WO1999007874A1 - Process for producing lh-rh derivatives - Google Patents

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WO1999007874A1
WO1999007874A1 PCT/JP1997/002705 JP9702705W WO9907874A1 WO 1999007874 A1 WO1999007874 A1 WO 1999007874A1 JP 9702705 W JP9702705 W JP 9702705W WO 9907874 A1 WO9907874 A1 WO 9907874A1
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Kazuhisa Kashimoto
Yumiko Nagano
Akiko Ohata
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Itoham Foods Inc
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Itoham Foods Inc
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C07K5/0825—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Glp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing an LH-RH derivative, which is a peptide useful as a medicine, using an enzyme.
  • Luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) are released from the anterior pituitary gland under the control of the luteinizing hormone-releasing hormone LH-RH produced in the hypothalamus.
  • LH-RH and its derivatives have gonadotropin-secreting activity and can inhibit gonadal function by continuous administration. For example, endometriosis, central precocious puberty, infertility, prostate cancer, etc. It has been applied as a prophylactic and therapeutic agent for or.
  • Buserelin Japanese Patent Publication No. 60-9519
  • Goserelin Japanese Patent Publication No. 61-13480
  • Leuprorelin Japanese Patent Publication No. 53-14072
  • Nafarelin Japanese Patent Publication No. 63-14072
  • a peptide fragment having a partial sequence corresponding to the polypeptide is formed by a liquid phase method or a solid phase method, and each fragment is further coupled in a liquid phase.
  • Chemical synthesis method by synthesis method JP-B-56-47175, JP-A-4-19-1468, JP-B-57-29462, JP-B-57-25540, JP-B-63-17839, JP-B-63-45398, JP-B-48-40770, JP-A-50-88069, JP-A-49-41375, JP-A-49-41376, JP-A-48-99170 JP, JP-B-52-20996, JP-A-49-35381, JP-B-52-8831, JP-B-57-668, JP-B-53-14072, JP-B-57-26506 Gazettes, Japanese Patent Publication No. 60-22720, Japanese Patent Publication No.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing LH-RH derivatives in large quantities at low cost.
  • the present invention provides a compound represented by the general formula (1):
  • R 1 represents lower alkyl
  • X represents an amino acid selected from the group consisting of D-Leu, D-Ser (But), D-Trp, (2-naphthyl) -D-Ala, and Gly
  • Y represents Gly - NH ", Azgl y (Azagurishin) - NH 2 or NHR 2 (R 2 is lower alkyl.) shows a).
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the above chymotrypsin or Is characterized in that the enzyme selected from the group consisting of chymotrypsin-like enzymes is chymotrypsin.
  • R 1 represents lower alkyl
  • X represents an amino acid selected from the group consisting of D-Leu, D-Ser (But), D-Trp, (2-naphthyl) -D-Ala, and Gly
  • Y represents Giy-NH 2 , Azgly-NH 2 or NHR 2
  • the solvent obtained by mixing the water or the buffer and the organic solvent is a mixed solvent of water or the buffer and a water-miscible organic solvent, or an organic solvent that partially mixes the water or the buffer with water. It is a saturated mixed solvent.
  • R 1 represents lower alkyl
  • X is D- Leu, D-Ser (But ), D-Trp, (2- naphthyl) - D-Ala, and the amino acid selected from the group consisting of Gly, Y is Gly- ⁇ 2, Azgly-Cafe 2 or NHR 2 (R 2 is lower alkyl.)
  • the LH-RH derivative is represented by the general formula (10) (SEQ ID NO: 1)
  • Gly at the 6th and 10th positions of LH-RH represented by the above is substituted with another amino acid, special amino acid or modified amino acid.
  • the amino acid at the position corresponding to the Giy at position 6 (hereinafter referred to as X) is not particularly limited as long as it is a D-form amino acid or a modified amino acid obtained by modifying these amino acids.
  • Specific D-form amino acids include D-Leu, D-Trp, D-Ala, D-Phe, D-Val, and D-His! )
  • Body amino acids, and modified amino acids include D-Ser (But), (2-naphthyl) -DAla, and the like.
  • X may be an L-form amino acid.
  • the amino acid is selected from the group consisting of: L-amino acid and Gly when it is an L-form amino acid.
  • Gly at position 10 (hereinafter referred to as Y) is preferably Gly-NH 2 , Azgly-NH 2 or NHR 2 (R 2 is lower alkyl).
  • “Lower alkyl” means alkyl having 1 to 3 carbon atoms, and specific examples include methyl, ethyl, propyl and isopropyl.
  • R 1 is preferably a methyl or ethyl group, and R 2 is preferably an ethyl or methyl group.
  • HOSu N-hydroxysuccinic acid imid
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • the peptide fragment represented by the general formula (1) corresponds to the first to third amino acid residues of the amino acid sequence of the LH-RH derivative represented by the general formula (3).
  • the peptide fragment represented by the general formula (2) corresponds to the amino acid residue at the 4-position or lower in the amino acid sequence of the LH-RH derivative represented by the general formula (3).
  • the peptide fragment represented by the general formula (1) or the peptide fragment represented by the general formula (2) can be synthesized by a known method for peptide synthesis. For example, "The Pept i des", Volume 1 (1966) [Schreder and Luhke, Academic Press, New York, USA], or "Peptide synthesis"
  • the functional groups that should not be involved in the reaction are protected by ordinary protecting groups, and after the reaction, the protecting groups are Is detached.
  • the functional groups involved in the reaction are usually activated.
  • Protecting groups for the amino group include benzyloxycarbonyl (Z), t-butyloxy. Cicarbonyl (Boc), t-Amyloxycarbonyl (Aoc), Isocarbonyloxycarbonyl, P-methoxybenzyloxycarbonyl, 2-Chloro-benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoro Examples include roacetyl, phthaloyl, formyl, 0-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, and the like.
  • Boc Boc
  • D-Ser (But) When D-Ser (But) is bonded, use Z group to remove only Z group without removing But (t-butyl) group. Can be.
  • carboxyl-protecting groups include alkyl esters (eg, methyl ester, ethyl ester, propyl ester, butyl ester, tert-butyl ester, etc.), benzyl ester, P-nitrobenzyl ester, methylbenzyl ester, p-chloro
  • Examples include benzyl ester, benzhydryl ester, benzyloxycarbonyl hydrazide, tert-butyloxycarbonyl hydrazide, and trityl hydrazide. When hydrazide is formed, it is preferable to use a methyl ester or ethyl ester.
  • Activated carboxyl groups involved in peptide bonds include, for example, the corresponding acid chloride, acid anhydride or mixed acid anhydride, azide, active ester
  • the peptide bond formation reaction can be carried out in the presence of a condensing agent, for example, a carbodiimide reagent such as dicyclohexyl carbodiimide or carbodiimidazole—tetraethyl pyrophosphite.
  • a condensing agent for example, a carbodiimide reagent such as dicyclohexyl carbodiimide or carbodiimidazole—tetraethyl pyrophosphite.
  • proteolytic enzymes have been mainly used for cleavage of peptide bonds, but it has been known for a long time that they can also be involved in the reverse reaction of peptide bond formation.
  • Enzymatic synthesis of long-chain peptides is limited to the case where the structure has an amino acid with a limited substrate specificity or the case where an enzyme having a limited substrate specificity is used.
  • Common enzymes such as these are anti-peptides It is rarely used. Therefore, enzymatic reactions are mainly used for relatively short-chain peptide bonds such as oligopeptides, but it takes time to study synthesis conditions.
  • Enzyme synthesis may solve the above-mentioned problems in chemical synthesis depending on the conditions, and it may be a very useful method if performed under mild conditions that enable mass production.
  • the present invention allows the peptide fragment represented by the general formula (1) to react with the peptide fragment represented by the general formula (2) in the presence of chymotrypsin or a chymotrypsin-like enzyme.
  • the LH-RH derivative represented by the general formula (3) was successfully produced by combining the two.
  • the chymotrypsin used in the present invention is a kind of serine protease registered with the International Union of Biochemistry (I. U. B.) Enzyme Committee as enzyme number E3.4.2.1. Is the enzyme that is used. Chymotrypsin is commercially available from SIGMA and the like.
  • the chymotrypsin-like enzyme refers to a protein degrading enzyme that recognizes aromatics such as Tyr and Phe, and specific examples include ⁇ -chymotrypsin.
  • the use of chymotrypsin or a chymotrypsin-like enzyme is preferable because Trp, which is one of the recognition sites for chymotrypsin or chymotrypsin-degrading enzyme, is present in the L ⁇ -RH derivative.
  • the reaction of chymotrypsin or chymotrypsin-like enzyme is usually carried out in a medium containing a buffer having a pH of about 5 to about 10, preferably a pH of about 6 to about 9, and more preferably a pH of about 7.5 to 8.5.
  • the medium containing a buffer is a solvent using the buffer itself as a medium, a mixed solvent of various buffers described below and a water-miscible organic solvent, or a solvent in which these buffers are not completely mixed with water. Refers to a mixed solvent with an organic solvent.
  • the buffer is not particularly limited as long as it has a pH value within the above range, and various buffers can be used.
  • Tris-HCl buffer Tris-HCl buffer, McIlbe In buffer, phosphate buffer, ammonium acetate buffer,
  • Buffers veronal buffers and the like.
  • the buffer is usually used by mixing with a water-miscible organic solvent.
  • water-miscible organic solvent examples include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMS0), dimethylimidazolidinone (DMI), hexamethylphosphorinoletriamide (HMPA), and meta-
  • DMF dimethylformamide
  • DMS0 dimethylsulfoxide
  • DI dimethylimidazolidinone
  • HMPA hexamethylphosphorinoletriamide
  • meta- there are nool (MeOH) and ethanol (EtOH).
  • MeOH nool
  • EtOH ethanol
  • dimethylformamide methanol
  • ethanol ethanol
  • organic solvents that are completely miscible with water such as n-butanol (l-BuOH) and ethyl acetate (EtOAc), can also be used.
  • l-BuOH n-butanol
  • EtOAc ethyl acetate
  • organic solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • the mixing ratio of the water-miscible organic solvent with water or a buffer solution is preferably 50% by volume or less from the viewpoint of reactivity.
  • an immobilized enzyme for example, immobilized chymotrypsin using celite is used. In the case of using, it is preferable that the content is 80% by volume or more.
  • the use of hydrated water of the above organic solvent has the advantage that the reaction efficiency of the enzyme is high.
  • the reaction of the above-mentioned enzymes is usually performed in a temperature range in which chymotrypsin or a chymotrypsin-like enzyme operates, that is, generally in a range of about 0 to about 50 ° (preferably, about 0 ° C to about 20 ° C).
  • a temperature range in which chymotrypsin or a chymotrypsin-like enzyme operates that is, generally in a range of about 0 to about 50 ° (preferably, about 0 ° C to about 20 ° C).
  • the amount of chymotrypsin or chymotrypsin-like enzyme used is not particularly limited, and can be appropriately changed depending on the reaction conditions.
  • about 50 mg to 50 g of substrate Using about 100 mg of chymotrypsin, the desired peptide can be synthesized in a range of about 75 to about 85% in one hour.
  • chymotrypsin or chymotrypsin-like enzyme may be used by dissolving it in water or an appropriate buffer, or may be used by a general method such as a carrier binding method, a cross-linking method, an inclusive method, or the like. It may be immobilized by a method and used as an immobilized enzyme.
  • the carrier used in the carrier binding method include polysaccharide derivatives such as cellulose, dextran, and agarose, polyacrylamide gel, celite, and porous glass.
  • cross-linking reagent used in the cross-linking method examples include glutaraldehyde, bisdiazobenzidine, N, N-polymethylenebis-acetoamide, ⁇ , ⁇ -ethylenebismaleimide, and the like.
  • Materials used in the entrapment method include polyacrylamide gel, polyacryl alcohol gel, starch, konjac powder, nylon, polyurea, polystyrene, ethylcellulose, collodion, and cellulose nitrate.
  • the immobilization method is not limited to the method using these.
  • LH—RH derivative represented by pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt (11) can be obtained.
  • chymotrypsin may be immobilized on agarose according to a conventional method and used as the immobilized enzyme.
  • the reaction solution can be easily removed from the reaction solution by passing the reaction solution through a filter such as a glass filter after completion of the reaction, and can be reused.
  • the above LH-RH derivative can be obtained, and the obtained LH-RH derivative can be purified as follows.
  • the LH_RH derivative produced by the method of the present invention can be desalted and purified according to a usual method.
  • desalting can be performed by various methods utilizing the difference in molecular size from salts, such as gel filtration, ultrafiltration, and dialysis.
  • ultrafiltration using a membrane made of cellulose acetate gel filtration using a Sephadex column such as Sephadex LH-20, Sephadex-1 60, Sephadex G-25, DEAE-cellulose, etc. It can be performed by ion exchange chromatography or the like.
  • two types of liquids that do not mix with each other for example, n-butanol in water
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • the LH-RH derivative produced by the method of the present invention is hydrophilic, it can be purified as follows using an organic solvent that is not completely miscible with water as described above.
  • the reaction mixture reacted as described above is extracted with an organic solvent, water is added to the extract, and the mixture is solidified with a solvent such as ether.
  • a solvent such as ether.
  • n-butanol (n_BuOH) or the like is preferable.
  • n_BuOH n-butanol
  • These solvents are highly polar and have high extraction efficiency, and do not mix with water, which is advantageous for partition chromatography in the next step.
  • To the reaction mixture (1, 200 mL) add about 1 to 4 n-butanol (300 mL), and perform partition chromatography with water in the reaction mixture.
  • the extraction with n-butanol may be repeated as appropriate.
  • the aqueous and organic layers are separately concentrated. At this time, since the peptide fragment of the above
  • the crude product obtained from the organic layer by partition chromatography be solidified with getyl ether, ethyl acetate or the like because the LH-RH derivative is hardly soluble in these solvents.
  • the solidified crude product is dissolved in a suitable buffer such as, for example, ammonium acetate, and fractionated by column chromatography using a suitable stationary phase and a mobile phase.
  • a weak cation exchange resin such as CM cellulose or a strong cation resin such as SP is used as the stationary phase, an interaction due to Arg residues contained in LH-RH can be obtained.
  • the mobile phase using the same buffer as that in which the solidified crude product was dissolved, increasing the salt concentration with a linear gradient has the advantage of increasing the yield.
  • a 0.01 M aqueous solution of ammonium acetate and a 0.1 M aqueous solution of ammonium acetate can be used.
  • the obtained eluate can be obtained by purifying the stationary phase and the eluent appropriately by HPLC and selecting the eluent.
  • HPLC a 0DS silica column such as TSK gel ODS-120T can be used as the stationary phase, and the use of a 0DS silica column is optimal.
  • 0.1% TFA-acetonitrile or the like can be used as the mobile phase.
  • the content of acetonitrile is changed from 0.1% TFA at the start to 20% acetonitrile by 1% per minute to obtain a linear concentration gradient of 0.1% TFA to 50% acetonitrile.
  • LH-RH peptide is good. Purification is not limited to the above purification method. When immobilized enzymes are used, they can be subjected to ion exchange without performing partition chromatography.
  • the method of the present invention has the following advantages as compared with the conventionally known methods for producing LH-RH derivatives, and is extremely industrially useful.
  • the LH-RH derivative can be converted into a pharmaceutically acceptable salt such as an acetate, a hydrochloride, a phosphate and the like, if necessary.
  • the obtained pure peptide was identified by measuring the retention time of high performance liquid chromatography (HPLC), measuring the optical rotation, and analyzing amino acids. These measurements were performed by the following measurement methods and measurement conditions unless otherwise specified.
  • LC-Module-1 manufactured by Nippon Waters-Limited was used as a detector.
  • DIC-370 manufactured by JASCO Corporation was used.
  • Amino acid analysis was performed by hydrolyzing the obtained peptide in 6 N hydrochloric acid (containing 0.1% phenol) at 110 ° C for 20 hours, and then using a Hitachi amino acid analyzer L-8500 (manufactured by Hitachi). I went.
  • the deprotected H-Arg (Tos) -Pro-NHE or TFA was dissolved in a mixed solvent of 80 mL of DMF and 200 mL of THF, and neutralized with N-methylmorpholine while cooling. Next, a solution prepared by dissolving 53.06 g of Z-Leu-OH and 23.02 g of HOSu in 200 mL of THF and 36.4 mL of WSC were added, and the mixture was stirred at 0 ° C for 5 minutes and at room temperature overnight. After confirmation with ninhydrin, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure.
  • the Z-Ser-Tyr-OMe 38.Og produced in the above (1-4) was dissolved in 200 mL of methanol, 50 g of hydrazine was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature overnight. Thereafter, the mixture was concentrated under reduced pressure and washed with methanol. Thus, 34.2 g (yield 90.0%) of Z-Ser-Tyr-MNH 2 was obtained.
  • the powder obtained from the organic layer was dissolved in a 0.01 M aqueous ammonium acetate solution and applied to a column (4 ⁇ 30 cm) filled with CM-cellulose.
  • a linear concentration gradient elution (60 mL / hour) of 500 mL of 0.01 M aqueous ammonium acetate solution (PH4.4) to 500 mL of 0.1 M aqueous ammonium acetate solution (pH 4.4) was performed, and 10 mL of the eluate was fractionated and collected.
  • the eluate was analyzed by high performance liquid chromatography, and the target fraction was collected and freeze-dried. In this way, 22.4 g of pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt was obtained (yield: 74.9%).
  • the filtrate was concentrated and applied to a column (4 x 30 cm) packed with CM-cellulose.
  • a linear concentration gradient elution (60 / hour) of 500 mL of 0.01 M aqueous ammonium acetate solution (pH 4.4) to 500 mL of 0.1 M aqueous ammonium acetate solution (PH4.4) was performed, and the elution was fractionated and collected in 10 mL portions. .
  • the eluate was analyzed by HPLC, and the desired fraction was collected and lyophilized.
  • 1.45 g of pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt was obtained (yield: 82.4%).
  • the melting point, optical rotation, Tf Rf value and elemental analysis value of the obtained compound were as follows: pG 1 uHis-Trp-Ser-Ty rD-Se r prepared in Example 1 (1-11). (Bu t) -Leu-Arg-Pro- NHEt.
  • the reaction was carried out using the peptides shown in Table 1 as substrates under the conditions of the above enzyme reaction, and the peptides produced 2 hours after the start of the reaction were analyzed by HPLC, and the yield was calculated from the area of each peak.
  • the yield was 0%, indicating that the reaction did not proceed at all.
  • the yield was as low as 7.8%, but it was confirmed that there was a product. The yield is 0% and the reaction does not proceed even when a substrate in which the enzyme binding site Ser is D-form is used.
  • ZD-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt produced according to (1-1) to (1-3) of Example 1 was replaced with the following (2-1) to (2- PGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt was produced in the same manner as in Example 1 except that it was produced according to 3).
  • Z-Leu-Arg-OEt was dissolved in 500 mL of methanol, 150 mL of thigh was added under ice cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the obtained residue was weighed with 500 mL of water, and extracted five times with 1,00 mL of n-butanol. The extract was washed four times with 500 mL of water and concentrated under reduced pressure.
  • the obtained residue was solidified by treating with a ether and dried. In this way, Z- Leu- Arg- NHNH 2 209.7g ( 74.1% yield).
  • H-Leu-Arg (Tos) -Pro-NHEt was dissolved in 80 mL DMF and 200 mL THF. The solution was neutralized with N-methylmorpholine while cooling. Next, to this solution was added a solution of 8.86 g of Boc-D-Leu-OH and 23.02 g of HOSu dissolved in 200 mL of THF, and 36.4 mL of WSC, and the mixture was stirred at 0 ° C for 5 minutes and at room temperature overnight. did. After confirmation with ninhydrin, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure. To the residue was added 500 mL of water, and extracted five times with 200 mL of n-butanol.
  • H-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt
  • H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt prepared in (3-3) above Except that 1.30 g was used, 1.33 g of Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-HEt was obtained in the same manner as (1-11) in Example 1 (yield 76.4%).
  • optical rotation, elemental analysis value and amino acid analysis value of pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt are shown below.
  • the Boc-Arg (N0 2) -0H 13.5g was dissolved in THF lOOmL, dry ice - cooled to -20 ° C with ethanol. To this, 3.3 mL of N-methylmorpholine was added dropwise, followed by 3.96 mL of isobutylchloroformate, and the mixture was stirred at -20 ° C for 1 minute to produce the corresponding mixed acid anhydride.
  • the obtained reaction solution was mixed with 200 mL of a DMF solution of H-Pro-Azgly-NH 2 ⁇ TFA (neutralized with N-methylmorpholine), and the mixture was stirred at 0 ° C for 5 minutes. After stirring at room temperature for 30 minutes, the mixture was concentrated under reduced pressure.
  • Boc-Arg (N0 2) the melting point of the Pro-Azgly-NH 2, optical rotation, shown below Symbol of Rf and elemental analysis values of TLC.
  • the H-Arg (N0 2) -Pro -NHEt 'TFA was dissolved in a mixed solvent of DMF 80 mL and THF 200 mL. The solution was neutralized with N-methylmorpholine while cooling. Next, to this solution was added a solution of 53.06 g (0.2 mole) of Z-Leu-OH and 23.02 g (0.22 mole) of HOSu dissolved in 200 mL of THF, and 36.4 mL (0.2 mol 1 e) of WSC, and added 0 ° C. The mixture was stirred at room temperature for 5 minutes at room temperature. After confirmation with ninhydrin, the reaction mixture was concentrated under reduced pressure.
  • H-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt
  • H-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg- produced in (4-6) above Except that 1.30 g of Pro-Azgly-NH 2 was used, pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg- 1.29 g (yield 75.9%) of Pro-Azgly-NH 2 was obtained.
  • Solid phase synthesis was performed using a peptide synthesizer 9600 manufactured by Milligen Biosciences as a solid phase synthesizer.
  • MBHA p-methylbenzhydrylamine
  • Boc-Gly-MBHA resin was washed with 8 mL of DCM (4 times, 1 minute each) and filtered.
  • the pGiu- Hi s-Trp- Ser- Tyr- D- Trp- Leu- Arg- Pro- amino acid sequence of Gly-NH 2 2 mmole of Boc-Pro-OH corresponding to the ninth amino acid residue was dissolved in 4 mL of DCM, and 1.5 mL of DCC (0.5M-DCM solution) was added in the amino acid activation vessel and reacted for 7 minutes. Thereafter, the reaction mixture was filtered and transferred to a concentration vessel, to which 3 mL of DMF was added, and DCM was distilled off under a stream of argon gas.
  • Boc-Ser (Bzl) -0H 2 In the above solid-phase synthesis, double coupling was performed when Arg was used. Thus, 2.76 g of the protected peptide-MBHA resin, Boc-Se r (Bz 1) -Tyr (Bz 1) -D-Trp-Leu-Arg (Tos) -Pro-G 1 y-MBHA resin was obtained. .
  • H-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt
  • H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly produced in (5-1) above except for using the -NH 2 1.30 g the of example 1 (Bok 11) by the same method as Li
  • pGlu-His-Trp-Ser -Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 1.26 g (75.45% yield) were obtained.
  • Example 5 (5-1) except that Boc-D- (2-naphthyl) -D-Ala-0H was used instead of Boc-D-Trp-0H corresponding to the sixth amino acid residue.
  • H-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt
  • H-Ser-Tyr-G 1 y-Leu-Arg-Pro-G produced in (6-1) above 1 y-NH 2 (SEQ ID NO: 4) pG 1 uHis-Trp-Ser-Ty rG 1 y-Leu-Arg- by the same method as in Example 1, except that 1.12 g was used. 1.16 g (76.3% yield) of Pro-Gly-NH 2 (SEQ ID NO: 1) was obtained.
  • amino acid number 2 Xaa is Arg (N0 2), the Xaa of the amino acid number 4 Azgly
  • Xaa represents Azgly- NH 2.

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Description

L H— R H誘導体の製造方法 技術分野
本発明は、 医薬として有用なペプチドである L H— R H誘導体を酵素を用いて 効率的に製造する方法に関する。 背景技術
黄体形成ホルモン （L H ) および卵胞刺激ホルモン （F S H ) は、 視床下部に 生成する黄体形成ホルモン放出ホルモン L H— R Hの支配下に脳下垂体前葉から 放出される。 L H— R Hおよびその誘導体は、 性腺刺激ホルモン分泌活性を有し、 連続投与により性腺機能の抑制現象が認められることから、 例えば子宮内膜症、 中枢性思春期早発症、 不妊症、 前立腺癌等の予防およびノまたは治療薬として応 用されている。 既に医薬品となっているものにブセレリン （特公昭 60-9519号公 報） 、 ゴセレリン （特公昭 61- 13480号公報） 、 リュープロレリン （特公昭 53 - 14072号公報） 、 ナファレリン （特公昭 63- 56238号公報） がある。
上記 L H— R Hおよびその誘導体の製造方法として、 そのポリペプチドに対応 する部分配列をもつぺプチドフラグメントを液相法または固相法で形成せしめ、 各フラグメントを液相中でさらにカップリングさせる液相合成法による化学合成 法 （特公昭 56-47175号公報、 特開昭 49-1 17468号公報、 特公昭 57- 29462号公報、 特公昭 57- 25540号公報、 特公昭 63- 17839号公報、 特公昭 63-45398号公報、 特 開昭 48- 40770号公報、 特開昭 50- 88069号公報、 特開昭 49-41375号公報、 特開 昭 49- 41376号公報、 特開昭 48-99170号公報、 特公昭 52- 20996号公報、 特開昭 49 - 35381号公報、 特公昭 52-8831号公報、 特公昭 57- 6 68号公報、 特公昭 53- 14072号公報、 特公昭 57- 26506号公報、 特公昭 60- 22720号公報、 特公昭 61- 13480号公報、 特公平 3-71439号公報等参照） が知られている。
しかしな力 ら、 液相合成法ではペプチドのアミノ酸残基の数が増すに従ってそ の溶解度が微妙に変化するので適当な溶媒を見出すのが次第に困難になリ、 それ につれて目的のペプチドと未反応物や副生成物との分離の困難さも増大してくる。 特に L H— R Hおよびその誘導体の 4位のセリン残基はラセミ化し易レ、ので夾雑 物として残存すること、 また原料の回収が不可能なことなど、 反応後の処理が困 難で且つ不経済なことから工業的に十分満足できるものではなレ、。 発明の開示
本発明の課題は、 L H— R H誘導体を効率よく大量に、 しかも安価に製造する 方法を提供することにある。
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 酵素合成手法によリエ業的生産 に適した L H— R H誘導体の製造方法を見出し、 本発明を完成した。
本発明は、 一般式（1) ：
pGlu-Hi s-Trp-OR1 ( 1 )
(式中、 R1は低級アルキルを示す。 )
で表されるペプチドフラグメントと、
一般式 (2) ：
H-Ser-Tyr- X-Leu-Arg-Pro- Y (2)
(式中、 Xは D- Leu、 D-Ser(But) , D- Trp、 （2-ナフチル） - D- A l a、 および G ly からなる群から選ばれるアミノ酸を示し、 Yは G l y- NH」、 Azgl y (ァザグリシン） - NH2または NHR2 (R2は低級アルキルである。 ） を示す。 )
で表されるペプチドフラグメントとを、 キモトリプシンまたはキモトリブシン様 酵素からなる群から選ばれる酵素の存在下で反応させることを特徴とする、
一般式 (3) ：
pG 1 u-H i s-Trp-ier-Tyr-X-Leu-Arg-Pro- Y " )
(式中、 Xおよび Υは前記のとおりである。 ）
で表される L H— R H誘導体の製造方法である。
ここで、 上記 R1は、 炭素数 1 〜 3のアルキル基であり、 また、 R2は、 炭素数 1 〜 3のアルキル基であることを特徴とする。 さらに、 上記キモトリブシンまた はキモトリプシン様酵素からなる群から選ばれる酵素が、 キモトリプシンである ことを特徴とする。
また、 本発明は、 一般式 (4) ：
pGlu-His-Trp-ORl (4)
(式中、 R1は低級アルキルを示す。 )
で表されるぺプチドフラグメントと、
一般式 (5) ：
H-Ser- Tyr- X- Leu-Arg-Pro- Y (5)
(式中、 Xは D- Leu、 D-Ser(But) , D-Trp、 （2-ナフチル） - D- Al a、 および Gly からなる群から選ばれるアミノ酸を示し、 Yは Giy- NH2、 Azgly- NH2または NHR2
(R2は低級アルキルである。 ） を示す。 ）
で表されるペプチドフラグメントとを、 キモ卜リプシンまたはキモトリプシン様 酵素からなる群から選ばれる酵素の存在下で、 水または緩衝液と有機溶媒とを混 合した溶媒中で反応させることを特徴とする
一般式 (6) ：
pGlu-H i s-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro- Y (b
(式中、 Xおよび Yは前記のとおりである。 ）
で表される L H— R H誘導体の製造方法である。
ここで、 上記水または緩衝液と有機溶媒とを混合した溶媒が、 水もしくは緩衝 液と水混和性有機溶媒との混合溶媒、 または水もしくは緩衝液を水と部分的に混 和する有機溶媒で飽和させた混合溶媒であることを特徴とする。
さらに、 本発明は、 一般式 (7) ：
Figure imgf000005_0001
(式中、 R1は低級アルキルを示す。 ）
で表されるぺプチドフラグメントと、
一般式 (8) ：
H-Ser-Tyr- X-Leu-Arg-Pro-Y (8)
(式中、 Xは D- Leu、 D-Ser(But) , D-Trp、 （2-ナフチル） - D- Ala、 および Gly からなる群から選ばれるアミノ酸を示し、 Yは Gly- ΝΉ2、 Azgly-廳2または NHR2 (R2は低級アルキルである。 ） を示す。 )
で表されるペプチドフラグメントとを、 キモトリブシンまたはキモトリプシン様 酵素からなる群から選ばれる酵素を固定化した固定化酵素の存在下で、 水または 緩衝液と有機溶媒とを混合した溶媒中で反応させることを特徴とする
一般式 (9) ：
pG lu-His -Trp-Se r-Tyr- X - Leu-Arg- Pro- Y (9)
(式中、 Xおよび Yは前記のとおりである。 ）
で表される L Η— R Η誘導体の製造方法である。
本明細書において、 L H— R H誘導体とは、 一般式（10) (配列番号 1 )
pG 1 u-H i s-Trp-Ser-Tyr-G 1 y- Leu - Arg- Pro - G 1 y-NH, ( 10)
で表される L H— R Hの 6位および 10位の G lyが他のアミノ酸、 特殊アミノ酸 または修飾アミノ酸に置換されたものをいう。 6位の Giy (以下、 Xという） に 相当する位置のアミノ酸は、 D体のアミノ酸またはこれらが修飾された修飾アミ ノ酸であればよく、 特に限定されない。 具体的な D体アミノ酸としては、 D- Leu、 D - Trp、 D - Al a、 D- Phe、 D-Val、 D- Hi sなどの！）体アミノ酸をあげることができ、 修飾アミノ酸としては、 D - Ser(But)、 （2-ナフチル） - D-A l aなどを挙げることが できる。 また、 Xは L体アミノ酸であってもよい。 Xが上記の D体アミノ酸およ び修飾アミノ酸である場合には、 D-Leu、 D- Trp、 D- Al a、 D- Ser(But)および（2 -ナ フチル) -D- A 1 aからなる群から選ばれるものが好ましく、 L体アミノ酸である場 合には G lyであること力 好ましレ、。 10位の Gly (以下、 Yという） は、 Gly - NH2、 Azg l y- NH2または NHR2 (R2は低級アルキルである。 ） ことが好ましい。
「低級アルキル」 とは、 炭素原子数 1〜 3個のアルキルを意味し、 具体的には、 メチル、 ェチル、 プロピルおよびイソプロピルを挙げることができる。 R1はメチ ルまたはェチル基、 R2はェチルまたはメチル基であることが好ましい。
また、 本明細書において、 アミノ酸、 ペプチド、 保護基、 溶媒、 その他に関し 略号で表示する場合、 国際純正および応用化学連合 （IUPAC) 、 国際生化学連合 ( IUB) の規定、 あるいは当該分野における慣用記号に従うものとする。 その例 を以下に示す。 ただし、 アミノ酸等に関し光学異性体がありうる場合は、 特に明 示しなければ L体を示すものとする。
Tyr ：チロシン残基
Gly ：グリシン残基
Azgly ：ァザグリシン残基
Glu ：グルタミン酸残基
pGlu ： ピログルタミン酸残基
Ser セリン残基
Arg アルギニン残基
Pro プロリン残基
Leu
Hi s
Al a ァラニン残基
Trp トリプトファン残基
Et ェチル
Boc t -ブトキシカルボニル
Aoc t-アミルォキシカルボニル
Bz ベンジル
Z ベンジルォキシカルボニル
Tos トシル
OMe メチルエステル
OBz ベンジルエステル
OSu N -ヒドロキシコハク酸ィミ ドエステル
TFA トリフルォロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
DMF ジメチルホルムアミド
DCC ジシクロへキシルカルボジイミ ド
wsc ： N -ェチル - N' -ジメチルァミノプロピル-カルボジィミ ド
HOSu： N-ヒドロキシコハク酸ィミ ド HOBt： 1-ヒドロキシベンゾトリァゾール
MeOH：メタノ一ル
EtOH：エタノール
AcOH：酢酸
一般式（1)で表されるペプチドフラグメントは、 一般式（3)で表される L H— R H誘導体のアミノ酸配列の 1位から 3位のアミノ酸残基に相当するものである。 また、 一般式 (2)で表されるペプチドフラグメントは、 一般式 (3)で表される L H 一 R H誘導体のアミノ酸配列の 4位以下のアミノ酸残基に相当するものである。 一般式（1 )で表されるぺプチドフラグメントまたは一般式（2)で表されるぺプチ ドフラグメントは、 それぞれ、 公知のペプチド合成の常法手段に従って合成でき る。 例えば 「ザ. ペプチド（The Pept i des)」 第 1巻（1966年） [Schreder and Luhke著、 Academi c Press ， New York, U. S. A. ], あるいは 「ペプチド合成」
[泉屋ら著、 丸善株式会社（1975年）] に記載されている方法に従って、 例えば アジド法、 酸クロライド法、 酸無水物法、 混合酸無水物法、 D C C法、 活性エス テル法 （P-ニトロフエニルエステル法、 N-ヒドロキシコハク酸イミ ドエステル法、 シァノメチルエステル法等） 、 ウッドワード試薬 Kを用いる方法、 カルボイミダ ゾ一ル法、 酸化還元法、 D C C _アディティブ （H0 'B、 HOBt, HOSu) 法、 固相法 等により合成することができる。 上記のような一般的なペプチドの合成法により、 例えば、 C末端アミノ酸に、 アミノ酸配列にしたがって順次 1個ずつアミノ酸を 縮合させるいわゆるステップワイズ伸長法によって、 または数個のフラグメン卜 に分けて各フラグメントを合成してそれらをカツプリ ングさせるフラグメント縮 合法によって製造することができる。
また、 上記一般式（ 1 )または (2)で表されるペプチドフラグメントの合成反応ェ 程では、 反応に関与すべきではない官能基は通常の保護基によって保護され、 反 応終了後保護基は脱離される。 更に、 反応に関与する官能基は通常活性化される。 これら各反応方法は公知であり、 それに用いられる試薬等も公知のものから適宜 選択し得る。
ァミノ基の保護基としては、 ベンジルォキシカルボニル （Z ) 、 t -プチルォキ シカルボニル（Boc)、 t-アミルォキシカルボニル（Aoc)、 イソボニルォキシカルボ ニル、 P-メトキシベンジルォキシカルボニル、 2-クロル-ベンジルォキシカルボ ニル、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホ ルミル、 0-ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニルホスフイノチオイル等が挙 げられる。 ァミノ基の保護には通常は Bocを用いる力 D- Ser(But)を結合する場 合には Z基を用いると、 But (t-プチル） 基を除去することなく Z基のみを除去 することができる。
カルボキシル基の保護基としては、 アルキルエステル （例えば、 メチルエステ ル、 ェチルエステル、 プロピルエステル、 ブチルエステル、 tert—ブチルエステ ル等） 、 ベンジルエステル、 P-ニトロべンジルエステル、 メチルベンジルエステ ル、 p-クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル、 ベンジルォキシカル ボニルヒドラジド、 tert-ブチルォキシカルボニルヒドラジド、 トリチルヒドラ ジド等力挙げられる。 ヒドラジド化する際には、 メチルエステル、 ェチルエステ ルを使用することが好ましい。
ぺプチド結合に関与するカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸クロライド、 酸無水物または混合酸無水物、 アジド、 活性エステル
(例えば、 ペンタクロロフエノール、 p -二トロフエノール、 N-ヒドロキシコハク 酸イミ ド、 N-ヒドロキシベンズトリァゾール、 N-ヒドロキシ- 5-ノルボルネン - 2, 3-ジカルボキシイミド等とのエステル） 等が挙げられる。 これらのうち、 フラ グメントの縮合の際には、 ラセミ化の少ないアジド法を用いることが好ましい。 尚、 ペプチド結合生成反応は縮合剤、 例えば、 ジシクロへキシルカルポジイミ ド、 カルボジィミダゾール等のカルボジィミ ド試薬ゃテトラェチルピロホスフエ ィト等の存在下に実施し得る場合もある。
従来、 蛋白質分解酵素は主としてペプチド結合の開裂に使用されてきたが、 そ の逆反応であるペプチド結合の生成反応にも関与し得ることは古くから知られて いる。 長鎖ペプチドの酵素合成は、 その構造中に限られた基質特異性のあるアミ ノ酸を有する場合か、 限られた基質特異性を有する酵素を用いる場合に限定され るため、 トリプシンゃキモトリプリンのような一般的な酵素はべプチドの形成反 応に用いられることは少ない。 したがって、 酵素反応は主にオリゴペプチド等の 比較的短鎖のペプチド結合に用いられるが、 合成条件の検討に時間を要する。 こ のため、 ペプチドを製造する場合、 一般的には化学合成が用いられており、 化学 合成で副反応が多い場合や反応が困難な場合に酵素合成が試される。 酵素合成は 条件次第では化学合成での上記問題点が解決され、 大量生産可能な緩和な条件で 行うことにより極めて有用な方法になることがある。
本発明は、 鋭意検討を重ねた結果、 一般式（1 )で表されるペプチドフラグメン トと、 一般式 (2)で表されるペプチドフラグメントとを、 キモトリブシンまたは キモトリプシン様酵素の存在下で反応させて両者を結合させることにより、 一般 式 (3)で表される L H— R H誘導体を効率よく製造することに成功したものであ る。
本発明で用いるキモトリブシンは、 国際生化学連合（I . U. B) 酵素委員会に酵素 番号 E 3. 4. 21. 1 として登録されているセリンプロテアーゼの一種であり、 ゥ シ膝臓から得られる酵素である。 キモトリブシンは、 S IGMA社等から市販されて いる。
キモトリブシン様酵素とは、 Tyr、 Pheなどの芳香族を認識するタンパク質分 解酵素をいい、 具体的には、 α—キモトリブシンなどを挙げることができる。 キモトリブシンまたはキモトリプシン様酵素を用いることが好ましいのは、 L Η— R H誘導体中にキモトリプシンまたはキモトリプシン分解酵素の認識部位の 1つである Trpが存在するためである。
キモトリブシンまたはキモトリブシン様酵素の反応は、 通常、 pHが約 5〜約 10、 好ましくは pHが約 6〜約 9、 より好ましくは、 pHが約 7. 5〜8. 5の緩衝液 を含む媒質中で行われる。
緩衝液を含む媒質とは、 緩衝液自体を媒質とする溶媒、 後述する各種の緩衝液 と水混和性有機溶媒との混合溶媒、 またはこれらの緩衝液を水と完全には混和し なレ、有機溶媒との混合溶媒をいう。
緩衝液としては、 pH値が上記範囲内のものであれば特に限定されることなく、 各種のものを使用することができる。 例えば、 トリス塩酸緩衝液、 マックィルべ イン緩衝液、 リン酸緩衝液、 酢酸アンモニゥム緩衝液、 ァ
緩衝液、 ベロナール緩衝液等が挙げられる。
上記のような緩衝液を反応媒質として使用する場合、 該緩衝液は、 通常、 水混 和性有機溶媒と混合して使用される。 ここで使用される水混和性有機溶媒として は、 例えば、 ジメチルホルムアミ ド（DMF)、 ジメチルスルホキシド（DMS0)、 ジメ チルイミダゾリジノン（DMI )、 へキサメチルホスホリノレトリアミド（HMPA)、 メタ ノール (MeOH)、 エタノール（EtOH)等が挙げられる。 好ましいのは、 ジメチルホル ムアミド、 メタノール、 およびエタノールである。
また、 n -ブタノ一ル（l-BuOH)、 酢酸ェチル（EtOAc)などの水と完全には混和し なレ、有機溶媒を使用することもできる。 水と完全には混和しなレ、有機溶媒を使用 する場合には、 後処理操作で分配クロマトグラフィーの操作を行いやすくするた めに、 BuOHを使用することが好ましい。
これらの有機溶媒は単独で使用してもよく、 または 2種以上を組み合わせて使 用してもよレ、。
キモトリプシンもしくはキモトリプシン様酵素は、 水または緩衝液単独の溶媒 中ではなく、 これらと有機溶媒とを混合した溶媒中で反応させると、 目的とする ぺプチドの収率が著しく向上する。
水混和性有機溶媒の水または緩衝液との混合割合は、 一般的には 50容量％以 下であることが反応性の面から好ましいが、 固定化酵素、 例えば、 セライトを用 いた固定化キモトリブシンを用いる場合には 80容量％以上であることが好まし い。 また、 水と完全には混和しない有機溶媒を用いる場合には、 上記の有機溶媒 の抱和水を用いると、 酵素の反応効率が高いという利点がある。
上述の酵素の反応は、 通常、 キモトリブシンまたはキモトリブシン様酵素が作 用する温度範囲、 即ち、 一般的には約 0〜約 50° ( 、 好ましくは約 0 °C〜約 20°C の範囲で行う。 約 10°Cで反応させると、 同時に起こる加水分解反応を抑制でき るという効果がある。
キモトリブシンまたはキモトリブシン様酵素の使用量は、 特に制限はなく、 反 応条件に応じて適宜変えることができる。 例えば、 基質 50 gに対して約 50mg〜 約 lOOmgのキモトリプシンを用いると、 1時間で約 75〜約 85%の範囲の収率で 目的のペプチドを合成することができる。
また、 一般式（2) で表されるペプチドフラグメント 1モル当たり、 一般式（1 ) で表されるペプチドフラグメントを、 通常、 1〜5モル、 好ましくは 2〜 4モル 使用する。
本発明の方法では、 キモトリプシンまたはキモトリプシン様酵素を水または適 当な緩衝液に溶解して使用してもよく、 または、 一般的な方法、 例えば、 担体結 合法、 架橋法、 包括法、 その他の方法によって固定化して固定化酵素として使用 してもよい。 担体結合法において用いる担体としては、 セルロース、 デキストラ ン、 ァガロースのような多糖類の誘導体、 ポリアクリルアミ ドゲル、 セライト、 多孔性ガラス等が挙げられる。 架橋法において用いる架橋試薬としては、 例えば、 グルタールアルデヒド、 ビスジァゾベンジジン、 N， N-ポリメチレンビスョ一ドア セトアミド、 Ν, Ν-エチレンビスマレインイミ ド等が挙げられる。 包括法で用いる 素材としては、 ポリアクリルアミドゲル、 ポリアクリルアルコールゲル、 デンプ ン、 コンニヤク粉、 ナイロン、 ポリウレア、 ポリスチレン、 ェチルセルロース、 コロジオン、 硝酸セルロース等が挙げられる。 但し、 固定化法は、 これらを用い た方法に何ら限定されるものではなレ、。
本発明の製造方法では、 例えば、 以下のようにして下記式（1 1 )
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt ( 1 1) で表される L H— R H誘導体を得ることができる
すなわち、 所定量の下記式（12)で表されるぺプチドフラグメント
pGlu-Hi s-Trp-OMe ( 12)
と、 所定量の下記式（13)で表されるぺプチドフラグメント
H-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-NHEt ( 13)
とを、 所定の活性を有するキモトリプシンの存在下で、 n-ブタノ一ル抱和水中、 PH7. 8付近にて、 約 10°Cで 1時間程度攪拌することにより、 上記 L H— R H誘導 体を得ることができる。 キモトリブシンの活性は、 約 1 , 000国際単位 （U) /mg 以上であることが、 後工程での除去がし易いために好ましい。 この反応の際に使 用する上記式（ 12)で表されるぺプチドフラグメントと上記式（ 13)で表されるぺプ チドフラグメントとのモル比は、 約 3 ： 1で使用すると収率が高い。 また、 上記 のように水または緩衝液などに溶解して反応液に酵素を添加する代わりに、 例え ば、 キモトリブシンを常法にしたがってァガロースに固定し、 固定化酵素として 用いてもよい。 固定化酵素を用いると、 反応終了後に反応液をグラスフィルタ一 などのフィルターを通すことにより、 反応液から容易に除去できると同時に再使 用が可能である。
以上のようにして、 上記 L H— R H誘導体を得ることができ、 得られた L H— R H誘導体は、 以下のようにして精製することができる。
本発明の方法によって製造された L H _ R H誘導体は、 通常の方法に従って脱 塩、 精製することができる。 ここで、 脱塩は塩類との分子サイズの相違を利用す る様々な方法、 例えば、 ゲル濾過、 限外濾過、 透析などによって行うことができ る。 具体的には、 セルロースアセテート製の膜などを用いた限外濾過、 セフアデ ックス LH- 20、 セフアデックス一60、 セフアデックス G- 25などのセフアデック スカラムを用いたゲル濾過、 DEAE—セルロース等を用いたイオン交換クロマトグ ラフィーなどによって行うことができる。 また、 精製においては、 互いに混合し 合わない 2種類の液体 （例えば、 水一 n-ブタノールなど） を用いてこれら 2液相 間の分配係数の差異を利用する分配クロマトダラフィ一、 シリ力ゲル等を固定相 とする順相クロマトグラフィーや 0DS-シリ力ゲル等を固定相とする逆相クロマ トグラフィーなどの高速液体クロマトグラフィー （HPLC) 等を使用することがで きる。
例えば、 本発明の方法によって製造した L H— R H誘導体は、 親水性であるた め、 上記のような水と完全には混和しない有機溶媒を用いて、 以下のようにして 精製することができる。 上述のように反応させた反応混合液を、 有機溶媒で抽出 し、 抽出液に水を加えて分配し、 ェ一テルなどの溶媒で固化する。 抽出に用いる 有機溶媒としては、 n-ブタノール （n_BuOH) などが好ましい。 これらの溶媒は極 性が高いために抽出効率が高く、 かつ水と混ざり合わないことから、 次の工程で 行う分配クロマトグラフィ一にとつて都合が良いことによる。 反応混合液 （l，200mL) に、 約 1ノ4量の n-ブタノール （300mL) を加えて、 反応混合液中の水との分配クロマトグラフィーを行う。 n-ブタノールによる抽出 は、 適宜繰り返してもよい。 水層と有機層とは別々に濃縮する。 このとき、 水層 からは、 上記（7)のペプチドフラグメントが回収されるため、 再度反応に使用す ることができる。
分配クロマトグラフィ一によつて有機層から得られた粗精製物は、 ジェチルェ 一テル、 酢酸ェチルなどによって固化することが、 L H— R H誘導体がこれらの 溶媒に難溶性であることから好ましい。 ついで、 この固化された粗精製物を、 例 えば、 酢酸アンモニゥムなどの適当な緩衝液に溶解し、 適当な固定相と移動相と を用いてカラムクロマトグラフィーで分画する。 固定相として、 C Mセルロース のような弱陽イオン交換樹脂、 S Pのような強陽イオン樹脂などを用いると、 L H— R Hに含まれる Arg残基による相互作用を得ることができる。 移動相として は、 固化した粗精製物を溶解したと同じ緩衝液を用いて、 塩濃度を直線勾配で高 めると収率が高いという利点がある。 具体的には、 0. 01 Mの酢酸アンモニゥム 水溶液と 0. 1 M酢酸アンモニゥム水溶液とを用いることができる。 得られた溶出 液を固定相と溶離液を適当に選択して HPLCで精製することによって得ること力 できる。 HPLCにおいては、 固定相として TSKゲル ODS- 120Tなどの 0DSシリカ力 ラムを使用することができ、 0DSシリカカラムの使用が最適である。 また、 移動 相としては 0. 1 %TFA—ァセトニトリルなどを使用することができる。 ここで、 ァセトニトリルの含有量は、 開始時の 0. 1 %TFA _ 20 %ァセトニトリルから毎分 1 %ずつ変化させて、 0. 1 %TFA— 50%ァセトニトリルとする直線濃度勾配とする と、 目的の L H— R Hペプチドの分離がよい。 精製は上記の精製方法に限られる ものではない。 また、 固定化酵素を使用する場合には、 分配クロマトグラフィー を行うことなく、 イオン交換にかけることができる。
本発明の方法は、 L H— R H誘導体を製造するための従来の既知の方法に比べ て以下に述べるような利点があリ、 工業的に極めて有用である。
ィ） 酵素反応の性質上ラセミ化等の副反応を伴わず合成することができるため精 製分離が容易である。 口） 収率が高く、 また未反応のフラグメントは、 回収再利用できるので経済的に 有利である。
LH— RH誘導体は必要に応じて医薬品として許容され得る塩、 例えば、 酢酸 塩、 塩酸塩、 リン酸塩等にすることができる。 実施例
以下、 本発明を実施例を挙げてより具体的に説明するが、 本発明はこれらに限 定されるものではない。
以下の実施例において、 得られた純粋ペプチドの同定は、 高速液体クロマトグ ラフィ一 （HPLC) の保持時間の測定、 旋光度の測定およびアミノ酸分析により行 つた。 これらの測定は、 特に示さない限り、 下記の測定法および測定条件により 行った。
( 1 ) 高速液体クロマトグラフィー （HPLC)
高速液体クロマトグラフィー分析には、 LC- Module- 1 (日本ウォーターズ - リ ミテッド社製） を検出器として用いた。
(HP LC分析条件）
カラム： TSK gel 0DS-120T (4.6x250腿）
溶離液： 0.1% TFA-ァセトニトリル
(ァセトニトリルを 20%から 50%まで毎分 1 %変化させる直線勾配グラジ ェン卜）
： 1 mL/min
検出波長： 220nm
(2) 旋光度
旋光度の測定には、 DIC-370 (日本分光工業社製） を用いた。
(旋光度測定条件）
光線： Naランプ 589nm
温度： 20°C
層長： 100讓 濃度： 5 mg/mL
(3) アミノ酸分析
アミノ酸分析は、 得られたペプチドを 6 Nの塩酸 （0.1%フエノール含有） 中 で 110°Cにて、 20時間加水分解した後に、 日立アミノ酸分析装置 L-8500型 （日 立製作所製） を用いて行った。
〔実施例 1〕 pGl_u- Hi - Trp- Ser- Tyr- D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEtの製造 (1-1) Boc-Arg(Tos)- Pro- MEtの製造
Boc- Arg(Tos)- OH 214.3gを THF 150mLおよび DMF 100mLの混合溶媒に溶解し、 ドライアイス一エタノールで一20°Cに冷却した。 次に、 これに N-メチルモルフ オリン 35mLを滴下し、 続いてイソブチルクロロフオルメイト 66mLを滴下して、 一 2CTCで 1分間撹拌して該当する混合酸無水物を製造した。 得られた反応液を、 H-Pro-NHEt 71. lgを THF 300mLに溶解した溶液と混合し、 0 °Cで 5分間、 室温 で 30分間撹拌した。 その後、 得られた反応混合液を減圧濃縮した。 残渣に酢酸 ェチル l，200mL (2回） を加えて、 水 500mLで 2回洗浄した後、 酢酸ェチル層を 減圧濃縮した。 残渣をエーテルで処理して固化し、 乾燥した。 このようにして Boc- Arg(Tos)- Pro-NHEt 221.18g (収率 80.0%) が得られた。
Boc- Arg(Tos)- Pro- NHEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記に 示す。
m.p. ： 100〜102°C
[a]D ： -30.3 (c=1.0， eOH)
Rf ： 0.69 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 (C25H40N606S . H20として）
理論値 C:52.61% H:7.42% N： 14.73%
測定値 C:52.85% H： 7.30% N:14.41%
(1-2) Z-Leu- Arg(Tos)- Pro- NHEtの製造
上記（卜 1) で製造した Boc- Arg(Tos)- Pro-匪 Et 110.54 gをジクロロメタン (DCM) 150mLに溶解した。 これに、 氷冷下で TFA 150mLを加えて、 30分間室温で 撹拌した。 得られた反応液を減圧濃縮し、 残渣にェ一テル I，500mLを加えて固化 し、 乾燥した。 このようにして H- Arg(Tos)- Pro- NHEt'TFAを得た。
この脱保護体 H- Arg(Tos)-Pro- NHEい TFAを、 DMF 80mLおよび THF 200mLの混 合溶媒に溶解し、 冷却しながら N-メチルモルフォリンで中和した。 次いで、 Z - Leu-OH 53.06g と HOSu 23.02 gとを THF 200mLに溶解した液、 および WSC 36.4 mL を加えて 0°Cで 5分間、 室温で一夜撹拌した。 ニンヒドリンでの確認後、 反 応混合液を減圧濃縮した。
残渣に酢酸ェチル l,500mLを加え、 水 500mLで 2回、 飽和食塩水 500 で 2 回洗浄した。 次いで、 酢酸ェチル層を減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理して固 化し、 乾燥した。 このようにして、 Z- Leu- Arg(Tos)- Pro-NHEt 119.5g (収率 85.1%) が得られた。
Z- Leu- Arg(Tos)- Pro- NHEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記 に示す。
m.p. ： 99〜103°C
[a] D ： - 40.6(c=1.0， MeOH)
Rf ： 0.75 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C34H49N707Sとして）
理論値 C:58.35% H:7.06% N:14.01%
測定値 C:58.40% Η:7.26% Ν:13.7δ%
(1-3) Z - D- Ser(But)-Leu- Arg- Pro- NHEtの製造
上記 U-2) で製造した Z- Leu- Arg(Tos)- Pro- NHEt 20.99gにァニソール 32mLを 加え、 次いで、 ドライアイス—エタノールで- 70°Cに冷却しながら HF約 200mL を加えて 0°Cで 1時間撹拌した。 その後、 減圧濃縮して、 残渣をェ一テルで処理 した。 析出した生成物を濾取し、 水酸化ナトリウム上で真空乾燥し H-Leu-Arg - Pro-NHEt -HFを得た。
' Z- D- Ser(But)- OH 8.86gを THF lOOmLに溶解した。 これをドライアイス—エタ ノールで - 20°Cに冷却し、 N-メチルモルフォリン 3.3mLを滴下し、 次いでイソブ チルクロロフオルメイト 3.96mLを滴下した後、 -20°Cで 1分間撹拌して該当する 混合酸無水物を製造した。 得られた反応液を、 H-Leu- Arg- Pro- NHEt'HFの DMF 200mL溶液 （N-メチルモルフォリンで中和したもの） と混合し、 0°Cで 5分間、 室温で 30分間撹拌した。 その後、 減圧濃縮し、 残渣に水 500mLを加えて、 n -ブ タノール 200mLで 5回抽出した。 抽出液を水で 5回洗浄した後、 n-ブタノ一ル 層を減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理して固化した。 このようにして Z-D - Ser (But)-Leu-Arg-Pro-NHEt 22.89g (収率 90.5%) が得られた。
Z- D- Ser(But)- Leu- Arg-Pro-MEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値 を下記に示す。
m.p. ： 121〜123°C
[a] D ： -49.0(c=1.0, MeOH)
Rf ： 0.51 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C34H56N807として）
理論値 C :59.28% H:8.19% N： 16.27% '
測定値 C :59.01% H:8.15% N:16.19¾
(1-4) Z-Ser-Tyr-0Meの製造
Z-Ser-0H 23.9gおよび H-Tyr-0Me 23.2gを DMF50mLに溶解し、 HOSu 12.7gお よび WSC 20mLを加えて 0°Cで 5分間、 室温で一夜撹拌した。 ニンヒドリンで確 認後、 反応混合液を減圧濃縮した。 残渣に酢酸ェチル 500mLを加え、 1 N塩酸 200mLで 2回、 飽和重曹水 200mLで 2回、 飽和食塩水 2回の順で洗浄した。 酢酸 ェチル層を減圧濃縮し、 残渣をへキサンで処理して固化した。 このようにして Z-Ser-Tyr-0Me 38.44g (収率 92.3%) が得られた。
Z- Ser- Tyr- OMeの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記に示す。 m.p. ： 49〜53°C (分解）
[a] D ： +2.3(c=I.0， MeOH)
Rf ： 0.89 (BuOH/AcOH/H0=4/l/5) 元素分析値 （C21H24N207として）
理論値 C:60.57% H:5.81% N:6.73%
測定値 C:60.88% H:5.88% N:6.99%
(1-5) Z-Ser- Tyr- NHNH2の製造
上記（1- 4)で製造した Z- Ser-Tyr- OMe 38. Ogをメタノール 200mLに溶解し、 ヒ ドラジン 50 gを加えて、 室温で一夜放置した。 その後、 減圧濃縮し、 メタノ一 ル洗浄した。 このようにして Z- Ser- Tyr-MNH2 34.2g (収率 90.0%) が得られた。
Z-Ser- Tyr- NHNH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記に示す。 m.p. ： 194〜197 °C
[a] D ： +9.9(c=1.0, DMF)
Rf ： 0.64 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C2。H24N406として）
理論値 C:57.69% H:5.81% N:13.45¾
測定値 C :57.85% H:5.83% N:13.49%
(1-6) Z - Ser- Tyr- D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEtの製造
上記（1-3)で製造した Z- D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEt 28. Ogをメタノール 300mLに溶解し、 10%パラジウム Z炭素 2.5g の存在下で水素を添加した。 7時 間室温で撹拌した後、 触媒を除去して減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理した。 このようにして、 H- D-Ser(But) - Leu- Arg- Pro- NHEtを得た。
上記（卜 5)で製造した Z- Ser-Tyr-NHNH2 20. lgを DMF 150mLに溶解し、 ドライ アイス一エタノールで- 20°Cに冷却した。 その溶液に、 4N HC卜ジォキサン 43.5 mL、 および亜硝酸ィソァミル 6.5mLを添加してアジド化合物とした。 さらにト リエチルアミン 24.4mLを添加して中和した。 その混合液を H- D- Ser (But)- Leu- Arg-Pro-NHEtの DMF 150mL溶液に移し、 - 20°Cで 2時間、 4でで 17時間攪拌し た後濃縮した。 残渣に水 500raLを加え、 n-ブタノ一ル 200mLで 5回抽出した。 水で 5回洗浄後、 n-ブタノール層を減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理して固化 した。 このようにして Z-Ser-Tyr-D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEt 33.2g (収率 87.5%) が得られた。
Z- Ser-Tyr- D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro-NHEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元 素分析値を下記に示す。
in. p. 1 〜 118°C (分解)
O] D - 27.6(c=1.0， DMF)
Rf 0.36 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （( y ^として）
理論値 C:58.83% H:7.51% N:14.91¾
測定値 C:58.88¾ H:7.55% N： 14.90%
(1-7) Z - pGlu- His- OHの製造
Z-pGlu-OH 52.6gを THF 400mLに溶解した。 この溶液をドライアイスーェタノ —ルで- 20°Cに冷却し、 N-メチルモルフォリン 22.0mL、 ついでイソブチルクロ口 フォルメイト 26.4mLを滴下した後、 -20°Cで 1分間撹拌して該当する混合酸無水 物を製造した。 得られた反応混合液に HOSu 25.3 gを加えて 30分間攪拌した。 次いでこれに H- His- 0H · HC1 62.9gおよびトリェチルァミン（TEA) 28.0mLを水 400 mLに溶解した溶液を加えた。 0°Cで 1時間、 室温で一夜撹拌した後、 減圧 濃縮した。 残水溶液を酢酸ェチルで洗浄し、 水層を n-ブタノ一ル抽出した。 水 で数回洗浄した後、 n-ブタノール層を減圧濃縮した。 エーテルで固化した後水に 溶解し、 PH 5に調整した。 この水溶液を HP-20を充填したカラム（5.0 X 20cm)に 注入し、 流出液のパウリ一反応が土になるまで水洗した後、 メタノールで溶出し た。 溶出したメタノール液を減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理した。 次いでメ タノ一ルーエーテルで再結晶化した。 このようにして Z- pGlu- His-0H 59.5g (収 率 74.3%) が得られた。
Z-pGlu-His-OH の融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記に示す。 m.p. ： 146〜149°C (分解）
[a] D ： -0.91 (c=1.0, DMF) Rf ： 0.14 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C13H2。N406として）
理論値 C :57.00% H:5.03% N:13.99%
測定値 C:57.23¾ H:5.05% N： 14.05%
(1-8) Z - pGlu- His- Trp- OMeの製造
上記（1- 7)で製造した Z-pGlu- His- OH 40.0g、 H-Trp-OMe - HCl 19.6gおよび HOSu 12.7gを DMF lOOmLに溶解した。 次いで、 この溶液を冷却しながら N—メ チルモルフォリンで中和した後、 WSC 2. OmLを加えて 0°Cで 5分間、 室温で一夜 撹拌した。 ニンヒドリンでの確認後、 反応混合液を減圧濃縮した。 残渣に酢酸ェ チル— n-ブタノール（l:l)200mLを加え、 有機層を水 100mLで 3回洗浄した。 有 機層を減圧濃縮し、 残渣をェ一テルで処理して固化した。 このようにして Z- pGlu- His- Trp-OMe 48.5g (収率 92.3%) が得られた。
Z-pGlu-His-Trp-OMeの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記に示 す。
m.p. ： 112〜U5°C (分解）
[a] D ： -1.5(c=1.0,DMF)
Rf ： 0.3 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C31H32Ns07として）
理論値 C:61.99% H:5.37¾ N:13.99%
測定値 C:61.54% H:5.33% N:13.80%
(1-9) pGlu- His- Trp- OMeの製造
上記（1-8)で製造した Z-pGlu-His-Trp-OMe 40.0gを DMF 50mLに溶解し、 10% パラジウムノ炭素 500mgの存在下で水素を添加した。 7時間室温で撹拌後、 触 媒を除去して減圧濃縮する。 残渣をエーテルで処理して固化した。 このようにし て pGlu- His-Trp-OMe 28.5g (収率 91.8%) が得られた。
pGlu- His- Trp- OMeの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記に示す。 m.p. ： 132〜137°C (分解）
[a] D ： +4. l(c=1.0,DMF)
Rf ： 0.18 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C23H2SN605として）
理論値 C:59.22% Η:5.62% Ν:1δ.02%
測定値 C:59.01% H:5.55% N:17.89%
(1-10) H - Ser- Tyr- D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEtの製造
上記（1-6)で製造した Z- Ser- Tyr- D-Ser(But)- Leu- Arg-Pro- NHEt 93.0gをメタ ノール 800mLに溶解し、 10%パラジウムノ炭素 5.0g の存在下で水素を添加し た。 7時間室温で撹拌した後、 触媒を除去して減圧濃縮した。 残渣をエーテルで 処理して固化した。 このようにして H- Ser- Tyr- D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEt 74. Og (収率 90.3%) が得られた。
H-Ser-Tyr-D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEt の融点、 旋光度、 TLCの Rf および 元素分析値を下記に示す。
m.p. ： 124〜128°C (分解）
[a] D ： +10. l(c=1.0， DMF)
Rf ： 0.16 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C38 4N1C09 として）
理論値 C:56.70% H:8.01% N:17.40%
測定値 C :56.55% H:7.97¾ N:17.18%
(1-11) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEtの製造
上記（1- 9)で製造した pGiu- His- Trp-OMe 30gおよび上記（1-10)で製造した H - Ser- Tyr- D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEt 22gを n-ブタノ一ル飽和水 l,300mLに溶 解した。 1 Mの塩酸またはアンモニア水を用いて pH7.8 に調整し、 その溶液に 1， 000 U/mgのキモトリブシン 78mgを n-ブタノ一ル飽和水 2.5mLに溶解した溶 液を加え、 10°Cで 1時間撹拌した。 反応混合液に n-ブタノール 300mLを加えて 合成されたペプチドを水と n-ブタノ一ルとで分配し、 下層 （水層） と上層 （n - ブタノール層） とに分離した。 下層に n-ブタノール (200mL)を加えて同様の分配 クロマトグラフィーをさらに 3回繰り返した。 上層は水 lOOmLで 5回洗浄し、 有 機層および水層を別々に濃縮し、 それぞれをェ一テルで固化した。 水層より回収 した H- Ser-Tyr- D- Ser (But)- Leu- Arg-Pro- NHEtは、 再度反応に使用する。 有機層 (n-ブタノール） を濃縮し、 残渣にェ一テルを加えて粉末化した。
有機層より得られた粉末は 0.01 M酢酸アンモニゥム水溶液に溶解して、 CM— セルロースを充填したカラム（4x30cm)にアプライした。 0.01 M酢酸アンモニゥ ム水溶液 （PH4.4) 500mL〜0.1 M酢酸アンモニゥム水溶液（pH4.4) 500mLの直線 型濃度勾配溶出（60mL/時間）を行って、 その溶出液を 10mLづっ分画採取した。 溶 出液を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、 目的画分を集めて凍結乾燥し た。 このようにして、 pGlu- His- Trp- Ser- Tyr-D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEt 22.4gが得られた （収率 74.9%) 。
pGlu- His- Trp- Ser-Tyr- D-Ser(BuO- Leu- Arg- Pro- NHEtの旋光度、 元素分析値 およびアミノ酸分析値を下記に示す。
[a]D ： - 46.0(C=1， H20)
元素分析 （CS。H86N16013-CH3C00H-2H20として） .
理論値 C，55.76% H, 7.09% N, 16.78%
測定値 C，55.60% H, 7.10% N, 16.79¾
ァミノ酸組成；
Ser 2.05(2), Glu 1.08(1), Pro 0.99(1), Leu 1.09(1), Tyr 0.92(1), His 0.93(1)， Arg 1.06(1)
(1-12) 固定化酵素による pGlu- His- Trp- Ser- Tyr- D- Ser(Bm)- Leu-Arg-Pro - NHEtの合成
(DpGlu-Hi s - Trp- Ser- Tyr-D- Ser (Bu t ) - Leu- Arg- Pro-NHEtの合成
上記（1-9)で製造した pGlu-His-Trp-OMe 2.00gおよび上記（ 1-10)で製造した H-Ser-Tyr - D- Ser(But)-Leu - Arg - Pro - NHEt 1.30gを水 200mLに溶解し、 1 Mの塩 酸またはアンモニア水を用いて、 PH7.8に調整した。 この溶液に、 2，000 U/gの 固定化キモトリブシンを （ァガロース担体） 2.5gを加えて懸濁し、 pH7.8である ことを確認したのち、 10°Cで 1時間攪拌した。 反応液をガラスフィルタ一により 濾過して固定化キモトリプシンを除去した。
濾液を濃縮し、 CM -セルロースを充填したカラム （4 x30cm) にアプライし た。 0.01Mの酢酸アンモニゥム水溶液 （pH4.4) 500mL〜0.1Mの酢酸アンモニゥム 水溶液 (PH4.4) 500mLの直線型濃度勾配溶出 （60 /時間） を行って、 その溶出 を 10 mLずつ分画採取した。 溶出液を HPLCにより分析し、 目的の画分を集めて 凍結乾燥した。 このようにして pGlu-His- Trp- Ser- Tyr- D- Ser(But)- Leu- Arg - Pro-NHEt 1.45gを得た (収率 82.4%) 。
なお、 得られた化合物の融点、 旋光度、 TLCの Rf値および元素分析値は、 実 施例 1の（1-11)で製造した pG 1 u-H i s-Trp-Ser-Ty r-D-Se r (Bu t ) -Leu-Arg-Pro- NHEtのものと一致した。
(2)基質特異性の検討
上記の酵素反応の条件で、 表 1に示すペプチドを基質として反応を行い、 反応 開始 2時間後に生成されたべプチドを HPLCで分析し、 各ピークの面積から、 収 率を算出した。
1
使用した基質 収率 （％) pGlu-His-Trp-OMe + H-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt 78.8 pGlu-His-D-Trp-OMe + H- Ser- Tyr-D- Ser(tBu)- Leu- Arg- Pro-冊 Et 0.0 pGlu-D-His-Trp-OMe + H-Ser- Tyr-D- Ser(tBu)- Leu- Arg- Pro- NHEt 7.8 pGlu-His-Trp-OMe + H- D-Ser- Tyr- D- Ser(tBu)- Leu- Arg- Pro- NHEt 0.0 _ 表 1に示すように、 酵素の認識部位である Trpが D体である基質を使用した場 合には、 収率は 0%で反応は全く進行しないことが示された。 また、 酵素の認識 部位の N末端側に隣接する Hisが D体である基質を使用した場合には、 収率は 7.8%と低かったが、 生成物があることが確認された。 酵素の結合部位である Serが D体である基質を使用した場合も、 収率は 0 %で、 反応が進行しないこと
9? が明らかになった。
以上より、 酵素合成を用いると、 酵素の基質特異性により、 Serおよび Hisの ラセミ化カ ¾3こりにくく、 光学純度の高い製品が得られることが示された。
〔実施例 2〕
本実施例において、 実施例 1の （ 1-1)〜（ 1-3)にしたがって製造した Z-D- Ser (But)-Leu-Arg-Pro-NHEt を、 下記 (2-1)〜（2- 3)にしたがって製造した以外は実 施例 1と同様にして pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEtを製 造した。
(2-1) Z-Leu- Arg- MNH2の製造
Z- Leu- OH 172.5gおよび H-Arg-OEい 2HC1 178.9gを DMF/THF(1 ）混合溶液 800 mLに溶解し、 0°Cにて N-メチルモルフォリン 143mLを加えて中和した。 次 いで DCC 147.5mLを加えて 0°Cにて 5分間、 室温にて 15時間攪拌した。 反応溶 液を減圧濃縮し、 得られた残渣に水 l，000raLを加えて、 酢酸ェチル 500mLで 2 回洗浄した後、 水層を n-ブタノール l,000mLで 3 回抽出した。 得られた n-ブタ ノ一ル層を減圧濃縮することにより Z- Leu - Arg- OEt が得られた。
Z-Leu-Arg-OEt をメタノール 500mLに溶解し、 氷冷下にて腿, ΝΗ,· 0 150mLを 加え、 室温にて 18時間攪拌した。 反応液を減圧濃縮して得られた残渣に水 500 mLをカロえ、 n-ブタノール l，00OmLで 5 回抽出した。 抽出液を水 500 mLで 4 回 洗浄した後、 減圧濃縮した。 得られた残渣をェ一テルで処理して固化し、 乾燥し た。 このようにして、 Z- Leu- Arg- NHNH2 209.7g (収率 74.1%)が得られた。
Z-Leu-Arg-丽 NH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf値、 および元素分析値を下記に示 す。
m.p. ： 105〜107°C
[a] D ： -30.6 (c =1.0， MeOH)
Rf値 ： 0.60 (BuOH/AcOH/H,0 = 4/l/5)
元素分析値 （C2。H33N704として） 理論値 C:55.61% H:7.64% N:22.51%
測定値 C:55.84% H:7.42% N:22.41%
(2-2) Z-Leu-Arg-Pro-NHEtの製造
上記（2- 1)で製造した Z-Leu- Arg- NHNH2 130.8g を DMF 500mLに溶解し、 ドラ ィアイス—エタノールで - 20°Cに冷却した。 その溶液に、 4N HC卜ジォキサン 225mL、 および亜硝酸ィソァミル 40.5mLを添加してアジド化合物とした。 さら にトリエチルァミン 126mLを添加して中和した。 その混合液を H- Pro- MEt 42.6g の DMF 200mL溶液に移し、 -20°Cにて 2 時間、 4°Cにて 16時間攪拌した 後濃縮した。 残渣に、 水 800mLを加え、 酢酸ェチル 400mLで 2 回洗浄した後に、 水層を n-ブタノール 800mLで 3回抽出し、 更に水 400mLで洗浄した。 得られた η-ブタノ一ル層を減圧濃縮した。 得られた残渣をエーテルで処理して固化し、 乾 燥した。 このようにして、 Z- Leu- Arg- Pro-NHEt 154.5g (収率 94.3%)が得られた。
Z-Leu- Arg- Pro- NHEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf値、 および元素分析値を下記 に示す。
m.p. ： 125〜126°C
[a] D ： -66.6 (c =1.0 MeOH)
Rf ： 0.45 (BuOH/AcOH/¾0 = 4/l/5)
元素分析値 （C27H43N705として）
理論値 C:59.43% H:7.94% N:17.97¾
測定値 C :59.31% H:7.78% N:18.13%
(2-3) Z - D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro-NHEt の製造
上記（2 - 2) で製造した Z-Leu- Arg- NHEt 154.5g をメタノール 1， 500mLに溶解 し、 10%パラジウム Z炭素 14gの存在下で水素を添加した。 16時間室温で攪拌 後、 触媒を除去して減圧濃縮して H- Leu- Arg- Pro- NHEt が得られた。
Z-D-Ser(But)-0H 82.3gを THF 200mLに溶解した。 これをドライアイス—エタ ノールで - 20°Cに冷却し、 N-メチルモルフォリン 30.7mLを滴下し、 次いでイソ プチルクロロフオルメイト 36. 3 mL滴下した後、 - 20°Cで 1 分間攪拌して該当 する混合酸無水物を製造した。 得られた反応液を、 H-Leu-Arg- Pro-NHEtの DMF 700mL溶液と混合し、 0 °Cで 5分間、 室温で 30分間攪拌した。 その後、 減圧濃 縮し、 残渣に水 l，000mLを加え、 酢酸ェチル 500mLで 2回洗浄した後、 水層を 酢酸ェチル Zn-ブタノール (2/ 1 ) 混合溶液 l，000mLで 2回抽出した。 抽出液を水 500mLで 5回洗浄した後、 減圧濃縮して得られた残渣をェ一テルで処理して固化 し、 乾燥した。 このようにして、 D-Ser(But) -Leu-Arg-Pro-NHEt 178. 3g (収率 91. 2%)が得られた。
尚、 得られた化合物の融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値は実施例 1 の（1-3) で製造した D- Ser (But) -Leu-Arg- Pro- NHEt のものと一致した。
〔実施例 3〕 pG lu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEtの製造
(3-1 ) Boc-D-Leu-Leu-Arg(Tos) -Pro-NHEt の製造
実施例 1の（1-2)で製造した Z- Leu- Arg(Tos)- Pro- NHEt 20. 99gをメタノール 200mLに溶解し、 10%パラジウム 炭素 1. 5gの存在下で水素を添加した。 7時 間室温で攪拌した後、 触媒を除去して減圧濃縮した。 残渣をエーテルで処理して 固化した。 このようにして、 H-Leu-Arg(Tos) - Pro-NHEtを得た。
H-Leu-Arg(Tos) -Pro-NHEt を、 DMF 80mLおよび THF 200mLに溶解した。 この 溶液を冷却しながら N-メチルモルフォリンで中和した。 次いで、 この溶液に、 Boc-D-Leu-OH 8. 86gと HOSu 23. 02gとを THF 200mLに溶解した溶液、 および、 WSC 36. 4mLを加えて 0 °Cで 5分間、 室温で一夜撹拌した。 ニンヒドリンでの確 認後、 反応混合液を減圧濃縮した。 残渣に水 500mLを加え、 n-ブタノール 200mL で 5回抽出した。 水で 5回洗浄した後、 n-ブタノ一ル層を減圧濃縮し、 残渣をェ —テルで処理して固化した。 このようにして Boc- D- Leu- Leu- Arg(Tos) -Pro-NHEt 21. 5g (収率 92. 1%) が得られた。
Boc- D- Leu- Leu-Arg(Tos) - Pro- NHEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析 値を下記に示す。
m. p. ： 1 19〜121°C [a] D ： -45.2(c=1.0, MeOH)
Rf ： 0.50 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C3。H56N806として）
理論値 C:57.67% H:9.03% N:17.93¾
測定値 C :57.43% H:8.89% N:17.80¾
(3-2) Z-Ser-Tyr-D- Leu- Leu-Arg(Tos)- Pro-NHEtの製造
上記（3- 1)で製造した Boc- D- Leu- Leu-Arg(Tos)-Pro- NHEt 25.8gを DCM lOmL に溶解した。 氷冷下、 TFA 10mを加えて、 30分間室温で撹拌した。 次いで減圧濃 縮し、 残渣にエーテル 200mLを加えて固化し、 乾燥した。 このようにして、 H- D- Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt · TFAを得た。
Z-Ser-Tyr-NHNH2 16.6g を DMF lOOmLに溶解し、 ドライアイス一エタノールで -20°Cに冷却した。 その溶液に 4N ΗΠ-ジォキサン 29.8mL および亜硝酸イソァ ミル 5.3mLを添加してアジド化合物とした。 さらにトリェチルァミン 16.7mL を添加して中和した混合液を、 H- D-Leu- Leu- Arg(Tos)- Pro- NHEt · TFAの DMF 200 mL溶液に移し、 - 20°Cで 2時間、 4 °Cで 17時間攪拌した後、 濃縮した。 残渣に 水 500mLを加え、 n-ブタノ一ル 200mLで 5回抽出した。 水で 5回洗浄後、 n-ブタ ノール層を減圧濃縮し、 残渣をェ一テルで処理して固化した。 このようにして、 Z-Ser-Tyr-D- Leu- Leu- Arg(Tos)- Pro- NHEt 25. Og (収率 83.2%) が得られた。
Z- Ser- Tyr-D-Leu- Leu- Arg(Tos)- Pro- NHEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元 素分析値を下記に示す。
m.p. ： 1 〜118°C (分解）
[a] D ： -30. l(c=1.0， DMF)
Rf ： 0.32 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （cyyi^oとして）
理論値 C:59.45% H:7.54% N:15.41%
測定値 C:59.33% H:7.52¾ N:15.32% (3-3) H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEtの製造
上記（3- 2)で製造した Z-Ser-Tyr- D-Leu-Leu-Arg(Tos)-Pro-NHEt 20.4g に、 ァ 二ソール 32mL を加え、 ドライアイス一エタノールで - 70°Cに冷却した。 これに HF 200mLを加えて 0°Cで 1時間攪拌した。 その後、 減圧濃縮し、 残渣をェ一テ ルで処理し、 析出した生成物を濾取して水酸化ナトリウム上で真空乾燥した。 こ のようにして、 H-Ser- Tyr-D-Leu- Leu-Arg-Pro- NHEt 16. Og (収率 92.4%)が得ら れた。
H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu- Arg- Pro- NHEtの融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分 析値を下記に示す。
m.p. ： 12i〜123°C
[a] D ： +11.0(c=1.0, DMF)
Rf ： 0.20 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （(：371162 。08として）
理論値 C:57.35% H:8.06% N:18.07%
測定値 C :57.21% H:8.01% N:18.10%
(3-4) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D- Leu- Leu-Arg- Pro- NHEtの製造
H-Ser- Tyr-D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro- NHEtの代わりに、 上記（3- 3)で製造した H-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt 1.30gを用いた以外は実施例 1の（1-11)と 同様の方法により Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro- HEt 1.33gを得た (収率 76.4%) 。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEtの旋光度、 元素分析値および アミノ酸分析値を下記に示す。
[a] D ： -32.0 ( 00.52， 5%AcOH)
元素分析 （C59H84N160I2として）
理論値 C:58.59% H:7.00% N:18.53%
測定値 C:58.40% H:7.10% N:18.31%
アミノ酸組成； Ser 1.05(1)， Glu 1.08(1)， Pro 0.99(1)， Leu 2.09(2)， Tyr 0.92(1), His 0.93(1)， Arg 1.06(1)
〔実施例 4〕 pG 1 u-H is-Trp-Se r-Tyr-D-Se r(But) -Leu- Arg- P ro-Azg 1 y-NH9の製造 (4-1) Z-P ro-Azg 1 y-NH2の製造
Z-Pro-OH 24.9g、 セミカルバジド塩酸塩 11.2gおよびトリェチルァミン 14.5mLを DMF200mLに溶解した。 その溶液に、 0°Cに冷却下、 DCC 20.6gを加え、 4°Cで 16時間攪拌した。 その後、 反応混合液からジシクロへキシルゥレア（DCU) を濾過して除去し、 減圧濃縮した。 残渣に酢酸ェチル 500mLを加え、 水 20(kL で 2回で洗浄した。 減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理して固化した。 このよう にして Z- Pro- Azgly-NH2 16.7g (収率 54.3%) が得られた。
Z-Pro-Azgly-NH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下記に示す。 m.p. ： 189〜190 。C
[a] D ： -43.6(c=1.4, DMF)
Rf ： 0.62 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C14H18N404として）
理論値 C:54.89% H:5.95% N： 18.29%
測定値 C :54.41% H:7.74% N:15.60%
(4 - 2)Boc-Arg(N02)- Pro- Azgly-NI の製造
上記 (4- 1) で製造した Z-Pro- Azgly- M2 16.5g を DMF 500mLに溶解し、 10%パ ラジウムノ炭素 l.lg の存在下で水素を添加した。 7時間室温で撹拌後、 触媒を 除去して減圧濃縮した。 残渣にエーテル l,500mLを加えて固化し乾燥した。 この ようにして、 H-Pro-Azgly-NH2 · TFAを得た。
Boc-Arg(N02)-0H 13.5gを THF lOOmLに溶解し、 ドライアイス—エタノールで -20°Cに冷却した。 これに、 N-メチルモルフォリン 3.3mLを滴下し、 次いでイソ プチルクロロフオルメイト 3.96mLを滴下した後、 - 20°Cで 1分間撹拌して該当す る混合酸無水物を製造した。 得られた反応液を、 H-Pro- Azgly- NH2 · TFAの DMF 溶液 （N-メチルモルフォリンで中和したもの） 200mLと混合し、 0 °Cで 5分間、 室温で 30分間撹拌した後、 減圧濃縮した。 残渣に水 500mLを加え、 n-ブタノー ル 200mLで 5回抽出した。 水で 5回洗浄後、 n-ブタノール層を減圧濃縮し、 残渣 をエーテルで処理して固化した。 このようにして、 Boc- Arg(N02)-Pro-Azgly-NH2 16.7g (収率 88.6%) が得られた。
Boc-Arg(N02)- Pro-Azgly-NH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を下 記に示す。
m.p. ： 135〜137°C (分解）
[a] D ： +35.3。 (c=1.0, DMF)
Rf ： 0.49 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C17H31N907として）
理論値 C :43.12% H:6.60% N:26.62%
測定値 C :54.41% H:7.74% N:15.60%
(4-3)Z-Leu-Arg(N02)-Pro-Azgly-NH2 (配列番号 2 ) の製造
上記（4 - 2) で製造した Boc-Arg(N02) - Pro-NHEt 110.54gを DCM 150mL に溶解し た。 その溶液に、 氷冷下で TFA 150mLを加えて、 30分間室温で撹拌した。 次い でその反応混合液を減圧濃縮し、 残渣にエーテル l，500mLを加えて固化し乾燥し た。 このようにして、 H-Arg(N02)-Pro-NHEt · TFAを得た。
H-Arg(N02) -Pro-NHEt ' TFAを、 DMF 80mLおよび THF 200mLの混合溶媒に溶解 した。 この溶液を冷却しながら N-メチルモルフォリンで中和した。 次いで、 こ の溶液に、 Z-Leu-OH 53.06g (0.2mole)と HOSu 23.02g(0.22mole)とを THF 200mL に溶解した溶液、 および WSC 36.4mL (0.2mo 1 e)を加えて 0 °Cで 5分間、 室温で一 夜撹拌した。 ニンヒドリンでの確認後、 反応混合液を減圧濃縮した。 残渣に酢酸 ェチル l，500mLを加え、 水 500mLで 2回、 飽和食塩水 500mLで 2回洗浄した。 そ の後、 酢酸ェチル層を減圧濃縮し、 残渣をェ一テルで処理して固化し乾燥した。 このようにして、 Z-Leu-Arg(N02)- Pro-Azgly- NH2 (配列番号 2 ) 27.52g (収率 98.6%) が得られた。
Z-Leu-Arg(N0,)-Pro- Azgly- NH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を 下記に示す。
m.p. ： 88〜90°C
[a] D ： -30.2(c=1.5, DMF)
Rf ： 0.57 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C26H4()N1()08として）
理論値 C:50.31¾ H:6.50¾ N:22.57%
測定値 C :50.24% H:6.41% N:22.45%
(4 - 4)Z-D- Ser(But)- Leu-Arg- Pro- Azgly-NH2の製造
上記 (4-3) で製造した Z-Leu-Arg(N02) - Pro- Azgly- NH2 (配列番号 2 ) 16.5gを DMF 500mLに溶解し、 10%パラジウムノ炭素 1. lg の存在下で水素を添加した。 7時間室温で撹拌した後、 触媒を除去して減圧濃縮した。 残渣にェ一テル l,500mLを加えて固化し乾燥した。 このようにして H- Leu- Arg- Pro- Azgly-NH2 (配列番号 3) を得た。
Z-D-Ser(But)-0H 8.86gを THF lOOmLに溶解し、 ドライアイス—エタノールで - 20°Cに冷却した。 この溶液に、 N-メチルモルフォリン 3.3mLを滴下し、 次いで イソプチルクロロフオルメイト 3.96mLを滴下した後、 - 20°Cで 1分間撹拌して該 当する混合酸無水物を製造した。 得られた反応液を、 H- Leu- Arg- Pro- Azgly-M2 の DMF 200mL溶液 （N-メチルモルフォリンで中和したもの） と混合し、 0°Cで 5 分間、 室温で 30分間撹拌した後、 減圧濃縮した。 残渣に水 50(kLを加え、 n -ブ タノ一ル 200mLで 5回抽出した。 水で 5回洗浄後、 n-ブタノ一ル層を減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理して固化した。 このようにして、 Z- D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro二 Azgly- NH2 16.9g (収率 78.3%) 力得られた。
Z-D- Ser(But)-Leu- Arg- Pro- Azgly-NH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf および元素 分析値を下記に示す。
m.p. ： U5〜118°C
[a] D ： -45.8(c=1.0, DMF)
Rf ： 0.51 (Bu0H/Ac0H/H0=4/l/5) 元素分析値 （C33H54N1()08として）
理論値 C :55.14% H: 7.57% N： 19.48%
測定値 C:55.01¾ H:7.42% N:19.33%
(4-5) Z-Ser-Tyr-D- Ser (But ) -Leu- Arg- Pro- Azg 1 y-NH2の製造
上記（4-4) で製造した Z-D-Ser(But)- Leu - Arg-Pro-Azgly-NH2 26.7g をメタノ —ル 500mLに溶解し、 10%パラジウム 炭素 1.9gの存在下で水素を添加した。 7時間室温で撹拌した後、 触媒を除去し、 減圧濃縮した。 残渣をェ一テルで処理 し、 析出した生成物を濾取し、 水酸化ナトリウム上で真空乾燥した。 このように して、 H- D- Ser(But)- Leu- Arg-Pro- Azgly- NH2を得た。
実施例 1の（1-5) で製造した Z- Ser- Tyr-NHNH2 18.5g を DMF 150mLに溶解し、 ドライアイス—エタノールで- 20°Cに冷却した。 その溶液に 4N HC卜ジォキサン 33. mL および亜硝酸ィソァミル 6. OmLを添加してアジド化合物とした。 さらに トリェチルァミン 18.7mL を添加して中和した。 その混合液を、 H-D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro-Azgly- NH2の DMF 150mL溶液に移し、 - 20°Cで 2時間、 4でで 17時 間攪拌した後濃縮した。 残渣に水 500mLを加え、 n-ブタノ一ル 200mLで 5回抽出 した。 水で 5回洗浄後、 n-ブタノール層を減圧濃縮し、 残渣をエーテルで処理し て固化した。 このようにして、 Z- Ser-Tyr-D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro-Azgly-NH2 28.3g (収率 78.6%) が得られた。
Z-Ser-Tyr-D-Ser(But)- Leu- Arg- Pro-Azgly- NH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf お よび元素分析値を下記に示す。
m.p. ： 110〜113°C (分解）
[a] D ： -28.2(c=1.0, DMF)
Rf ： 0.36 (BuOH/AcOH/H,0=4/l/5)
元素分析値 （C45H68NI2012として）
理論値 C:55.77% H:7.07% N:17.34%
測定値 C:55.64% H:7.01% N:17.29% (4- 6)H-Ser- Tyr- D-Ser(But)-Leu- Arg-Pro- Azgly-NH2の製造
上記（4-5) で製造した Z-Ser- Tyr- D-Ser(But)- Leu- Arg-Pro-Azgly-NH225.4g をメタノールに 500mLに溶解し、 10%パラジウム 炭素 1.3g の存在下で水素を 添加した。 7時間室温で撹拌した後、 触媒を除去して減圧濃縮した。 残渣をェ一 テルで処理して固化した。 このようにして、 H-Ser- Tyr-D- Ser(But)- Leu- Arg- Pro-Azgly-NH220.7g (収率 94.6%) が得られた。
H-Ser-Tyr-D-Ser(But) -Leu-Arg- Pro-Azgly-NH2の融点、 旋光度、 TLCの Rf お よび元素分析値を下記に示す。
m.p. ： 120〜122°C
[a] D ： +11.2(c=1.0, DMF)
Rf ： 0.31 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （cyyy^。として）
理論値 C:53.22% H:7.48% N:20.13%
測定値 C:53.19% H:7.43% N:20.01%
(4-7) pGlu- His- Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu- Arg-Pro- Azgly-NH2の製造
H-Ser- Tyr- D-Ser(But)-Leu-Arg- Pro- NHEt の代わりに、 上記（4-6)で製造した H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 1.30gを用いた以外は実施例 1の (卜 11)と同様の方法によリ、 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro- Azgly-NH2 1.29g (収率 75.9%)を得た。
pG 1 u-H i s-Trp-Se r-Tyr-D-Se r(But) -Leu-Arg- Pro- Azg 1 y-NH2の旋光度、 元素分 析値およびアミノ酸分析値を下記に示す。
[a] D ： - 52.4(01.0， DMF)
元素分析 （C59 4N18014として）
理論値 C: 55.82% H:6.67% N:19.86%
測定値 C: 55.70% H:6.55% N:19.72%
アミノ酸組成；
Ser 2.02(2)， Glu 1.07(1)， Pro 1.00(1), Leu 1.03(1)， Tyr 0.92(1)， Hi s 0. 94( 1) , Arg 1. 02( 1)
〔実施例 5〕 pG 1 u-H i s-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH.の製造
(5-1) H-Ser- Tyr-D-T p- Leu-Arg- Pro-Gly-NH2の製造
固相合成装置として Mi l l igen Bi oreserch社製ペプチドシンセサイザー 9600 を用いて固相合成を行った。
まず、 p-メチルベンズヒドリルァミン （MBHA) 樹脂 （ペプチド研究所社製、 ァ ミノ基 0. 72腿 ol/g) 694mg をペプチド固相合成用反応容器に入れ、 DCM 8 mL
( 4回、 各 1分間） 、 60% TFA含有 DCM溶液 8 mL (20分間） 、 DCM 4 mL ( 3 回、 各 15秒間） 、 DIEA 1 mL含有 DMF溶液 3 mL ( 2回、 各 1分間） DMF 8 mL
( 6回、 各 40秒間） の順でアルゴンガス気流中、 攪拌下にて処理した。 また、 各々の処理毎に濾過を行った。
—方、 pGlu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Trp- Leu-Arg- Pro- Gly-冊2のアミノ酸配列の第 10番目のアミノ酸残基に対応する Boc- G - 0H 2 mmo leを DCM 4 mLに溶解した。 この溶液をァミノ酸活性化容器に入れ、 DCC (0. 5 M -DCM溶液） 3 mLおよび HOBt (0. 5 M— DCM溶液） 4 mLを加え、 30分間反応させた。 反応液を濾過して 濃縮容器に移した。 これに DMF 3 mLを加え、 アルゴンガス気流下 DCMを留去し た。 その後、 DMF 3 mLを加え、 前記のペプチド固相合成用反応容器に移して 30 分間反応させた。 次いで DCM 8 mLで洗浄した （ 6回、 各 20秒間） 。 さらに、 Boc-Gly-0H 2 mmo lを DCM 4 mLに溶解し、 ァミノ酸活性化反応容器中で同様の 操作を繰り返すいわゆるダブルカツプリング法を行った後、 濾過して Boc- Gly- MBHA樹脂を得た。
次に、 得られた Boc-Gly- MBHA樹脂を DCM 8 mLで洗浄し （4回、 各 1分間） 、 濾過した。 これに、 60%TFA含有 DCM溶液 8 mL (20分間） 、 DCM 4 mL ( 3回、 各 15秒間） 、 DIEA 1 mL含有 DMF溶液 3 mL ( 2回、 各 1分間） 、 DMF 8 mL ( 6 回、 各 40秒間） の順でアルゴンガス気流中、 攪拌下にて処理し、 また、 各々の 処理毎に濾過を行った。
さらに、 pGiu- Hi s-Trp- Ser- Tyr-D- Trp- Leu- Arg- Pro- Gly-NH2のアミノ酸配列の 第 9番目のアミノ酸残基に対応する Boc- Pro-OH 2 mmole を DCM 4 mLに溶解し、 アミノ酸活性化容器中で DCC (0.5M— DCM溶液） 1.5mLを加え、 7分間反応させ た。 その後、 反応混合液を濾過して濃縮容器に移し、 これに DMF 3 mLを加え、 アルゴンガス気流下 DCMを留去した。 これに DMF 3 mLを加え、 前記のぺプチド 固相合成用反応容器に移して 30分間反応させた。 ついで DCM 8 mLで洗浄し （6 回、 各 20秒間） 、 濾過して Boc-Pro- Gly-MBHA樹脂を得た。
以下、 表 2に示すアミノ基保護アミノ酸を用いて順次 8番目から 4番目までの アミノ酸をカツプリングした。
2
ァミノ 保護アミノ酸 使用量
酸順序 (mmol)
8 Boc-Arg(Tos)-0H 2 x 2
7 Boc-Leu - OH 2
6 Boc-D-Trp-OH 2
5 Boc-Tyr(Bzl)- OH 2
4 Boc-Ser(Bzl)-0H 2 上記固相合成において、 Argを用いた場合はダブルカツプリングを行った。 このようにして、 保護ペプチド一 MBHA樹脂、 Boc-Se r (Bz 1 ) -Tyr (Bz 1 ) -D-Trp- Leu-Arg (Tos ) -Pro-G 1 y-MBHA樹脂 2.76gを得た。
上記保護ペプチド一 MBHA樹脂 2.76gにァニソ一ル 5 mLを加え、 さらに無水 フッ化水素 25mLを加えて、 0°Cで 1時間撹拌した。 反応後、 無水フッ化水素を 減圧下で留去し、 残查をェ一テルで洗浄した。 このようにして、 H- Ser-Tyr-D- Trp-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH2 1.30g力得られた。
H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH, の旋光度、 TLCの Rf および元素分析値 を下記に示す。
[a] D ： -50.4(c=1.0, MeOH) Rf ： 0.13 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C59H84N16012 ' AcOH · 2H20として）
理論値 C:54.31% H:7.04% N:17.27%
測定値 C:54.20% H:6.89¾ N:16.97%
(5-2)pGlu- His- Trp- Ser-Tyr-D- Trp-Leu-Arg- Pro-Gly-NH2の製造
H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt の代わりに、 上記（5-1) で製造した H-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 1.30gを用いた以外は実施例 1の（卜 11) と同様の方法によリ、 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 1.26g (収率 75.45%) を得た。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D- Trp- Leu-Arg-Pro-Gly- NH2の旋光度、 元素分析値およ びアミノ酸分析値を下記に示す。
[a] D ： -56.6(C=1.0, H20)
元素分析 （C64H82N180l3 · AcOH · 2H20として）
理論値 C:56.32% H:6.44% N:17.91¾
測定値 C:56.20% H:6.38% N:16.97%
アミノ酸組成；
Ser 0.98(1)， Glu 1.07(1), Gly 1.01(1)， Pro 0.99(1)， Leu 1.00(1), Tyr 0.92(1)， His 0.95(1), Arg 1.08(1)
〔実施例 6〕 pG 1 u-H is-Trp-Ser-Tyr- (2-ナフチル）- D- A 1 a-Leu-Arg-P ro-G 1 y-NH7 の製造
(6- 1 ) H-Se r-Tyr- (2-ナフチル） - D-A 1 a-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH2の製造
第 6番目のアミノ酸残基に対応する Boc-D- Trp- 0Hの代わりに Boc-D- (2-ナフ チル) - D- Ala-0Hを使用した以外は実施例 5の（5-1) と同様の処理をして、 H-
Ser- Tyr- (2-ナフチル） -D- Ala- Leu- Arg-Pro- Gly- NH20.98gを得た。
H-Ser- Tyr-(2-ナフチル） - D-Ala- Leu-Arg- Pro- Gly-NH2の旋光度、 TLCの Rf お よび元素分析値を下記に示す。 [α] D ： -44.1(C=1.0, MeOH)
Rf ： 0.15
元素分析値 （C47H66N12010として）
理論値 C:58.86% H:6.94% N:17.52%
測定値 C:58.72% H:6.88% N:17.49%
(6-2) pG 1 u-H i s-Trp-Ser- Tyr- (2-ナフチル） -D-A 1 a-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH2の製造 H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt の代わりに、 上記（6-1)で製造した H-Ser- Tyr- (2-ナフチル) -D-A 1 a-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH^.98g を用いた以外は実 施例 1の（1-11)と同様の方法によリ、 pGlu-His- TYp-Ser-Tyr- (2-ナフチル) -D- A 1 a-Leu-Arg-Pro-G ly-NH20.93g (収率 76.2%) を得た。
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr- (2-ナフチル） -D-Ala-Leu-Arg-Pro- Gly-NH2の旋光度、 元素分析値およびアミノ酸分析値を下記に示す。
[a] D ： —50.3(01.0， H20)
元素分析 （C69H88N180l4として）
理論値 C:59.47% H:6.37% N:18.09%
測定値 C:59.40% H:6.33¾ N:17.98¾
ァミノ酸組成；
Ser 0.98(1)， Glu 1.05(1)， Gly 1.00(1)， Pro 1.03(1)， Leu 1.00(1)， Tyr 0.93(1), His 0.94(1), Arg 1.07(1)
〔実施例 7〕 pG 1 u-H i s-Trp-Se r-Tyr-G 1 y-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH9 (配列番号 1 ) の
(7-1) H-Ser-Tyr-G 1 y-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH2 (配列番号 4) の製造
第 6番目のァミノ酸残基に対応する Boc-D- Trp- 0Hの代わリに Boc-Gly- 0Hを使 用した以外は実施例 5の（ 5- 1 )と同様の処理をして H- Se r-Tyr-G 1 y-Leu-A rg-P ro -
Gly-NH2 (配列番号 4) 1.12 gを得た。
H-Ser- Tyr- Gly-Leu- Arg- Pro- Gly-NH2の旋光度、 TLCの Rf および元素分析値を 下記に示す。
[a] D ： -40. l(c=1.0, MeOH)
Rf ： 0.10 (BuOH/AcOH/H20=4/l/5)
元素分析値 （C^H^NnOgとして）
理論値 C:53.00% H:7.14¾ N:20.60%
測定値 C:53.20% H:6.89% N:20.97%
(7-2) pG 1 u-H i s-Trp-Se r-Tyr-G 1 y-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH2 (配列番号 1 ) の製造
H- Ser- Tyr-D-Ser(But)- Leu-Arg- Pro-NHEt の代わりに、 上記（6-1)で製造した H-Ser-Tyr-G 1 y-Leu-Arg-Pro-G 1 y-NH2 (配列番号 4 ) 1.12gを用いた以外は実施 例 1の（卜 11)と同様の方法により、 pG 1 u-H i s-Trp-Ser-Ty r-G 1 y-Leu-Arg-Pro- Gly-NH2 (配列番号 1) 1.16g (収率 76.3%) を得た。
pGlu-His-Trp- Ser-Tyr- Gly-Leu-Arg-Pro-Gly- NH2の元素分析値およびァミノ酸 分析値を下記に示す。
元素分析 （C55H75N17013 · AcOH · 2H20 として）
理論値 C:53.55% H:6.54% N:18.63%
測定値 C:53.85% H:6.89¾ N:18.97%
アミノ酸組成；
Ser 1.01(1)， Glu 1.03(1), Gly 2.01(2), Pro 0.98(1)， Leu 1.01(1), Tyr 0.94(1), His 0.94(1)， Arg 1.08(1) 産業上の利用性
本発明の方法は、 酵素反応を利用することからラセミ化等の副反応を伴わない ので LH— RH誘導体の分離、 精製が容易である。 さらに、 しかも、 収率が高く、 未反応のぺプチドフラグメントを回収して再利用することが可能であるため、 ェ 業的に極めて有用である。 配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 1 0
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
他の情報 Xaaはピログルタミン酸残基を表す。
配列
Xaa Hi s Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1 5 10 配列番号： 2
配列の長さ ： 4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴：
他の情報：アミノ酸番号 2の Xaaは Arg (N02)、 アミノ酸番号 4の Xaaは Azgly
(ァザグリシン） -NH2を表す。
配列
Leu Xaa Pro Xaa
1 4 配列番号： 3
配列の長さ ： 4
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド 配列の特徴：
他の情報： Xaaは Azgly- NH2を表す。 配列
Leu Arg Pro Xaa
1 4 配列番号： 4
配列の長さ ： 7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
1 5 7

Claims

請求の範囲
1 . 一般式（1) ：
pGlu-His-Trp-OR1 (1)
(式中、 R1は低級アルキルを示す。 )
で表されるペプチドフラグメントと、
一般式 (2) ：
H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (2)
(式中、 Xは D-Leu、 D-Ser(But)、 D- Trp、 （2-ナフチル） -D- Ala、 Leuおよび Glyからなる群から選ばれるアミノ酸を示し、 Yは Gly-NH2、 Azgly (ァザグリシ ン） - NH2または NHR2 (R2は低級アルキルである。 ） を示す。 ）
で表されるぺプチドフラグメントとを、 キモトリブシンまたはキモトリプシン様 酵素からなる群から選ばれる酵素の存在下で反応させることを特徴とする、 一般式 (3) ：
pG 1 u-H i s-Trp-Ser-Tyr- X-Leu-Arg-Pro- Y (3)
(式中、 Xおよび Υは前記のとおりである。 ）
で表される L Η— R Η誘導体の製造方法。
2 . 前記 R1が、 炭素数 1〜 3のアルキル基であることを特徴とする請求項 1に 記載の L Η— R Η誘導体の製造方法。
3 . 前記 R2が、 炭素数 1〜 3のアルキル基であることを特徴とする請求項 1ま たは 2に記載の L Η— R Η誘導体の製造方法。
4 . 前記キモトリプシンまたはキモトリプシン様酵素からなる群から選ばれる酵 素が、 キモトリプシンであることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれかに記載の L H— R H誘導体の製造方法。
5 . 一般式 (4)： pGlu-His-Trp-ORl (4)
(式中、 R1は低級アルキルを示す。 )
で表されるぺプチドフラグメントと、
一般式 (5) ：
H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (5)
(式中、 Xは D-Leu、 D-Ser(But), D-Trp、 （2-ナフチル） -D-Ala、 および Gly からなる群から選ばれるアミノ酸を示し、 Yは Gly-NH2、 Azgly (ァザグリシン） -NH2または NHR2 (R2は低級アルキルである。 ） を示す。 )
で表されるペプチドフラグメントとを、 キモトリブシンまたはキモトリプシン様 酵素からなる群から選ばれる酵素の存在下で、 水または緩衝液と有機溶媒とを混 合した溶媒中で反応させることを特徴とする
一般式 (6) ：
pGlu-Hi s-Trp-Se r-Tyr-X -Leu-Arg-P ro-Y (6)
(式中、 Xおよび Yは前記のとぉリである。 ）
で表される L Η— R Η誘導体の製造方法。
6 . 前記水または緩衝液と有機溶媒とを混合した溶媒が、 水または緩衝液と水混 和性有機溶媒との混合溶媒、 または水または緩衝液を水と部分的に混和する有機 溶媒で飽和させた混合溶媒であることを特徴とする請求項 5に記載の L Η— R Η 誘導体の製造方法。
7 . 一般式 (7) ：
pGlu-His-Trp-ORl (7)
(式中、 R1は低級アルキルを示す。 ）
で表されるぺプチドフラグメントと、
一般式 (8) ：
H-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y (8)
(式中、 Xは D- Leu、 D-Ser(But), D-Trp、 （2-ナフチル） -D- Ala、 および Gly からなる群から選ばれるアミノ酸を示し、 Yは Gly-NH2、 Azgly (ァザグリシン） -NH2または MR2 (R2は低級アルキルである。 ） を示す。 ）
で表されるペプチドフラグメントとを、 キモトリブシンまたはキモトリプシン様 酵素からなる群から選ばれる酵素を固定化した固定化酵素の存在下で、 水または 緩衝液と有機溶媒とを混合した溶媒中で反応させることを特徴とする
一般式 (9) ：
pG 1 u-H i s-Trp-Se r-Ty r- X -Leu-Arg-P ro- Y (9)
(式中、 Xおよび Yは前記のとおりである。 ）
で表される L Η— R Η誘導体の製造方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2119724A1 (en) 2005-05-03 2009-11-18 Novetide Ltd. Solid-phase process foor the preparation of goserelin

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006133353A2 (en) * 2005-06-08 2006-12-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods of facilitating neural cell survival using non-peptide and peptide bdnf neurotrophin mimetics
CN101759777B (zh) * 2010-01-05 2013-06-05 江苏诺泰制药有限公司 一种戈舍瑞林的合成方法
RU2444525C2 (ru) * 2010-06-09 2012-03-10 Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" Способ получения нонапептидэтиламида и промежуточные соединения для его получения
RU2015141934A (ru) 2013-03-15 2017-04-20 Фарматрофикс, Инк. Непептидные миметики нейротрофина bdnf
JP2016519668A (ja) 2013-03-15 2016-07-07 ファーマトロフィックス， インコーポレイテッド 非ペプチドｂｄｎｆニューロトロフィン模倣化合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4234571A (en) * 1979-06-11 1980-11-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Nonapeptide and decapeptide derivatives of luteinizing hormone releasing hormone
JPS6113480B2 (ja) * 1976-05-11 1986-04-14 Ici Plc

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE43738T1 (de) 1984-06-26 1989-06-15 Siemens Ag Positioniereinrichtung fuer einen magnetplattenspeicher.
US5002872A (en) * 1989-05-10 1991-03-26 W. R. Grace & Co.-Conn. Enzyme mediated coupling reactions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6113480B2 (ja) * 1976-05-11 1986-04-14 Ici Plc
US4234571A (en) * 1979-06-11 1980-11-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Nonapeptide and decapeptide derivatives of luteinizing hormone releasing hormone

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D.A. LOVEJOY et al., "Primary Structure of Two Forms of Gonadotropin-Releasing Hormone from Brains of the American Alligator(Alligator Mississippiensis)", REGULATORY PEPTIDES, (1991), 33, p. 105-116. *
M. SCHUSTER et al., "Alpha-Chymotrypsin-Catalyzed (3+7) Segment Synthesis of the Luteinizing Hormone Releasing Hormone", TETRAHEDRON LETTERS, (1992), Vol. 33, No. 20, p. 2799-2802. *
NANCY SHERWOOD et al., "Characterization of a Teleost Gonadotropin-Releasing Hormone", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, (1983), Vol. 80, p. 2794-2798. *
See also references of EP1008656A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2119724A1 (en) 2005-05-03 2009-11-18 Novetide Ltd. Solid-phase process foor the preparation of goserelin
EP2119725A1 (en) 2005-05-03 2009-11-18 Novetide Ltd. Methods for the production of leuprolide

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