BRL社）、 1の dNTP mix (各 10mM)と 1 1の RNas ein(40U/ z l ) ( STRATAGENE社）を混和し、さらに 12，000Uの逆転写酵素 Superscript K GIBCO BRL社）を添加して全量 50 / 1とし、 44°Cで 1時間ィンキュベ一トした。
( c )第二鎖 cDNA合成
合成した第一鎖 cDNAの 45 / 1に 20 1の 10x 第二鎖バッファ一、 6 1の第二鎖 dNTP ミックス（STRATAGENE社）、 113. 9 1の滅菌精製水、 2 1の [ひ-32 P]dATP(Amersham 社）を混和し、さらに 3Uの E. col i Rnase Hと 100Uの E. col i MAポリメラ一ゼ（STRAT 八6£ 社）添加して16 で2.5時間ィンキュベ一卜して第二鎖を合成した。
( d) ZAP Express Vectorへの cDMの揷入
Xholリンカ一プライマーの逆端を 5Uの Pfu DNAポリメラ一ゼ （ STRATAGENE社） に よりブランティングした後、 4Uの T4 DNAリガーゼにより EcoRIアダプタ一を 8°C、一 晚放置して連結し、さらに EcoRI端を 10Uの T4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン 酸化処理した。 Xholリンカ一端は 120Uの Xhol処理で切断した。 EcoRIと Xholのサイ ト で cDNAを ZAP Express Vectorに T4 MAリガ一ゼを用いて 12°Cでー晚反応させ挿入 した。
( e )ィンビト口パッケージングと力価の検討
ファージへのパッケージングは Gigapack Gold I I ( STRATAGENE社）を用い、工程は 完全に推奨プロトコルに従った。パッケージ後のファージ液は以下のようにして力 価を調べた。ファージ液原液と SMバッファ一を用いて 10倍希釈したものをそれそれ 調製し、各々 と 200 1の XU-Blue MRF' ( 0D =0.5 )と 37°C15分間ィンキュベート して感染させた。これを LBトップアガー 3ml、0.5Mの IPTG、12.5mgの X-Galと共に 100 腿の NZYァガ一 （GIBC0社） プレートに重層し一晩放置した。その結果、 95%以上が インサートを保持し、形成されたプラ一ク数から 50， 000個のブラークを得るのに必 要なファージ液量も決定された。
( f ) cMAライブラリーの増幅
事前に調製しておいた 150誦の NZYァガ一プレート 20枚に、 50，000プラーク/プレー トとなるようにファージ処理したホストバクテリアをトップアガーとともに重層 し一晩 37°Cで放置してプラークを形成させた。 8mlの SMバッファーを添加してさら に 4°Cで一晩放置した。ファージが充分に遊離した SMバッファ一を回収し、さらに 2 mlの SMバッファーでリンスして回収した。これを cDNAライブラリーの保存液として 分注し- 70°Cで凍結保存した。以降 cDNAラィブラリ一のスクリ一ニングにはこの保 存液を用いた。
( 2 ) IMC- HA1細胞由来 cDNAラィブラリ一のスクリ一ニング
(a) 一次スクリーニング
滅菌角 2号シャーレに NZYァガ一プレートを 20枚調製した。 50, 000プラーク/プレ ―トとなる様に 0D F0. 5に合わせた X -BlueMRF'に cDNAライブラリーのファージを 感染させ、 LBトップアガーとともに NZYァガープレートに重層し、 37°Cで一晩放置し た。翌日プラークの適性な形成を確認した後、 4ΐで 2時間冷却し、 Hybond N+メンブレ ンにプラーク中の DNAを転写した。メンブレンは変成、乾燥、 UV-クロスリンクの工程 をへた後、以下の手順でハイプリダイゼ一シヨンした。
メンプレンを 2xPIPESバヅファー、 50%ホルムアミ ド、 0. 5%SDS、変性サケ精子 DNA ( 100 g/ml )溶液中に浸し、 42°Cで 1時間プレハイブリダィゼ一シヨンした。 [ひ-" P]dCTPで放射標識した 23-1#2及び 28- 1#3を既述の方法に従って調製し、これをプロ —ブとして上記プレハイブリダィゼ一シヨン溶液に添加して 42°Cで一晩放置した。 ハイブリダイゼ一ション後のメンブレンは 0. 1xSSC、 0. 1%SDS溶液で 65°C、20分間の 洗浄を 3-4回おこなった。放射活性の画像化は既述の方法に従った。 BAS2000で画像 を等倍に印刷し、プレート上で相当するボイントを先端を切除した P1000用の滅菌 チップで打ち抜き、 SMバッファ一中にファージを溶出させた。
(b) 二次スクリ一ニング
一次スクリーニングで陽性と判断されたファージ液をさらに同様の工程でスク リーニングした。ただし、 ファージ液は 10倍の希釈系列を作製し、滅菌角 2号シャ一 レのかわりに 100腿ブラスチックディッシュを用いて重層した。二次スクリ一ニン グで陽性と判断されたポイントのファージを SMバッファ一中に溶出し、 T7と T3のプ ライマ一を用いてィンサートを増幅した。この段階で複数のィンサー卜が認められ た場合はさらに同様の工程でスクリーニングを続行した。
この cDNAライブラリ一スクリーニングを通して、 23-1#2に特異的に結合するファ ージクローン #9. 3133を、28-1#3に特異的に結合するファ一ジクロ一ン#7. 1641、#8. 32、 #11.2441を得た。
( c ) pBK-CMVファージミ ドベクターへのクロ一ニング
ZAP Expressはヘルパーファージ（ExAssist helper phage)の存在下でインビボで 直接ィンサ一トを含んだまま pBK-CMVファ一ジミ ドベクタ一として切り出しが可能 である。前述のクローン化したファージょり pBK- CMVファージミ ドベクタ一として 切り出し、 XL0LR中に入れてカナマイシン含有の LBプレート上でコロニーを形成さ せクローニングした。その結果、 ファージミ ドぺク夕一クローン #9. 31334、#7. 164 11、#8.323、#11.24413を得た。
(d) クローン #9. 31334、 #7. 16411、#8.323、#11.24413の塩基配列の決定
これら cDNAを含んだ pBK-CMVファージミ ドベクターを用いたダイプライマー （D ye Primer) 法により塩基配列の部分的な決定を行った。 具体的には、 実施例 1 ( 6 )と同様に配列を決定した。ただし、 サイクルシークェンシング反応は T3プライ マ一 （AATTAACCCTCACTAAAGGG/配列番号： 33 )、T7プライマー （GTMTACGACTCACTAT AGGGC/配列番号： 34)を用いて行った。さらに、 ダイプライマ一法により配列が部 分的に確定した pBK- CMVファージミ ドぺク夕一のィンサート中に RT- PCRで使用した プライマ一及び適当な配列のプライマ一をデザィンし、 ダイ夕一ミネ一夕一法で さらに未確定領域の配列を決定した。 PRI SM Ready Reaction Terminator Cycle S equencing Kitを用いた。二本鎖 DNA250-500ngに 3.2pmolのブライマ一、 8〃1の上言己 プレミックスを混和して全量を 20〃1とし、 96°Cで 2分間を 1サイクル、 96°Cで 10秒間、 50°Cで 5秒間、 60°Cで 4分間を 25サイクルの条件でサイクルシークェンスした。電気 泳動と解析の条件はダイプライマ一法と同様に行った。
その結果、 23-1#2にっぃては全長983ゎ のクローン#9. 31334を得た（配列番号： 3 )。この配列は 167アミノ酸をコードする翻訳領域が含まれた新規遺伝子であった。 アミノ酸配列はカテブシン類の阻害タンパク質である牛シス夕チン Bと部分的に約
38%の相同性を認めた。 他方 28-1#3に関しては 3種類の cDNA(#7.16411, #8.323, # 11.24413 )がクローニングされた。これらの塩基配列を決定し比較検討したところ #8.323のプロセシングの違いによって #7.16411と #11.24413が産生される可能性が 強く示唆された。塩基長は #8.323で l，114bp、 #7.16411と #11.24413がそれそれ 691b Pと 684bpであった。 #7. 16411と #11.24413はいずれも 5'末端側 lOObp前後が異なる以 外は同一の塩基配列を示し、 N—末端 20-30ァミノ酸が異なる 131及び 126ァミノ酸 のタンパク質をコードすると考えられた。 予想アミノ酸は #7.16411では疎水性の N -末端を持つと考えられるが、 #11.24413では逆に親水性を示すと計算された。 2 8-1#3を用いて得られた 3種類の配列も #9.31334と同様に検索結果は新規の遺伝子 であり、 #7.16411がコードすると考えられるタンパク質は、 ヒトの SLPI (secret ary leukoprotease inhibitor) に部分的に 60%近い相同性を示した。 これらのク ローンの塩基配列は、 配列番号： 5 (クローン #7.16411の塩基配列） 、 配列番号： 7 (クローン #8.323の塩基配列） 及び配列番号： 8 (クローン #11.24413の塩基配列） にそれそれ示した。
[実施例 6 ] 種々の癌細胞や正常組織における #7.16411及び #11.24413の発現 #7.16411及び #11.24413を特異的に増幅するプライマ一をデザインし RT-PCR法に よって種々の癌細胞や正常組織における発現を調べた。 PCRは各 cDNAが IMC- HA1にお いて定量性をもって検出されうると考えられる条件 （後述の実施例 7の条件） で検 討した。なお、 #7.16411の増幅には、 「7F2」 （配列番号： 35) および 「28- 1#3F1」 (配列番号： 31 ) を、 #11.24413の増幅には、 「11F2」 (配列番号: 49) および 「2 8-l#3Flj (配列番号： 31 ) をプライマ一として用いた。 その結果、 #7.16411につ いては発色の濃淡に差異こそあつたが調べたほとんどすべての癌細胞と正常組織 で増幅され得た。 しかし、 #11.24413に関しては癌細胞では？388と1 (：-1½1細胞、 正常組織では胸腺、 肺、 脾臓そしてわずかに末梢血において検出されたのみであ つた。 このことから大半の正常組織では #7. 16411へのプロセシングが普通であり、 #11.24413は特殊な細胞でのみ発現している可能性が高い。 #11.24413は^0 1細 胞の全身への急速な広がりなどの特殊性を与えている重要な因子と考えられた。
[実施例 7 ] 種々の腫瘍細胞株および正常組織中でのマウス CMAPの発現
#9.31334の翻訳領域に認められた予想アミノ酸配列をマウス CMAPと名付けた。以 降、 #9.31334をマウス CMAPと称する。
RT-PCR (Riverse Transcription PCR) により 12種類のマウス腫瘍細胞株中での マウス CMAPの発現を調べた（図 1 )。各細胞株より総 RNAを実施例 1 ( 1 )と同様の方法 で抽出し、実施例 1 (2 )と同様に相補的一本鎖 cDNAを調製した。実施例 1( 5 )と同様に PCRによりマウス CMAPを検出した。反応は 94°Cで 2分間を 1行程、 94°Cで 1分間、 68°C で 2分間を 30行程、 68 Cで 5分間を 1行程で、プライマーは 「23-l#2Fl」 （配列番号 : 29) 、 「23-l#2Rl」 （配列番号： 30) を用いた。銪型となる一本鎖 cDNAの希釈率は、 事前の検討により CMAPを増幅する際 10倍希釈、対照の G3PDHを検出する際 40倍希釈 することで IMC- HA1細胞に関しては希釈率と産物量がはぼ直線関係となる準定量条 件となることを確認した。
その結果、マウス CMAPは IMC-HA1細胞以外では、 M- 5076細胞、 L5178Y細胞、 P388細胞、 L 1210細胞で明らかに発現していることが判明した。これらの細胞株はいずれも 1 X 105個をマウスの尾静脈より移植した際に肝臓に主に転移巣を形成することを解剖 肉眼所見と病理学的解析により確認した。 マウス CMAPの発現がほとんど確認でき なかった B-16-BL6細胞と Colon26細胞は実験的に肺転移巣を強く誘導するが、 肝転 移は認められなかった。 また、 マウス CMAPの発現が検出限界下であったその他の 細胞株はいずれもマウスへの尾静脈移植によってほとんど排除され退縮した。 こ れらの結果はマウス CMAPの発現は癌細胞の肝転移と密接に関連している可能性を 示唆した。
また、 正常な 5週齢雌 CDF1マウス 2〜3匹から 15の組織を外科的に切除し、ポリ ト ロンを用いて組織を破碎した後、前述と同様に RT-PCR法でマウス CMAPの発現を確認 した （図 2 ) 。その結果、 IMC-HA1細胞よりは明らかに弱いが、胸腺、脾臓、腸管膜リ ンパ節でマウス CMAPの発現が認められた。これらの結果はマウス CMAPが正常組織中 でも生理的役割を担っており、それは免疫機構と深く関連している可能性を示唆し た。
[実施例 8 ] マウス CMAPのヒトホモローグの同定
( 1 ) データベースの検索
マウス CMAPの塩基配列に相同性を示すヒト塩基配列を Genbankと EMBLデー夕ベー ス中から FastAにて検索した。ソフトウヱァは Genetics Computer Group社製 VMS(V ersion 8)を用いた。その結果 2つの EST (Expressed Sequence Tag) 、N47763と N56 875、がそれそれマウス CMAPと 75.7% 72.0 の相同性を示すことが判明した。これら 二つの ESTは 34塩基の相同配列を保持しており、同一起源のヒト CMAPに由来する可 能性が強く示唆された。
( 2 ) RT-PCR法によるヒト CMAPの増幅
マウスの正常組織中で脾臓にマウス CMAPが発現していたことから、ヒト脾臓を錶 型 DNAの供給源に選んだ。ヒ卜の脾臓より抽出した 2 gの総 RNA(OriGene社）を実施 例 1 ( 2 )と同様の方法で一本鎖 cDNAを調製した。 N47763と N56875の配列を基に 8個の プライマ一（配列番号 H- CMAP- 1〜8)をデザインした。錶型一本鎖 cDNAを H- CMAP- 1と 2のプライマーを用いて実施例 1( 5)と同様に PCRを行った。反応条件は、 94°Cで 2分間 を 1行程、 94°Cで 30秒間、 60°Cで 30秒間、 72°Cで 90秒間を 30行程、 72°Cで 5分間を 1行程、 以上 3行程を連続して行った。サ一マルサイクラ一は PEMIN ELMER 9600を用いた。
( 3 ) 配列の決定
増幅されたヒト CMAPに由来する約 0.8kbの cDNA産物の塩基配列を、プライマー H - CMAP-1-8 (配列番号： 39〜46) を用いて実施例 1(6)と同様の方法で直接決定した (配列番号： 37)。ヒト CMAPはマウス CMAPと 65.9%の相同性を認めた。またヒト CMAPは 塩基配列中 83番目から 583番目に存在し、そのアミノ酸配列 （配列番号： 38) はマウ ス CMAPと 71.6%の相同性を示した。従ってこれら 2つのタンパク質はほぼ同様の機能 を有する可能性が強く示唆された。 ( 4 ) ヒト CMAPとフアミリ一2シス夕チンとのアミノ酸配列比較
LaserGene(DNASTAR¾ )中の多重配列比較プログラム MegAlignによってマウスお よびヒトの CMAPとヒトフアミリ一2シス夕チンとのアミノ酸配列を比較検討した (図 3 ) 。その結果、フアミリ一2シス夕チンのコンセンサス配列（121番、 132番、 14 6番、 166番目のシスティン残基、 59番目のグリシン残基、 103〜107番目の配列¾0 0}、 153~155番目の配列 VFW)は CMAP中で最低限保存されていることが判明した。しかし 全体の相同性としてはいずれも 30¾以下であった。特に N末端側の配列は特徴的で長 く、 CMAPに特殊性を与えている可能性が示唆されるシスティン残基が複数認められ た。 84番目の Nは理論的に糖が付加する可能性が高 他の近傍の配列には見られな い性質と考えられた。 CMAPはこれまでに報告されているシス夕チン類に相似する配 列を保持しながらも、特徴的なァミノ酸残基が多数認められ、既知の物とは異なる 性質を保持する可能性が示唆された。
[実施例 9 ] マウス CMAPの恒常的低下による IMC-HA1細胞のマゥスでの転移能の 低下
転移の成立には複数の重複した遺伝子の質あるいは発現の量の変化が必要であ ると一般的に考えられている。従って一つの転移関連遺伝子を低転移性の細胞に誘 導してもマウスで転移能の上昇を確認することは困難と考えられた。そこでマウス CMAPmMAを相補的に相殺する配列を組み込んだベクタ一を IMC-HA1細胞内に導入し、 安定に形質転換したクローン細胞を構築して実際のマウスでの転移能の変化を調 ベた。
( 1 ) pBK- AS-C APベクタ一の構築
pBK- CMV発現べクタ一を Nhe Iと Kpn I制限酵素で処理し、 lac Zプロモーターとマル チクロ一ニングサイ 卜を除去した直鎖状べクタ一を調製した。ィンサ一トは IMC-H A1細胞の総 RNAを材料として RT- PCRによって調製した。プライマ一は CMAP- F1 (配列 番号： 47)と CMAP-R1 (配列番号： 48)を用いた。これらのプライマ一はそれそれの末端 に Nhelと Kpnl制限酵素認識部位が付加されており、その増幅産物はマウス CMAPの 5 '側非翻訳領域と翻訳領域全般に相当する。約 0.5kbの増幅産物を Nhelと Kpnl制限酵 素で処理し、 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社）で精製後、先に調製した直 鎖状ベクターに DNA Ligation Kit (宝酒造社）を用いて接合した。以上の行程によつ て、細胞中でマウス CMAPのアンチセンスとなる mRNAを発現するべクタ一、 pBK-AS-C MAPを構築した。
( 2 ) pBK- AS- CMAPベクターの IMC-HA1細胞への挿入と形質転換細胞の選択 pBK-AS-CMAPをコンビテント細胞中に導入し大量培養後、 QIAfi lter Plasmid Mi di Kit(QIAGEN社）を用いて常法に従って大量調製した。約 50 zgのプラスミ ドは Ap aL Iで 1ケ所切断し直鎖状にした後、フエノール抽出とエタノール沈殿によって純化 し、 の EPバッファー（25mM Hepes pH7.0, 137mM NaCl、5mM KC 0.27mM Na2HP0,、 6mM デキストロース）中に溶解した。対数増殖期にある IMC- HA1細胞を 100mlの培養 液から約 1x10"個回収し、 EPバッファ一で再度懸濁し密度 4x10'個/ mlの細胞浮遊液を 調製した。この細胞懸濁液 450 1に先に調製した 50〃1のプラスミ ド液を混合し、 G enePulserl I (Bio- Rad社）を用いて 250mV、 500 /F、シングルパルスの条件でエレクト ロボレ一シヨン法にてプラスミ ドを細胞中に導入した。室温で 10分間放置後、細胞 を通常の条件下で培養した。 24時間後から遺伝子導入した細胞を 0.3mg/mlのネオマ ィシンで持続的に 2週間処理し続け、安定に形質転換された細胞を選択した。 細胞 は限界希釈法によってクローニングした。 約 50個のクローン細胞を得た後、 RT - P CRによってマウス CMAPの低下している細胞をスクリーニングした。 その結果、 3株 のクローン細胞、 57C4株、 53A9株、 53E9株を得た。 インサートを持たない pBK-CM Vベクタ一についても同様の操作を行い、 ベクタ一コントロールとなるクローン株 18B5を得た。 これら細胞株中でのマウス CMAPmRNAの発現をノーザン法で確認した ところ、 18B5株で IMC- HA1細胞とほぼ同様、 57C4株、 53A9株、 53E9株ではそれそれ 約 49%、 32%、 16%の発現にとどまつていた。 これらの細胞株はいずれも培養時 の増殖、 形態などに特に変化は認められなかつた。
( 3 ) インビボでの転移能の確認 マウス CMAPmRNAの発現が異なる IMC- HA1細胞由来ク口一ン細胞株のマウスでの実 際の転移能を 3つの独立した実験系で試験した。試験 Iではそれそれの細胞を 5x10^0 皮下に移植して 15日目に肝臓を摘出して観察および重量測定すると同時に延命も 追時調査した。試験 I Iでは試験 Iと同様だが移植後 3日目に移植部原発腫瘤を近傍の リンパ節とともに切除した。この実験では肝臓への IMC-HA1細胞の微小転移巣を模 倣することが可能となる。さらに試験 I IIでは直接細胞を尾静脈より lxlO3個移入し て 13日目に肝臓を摘出するとともに並行して延命も追時調査した。その結果、 マウ ス CMAPmRNAの発現と肝臓への転移巣の形成、延命に密接な関連があることが明らか となった（表 1 )。なお、 表中の注釈 「1 )」 は、 「60日間生存したマウスの数/試験 したマウスの数」 を示す。
表 1 試験
細胞系 cmap 肝《重置 (g), 生存日数
mRNA(%) 平均 ± SD P wba T/C% 平均 土 SD P valu* T/C% S T"
IMC-HA1 100 2.070 土 0.409 173 17.4 土 1.5 100 0/5
1ΘΒ5 101 2.240 土 0.351 02500 187 17.6 土 2.1 0JBB2S 101 0/5
57C4 49 1.456 士 0.109 0.0QO! 1 . 122 19.8 土 1.9 Ο0βΕ7 114 0/5
53A9 32 1.262 ± 0.079 < αοοοι 1 , 106 23.4 ± 2.3 osxxx · 134 0/5
53E9 16 1.223 ± 0.130 < αοοοι 1 , 102 25.4 土 3.4 < (0001 · 146 0/5
I C-LE5 <5 1.140 土 0.082 < ΟΧΧΟ 1 ■ 95 > 59.0 土 2.2 < OuOQOI > 339 4/5 正常 1.196 土 0.080 < οαχη ■ . 100 試験 II
細胞系 cmap 肝 重量 (g) 生存日数
mRNA(%) 平均 士 SD P vkm T/C% 平均 土 SD P vmkjtt T/C%
IMC-HA1 100 1.506 ± 0.149 145 18.0 土 0.7 100 0/5
18B5 101 1.624 土 0.479 157 18.0 ± 1.6 100 0/5
57C4 49 1.047 土 0.199 O.0CQO • 101 20.6 ± 1.1 aieoo 114 0/6
53A9 32 0.947 士 0.144 αοοοι • 91 > 30.7 土 15.1 αοοοι · > 171 1/6
53E9 16 1.050 ± 0.145 0.0013 , 101 > 43.0 ± 18.8 < Ο 001 · > 239 3/6
I C-LE5 <5 0.962 ± 0.063 0.CXXS • 93 > 53.5 土 7.8 < 0.0001 % > 297 3/6 正常 1.036 ± 0.139 οοιο • 100 試験 I π
細胞系 cmap 肝職重 S(g) 生存日数
m A(%) 平均 ± SD P value T/C% 平均 土 SD P vmlua T/C% S/T11
IMC-HA1 100 1.767 土 0.460 191 14.0 ± 0.7 100 0/5
18B5 101 1.940 ± 0.161 209 13.6 土 0.5 97 0/5
57C4 49 1.102 ± 0.186 < 0.C0O1 · 119 19.2 ± 1.5 αοοββ · 137 0/5
53A9 32 0.960 土 0.094 < aooot · 104 21.4 土 2.6 O.00CM · 153 0/5
53E9 16 0.940 ± 0.061 < 0.0001 · 101 > 36.0 土 20.7 < 0XD01 257 1/5
I C-LE5 <5 0.949 士 0.103 < 0.0001 102 > 60.0 ± 0.0 ύ.0001 > 429 5/5 正常 0.927 土 0.052 < 0.0001 100
特に、試験 IIでは 53A9株を移植したマウス 6匹中 1匹で、 53E9株では半数の 3匹で肝 転移を誘発することなく 60日以上の延命を認めた。以上の結果から、マウス CMAPの 発現は肝臓への転移巣形成能と深く関連しており、癌細胞が脈間に移入した後に主 に作用することが推察された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 癌転移に関与する新規なタンパク質および該タンパク質をコ一 ドする DNAが提供された。 また、 該 DNAが挿入されたべクタ一、 該ベクタ一を保持 する形質変換体、 該形質転換体を培養する工程を含む組み換えタンパク質の製造 方法が提供された。 また、 該遺伝子の検出、 単離、 増幅または発現の抑制に用い られる DNAが提供された。 さらに、 、 該タンパク質を利用した癌転移阻害剤のスク リ一ニング方法が提供された。 これにより新たな癌転移阻害剤の開発が可能とな つた。
配列表
( 1 ) 出願人の氏名又は名称：萬有製薬株式会社
( 2 ) 発明の名称：癌転移関連遺伝子
( 3 ) 整理番号： B 1— 0 0 1 P C T
( 4 ) 出願番号：
( 5 ) 出願曰：
( 6 ) 優先権のもととなった出願をした国名及び出願の番号：
日本国 平成 9年特許願第 1 0 5 3 3 3号
( 7 ) 優先日： 1 9 9 7年 4月 8日
( 8 ) 配列の数： 4 9 配列番号： 1
配列の長さ： 656
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
ハイポセティカル ： No
アンチセンス ： Yes
起源
生物名： Mus Musculus
セルライン ： IMC -M1細胞 配列
TATTATGTTG AGTGATATTT TTTTTTTTAG GTGATCAGCT TTTTATTTAT GATAAATCAT 60 CCCCATCAAT ATTAGTCTGA TGGTAGCAGA CCAGACGGCT GCAGAATCTG CTCATGCAGT 120 CGGGCATCAA GAAGCTTCCC ACACTACCAC CTTGTTGACT GTATCTGCTT TGCTCTGCAC 180
GTGCTCCAGT AATGTCATCA AAGGACTCTC TGCGTGCCCA CATCCTGAAT CTAGGTGTGT 240
AGCACCAGAG AATTCATTTT AGAAGAAAGT GTGAATACAG TTAATCTGGA GAGGAGGGCA 300
CTATATTCTC CCAGTCCAGC CCCCTGATGA CCCACTGGCA TGTTAATCTG CTCGCTGGTA 360
AGCAGGCCCT GAGGATCTGA GATGGCCAGG ATGGGGTGGA AAGTAAGGAG TGGGGAAAAC 420
ACGAGTGGAT ATGTATCACA GCTGCAGTCT TGCTAAAGAG ACAGAAGTCA CTGGCAGAGG 480
AGAACAGGCA CCTCAAAACT GTGGAGCCAG GGGATGACCC AGACTTCAGA GTAGCAATAT 540
AGAGTCCGCT TCAAGGCAGG GTTGGTTTGG AAGTCACAGT TGTCCAGTTG GTGATGCATG 600
GTCTTCCTGC ATGTAGTTCG GCCGATTTTC ACCTCCAGCA TTTAGTGAGG GTTAAT 656 配列番号： 2
配列の長さ ： 369
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
ハイポセティカル： No
アンチセンス ： Yes
起源
生物名： Mus Musculus
セルライン ： IMC— HA1細胞
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTGC ATAGAGAAAT GAATGCGTTT ATTTATTTGC 60
TCTCCAACAG CATTTCCCTA AAGCTCGGTG AATGCTGAGC CAAAAGGAGA TGTTAGTGGT 120
AAAACAGTAA CCCTGGTCCA CAGGATCCAA GCCTGGGATA CAGGGAGCCG GGAGCCATGG 180 AACCCGGAGC AGGGACGCCT GGGAGCAGGG AAGTAGTCTC CAGAGCACAC CGAGCACGAG 240
TCCAGAGCCG GCGCCAATGT CAGGGATCAG GCTCACATCG GGGGCAGGCA GACTTTCCCA 300
CATATACCCT CACAGCACTT GTATTTGCCG TCACACTGCC CGTCCCTCCA GCATTTAGTG 360
AGGGTTAAT 369 配列番号： 3
配列の長さ ： 983
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
ハイポセティカル： No
アンチセンス ： No
起源
生物名 ： Mus Musculus
セルライン ： IMC— HA1細胞
直接の起源
ライブラリ一名 ： IMC— HA1細胞由来 cDNAライブラリ一
クローン名 ： 23— 1 #2
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 17. . 520
特徴を決定した方法： E 配列
CTGAAGCTAC CCCACC ATG CCC TGG TCC TGG AGC TGT ACT TGC CGA GCA CTT 52 Met Pro Trp Ser Trp Ser Cys Thr Cys Arg Ala Leu
1 5 10
GGC CCA CTA CAT GCT CCC TGC ATT TCC CCA GCC ATG TGG CTG GCC ATT 100 Gly Pro Leu His Ala Pro Cys l ie Ser Pro Ala Met Trp Leu Ala l ie
15 20 25
CTG CTT GCC CTC TGC TGC CTA ACT TCT GAC ACC CAT GGG GCA CGC CCC 148 Leu Leu Ala Leu Cys Cys Leu Thr Ser Asp Thr His Gly Ala Arg Pro
30 35 40
CCA GAT TTT TGT TCC AAA GAT TTG ATC TCC AGT GTG AAG CCA GGA TTC 196 Pro Asp Phe Cys Ser Lys Asp Leu l ie Ser Ser Val Lys Pro Gly Phe
45 50 55 60
CCC AAA ACA ATA GAG ACC AAT AAC CCA GGA GTG CTT AAG GCC GCC AGG 244 Pro Lys Thr l ie Glu Thr Asn Asn Pro Gly Val Leu Lys Ala Ala Arg
65 70 75
CAC AGT GTG GAA AAG TTC AAC AAC TGC ACA AAT GAC ATC TTT TTG TTC 292 His Ser Val Glu Lys Phe Asn Asn Cys Thr Asn Asp l ie Phe Leu Phe
80 85 90
AAG GAG TCC CAT GTC AGC AAA GCC CTG GTA CAG GTG GTG AAA GGC CTG 340 Lys Glu Ser His Val Ser Lys Ala Leu Val Gin Val Val Lys Gly Leu
95 100 105
AAA TAT ATG CTG GAG GTG AAA ATC GGC CGA ACT ACA TGC AGG AAG ACC 388 Lys Tyr Met Leu Glu Val Lys l ie Gly Arg Thr Thr Cys Arg Lys Thr
110 115 120
ATG CAT CAC CAA CTG GAC AAC TGT GAC TTC CAA ACC AAC CCT GCC TTG 436 Met His His Gin Leu Asp Asn Cys Asp Phe Gin Thr Asn Pro Ala Leu
125 130 135 140 AAG CGG ACT CTA TAT TGC TAC TCT GAA GTC TGG GTC ATC CCC TGG CTC 484 Lys Arg Thr Leu Tyr Cys Tyr Ser Glu Val Trp Val lie Pro Trp Leu
145 150 155
CAC AGT TTT GAG GTG CCT GTT CTC CTC TGC CAG TGACTTCTGT CTCTTTAGCA 537 His Ser Phe Glu Val Pro Val Leu Leu Cys Gin
160 165
AGACTGCAGC TGTGATACAT ATCCACTCGT GTTTTCCCCA CTCCTTACTT TCCACCCCAT 597
CCTGGCCATC TCAGATCCTC AGGGCCTGCT TACCAGCGAG CAGATTAACA TGCCAGTGGG 657
TCATCAGGGG GCTGGACTGG GAGAATATAG TGCCCTCCTC TCCAGATTAA CTGTATTCAC 717
ACTTTCTTCT AAAATGAATT CTCTGGTGCT ACACACCTAG ATTCAGGATG TGGGCACGCA 777
GAGAGTCCTT TGATGACATT ACTGGAGCAC GTGCAGAGCA AAGCAGATAC AGTCAACAAG 837
GTGGTAGTGT GGGAAGCTTC TTGATGCCCG ACTGCATGAG CAGATTCTGC AGCCGTCTGG 897
TATGCTACCA TCAGACTAAT ATTGATGGGG ATGATTTATC ATAAATAAAA AGCTGATCAC 957
CTAAAAGCAA AAAAAAAAAA AAAAAA 983 配列番号： 4
配列の長さ ： 167
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名 ： Mus Mus cuius
セルライン ： IMC— HA1細胞 配列
Met Pro Trp Ser Trp Ser Cys Thr Cys Arg Ala Leu r¾M：
醒： fi
169： ^ou
9：
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UI3 S Q ΐΐ9ΐ naq Ι¾Λ ojj Ϊ¾Λ Wf) aqd STH
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0Z 91 an ¾iv nai djx BIV OJJ s OJd ¾IV STH OJd X{g
01 9 Ϊ
Of- f/13d I€^Sf/86 OAV トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
ハイポセティカル： No
アンチセンス ： No
起源
生物名 ： Mus Musculus
セルライン ： IMC— HA1細胞
直接の起源
ライブラリ一名 ： IMC— HA1細胞由来 cDNAライブラリ一
クローン名： 28— 1 #3
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 37. . 429
特徴を決定した方法： E 配列
CTCGGGACTG GTCATCAGAG CTCCCCTGCC TTCACC ATG AAG TCC TGC GGC CTT 54
Met Lys Ser Cys Gly Leu
1 5
TTA CCT TTC ACG GTG CTC CTT GCT CTG GGG ATC CTG GCA CCC TGG ACT 102 Leu Pro Phe Thr Val Leu Leu Ala Leu Gly l ie Leu Ala Pro Trp Thr
10 15 20
GTG GAA GGA GGC AAA AAT GAT GCT ATC AAA ATC GGA GCC TGC CCT GCT 150 Val Glu Gly Gly Lys Asn Asp Ala l ie Lys l ie Gly Ala Cys Pro Ala
25 30 35
AAA AAG CCT GCC CAG TGC CTT AAG CTT GAG AAG CCA CAA TGC CGT ACT 198 翊, ： w
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6S画 df/IOd K 6 0AV トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名 ： Mus Musculus
セルライン ： IMC— HA1細胞
配列
Met Lys Ser Cys Gly Leu 1 5 Leu Pro Phe Thr Val Leu Leu Ala Leu Gly l ie Leu Ala Pro Trp Thr
10 15 20
Val Glu Gly Gly Lys Asn Asp Ala l ie Lys l ie Gly Ala Cys Pro Ala
25 30 35
Lys Lys Pro Ala Gin Cys Leu Lys Leu Glu Lys Pro Gin Cys Arg Thr
40 45 50
Asp Trp Glu Cys Pro Gly Lys Gin Arg Cys Cys Gin Asp Ala Cys Gly 55 60 65 70
Ser Lys Cys Val Asn Pro Val Pro l ie Arg Lys Pro Val Trp Arg Lys
75 80 85
Pro Gly Arg Cys Val Lys Thr Gin Ala Arg Cys Met Met Leu Asn Pro
90 95 100
Pro Asn Val Cys Gin Arg Asp Gly Gin Cys Asp Gly Lys Tyr Lys Cys
105 110 115
Cys Glu Gly l ie Cys Gly Lys Val Cys Leu Pro Pro Met
120 125 130 配列番号： 7 配列の長さ ： 1114
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
ハイポセティカル： No
アンチセンス： No
起源
生物名 ： us Musculus
セルライン ： IMC— HA1細胞
直接の起源
ライブラリ一名： IMC—HA1細胞由来 cDNAライブラリ
クローン名： #8.323 配列
CCAGAGGCCA GTTTGGGATG CCAAACCCCT ACCTAACCAG AAGAAGAGAA GAAAGGCCAC 60 TGCCGAGGTC ACTTCCAGTA CTTGGAGGAG AAAGCAACGT TCCCATTTAC AGCTGAGTAA 120 CAGGAGCCAC AAGGTATGTC TGACTCAAAA GTTCAGGCTC TCGATGACTG TGCGGTGCTG 180 CCCAGTGTGT CTTCTTCAAT GTAACCTCAG GACCTAGAAC AGCACCTTGC ATGTGCTCTC 240 AGGTGGTTAC TCTGATGGCC TCATGGTCCT GCCTGAAACA GAAAGTCTGC CACCTACTTC 300 TGTAGCAGCA AGACTCCTGT TCTGTGGCTA AGCTTCCTGC CTGTGCAAGA GCCACAGGGA 360 GGGGCCAAAT GCATGCCACT GGGGCCACGC CTCCTGGTAA AGACATAAAT AGTGATCCTC 420 GGGACTGGTC ATCAGAGCTC CCCTGCCTTC ACCATGAAGT CCTGCGGCCT TTTACCTTTC 480 ACGGTGCTCC TTGCTCTGGG GATCCTGGCA CCCTGGACTG TGGAAGGAGG CAAAAATGAT 540 GCTATCAAAA TCGGAGCCTG CCCTGCTAAA AAGCCTGCCC AGTGCCTTAA GCTTGAGAAG 600 CCACAATGCC GTACTGACTG GGAGTGCCCG GGAAAGCAGA GGTGCTGCCA AGATGCTTGC 660 GGTTCCAAGT GCGTGAATCC TGTTCCCATT CGCAAACCAG TGTGGAGGAA GCCTGGGAGG 720
TGCGTCAAAA CTCAGGCAAG ATGTATGATG CTTAACCCTC CCAATGTCTG CCAGAGGGAC 780
GGGCAGTGTG ACGGCAAATA CAAGTGCTGT GAGGGTATAT GTGGGAAAGT CTGCCTGCCC 840
CCGATGTGAG CCTGATCCCT GACATTGGCG CCGGCTCTGG ACTCGTGCTC GGTGTGCTCT 900
GGAAACTACT TCCCTGCTCC CAGGCGTCCC TGCTCCGGGT TCCATGGCTC CCGGCTCCCT 960
GTATCCCAGG CTTGGATCCT GTGGACCAGG GTTACTGTTT TACCACTAAC ATCTCCTTTT 1020
GGCTCAGCAT TCACCGAGCT TTAGGGAAAT GCTGTTGGAG AGCAAATAAA TAAACGCATT 1080
CATTTCTCTA TGCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1114 配列番号： 8
配列の長さ ： 684
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
ハイポセティカル： No
アンチセンス： No
起源
生物名 ： Mus Musculus
セルライン ： IMC—HA1細胞
直接の起源
ラィブラリ一名： IMC—HA1細胞由来 cDNAラィブラリ一
クローン名： 28— 1 #3
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 0-420 s^O i Cig nig s s^o s α χ sXq vCig dsy sA^ u^g ig dsy Say
C6C I9X VXV 199 9V9 X9X 3DX 9W OVX WV 399 OVO X3I OVO 909 3V3 09V
001 96 06 uio S iQ 八 usy OJd。 usy s Say ¾IV Ujg aqx s^q S DVO 301 DID IW 303 133 3W XID 9XV DIV X9X V3V V09 9V3 IDV WV
98 08 9A
Ι¾Λ S Co Sjy 0Jd s q Say da 八 OJJ s q 3ay 9{i OJJ {¾Λ OJJ
DID 091 00V 09D 133 9W 9DV D3I 3ID VOO WV 393 XXV 033 IID 133 QL S9 09 99 usy Ι¾Λ s^o s q J9S XlD s ^ιγ dsy iqg s ¾ s Say iqg s ig
6^ IW 910 331 9W D3X 1D3 391 I0D IV9 WO DDI 091 ODV OVD 9W VOO
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GGG AAA GTC TGC CTG CCC CCG ATG TGAGCCTGAT CCCTGACATT GGCGCCGGCT 447 Gly Lys Val Cys Leu Pro Pro Met
120 125
CTGGACTCGT GCTCGGTGTG CTCTGGAAAC TACTTCCCTG CTCCCAGGCG TCCCTGCTCC 507 GGGTTCCATG GCTCCCGGCT CCCTGTATCC CAGGCTTGGA TCCTGTGGAC CAGGGTTACT 567 GTTTTACCAC TAACATCTCC TTTTGGCTCA GCATTCACCG AGCTTTAGGG AAATGCTGTT 627 GGAGAGCAAA TAAATAAACG CATTCATTTC TCTATGCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 684 配列番号： 9
配列の長さ ： 126
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名： Mus Musculus
セルライン ： IMC— HA1細胞 配列
Met Pro Asn Pro Tyr Leu
1 5
Thr Arg Arg Arg Glu Glu Arg Pro Leu Pro Arg Ser Leu Pro Val Leu
10 15 20
Gly Asp Ala l ie Lys l ie Gly Ala Cys Pro Ala Lys Lys Pro Ala Gin
25 30 35
Cys Leu Lys Leu Glu Lys Pro Gin Cys Arg Thr Asp Trp Glu Cys Pro 40 45 50
Gly Lys Gin Arg Cys Cys Gin Asp Ala Cys Gly Ser Lys Cys Val Asn
55 60 65 70
Pro Val Pro He Arg Lys Pro Val Trp Arg Lys Pro Gly Arg Cys Val
75 80 85
Lys Thr Gin Ala Arg Cys Met Met Leu Asn Pro Pro Asn Val Cys Gin
90 95 100
Arg Asp Gly Gin Cys Asp Gly Lys Tyr Lys Cys Cys Glu Gly He Cys
105 110 115
Gly Lys Val Cys Leu Pro Pro Met
120 125 配列番号： 10
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGCT GGGGA 25 配列番号： 11
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGCT GGAGG 25
配列番号： 12
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGCT GGTGG 25 配列番号： 13
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGCT GGTAG 25
配列番号： 14
配列の長さ： 26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAAGATC TGACTG 26
配列番号： 15
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGCT GGGTG 25 配列番号： 16
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGCT GTATG 25
配列番号： 17
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGGA GCTGG 25 配列番号： 18
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAATGTG GCAGG 25 配列番号： 19
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATTAACCCTC ACTAAAGCAC CGTCC 25
配列番号： 20
配列の長さ ： 30 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTAA 30 配列番号： 21
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTAC 30 配列番号： 22
配列の長さ ： 30
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTAG 30
配列番号： 23
配列の長さ ： 30 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTCA 30 配列番号： 24
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTCC 30 配列番号： 25
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTCG 30
配列番号： 26 配列の長さ： 30
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTGA 30 配列番号： 27
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTGC 30 配列番号： 28
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CATTATGCTG AGTGATATCT TTTTTTTTGG 30
配列番号： 29 配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CAGAATCTGC TCATGCAGTC 20 配列番号： 30
配列の長さ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CACTCCTTAC TTTCCACCCC 20 配列番号： 31
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
AACAGCATTT CCCTAAAGCT CGG 23 配列番号： 32
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
TGGAAACTAC TTCCCTGCTC CCA 23 配列番号： 33
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
AATTAACCCT CACTAAAGGG 20 配列番号： 34
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22 配列番号： 35
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
7F2
配列
CTCGGGACTG GTCATCAGAG CTCCCC 26 配列番号： 36
配列の長さ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GACTGTATCT GCTTTGCTCT GCAC 24 配列番号： 37
配列の長さ： 800
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル：
アンチセンス ： No
起源
生物名： us Muscukus
セルライン ： IMC— HA1細胞
配列の特徴
特徴を表す記号： CDS
存在位置： 83. . 583
特徴を決定した方法： E 配列
ACAGACCACT GCCCCCACCT GCCCTGCGCC ATCTACCCAA GAAGGCTCGG CACGGGCACC 60 AACCACTGCC TCCAACTGCC CC ATG CTG CCT GAG AAG GCA CTG CAC GGC CAC 112
Met Leu Pro Glu Lys Ala Leu His Gly His
1 5 10
CCC CAA CTG CCC CGC ACT GTC CCT ACC CGG GCA GCC ATG CGA GCG GCT 160 Pro Gin Leu Pro Arg Thr Val Pro Thr Arg Ala Ala Met Arg Ala Ala
15 20 25
GGA ACT CTG CTG GCC TTC TGC TGC CTG GTC TTG AGC ACC ACT GGG GGC 208 Gly Thr Leu Leu Ala Phe Cys Cys Leu Val Leu Ser Thr Thr Gly Gly
30 35 40
CCT TCC CCA GAT ACT TGT TCC CAG GAC CTT AAC TCA CGT GTG AAG CCA 256 Pro Ser Pro Asp Thr Cys Ser Gin Asp Leu Asn Ser Arg Val Lys Pro
45 50 55
GGA TTT CCT AAA ACA ATA AAG ACC AAT GAC CCA GGA GTC CTC CAA GCA 304 Gly Phe Pro Lys Thr l ie Lys Thr Asn Asp Pro Gly Val Leu Gin Ala 60 65 70
GCC AGA TAC AGT GTT GAA AAG TTC AAC AAC TGC ACG AAC GAC ATG TTC 352 Ala Arg Tyr Ser Val Glu Lys Phe Asn Asn Cys Thr Asn Asp Met Phe
75 80 85 90
TTG TTC AAG GAG TCC CGC ATC ACA AGG GCC CTA GTT CAG ATA GTG AAA 400 Leu Phe Lys Glu Ser Arg l ie Thr Arg Ala Leu Val Gin l ie Val Lys
95 100 105
GGC CTG AAA TAT ATG CTC GAG GTG GAA ATT GGC AGA ACT ACC TGC AAG 448 Gly Leu Lys Thr Met Leu Glu Val Glu lie Gly Arg Thr Thr Cys Lys
110 115 120
AAA AAC CAG CAC CTG CGT CTG GAT GAC TGT GAC TTC CAA ACC AAC CAC 496 Lys Asn Gin His Leu Arg Leu Asp Asp Cys Asp Phe Gin Thr Asn His
125 130 135
ACC TTG AAG CAG ACT CTG AGC TGC TAC TCT GAA GTC TGG GTC GTG CCC 544 Thr Leu Lys Gin Thr Leu Ser Cys Tyr Ser Glu Val Trp Val Val Pro
140 145 150
TGG CTC CAG CAC TTC GAG GTG CCT GTT CTC CGT TGT CAC TGACCCCCGC 593 Trp Leu Gin His Phe Glu Val Pro Val Leu Arg Cys His
155 160 165
CTCTTCAGCA AGACCACAGC CATGACAAAC ACCAGGATGC ATGCTCCTTG TCCCCTCCCA 653 CCCGCCTCAT GACCCAGCCT CACAGACCCT CTCAGGCCTC TGACGAGTGA GCGGGTGAAG 713 TGCCACTGGG TCACCGCAGG GCAGCTGGAA TGGCAGCATG GTAGCGCCTC CTAACAGATT 773 AAATAGATCA CATTTGCTTC TAAAATT 800 配列番号： 38
配列の長さ ： 167 配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名 ： Mus Muscukus
セルライン ： IMC— HA1細胞 配列
Met Leu Pro Glu Lys Ala Leu His Gly His 1 5 10
Pro Gin Leu Pro Arg Thr Val Pro Thr Arg Ala Ala Met Arg Ala Ala
15 20 25
Gly Thr Leu Leu Ala Phe Cys Cys Leu Val Leu Ser Thr Thr Gly Gly
30 35 40
Pro Ser Pro Asp Thr Cys Ser Gin Asp Leu Asn Ser Arg Val Lys Pro
45 50 55
Gly Phe Pro Lys Thr lie Lys Thr Asn Asp Pro Gly Val Leu Gin Ala
60 65 70
Ala Arg Tyr Ser Val Glu Lys Phe Asn Asn Cys Thr Asn Asp Met Phe 75 80 85 90
Leu Phe Lys Glu Ser Arg l ie Thr Arg Ala Leu Val Gin l ie Val Lys
95 100 105
Gly Leu Lys Thr Met Leu Glu Val Glu l ie Gly Arg Thr Thr Cys Lys
110 115 120
Lys Asn Gin His Leu Arg Leu Asp Asp Cys Asp Phe Gin Thr Asn His
125 130 135 Thr Leu Lys Gin Thr Leu Ser Cys Tyr Ser Glu Val Trp Val Val Pro
140 145 150
Trp Leu Gin His Phe Glu Val Pro Val Leu Arg Cys His
155 160 165 配列番号： 39
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ACAGACACTG CCCCCACCTG C 21 配列番号： 0
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
AATTTTAGAA GCAAATGTGA TC 22 配列番号： 1
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ACATGTCGTT CGTGCAGTTG TTG 23 配列番号： 42
配列の長さ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
AATTGGCAGA ACTACCTGCA AG 22 配列番号： 3
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
GGTCTTGCTG AAGAGGCGGG GG 22 配列番号： 44
配列の長さ ： 22 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
CACTGTCCCT ACCCGGGCAG CC 22 配列番号： 45
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
ATCTACCCAA GAAGGCTCGG CAC 23 配列番号： 46
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
TCTGTTAGGA GGCGCTACCA TGC 23 配列番号： 47 配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
AATTCGGTAC CAGCTGAAGC TACCCCACCA TGCCC 35 配列番号： 48
配列の長さ ： 34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DM
配列
AGTCGCTAGC AGAGGAGAAC AGGCACCTCA MAC 34 配列番号： 49
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列
TGTTATTAAT GATCTGGAAG CACC 24

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 4、 6、 9、 または 3 8のいずれかに記載のアミノ酸配列から なるタンパク質、 または該タンパク質中のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が置換、 欠失、 若しくは付加したアミノ酸配列からなり癌転移活性を 有するタンパク質。
2 . 配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 3 7のいずれかに記載の塩基配列から なる DNAとハイブリダィズする DNAがコードするタンパク質であって、 癌転移活性 を有するタンパク質。
3 . 請求項 1に記載のタンパク質をコードする DNA。
4 . 配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 3 7のいずれかに記載の塩基配列から なる、 請求項 3に記載の DNA。
5 . 配列番号： 3、 5、 7、 8、 または 3 7のいずれかに記載の塩基配列から なる DNAとハイブリダィズする DNAであって、 癌転移活性を有するタンパク質をコ ―ドする DNA。
6 . 請求項 3から 5のいずれかに記載の MAが挿入されたべクタ一。
7 . 請求項 6記載のベクタ一を保持する形質転換体。
8 . 請求項 7に記載の形質転換体を培養する工程を含む、 請求項 1または 2に 記載の夕ンパク質の製造方法。
9 . 請求項 3から 5のいずれかに記載の DNAと特異的にハイブリダィズする DNA であって、 少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有する DNA。
1 0 . 請求項 3から 5のいずれかに記載の DNA若しくはその一部に対するアンチ センス DM。
1 1 . 請求項 1または 2に記載のタンパク質に結合する抗体。
1 2 . 癌転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であつ て、 (a) 請求項 1または 2に記載のタンパク質に被検試料を接触させる工程、
(b) 請求項 1または 2に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物を選 択する工程、 を含む方法。
13. 癌転移を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であつ て、
( a ) 請求項 1または 2に記載の夕ンパク質を発現する細胞に被検試料を接触さ せる工程、
(b) 被検試料を接触させた細胞における請求項 1または 2に記載のタンパク質 の発現量を請求項 1 1に記載の抗体を用いて検出する工程、
(c) 被検試料を接触させない細胞における請求項 1または 2に記載のタンパク 質の発現量と比較して、 請求項 1または 2に記載のタンパク質の発現量を低下さ せる化合物を選択する工程、 を含む方法。
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