WO1999015196A1 - Pharmazeutisches präparat enthaltend vitamin k-abhängige einzelfaktoren - Google Patents

Pharmazeutisches präparat enthaltend vitamin k-abhängige einzelfaktoren Download PDF

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WO1999015196A1
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individual factors
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Yendra Linnau
Peter Turecek
Hans-Peter Schwarz
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Baxter AG
Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
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Baxter AG
Immuno AG
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    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical preparation containing vitamin K-dependent individual factors.
  • Protein K-dependent proteins are characterized by the fact that they require vitamin K in an essential way for their biosynthesis.
  • prothrombin factor II
  • Normal prothrombin contains ⁇ -carboxyglutamate at the N-terminal end, i.e. a second carboxyl group on the glutamate residue.
  • ⁇ -carboxyglutamate is a very strong chelator for calcium ions.
  • Prothrombin is bound to phospholipid membranes, which originate from cell membranes, eg from platelets, via these bound Ca 2+ ions in order to obtain the correct topology for initiating blood coagulation.
  • prothrombin have ⁇ -carboxyglutamate residues
  • the coagulation factors VII, IX and X are carboxylated on specific glutamate residues in order to develop a high affinity for calcium ions.
  • other proteins involved in the coagulation cascade such as Protein C, Protein S and Protein Z, also need vitamin K for their biosynthesis.
  • Vitamin K-dependent individual factors in particular factors II, VII, IX and X, have similar physico-chemical properties, such as similar molecular weights, pl's, electrophoretic mobility, etc., and are therefore generally referred to as a prothrombin complex (other name : Factor IX complex or PPSB complex). Due to the similar protein characteristics, it is difficult to prepare the factors individually. The production of prothrombin complex preparations with simultaneous isolation of all the factors contained was therefore always preferred in the prior art over the production of blood factor concentrates in the production of pharmaceutical preparations (see Brummelhuis in: Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academic Press, pages 117-128).
  • EP-A-0 700 684 describes a prothrombin complex concentrate together with at least one further component which promotes blood coagulation as an antidote for blood anticoagulants.
  • prothrombin complex concentrates contain activated coagulation factors, which are mostly active serine proteases, due to their purification from complex protein mixtures.
  • activated coagulation factors which are mostly active serine proteases
  • patients in particular should not be coagulated, since the development of thrombosis can or is fatal.
  • proteolytic inactivation of the individual factors occurs, which, depending on the individual stability of the individual factors, can have serious consequences.
  • prothrombin complex concentrates therefore tend to be unstable and are unsuitable for long storage. These degradation reactions, in particular through thrombin, even occur in the solid state, i.e. drying or lyophilization of the preparations does not lead to reliable storage stability.
  • prothrombin complex concentrates are extremely inflexible with regard to the relative ratios of the individual factors contained. There are hardly any possibilities to influence these relations in the course of the purification of the prothrombin complex, which is particularly disadvantageous when a prothrombin complex enriched with certain factors is desired. It is therefore an object of the present invention to provide pharmaceutical combination preparations of vitamin K-dependent proteins which are precisely defined or definable in their composition, have high stability, in particular in the case of long-term storage, and high flexibility in variation of their composition.
  • a pharmaceutical separated prothrombin complex preparation containing at least two chromatographically purified vitamin K-dependent individual factors as active substances.
  • the preparation according to the invention should contain highly purified factor IX in combination with at least one further highly purified vitamin K-dependent single factor.
  • the present invention a preparation is made available which contains the individual blood factors in highly purified form, which are freed from disturbing impurities, in particular from thrombin activity.
  • the individual factors to be combined according to the invention are purified from plasma or recombinant cells by chromatographic purification processes, such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography and / or molecular exclusion chromatography.
  • factor VII In the determination of factor II activity in particular, there are always falsified results due to the presence of traces of factor Ha, since traces of factor Ha already overlap the concentration determination of factor II in such a way that values are even many times higher than the theoretical Purity can be determined.
  • the factor VII values are therefore somewhat lower than the other factors, since factor VII is a very unstable protein that is converted to factor VIIa very quickly. Therefore, a factor VII preparation that has more than 10% of the theoretical purity is regarded as highly purified.
  • the preparation according to the invention is composed of individual factor preparations which are very precisely defined with regard to their activity or their degree of purity, the ratio of the individual factors to one another can also be set optimally. Problems that arise in the course of further processing of the total protein complex concentrates in the prior art, for example through loss of activity during virus inactivation, but also through processes that occur in the course of the purification process, can also be avoided from the outset, since after the union of the highly purified individual factors for the preparation according to the invention, preferably no further processing steps are carried out.
  • the preparation according to the invention thus has the overall advantage of being standardizable. This ensures that the respective individual factors are contained in the concentration +/- 10% deviation in the preparation.
  • Preferred individual factors are selected from the invention the group consisting of factor II, factor VII, factor IX, factor X, protein C, protein S and protein Z.
  • Preferred production methods for highly purified preparations of these proteins can be found, for example, in EP 0 796 623 (factors II and X), the A 594/97 (factor VII), EP 0 496 725 (factor IX), EP 0 533 209 (protein C) and EP 0 406 216 (protein S).
  • the factors II, VII, IX and X are preferably combined starting from highly purified individual factors, the highly purified individual factors protein C, protein S and / or protein Z possibly also being added in order to be able to provide a prothrombin complex which is as physiological as possible, ie a prothrombin complex whose composition corresponds to the physiological one - only without the disruptive accompanying proteins that flow from plasma during the course of the prothrombin complex purification, e.g. Thrombin.
  • the individual factors can be purified from plasma, in particular human plasma, or can be produced recombinantly. Since it is not necessary to separate the structurally and physicochemically very similar factors in the production by recombinant DNA technology, the preparation according to the invention is preferably composed of highly purified recombinant individual factors.
  • the factor can also be produced transgenically; it can be a derivative, in particular a peptide and / or a fragment.
  • the relative values of the highly purified individual factors can be set easily and in any relation to one another in the preparation, for example in that these conditions correspond to the natural conditions in the blood, that is to say approximately one unit of the other per unit of one factor Factor is present.
  • a preferred preparation according to the present invention therefore contains the highly purified individual factors Factor II, Factor VII, Factor IX and Factor X in a relative ratio, based on international units of (0.5 to 2): (0.5 to 2): 0, 5 to 2): (0.5 to 2). If protein C, protein S and / or protein Z are also present in the preparation, these individual factors also preferably have relative ratios of 0.5 to 2.
  • the individual factors on the basis of their relative stabilities, in particular in relation to their relative half-lives, i.e. that more is provided from a less stable factor and correspondingly less from the stable factor.
  • the intended period of use or effect can also be taken into account, i.e. the longer this period of time, the greater the weighting of these relative values.
  • Recombinant proteins with a changed half-life for example, can then also be standardized accordingly.
  • Other factors such as in vivo recovery can be included in a standardization of the factors.
  • a preparation which is preferred in this regard therefore comprises the individual factors Factor II, Factor VII, Factor IX and Factor X in a relative ratio, based on international units of (0.5 to 2): (5 to 35): (0.5 to 7 ): (0.5 to 5) because the half-lives of prothrombin are 60 hours, of factor VII 2 hours, of factor IX 20 hours and of factor X 40 hours.
  • a preferred preparation with these factors therefore contains the individual factors Factor II, Factor VII, Factor IX, Factor X, Protein C and Protein S in a relative ratio, based on international units of (0.5 to 2): (5 to 35): (0.5 to 7): (0.5 to 5): (1 to 15): (1 to 15).
  • Factor VII is usually considered to be quite unstable and is therefore preferably provided in an increased amount, for example in 10-fold concentration (based on international units) in the preparation according to the invention.
  • a particularly preferred preparation therefore contains individual factor VII and individual factor II in a ratio of greater than 10: 1.
  • the present preparation preferably provides a prothrombin complex or a partial prothrombin complex composed of highly purified individual factors.
  • the individual factors in the preparation do not form a complex. This can be demonstrated, for example, by analytical ion exchange chromatography on Q-Sepharose (Pharmacia), the individual factors being able to be eluted discretely when eluted with a salt gradient.
  • the complexes as they are present in the prothrombinase or in the pro-prothrombinase.
  • Prothrombinase is an enzyme-substrate complex that forms on a phospholipid surface and enables the activation of prothrombin.
  • prothrombinase consists of factor II (prothrombin), activated factor X (factor Xa), cofactor V or Va, phospholipids and calcium ions. These factors exist in vivo as a transient complex for activating the prothrombin and formation of the thrombin.
  • a corresponding pro-prothrombinase is defined as a complex of factors which are at least partially modified or activated to form a prothrombinase.
  • the pro-prothrombinase is therefore to be understood as a precursor of the prothrombinase and as a complex in which one or more components are present in their precursors, as zymogens or as proforms and which is formed on the basis of affinities of the components to one another.
  • a preferred embodiment is therefore characterized in that the preparation has no activated coagulation factors, in particular no factor Ha, IXa, Xa and given if Vlla contains.
  • Preferred preparations according to the invention contain less than 0.1 U factor VIII: C or factor VIII: Ag / mg protein and / or less than 0.1 U factor Ila / unit prothrombin and / or less 0.1 U factor Xa / unit factor X .
  • the preparation according to the invention further contains magnesium ions. These ions have a competitive effect on calcium ions and can displace the calcium ions especially in the complete or partial prothrombin complex. This prevents premature thrombin formation in a solution of the preparation according to the invention to an even greater extent and thus stabilizes it to such an extent that it remains stable for many hours even in an aqueous solution.
  • the pharmaceutical preparation according to the present invention can even be provided as a stable infusion solution, especially if it is ensured that it does not contain any free calcium ions.
  • the free calcium ion content can easily be determined by known ion titrations or other analytical methods.
  • a pharmaceutically acceptable chelating agent preferably EDTA, and related substances such as citrate.
  • the preparation according to the invention preferably also contains antithrombin III in the amounts in which it has hitherto been used as stabilizing agent in prothrombin complex concentrates, optionally together with heparin.
  • the preparation is therefore free from albumin and / or stabilizers, such as in particular antithrombin III and / or heparin.
  • the preparation according to the invention is also free of phospholipids.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention is treated on the basis of a treatment for virus inactivation of infectious viruses or other infectious agents.
  • This virus inactivation treatment is preferably ensured by two mutually independent virus inactivation or virus depletion methods.
  • This inactivation treatment is preferably ensured by a tenside and / or heat treatment, for example by a heat treatment in the solid state, in particular a steam treatment according to EP-0 159 311, EP-0 519 901 or EP-0 674 531.
  • Treatments for inactivating viruses also include treatment with chemical or chemical / physical methods, e.g. with chaotropic substances according to W094 / 13329, DE 44 34 538 or EP-0 131 740 (solvent) or photo inactivation.
  • Nanofiltration or antibody-enhanced nanofiltration is also a preferred method for depleting viruses in the context of the present invention.
  • the preparation according to the invention preferably also contains pharmaceutically acceptable buffer substances or stabilizers, for example the substances already provided for prothrombin complex concentrates in pharmacopoeias.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention can of course be used for all previous indications of the prothrombin complex.
  • the present invention therefore also relates to the use of the preparation according to the invention for the production of a preparation for the treatment of acquired or inherited bleeding disorders, for the treatment of severe bleeding, for the prophylaxis of bleeding, in particular in the presence of inherited bleeding disorders, for substitution therapy and for the treatment of haemophilia B. .
  • the preparation according to the invention also proves to be indicated for liver dysfunction.
  • a lyophilized prothrombin complex factor preparation which contained factors II, IX, X as well as protein C and protein S, was carried out according to the method of Brummelhuis, HGJ, Preparation of the Prothrombin Complex. In: Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, JM ed., 117-128, Academic Press, New York, (1980), and heat-treated for virus inactivation according to EP 159 311.
  • the lyophilizate was made accordingly (1000 U factor X / g, 1200 U factor II / g) dissolved in distilled water so that it contained 50 000 U factor X / l, and adjusted to pH 7.0.
  • the solid phase was then separated by centrifugation, 20 minutes at 5000 rpm, and the precipitate was washed twice with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, containing 10% ammonium sulfate, by resuspension and centrifugation again.
  • a third wash was carried out in an analogous manner with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, containing 150 mM NaCl.
  • the prothrombin complex fraction was eluted with 1 M sodium phosphate solution, pH 7.0, 25 ml of this solution per g of calcium phosphate being stirred at room temperature for 1 hour and then the remaining precipitate being separated off by centrifugation as above.
  • the supernatant was then subjected to ammonium sulfate precipitation with 366 g of ammonium sulfate per 1 h at 4 ° C. with stirring.
  • the precipitate containing the prothrombin complex fraction was centrifuged off as above.
  • the precipitate was 6.0, was added to a 25 mM trisodium citrate buffer containing 100 mM NaCl, 1 mM benzamidine hydrochloride, pH, and on a column filled with Sephadex ® G-25, at 4 ° C with a linear flow rate of 1 cm / min buffered against 25 mM trisodium citrate dihydrate buffer containing 100 mM NaCl and 1 mM benzamidine hydrochloride, pH 6.0, in order to separate the ammonium sulfate.
  • the UV absorption at 280 nm and the electrical conductivity were measured in the eluate stream.
  • the protein-containing fractions were combined and then subjected to ion exchange chromatography on DEAE-Sepharose FF ® , from Pharmacia.
  • the chromatography was carried out at 22 ° C. Before the proteins were applied, the column had been equilibrated with a 25 mM trisodium citrate dihydrate buffer containing 100 mM NaCl, 1 mM benzamidine hydrochloride, pH 6.0.
  • the protein fractions were eluted in 1
  • a factor II preparation prepared in this way had a specific activity of 6.9 U / mg protein.
  • the factor II activity was determined using the 1-step method, based on the thromboplastin time, using a factor II deficiency plasma against the international factor II standard using the reagent combination from IMMUNO, Vienna.
  • coagulation factors were traces or no longer detectable in coagulation analyzes (factor VII ⁇ 0.00002 E / E factor II, factor IX 0.0002 E / E factor II, factor X 0.004 E / E factor II, protein C 0.003 E / E factor II and factor VIII ⁇ 0.0002 E / E factor II).
  • factor II As an alternative production method for a highly purified factor II, a method was also used in which factor IX was first separated from a lyophilized prothrombin complex factor preparation by means of hydrophobic chromatography, then factor II was isolated and this was then highly purified by chromatography on hydroxyapatite.
  • the prothrombin complex factor preparation was dissolved as described above and incubated with detergent for 1 h at room temperature.
  • a Factor II, IX and X was subsequently by ion exchange chromatography on DEAE-Sepharose FF ®, Fa. Pharmacia, containing fraction isolated. From this then the Factor IX-containing fraction was purified by interaction with Butyl-Toyopearl ®, Fa. Toso Haas, removed. The adsorption supernatant was then purified on Phenyl-Sepharose High Performance ®, Fa. Pharmacia through a further hydrophobic interaction, with about 4 grams of protein / 1 gel could be adsorbed.
  • Plasmatic factor IX Plasmatic factor IX
  • prothrombin complex 150 ml of prothrombin complex were pre-cleaned using dextran sulfate (Miletich et al., Analytical Biochemistry 105, 304 (1980)). 20 ml of eluate (912 IU factor IX, 160 IU factor X) was applied to a column with 20 ml of an agarose polymer with octyl groups (Octyl-Sepharose-CL-4B (Pharmacia, Sweden)) at a flow rate of 360 ml / h plotted. The column was previously equilibrated with 80 ml of buffer A. After washing the loaded gel with 120 ml of buffer A, the factor IX-containing fraction was eluted with 80 ml of a 250 mmol NaCl solution.
  • factor IX The yield of factor IX was 54% of the initial activity. The specific activity was 186 IU. Factor IX / mg protein. Factor X was only present in traces.
  • High-purity Protein C was obtained from a crude Protein C fraction that was made from commercially available prothrombin complex concentrate. The purification was carried out by affinity chromatography using monoclonal antibodies. Anti-Protein C monoclonal antibodies were prepared as follows:
  • BALB / C mice were immunized with 100 ⁇ g human protein C at two-week intervals by intraperitoneal injection. After six weeks, another 50 ⁇ g of human protein C were injected and the fusion was carried out three days later.
  • the myeloma cell line (P3-X-63-AG8-653, 1.5 x 10 7 cells) was mixed with 1.7 x 10 8 spleen cells from a mouse, and the fusion according to the modified Koehler & Milstein method using PEG 1500 carried out (Koehler G., Milstein C., Nature 256 (1975), 495-497). Positive clones, tested using an ELISA, were subcloned twice. Ascites production was carried out by injection of 5 x 10 6 hybridoma cells per BALB / C mouse two weeks after Pristan treatment.
  • the immunoglobulin was purified from ascites by ammonium sulfate precipitation and subsequent chromatography using QAE-Sephadex and then chromatography on Sephadex G200. To reduce the risk of transmitting murine viruses, the antibody was subjected to a virus inactivation step before immobilization.
  • the monoclonal antibodies against protein C thus obtained were coupled to CNBR-Sepharose 4B (Pharmacia).
  • the following buffers were used to purify Protein C using affinity chromatography:
  • adsorption buffer 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 0.25 M NaCl and 5 mM benzamidine; the following was used as washing buffer: 20 mM Tris, 1 M NaCl, 2 mM
  • Benzamidine 2mM EDTA; the pH was 7.4; the following was used as elution buffer: 3 M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M
  • the prothrombin complex concentrate was dissolved in the adsorption buffer, about 10 g of the prothrombin complex concentrate being used for a 20 ml monoclonal antibody column.
  • the dissolved prothrombin complex concentrate was then filtered, centrifuged at 20,000 rpm for 15 minutes and sterile filtered through a 0.8 ⁇ m filter.
  • the sterile-filtered and dissolved prothrombin complex concentrate was applied to the column at a flow rate of 10 ml / h.
  • the column was then washed protein-free with the washing buffer and finally the bound protein C with the elu tion buffer eluted at a flow rate of 5 ml / h and the fractions collected.
  • the eluted protein C was dialyzed against a buffer (0.2 M Tris, 0.15 M glycine and 1 mM EDTA, pH 8.3).
  • the protein C content was determined antigenically by means of the Laurell method and in terms of activity after Protac activation.
  • the protein C eluate obtained was prepared in the following manner for a pharmaceutically administrable preparation:
  • the eluate was first subjected to an ultrafiltration and a diafiltration step.
  • the filtrate obtained was freeze-dried and virus inactivated by steaming for one hour at 80 ° C. ⁇ 5 ° C. and 1375 ⁇ 35 mbar.
  • the lyophilized virus-inactivated material was then dissolved in a sterile isotonic NaCl solution and any antibodies or serum amyloid P present were removed by means of ion exchange chromatography on Q-Sepharose.
  • the purified solution was concentrated through a further ultrafiltration and diafiltration step. Thereafter, 10 albumin, 150 mM NaCl and 15 mM trisodium citrate were added to the solution obtained.
  • the pH of the solution was 7.5.
  • Mouse immunoglobulin and factors II, VII, IX and X could not be detected.
  • the solution was then sterile filtered, filled and lyophilized.
  • the specific activity was 14 units of protein C / mg.
  • An amidolytic test was used as the activity test, the protein C being activated by means of Protac (Pentapharm).
  • Human protein S was produced from factor IX concentrate (prothrombin complex STIM-3 IMMUNO AG Vienna) using QAE-Sephadex and Blue Sepharose CL-6B chromatography (Pharmacia) in the following way: The lyophilized concentrate (100 g) was dissolved in 200 ml of sterile, ion-free water and against a buffer consisting of 0.01 M 2- (N-morpholineethanesulfonic acid), pH 6.0; 0.18 M NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM benzamidine HCl and 0.02% NaN 3 (start buffer), dialyzed. The dialyzed material was then applied to a QAE-Sephadex column (8 x 19 cm) and equilibrated with the buffer mentioned. 1.5 l buffer (starting buffer) was used as the washing solution.
  • Protein S was eluted at 110 ml / h with a linear NaCl gradient consisting of 1.2 l of start buffer and 1.2 l of a further buffer, which differs from the first buffer by adding 0.5 M NaCl.
  • the Protein S fractions were examined by Fast Flow SDS Page (Pharmacia) and antigen determination (Laurell) for Protein S, and fractions containing Protein S were pooled and finally dialyzed against a buffer.
  • This buffer contained 50 mM TRIS-HC1, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM benzamidine-HCl and 0.2% NaN 3 .
  • the Protein S pool was applied to a Blue Sepharose column CL-6B (2.5 cm x 10.5 cm) and equilibrated with the start buffer.
  • the washing was carried out at a rate of 15 ml / h with 500 ml of starting buffer.
  • the protein S could thus be eluted in the "void volume” while prothrombin adsorbed on the column.
  • the protein S-rich fractions were again determined using the SDS-Page Fast Flow System (Pharmacia) and according to Laurell (Scand. J. Clin. Invest. (Suppl.) 29 (1977) 21 (Suppl. 124)).
  • the protein S produced in this way had the characteristic morphology for protein S on a reduced SDS page, namely two close bands (doublet) with a molecular weight of approximately 86,000 and 76,000.
  • the protein concentration was determined spectrophotometrically using an extinction coefficient of 0.1 at 280 nm for human protein S, and was confirmed by the LOWRY method (Lowry 0., Rosebrough N., Farr AL, Randall R., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265).
  • the pre-purified protein S thus produced was used to produce sheep antiserum against protein S by making four immunization injections, 100 ⁇ g of protein S being administered subcutaneously with Freund's adjuvant in the first two injections and in the following booster- gene with incomplete adjuvant. After further boosters, the antiserum was tested by double immunodiffusion and showed a precipitation with purified protein S and with normal plasma.
  • the IgG fraction from 450 ml of antiserum was obtained by alcohol precipitation and subsequent adsorption on Sephadex A 50 in TRIS-HCl buffer, pH 6.8.
  • the supernatant from 450 ml of antiserum contained 1.14 g of anti-protein S-IgG.
  • the IgG fraction was coupled to 450 ml Sepharose CL-4B using 5.7 mg protein / ml Sepharose. The coupling efficiency was 76%.
  • the AntiProtein S column was equilibrated with glycine-HCl, pH 3, and adsorption buffer, pH 7.5.
  • the adsorption buffer consisted of 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 0.25 M NaCl, 2 mM benzamidine, 0.02% Tween ® 20, and 0.02% NaN 3, pH 7.4.
  • the washing buffer solution had the following concentrations: 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 1.0 M NaCl, 0, 5 mM benzamidine, 0.01% Tween ® 20; 0.02% NaN 3 , pH 7.4.
  • the elution buffer was composed as the washing buffer, with the modification that 0.05% Tween ® 20 and additionally 243.3 g NaSCN, pH 7.4 (a 3 M thiocyanate solution) were used.
  • the dialysis buffer solution contained 20 mM Tris, 0.15 mM glycine, 1 mM EDTA, 2 mM benzamidine, pH 8.3.
  • the protein S fraction prepared from prothrombin complex concentrate, 100 g of the fraction were dissolved in 1 l adsorption buffer and dialyzed overnight against an adsorption buffer solution. After application of the sample, the column was washed with washing buffer, approx. 5 l, protein-free, followed by elution with 3 M NaSCN in the elution buffer solution. The eluate was dialyzed immediately until SCN was below the detection limit; the eluate had a concentration of 500 ⁇ g / ml protein S. It was free of C4-binding protein.
  • Anti-Protein S monoclonal antibodies were prepared as follows:
  • mice were immunized with 100 ⁇ g of the protein S produced at two-week intervals by intraperitoneal injection. After six weeks, 50 ⁇ g of the human protein S were injected again and the fusion was carried out three days later.
  • the myeloma cell line (P3-X-63-AG8-653, 1.5 x 10 7 cells) was mixed with 1.7 x 10 8 spleen cells from a mouse, and the fusion according to the modified Koehler & Milstein method using PEG 1500 carried out (Köhler G., Milstein C, Nature 256 (1975) 495-497).
  • the immunoglobulin was purified from ascites by ammonium sulfate precipitation and subsequent chromatography using QAE-Sephadex and then chromatography on Sephadex G200.
  • the IgG fraction obtained from ascites and pre-purified on protein A-Sepharose was coupled to Sepharose CL-4B.
  • the affinity-chromatographic purification of protein S which was obtained from prothrombin complex concentrate, was carried out under the conditions described for polyclonal protein S antibodies.
  • the concentration of the protein S eluate was 600 ⁇ g / ml. It was free of C4 binding protein.
  • the protein S preparations highly purified by the method of polyclonal or monoclonal affinity chromatography, were subjected to an SDS page (gradient gel 8 to 12%) and they can be determined using Coomassie staining (Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ⁇ 1
  • prothrombin complex containing the factors prothrombin, factor VII, factor IX, and factor X, but without protein C and protein S, was prepared and sterile filled. According to international recommendations, 10,000 international units of heparin / 1 were added to the solution before bottling.
  • Example 4 Pharmaceutical preparation of the vitamin K-dependent proteins for permanent substitution and maintenance of constant plasma levels:
  • Example 5 Pharmaceutical preparation of a partial prothrombin complex:
  • prothrombin complex preparations which, after setting a normal plasma concentration of 1 unit factor VIII / ml, plasma concentration after 24 h has already decreased again below the concentration required for functioning hemostasis of at least 20%, while, for example, the prothrombin plasma level is still increasing 1
  • Chromogenic substrates S-2238, S-2222, S-2444, S-2366 and S-2251 from Chromogenix were used to determine the content of activated prothrombin complex factors. The determinations were carried out using the buffer conditions specified by the manufacturer.
  • the activated factors thrombin, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, activated protein C, which developed proteolytic activities against the peptide substrates used, could be determined by the chromogenic substrates. After evaluating the photometric analysis of the chromogenic conversion of the substrate, it was possible to determine that for all substrates the content in the preparations described above, containing vitamin K, proteins or selected factors of the prothrombin complex, were in each case below 10 mU / ml.

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Abstract

Beschrieben wird ein pharmazeutisches separiertes Prothrombinkomplex-Präparat, das mindestens 2 hochgereinigte Vitamin K-abhängige Einzelblutfaktoren enthält.

Description

Pharmazeutisches Präparat enthaltend Vitamin K-abhäncriαe Einzelfaktoren
Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat enthaltend Vitamin K-abhängige Einzelfaktoren.
Vitamin K-abhängige Proteine zeichnen sich dadurch aus, daß sie für ihre Biosynthese in essentieller Weise Vitamin K benötigen. So kann beispielsweise Prothrombin (Faktor II) , das unter Einwirkung von Vitamin K-Antagonisten gebildet wird, im Gegensatz zu normalem Prothrombin kein Ca2+ binden. Normales Prothrombin enthält am N-terminalen Ende γ-Carboxyglutamat , also eine zweite Carboxylgruppe am Glutamatrest . Im Zuge der Biogenese von funk- tionellem Prothrombin werden nämlich in der aminoterminalen Region des Proteins die ersten zehn Glutamatreste von einem Vitamin K-abhängigen Enzymsystem zu γ-Carboxyglutamat carboxyliert . Diese γ-Carboxyglutamatgruppe ist ein sehr starker Chelator für Calciumionen. Über diese gebundenen Ca2+- Ionen wird Prothrombin auf Phospholipidmembranen gebunden, die aus Zellmembranen, z.B. aus Blutplättchen stammen, um so die richtige Topologie zur Initiierung der Blutgerinnung zu erhalten.
Nicht nur Prothrombin besitzt γ-Carboxyglutamatreste, sondern auch die Gerinnungsfaktoren VII, IX und X werden an spezifischen Glutamatresten carboxyliert, um so eine hohe Affinität gegenüber Calciumionen auszubilden. Aber auch weitere an der Gerinnungs- kaskade beteiligte Proteine, wie Protein C, Protein S und Protein Z benötigen Vitamin K zu ihrer Biosynthese.
Vitamin K-abhängige Einzelfaktoren, insbesondere die Faktoren II, VII, IX und X, weisen ähnliche physiko-chemische Eigenschaften auf, wie z.B. ähnliche Molgewichte, pl's, elektrophoretische Mobilität, etc., und werden daher in der Regel gemeinsam als Prothrombinkomplex (andere Bezeichnung: Faktor IX-Komplex oder PPSB-Komplex) gewonnen. Auf Grund der ähnlichen Proteincharakteristik ist es schwer, die Faktoren einzeln präparativ herzustellen. Die Herstellung von Prothrombinkomplex-Präparaten mit gleichzeitiger Isolierung aller enthaltenen Faktoren war daher im Stand der Technik immer gegenüber der Herstellung von Blut- faktor-Konzentraten bei der Herstellung pharmazeutischer Präparate bevorzugt (siehe Brummelhuis in: Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academic Press, Seiten 117- 128) . Es zeigte sich aber auch, daß die Prothrombinkomplex-Faktoren auf Grund ihrer unterschiedlichen Stabilität bzw. Halbwertszeit niemals im physiologischen Verhältnis (jeweils 1 E des Proteins) gewonnen werden können (siehe Müller et al . , Krankenhauspharmazie 13 (11), (1992), 528-531; Köhler et al . , Thrombosis Research 60 (1990) , Seiten 63-70) .
In der EP-A-0 700 684 ist ein Prothrombinkomplex-Konzentrat zusammen mit wenigstens einer weiteren, die Blutgerinnung fördernde Komponente als Gegenmittel für Blutantikoagulantien beschrieben.
Es besteht das Risiko, daß Prothrombinkomplex-Konzentrate auf Grund ihrer Aufreinigung aus komplexen Proteingemischen aktivierte Gerinnungsfaktoren, welche zumeist aktive Serinproteasen sind, beinhalten. Gerade Patienten sollten aber nicht koaguliert werden, da die Entstehung von Thrombosen fatal sein kann bzw. ist. Selbst wenn nur Spuren dieser aktivierten Gerinnungsfaktoren, insbesondere Thrombin, in einem solchen Präparat vorhanden sind, kommt es zu proteolytischer Inaktivierung der Einzelfaktoren, die je nach individueller Stabilität der Einzelfaktoren gravierende Folgen haben können. Insgesamt neigen daher Prothrombinkomplex-Konzentrate zu Instabilitäten und sind für eine längere Lagerung ungeeignet. Diese Abbaureaktionen, insbesondere durch Thrombin, treten sogar im festen Zustand auf, d.h., auch eine Trocknung bzw. Lyophilisierung der Präparate führt nicht zu einer verläßlichen Lagerstabilität.
Weiters sind Prothrombinkomplex-Konzentrate bezüglich der relativen Verhältnisse der enthaltenen Einzelfaktoren äußerst unflexibel. Es gibt kaum Möglichkeiten, diese Relatiwerhältnisse im Zuge der Reinigung des Prothrominkomplexes zu beeinflussen, was vor allem dann von Nachteil ist, wenn ein an bestimmten Faktoren angereicherter Prothrombinkomplex erwünscht ist . Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, pharmazeutische Kombinationspräparate von Vitamin K-abhängigen Proteinen zur Verfügung zu stellen, die in ihrer Zusammensetzung genau definiert bzw. definierbar sind, eine hohe Stabilität, insbesondere bei der längerfristigen Lagerung, aufweisen und eine hohe Flexibilität in der Variation ihrer Zusammensetzung haben.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein pharmazeutisches separiertes Prothrombinkomplex-Präparat enthaltend mindestens zwei chromatographisch gereinigte Vitamin K-abhängige Einzelfaktoren als Wirksubstanzen. Vor allem soll die erfindungsgemäße Präparation hochgereinigten Faktor IX in Kombination mit zumindest einem weiteren hochgereinigten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktor enthalten.
Im Gegensatz zum Stand der Technik, bei welchem der Prothrombinkomplex immer als Komplex aufgereinigt und nicht durch Kombina- nation von einzelnen Faktoren hergestellt wurde und außerdem im besten Fall nur bis zu einer intermediären, also nur bis zu mäßiger Reinheit vorliegt, wird mit der vorliegenden Erfindung ein Präparat zur Verfügung gestellt, welches die Einzelblutfak- toren in hochgereinigter Form enthält, die von störenden Verunreinigungen, insbesondere von einer Thrombinaktivität , befreit sind. Insbesondere werden die erfindungsgemäß zu kombinierenden Einzelfaktoren durch chromatographische Reinigungsverfahren, wie der Ionenaustauschchromatographie, der hydrophoben Chromatographie, der Affinitätschromatographie und/oder der Molekularaus- Schlußchromatographie aus Plasma bzw. rekombinanten Zellen gereinigt. Damit können für die meisten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren jeweils spezifische Aktivitäten von mindestens 50 % der theoretischen Reinheit, vorzugsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 90 %, bis zur theoretischen Reinheit für den Einzelfaktor erreicht werden. Dementsprechend ist es auch bevorzugt, Faktoren zu verwenden, die im wesentlichen frei (≤ 5 %) von Denaturierungsprodukten sind.
Bei der pharmazeutischen Herstellung von Blutgerinnungsprotein- Präparationen werden in der Regel drei verschiedene Reinheitsgrade unterschieden; niedrig, intermediär und hoch. Tabel le 1
in vivo-Halbwertszeit theoretische Reinheit
Faktor II 60 h 0,1 E/mg
Faktor VII 2 - 2,5 h 2000 (1667 - 2500) Faktor IX 18 - 24 h 250 (200 - 333) Faktor X 40 h 118 (100 - 143)
Insbesondere bei der Ermittlung der Faktor II -Aktivität gibt es auf Grund der Anwesenheit von Spuren von Faktor Ha immer wieder verfälschte Ergebnisse, da bereits Spuren von Faktor Ha die Konzentrationsbestimmung von Faktor II derart überlagern, daß dabei sogar um ein Vielfaches höhere Werte als die theoretische Reinheit ermittelt werden können. Bei Faktor VII sind die Werte deshalb gegenüber den anderen Faktoren etwas niedriger, da Faktor VII ein sehr labiles Protein ist, das äußerst rasch zu Faktor VIIa umgewandelt wird. Daher wird schon eine Faktor VII- Präparation die mehr als 10 % der theoretischen Reinheit aufweist, als hochgereinigt angesehen.
Da das erfindungsgemäße Präparat von insbesondere hinsichtlich ihrer Aktivität bzw. ihres Reinheitsgrades sehr genau definierten Einzelfaktorpräparationen zusammengesetzt wird, kann auch das Verhältnis der einzelnen Faktoren zueinander optimal eingestellt werden. Hiebei können auch Probleme, die sich im Zuge der Weiterverarbeitung von den Gesamtprotein-Komplexkonzentraten im Stand der Technik ergeben, beispielsweise durch Aktivitätseinbußen bei der Virusinaktivierung, aber auch durch Prozesse, die im Zuge des Reinigungsverfahrens auftreten, von vornherein vermieden werden, da nach der Vereinigung der hochgereinigten Einzelfaktoren zum erfindungsgemäßen Präparat vorzugsweise keine weiteren Bearbeitungsschritte mehr durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Präparat weist also insgesamt den Vorteil der Standardisierbarkeit auf. Dadurch ist gewährleistet, daß die jeweiligen Einzelfaktoren in der zugegebenen Konzentration +/- 10 % Abweichung im Präparat enthalten sind.
Bevorzugte Einzelfaktoren werden erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Protein Z. Bevorzugte Herstellungsmethoden für hochgereinigte Präparate dieser Proteine finden sich z.B. in der EP 0 796 623 (Faktoren II und X), der A 594/97 (Faktor VII) , der EP 0 496 725 (Faktor IX) , der EP 0 533 209 (Protein C) und der EP 0 406 216 (Protein S) .
Im erfindungsgemäßen Präparat werden vorzugsweise zumindest die Faktoren II, VII, IX und X ausgehend von hochgereinigten Einzelfaktoren zusammengefügt, wobei gegebenenfalls auch noch die hochgereinigten Einzelfaktoren Protein C, Protein S und/oder Protein Z zugemischt werden, um einen möglichst physiologischen Prothrombinkomplex bereitstellen zu können, d.h. einen Prothrombinkomplex, der in der Zusammensetzung dem physiologischen entspricht - nur ohne die störenden Begleitproteine, die im Zuge der Prothrombinkomplex-Reinigung aus Plasma einfließen, wie z.B. Thrombin .
Die Einzelfaktoren können aus Plasma, insbesondere Humanplasma, aufgereinigt werden oder rekombinant hergestellt werden. Da bei der Herstellung durch rekombinante DNA-Technologie eine Trennung der strukturell und physikochemisch sehr ähnlichen Faktoren nicht erforderlich ist, wird das erfindungsgemäße Präparat vorzugsweise aus hochgereinigten rekombinanten Einzelfaktoren zusammengesetzt. Der Faktor kann auch transgen hergestellt sein; er kann ein Derivat sein, insbesondere ein Peptid und/oder ein Fragment .
Die Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein S und C sind kloniert und sequenziert worden und deren Darstellung wird beispielsweise in Falkner et al . , Thrombosis and Haemostasis 68 (2) (1992), Seiten 119 bis 124 für Vitamin K-abhängige Proteine beschrieben.
Erfindungsgemäß sind die Relatiwerhaltnisse der hochgereinigten Einzelfaktoren leicht und in beliebiger Relation zueinander im Präparat einstellbar, beispielsweise indem diese Verhältnisse den natürlichen Verhältnissen im Blut entsprechen, also in etwa pro Einheit des einen Faktors, jeweils eine Einheit des anderen Faktors vorhanden ist. Ein bevorzugtes Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung enthält daher die hochgereinigten Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relatiwerhaltnis, bezogen auf internationale Einheiten von (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : 0,5 bis 2) : (0,5 bis 2). Sind auch Protein C, Protein S und/oder Protein Z im Präparat vorhanden, so weisen auch diese Einzelfaktoren bevorzugterweise Relativverhältnisse von 0,5 bis 2 auf.
Andererseits ist es erfindungsgemäß auch möglich, die Einzelfaktoren auf Grund ihrer relativen Stabilitäten, insbesondere im Verhältnis ihrer relativen Halbwertszeiten, einzustellen, d.h., daß von einem weniger stabilen Faktor mehr vorgesehen wird und vom stabilen Faktor entsprechend weniger. Dabei kann auch die vorgesehene Zeitdauer der Anwendung bzw. Wirkung mitberücksichtigt werden, d.h., je länger diese Zeitdauer ist, umso größer sind auch diese Relatiwerhaltnisse zu gewichten.
Auch rekombinante Proteine mit beispielsweise veränderter Halbwertszeit können dann entsprechend standardisiert werden. Auch weitere Faktoren, wie z.B. die in vivo-Wiederauffindung (recovery) , können in eine Standardisierung der Faktoren mitein- bezogen werden.
Ein in dieser Hinsicht bevorzugtes Präparat umfaßt daher die Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relatiwerhaltnis, bezogen auf internationale Einheiten von (0,5 bis 2) : (5 bis 35) : (0,5 bis 7) : (0,5 bis 5), da die Halbwertszeiten von Prothrombin 60 Stunden, von Faktor VII 2 Stunden, von Faktor IX 20 Stunden und von Faktor X 40 Stunden betragen. Ein bevorzugtes Präparat mit diesen Faktoren enthält daher die Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Relatiwerhaltnis, bezogen auf internationale Einheiten von (0,5 bis 2) : (5 bis 35) : (0,5 bis 7) : (0,5 bis 5) : (1 bis 15) : (1 bis 15).
Da Faktor II der mit Abstand stabilste dieser Faktoren ist und darüberhinaus auch in seiner aktivierten Form Thrombin das größte Stabilitätsrisiko trägt, ist eine Präparation, die kein Pro- thrombin enthält, bevorzugt. Faktor VII wird meist als recht instabil angesehen und wird daher bevorzugterweise in erhöhtem Maße, z.B. in 10-facher Konzentration (bezogen auf internationale Einheiten) im erfindungsgemäßen Präparat vorgesehen. Ein besonders bevorzugtes Präparat enthält daher Einzelfaktor VII und Einzelfaktor II in einem Verhältnis von größer 10 : 1.
Bevorzugterweise wird mit dem vorliegenden Präparat ein Prothrombinkomplex oder ein partieller Prothrombinkomplex aus hochgereinigten Einzelfaktoren zur Verfügung gestellt. Es ist jedenfalls bevorzugt, daß die Einzelfaktoren im Präparat keinen Komplex bilden. Dies kann beispielsweise durch analytische Ionen- austauschchromatographie an Q-Sepharose (Pharmacia) gezeigt werden, wobei die einzelnen Faktoren bei Elution mit einem Salzgradienten diskret eluiert werden können. Im Gegensatz dazu stehen die Komplexe wie sie bei der Prothrombinase oder bei der Pro- Prothrombinase vorliegen.
Die Prothrombinase ist ein Enzym-Substratkomplex, der sich an einer Phospholipidoberflache bildet und die Aktivierung von Prothrombin ermöglicht. Die Prothrombinase besteht definitionsgemäß aus dem Faktor II (Prothrombin) , dem aktivierten Faktor X (Faktor Xa) , den Cofaktor V bzw. Va, Phospholipiden und Calciumionen. Diese Faktoren liegen in vivo als transienter Komplex zur Aktivierung des Prothrombins und Bildung des Thrombins vor. Eine entsprechende Pro-Prothrombinase ist als Komplex von Faktoren definiert, die zumindest teilweise modifiziert bzw. aktiviert zur Bildung einer Prothrombinase vorliegen. Die Pro-Prothrombinase ist daher als Vorstufe der Prothrombinase und als Komplex zu verstehen, bei welchem eine oder mehrere Komponenten in ihren Vorstufen, als Zymogene oder als Proformen vorliegen und der aufgrund von Affinitäten der Komponenten zueinander gebildet wird.
Aus Stabilitätsgründen ist es vorteilhaft, jegliche Präsenz von aktivierten Gerinnungsfaktoren im erfindungsgemäßen Präparat zu vermeiden. Eine bevorzugte Ausführungsform ist daher dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat keine aktivierten Gerinnungsfak- toren, insbesondere keinen Faktor Ha, IXa, Xa und gegebenen- falls Vlla, enthält.
Bevorzugte erfindungsgemäße Präparate enthalten weniger als 0,1 E Faktor VIII :C oder Faktor VIII:Ag/mg Protein und/oder weniger als 0,1 E Faktor Ila/Einheit Prothrombin und/oder weniger 0,1 E Faktor Xa/Einheit Faktor X.
Um die hervorragende Stabilität des erfindungsgemäßen Präparats möglichst lange zu bewahren, ist es vorteilhaft, die erfindungsgemäße Präparation in lyophilisierter Form bereitzustellen. Dadurch ist es möglich, das erfindungsgemäße Präparat nahezu unbegrenzt lange zu lagern und trotzdem als Lyophilisat innerhalb kurzer Zeit zu einer gebrauchsfertigen Lösung zu rekonstituieren.
Entsprechend einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Präparation weiters Magnesiumionen. Diese Ionen wirken kompetitiv zu Calciumionen und können die Calciumionen vor allem im vollständig oder partiellen Prothrombinkomplex verdrängen. Damit wird eine vorzeitige Thrombinbildung in einer Lösung der erfindungsgemäßen Präparation in noch größerem Ausmaß unterbunden und damit diese soweit stabilisiert, daß sie sogar in einer wässerigen Lösung über viele Stunden stabil bleibt.
Es hat sich herausgestellt, daß die pharmazeutische Präparation gemäß der vorliegenden Erfindung sogar als stabile Infusionslösung zur Verfügung gestellt werden kann, vor allem wenn gewährleistet ist, daß sie keine freien Calciumionen enthält. Der Gehalt an freien Calciumionen kann leicht durch bekannte Ionentitrationen oder andere analytische Methoden bestimmt werden. Zur Komplexierung der Calciumionen eignet sich z.B. ein pharmazeutisch akzeptabler Chelatbildner, vorzugsweise EDTA, und verwandte Substanzen, wie Citrat.
Bevorzugterweise enthält das erfindungsgemäße Präparat weiters Antithrombin III in den Mengen, in denen es bisher in Prothrom- binkomplex-Konzentraten als stabilisierend eingesetzt worden ist, gegebenenfalls gemeinsam mit Heparin. Obwohl diese Maßnahme auf Grund des hohen Reinheitsgrades der Einzelfaktoren nicht unbedingt notwendig erscheint, kann sie aus pharmazeutischen Gründen oder auch Erfordernissen von Pharmakopöen oder sonstigen Vorschriften im Hinblick auf die Prothrombinkomplex-Konzentrate des Standes der Technik als vorteilhaft angesehen werden.
In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Präparation deshalb frei von Albumin und/oder Stabilisatoren, wie insbesondere Antithrombin III und/oder Heparin. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Präparat auch frei von Phospholipiden.
Das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat wird gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform auf Grund einer Behandlung zur Vi- rusinaktivierung von infektiösen Viren oder anderen infektiösen Agenzien behandelt. Diese Behandlung zur Virusinaktivierung wird vorzugsweise durch zwei voneinander unabhängige Virusinaktivie- rungs- oder Virusabreicherungsverfahren gewährleistet.
Diese Inaktivierungsbehandlung wird vorzugsweise durch eine Ten- sid- und/oder Hitzebehandlung gewährleistet, beispielsweise durch eine Hitzebehandlung in festem Zustand, insbesondere eine Dampfbehandlung gemäß der EP-0 159 311, der EP-0 519 901 oder der EP-0 674 531.
Weitere Behandlungen zur Inaktivierung von Viren umfassen auch die Behandlung mit chemischen oder chemisch/physikalischen Methoden, z.B. mit chaotropen Stoffen gemäß der W094/13329, der DE 44 34 538 oder der EP-0 131 740 (Lösungsmittel) oder die Photoinaktivierung.
Die Nanofiltration oder die Antikörper-verstärkte Nanofiltration (siehe PCT/AT97/00075) stellt ebenfalls ein bevorzugtes Verfahren zur Abreicherung von Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Präparat weiters pharmazeutisch akzeptable Puffersubstanzen oder Stabilisatoren, beispielsweise die in Pharmakopöen bereits für Prothrombinkomplex- Konzentrate vorgesehenen Substanzen.
Figure imgf000012_0001
Das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat kann selbstverständlich für alle bisherigen Indikationen des Prothrombinkom- plexes verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Präparats zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von erworbenen oder vererbten Blutgerinnungsstörungen, zur Behandlung von schweren Blutungen, zur Prophylaxe von Blutungen, insbesondere bei Vorliegen von vererbten Blutgerinnungsstörungen, zur Substitutionstherapie und zur Behandlung von Hämophilie B.
Auch bei Leberfunktionsstörungen erweist sich das erfindungs- gemäße Präparat als indiziert.
Bei der Verabreichung an Patienten ist bei der Dosierung von bisherigen Verabreichungsregimes auszugehen, wobei jedoch die genauere Definiertheit der erfindungsgemäßen Präparate von Vorteil ist.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele auf die sie jedoch nicht eingeschränkt werden soll, näher erläutert .
B e i s p i e l e :
B e i s p i e l 1 : Herstellung der Einzelfaktorpräparationen
1.1. Herstellung von Einzelfaktorpräparationen von plas ati- sche Faktor X und plasmatischem Faktor II :
Eine lyophilisierte Prothrombinkomplexfaktorenpräparation, welche die Faktoren II, IX, X sowie Protein C und Protein S enthielt, wurde nach der Methode von Brummelhuis, H.G.J., Prepara- tion of the Prothrombincomplex. In: Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J.M. ed., 117-128, Academic Press, New York, (1980) , hergestellt und zur Virusinaktivierurig nach EP 159 311 hitzebehandelt. Entsprechend wurde das Lyophilisat (1000 E Faktor X/g, 1200 E Faktor Il/g) in destilliertem Wasser gelöst, sodaß dieses 50 000 E Faktor X/l enthielt, und auf pH 7,0 eingestellt. Nach Zusatz von 12 % (v/v) TWEEN® 80 wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde mit einem 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, 1:5 verdünnt und die Prothrombin- komplexproteinfraktion an Calciumphosphat (Ca3 (P04)2) in einer Konzentration von 30 g Ca3 (P04)2 pro 1 Prothrombinkomplexlösung durch einstündiges Rühren bei Raumtemperatur adsorbiert. Anschließend wurde die feste Phase durch Zentrifugation, 20 Minuten bei 5000 rpm, abgetrennt und der Niederschlag zweimal mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, enthaltend 10 % Ammoniumsulfat, durch Resuspension und erneute Zentrifugation gewaschen. Eine dritte Waschung wurde mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, enthaltend 150 mM NaCl in analoger Weise durchgeführt. Die Elution der Prothrombinkomplexfraktion erfolgte mit 1 M Natriumphosphatlö- sung, pH 7,0, wobei 25 ml dieser Lösung pro g Calciumphosphat 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend der verbleibende Niederschlag durch Zentrifugation wie oben abgetrennt wurde. Der Überstand wurde anschließend einer Ammoniumsulfatfällung mit 366 g Ammoniumsulfat pro 1 15 h bei 4°C unter Rühren unterzogen. Das Präzipitat, enthaltend die Prothrombinkomplexfraktion, wurde wie oben abzentrifugiert . Der Niederschlag wurde in einem 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, aufgenommen und auf einer Säule, gefüllt mit Sephadex® G-25, bei 4°C mit einem linearen Fluß von 1 cm/min gegen 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puf- fer, enthaltend 100 mM NaCl und 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, umgepuffert, um das Ammoniumsulfat abzutrennen. Dabei wurde im Eluatstrom die UV-Absorption bei 280 nm und die elektrische Leitfähigkeit gemessen. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und anschließend einer Ionenaustauschchromatogra- phie über DEAE-Sepharose FF®, Fa. Pharmacia, unterzogen. Die Fraktionen wurden auf einer Säule (Innendurchmesser : Gelbett- höhe = 1 : 1,3) mit einem Gelvolumen von 8,2 1, 0,55 g Protein/1 Gel, bei einem linearen Fluß von 0,36 cm/min aufgetragen. Die Chromatographie erfolgte bei 22 °C. Vor Auftrag der Proteine war die Säule mit einem 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6,0, äqui- libriert worden. Die Elution der Proteinfraktionen erfolgte in 1
Figure imgf000015_0001
triert und gegen einen Puffer enthaltend 4 g Trinatriumcitratdi- hydrat/1, 8 g NaCl/1, pH 7,0, umgepuffert. Eine so hergestellte Faktor II-Präparation wies eine spezifische Aktivität von 6,9 E/mg Protein auf. Die Bestimmung der Faktor II-Aktivität erfolgte mit der 1-Stufen-Methode, basierend auf der Thromboplastin- zeit, unter Verwendung eines Faktor II-Mangelplasmas gegen den Internationalen Faktor II-Standard unter Verwendung der Reagens- kombination von IMMUNO, Wien. Andere Gerinnungsfaktoren waren in Gerinnungsanalysen in Spuren oder gar nicht mehr nachweisbar (Faktor VII < 0,00002 E/E Faktor II, Faktor IX 0,0002 E/E Faktor II, Faktor X 0,004 E/E Faktor II, Protein C 0,003 E/E Faktor II und Faktor VIII < 0,0002 E/E Faktor II).
Als alternatives Herstellungsverfahren für einen hochgereinigten Faktor II wurde auch ein Verfahren verwendet, bei dem aus einem lyophilisierten Prothrombinkomplexfaktorenpräparat durch hydrophobe Chromatographie zuerst Faktor IX abgetrennt, anschließend Faktor II isoliert und dieser dann durch Chromatographie an Hydroxylapatit hochgereinigt wurde.
Die Prothrombinkomplexfaktorenpräparation wurde wie oben beschrieben gelöst und mit Detergens 1 h bei Raumtemperatur inkubiert . Anschließend wurde durch Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sepharose FF®, Fa. Pharmacia, eine Faktor II, IX und X- hältige Fraktion isoliert. Aus dieser wurde anschließend durch Interaktion mit Butyl-Toyopearl®, Fa. Toso Haas, die Faktor IX- enthaltende Fraktion entfernt. Der Adsorptionsüberstand wurde anschließend an Phenyl-Sepharose High Performance®, Fa. Pharmacia, durch eine weitere hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt, wobei ca. 4 g Protein/1 Gel adsorbiert werden konnten. In einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser : Gelbetthöhe = 1 : 1,9 wurde bei einem linearen Fluß von 0,25 cm/min die Proteinfraktion adsorbiert, anschließend durch Waschen mit 20 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,4, das Inertprotein entfernt und schließlich durch stufenweise Elution die Faktor II enthaltende Fraktion isoliert, die bei fallender Leitfähigkeit bei 1,9 M NaCl vom Gel desorbierte. Die Faktor II enthaltende Fraktion wurde anschließend direkt an Ceramik-Hydroxylapatit® , Fa. Biorad, adsorbiert. Dies erfolgte auf einer Säule mit einem
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1 1 1
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aufwies, während der Faktor VIIa-Gehalt unter einer Einheit/ml lag. Entsprechend konnte eine hochgereinigte Faktor Vll-Präpara- tion ohne wesentliche Aktivierung des Faktor VII gewonnen werden. Die Ausbeute bei der Chromatographie betrug über 50 %.
1.3. Plasmatischer Faktor IX :
150 ml Prothrombinkomplex wurden mittels Dextransulfat vorgereinigt (Miletich et al . , Analytical Biochemistry 105, 304 (1980)). 20 ml Eluat (912 I.E. Faktor IX, 160 I.E. Faktor X) wurden auf eine Säule mit 20 ml eines Agarose-Polymers mit Octyl-Gruppen (Octyl-Sepharose-CL-4B (Pharmacia, Schweden) ) mit einer Flußrate von 360 ml/h aufgetragen. Die Säule wurde zuvor mit 80 ml Puffer A equilibriert. Nach dem Waschen des beladenen Gels mit 120 ml Puffer A wurde die Faktor IX-hältige Fraktion mit 80 ml einer 250 mmolaren NaCl-Lösung eluiert.
Die Ausbeute an Faktor IX lag bei 54 % der Ausgangsaktivität. Die spezifische Aktivität betrug 186 I.E. Faktor IX/mg Protein. Faktor X war nur mehr in Spuren vorhanden.
1.4. Gewinnung von plas atischem Protein C
Hochreines Protein C wurde aus einer rohen Protein C-Fraktion gewonnen, die aus kommerziell erhältlichem Prothrombinkomplex- Konzentrat hergestellt wurde. Die Reinigung erfolgte affinitäts- chromatographisch mittels monoklonaler Antikörper. Monoklonale Anti-Protein C-Antikörper wurden wie folgt hergestellt:
BALB/C-Mäuse wurden mit 100 μg menschlichem Protein C in zweiwöchigen Abständen durch intraperitoneale Injektion immunisiert. Nach sechs Wochen wurden noch einmal 50 μg des menschlichen Protein C injiziert und drei Tage später die Fusion vorgenommen. Die Myelomzellinie (P3-X-63-AG8-653 , 1,5 x 107 -Zellen) wurde vermischt mit 1,7 x 108 -Milzzellen von einer Maus, und die Fusion nach modifizierter Köhler & Milstein-Methode unter Verwendung von PEG 1500 durchgeführt (Köhler G. , Milstein C. , Nature 256 (1975) , 495-497) . Positive Klone, getestet mittels eines ELISA, wurden zweimal subgeklont . Aszitesproduktion erfolgte durch Injektion von 5 x 106 -Hybridomzellen je BALB/C-Maus zwei Wochen nach Pristan- Behandlung.
Das Immunglobulin wurde aus Aszites durch Ammoniumsulfatpräzipi- tation und anschließende Chromatographie mittels QAE-Sephadex und darauffolgend Chromatographie an Sephadex G200 gereinigt. Um das Risiko der Übertragung muriner Viren zu reduzieren, wurde der Antikörper vor der Immobilisierung noch einem Virusinakti- vierungsschritt unterworfen. Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper gegen Protein C wurden an CNBR-Sepharose 4B (Pharmacia) gekoppelt. Für die Reinigung des Protein C mittels Affinitätschromatographie wurden folgende Puffer verwendet:
Als Adsorptionspuffer: 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCl und 5 mM Benzamidin; als Waschpuffer wurde verwendet: 20 mM Tris, 1 M NaCl, 2 mM
Benzamidin, 2 mM EDTA; der pH-Wert betrug 7,4; als Elutionspuffer wurde verwendet: 3 M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M
NaCl, 0,5 mM Benzamidin, 2 mM EDTA.
Ein weiterer geeigneter monoklonaler Antikörper zur Reinigung von Protein C ist in der US 5,336,610 beschrieben. Dieser Antikörper bindet an das Aktivierungspeptid von Protein C und ist daher geeignet, das Zymogen Protein C selektiv von der aktivierten Form zu reinigen.
Im einzelnen: Das Prothrombinkomplex-Konzentrat wurde im Adsorptionspuffer aufgelöst, wobei etwa 10 g des Prothrombinkomplex- Konzentrates für eine 20 ml monoklonale Antikörpersäule zur Verwendung kamen. Anschließend wurde das aufgelöste Prothrombinkomplex-Konzentrat filtriert, bei 20 000 rpm 15 min lang zentrifu- giert und durch ein 0,8 μm-Filter sterilfiltriert. Das sterilfiltrierte und gelöste Prothrombinkomplex-Konzentrat wurde auf die Säule aufgetragen mit einer Flußrate von 10 ml/h. Anschließend wurde die Säule mit dem Waschpuffer proteinfrei gewaschen und schließlich das gebundene Protein C mit dem Elu- tionspuffer bei einer Flußrate von 5 ml/h eluiert und die Fraktionen gesammelt. Das eluierte Protein C wurde gegen einen Puffer (0,2 M Tris, 0,15 M Glycin und 1 mM EDTA, pH 8,3) dialy- siert. Der Protein C-Gehalt wurde antigenmäßig mittels der Methode nach Laurell und aktivitätsmäßig nach Protac-Aktivierung bestimmt .
Das erhaltene Protein C-Eluat wurde in folgender Weise zu einer pharmazeutisch applizierbaren Präparation fertiggestellt:
Das Eluat wurde zuerst einem Ultrafiltrations- und einem Diafiltrationsschritt unterworfen. Für die Diafiltration wurde ein Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet, der 150 mM NaCl und 15 mM Trinatriumcitrat .2H2 O enthielt. Das erhaltene Filtrat wurde gefriergetrocknet und durch eine einstündige Dampfbehandlung bei 80°C ± 5°C nd 1375 ± 35 mbar virusinaktiviert.
Das lyophilisierte virusinaktivierte Material wurde sodann in einer sterilen isotonen NaCl-Lösung gelöst und mittels Ionen- austauschchromatographie an Q-Sepharose wurden eventuell vorhandene Antikörper bzw. Serumamyloid P entfernt. Die gereinigte Lösung wurde durch einen weiteren Ultrafiltrations- und Diafiltrationsschritt konzentriert. Danach wurden zur erhaltenen Lösung 10 Albumin, 150 mM NaCl und 15 mM Trinatriumcitrat zugegeben. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,5. Maus-Immunglobulin sowie die Faktoren II, VII, IX und X konnten nicht nachgewiesen werden. Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert, abgefüllt und lyophilisiert. Die spezifische Aktivität betrug 14 Einheiten Protein C/mg. Als Aktivitätstest wurde ein amidolytischer Test verwendet, wobei das Protein C mittels Protac (Fa. Pentapharm) aktiviert wurde.
1.5. Reinigung von plasmatische Protein S
Menschliches Protein S wurde aus Faktor IX-Konzentrat (Prothrombinkomplex STIM-3 IMMUNO AG Vienna) mittels QAE-Sephadex und Blue Sepharose CL-6B-Chromatographie (Pharmacia) in folgender Weise hergestellt : Das lyophilisierte Konzentrat (100 g) wurde in 200 ml sterilem, ionenfreiem Wasser gelöst und gegen einen Puffer, bestehend aus 0,01 M 2- (N-Morpholinethansulfonsäure) , pH 6,0; 0,18 M NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM Benzamidin-HCl und 0,02 % NaN3 (Startpuffer), dia- lysiert. Das dialysierte Material wurde dann auf eine QAE-Sepha- dex-Säule (8 x 19 cm) aufgetragen und mit dem genannten Puffer equilibriert Als Waschlösung wurden 1,5 1 Puffer (Startpuffer) verwendet .
Protein S wurde mit 110 ml/h mit einem linearen NaCl-Gradienten, bestehend aus 1,2 1 Startpuffer und 1,2 1 eines weiteren Puffers, der sich von dem ersten Puffer durch Zusatz von 0,5 M NaCl unterscheidet, eluiert. Die Protein S-Fraktionen wurden mittels Fast Flow SDS Page (Pharmacia) und Antigenbestimmung (Laurell) nach Protein S untersucht, und Fraktionen, die Protein S enthielten, wurden gepoolt und schließlich gegen einen Puffer dia- lysiert. Dieser Puffer enthielt 50 mM TRIS-HC1, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Benzamidin-HCl und 0,2 % NaN3. Nach der Dialyse wurde der Protein S-Pool an eine Blue Sepharose-Säule CL-6B (2,5 cm x 10,5 cm) aufgetragen und mit dem Startpuffer equilibriert .
Die Waschung erfolgte bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/h mit 500 ml Startpuffer. Das Protein S konnte so im "void volume" eluiert werden, während Prothrombin an der Säule adsorbierte. Die Protein S-reichen Fraktionen wurden wieder mittels SDS-Page Fast Flow System (Pharmacia) und gemäß Laurell (Scand. J. Clin. Invest. (Suppl.) 29 (1977) 21 (Suppl. 124)) bestimmt.
Das so hergestellte Protein S hatte die für Protein S charakteristische Morphologie an einem reduzierten SDS-Page, nämlich zwei nahe Banden (Doublett) mit einem Molekulargewicht von etwa 86.000 bzw. 76.000. Die Proteinkonzentration wurde spektropho- tometrisch bestimmt anhand eines Extinktionskoeffizienten von 0,1 bei 280 nm für menschliches Protein S, und wurde durch die Methode nach LOWRY bestätigt (Lowry 0., Rosebrough N. , Farr AL, Randall R. , Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265). Das so hergestellte vorgereinigte Protein S wurde zur Herstellung von Schaf-Antiserum gegen Protein S verwendet, indem vier Immunisierungsinjektionen vorgenommen wurden, wobei bei den ersten zwei Injektionen 100 μg Protein S mit Freund' schem Adju- vans subkutan appliziert wurden und bei den folgenden Boosterun- gen mit inkomplettem Adjuvans gearbeitet wurde. Nach weiteren Boosterungen wurde das Antiserum mittels doppelter Immunodiffusion getestet und zeigte eine Präzipitation mit gereinigtem Protein S und mit Normalplasma.
Die IgG-Fraktion aus 450 ml Antiserum wurde durch Alkoholfällung und anschließende Adsorption an Sephadex A 50 in TRIS-HCl-Pu- ffer, pH 6,8, erhalten. Aus 450 ml Antiserum waren im Überstand 1,14 g Anti-Protein S-IgG. Die IgG-Fraktion wurde an 450 ml Sepharose CL-4B gekoppelt, wobei 5,7 mg Protein/ml Sepharose eingesetzt wurden. Die Kopplungseffizienz betrug 76 %. Die AntiProtein S-Säule wurde mit Glycin-HCl, pH 3, und Adsorptionspuffer, pH 7,5, equilibriert.
Der Adsorptionspuffer bestand aus 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCl, 2 mM Benzamidin, 0,02 % Tween® 20 und 0,02 % NaN3 , pH 7,4. Die Waschpufferlösung hatte folgende Gehalte: 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 1,0 M NaCl, 0 , 5 mM Benzamidin, 0,01 % Tween® 20; 0,02 % NaN3 , pH 7,4.
Der Elutionspuffer war wie die Waschpufferlösung zusammengesetzt, mit der Änderung, daß 0,05 % Tween® 20 und zusätzlich 243,3 g NaSCN, pH 7,4 (eine 3 M Rhodanid-Lösung) verwendet wurden.
Die Dialysepufferlösung enthielt 20 mM Tris, 0,15 mM Glycin, 1 mM EDTA, 2 mM Benzamidin, pH 8,3.
Zur weiteren Reinigung der Protein S-Fraktion, hergestellt aus Prothrombinkomplex-Konzentrat wurden 100 g der Fraktion in 1 1 Adsorptionspuffer gelöst und über Nacht gegen eine Adsorptionspufferlösung dialysiert. Die Säule wurde nach Auftragen der Probe mit Waschpuffer, ca. 5 1, proteinfrei gewaschen, anschließend erfolgte die Elution mit 3 M NaSCN in der Elutionspufferlösung . Das Eluat wurde sofort dialysiert, bis SCN unter der Nachweisgrenze lag; das Eluat hatte eine Konzentration von 500 μg/ml Protein S. Es war frei von C4- binding-Protein.
Monoklonale Anti-Protein S-Antikörper wurden wie folgt hergestellt:
BALB/C-Mäuse wurden mit 100 μg des hergestellten Protein S in zweiwöchigen Abständen durch intraperitoneale Injektion immunisiert. Nach sechs Wochen wurden noch einmal 50 μg des menschlichen Protein S injiziert und drei Tage später die Fusion vorgenommen. Die Myelomzellinie (P3-X-63-AG8-653 , 1,5 x 107 -Zellen) wurde vermischt mit 1,7 x 108 -Milzzellen von einer Maus, und die Fusion nach modifizierter Köhler & Milstein-Methode unter Verwendung von PEG 1500 durchgeführt (Köhler G. , Milstein C, Nature 256 (1975) 495-497) .
Positive Klone, getestet mittels eines ELISA, wurden zweimal subgeklont . Aszitesproduktion erfolgte durch Injektion von 5 x 106 -Hybridomzellen je BALB/C-Maus zwei Wochen nach Pristan- Behandlung .
Das Immunglobulin wurde aus Aszites durch Ammoniumsulfatpräzipi- tation und anschließende Chromatographie mittels QAE-Sephadex und darauffolgend Chromatographie an Sephadex G200 gereinigt.
Die aus Aszites gewonnene und an Protein A-Sepharose vorgereinigte IgG-Fraktion wurde an Sepharose CL-4B gekoppelt. Die affi- nitätschromatographische Reinigung von Protein S, welches aus Prothrombinkomplexkonzentrat gewonnen wurde, erfolgte unter den für polyklonale Protein-S-Antikörper beschriebenen Bedingungen. Die Konzentration des Eluates an Protein S betrug 600 μg/ml. Es war frei von C4 -binding-Protein.
Die nach der Methode der polyklonalen oder der monoklonalen Affinitätschromatographie hochgereinigten Protein S-Präparatio- nen wurden einer SDS-Page (Gradientengel 8 bis 12 %) unterworfen und sie können anhand von Coomassie-Färbung (Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ε 1
Figure imgf000025_0001
B e i s p i e l 3: Pharmazeutische Zubereitung des Prothrom- binkomplexes :
Wie im vorigen Beispiel beschrieben, wurde ein hochgereinigter Prothrombinkomplex, enthaltend die Faktoren Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX, und Faktor X, jedoch ohne Protein C und Protein S, dargestellt und steril verfüllt. Gemäß internationalen Empfehlungen wurden der Lösung vor Abfüllung 10000 internationale Einheiten Heparin/1 zugesetzt.
B e i s p i e l 4: Pharmazeutische Zubereitung der Vitamin K- abhängiger Proteine zur Dauersubstitution und Erhaltung konstanter Plasmaεpiegel:
Nach Substitution mit einem Vitamin-K-abhängigen Protein-Konzentrat, bei welchem möglichst konstante Plasmaspiegel der Faktoren des Prothrombinkomplexes erreicht werden sollen, ergibt sich aufgrund der unterschiedlichen Halbwertszeiten der einzelnen Faktoren die Notwendigkeit, die Substitutionsraten dieser Proteine in einem nicht äquivalenten Verhältnis durchzuführen. Entsprechend wurde eine pharmazeutische Zubereitung wie oben beschrieben, dargestellt, die Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Verhältnis von 1:30:3:1,5:6:6 enthielt.
B e i s p i e l 5: Pharmazeutische Zubereitung eines partiellen Prothrombinkomplexes :
Durch die unterschiedlichen in vivo Halbwertszeiten der Faktoren des Prothrombinkomplexes, insbesondere durch die lange Halbwertszeit von Prothrombin von 2-5 Tagen im Vergleich zur kurzen Halbwertszeit des Faktor VII von 4 bis 7 h, und des Faktor IX von unter 24 h, ergibt sich bei Dauersubstitution mit Prothrom- binkomplexpräparaten, das bei Einstellung einer normalen Plasmakonzentration von 1 Einheit Faktor Vll/ml, Plasmakonzentration nach 24 h schon wieder unter die für eine funktionierende Haemostase erforderliche Konzentration von mindestens 20 % abgenommen hat, während z.B. der Prothrombin-Plasmaspiegel noch an- 1
Figure imgf000027_0001
Zur Bestimmung des Gehaltes an aktivierten Prothrombinkomplex- faktoren wurden die chromogenen Substrate S-2238, S-2222, S- 2444, S-2366 und S-2251 der Firma Chromogenix verwendet. Die Bestimmungen wurden unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Pufferbedingungen durchgeführt. Durch die chromogenen Substrate konnten jeweils die aktivierten Faktoren Thrombin, Faktor Vlla, Faktor IXa, Faktor Xa, aktiviertes Protein C, welche pro- teolytische Aktivitäten gegen die eingesetzten Peptidsubstrate entwickelten, bestimmt werden. Nach Auswertung der photometrischen Analyse des chromogenen Substratumsatzes konnte bestimmt werden, daß für alle Substrate der Gehalt in den vorher beschriebenen Präparationen, enthaltend Vitamin K, Proteine oder ausgewählte Faktoren des Prothrombinkomplexes jeweils unter 10 mU/ml , lagen .

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Pharmazeutisches separiertes Prothrombinkomplex-Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mindestens 2 chromatographisch gereinigten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren als Wirksubstanzen besteht.
2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelfaktoren ausgewählt sind aus der Gruppe Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S und Protein Z.
3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest die Faktoren II, VII, IX und X enthält.
4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die Einzelfaktoren Protein C und Protein S enthält.
5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Einzelfaktoren ein rekombi- nanter Faktor, ein transgen hergestellter Faktor, ein Derivat, insbesondere ein Peptid, und/oder ein Fragment ist.
6. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es die enthaltenen Einzelfaktoren in einem Verhältnis umfaßt, welches im wesentlichen dem Verhältnis dieser Faktoren im Blut entspricht .
7. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relatiwerhaltnis-, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) umfaßt.
8. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Relativver- hältnis, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) : (0,5 bis 2) umfaßt.
9. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, daß es die enthaltenen Einzelfaktoren in einem Verhältnis umfaßt, das den relativen Halbwertszeiten der Einzelfaktoren entspricht.
10. Präparat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X in einem Relatiwerhaltnis, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) : (5 bis 35) : (0,5 bis 7) : (0,5 bis 5) umfaßt.
11. Präparat nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es die Einzelfaktoren Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Protein C und Protein S in einem Relatiwerhaltnis, bezogen auf internationale Einheiten, von (0,5 bis 2) :
(5 bis 35) : (0,5 bis 7) : (0,5 bis 5) : (1 bis 15) : (1 bis 15) umfaßt .
12. Präparat nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Faktor VII und Faktor II in einem Verhältnis größer als 10 : 1 umfaßt.
13. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelfaktoren im Präparat keinen Komplex bilden.
14. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es einen partiellen Prothrombinkomplex umfaßt.
15. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es keinen aktivierten Gerinnungsfaktor ausgewählt aus Ha, IXa, Xa und gegebenenfalls Vlla enthält.
16. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es weniger als 0,1 E Faktor VIII :C oder Faktor VIII:Ag/mg Protein enthält.
17. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es weniger als 0,1 E Faktor Ila/E Prothrombin enthält.
18. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß es weniger als 0,1 E Faktor Xa/E Faktor X enthält.
19. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es in lyophilisierter Form vorliegt.
20. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es Magnesiumionen enthält.
21. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es keine freien Calciumionen enthält.
22. Präparat nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Chelatbildner zum Komplexieren von freien Calciumionen enthält .
23. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß es weiters Antithrombin III in stabilisierenden Mengen, gegebenenfalls gemeinsam mit Heparin, enthält.
24. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß es auf Grund einer Virusinaktivierungs- oder Virusabreicherungsbehandlung frei von infektiösen Viren ist.
25. Präparat nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Freiheit von infektiösen Viren durch zwei voneinander unabhängige Inaktivierungs- oder Abreicherungsverfahren für Viren gewährleistet ist.
26. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß es weiters pharmazeutisch akzeptable Puffersubstanzen oder Stabilisatoren umfaßt.
27. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekenn- zeichnet, daß es aus hochgereinigten Vitamin K-abhängigen Einzelfaktoren besteht, die virusinaktiviert sind.
28. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß es den Einzelfaktor Faktor X in seiner α-Form und/oder /S-Form umfaßt.
29. Diagnostisches Präparat enthaltend ein Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 28.
30. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von erworbenen oder vererbten Blutgerinnungsstörungen.
31. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von schweren Blutungen.
32. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Herstellung einer Präparation zur Prophylaxe von Blutungen, insbesondere bei Vorliegen von vererbten Blutgerinnungsstörungen.
33. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Herstellung einer Präparation zur Substitutionstherapie.
34. Verwendung eines Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Herstellung einer Präparation zur Behandlung von Hämophilie B.
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