WO1999005290A1 - Nouvelle serine protease - Google Patents

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WO1999005290A1
WO1999005290A1 PCT/JP1998/003324 JP9803324W WO9905290A1 WO 1999005290 A1 WO1999005290 A1 WO 1999005290A1 JP 9803324 W JP9803324 W JP 9803324W WO 9905290 A1 WO9905290 A1 WO 9905290A1
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WO
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amino acid
acid sequence
domain
serine protease
partial peptide
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PCT/JP1998/003324
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English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuo Tsuruoka
Kyoko Yamashiro
Nozomi Yamaguchi
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Suntory Ltd
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Suntory Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)

Definitions

  • the present invention provides a novel serine protease, a DNA encoding the same, a method for producing the serine protease, and a screen for a physiologically active substance using the serine protease or the DNA encoding the same.
  • Serine protease is widely found in animals, plants and microorganisms. Especially in higher animals, food digestion, blood coagulation / fibrinolysis, complement activation, hormone production, ovulation / fertilization, phagocytosis, It is known to be involved in an extremely large number of biological reactions such as cell proliferation, development, differentiation, aging, and metastasis (Neurath, H. Science, 222, 350-357, 199 8 4)
  • serine protease acts as a physiologically important functional molecule also in the central nervous system.
  • serine proteases expressed in the brain include tissue-type plasminogen activator (Sappiro, AD., Madani, R., Huarte, J., Belin, D., Ki ss. JZ, Wohlwent, A., and Vassal 1 i, JD., J. CI in. Invest., 92, 679-685, 1993), Trombin (Monard, D.
  • serine protease protein coagulation lines ⁇ scheme, click re Ngurudome Lee down, EGF-1 ike structure, off I Nga structure, r - carboxyglutamicacid Tome Lee emissions Naribi to Appuru domain structure, such as Lee down At the N-terminal side (Furie, B., and Furie, BC, Cell, 53, 505-518, 1988).
  • perinase, plasminogen activator, plasminogen, and the like are known as serine protein-proteins having a kring domain.
  • Klingle domains have the ability to bind fibrin, heparin and ricin analog (Scanu, AM and Edelstein, C., Biochimica. Biophysica. Acta, 1256, 1-12, 1995), in the blood fibrinolysis system, plasminogen activator is bound to the precipitated fibrin via the kring domain, activating the plasmin bound in the vicinity. It is shown.
  • angiogenesis inhibitor angiostatin It is clear that this is a single domain in the plasminogen molecule (Cao, Y., Ji, RW, Davidson, D., Scalier, J., Marti, D., So hndel, S., McCance, SG, 0 'Rei 1 ly, .S., LI inis, M., and Folkman, J., J. Biol. Chem., 271, 29461-29467, 1996), Klingle Domain structure A single physiological activity was demonstrated for the first time.
  • Cyclophilin C is a series of proteins having the domain structure of the force-venger receptor cis-tin-rich (SRCR) observed in the macrophage force-venger receptor. Binding proteins, Speract receptor, Complement factor I, CD5, CD6, etc. are known (Resnick, D., Pearson, A., and Krieger , M., Trends. Biochem. Sci., 19, 5-8, 1994).
  • Cyclophilin C-binding protein and complement factor I are secreted proteins, whereas the Speract receptor and CD5 and CD6 are membrane-bound proteins. It is known to be a binding protein. Among them, the protein that binds to the membrane-bound protein CD6 was found to be an activated leukocyte adhesion molecule (ALCAM), and the binding position is located in the SRCR domain structure of CD6. Kotagawa (Whitney, GS, Starling, GC, Bowen, MA, Modrel 1, B., Siadak, AW, and Aruffo, AJ Biol. Chem., 270, 18187-18190, 1995) It is known that ALCAM, a ligand for CD6, is expressed on activated lymphocytes and neurons.
  • ALCAM activated leukocyte adhesion molecule
  • a protein having a plurality of domain structures not only has a unique function in each domain, but also has an associated function in each domain. Are considered to function with specific cognitive functions
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a novel serine protease and a novel serine protease DNA encoding the same. Another object of the present invention is to provide a method for producing the protease in a large amount using the DNA, and a method for screening a physiologically active substance using the serine protease or a DNA encoding the same. It is assumed that
  • the present invention is based on (1) To 12 (SEQ ID NO: 6), the same amino acid sequence as the serine protease, or an amino acid sequence in which a part thereof is deleted or substituted, or the same amino acid sequence or A serine protease comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been added to the amino acid sequence in which a part thereof has been deleted or substituted, or a partial amino acid sequence thereof.
  • SEQ ID NO: 6 To 12
  • SEQ ID NO: 6 the same amino acid sequence as the serine protease, or an amino acid sequence in which a part thereof is deleted or substituted, or the same amino acid sequence or A serine protease comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been added to the amino acid sequence in which a part thereof has been deleted or substituted, or a partial amino acid sequence thereof.
  • FIG. 1 to 12 SEQ ID NO: 6 having the same amino acid sequence as the serine proteinase domain consisting of the amino acid sequences of 578 to 8222 or a part thereof.
  • Serine protease comprising an amino acid sequence to which is added Provide the domain or its partial peptides.
  • the present invention further provides (3) FIG. 1 to 12 (SEQ ID NO: 6), the amino acid sequence consisting of the amino acid sequence of amino acids 40 to 112, or a part of the same amino acid sequence as the kling domain.
  • the present invention further relates to (4) Amino acid numbers 11 17 to 21 17, 22 7 to 32 7, and 33 3 shown in FIGS. 7 to 12 (SEQ ID NO: 6).
  • Amino acid sequence identical to the scavenger receptor cystin litsch (SRCR) domain consisting of amino acid sequences 4 to 433 or numbers 447 to 547 or a part thereof is deleted
  • One or more amino acids are added to the substituted amino acid sequence or to the amino acid sequence in which the same amino acid sequence or a part thereof is deleted or substituted.
  • a SRCR domain comprising the amino acid sequence or a partial peptide thereof.
  • the present invention further provides (5) a DNA encoding the serine protease, domain or partial peptide thereof according to any of (1) to (4) above.
  • the present invention further provides (6) a DNA encoding the serine protease, domain or partial peptide thereof according to any of (1) to (4) above, and a string DNA that hybridizes under mild conditions and encodes a peptide having serine protease, domain, or partial peptide activity thereof.
  • the present invention further provides (7) an expression vector comprising the DNA of (5) or (6). / JP98 / 03324
  • the present invention further provides (8) a host transformed by the expression vector according to (7).
  • the present invention further provides (9) a method of culturing or breeding the host according to the above (8), and collecting serine protease, domain, or a partial peptide thereof. It provides a method for producing zeolites, domains or their partial peptides.
  • the present invention further provides (10) an antibody having the serine protease, domain, or partial peptide thereof described in any of (1) to (4) as an antigen.
  • the present invention further provides (11) the serine protease or domain described in any one of the above (1) to (4), or a partial peptide thereof, or the above (5) or (5). 6) A method for screening a physiologically active substance using the DNA according to 6).
  • FIG. 1 shows a portion of the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse serine protease and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 2 shows a portion of the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse serine protease and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 3 shows a portion of the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse serine protease and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 4 shows a portion of the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse serine protease and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 5 shows a part of the nucleotide sequence of cDNA which encodes mouse serine protease and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 6 shows a part of the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse serine protease and the corresponding amino acid sequence. / JP98 / 03324
  • FIG. 7 shows a portion of the nucleotide sequence of cDNA which encodes human serine protease, and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 8 shows a part of the nucleotide sequence of cDNA which encodes human serine protease, and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 9 shows a portion of the nucleotide sequence of cDNA which encodes human serine protease, and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 10 shows a part of the nucleotide sequence of cDNA which encodes human serine protease, and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 11 shows a part of the nucleotide sequence of cDNA encoding human 'serine protease and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 12 shows a part of the nucleotide sequence of cDNA which encodes human serine protease and the corresponding amino acid sequence.
  • FIG. 13 is an electrophoretogram showing the results of Northern blottin showing transcription of the serine protease gene in each mouse organ.
  • Cloning of cDNA encoding mouse serine protease is performed by first preparing a cDNA library from mouse brain-derived mRNA isolated and prepared according to a conventional method, and then preparing the cDNA library. The PCR was performed using a PCR primer designed based on the serine protease motif. Using the PCR product obtained here as a probe, screening was performed for clones that have a long 5 'translation region and are expected to encode novel functional proteins.
  • mouse BSSP-3 a 2.7 kb cDNA designated as mouse BSSP-3.
  • the obtained cDNA sequence was examined by a conventional method.
  • mouse BSSP-3 cDNA was found to be not only serine proteinase domain but also clone domain and small domain. It has been clarified that it encodes a novel functional protein including the force-venger receptor cysteine-rich domain.
  • the isolated mouse BSSP-3 cDNA encodes one kring domain, three scavenger receptor cystine rich domains and one serine proteinase domain.
  • a specific example is described in Example 1.
  • mouse BSSP-13 mRNA in each mouse organ and each region of the mouse brain was confirmed using the isolated mouse BSSP-3c full-length probe as a probe. Strong expression was observed, and expression was also observed in lung and kidney. In each part of the mouse brain, strong expression was observed in the cerebrum and brain stem, and expression was also observed in medulla oblongata. Its size was only about 2.7 kb in each case. Of the brain sites examined, expression of mouse BSSP-3mRNA was not observed in the cerebellum. A specific example is described in Example 2. This confirmed that mouse BSPSP-3mRNA was actually expressed in mouse organs.
  • human BSSP-3 cDNA was successfully isolated.
  • human BSSP-3 cDNA is clearly different from what would be expected from the primary structure of mouse BSSP-3 cDNA, with one kring domain and four scavenges.
  • the gene encodes a receptor domain and a single serine proteinase domain.
  • Example 3 the present inventors have expressed, in COS-1 cells, DNA encoding human serine protease mature protein among human BSSP-3c DNAs. It was revealed that it was a functional protein with apparent enzyme activity. A specific example is described in Example 4.
  • the mouse and human BSSP-3 cDNAs isolated in this study were composed of a new serine protease domain, a new kringle domain, and a new scavenger receptor system due to their primary structures.
  • serine proteinase domain is a functional protein having enzymatic activity.
  • novel functional protein in the present invention not only clearly has a complex function in the primary structure, but also plays a certain role in physiological functions in the brain through the complex function. Therefore, the novel functional proteins encoded by the mouse BSSP-3cDNA and the mouse BSSP-3cDNA of the present invention provide a useful means for analyzing the pathology of various mouse disease models.
  • human BSSP-3c DNA of the present invention and novel functional proteins encoded by the human BSSP-3c DNA include various types of proteins. It provides a method for screening therapeutic agents for diseases, and can also be applied to the development of actual therapeutic agents for human diseases.
  • Examples of the therapy include replacement therapy by administration of a genetic recombinant and therapy for promoting or suppressing gene expression by a sense or antisense method.
  • each of the domain structures of the novel functional protein can also function independently. Therefore, after individually expressing each domain structure, a molecule that interacts with each domain structure can be identified. In addition, by examining the involvement of the identified molecular groups in diseases, replacement therapy by administration of genetically modified organisms and gene expression promotion or suppression therapy by sense or antisense methods are performed. Is also possible.
  • FIGS. 1 to 6 SEQ ID NO: 3
  • cDNA can be obtained as described in Examples, but is not limited thereto. That is, the DNA encoding the natural serine protease is specifically disclosed in the present invention if one nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the natural serine protease is determined. It can be cloned as cDNA by a strategy different from the strategy, and can also be cloned from the genome of the cell that produces it.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the DNA of the present invention further encodes a protein or a glycoprotein having serine protease activity, and can be obtained by encoding the protein of FIG. 1-6 (SEQ ID NO: 3) or FIG. 7-12 (SEQ ID NO: 5). DNAs that hybridize to nucleotide sequences are also included. Also, the general method of hybridization is well known to those skilled in the art (for example, Special Issue on Experimental Medicine, Yodosha, “Biotechnology—Experimental Method Series Genetic Engineering Summary”, Vo 1.5, No. 11, 24-60, 1987), activity measurements are also well known to those skilled in the art.
  • the various primer or probe nucleotides used in the examples can be used as probes for selection of genomic DNA fragments.
  • Figure 1-6 SEQ ID NO: 3
  • Other probes designed based on the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 12 SEQ ID NO: 5
  • General methods for cloning DNA of interest from genomics are well known in the art (Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Chapters 5 and 6).
  • DNA encoding the natural serine protease of the present invention can also be prepared by DNA synthesis.
  • Chemical synthesis of DNA is the industry's automated DNA synthesizer, such as Applied Biosystems.
  • FIGS. 1-6 SEQ ID NO: 3
  • FIGS. 1-6 SEQ ID NO: 3
  • DNA having the nucleotide sequence shown in 5) can be easily synthesized.
  • DNA encoding the natural serine protease of the present invention with a codon different from the native codon can also be prepared by chemical synthesis as described above, and can be prepared using the method shown in FIGS. 1 to 6 (SEQ ID NO: 3) or Figure?
  • DNA or RNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to 5 (SEQ ID NO: 5) can be obtained by a site-directed mutagenesis method using site-directed mutagenesis as a type I together with a mutagenic primer. (See, eg, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley Sons, Chapter 8.).
  • the native amino acid A polypeptide in which one or more amino acids are added to the sequence and which still maintains serine protease activity;
  • a polypeptide from which a plurality of amino acids have been removed and which still maintain serine protease activity, one to a plurality of amino acids in the natural amino acid sequence are other amino acids
  • Various mutant serine proteases can be designed and manufactured, such as polypeptides that maintain the serine protease activity without the mutation.
  • the number of amino acids in the above mutations such as addition, removal and substitution of amino acids is not particularly limited, and the number of amino acids added is, for example, used for the hybrid protein with serine protease of the present invention.
  • the number of amino acids of functional proteins for example, known extraction and purification or stabilization proteins such as maltose binding protein (ma1tose-bindingrotein) or various physiologically active proteins such as serine protein It depends on that of the signal peptide added to the enzyme, that is, depends on the purpose of the mutation, for example, 1 to 50, preferably 1 to 10 is added.
  • the number of amino acids to be removed is designed and determined so that serine proteinase activity is maintained, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, and The number of amino acids in a region other than the active region of serine protease may be mentioned. Furthermore, for substitutions, the number of amino acids to be substituted is designed and determined to maintain serine protease activity, for example from 1 to 10, preferably from 1 to 5 Is raised.
  • FIG. 1 to FIG. 6 SEQ ID NO: 4 or FIG. A serine proteinase domain consisting of amino acid sequences of amino acids 5 17 to 7 61 or 5 78 to 8 22 shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 (SEQ ID NO: 6), respectively.
  • Figures 1-6 SEQ ID NO: 4 or Figure? 1 to 12 (SEQ ID NO: 6), a single domain consisting of amino acid sequences from 85 to 157 or 40 to 112 amino acids, respectively.
  • 1 to 6 SEQ ID NO: 4 or figure?
  • the present invention provides a scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) domain, which can be prepared by a method described below, a peptide synthesis method known per se, or an appropriate proteinase by a suitable protease. It can be carried out by cleavage of the protease, and a mutant domain that maintains the activity of the domain of the present invention or a DNA encoding the same can also be produced.
  • SRCR scavenger receptor cysteine-rich
  • the serine protease or domain DNA of the present invention can be used to produce a recombinant serine protease or domain by a conventional gene recombination method. . That is, DNA encoding the serine protease or domain of the present invention is introduced into an appropriate expression vector, the expression vector is introduced into an appropriate host cell, and the host cell is cultured. Intake the desired serine protease or domain from the culture (cells or medium) obtained.
  • the serine protease or domain of the present invention may have a biochemical or chemical modification, such as N-terminal acylation, for example, C-sylation or deletion such as formylation, acetylation, or the like. May be obtained in the form of No.
  • the expression system can also improve the secretion efficiency and expression level by adding or improving a signal sequence or selecting a host.
  • a gene encoding a signal peptide of another structural peptide is placed upstream of the serine protease or domain of the structural gene 5 ′ of the present invention.
  • a method of linking via a gene encoding a cleavable partial peptide As a specific example, the method using the gene encoding the signal sequence of the trypsin gene and the enterokinase recognition sequence described in Example 4 can be mentioned.
  • Prokaryote or eukaryote can be used as a host.
  • bacteria in particular, Escherichia coli (Escherichiacol o), bacteria of the genus Bacillus (Bacillus), for example, Bacillus subtilis (dan. Subtilis), and the like can be used.
  • eukaryotes include yeasts, e.g., Saccharomyces yeasts, e.g., Saccharomyces' s. podopterafrugiperda), key looper cells (T_ri—ch ⁇ 1usiani), silkworm cells (Bombyxmori), animal cells such as human cells, monkey cells, mouse cells, etc.
  • COS-1 Cells Vero cells, CH0 cells, L cells, myeloma cells, C127 cells, BAL BZc3T3 cells, Sp-2ZO cells and the like can be used.
  • an organism itself for example, an insect, for example, a silkworm, a cabbage, or the like, can also be used.
  • Plasmid, phage, phagemid, virus (baculo (insect), vaccinia (animal cell)) and the like can be used as expression vectors.
  • Promoter selection in expression vector depends on host cell
  • 1 ac promoter, tr promoter, etc. are used as bacterial promoters
  • adhl promoter, pqk promoter, etc. are used as yeast promoters.
  • the promoter for Baculovirus polydolin promoter is used as a promoter for the cell.
  • ear 1 y or 1 ate of Simian Virus 40 or 1 ate promoter the CMV promoter, the HSV-TK promoter or
  • One example is the SR a promoter.
  • expression vectors include enhancers, splicing signals, poly-A addition signals, selection factors (eg, dihydrofolate reductase gene (metrexate resistance), ne 0 gene (G4 18 resistant) etc.) is preferred.
  • an enhancer for example, an enhancer such as SV40 is inserted upstream or downstream of the gene.
  • Transformation of a host with an expression vector can be carried out by conventional methods well known in the art, and these methods are described in, for example, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. .
  • the culture of the transformant can also be performed according to a conventional method.
  • o Purification of serine protease or domain from the culture may be performed according to a conventional method for isolating and purifying the protein, for example, an Filtration and various types of column chromatography, for example, chromatography using Sepharose, etc. can be performed.
  • the serine protease or domain of the present invention thus obtained is a functional protein, and therefore provides a useful means for pathological analysis and enables screening of a physiologically active substance using the protein.
  • the screening method is useful for exploratory research on therapeutic agents for various diseases.
  • Specific examples of screening methods include, for example, Test samples such as peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products, or natural components obtained from various cell culture supernatants, and artificial components such as various synthetic compounds.
  • serine protease or domain of the present invention or a partial peptide thereof or the above-described serine protease, domain or a DNA encoding the partial peptide may be used.
  • the above-described measurement of the physiological activity and the measurement of the binding affinity using the transformed host or its cell membrane fraction are also preferable embodiments of the screening method of the present invention.
  • DNA encoding the serine protease, domain or partial peptide thereof of the present invention can be used for replacement therapy by administration of a recombinant and gene expression promotion or suppression therapy by a sense or antisense method. It is provided as a useful tool for elucidating physiological functions in the body, and is also used for screening new drugs based on the elucidated information.
  • the serine protease, domain, or partial peptide thereof or the DNA encoding them according to the present invention may be prepared in a form that can be used in carrying out the above-mentioned screening method.
  • the partial peptides that can be provided as peptides include peptide fragments present in the vicinity of serine residues in the active site and recognition of the serine protease or domain-specific antibody of the present invention. Peptide fragments comprising regions specific to the serine protease of the present invention, such as peptide fragments that can be sites, may be mentioned.
  • the partial peptide may be prepared by the method described above for the serine protein or domain of the present invention, or by a peptide synthesis method known per se or an appropriate proteinase.
  • the above-mentioned cell membrane fraction can be obtained by culturing a host cell capable of expressing a DNA encoding the serine protease, domain or a partial peptide thereof of the present invention under conditions capable of expression. This refers to a fraction obtained by crushing host cells containing serine protease, domain or its partial peptide by a method known per se, and then obtaining a large amount of cell membrane.
  • the method for screening a physiologically active substance using the serine protease, domain or partial peptide thereof according to the present invention is a method for screening a serine protease, domain or partial peptide thereof according to the present invention. Screening the test sample using the DNA encoding them, the host cell containing the serine protease, domain, or its partial peptide, or its cell membrane fraction. It is performed by As a specific method, an activity measuring method or binding using the serine protease of the present invention, the domain of domain and its partial peptide, for example, a synthetic substrate such as a chromogenic substrate, a substrate labeled with a radionuclide, and the like. It is performed by an affinity measurement method.
  • the cell When a host cell containing serine protease, domain, or a partial peptide thereof is used, the cell may be immobilized by a method known per se (eg, with dartartaldehyde, formaldehyde, etc.). it can.
  • a method known per se eg, with dartartaldehyde, formaldehyde, etc.
  • the method is used to evaluate the promotion or suppression of gene expression, for example, using a reporter gene such as a luciferase gene. be able to.
  • RNA 51 (about 6) was added oligo dT primer 1-2 1 (1 g), heated at 70 ° C for 10 minutes, and quenched in ice.
  • the primer number is based on the amino acid conserved region (N-Va1-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys) near the active residue (His) as a primer. : Ori sesame one shown in 1 KY 1 8 5 (5 '— GTG
  • the supernatant obtained by centrifugation at 400 xg for 5 minutes was transferred to another 50 ml centrifuge tube, and the 5 MNaCl solution was added to the mixture at 950 ⁇ 1
  • the solution was passed through the 21-gauge injection needle again three times using a syringe.
  • 1 tablet of oligo (dT) cellulose was added to this solution, and after swelling for 2 minutes, it was vibrated slowly for 1 hour. After 1 hour, centrifuge at 2,000 x g for 5 minutes, aspirate the supernatant, suspend in 20 ml of binding buffer, and centrifuge the pellet to further add 10 ml of binding buffer.
  • the plate was washed three times with 10 ml of a low salt concentration washing solution. After the final washing, suspend the oligo (dT) cellulose in a low-salt washing solution of 800 // 1 and put it into a spin column.Wash the centrifugal washing 3 times at 500 x Xg for 10 seconds. I returned. After washing, 200 ⁇ l of elution buffer was added, and centrifugation was repeated twice at 500 ⁇ 10 g for 10 seconds to obtain 4001 mRNA solution.
  • the mR NA was recovered from the mR NA solution by ethanol precipitation according to a conventional method, and dissolved in 201 D EPC-treated distilled water.
  • T4DNA polymerase One (10 U) of T4DNA polymerase was added and reacted at 16 ° C for 5 minutes.
  • cDNA was packaged using Gigapack Packing Extracts (Stratagene). That is, after ligation of 0.1 ⁇ g Z ⁇ 1, add Freee — thaw Extract 10 / zl attached to the kit to cDNA solution 1 ⁇ 1 and then add the kit. G The attached Sonic Extract 15 51 was added immediately and stirred well. After standing for 2 hours at room temperature, 5 0 0 1 full Aji dilution buffer (1 0 0 mM N a C l, 1 0 m MM g S 0 4, 5 0 mM T ris / HC lp H 7. 5, 0 0 1% gelatin)
  • 201 mouthpiece form was added. After mixing well, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes at room temperature, and the supernatant was collected to obtain a phage solution. This phage solution was infected with host Escherichia coli after titration according to a conventional method.
  • Example 1 was labeled with alpha-32 P d CTP using the resulting DNA fragment B ca B est DNA 1 abe 1 ingkit (T akara) in (1) to prepare a probe. Using this probe, about 400,000 clones of the cDNA library obtained in the previous step were screened. As a result, the longest clone of the imported DNA fragment, PUC 18 / m BSSP-3 / l-1, was obtained from about 400,000 clones.
  • the full-length cDNA of pUC18ZmBSSP-3Zl-l is 2,597 base pairs, 24 4 base pairs of 5 'untranslated region, 2283 base pairs of translated region, 7 It consists of 0 base pairs of the 3 'untranslated region, which not only encodes the serine protease domain (amino acid number: 517-761) but also the cloned domain. (Amino acid number: 85 to 157) and scavenger receptor cystine rich domain (amino acid number domain 1: 166—266, domain 2 : 2 7 3 — 3 7 2, and domain 3: 3 8 6 to 4 8 6).
  • Mouse brain tota1 RNA was prepared using Trisol reagent (Lifetechnoguchi) according to the attached document. That is, the cerebrum, brain stem, cerebellum and medulla of the mouse were removed, immediately homogenized with polytron, and the tissue was dissolved by adding 10 times the tissue volume (about 3 ml) of the resolving reagent. . Further, the clonal form 6001 was added thereto, followed by stirring and centrifugation at 15,000 rpm at 4 ° C for 15 minutes. After the centrifugation, the aqueous phase was collected, 1501 isopropanol was added to the collected aqueous phase, the mixture was stirred, and centrifuged at 150,000 rpm at 4 ° C for 30 minutes.
  • Trisol reagent Lifetechnoguchi
  • RNAs at various parts of the mouse brain were dissolved in 4001 DEPC-treated distilled water, and then plotted on a membrane filter according to a conventional method. Then, p UC 1 8 / m BSSP - 3 / l - l was digested with the restriction enzyme E c 0 RI, about 2. The DNA fragment of 7 kbp isolated 'purified, the above-described method Dehi - 32 P A probe was prepared by labeling with dCTP.
  • This probe was prepared using a membrane filter prepared by blotting t0ta1 RNA prepared from each of the mouse brain sites described above and a membrane filter prepared by blotting mRNA prepared from various commercially available organs. After hybridization overnight at 55 ° C with 2 x SSC containing 0.1% SDS (150 mM MNaC1, 15 mM MS). odiumcitrate) at room temperature for 20 minutes, followed by 2 washes at 65 ° C for 30 minutes at 0. lx SSC, 0.1% SDS, and an imaging plate for BAS 2000 (Fuji Photo The film was exposed for 30 minutes.
  • the human brain cDNA library was purchased from Clontech.
  • the mouse BSPP-3cDNA fragment was fluorescently labeled with glutaraldehyde to prepare a probe. Using this probe, approximately 400,000 clones of human brain cDNA library were screened to obtain pUC18 / hBSSP-3.
  • the translation region of BSSP-3c DNA encodes the serine protease domain (amino acid number: 578-8822), similar to the mouse BSSP-3c DNA. Not only that, but not limited to, the clean domain (amino acid number: 40 to 112) and the scavenger receptor cysteine rich domain (amino acid number domain 1: 1 1 to 2) 17, Domain 2: 2 27-3 2 7, Domain 3: 3 3 4-4 3 3, Domain 4: 4 7-5 4 7) It was clear that they were
  • the scavenger receptor cis-tin-rich domain is clearly different from that expected from the primary structure of the mouse BSSP-3 cDNA, whereas that of the mouse BSSP-3 is three. It turned out that there were four human BSSP-3s.
  • the chimeric gene DNA prepared in Example 4 (1) was (Life Technologies) and transfused into COS-1 cells. That is, a 10 cm diameter culture dish (Corning, 431067) was placed on a Dulbecco's minimal essential medium (DMEM, Nissui Pharmaceutical) containing 10% fetal calf serum. S- 1 were implanted cells a 5 X 1 0 5 cells. The next day, the cells were rinsed with 5 ml of Opti-MEM medium (Life Technology 1 ogies), and 5 ml of new 0 pti-MEM medium was added, followed by culturing at 37 ° C for 2 hours.
  • DMEM Dulbecco's minimal essential medium
  • a mixture of 1 ⁇ g of the above-mentioned plasmid and 5 g of lipofectin was added to each dish, and cultured at 37 ° C. for 5 hours.
  • 5 ml of Opti-MEM medium was added to make a total of 10 ml, and the cells were cultured at 37 ° C for 72 hours.
  • the culture supernatant was collected by centrifugation, and used as a sample for measuring the enzyme activity.
  • a culture supernatant in which only the expression plasmid pdKCR was transfused into COS-1 cells was also prepared.
  • the enzyme activity in the culture supernatant obtained in Example 4 (2) was measured. That is, 5 ⁇ l of enterokinase (10 mg / ml, Biozyme Laboratories) was mixed with 45 1 of the culture supernatant of COS-1 cells, and reacted at 37 ° C. for 2 hours. Next, the synthetic substrate Boc—Phe—Ser-Arg—MCA (Peptide Research Laboratories) dissolved in DMS0 was diluted with 0.1 MTris / HCl, pH 8.0. 501 was added with 2 mM substrate solution, and reacted at 4 ° C. for 16 hours. After the reaction, the fluorescence was measured at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 535 nm.
  • the present inventors have developed novel functional proteins, including not only a novel serine mouth domain but also a novel clone domain and a novel scavenger receptor Yuichi Sistine Reit domain, from a mouse brain cDNA library.
  • the mouse BSSP-3c DNA was isolated.
  • the isolated mouse BSSP-3 cDNA encodes a single domain, three scavenger receptor cystine-rich domains, and one serine proteinase domain. .
  • the present inventors found that the mouse BSSP-3 mRNA is strongly expressed in the brain, and that the brain BS and brain stem, in particular, It was revealed that it was strongly expressed.
  • human BSSP-3 cDNA is clearly different from what would be expected from the primary structure of mouse BSSP-3 cDNA, with one Kring domain and four scavenger receptors. It revealed that it encodes a cysteine rich domain and one serine proteinase domain. Furthermore, when the present inventors expressed in human COS-1 cells a DNA encoding human serine proteinase mature protein among human BSSP-3 cDNAs, they clearly showed enzymatic activity. Clarified that it is a functional protein.
  • the novel functional protein in the present invention not only clearly has a complex function in the primary structure, but also has a It plays a certain role in the physiology of the brain through its complex functions. Therefore, the mouse BSSP-3 cDNA and the novel functional protein encoded by the mouse BSSP-3 cDNA of the present invention provide useful means for analyzing the pathological state of various mouse disease models.
  • the human BSSP-3c DNA of the present invention and the novel functional protein encoded by the human BSSP-3c DNA are It provides a means for screening various therapeutic agents, and can be applied to the development of actual therapeutic agents for human diseases.
  • the therapeutic method include replacement therapy by administration of a genetic recombinant and therapy for promoting or suppressing gene expression by a sense or antisense method.
  • each of the domain structures of the new functional protein can also function independently. Therefore, after individually expressing each domain structure, a molecule interacting with each domain structure can be identified. In addition, by examining the involvement of the identified molecules in diseases, it is possible to carry out replacement therapy by administration of a genetic recombinant and promotion or suppression of gene expression by the sense or antisense method.

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Description

新規セリ ンプロテアーゼ 技術分野
本発明は、 新規セ リ ンプロテアーゼ、 それをコー ドする D N A、 及び該セ リ ンプロテアーゼの製造方法、 並びに該セ リ ンプロテア一 ゼまたはそれをコー ドする D N Aを用いる生理活性物質のスク リ ー ニング方法に関する。 背景技術
セ リ ンプロテア一ゼは、 動物、 植物、 微生物に広く 存在し、 特に 、 高等動物では、 食物の消化、 血液凝固 · 線溶、 補体活性化、 ホル モ ン産生、 排卵 · 受精、 食作用、 細胞増殖、 発生 ' 分化、 老化、 癌 転移など極めて多く の生体反応に関与していることがわかっている ( N e u r a t h , H . S c i e n c e , 2 2 4 , 3 5 0 - 3 5 7 ， 1 9 8 4 )
近年、 中枢神経系においてもセ リ ンプロテア一ゼが生理的に重要 な機能分子と して働いている こ とが確認されるよう になった。 例え ば、 脳内において発現しているセ リ ンプロテアーゼと しては、 組織 型プラス ミ ノ 一ゲ ンァクチべ一ター （Sappiro, A-D.， Madani, R. , Hua rte, J. , Bel in, D. , Ki ss. J. Z. , Wohlwent, A. , and Vassal 1 i, J-D. , J. CI in. Invest. , 92, 679-685, 1993) 、 ト ロ ン ビン （ Monard, D. Trends Ne urosci. , 11, 541 -544, 1988). ヒ ト ト リ プシ ン IV (Wiegand, U. , Corba ch, S. , Minn, A.. Rang, J. and Muller-Hill, B. , Gene, 136, 167-175, 199 3)、 ニューロプシ ン （Chen, Z-L. , Yoshida, S.， Kato, Κ·， Momota, Y.， S uzuk i , J. , Tanaka, T. , 1 to, J. , N i sh i no, H. , A i mo to, S. , Ki yama, H. , and Shi osaka, S. , J. Neurosci. , 15(7), 5088-5097, 1995)、 ニューロ シ ン (Yamashiro, K. , Tsuruoka, N. , Kodama, S. , Tsu j imoto, M. , Yamamura, Y
.， Tanaka, T.， Nakazato, H.， and Yamaguchi, N. , B i ochim. B i ophys. Act a, 1350, 11-14， 1997)などが知られている。
これら脳内におけるセリ ンプロテア一ゼは、 ニューロ ンの神経突 起の伸展に関与するばかりでなく、 標的ニューロ ンとのシナプス形 成過程に関与していることが想定されている （Liu， Y. , Fields, R. D.
, Fi tzger aid, S. , Fes toff, B. . , and Nelson, P. G. , J. Neurobioi, 25, 3
25, 1994)。
しかしながら、 これらセリ ンプロテア一ゼの脳内における生理機 能についてはほとんど解明されていない。 また、 脳内に発現し重要 な生理機能を担うセリ ンプロテアーゼがその他多数存在することが 予想されるがその多く は特定されていないのが現状である。
一方、 凝固線溶補体系のある種のセリ ンプロテアーゼタンパク質 は、 ク リ ングルドメ イ ン、 E G F— 1 i k e構造、 フ ィ ンガー構造 、 r — c a r b o x y g l u t a m i c a c i d トメ イ ンなりび にァップル ドメ イ ンなどの構造を N末端側に有している （Furie, B. , and Fur i e, B. C. , Cell, 53, 505-518, 1988) 。 例えば、 ク リ ングル ド メ ィ ンを持つセリ ンプロテア一ゼタ ンパク質と してはゥロキナーゼ 、 プラス ミ ノーゲンァクチべ一夕一、 プラス ミ ノーゲンなどが知ら れている。
ク リ ングル ドメ イ ンは、 フイ ブリ ン、 へパリ ンおよびリ シンアナ ログとの結合能を有し （Scanu, A. M. and Edelstein, C. , Biochimica. Bi ophys ica. Acta, 1256, 1-12, 1995) 、 血液線溶系においては、 析出 したフ イ ブリ ンにプラスミ ノーゲンァクチべ一夕一がク リ ングル ド メ イ ンを介して結合し、 近傍に結合したプラス ミ ンを活性化するこ とが示されている。 さ らに、 血管新生抑制因子アンジォスタチンが 、 プラス ミ ノ ーゲン分子中のク リ ングル ドメ イ ンである こ とが明ら カヽとなり （Cao， Y. , J i, R. W. , Davidson, D. , Scalier, J. , Marti, D. , So hndel, S.， McCance, S. G. , 0' Rei 1 ly, . S. , LI inis, M.， and Folkman, J. , J. Biol. Chem. ,271, 29461-29467, 1996) 、 ク リ ングル ドメ イ ン構造 単独の生理活性が初めて示された。
また、 マク ロフ ァージス力ベンジャー レセプタ一において認めら れたス力ベンジャー レセプターシスティ ン リ ッ チ （ S R C R) ドメ ィ ン構造を有する一連のタ ンパク質群と して、 サイ ク ロ フ ィ リ ン C 結合蛋白質、 スペラ ク ト （ S p e r a c t ) レセプタ一、 コ ンプリ メ ン ト フ ア ク ター I 、 C D 5、 C D 6 などの存在が知られている （ Resnick, D. , Pearson, A. , and Krieger, M. , Trends. Bio chem. Sci. , 19， 5-8， 1994) 。
サイ ク ロフ ィ リ ン C結合蛋白質やコ ンプリ メ ン ト フ ァ ク タ一 I は 分泌タ ンパク質であるのに対して、 スペラ ク ト （ S p e r a c t ) レセプターや C D 5および C D 6 は、 膜結合型タ ンパク質である こ とが知られている。 このう ち、 膜結合型タ ンパク質 C D 6 と結合す る タ ンパク質が活性化白血球接着分子 （A L C AM) である こ とが 見い出され、 C D 6 の S R C R ドメ イ ン構造に結合位置がある こ と がわかつた (Whi tney, G. S. , Starl ing, G. C. , Bowen, M. A. , Modrel 1, B. ， Siadak, A. W.， and Aruf fo, A. J. Biol. Chem. , 270, 18187-18190, 1995) さ らに、 C D 6の リ ガン ドである A L C A Mは、 活性化リ ンパ球 やニューロ ンに発現している こ とが知られており、 C D 6 は、 A L
C AMとの相互作用を介して免疫系や神経系における恒常性の維持 に一定の制御機能を果た している こ とが推察される。
このよ う に、 複数の ドメ イ ン構造を有する タ ンパク質は、 各 ドメ ィ ンが固有の機能を有するばかりでな く 、 各 ドメ イ ンの機能が連関 して特異的な認識機能を持って機能しているものと考えられている
発明の開示
本発明は上記の実情に鑑みてなされたものであり、 その目的は新 規なセリ ンプロテアーゼ、 及びそれをコ一 ドする新規セリ ンプロテ ァ一ゼ D N Aを提供することにある。 さ らに、 本発明は当該 D N A を用いて当該プロテアーゼを大量に生産する方法及び該セリ ンプロ テア一ゼまたはそれをコー ドする D N Aを用いる生理活性物質のス ク リーニング方法を提供することを目的とする ものである。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 脳内に発現するセ リ ンブ 口テア一ゼをコ一ドする c D N Aに良く保存されている領域をプ口 —ブと して用い、 5 ' 翻訳領域が特徴的な c D N Aをスク リーニン グすることにより、 新規機能タ ンパク質をコー ドする c D N Aを単 離し、 本発明を完成させるに至った。
従って本発明は、 （ 1 ) 図？〜 1 2 (配列番号 ： 6 ) に示すセリ ンプロテアーゼと同一のァ ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も しく は置換したア ミ ノ酸配列、 あるいは該同一のァ ミ ノ酸配列またはそ の一部が欠失も し く は置換したア ミ ノ酸配列に 1 乃至複数個のア ミ ノ酸が付加されたァ ミ ノ酸配列を含んでなるセリ ンプロテアーゼま たはその部分べプチ ドを提供する。
本発明はさ らに、 （ 2 ) 図？〜 1 2 (配列番号 ： 6 ) に示すァ ミ ノ酸番号 5 7 8から 8 2 2 までのア ミ ノ酸配列からなるセリ ンプロ テアーゼ ドメイ ンと同一のァ ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も し く は置換したア ミ ノ酸配列、 あるいは該同一のァ ミ ノ酸配列または その一部が欠失も しく は置換したア ミ ノ酸配列に 1 乃至複数個のァ ミ ノ酸が付加されたァ ミ ノ酸配列を含んでなるセリ ンプロテア一ゼ ドメ ィ ンまたはその部分べプチ ドを提供する。
本発明はさ らに、 （ 3 ) 図？〜 1 2 (配列番号 ： 6 ) に示すア ミ ノ酸番号 4 0から 1 1 2 までのア ミ ノ酸配列からなるク リ ングル ド メ イ ンと同一のア ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も しく は置換し たァ ミ ノ酸配列、 あるいは該同一のァ ミ ノ酸配列またはその一部が 欠失も しく は置換したァ ミ ノ酸配列に 1 乃至複数個のァ ミ ノ酸が付 加されたァ ミ ノ酸配列を含んでなるク リ ングル ドメ ィ ンまたはその 部分べプチ ドを提供する。
本発明はさ らに、 （ 4 ) 図 7 〜 1 2 (配列番号 ： 6 ) に示すア ミ ノ酸番号 1 1 7から 2 1 7 まで、 番号 2 2 7から 3 2 7 まで、 番号 3 3 4から 4 3 3 までまたは番号 4 4 7 から 5 4 7 までのア ミ ノ酸 配列からなるスカベンジャーレセプターシスティ ンリ ツチ （ S R C R ) ドメ イ ンと同一のア ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も しく は 置換したア ミ ノ酸配列、 あるいは該同一のァ ミ ノ酸配列またはその 一部が欠失も しく は置換したア ミ ノ酸配列に 1 乃至複数個のァ ミ ノ 酸が付加されたア ミ ノ酸配列を含んでなる S R C R ドメ イ ンまたは その部分べプチ ドを提供する。
本発明はさ らに、 （ 5 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれかに記載の セリ ンプロテアーゼ、 ドメ イ ンまたはそれらの部分べプチ ドをコ一 ドする D N Aを提供する。
本発明はさ らに、 （ 6 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれかに記載の セリ ンプロテアーゼ、 ドメ イ ンまたはそれらの部分べプチ ドをコ一 ドする D N Aとス ト リ ンジヱ ン トな条件下でハイブリ ダイズし、 か つ、 セリ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンまたはそれらの部分ペプチ ド活 性を有するぺプチ ドをコ一 ドする D N Aを提供する。
本発明はさ らに、 （ 7 ) 前記 （ 5 ) 又は （ 6 ) に記載の D N Aを 含んでなる発現ベクターを提供する。 /JP98/03324
本発明はさ らに、 （ 8 ) 前記 （ 7 ) に記載の発現べクタ一により 形質転換された宿主を提供する。
本発明はさ らに、 （ 9 ) 前記 （ 8 ) に記載の宿主を培養または飼 育し、 セリ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンまたはそれらの部分ペプチ ド を採取することを特徴とするセリ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンまたは それらの部分べプチ ドの製造法を提供する。
本発明はさ らに、 （ 1 0 ) 前記 （ 1 ) から （ 4 ) のいずれかに記 載のセリ ンプロテア一ゼ、 ドメ ィ ンまたはそれらの部分べプチ ドを 抗原とする抗体を提供する。
本発明はさ らに、 （ 1 1 ) 前記 （ 1 ) から （ 4 ) のいずれかに記 載のセリ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンも しく はそれらの部分べプチ ド または前記 （ 5 ) または （ 6 ) に記載の D N Aを用いる生理活性物 質のス ク リ 一ニ ング方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 はマウス · セリ ンプロテアーゼをコ一 ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 2 はマウス . セリ ンプロテア一ゼをコー ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 3 はマウス · セリ ンプロテアーゼをコ一 ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するァ ミ ノ酸配列を示す。
図 4 はマウス · セリ ンプロテア一ゼをコ一 ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 5 はマウ ス · セリ ンプロテア一ゼをコ一 ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 6 はマウ ス · セリ ンプロテア一ゼをコ一 ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するァ ミ ノ酸配列を示す。 /JP98/03324
図 7 はヒ ト · セリ ンプロテア一ゼをコ一 ドする c D N Aの塩基配 列の一部分、 及びそれに対応するァ ミ ノ酸配列を示す。
図 8 はヒ 卜 · セリ ンプロテア一ゼをコ一ドする c D N Aの塩基配 列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 9 はヒ ト · セリ ンプロテア一ゼをコ一ドする c D N Aの塩基配 列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 1 0 はヒ ト · セリ ンプロテア一ゼをコ一ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 1 1 はヒ ト ' セリ ンプロテア一ゼをコー ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するア ミ ノ酸配列を示す。
図 1 2 はヒ ト · セリ ンプロテア一ゼをコ一ドする c D N Aの塩基 配列の一部分、 及びそれに対応するァ ミ ノ酸配列を示す。
図 1 3 は、 マウスの各臓器におけるセリ ンプロテアーゼ遺伝子の 転写を示す Northern blottin の結果を示す電気泳動図である。 発明の実施の形態
マウ スセリ ンプロテア一ゼをコ一 ドする c D N Aのクロ一ニング は、 先ず、 常法に従って単離調製したマウス脳由来 mR N Aから c D N Aライブラ リ 一を作製し、 次に、 作製した c D N Aライブラ リ 一をセリ ンプロテアーゼモチーフをもとにデザィ ンした P C Rブラ イマ一を用いた P C Rにより行なった。 ここで得られた P C R産物 をプローブと して、 5 ' 翻訳領域が長く新規機能タ ンパク質をコ一 ドすると予想されるクロー ンのスク リーニングを実施した。
その結果、 本発明者らは、 マウス B S S P— 3 と命名した 2. 7 kbの c D N Aを単離するこ とに成功した。 得られた c D N A配列を 常法により調べた結果、 マウス B S S P— 3 c D N Aは、 セリ ン プロテア一ゼ ドメ イ ンばかりでなく ク リ ングル ドメ イ ンならびにス 力ベンジ ャーレセプターシスティ ンリ ツチ ドメィ ンを含む新規機能 タ ンパク質をコ一 ドしていることが明らかとなった。 単離したマウ ス B S S P— 3 c D N Aは、 1 つのク リ ングル ドメ イ ン、 3 つの スカベンジ ャー レセプターシスティ ン リ ツ チ ドメ イ ンおよび 1 つの セリ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンをコ一 ドしていた。 具体例を実施例 1 に記載する。
次に、 単離したマウス B S S P— 3 c D N A全長をプローブと して、 マウス各臓器およびマウス脳各部位におけるマウス B S S P 一 3 mR N Aの発現を確認したところ、 マウス各臓器においては 、 特に脳に強い発現を認め、 肺および腎臓においても発現を認めた 。 また、 マウス脳各部位においては、 大脳および脳幹に強い発現を 認め、 延髄においても発現を認めた。 その大きさはいずれの場合に おいても約 2. 7 kbの大きさのみであった。 検討した脳各部位のう ち、 マウス B S S P— 3 m R N Aの発現は小脳では認められなか つた。 具体例を実施例 2 に記載する。 このことから、 マウス B S S P - 3 mR N Aは、 実際にマウス臓器で発現していることが確認 された。
さ らに、 マウス B S S P— 3 c D N Aをプローブにしてヒ ト脳 c D N Aライブラ リ 一をスク リーニングした結果、 ヒ ト B S S P— 3 c D N Aを単離することに成功した。 その結果、 本発明者らは 、 ヒ ト B S S P— 3 c D N Aがマウス B S S P— 3 c D N Aの一次 構造から予想される ものとは明らかに異なり、 1 つのク リ ングル ド メ イ ン、 4つのスカベンジ ャー レセプターシスティ ン リ ツ チ ドメ ィ ンおよび 1 つのセリ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンをコー ドしていること を明らかにした。 具体例を実施例 3 に記載する。 さ らに、 本発明者 は、 ヒ ト B S S P— 3 c D N Aのうちセリ ンプロテア一ゼ成熟タ ンパク質をコー ドする D N Aを C O S — 1細胞で発現したところ、 明らかに酵素活性を持つ機能タンパク質であることを明らかにした 。 具体例を実施例 4 に記載する。
以上の結果から、 今回単離したマウスおよびヒ ト B S S P— 3 c D N Aは、 その一次構造上、 新規セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ン、 新規ク リ ングル ドメ イ ンならびに新規スカベンジ ャー レセプタ一シ スティ ンリ ツチ ドメ ィ ンを含む新規機能夕 ンパク質をコ一 ドしてい ることばかりでなく 、 セリ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンが酵素活性を持 つた機能タンパク質であることが明らかとなった。
本発明における新規機能タンパク質は、 一次構造上複合的な機能 を有することが明らかであるばかりでなく 、 その複合的な機能を通 して脳内の生理機能に一定の役割を果たしている。 したがって、 本 発明のマウス B S S P— 3 c D N Aおよびマウス B S S P— 3 c D N Aがコー ドしている新規機能タ ンパク質は、 各種マウス疾患 モデルの病態解析に有用な手段を提供するものである。 また、 病態 解析を通じて得られた疾患治療のための有用な情報を基に、 本発明 のヒ ト B S S P— 3 c D N Aおよびヒ ト B S S P— 3 c D N A がコー ドしている新規機能タンパク質は、 各種疾患治療剤をスク リ 一二ングする手法を提供するものであり、 さ らに実際のヒ ト疾患治 療薬の開発に適用すること も可能である。
その治療法と しては、 遺伝子組換え体投与による補充治療ならび にセンス又はア ンチセンス法による遺伝子発現促進又は抑制治療が 挙げられる。 さ らに、 新規機能タ ンパク質の各 ドメ イ ン構造のそれ ぞれは、 単独で機能することもまた可能である。 したがって、 各 ド メ イ ン構造を個別に発現させた後、 各 ドメ イ ン構造と相互作用を示 す分子を特定することができる。 また、 特定した分子群の疾患への 関与を調べることにより、 遺伝子組換え体投与による補充治療なら びにセンス又はア ンチセ ンス法による遺伝子発現促進又は抑制治療 も可能である。
以下、 実施例に基づいて本発明を説明する。
本発明においては、 新規セリ ンプロテアーゼをコ一 ドする D N A のヌ ク レオチ ド配列と して図 1〜 6 (配列番号 ： 3 ) および図？ 〜
1 2 (配列番号 ： 5 ) に示すヌ ク レオチ ド配列を開示するが、 本発 明のセリ ンプロテア一ゼの D N Aはこれに限定されない。 一旦、 天 然セリ ンプロテア一ゼのァ ミ ノ酸配列が決定されれば、 コ ドンの縮 重に基き、 同じァ ミ ノ酸配列をコー ドする種々のヌ ク レオチ ド配列 を設計し、 それを調製することができる。 この場合、 使用すべき宿 主により高頻度で用いられるコ ドンを使用するのが好ま しい。
本発明の天然セリ ンプロテア一ゼをコ一 ドする D N Aを得るには 、 実施例に記載する様にして c D N Aを得ることができるが、 これ に限定されない。 すなわち、 天然セリ ンプロテア一ゼのァ ミ ノ酸配 列をコー ドする 1 つのヌ ク レオチ ド配列が決定されれば天然セリ ン プロテアーゼをコ一 ドする D N Aは、 本発明に具体的に開示するス トラテジ一とは異なるス トラテジ一により c D N Aと してクロ一二 ングすることができ、 さ らにはそれを生産する細胞のゲノムからク ローニングすることもできる。
例えば、 実施例 1 に示すような D N A (ヌ ク レオチ ド） プライマ 一を用いるポリ メ ラ一ゼ連鎖反応法 （ P C R ) により ク ロ一ニング することができる。
本発明の D N Aはさ らにセ リ ンプロテア一ゼ活性を有する蛋白ま たは糖蛋白をコー ドし、 図 1〜 6 (配列番号 ： 3 ) または図 7〜 1 2 (配列番号 ： 5 ) のヌ ク レオチ ド配列とハイブリ ダィズする D N Aも含まれる。 また、 ハイブリ ダィゼー シ ヨ ンの一般的方法は当業 者においてよく知られており （例えば、 実験医学臨時増刊号、 羊土 社、 "バイオテク ノ ロジ一実験法シ リ ーズ遺伝子工学総集編" 、 Vo 1. 5， No. 1 1 , 2 4 - 6 0 , 1 9 8 7 ) 、 活性測定もまた当業者 によく知られている。
ゲノ ムからクローニングする場合、 実施例において使用 した種々 のプライマ一ヌ ク レオチ ド又はプローブヌ ク レオチ ドを、 ゲノム D N A断片の選択のためプローブと して使用することができる。 また 、 図 1〜 6 (配列番号 ： 3 ) または図？ 〜 1 2 (配列番号 ： 5 ) に 記載するヌ ク レオチ ド配列に基いて設計された他のプローブを用い ることもできる。 ゲノ ムから目的とする D N Aをクローニングする ための一般的方法は当業界においてよく知られている （Current Pr otocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons社、 第 5章及び 第 6章） 。
本発明の天然セリ ンプロテア一ゼをコ一 ドする D N Aはまた、 ィ匕 学合成によっても調製することができる。 D N Aの化学合成は当業 界において自動 D N A合成機、 例えばアプライ ドバイオシステム社
3 9 6 D N A/RN A合成機など採用 して容易である。 従って、 当 業者は、 図 1 〜 6 (配列番号 ： 3 ) または図 7 ~ 1 2 (配列番号 ：
5 ) に示されるヌ ク レオチ ド配列の D N Aを容易に合成することが できる。
本発明の天然型セリ ンプロテアーゼを生来のコ ドンとは異なるコ ドンにより コー ドする D N Aは、 前記のごと く化学合成により調製 することもでき、 また図 1 ~ 6 (配列番号 ： 3 ) または図？〜 1 2 (配列番号 ： 5 ) に示すヌ ク レオチ ド配列を有する D N A又は R N Aを铸型と して変異誘発プライマ一と共に用いる部位特定変異誘発 法 ( s i t e— d i r e c t e d m u t a g e n e s i sノ 等 法に従って得ることもできる （例えば、 Current Protocols In Mol ecular Biology, John Wi ley k Sons社、 第 8章を参照のこと） 。
こう して、 一旦ァ ミ ノ酸配列が決定されれば、 この天然ァ ミ ノ酸 配列に 1 〜複数のァ ミ ノ酸が付加されておりなおセリ ンプロテア一 ゼ活性を維持しているポリべプチ ド、 前記天然ァ ミ ノ酸配列から 1
〜複数個のァ ミ ノ酸が除去されておりなおセリ ンプロテア一ゼ活性 を維持しているポリペプチ ド、 前記天然ア ミ ノ酸配列中の 1 〜複数 個のア ミ ノ酸が他のア ミ ノ酸により置き換えられておりなおセリ ン プロテアーゼ活性を維持しているポリペプチ ド、 さ らには、 上記の ア ミ ノ酸付加変異、 ア ミ ノ酸除去変異及びア ミ ノ酸置換変異が組合 わされた変異を有しなぉセリ ンプロテアーゼ活性を維持しているポ リペプチ ドなど、 種々の変異型セリ ンプロテア一ゼを設計し、 それ を製造することができる。
上記ァ ミ ノ酸の付加、 除去及び置換等の変異におけるァ ミ ノ酸の 数は、 特に限定されないが、 付加については、 例えば、 本発明のセ リ ンプロテアーゼとのハイプリ ッ ド蛋白に用いられる機能性蛋白の ア ミ ノ酸の数 （例えば、 マル トースバイ ンディ ングプロテイ ン （ m a 1 t o s e — b i n d i n g r o t e i n ) 等の公知の抽出 精製も し く は安定化用蛋白または各種生理活性蛋白ゃ本セリ ンプロ テア一ゼに付加されたシグナルべプチ ドのそれに依存し、 すなわち 、 当該変異の目的に依存して決定される。 例えば、 1 〜 5 0 、 好ま しく は、 1 〜 1 0の付加があげられる。
また、 除去については、 除去されるア ミ ノ酸の数は、 セリ ンプロ テアーゼ活性が維持されるように設計、 決定され、 例えば、 1 〜 3 0、 好ま しく は 1 〜 2 0、 また、 本セリ ンプロテア一ゼの活性領域 以外の領域のア ミ ノ酸の数があげられる。 さ らに、 置換については 、 置換されるア ミ ノ酸の数は、 セリ ンプロテア一ゼ活性が維持され るように設計、 決定され、 例えば、 1 〜 1 0、 好ま し く は、 1 〜 5 があげられる。
また、 本発明においては、 図 1 ~ 6 (配列番号 ： 4 ) または図 7 〜 1 2 (配列番号 ： 6 ) に示すそれぞれア ミ ノ酸番号 5 1 7 から 7 6 1 までまたは 5 7 8から 8 2 2 までのア ミ ノ酸配列からなるセリ ンプロテア一ゼ ドメ イ ン、 図 1 〜 6 (配列番号 ： 4 ) または図？〜 1 2 (配列番号 ： 6 ) に示すそれぞれア ミ ノ酸番号 8 5 から 1 5 7 までまたは 4 0カヽら 1 1 2 までのア ミ ノ酸配列からなるク リ ングル ドメ イ ン、 または図 1 〜 6 (配列番号 ： 4 ) または図？〜 1 2 (配 列番号 ： 6 ) に示すそれぞれア ミ ノ酸番号 1 6 6 から 2 6 6 まで、 番号 2 7 3から 3 7 2 までもしく は番号 3 8 6から 4 8 6 までまた は番号 1 1 7から 2 1 7 まで、 番号 2 2 7から 3 2 7 まで、 番号 3 3 4カヽら 4 3 3 まで、 も しく は番号 4 4 7から 5 4 7 までのァ ミ ノ 酸配列からなるスカベンジ ャー レセプター システィ ンリ ツ チ （ S R C R ) ドメ イ ンを提供し、 これら ドメ イ ンの作製は、 後記する方法 またはそれ自体公知のぺプチ ド合成法も しく は適当なプロテア一ゼ による該セリ ンプロテア一ゼの切断により行う ことができ、 また本 発明の ドメ イ ンの活性を維持する変異型 ドメ イ ンまたはそれをコ一 ドする D N Aも同様に作製することができる。
上記のようにして本発明のセリ ンプロテアーゼまたは ドメ イ ンの D N Aが得られると、 これを用いて、 常用の遺伝子組換え法により 組換えセリ ンプロテア一ゼまたは ドメ イ ンを製造することができる 。 すなわち、 本発明のセリ ンプロテアーゼまたは ドメ イ ンをコー ド する D N Aを適当な発現ベクターに揷入し、 該発現べクタ一を適当 な宿主細胞に導入し、 該宿主細胞を培養し、 そして得られた培養物 (細胞又は培地） から目的とするセ リ ンプロテア一ゼまたは ドメ イ ンを摂取する。
本発明のセリ ンプロテア一ゼまたは ドメ イ ンは、 生化学的又は化 学的な修飾、 例えば、 N末端ァ シル化、 例えばホル ミ ル化、 ァセチ ル化などの C 了シル化または欠失等がされた形で得られてもよ い。 発現系は、 シグナル配列の付加、 改良や宿主の選択によって分 泌効率及び発現量の向上を図ること もできる。 シグナル配列の付加 及び改良手段と しては、 他の構造べプチ ドのシグナルべプチ ドをコ 一ドする遺伝子を本発明のセリ ンプロテア一ゼまたは ドメ イ ンの構 造遺伝子 5 ' 側上流に、 切断可能な部分ペプチ ドをコー ドする遺伝 子を介するように連結する方法が挙げられる。 具体的例示と しては 、 実施例 4 に記載した ト リプシン遺伝子のシグナル配列およびェン テロキナーゼ認識配列をコー ドする遺伝子を用いる方法があげられ る。
宿主と しては原核生物又は真核生物を用いることができる。 原核 生物と しては細菌、 特に大腸菌 （ E s c h e r i c h i a c o l 丄） 、 バシルス属 (B a c i l l u s ) 細菌、 例えばバシルス · ズ プチリ ス （旦. s u b t i 1 i s ) 等を用いることができる。 真核 生物と しては酵母、 例えばサッカロ ミ セス ( S a c c h a r o m y c e s ) 属酵母、 例えばサッカロ ミ セス ' セレピシェ一 （ . s e r e V i s i a e ) 、 等の真核性微生物、 昆虫細胞、 例えば、 ヨガ 細胞 S— p o d o p t e r a f r u g i p e r d a ) 、 キヤへッ ルーパー細胞 （ T_r i— c h ο ρ 1 u s i a n i ) 、 カイ コ細胞 （ B o m b y x m o r i ) 、 動物細胞、 例えばヒ ト細胞、 サル細胞 、 マウス細胞等、 具体的には、 C O S— 1細胞、 V e r o細胞、 C H 0細胞、 L細胞、 ミエローマ細胞、 C 1 2 7細胞、 B A L BZ c 3 T 3細胞、 S p— 2 ZO細胞等を使用することができる。 本発明 においてはさ らに、 生物体それ自体、 例えば昆虫、 例えばカイ コ、 キヤべツル一パ一等を用いることもできる。
発現べクタ一と しては、 プラス ミ ド、 ファージ、 フ ァージ ミ ド、 ウ ィ ルス （バキュロ （昆虫） 、 ワ クチニァ （動物細胞） ） 等が使用 できる。 発現べクタ一中のプロモータ一は宿主細胞に依存して選択 され、 例えば細菌用プロモータ一と しては 1 a cプロモーター、 t r プロモータ一等が使用され、 酵母用プロモータ一と しては、 例 えば、 a d h l プロモータ一、 p q kプロモータ一等が使用される また、 昆虫用プロモータ一と してはバキュロウ ィ ルスポリへ ドリ ンプロモーター等、 動物細胞と しては S i m i a n V i r u s 4 0の e a r 1 yもしく は 1 a t eプロモー夕一、 CMVプロモータ 一、 H S V— T Kプロモーターまたは S R aプロモータ一等があげ られる。 また、 発現べクタ一には、 以上の他にェンハンサ一、 スプ ライ シングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一力一 （例えば ジ ヒ ド口葉酸還元酵素遺伝子 （メ ト ト レキセー ト耐性） 、 n e 0遺 伝子 （ G 4 1 8耐性） 等） 等を含有しているのを用いるのが好ま し い。 なお、 ェンハンサ一を使用する場合、 例えば S V 4 0のェンハ ンサ一等を遺伝子の上流または下流に挿入する。
発現ベクターによる宿主の形質転換は、 当業界においてよく知ら れている常法により行う ことができ、 これらの方法は例えば、 Curr ent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons社、 に 己 載されている。 形質転換体の培養も常法に従って行う ことができる o 培養物からのセリ ンプロテア一ゼまたは ドメ イ ンの精製は、 タ ン パク質を単離 · 精製するための常法に従って、 例えば、 限外濾過、 各種カラムクロマ トグラフィ 一、 例えばセファロ一スを用いるク ロ マ 卜グラフィ 一等により行う ことができる。
このようにして得られる本発明のセリ ンプロテア一ゼまたは ドメ イ ンは、 機能的タンパク質であることから、 病態解析に有用な手段 を提供し、 本タンパク質を用いる生理活性物質のスク リ ーニングを 可能と し、 当該スク リ ーニング方法は、 各種疾患治療剤の探索研究 に有用である。 スク リーニング方法の具体例と して、 例えば、 ぺプ チ ド、 タ ンパク質、 非ペプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物 のような、 または、 各種細胞培養上清等より得られる天然成分、 各 種合成化合物等の人工成分のような被験試料の生理活性の測定を行 なう ことにより、 例えばセリ ンプロテア一ゼ阻害物質の場合は、 実 施例 4 と同様にして、 行う ことができる。
また、 本発明のセリ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンも しく はそれらの 部分べプチ ドまたは前記したセ リ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンも しく はそれらの部分べプチ ドをコ一 ドする D N Aで形質転換された宿主 も しく はその細胞膜画分を使用する上記生理活性測定、 結合親和性 測定等も本発明のスク リ ーニング方法の好ま しい実施態様である。
また、 本発明のセリ ンプロテアーゼ、 ドメ イ ンまたはその部分べ プチ ドをコ一 ドする D N Aは、 遺伝子組換体投与による補充治療な らびにセンスまたはアンチセンス法による遺伝子発現促進または抑 制治療や生体内生理機能解明の有用な手段と して提供され、 解明さ れた情報を基に新規医薬のスク リ ーニングにも用いられる。
さ らにまた、 本発明のセリ ンプロテア一ゼ、 ドメイ ンも し く はそ の部分べプチ ドまたはそれらをコー ドする D N Aは、 上記スク リ ー ニング方法を実施する際に用いうる形態でキッ トと して提供できる 部分べプチ ドと しては、 活性部位のセリ ン残基の近傍に存在する ぺプチ ド断片および本発明のセリ ンプロテア一ゼまたは ドメ イ ンに 特異的な抗体の認識部位となり得るぺプチ ド断片などの本発明のセ リ ンプロテアーゼに特有の領域からなるぺプチ ド断片を挙げること ができる。 なお、 該部分ペプチ ドの作成は、 本発明のセリ ンプロテ ァーゼまたは ドメ ィ ンについて前記した方法またはそれ自体公知の ぺプチ ドの合成法も しく は適当なプロテア一ゼによる該セリ ンプロ テア一ゼまたは ドメ ィ ンの切断により行なう ことができる。 また、 上記の細胞膜画分は、 本発明のセリ ンプロテアーゼ、 ドメ ィ ンまたはその部分べプチ ドをコ一 ドする D N Aを発現し得る宿主 細胞を、 発現が可能な条件下培養し、 得られたセ リ ンプロテアーゼ 、 ドメ イ ンまたはその部分ペプチ ドを含有する宿主細胞をそれ自体 公知の方法で破砕した後、 得られる細胞膜が多く含まれる画分のこ とをいう。
本発明のセリ ンプロテアーゼ、 ドメ ィ ンまたはその部分べプチ ド を用いる生理活性物質のスク リ ーニング方法は、 本発明のセリ ンプ 口テア一ゼ、 ドメイ ンも しく はその部分べプチ ドも しく はそれらを コー ドする D N Aまたは該セリ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンも し く は その部分べプチ ドを含有する宿主細胞も しく はその細胞膜画分を用 いて、 被検試料をスク リーニングすることにより行なわれる。 具体 的方法と して、 本発明のセリ ンプロテア一ゼ、 ドメイ ンおよびその 部分ペプチ ドの基質、 例えば、 発色基質等の合成基質、 放射性核種 により標識された基質等、 を用いる活性測定法や結合親和性測定法 により行なわれる。
なお、 セリ ンプロテア一ゼ、 ドメ イ ンまたはそれらの部分べプチ ドを含有する宿主細胞を用いる場合、 それ自体公知の方法で細胞を 固定化 （ダルタルアルデヒ ド、 ホルムアルデヒ ド等で） して用いる ことができる。 また、 該セリ ンプロテアーゼ、 ドメ イ ンまたはそれ らの部分ペプチ ドをコー ドする D N Aを用いる場合は、 遺伝子発現 促進または抑制を評価する手法、 例えばルシフ ラーゼ遺伝子等の レポーター遺伝子を用いて、 行う ことができる。
実施例
実施例 1 . プローブ用新規セ リ ンプロテア一ゼモチーフ c D N A のクーロ 一ニング ( 1 ) セ リ ンプロテアーゼ保存領域を用いた P C R
マウ ス脳 mR N Aの調製は、 R T G— T一 ！ r i m e d f i r s t — s t r a n d k i t ( P h a r m a c i a ) を用い一し添付 の文書に従って行った。 得られた mR N A 5 1 (約 6 ) にォ リ ゴ d Tプライマ一 2 〃 1 ( 1 〃 g ) を加え、 7 0 °Cで 1 0分間熱 した後、 氷中で急冷した。
この熱変性 mR N Aに、 4 〃 1 の 5 乂 ？ 1 5 s t r a n d b u f f e r ( 2 5 0 mM T r i s - H C l H 8. 3 , 3 7 5 m M K C 1 , 1 5 mM M g C 1 2 ) , l 〃 I 0 mM d N T P , 2 1 の 0. 1 M D T T, ジォチルピロカーボネー ト (D E P C) 処理した蒸留水および 5 / 1 ( 1 0 0 0 U) の S u p e r S c r i p t llR Tを加え、 3 7 °Cで 1時間反応させた。 こ う して得られた F i r s t s t r a n d c D N Aをテンプレー ト と してセ リ ンプロテア一ゼ保存領域を用いた P C Rを行なつた。 プライマーと して、 活性残基 （H i s ) 近傍のァ ミ ノ酸保存領域 ( N - V a 1 - L e u - T h r - A l a— A l a— H i s — C y s ) を基に配列番号 ： 1 に示すォリ ゴマ一 K Y 1 8 5 ( 5 ' — G T G
C T C A C N G C N G C B C A Y T G - 3 ' ) および 活性残基 （ S e r ) 近傍のア ミ ノ酸保存領域 （N - G 1 y— A s p — S e r— G l y— G l y— P r o— L e u ) を基に配列番号 ： 2 に示すオ リ ゴマー KY 1 8 9 ( 3 ' 一 C C V C T R A G D C C N C C N G G C G A— 5 ) をそれぞれ合成したものを用い た。 T a q D N A p o l y m e r a s e Am e r s h a m社 ) を用いて P C Rを行った後、 P C R反応液を p C R Ilベクタ一 （ I n V i t r o g e n社） にサブクロ一ニ ングした。
( 2 ) ス ク リ ーニ ング用マウス脳 m R N Aの単離精製
マウ ス脳 mR NAの調製は、 F a s t T r a c k mR N A I s o l a t i o n k i t ( I n v i t r o g e n社） を用いて 添付の文書に従って行った。 すなわち、 摘出したマウスの全脳に 1 5 mlの L y s i s B u f f e rを加え、 テフ ロ ンホモジナイザー でただちにホモジナイズした。 ホモジナイズした組織は、 注射筒を 用いて 2 1 ゲージの注射針に 3回通したのち、 5 0 mlの遠心管に入 れ、 4 5 °Cの水浴中で 1時間イ ンキュベーシ ョ ン した。
イ ンキュべ一ショ ン後、 4 0 0 0 X gで 5分間遠心して得られた 上清を別の 5 0 mlの遠心管に入れ、 そこに 5 M N a C 1溶液を 9 5 0 〃 1加えた後、 再び注射筒を用いて 2 1 ゲージの注射針に 3回 通した。 次に、 この溶液にオリ ゴ （ d T ) セルロースを 1錠加え、 2分間膨潤させた後、 1 時間ゆっ く り振動させた。 1時間後、 2 , 0 0 0 X gで 5分間遠心し、 上清を吸引 した後、 2 0 mlの結合緩衝 液に懸濁後、 遠心した沈渣をさ らに 1 0 mlの結合緩衝液で洗浄した 次に、 1 0 mlの低塩濃度洗浄液で 3回洗浄した。 最終洗浄後、 ォ リ ゴ （ d T) セルロースを 8 0 0 // 1 の低塩濃度洗浄液に懸濁し、 スピンカラムに入れ、 5 0 0 0 X gで 1 0秒間の遠心洗浄を 3回繰 り返した。 洗浄後、 2 0 0 の溶離緩衝液を加え、 5 0 0 0 x g で 1 0秒間の遠心を 2回繰り返すことにより 4 0 0 1 の mR N A 溶液を得た。 m R N A溶液から常法に従い、 エタノール沈殿により mR N Aを回収し、 2 0 1 の D E P C処理した蒸留水に溶解した
( 3 ) c D N Aライ ブラ リ ーからのスク リ ーニング
く工程 1 > c D N Aの合成
実施例 1 ( 2 ) で得られた m R N A 5 / 1 (約 6 // g ) にオリ ゴ d T N o t l プライマ一 2 / 1 ( l g) を加え、 7 0 °Cで 1 0 分間熱した後、 氷中で急冷した。 この熱変性 mR N Aに、 4 1 の 5 x 第一鎖緩衝液 （ 2 5 0 mM T r i s - H C 1 H 8. 3 ， 3 7 5 mM K C 1 , 1 5 mM M g C l 2 ) , 1 /z l の 1 0 m M d N T P , 2 1 の 0. 1 M D T T, D E P C処理した蒸留 水および 5 / 1 ( 1 0 0 0 U) の S u p e r S c r i p t lIR T を加え、 3 7 °Cで 1 時間反応させた。
次に、 この反応液に 9 1 1 の D E P C処理した蒸留水、 3 0 a
1 の 5 X第二鎖緩衝液 （ 1 0 0 mM T r i s — H C 1 H 6.
9， 4 5 0 mM K C 1 , 2 3 mM Μ g C 1 2 , 0. 7 5 m Μ
/3 - Ν A D + , 5 0 mM (N H 4 ) 2 S〇 4 ) ， 3 〃 1 の l O mM d N T P , 1 1 ( 1 0 U) の大腸菌 D N A リ ガ一ゼ、 4
1 ( 4 0 U) の大腸菌 D N A ポリ メ ラーゼおよび 1 〃 1 ( 2 U ) の大腸菌 RN a s e Hを加え、 1 6 °Cで 2時間反応後、 2
1 ( 1 0 U ) の T 4 D N A ポリ メ ラ一ゼを加え 1 6 °Cで 5分間 反応させた。
さ らに、 この溶液に 1 0 〃 1 の 0. 5 M E D T Aを加えて混合し た後、 1 5 0 fi 1 のフ エ ノ ール ： ク ロ 口ホルム ： イ ソア ミ ノレアルコ —ル （ 2 5 ： 2 4 ： 1 ) を加え、 撹拌後 1 5， 0 0 0 rpm で 5分間 遠心し、 上清を回収した。 得られた上清に、 1 0 1 の 5 M K 0 A c , 4 0 0 〃 1 のエタ ノ ールを加え撹拌し、 1 5， O O O rpm で 1 0分間遠心した。 遠心して得られた沈殿物を 5 0 0 1 の 7 0 % エタノールで洗い、 軽く風乾後、 2 5 〃 1 の D E P C処理した蒸留 水に溶解した。
く工程 2〉 E c 0 R I アダプタ一の付加
前工程で得られた 2本鎖 c D N A 2 5 1 に 1 0 1 の 5 x T 4 D N A 連結緩衝液 （ 2 5 0 mM T r i s — H C 1 p H 7. 6 , 5 0 mM M g C 1 2 , 5 mM A T P , 5 m M D T T, 2 5 % ( w/ v ) , P E G 8 0 0 0 ) , E c o R I アダプタ一溶液 1 0
2 o H 1 ( 1 0 〃 g) および 5 〃 1 ( 5 U) の T 4 D N A 1 i g a s eを加え、 1 6 °Cにて 1 6時間反応後、 5 0 1 のフ ヱノール ： ク ロ口ホルム ： イ ソア ミルァノレコ一ノレ （ 2 5 ： 2 4 ： 1 ) を加え、 撹拌後 1 5， 0 0 0 rpm で 5分間遠心し、 上清を回収した。 回収し た上清に、 5 〃 1 の 5 M K 0 A c , 1 2 5 z l のエタノールを加 え撹拌し、 一 8 0 °C， 2 0分間冷却後、 1 5， 0 0 0 rpm で 1 0分 間遠心した。 遠心して得られた沈殿物を 2 0 0 z l の 7 0 %ェタノ —ルで洗い、 軽く風乾後、 4 0 y l のD E P C処理した蒸留水に溶 解した。
〈工程 3 > A g t 1 0 とのライゲ一シヨ ン
サイズ分画した c D N A溶液 3 mlに； I g t 1 0 (E c o R I 切断） 1 1 ( 5 0 ng) を加え、 1 1 〃 1 の D E P C処理した蒸留 水、 4 /z l の 5 X T 4 D N A 連結緩衝液、 の 5 X T 4 D N A リガ一ゼを加え室温で 3時間反応させた。 フヱノール ： ク ロロホルム ： イ ソア ミノレァノレコ一ノレ （ 2 5 ： 2 4 ： 1 ) 抽出を行い 、 5 1 ( 5 〃 g) の y e a s t t R N A , 5 1 の 51^? 〇 八 cおよび 1 2 5 1 のエタノールを加え撹拌し、 一 8 0 °C 2 0分間 冷却後、 1 5， 0 0 0 rpm で 1 0分間遠心した。 遠心して得られた 沈殿物を 2 0 0 a 1 の 7 0 %エタノールで洗い、 軽く風乾後、 5 1 の T E ( 1 0 mM T r i s — H C 1 H 8. 0， 1 mM E D T A) に溶解した。
く工程 4〉 パッケージング
工程 3で得られたライゲーシ ヨ ン後 c D NAを G i g a p a c k P a c k a g i n g E x t r a c t s ( S t r a t a g e n e ) を用いてパッケージングした。 すなわち、 0. 1 〃 g Z〃 1 のラ ィゲ一シ ヨ ン後 c D N A溶液 1 β 1 にキッ ト添付の F r e e z e — t h a w E x t r a c t 1 0 /z l を加えた後、 さ らに、 キッ ト 添付の S o n i c E t r a c t 1 5 〃 1 を直ちに加えよく撹 拌した。 室温で 2時間放置後、 5 0 0 1 のフ ァージ希釈緩衝液 （ 1 0 0 mM N a C l , 1 0 m M M g S 04 , 5 0 mM T r i s /H C l p H 7. 5， 0. 0 1 % ゼラチン） を加え、 さ らに
、 2 0 1 のクロ口ホルムを加えた。 よく 混和した後、 室温で 1 5 0 0 0 rpm , 5分間遠心した上清を回収し、 フ ァージ液を得た。 常 法に従い、 このフ ァージ液はタイ ト レーンヨ ン後、 ホス ト大腸菌に 感染させた。
く工程 5〉 ライブラ リ 一のスク リ ーニング
実施例 1 ( 1 ) で得られた D N A断片を B c a B e s t D N A 1 a b e 1 i n g k i t ( T a k a r a ) を用いて α— 32 P d C T Pで標識し、 プローブを作製した。 このプローブを用い、 前 工程で得られた約 4 0万ク ロー ンの c D N Aライブラ リ ーをスク リ 一二ングした。 その結果、 約 4 0万個のク ローンから、 揷入 D N A 断片の最も長いクロー ン P U C 1 8 /m B S S P - 3 / l - 1 を得 た。
p U C 1 8 Zm B S S P— 3 Z l — l の c D N Aの全長は 2， 5 9 7塩基対で、 2 4 4塩基対の 5 ' 非翻訳領域、 2 2 8 3塩基対の 翻訳領域、 7 0塩基対の 3 ' 非翻訳領域から成り、 その翻訳領域は セリ ンプロテアーゼドメ イ ン （ア ミ ノ酸番号 ： 5 1 7〜 7 6 1 ) を コー ドするばかりでなく ク リ ングル ドメ イ ン （ア ミ ノ酸番号 ： 8 5 〜 1 5 7 ) ならびにスカベンジ ャー レセプターシスティ ン リ ッ チ ド メ イ ン （ア ミ ノ酸番号 ドメ イ ン 1 ： 1 6 6 — 2 6 6、 ドメ イ ン 2 : 2 7 3 — 3 7 2、 ドメ イ ン 3 : 3 8 6〜 4 8 6 ) を含む新規機能 タ ンパク質をコー ドしていることが明らかとなった。 p U C 1 8 / m B S S P— 3 / 1 ― 1 の c D N Aの塩基配列および対応するア ミ ノ酸配列を図 1 ~ 6 (配列番号 ： 3 ) に示した。 実施例 2. m B S S P— 3の N o r t h e r n b 1 o t t i n gによる発現部位の検討
マウス脳の t o t a 1 R N Aは、 ト リ ゾル試薬 （ライ フテク ノ 口ジ一） を用いて添付の文書に従って調製した。 すなわち、 マウス の大脳、 脳幹、 小脳および延髄を摘出したのちポリ ト ロンでただち にホモジナイズし、 組織容量の 1 0倍量 （約 3 ml) の 卜 リ ゾル試薬 を加えることにより組織を溶解した。 さ らに、 ク ロ口ホルム 6 0 0 1 を加えて撹拌し、 1 5， 0 0 0 rpm , 4 °Cで 1 5分間遠心した 。 遠心後、 水相を回収し、 回収した水相に 1 5 0 0 1 のイ ソプロ パノールを加えて撹拌し、 1 5 , 0 0 0 rpm , 4 °Cで 3 0分間遠心 した。
得られたマウスの脳の各部位の全 RN Aの沈殿を 4 0 0 1 の D E P C処理した蒸留水に溶解した後、 常法に従いメ ンブラ ンフィ ル ターにプロ ッ ト した。 次に、 p U C 1 8 /m B S S P - 3 / l - l を制限酵素 E c 0 R Iで消化し、 約 2. 7 kbp の D N A断片を単離 ' 精製し、 前述の方法でひ -32 P d C T Pで標識することによ りプローブを作製した。
このプローブを前述のマウス脳各部位から調製した t 0 t a 1 RN Aをブロ ッ 卜 したメ ンブラ ンフ ィルタ一および市販の各種臓器 から調製した m R N Aをブロ ッ 卜 したメ ンブラ ンフ ィ ルター （クロ ンテッ ク社） と 5 5 °Cで一晩ハイブリ ダィズさせた後、 それぞれの メ ンブラ ンフ ィ ルターを 0. 1 % S D Sを含む 2 x S S C ( 1 5 0 m M N a C 1 , 1 5 m M S o d i u m c i t r a t e ) で室 温、 2 0分間、 続いて、 0. l x S S C, 0. 1 % S D Sに替え 6 5 °C, 3 0分間で 2回洗い、 B A S 2 0 0 0用イメージングプレー ト （富士写真フ ィ ルム） に 3 0分間露光させた。
その結果を図 1 3 に示した。 各臓器の発現では、 脳、 肺および腎 臓で発現していることが確認された。 脳の各部位では、 大脳および 脳幹で強い発現を認め、 また、 延髄でも弱い発現を認めたが、 小脳 での発現は認められなかった。 発現は、 いずれの場合も約 2 . 7 kb の大き さのみであった。
実施例 3 . ヒ ト B S S P— 3 c D N Aのク ローニング
ヒ ト脳 c D N Aライブラ リ一は、 ク ロンテッ ク社より購入した。 マウス B S S P — 3 c D N A断片をグルタールアルデヒ ドを用い て蛍光標識し、 プローブを作製した。 このプローブを用い、 約 4 0 万ク ロー ンのヒ ト脳 c D N Aライブラ リ一をスク リ一ニングした結 果、 p U C 1 8 / h B S S P — 3 を得た。
p U C 1 8 / h B S S P — 3 c D N Aの翻訳領域は、 マウス B S S P — 3 c D N Aと同様にセリ ンプロテアーゼ ドメ イ ン （ア ミ ノ酸番号 ： 5 7 8〜 8 2 2 ) をコー ドするばかりでなく ク リ ングル ドメ イ ン （ア ミ ノ酸番号 ： 4 0〜 1 1 2 ) ならびにスカベンジ ャー レセプターシスティ ンリ ッチ ドメ イ ン （ア ミ ノ酸番号 ドメ イ ン 1 : 1 1 7〜 2 1 7 、 ドメ イ ン 2 : 2 2 7〜 3 2 7 、 ドメ イ ン 3 : 3 3 4〜 4 3 3 、 ドメ イ ン 4 ： 4 4 7 - 5 4 7 ) を含む機能タ ンパク 質をコ一 ドしていることが明らかとなった。
しかしながら、 マウス B S S P — 3 c D N Aの一次構造から予 想されるものとは明らかに異なり、 スカベンジ ャーレセプターシス ティ ンリ ッチ ドメ イ ンがマウス B S S P — 3では 3つであるのに対 して、 ヒ ト B S S P — 3 は 4つであることが明らかとなった。 p U C 1 8 / h B S S P - 3の塩基配列および対応する Ύ ミ ノ酸配列を 図？〜 1 2 (配列番号 ： 5 ) に示す。
実施例 4 . ヒ ト B S S P — 3 c D N Aがコー ドする新規セ リ ン プロテア一ゼ成熟タンパク質の酵素活性の測定
( 1 ) 発現ブラス ミ ドの構築 p U C l 8 Zh B S S P— 3の D N A断片と p d K C Rベクター D N A断片を常法に従いライゲーシヨ ンし、 大腸菌 J M 1 0 9を形 質転換させ、 生じたコロニーを P C R法により解析して目的とする セリ ンプロテア一ゼ h B S S P— 3発現プラス ミ ド p d K C R/ h B S S P— 3を得た。
次に、 ト リプシ ン 11の開始メチォニンに続く シグナル配列ならび にェンテロキナーゼ認識配列をコ一ドする遺伝子を増幅し、 かつ 5 ' 側上流に E c 0 R I， 3 ' 側下流に B s p M I制限酵素認識部位 を付加するようにプライマ一を設計した。 これらプライマーを用い 、 p C R/T r y s i n ilプラス ミ ドをテンプレー トと した P C Rを行い、 その産物を制限酵素 （E c o R I および B s p M I ) で消化後、 約 7 5 bpの D N A断片を単離 ' 精製した。 同様に、 ヒ ト B S S P— 3の成熟タンパク質をコ一 ドする D N Aの上流に B s p M I 制限酵素認識部位を付加するようにデザイ ンしたプライマ 一を用い、 p d K C R/h B S S P— 3をテ ンプレー トと した P C Rを行い、 その産物を制限酵素 （B s p M I および B p u 1 1 0 2 I ) で消化後、 D N A断片を単離 ' 精製した。
次に、 得られた ト リプシン 11のシグナル配列ならびにェンテロキ ナ一ゼ認識配列をコ一 ドする D N A断片と ヒ ト B S S P— 3の成熟 タンパク質をコー ドする D N A断片を、 常法に従い、 制限酵素 （B s p M l および B p u 1 1 0 2 1 ) で前消化した （11：。 1¾ h B S S P— 3ベクタ一にライゲーシ ヨ ンし、 大腸菌 J M 1 0 9を 形質変換させた。 形質変換したコロニーのうち目的とするキメ ラ D N Aを含むコロニーを P C R法により確認し、 発現プラス ミ ド （ p d K C R/T r p— h B S S P— 3 ) を得た。
( 2 ) C 0 S— 1細胞における発現
実施例 4 ( 1 ) で作製したキメ ラ遺伝子 D N Aをリ ボフ ヱクチン ( L i f e T e c h n o l o g i e s ) を用いて C O S— 1細胞 に トラ ンスフヱク シヨ ンした。 すなわち、 直径 1 0 cmの培養用ディ シュ （C o r n i n g, 4 3 0 1 6 7 ) に 1 0 %ゥ シ胎児血清を含 むダルべコの最少必須培地 （ D M E M， 日水製薬） で C 0 S— 1細 胞を 5 X 1 0 5 細胞植え込んだ。 翌日、 O p t i — M E M培地 （L i f e T e c h n o 1 o g i e s ) 5 mlで細胞をリ ンス した後、 新しい 5 mlの 0 p t i - M E M培地を加え、 3 7 °Cで 2時間培養し た。
培養後、 デイ シュ 1枚あたり、 上述のプラス ミ ド 1 〃 gおよびリ ポフヱクチン 5 gの混液を加え、 3 7 °Cで 5時間培養した。 培養 後、 O p t i — M E M培地を 5 ml加え、 合計 1 0 mlと し、 3 7 °Cで 7 2時間培養した。 培養後、 遠心操作により培養上清を集め、 酵素 活性の測定サンプルと した。 また、 コ ン トロールと して、 発現ブラ ス ミ ド p d K C Rのみを C O S— 1細胞に ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン し た培養上清も調製した。
( 3 ) 酵素活性の測定
実施例 4 ( 2 ) で得られた培養上清中の酵素活性を測定した。 す なわち、 C O S— 1細胞の培養上清 4 5 1 にェンテロキナーゼ （ 1 0 mg/ ml, B i o z y m e L a b o r a t o r i e s ) 5 μ. 1 を混和し、 3 7 °Cで 2時間反応させた。 次に、 D M S 0に溶解した 合成基質 B o c— P h e— S e r一 A r g— MC A (ペプチ ド研究 所） を 0. 1 M T r i s /H C l ， p H 8. 0で希釈した 0. 2 mM基質溶液を 5 0 1加え、 4 °Cで 1 6時間反応させた。 反応後、 励起波長 4 8 5 nm、 蛍光波長 5 3 5 nmにおける蛍光を測定した。 そ の結果、 T r p— h B S S P— 3を発現した C O S— 1細胞の培養 上清をェンテロキナーゼ消化した時にのみ、 酵素活性を認めた。 以上の結果から、 ヒ ト B S S P— 3のセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンは、 酵素活性を持つ機能夕 ンパク質であることが明らかとなつた
発明の効果
本発明者らは、 マウス脳 c D N Aライブラ リ ーから新規セリ ンプ 口テアーゼ ドメ ィ ンばかりでなく新規ク リ ングル ドメ イ ンならびに 新規スカベンジャーレセプ夕一システィ ンリ ツチ ドメ ィ ンを含む新 規機能タンパク質をコー ドするマウス B S S P— 3 c D N Aを単 離した。 単離したマウス B S S P— 3 c D N Aは、 1 つのク リ ン グル ドメ イ ン、 3つのスカベンジ ャー レセプターシスティ ン リ ツ チ ドメ イ ンおよび 1 つのセリ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンをコー ドしてい た。 また、 単離したマウス B S S P— 3 mR N Aの発現部位の検 討結果から、 本発明者らは、 マウス B S S P— 3 mR N Aが脳に 強く発現していること、 脳のうち特に大脳および脳幹で強く発現し ていることを明らかにした。
次に、 マウス B S S P— 3 c D N Aをプローブにして、 ヒ ト脳 c D N Aライブラ リ ーからヒ ト B S S P— 3 c D N Aを単離する ことに成功した。 その結果、 本発明者らは、 ヒ ト B S S P— 3 c D N Aがマウス B S S P— 3 c D N Aの一次構造から予想される ものとは明らかに異なり、 1 つのク リ ングル ドメイ ン、 4つのスカ ベンジャー レセプター システィ ン リ ッ チ ドメ イ ンおよび 1 つのセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンをコー ドしていることを明らかにした。 さ らに本発明者らは、 ヒ ト B S S P— 3 c D N Aのうちセ リ ン プロテア一ゼ成熟タ ンパク質をコ一 ドする D N Aを C O S— 1 細胞 で発現したところ、 明らかに酵素活性を持つ機能タ ンパク質である ことを明らかにした。 本発明における新規機能タ ンパク質は、 一次 構造上複合的な機能を有することが明らかであるばかりでなく 、 そ の複合的な機能を通して脳内の生理機能に一定の役割を果たしてい る。 したがって、 本発明のマウス B S S P— 3 c D N Aおよびマ ウス B S S P— 3 c D N Aがコー ドしている新規機能タ ンパク質 は、 各種マウス疾患モデルの病態解析に有用な手段を提供する もの である。
また、 病態解析を通じて得られた疾患治療のための有用な情報を 基に、 本発明のヒ ト B S S P— 3 c D N Aおよびヒ ト B S S P— 3 c D N Aがコー ドしている新規機能タ ンパク質は、 各種疾患治 療剤をスク リ一ニングする手段を提供する ものであり、 さ らに実際 のヒ ト疾患治療薬の開発に適用することも可能である。 その治療法 と しては、 遺伝子組換え体投与による補充治療ならびにセンス又は ア ンチセ ンス法による遺伝子発現促進又は抑制治療が挙げられる。 さ らに、 新規機能タ ンパク質の各 ドメ イ ン構造のそれぞれは、 単 独で機能することもまた可能である。 したがって、 各 ドメ イ ン構造 を個別に発現させた後、 各 ドメ イ ン構造と相互作用を示す分子を特 定することができる。 また、 特定した分子群の疾患への関与を調べ ることにより、 遺伝子組換え体投与による補充治療ならびにセ ンス 又はア ンチセンス法による遺伝子発現促進又は抑制治療も可能であ る。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号 ： 6 に示すセリ ンプロテア一ゼと同一のア ミ ノ酸配 列またはその一部が欠失も しく は置換したア ミ ノ酸配列、 あるいは 該同一のァ ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も しく は置換したァ ミ ノ酸配列に 1 乃至複数個のァ ミ ノ酸が付加されたァ ミ ノ酸配列を含 んでなるセリ ンプロテアーゼまたはその部分べプチ ド。
2. 配列番号 ： 6 に示すア ミ ノ酸番号 5 7 8から 8 2 2 までのァ ミ ノ酸配列からなるセリ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンと同一のァ ミ ノ酸 配列またはその一部が欠失も しく は置換したア ミ ノ酸配列、 あるい は該同一のア ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も しく は置換したァ ミ ノ酸配列に 1 乃至複数個のァ ミ ノ酸が付加されたァ ミ ノ酸配列を 含んでなるセリ ンプロテア一ゼ ドメ ィ ンまたはその部分べプチ ド。
3. 配列番号 ： 6 に示すア ミ ノ酸番号 4 0から 1 1 2 までのア ミ ノ酸配列からなるク リ ングル ドメイ ンと同一のァ ミ ノ酸配列または その一部が欠失も しく は置換したァ ミ ノ酸配列、 あるいは該同一の ァ ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も しく は置換したア ミ ノ酸配列 に 1 乃至複数個のァ ミ ノ酸が付加されたァ ミ ノ酸配列を含んでなる ク リ ングル ドメ イ ンまたはその部分べプチ ド。
4. 配列番号 ： 6 に示すア ミ ノ酸番号 1 1 7から 2 1 7 まで、 番 号 2 2 7力、ら 3 2 7 まで、 番号 3 3 4から 4 3 3 までまたは番号 4 4 7カヽら 5 4 7 までのア ミ ノ酸配列からなるスカベンジャーレセプ ター システィ ンリ ッチ （ S R C R ) ドメイ ンと同一のア ミ ノ酸配列 またはその一部が欠失も しく は置換したァ ミ ノ酸配列、 あるいは該 同一のァ ミ ノ酸配列またはその一部が欠失も しく は置換したア ミ ノ 酸配列に 1 乃至複数個のァ ミ ノ酸が付加されたァ ミ ノ酸配列を含ん でなる S R C R ドメ イ ンまたはその部分べプチ ド。
5. 請求項 1 から 4のいずれか 1 項に記載のセリ ンプロテアーゼ 、 ドメ イ ンまたはそれらの部分べプチ ドをコ一ドする D N A。
6. 請求項 1 から 4のいずれか 1 項に記載のセリ ンプロテア一ゼ 、 ドメ イ ンまたはそれらの部分べプチ ドをコ一ドする D N Aとス ト リ ンジヱ ン 卜な条件下でハイブリ ダィズし、 かつ、 セリ ンプロテア —ゼ、 ドメイ ンまたはそれらの部分べプチ ド活性を有するぺプチ ド をコ一 ドする D N A。
7. 請求項 5 または 6 に記載の D N Aを含んでなる発現べクタ一
8. 請求項 7 に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主。
9. 請求項 8 に記載の宿主を培養または飼育し、 セリ ンプロテア ーゼ、 ドメイ ンまたはそれらの部分べプチ ドを採取することを特徴 とするセリ ンプロテアーゼ、 ドメ イ ンまたはそれらの部分べプチ ド の製造法。
10. 請求項 1 から 4のいずれか 1 項に記載のセリ ンプロテアーゼ 、 ドメ イ ンまたはそれらの部分べプチ ドを抗原とする抗体。
1 1. 請求項 1 から 4のいずれか 1 項に記載のセリ ンプロテア一ゼ 、 ドメ イ ンも しく はそれらの部分ペプチ ドまたは請求項 5 または 6 に記載の D N Aを用いる生理活性物質のスク リ ーニング方法。
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