WO1999018201A1 - Gankyrin - Google Patents

Description

明 細 書 ガンキ リ ン 発明の分野

本発明は'新規蛋白質ガンキ リ ン （gankyrin) 、 その製造及びその 利用に関する。 背景技術

肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma； H C C ) は東洋及び南ァ フ リ カにおける最も普通に見出される癌の 1 種である。 過去 1 0年 間に H C C患者の診断及び治療は大きな進展があり、 その結果、 切 除可能な症例が増加している （Arii， S. et al.， Primary liver ca ncer in Japan, Spr i nger-Ver 1 ag (1992) 243-255 ； The liver ca ncer Study Group of Japan, Primary liver cancer in Japan, Sp ringer-Verlag (1992) 445-453) 。 しかしながら、 その著しい進展 にも拘らず、 生存率は低いままである。 生存期間の延長に対する主 たる障害の 1 つは腫癌を巨視的に完全に除去した後の肝内再発のよ つでめる (The Liver Cancer Study Group of Japan, Ann. Surg. ( 1 990) 211, 277-287; Belghi ti, J. et al. , Ann. Surg. (1991) 214, 114 -117) 。

これに関して、 肝内再発及び生存期間の延長に影響する予後判定 因子を決定するために大きな努力が払われてきた。 今まで、 本発明 者らは H C Cの幾つかの遺伝子の発現を分析した 1 i s e, M. et al. ， Hepatology (1996) 23, 455-464； Furutani, M et al. , Hepatol ogy (1996) 24, 1441-1445； Furutani, . et al. , Cancer Lett. ( 1997) 111， 191- 197) 。 その結果得られた k a n — 1 (胆汁酸 C o A ： ア ミ ノ酸 N—ァ シル ト ラ ンスフ ェ ラ 一ゼ） m R N Aを新規な予 後判定因子と して同定した。 この因子の発現は、 予後不良例の HCC 中で減少する （Furutani, M. et al. , Hepatology (1996) 24， 1441 -1445)。

この他に も、 門脈併発、 α — フ ヱ ト プロテイ ン （A F P ) レベル 、 腫瘍サイズ、 腫瘍の数のごとき従来からの臨床予後因子に予測価 値を付加する H C Cの新規な分子マ一力一が求められている （The liver Cancer Study Group of Japan, Primary liver Cancer in J apan, Spr i nger-Ver 1 ag (1992) 445-453； The liver Cancer Study Group of Japan, Ann. Surg. (1990) 211, 277-287； The liver Ca ncer Study Group of Japan, Cancer (1994) 74, 2772-2780； Fran co, D. et al. , Gastroenterology ( 1990) 98. 733-738； Cal vet, X . et al. , Hepatology (1990) 12， 753-760) 。 発明の開示

本発明者は、 H C Cにおいて発現が増加する分子マーカーを同定 するために、 H C C患者の切除肝の cDNAから健常人の肝臓 cDNAをサ ブ トラ ク ト （subtract) した。 その結果、 ア ンキ リ ン リ ピー トモチ —フ ankyrin repeat mo t i f ) のみカヽらなり、 in vitroおよひ in v ivo のア ツセィ系で癌原性を示す新規な遺伝子、 ガンキ リ ンを単離 した。

従って本発明は、 新規なガンキ リ ンポ リ ペプチ ド、 それをコー ド する遺伝子系、 該ポ リペプチ ドの製造方法、 及び該ポ リべプチ ドに 対する抗体、 並びにそれらの用途を提供する。

上記の課題を解決するため、 本発明は、 配列番号 ： 2 に示す 1 4 位の A 1 a力、ら 2 2 6位の G 1 y までのア ミ ノ酸配列から成り、 且 つガンキリ ンの生物学的活性を有するポ リべプチ ドを提供する。 本発明はまた、 配列番号 ： 2 に示す 1 4位の A 1 aから 2 2 6位 の G 1 yまでのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠 失、 付加及びノ又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持している ポリぺプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 2 に示す 1 位の M e t から 2 2 6位の G 1 yまでのア ミ ノ酸配列から成り、 ガンキリ ンの生物学的活性を 有するポ リべプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 2 に示す 1 位の M e t から 2 2 6 位の G 1 yまでのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失 、 付加及び/又は他のア ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ 酸配列から成り、 且つガンキ リ ンの生物学的活性を維持しているポ リぺプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 1 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ンジ ェ ン トな条件下でハイプリ ダイズするこ とができる D N Aにより コ一 ドされており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有す るポ リべプチ ドを提供する。 ス ト リ ンジ ヱ ン 卜な条件とは、 例えば 6 5 °C、 0 . 1 X S S C及び 0 . 1 % S D Sにより与えられる条件 である。

本発明はまた、 配列番号 ： 2 に示す 1 4位の A 1 a力、ら 2 2 6位 の G 1 yまでのア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキ リ ンの生物学的 活性を有するポ リべプチ ドをコ一 ドする DNA 、 配列番号 ： 2 に示す 1 4位の A 1 aカヽら 2 2 6位の G 1 y までのア ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のア ミ ノ酸の欠失、 付加及び Z又は他のア ミ ノ酸によ る置換により修飾されたア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ンの 生物学的活性を維持しているポ リべプチ ドをコ一 ドする D NA 又は配 列番号 ： 1 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ン ジ ヱ ン 卜な 条件下でハイプリ ダイズするこ とができる D N Aにより コー ドされ ており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有するポ リ ペプチ ドにシ グナル配列が付加されたシグナル付加ポ リべプチ ドを提供する。 ス ト リ ンジ ヱ ン 卜な条件とは、 例えば 6 5 °C、 0 . 1 X S S C及び 0 . 1 % S D Sにより与えられる条件である。

本発明はまた、 配列番号 ： 4 に示す 1 4位の A 1 aから 2 3 1 位 の M e t までのア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキ リ ンの生物学的 活性を有するポ リべプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 4 に示す 1 4位の A 1 aから 2 3 1 位 の M e t までのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠 失、 付加及び/又は他のア ミ ノ酸による置換により修飾されたア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持している ポ リベプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 4 に示す 1 位の M e t 力、ら 2 3 1 位の M e t までのァ ミ ノ酸配列から成り、 ガンキリ ンの生物学的活性を 有するポ リべプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 4 に示す 1 位の M e t から 2 3 1 位の M e t までのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失 、 付加及び Z又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ 酸配列から成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持しているポ リベプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 3 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ン ジ ェ ン 卜な条件下でハイプリ ダイズするこ とができる D X Aにより コ一 ドされており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有す るポ リべプチ ドを提供する。 ス ト リ ンジヱ ン 卜な条件とは、 例えば 6 5 °C、 0 . 1 X S S C及び 0 . 1 % S D Sにより与えられる条件 でめる。 W /1 01 本発明はまた、 配列番号 ： 4 に示す 1 4 位の A 1 aから 2 3 1 位 の M e t までのア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ンの生物学的 活性を有するポ リペプチ ドをコー ドする D N A、 配列番号 ： 4 に示 す 1 4位の A 1 a力、ら 2 3 1 位の M e t までのア ミ ノ酸配列におい て 1 又は複数個のア ミ ノ酸の欠失、 付加及び/又は他のア ミ ノ酸に よる置換により修飾されたア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキ リ ン の生物学的活性を維持しているポ リべプチ ドをコ一 ドする D N A又 は配列番号 ： 3 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ン ジ ェ ン トな条件下でハィブリ ダイズするこ とができる D N Aにより コー ド されており、 且つガンキ リ ンの生物学的性質を有するポ リペプチ ド にシグナル配列が付加されたシグナル付加ポ リベプチ ドを提供する 。 ス ト リ ン ジ ヱ ン 卜な条件とは、 例えば 6 5 °C、 0 . 1 X S S C及 び 0 . 1 % S D Sにより与えられる条件である。

本発明はまた、 配列番号 ： 6 に示す 1 4位の A 1 aから 2 3 1 位 の M e t までのァ ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキ リ ンの生物学的 活性を有するポ リぺプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 6 に示す 1 4位の A 1 aから 2 3 1 位 の M e t までのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠 失、 付加及び Z又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持している ポリ べプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 6 に示す 1 位の M e t から 2 3 1 位の M e t までのァ ミ ノ酸配列から成り、 ガンキ リ ンの生物学的活性を 有するポリ べプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 6 に示す 1 位の M e t から 2 3 1 位の M e t までのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失 、 付加及び Z又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ 酸配列から成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持しているポ リベプチ ドを提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 5 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ンジ ヱ ン 卜な条件下でハイプリ ダイズするこ とができる D N Aにより コー ドされており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有す るポ リべプチ ドを提供する。 ス ト リ ン ジ ヱ ン 卜な条件とは、 例えば 6 5 °C、 0. 1 X S S C及び 0. 1 % S D Sにより与えられる条件 である。

本発明はまた、 配列番号 ： 6 に示す 1 4位の A 1 aから 2 3 1 位 の M e t までのア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ンの生物学的 活性を有するポ リペプチ ドをコー ドする D N A、 配列番号 ： 6 に示 す 1 4位の A 1 a力、ら 2 3 1 位の M e t までのア ミ ノ酸配列におい て 1 又は複数個のア ミ ノ酸の欠失、 付加及び Z又は他のア ミ ノ酸に よる置換により修飾されたア ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキ リ ン の生物学的活性を維持しているポ リ べプチ ドをコ一 ドする D N A又 は配列番号 ： 5 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ン ジ ヱ ン 卜な条件下でハイプリ ダイズするこ とができる D N Aによ り コー ド されており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有するポ リペプチ ド にシグナル配列が付加されたシグナル付加ポ リベプチ ドを提供する 。 ス ト リ ンジ ヱ ン 卜な条件とは、 例えば 6 5 °C、 0 . 1 X S S C及 び 0. 1 % S D Sにより与えられる条件である _c

本発明はまた、 前記のポリベプチ ドと他のぺプチ ド又はポ リ ぺプ チ ドとから成る融合ポ リべプチ ドを提供する。

本発明はまた、 前記のポ リべプチ ドをコ一 ドする D N Aを提供す る。

本発明はまた、 前記の D N Aを含んで成るべク タ一を提供する _c 本発明はまた、 前記のベク ターにより形質転換された宿主を提供 する。

本発明はまた、 前記のポ リペプチ ドの製造方法であって、 該ポ リ ぺプチ ドをコ一 ドする D N Aを含んで成る発現べク タ一により形質 転換された宿主を培養し、 該培養物から目的ポ リペプチ ドを採取す ることを特徴とする方法を提供する。

本発明はまた、 前記のポ リペプチ ドに対して特異的に反応する抗 体を提供する。 この抗体は好ま し く はモノ ク ローナル抗体又はポ リ ク 口一ナル抗体である。

本発明はまた、 前記の抗体と、 ガンキリ ンポ リべプチ ドが含まれ ると予想される試料とを接触せしめ、 前記抗体とガンキリ ンポ リべ プチ ドとの免疫複合体の生成を検出又は測定するこ とを含んで成る ガンキリ ンポリぺプチ ドの検出又は測定方法を提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 1 に示される塩基配列のいずれかの箇 所にハイプリ ダイズするアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドを提供す る

本発明はまた、 配列番号 ： 1 に記載の塩基配列中の連続する少な く と も 2 0個以上のヌ ク レオチ ドに対するア ンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドを提供する。 前記連続する少な く と も 2 0個以上のヌ ク レ ォチ ドに対するアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドは好ま し く は翻訳 開始コ ドンを含む。

本発明はまた、 前記アンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドを有効成分 と して含有してなるガンキリ ンポ リべプチ ドの発現阻害剤を提供す る。

本発明はまた、 ガンキリ ンポ リ ベプチ ドと R b との結合に対する ガンキリ ンポ リ べプチ ドのァゴニス 卜又はア ンタ ゴニス 卜のスク リ 一二ング方法において、 R bの存在下でガンキリ ンポ リべプチ ド又 はガンキリ ンポ リべプチ ド含有物と、 ガンキリ ンポ リペプチ ドのァ ゴニス ト又はア ンタゴニス トを含むと予想される試料とを接触せし め、 そして遊離のガンキリ ンポ リペプチ ド又は R bを検出する、 こ とを特徴とする方法を提供する。 前記ガンキ リ ン含有物は、 例えば ガンキリ ンを発現する細胞の溶解物である。

本発明はまた、 ガンキリ ンポ リべプチ ドと N F B との結合に対 するガンキ リ ンポ リ べプチ ドのァ ゴニス ト又はア ンタ ゴニス トのス ク リ ーニング方法において、 N F Bの存在下でガンキリ ンポ リ べ プチ ド又はガンキリ ンポ リべプチ ド含有物と、 ガンキリ ンポ リ ぺプ チ ドのァゴニス ト又はアンタゴニス 卜を含むと予想される試料とを 接触せしめ、 遊離のガンキリ ンポ リぺプチ ド又は N F κ Bを検出す る、 こ とを特徴とする方法を提供する。 前記ガンキ リ ン含有物は、 例えばガンキリ ンを発現する細胞の溶解物である。 図面の簡単な説明

図 1 はヒ 卜の X染色体上のガンキリ ン遺伝子の位置を示す模式図 である。

図 2 は、 ヒ ト リ ンパ球中の染色体上のガンキリ ン遺伝子をィ ン . サイチュー ' ハイブリ ダィゼ一シ ョ ン法により蛍光染色して検出 し たこ とを示す写真である。

図 3 は、 5人の肝癌患者 （ 1 〜 5 ) の正常肝組織 （ N ) 及び肝癌 組織 （T) からの mR N Aをヒ トガンキリ ン c D N Aをプローブと してノザン法により検出 した結果を示す電気泳動図である。

図 4 は、 種々 の ヒ ト細胞系の mR N Aを ヒ ト ガンキ リ ン c D N A をプローブと してノザン法により検出 した結果を示す電気泳動図で ある。

図 5 は、 種々の正常組織中の mR N Aをヒ トガンキリ ン c D N A をプローブと してノザン法により検出 した結果を示す電気泳動図で ある。

図 6 は、 3人の肝癌患者 （ 1 〜 3 ) の正常肝組織 （N ) 及び肝癌 組織 （ T ) からの細胞溶解物中のガンキ リ ンポ リペプチ ドを、 抗ガ ンキリ ンボリペプチ ド抗体を用いてウェスタ ンブロ ッ ト法で検出し た結果を示す電気泳動図である。

図 7 は、 種々のヒ ト細胞系からの細胞溶解物中のガンキリ ンポ リ ぺプチ ドを、 抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体を用いてウェスタ ンブ ロ ッ ト法で検出した結果を示す電気泳動図である。

図 8の Aは、 ィ ンビ ト ロ翻訳されたガンキ リ ン遺伝子生成物を図 6 と同様にして検出 した結果を示し、 Bはイ ンビ ト ロ翻訳されたガ ンキリ ン遺伝子生成物 （未標識） を図 6 と同様にして検出 した結果 を示す電気泳動図である。

図 9 は、 ガンキリ ンポ リべプチ ドと G S Tとの融合ポ リべプチ ド を大腸菌で発現させ、 種々の抗体により検出 した結果を示す電気泳 動図である。

図 i 0 は、 ガンキリ ンポ リペプチ ドと H Aとの融合ポ リペプチ ド を 2 9 3細胞において発現させ、 種々の抗体により検出 した結果を 示す電気泳動図である。

図 1 1 は、 ガンキリ ンポ リペプチ ドと H Aとの融合ポ リ べプチ ド を 2 9 3細胞において発現させ、 種々の抗体により検出 した結果を 示す電気泳動図である。

図 1 2 は、 N I H / 3 T 3細胞の種々の細胞周期における m R X Aをマウスガンキ リ ン c D N Aをプローブと してノザン法により検 出した結果を示す電気泳動図である。

図 1 3 は、 種々の濃度で増殖した N I H Z 3 T 3細胞の m R N A を、 図 1 2 と同様にして検出 した結果を示す電気泳動図である。 図 1 4 は、 マウ スにおける部分的肝切除後の肝再生過程における 肝組織の m R N Aを、 図 1 2 と同様に して検出 した結果を示す電気 泳動図である。

図 1 5 は種々の蛋白質中のアンキリ ン リ ピー 卜の位置と反復数を 示す図である。 発明の実施の形態

本発明によれば、 ガンキリ ンポ リペプチ ドとは、 ガンキリ ンの生 物学的活性を有するポ リベプチ ドを意味する。 ガンキリ ンの生物学 的活性とは癌原性であり、 その具体的な作用は実施例 4 に示すとお り、 細胞の軟寒天中でのコロニー形成能の増加、 マウスにおける造 腫瘍能及びアポ トーシス誘導の抑制である。

本発明のガンキリ ン遺伝子又はその cDNAは、 肝癌細胞又は肝癌組 織を取得源と してスク リ 一二ングを行い、 遺伝子又はその cDNAを得 ることができる。 遺伝子又はその cDNAのスク リ ーニング方法又は単 離方法と しては、 サブ トラ ク シ ヨ ン法 （Nucleic Acids Research ( 1988) 16, 10937 ) 、 ディ フ ァ レ ン シ ャル ' ハイブリ ダィ ゼ一 シ ョ ン法 （Cell (1979) 16， 443-452 ) 等、 発現量の変化する遺伝子を 選択的にスク リ ーニングできる方法を用いる こ とができる。

本発明のガンキリ ンポ リべプチ ドをコ一 ドする遺伝子は、 例えば 、 正常肝組織から.調製した c D N Aライブラ リ ーと、 肝癌組織から 調製した c D N Aライブラ リ ーとのサブ トラ ク シ ョ ン法によ り、 肝 癌組織では転写されているが正常組織では転写されていない m R λ^τ Αに由来する c D N Aを選択する こ とにより得られる。

例えば、 サブ トラ ク シ ヨ ン法は、 肝癌組織又は正常肝組織から得 られた c D N Aをプライマーによ り増幅する。 正常肝組織を増幅す るためのプライマ一は標識化合物、 例えばビォチンで標識する。 次 いで、 過剰量の正常肝組織由来の二本鎖 c D N Aと少量の肝癌組織 由来の二本鎖 c D N Aとを混ぜ、 熱変性するこ とにより一本鎖に し て、 これを二本鎖にもどす。 肝癌組織由来の c D N Aのうち、 正常 肝組織にも発現していたものは、 そのほとんどが過剰に存在する正 常肝組織由来の c D N Aと二本鎖を形成し、 標識を持つようになる しかしながら、 肝癌組織に由来する c D N A同士が二本鎖を形成 すると、 標識を持たない。 そこで、 標識を有する c D N A二本鎖 D N Aを除去すれば、 肝癌組織に特異的な c D N Aが得られる。 この 操作を繰り返すことにより肝癌組織に特異的な c D N Aを濃縮する こ とができる。 この具体的な方法は、 実施例 1 に示す。 さ らに得ら れた cDNA断片や全長の cDNAをプロ一ブと して用いて、 ガンキ リ ンポ リ ベプチ ドを発現する細胞又は組織及びガンキ リ ンポ リ べプチ ドを 発現しない細胞又は組織の mRNAに対してノ ーザンプロ ッティ ングを 行う ことにより、 選択した遺伝子の mRNAが特異的に発現している こ とを確認するこ とができる。

上記のよう に得られた cDNA又は cDNA断片をプロ一ブと して、 cDNA ライブラ リ 一をスク リ ーニ ングするこ とにより異なる細胞、 組織、 臓器又は種からガンキリ ン遺伝子を得る こ とができる。 また、 得ら れた cDNAの塩基配列を決定するこ とにより、 ガンキリ ン遺伝子産物 のポ リべプチ ドをコ一 ドする翻訳領域を決定でき、 このポ リ べプチ ドのア ミ ノ酸配列を得ることができる。 また、 得られた cDNAをプロ ーブと してジヱノ ミ ッ ク DNA ライブラ リ ーをスク リ ーニングする こ とにより、 染色体 DNA を単離するこ とができる。

cDNAライブラ リ ーやジヱノ ミ ッ ク DNA ライブラ リ 一等の DNA ラィ ブラ リ ーは、 例えば Sambrook, J. et al. , olecular C 1 on i ng Co Id Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)に言己載の方法により調 製してもよいし、 市販の DNA ライブラ リ 一を用いてもよい。 本発明の遺伝子も しく は DNA は、 その塩基配列又はその一部が明 らかな場合、 それをプライマ一と して PCR 法を用いる こ とにより得 るこ とができる。

本発明のガンキリ ンポリべプチ ドはまた、 配列番号 ： 1 に示す塩 基配列を有する核酸とス ト リ ンジェ ン トな条件下でハィブリ ダイズ する D N Aにより コ 一 ドされており、 且つガンキリ ンの生物学的活 性を有するポ リべプチ ドを含む。

ス ト リ ン ジ ヱ ン 卜な条件と しては、 低ス ト リ ン ジ ヱ ン 卜な条件が 挙げられる。 低ス ト リ ン ジ ヱ ン 卜の条件とは、 例えば 5 0 °C、 2 X SSC 、 0 . 1 % S D Sである。 またより好ま しく は、 高ス ト リ ン ジ ェ ン トな条件が挙げられる。 高ス ト リ ン ジ ェ ン 卜な条件とは、 例え ば 6 5 °C、 0 . 1 X S S C及び 0 . 1 % S D Sが挙げられる。

上記のハイプリ ダイズする D N Aは好ま し く は天然由来の D N A 、 例えば c D N A又はジヱノ ミ ッ ク D N Aであってよい。 配列番号 ： 2 に示したア ミ ノ酸配列、 配列番号 ： 1 に示した塩基配列につい て、 既知 DNA データベース （GenBank 、 EMBL) 及び蛋白質データべ ース （SWISS- PLOT) に含まれる全ての配列に対して相同性検索を行 つた結果、 一致する ものは見いだせなかった。 このこ とから本発明 の遺伝子とその遺伝子産物であるポ リ ペプチ ドは新規な分子である こ とが明らかとなった。

実施例 1 に示すごと く 、 本発明の新規なガンキリ ンポ リぺプチ ド の c D N Aとハイブリ ダィズする遺伝子は、 本発明においてヒ ト以 外の動物、 例えばラ ッ ト、 マウ ス等にも広く 分布し、 またヒ ト の種 々 の組織にも分布しているこ とが判明 した。 従って、 上記の天然由 来の D N Aは、 例えば実施例 1 においてヒ トガンキ リ ンポ リ ぺプチ ドの c D N Aとハイプリ ダイズする m R N Aが検出される組織由来 の c D N Aやジヱ ノ ミ ッ ク D N Aであってもよい。 本発明はまた、 上記のごと く配列番号 ： 2 に示す塩基配列を有す る核酸とハイプリ ダイズし且つガンキリ ンの活性を有するポ リ ぺプ チ ドをコー ドする D N Aを包含する。 この D N Aも、 前記の方法に より発現させることができる。 このようなガンキリ ンポ リべプチ ド を得るために、 ガンキリ ン遺伝子の塩基配列に所望の変異を導人す るには合成オリ ゴヌ ク レオチ ドプライマ一を利用するこ とができる (Mark, D. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、 Zol ler, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、 Wang, A. et al. , Science 224, 1431-1 433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA (1982) 79， 6409-6413 ) 。

また、 ガンキリ ンポ リ ペプチ ドをコー ドする c D N Aやジヱ ノ ミ ッ ク D N Aの他、 合成 D N Aであってもよい。 具体的には、 配列番 号 ： 2で表されるア ミ ノ酸配列を有するガンキリ ンをコ一 ドする D N Aが挙げられ、 例えば配列番号 ： 1 で表される塩基配列を有する D N Aが用いられる。 これらの D N Aは、 それ自体公知の遺伝子ェ 学的手法を用いて製造するこ と もできる。

後述の実施例 1 で得られたプラス ミ ド pBS- t4- U を保持する形質 転換体大腸菌は Escherichia col i DH5a (pBS- t4- 11 ) と命名され 、 平成 9 ( 1 9 9 7 ) 年 9 月 2 9 日に工業技術院生命工学工業技術 研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に寄託番号 F E R M BP- 6 1 2 8 と して寄託されている。

本発明のガンキリ ンポ リべプチ ドと しては、 例えば配列番号 ： 2 で表されるア ミ ノ酸配列と同一も し く は実質的に同一のア ミ ノ酸配 列を有するガンキ リ ンポ リべプチ ド等が挙げられる。 具体的には、 配列番号 ： 2で表されるァ ミ ノ酸配列を有するガンキリ ンの他、 配 列番号 ： 2で表されるァ ミ ノ酸配列中の 1 又は 2個以上、 好ま し く は、 2個以上 3 0個以下、 より好ま し く は 2個以上 1 0個以下のァ ミ ノ酸が欠失したもの、 配列番号 ： 2 で表されるア ミ ノ酸配列に 1 又は 2個以上、 好ま し く は、 2個以上 3 0個以下、 より好ま し く は 2個以上 1 0個以下のア ミ ノ酸が付加したもの、 配列番号 ： 2で表 されるァ ミ ノ酸配列中の 1 又は 2 個以上、 好ま し く は、 2個以上 3 0個以下、 より好ま し く は 2個以上 1 0個以下のア ミ ノ酸が他のァ ミ ノ酸で置換されたものが挙げられる。

また、 本発明にはガンキ リ ンの生物学的活性を有し、 且つ配列番 号 ： 2 に示されるア ミ ノ酸配列を有するポ リペプチ ドと相同なポ リ ペプチ ドも含まれる。 相同なポ リペプチ ドとは配列番号 ： 2 のア ミ ノ酸配列とは、 一般に少な く と も 20個、 好ま し く は 3 0個の連続し たア ミ ノ酸残基で、 少な く と も 70 % 、 好ま し く は少な く と も 80 % 、 より好ま し く は少な く と も 90 % 、 より好ま し く は少な く と も 95 % 以 上、 ァ ミ ノ酸配列上の相同性を有するポ リべプチ ドを意味する。 本発明のガンキリ ンポ リべプチ ドは、 後述するそれを産生する細 胞ゃ宿主あるいは精製方法により、 ア ミ ノ酸配列、 分子量、 等電点 又は糖鎖の有無や形態が異なっている。 しかしながら、 得られたガ ンキリ ンポ リべプチ ドが天然のガンキ リ ンポ リベプチ ドと実質的に 同質の活性を有する ものである限り本発明に含まれる。 ガンキ リ ン ポリペプチ ドと実質的に同質の活性と しては、 後述の実施例 4 に記 載される癌原性、 例えば細胞の軟寒天中でのコロニー形成能の増加 、 マウ スにおける造腫瘍能及びアポ ト ー シス誘導の抑制が挙げられ る。 実質的に同質とは、 癌原性等が性質的に同質であるこ とを示す 本発明のガンキ リ ンポ リ べプチ ドの部分べプチ ドと しては、 例え ばガンキリ ンの分子のうち、 疎水性プロ ッ 卜解析から推定される疎 水性領域や親水性領域の 1 つあるいは複数の領域を含む部分べプチ ドが挙げられる。 これらの部分べプチ ドは 1 つの疎水性領域の一部 あるいは全部を含んでいてもよいし、 1 つの親水性領域の一部ある いは全部を含んでいてもよい。

本発明のガンキリ ンポ リべプチ ドの部分べプチ ドは、 自体公知の ペプチ ド合成法に従って、 あるいは本発明のガンキリ ンポ リべプチ ドを適切なぺプチダーゼで切断するこ とによって製造するこ とがで きる。 ペプチ ド合成法と しては、 たとえば固相合成法、 液相合成法 のいずれによっても良い。

また反応後は通常の精製法、 例えば溶媒抽出、 蒸留、 カラムク ロ マ トグラフ ィ 一、 高速液体ク ロマ ト グラフ ィ ー、 再結晶を組合わせ て本発明の部分べプチ ドを単離精製するこ とができる。

前記のように構築した D N Aは、 公知の方法により発現させ、 ガ ンキリ ンポ リべプチ ドを取得するこ とができる。 哺乳類細胞を使用 する場合、 常用される有用なプロモータ一 Zェ ンハ ンサー、 発現さ れる遺伝子、 その 3'側下流にポ リ A シグナルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むべク ターによ り発現させるこ とができる。 例えばプロモーター Zェンハンサ一と しては、 ヒ トサイ トメ ガロウ イ ノレス Bリ期フ 口 モー タ ー /ェ ンノヽ ンサ一 ( human cytomegalovirus immediate earl y promoter/enhancer ) 挙げるこ と力くできる。 また、 その他にガンキリ ンポ リぺプチ ド発現に使用できるプロモ 一 夕 一 /ェ ン ノヽンサ一と して、 レ トロウ イ ルス、 ポ リ オ一マウ ィ ル ス、 アデノ ウ イ ノレス、 シ ミ ア ンゥ イ ノレス 40 (SV 40 ) 等のウ イ ノレス プロモー タ 一 Zェ ンハ ンサ一ゃ ヒ ト ェロ ンゲ一 シ ョ ンフ ァ ク タ 一 1 a (HEF1 ) の哺乳類細胞由来のプロ モーターノエ ンハ ンサーを用 いればよい。

例えば、 SV 40 プロモータ一 Zェ ンハ ンサ一を使用する場合、 Mu l l iganらの方法 （Nature (1979) 277, 108) 、 また、 HEF1 プロモ —ター/ェンハ ンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322) に従えば容易に実施する こ とが できる。

大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 ポ リ ペプチ ド分 泌のためのシグナル配列、 発現させる遺伝子を機能的に結合させて 発現させることができる。 例えばプロモーターと しては、 lacZプロ モーター、 araBプロモータ一を挙げるこ とができる。 lacZプロモ一 ターを使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341, 544-546 ； FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーターを使用する 場合、 Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従え ばよい。

ガンキリ ンポ リペプチ ド分泌のためのシグナル配列と しては、 大 腸菌のペリ ブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S . P. et al J. Bacteriol. ( 1987) 169, 4379 ) を使用すればよい 複製起源と しては、 SV 40 、 ポ リ オ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ イ ノレ ス、 ゥシパピローマウ ィ ルス （BPV ) 等の由来のものを用いる こ と ができる。 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現 ベク タ一は選択マーカ一と して、 ア ミ ノ グリ コ シ ド トラ ンスフ ェラ ーゼ （ APH ) 遺伝子、 チ ミ ジンキナーゼ （ TK) 遺伝子、 大腸菌キサ ンチ ングァニンホスホ リ ボシル ト ラ ンスフ ヱ ラ 一ゼ （ Ecogp t ) 遺伝 子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができる。 本発明において、 ガンキリ ンポ リペプチ ドの製造のために、 任意 の産生系を使用するこ とができる。 ガンキリ ンポリ べプチ ド製造の ための産生系は、 in vitroおよび in vivo の産生系がある。 in vi t roの産生系と しては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用 する産生系が挙げられる。 真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば CH0 ( J. Exp. Med. (1995) 108, 945) 、 COS 、 ミ エ口—マ、 BHK (ba by hamster kidney ) 、 HeLa、 Vero、 (2) 両生類細胞、 例えばァフ リ カツメ ガエル卵母細胞 （Valle, et al.， Nature ( 1981) 291, 35 8-340 ) 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば sf9 、 sf21、 Tn5 が知ら れている。 CH0 細胞と しては、 特に DHFR遺伝子を欠損した CH0 細胞 である dhfr- CHO (Pi'oc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4 220 ) や CHO K- 1 (Pro Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275 ) を好適に使用するこ とができる。

植物細胞と しては、 Nicotiana tabacum 由来の細胞が知られてお り、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母、 例え ばサッカ ロ ミ セス （ Saccharomyces ) 属、 例えばサ ッ カ ロ ミ セス ' セ レ ヒ シェ ( Saccharomyces cerevisiae) 、 糸；!犬囷'、 ^ (列んは ァスぺ ルギウス属 （Aspergillus ) 属、 例えばァスペルギウス ' 二ガー （ Asper illus ni er ) 力く矢口られている。

原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. col i ) 、 枯草菌が知られている。

これらの細胞を目的とする D N Aにより形質転換し、 形質転換さ れた細胞を i n v i t roで培養するこ とによりガンキリ ンポ リべプチ ド が得られる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と し て、 DMEM、 MEM 、 RPMI 1640, 1MDMを使用するこ とができる。 その際 、 牛胎児血清 （FCS ) 等の血清補液を併用するこ と もできる し、 無 血清培養してもよい。 培養時の pHは約 6 〜 8 であるのが好ま しい。 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 1 5 〜 2 0 0 時間行い、 必要に応じ て培地の交換、 通気、 撹拌を加える。

—方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的とす る D N Aを導入し、 動物又は植物の体内でガンキリ ンポ リべプチ ド を産生させ、 回収する。 本発明における 「宿主」 とは、 これらの動 物、 植物を包含する。

動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥ シを用い るこ とができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Appl i ca tions, 1993 ) 。 また、 哺乳類動物を用いる場合、 ト ラ ンス ジ ェニ ッ ク動物を用いるこ とができる。

例えば、 目的とする D N Aをャギ 3カゼィ ンのような乳汁中に固 有に産生される蛋白質をコー ドする遺伝子の途中に挿入して融合遺 伝子と して調製する。 この D N Aが挿入された融合遺伝子を含む DN A 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受 容したャギから生まれる トラ ンス ジ ヱニ ッ クャギ又はその子孫が産 生する乳汁からガンキリ ンポ リべプチ ドを得る。 トラ ンス ジ ェニ ッ クャギから産生されるガンキリ ンポ リべプチ ドを含む乳汁量を増加 させるために、 適宜ホルモ ンを トラ ンス ジ ェニ ッ クャギに使用 して もよい。 (Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology ( 1994) 12， 699 - 702 ) o

また、 昆虫と しては、 例えばカイ コを用いるこ とができる。 カイ コを用いる場合、 目的とする D N Aを揷入したバキュロウ ィ ルスを カイ コに感染させ、 このカイ コの体液より所望のガンキ リ ンポ リ べ プチ ドを得る （Susumu, M. et al. , ature ( 1985) 315， 592-594

) ο

さ らに植物を使用する場合、 例えばタバコを用いる こ とができる 。 タバコを用いる場合、 目的とする D Ν Αを植物発現用べク タ一、 例えば pMON 530に揷入し、 このベク ターを Agrobacterium tumefaci l 8 ens のようなノく クテ リ アに導入する。 このバクテ リ アをタバコ、 例 えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望のポ リ ペプチ ドを得る （Julian, K. - a et al. , Eur. J. Immunol. (1 994) 24， 131-138) 。 宿主への発現ベク ターの導入方法と しては、 公知の方法、 例えばリ ン酸カルシウ ム法 （Virology (1973) 52, 45 6-467 ) やエ レ ク ト ロボ レ一 シ ヨ ン法 （EMBO J. (1982) 1, 841-84 5 ) 等が用いられる。 また、 発現に使用する宿主のコ ドン使用頻度 を考慮して、 より発現効率の高い配列を設計する こ とができる （Gr antham, R. et al. , Nucelic Acids Research (1981) 9， r43-r74

) o

このようにして得られたガンキリ ン遺伝子産物がガンキリ ンの生 物学的活性を有しているこ とは、 例えば次ぎのよう に して確認する ことができる。 例えば、 後述の実施例 4 に記載されている方法を用 い、 ガンキ リ ンポ リペプチ ド産生細胞を軟寒天中で培養する。 ガン キリ ンポ リべプチ ド発現細胞は軟寒天中でコ ロニー形成能が増加し ている。 また、 ガンキリ ンポ リペプチ ド発現細胞をマウスに移植す る。 ガンキリ ンポ リ ペプチ ド発現細胞はマウ ス体内で造腫瘍能を示 す。 また、 ガンキ リ ンポ リペプチ ド発現細胞をアポ トーシス誘導条 件下におく 。 ガンキリ ンポ リべプチ ド発現細胞はアポ トーシス誘導 を抑制する。

上記で得られたガンキリ ンポ リペプチ ドは、 細胞内外、 宿主から 単離し実質的に純粋で均一なポ リ べプチ ドと して精製する こ とがで き る。 ガンキ リ ンポ リペプチ ドの分離、 精製は、 通常の蛋白質の精 製で使用されている分離、 精製方法を使用すればよ く 、 何ら限定さ れる ものではない。 例えば、 ク ロマ ト グラフ ィ ーカラム、 フ ィ ノレ夕 一、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 免疫沈降、 S D S —ポ リ アク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析等を適宜選択、 組み 合わせればガンキ リ ンポ リ べプチ ドを分離、 精製する こ とができ る ク ロマ 卜 グラ フ ィ 一と しては、 例えばァフ ィ 二テ ィ ー ク ロマ ト グ ラ フ ィ ー、 イオ ン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 疎水性ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 ゲル濾過、 逆相ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィ 一等力く挙け りれる (Strategies for Protein Purification and Ch aracterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Mar shak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) ₀ こ れらのク ロマ ト グラ フ ィ ーは、 液相ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 例えば HP し C、 FPLC等の液相ク 口マ ト グラ フ ィ 一を用いて行う こ とができ る。 なお、 ガンキ リ ンポ リ べプチ ドを精製前又は精製後に適当なタ ンパ ク修飾酵素を作用 させる こ とによ り 、 任意に修飾を加えたり部分的 にべプチ ドを除去する こ と もでき る。 タ ンパク修飾酵素と しては、 ト リ プシ ン、 キモ ト リ ブシ ン、 リ シルエン ドべプチダ一ゼ、 プロテ イ ンキナーゼ、 グルコ シダーゼ、 プロテイ ンキナーゼ、 グルコ シダ —ゼが用い られる。

本発明のガンキ リ ンポ リ べプチ ドは、 ス ク リ 一ニ ング方法に使用 されるために有用である。 すなわち、 R b (DeCaprio, J. A. et al. ， Cell ( 1989) 58, 1085-1095 ) の存在下でガンキ リ ンポ リ べプチ ド又はガンキ リ ンポ リ べプチ ド含有物と、 ガンキ リ ンポ リ べプチ ド のァゴニス ト又はア ンタ ゴニス 卜を含むと予想される試料とを接触 せ しめ、 そ して遊離のガンキ リ ンポ リ べプチ ド又は R bを検出又は 測定する、 こ と力、らなるガンキ リ ンポ リ ぺプチ ドのァ ゴニス ト又は ガンキ リ ンア ンタ ゴニス 卜のス ク リ ーニング方法 ； 又は、 N F / B (Baeuerle, P. A. et al. , Cell ( 1988) 53， 21卜 217)の存在下でガ ンキ リ ンポ リ べプチ ド又はガンキ リ ンポ リ べプチ ド含有物と、 ガン キ リ ンポ リ べプチ ドのァゴニス 卜又はア ン夕 ゴニス トを含むと予想 される試料とを接触せしめ、 そ して遊離のガンキリ ンポ リべプチ ド 又は N F Bを検出又は測定する、 ことからなるガンキリ ンポ リべ プチ ドのァゴニス ト又はガンキリ ンアンタゴニス 卜のスク リ 一ニン グ方法において使用されるために有用である。

これらのスク リ 一ニング方法に用いられるガンキリ ンポリ べプチ ドは組換え型、 天然型のいずれであっても使用 し得る。 また、 R b又 は N F c B との結合性を維持している限り、 ガンキリ ンポ リべプチ ドの部分べプチ ドであってもよい。 ガンキリ ンポ リべプチ ド含有物 と しては、 ガンキリ ンポ リペプチ ドを発現する細胞の溶解物が挙げ られる。

すなわち、 本発明は、 R bの存在下で、 ガンキリ ンポ リペプチ ド 又はガンキリ ンポ リべプチ ド含有物と、 ガンキリ ンポ リ ぺプチ ドの ァゴニス ト又はア ンタゴニス 卜を含むと予想される試料とを接触せ しめた場合と、 ガンキリ ンポ リべプチ ド又はガンキリ ンポリ べプチ ド含有物と、 ガンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又はア ンタ ゴニ ス トを含まない試料を接触せしめた場合の、 検出又は測定された遊 離のガンキリ ンポ リべプチ ド又は R bを比較するこ とから成るガン キリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又はアンタ ゴニス 卜のスク リ ー二 ング方法に係わる。

本発明はまた、 N F Bの存在下で、 ガンキリ ンポ リ ペプチ ド又 はガンキリ ンポ リべプチ ド含有物と、 ガンキリ ンポ リ べプチ ドのァ ゴニス ト又はア ンタゴニス トを含むと予想される試料とを接触せし めた場合と、 ガンキリ ンポリべプチ ド又はガンキリ ンポ リべプチ ド 含有物と、 ガンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又はア ンタゴニス トを含まない試料を接触せしめた場合の、 検出又は測定された遊離 のガンキリ ンポ リべプチ ド又は N F κ Bを比較することから成るガ ンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又はアンタゴニス 卜のスク リ 一 二ング方法に係わる。

これらのスク リ ーニング方法において、 遊離のガンキリ ンポ リべ プチ ド、 R b又は N F / Bを検出又は測定するためには、 例えばガ ンキリ ンポ リぺプチ ド、 R b又は N F c Bを標識化合物、 例えばビ ォチン、 アビディ ン、 放射性同位元素、 例えば 〔 1 ^{2 5} I 〕 、 〔 ^{3 5} S 〕 、 〔 ³ H〕 、 〔 ^{1 4} C〕 、 蛍光物質、 酵素、 例えば西洋ヮサビペル ォキシダーゼ、 アルカ リ フ ォ スフ ァ ターゼを用いて標識し、 これを 検出又は測定するこ とができる。 これらの標識化合物はすでに公知 であり、 通常の方法に従って標識するこ とができる。 また、 遊離の ガンキリ ンポ リべプチ ド、 R b又は N F κ Bを検出又は測定するた めには、 ガンキリ ンポリペプチ ド、 R b又は N F Bに対する抗体 を用いて行う ことができる。

具体的には、 ガンキリ ンポ リぺプチ ドを支持体、 例えばビ一ズ、 プレー トに固定し、 R b又は N F /c Bの存在下でガンキリ ンポ リ べ プチ ドのァゴニス 卜又はアンタゴニス トを含むと予想される試料を 加え、 イ ンキュベー トの後、 溶液中に含まれる R b又は N F / Bを 抗体により検出又は測定すればよい。 また、 遊離の R b又は N F B を検出又は測定するために、 プレー 卜に固定したガンキ リ ンポ リ べ プチ ドに結合した R b又は N F κ Bを検出又は測定してもよい。

その際、 ガンキリ ンポ リぺプチ ドを他のぺプチ ド又はポ リ ぺプチ ドと遺伝子工学的に融合させた融合ポ リぺプチ ドを用いるこ とがで きる。 融合に付される他のぺプチ ド又はポ リべプチ ドと しては H A

(へモグルァチニン） 、 F L A G等が挙げられ、 遊離のガンキ リ ン ポ リべプチ ドをこれら融合に付される他のぺプチ ド又はポ リ べプチ ドに対する抗体を用いて検出又は測定するこ とができる。 したがつ て、 ガンキリ ンポ リべプチ ドを他のぺプチ ド又はポ リ ぺプチ ドと遺 伝子工学的に融合させた融合ポ リべプチ ドは、 本発明において有用 である。

本発明のスク リ 一ニング方法で使用されるガンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又はア ンタゴニス トを含むと予想される試料と して は、 例えばペプチ ド、 タ ンパク質、 非ペプチ ド性化合物、 合成化合 物、 微生物発酵生産物、 海洋生物抽出液、 植物抽出液、 細胞抽出液 、 動物組織抽出液が挙げられる。 これらの試料は新規な物質であつ てもよいし、 公知の物質であってもよい。

本発明のスク リ ーニング方法は、 癌原性を有するガンキリ ンポ リ ぺプチ ドのァゴニス ト又はアンタゴニス トを検出又は測定するこ と ができるため有用である。

ガンキリ ンポ リペプチ ドは、 本発明において R b又は N F /c B と 相互作用するこ とが見いだされた。 ガンキリ ンポ リ べプチ ドは癌原 性を有することから、 ガンキリ ンポ リ べプチ ドと R b又は N F B との結合を調節するガンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又はアン タゴニス トは医薬品と して有用である。

具体的には、 上記のス ク リ ーニング方法を実施するには、 まず、 本発明のガンキ リ ンポ リベプチ ド又はガンキリ ンポ リ べプチ ド含有 物を、 スク リ ーニングに適した緩衝液に懸濁し、 プレー 卜に固定す ることによりガンキリ ンポ リべプチ ド標品を調製する。

緩衝液と しては、 ガンキリ ンポ リべプチ ドの結合を阻害しないも のであれば何でもよ く 、 例えば pH 6 〜 8 のリ ン酸緩衝液、 ト リ スー 塩酸緩衝液、 P B S、 H B S Sが用いられる。 また、 非特異的結合 を低減させる目的で、 ゥ シ血清アルブ ミ ンのタ ンパク質、 C H A P Sや T w e e n 8 0 TM、 ジギ トニン等の界面活性剤を加えるこ と も できる。 さ らに、 タ ンパク質分解酵素によるガンキ リ ンポ リ べプチ ドの分解を抑えるために、 P M S F、 ぺプスタチン、 ロイぺプチン 等のタ ンパク質分解酵素阻害剤を添加すること もできる。 次いで、 該ガンキリ ンポ リペプチ ド標品に、 放射性同位元素によ り標識した R b又は N F /c B と適当な濃度の試料を同時に添加し、 約 0〜 5 0 °C (望ま し く は約 4 〜 3 7 °C ) で、 約 0 . 5 〜 2 4 時間

(望ま し く は約 0 . 5 ~ 3 時間） 反応させる。 反応後、 適量の緩衝 液で洗浄したのち該ガンキリ ンポ リべプチ ド標品に残存する放射線 量をガンマカウ ンタ一又は液体シンチレーシ ョ ンカウ ンターで測定 する。 このとき、 ガンキリ ンポリペプチ ド標品に対する非特異的な 結合を測定するために、 ガンキリ ンポ リ べプチ ドと相互作用 しない 別のポリべプチ ドを同様に標識して添加したガンキ リ ンポ リベプチ ド標品を調製する。 また、 試料を含まない緩衝液を添加したガンキ リ ンポリべプチ ド標品をネガティ ブコ ン ト ロールとする。

試料を含むときの残存放射線量から非特異的結合量を差し引いた 値が特異的結合量である。 反応液に試料を添加しない場合に比べて 、 この特異的結合量を低下させる試料をガンキリ ンポ リべプチ ドの ァゴニス ト又はア ンタゴニス 卜の候補物質と して選択するこ とがで きる。

本発明のスク リ 一ニング方法を用いて得られるガンキ リ ンポ リ べ プチ ドのァゴニス ト又はア ンタ ゴニス ト は、 ス ク リ ーニ ング方法を 用いて試料、 例えばペプチ ド、 タ ンパク質、 非ペプチ ド性化合物、 合成化合物、 微生物発酵生産物、 海洋生物抽出液、 植物抽出液、 細 胞抽出液、 動物組織抽出液をスク リ ーニングするこ とができる。 こ れらの試料は新規な物質であってもよい し、 公知の物質であっても よい。

これらのガンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又はアンタゴニス トは、 ガンキリ ンポ リペプチ ドと R b又は N F /c B との結合を阻害す る物質である。 本発明のスク リ 一ニング方法を用いて得られるガン キリ ンポリべプチ ドのァゴニス ト又はア ンタゴニス 卜の構造の一部 を、 付加、 欠失あるいは置換により変換される物質も本発明のス ク リ ーニング方法を用いて得られるガンキ リ ンポ リ べプチ ドのァ ゴニ ス ト又はア ンタ ゴニス 卜 に含まれる。

本発明のスク リ ーニング方法を用いて得られるガンキ リ ンポ リ べ プチ ドのァゴニス 卜又はアンタ ゴニス 卜を ヒ トゃ哺乳動物、 例えは" マウス、 ラ ッ ト、 モルモ ッ ト、 ゥサギ、 ニヮ ト リ 、 ネ コ、 ィ ヌ、 ヒ ッ ジ、 ブタ、 ゥ シ、 サル、 マ ン ト ヒ ヒ、 チ ンパ ン ジーの医薬と して 使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができる。

例えば必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エ リ キ シル 剤、 マイ ク ロカプセル剤と して経口的に、 あるいは水も し く はそれ 以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えばガンキリ ンポ リべプチ ドの ァゴニス ト又はア ンタ ゴニス トを生理学的に認められる単体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒ クル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤とと もに一般に認 められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和するこ と によ つ て製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示さ れた範囲の適当な容量が得られるようにする ものである。

錠剤、 カプセル剤に混和する こ とができる添加剤と しては、 例え は'ゼラチ ン、 コー ンスターチ、 ト ラ ガン トガム、 アラ ビア ゴムのよ うな結合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コー ンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のよ う な膨化剤、 ステア リ ン酸マグネ シウ ム のよ うな潤滑剤、 シ ョ糖、 乳糖又はサ ッ カ リ ンのよ う な甘味剤、 ベ パー ミ ン ト、 ァカモノ油又はチヱ リ ーのような香味剤が用いられる 。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさ らに油 脂のような液状単体を含有するこ とができる。 注射のための無菌組 成物は注射用蒸留水のようなべヒ クル中の活性物質、 胡麻油、 椰子 油のような天然産出植物油を溶解又は懸濁させるの通常の製剤実施 に従って処方するこ とができる。

注射用の水溶液と しては、 例えば生理食塩水、 ブ ドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液、 例えば D — ソルビ ト ール、 D —マ ンノ ース 、 D —マンニ ト ール、 塩化ナ ト リ ウ ムが挙げられ、 適当な溶解補助 剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタ ノ ール、 ポ リ アルコール、 例えばプロ ピレングリ コール、 ポ リエチレングリ コール、 非イオン 性界面活性剤、 例えばポ リ ソルベー ト 8 0 ( T M ) 、 H C 0— 5 0 と併用 してもよい。

油性液と してはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤と して安 息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールと併用 してもよい。 また、 緩 衝剤、 例えばリ ン酸塩緩衝液、 酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液、 無痛化剤、 例えば塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力イ ン、 安定剤、 例えばべ ンジルアルコール、 フ ヱ ノ ール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調 製された注射液は通常、 適当なァンプルに充塡させる。

ガンキ リ ンポ リ べプチ ドのァ ゴニス ト又はア ンタ ゴニス 卜の投与 量は、 症状により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （ 体重 6 0 k gと して） においては、 1 日あたり約 0 . 1 力、ら 1 0 0 m g 、 好ま し く は約 1 . 0 カヽら 5 0 m g、 より好ま し く は約 1 . 0 カヽら 2 0 mgである。

非経口的に投与する場合は、 その 1 回投与量は投与対象、 対象臓 器、 症状、 投与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通 常成人 （体重 6 0 k gと して） においては、 1 日あたり約 0 . 0 1 か ら 3 0 m g , 好ま し く は約 0 . 1 から 2 0 m g , より好ま し く は約 0 . 1 から 1 0 m g程度を静脈注射によ り投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たり に換算した量を投与する こ とが できる。

本発明の抗ガンキ リ ンポ リ べプチ ド抗体は、 公知の手段を用いて モノ ク ロ一ナル抗体又はポ リ ク ローナル抗体と して得るこ とができ る。

モノ ク ローナル抗体は、 ガンキリ ンポ リべプチ ドを感作抗原と し て使用 して、 これを通常の免疫方法に したがって免疫し、 得られる 免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通 常のスク リ 一二ング法により、 モノ ク 口一ナル抗体産生細胞をス ク リ ーニングするこ とによって作製できる。

具体的には、 モノ ク ローナル抗体又はポ リ ク ローナル抗体を作製 するには次のよう にすればよい。

例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用されるガンキリ ンポ リ べ プチ ドは、 その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、 例え ばヒ ト、 マウス又はラ ッ ト由来のガンキリ ンポ リべプチ ドが好ま し い。 これらのヒ ト、 マウス又はラ ッ トガンキリ ンポ リペプチ ドは、 本明細書に開示される遺伝子配列を用いて得るこ とができる。

本発明において、 感作抗原と して使用されるガンキリ ンポ リ ぺプ チ ドは、 本明細書に記載された全てのガンキ リ ンポ リ べプチ ドの生 物学的活性を有するガンキリ ンポ リ べプチ ドを使用できる。 また、 ガンキリ ンポ リべプチ ドの断片も用いるこ とができる。 ガンキリ ン ポ リ ペプチ ドの断片と しては、 例えばガンキリ ンポ リべプチ ドのカ ルポキシ （ C ) 末端断片が挙げられる。 本明細書で 「抗ガンキ リ ン ポ リペプチ ド抗体」 とはガンキリ ンポ リべプチ ドの全長又は断片に 特異的に反応する抗体を意味する。

ガンキリ ンポ リべプチ ド又はその断片をコ一 ドする遺伝子を公知 の発現ベク ター系に挿入して本明細書で述べた宿主細胞を形質転換 させた後、 その宿主細胞内外又は、 宿主から目的のガンキリ ンポ リ ペプチ ド又はその断片を公知の方法で得、 このガンキリ ンポ リ ぺプ チ ドを感作抗原と して用いればよい。 また、 ガンキ リ ンポ リ べプチ ドを発現する細胞又はその溶解物を感作抗原と して使用 してもよい 感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定される もので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま し く 、 一般的にはげつ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が 使用される。

げっ歯目の動物と しては、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスター 等が使用される。 ゥサギ目の動物と しては、 例えば、 ゥサギが使用 される。 霊長目の動物と しては、 例えばサルが使用される。 サルと しては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザル） 、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マン ト ヒ ヒ、 チンパンジー等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法に したがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は

、 皮下に注射することにより行われる。 具体的には、 感作抗原を P B S (Pho s pha t e - B u f f e r e d Sa l i ne ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望により通常のアジュバン ト、 例えば、 フ ロイ ン ト完全アジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与し、 以降フロ イ ン ト不完全ア ジ ュバン 卜 に適量混合した感作抗原を、 4 〜 2 1 日毎に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に 適当な担体を使用することができる。 このよ う に免疫し、 血清中に 所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。

こ こで、 ガンキリ ンポリべプチ ドに対するポ リ ク ローナル抗体を 得るには、 血清中の所望の抗体レベルが上昇したこ とを確認した後 、 抗原を感作した哺乳動物の血液を取り 出す。 この血液から公知の 方法により血清を分離する。 ポ リ ク ロ一ナル抗体と してポ リ ク ロー ナル抗体を含む血清を使用 してもよいし、 必要に応じこの血清から ポリ ク ロ一ナル抗体を含む画分をさ らに単離してもよい。 モノ ク ローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物 から免疫細胞を取り出 し、 細胞融合に付せばよい。 この際、 細胞融 合に使用される好ま しい免疫細胞と して、 特に脾細胞が挙げられる 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物の ミ エ ローマ細胞と しては、 既に公知の種々の細胞株、 例えば、 P 3 ( P 3 X 6 3 A g 8 . 6 5 3 ) (Kearney, J. F. et al. , J. Immunol. ( 1979) 123, 1548-1550) 、 P 3 x 6 3 A g 8 . U 1 (Yel ton, D. E . et al. , Current Topics in Microbiology and Immunology (197 8) 81， 1-7) 、 N S - 1 (Kohler, G. and M stein, C. , Eur. J. Immunol. (1976) 6， 511-519) 、 M P C— 1 1 (Margulies, D. H. et al. , Cell (1976) 8, 405-415) 、 S P 2 / 0 (Shulman, . et al. , Nature (1978) 276, 269-270) 、 F 0 (de St. Groth, S. F . and Scheidegger, D. , J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21) 、 S 1 9 4 (Trowbridge, I. S. , J. Exp. Med. ( 1978) 148, 313-3 23) 、 R 2 1 0 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277， 131-133 ) 等が好適に使用される。

前記免疫細胞と ミ エローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 例えば、 ミ ルスティ ンらの方法（Gal fre， G. and Mi lstein, C. ， Methods Enzymol. ( 1981) 73, 3-46) 等に準じて行う こ とができ る。

より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポ リ エチ レ ング リ コール （ P E G) 、 セ ンダイ ウ ィ ルス （ H V J ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメ チル スルホキシ ド等の補助剤を添加使用すること もできる。 免疫細胞と ミ エローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミ エローマ 細胞に対して免疫細胞を 1 〜 1 0倍とするのが好ま しい。 前記細胞 融合に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミ エローマ細胞株の増 殖に好適な R P M I 1 6 4 0培養液、 M E M培養液、 その他、 この 種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに 、 牛胎児血清 （ F C S ) 等の血清補液を併用するこ と もできる。 細胞融合は、 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く 混合し、 予め、 3 7 °C程度に加温した P E G溶液、 例 えば、 平均分子量 1 0 0 0 〜 6 0 0 0程度の P E G溶液を通常、 3 0〜 6 0 % ( w Z v ) の濃度で添加し、 混合するこ とによって目的 とする融合細胞 （ハイプリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な 培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すこ と によりハイプリ ドーマの生育に好ま し く ない細胞融合剤等を除去で きる。

当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば H A T培養液 (ヒポキサンチ ン、 ア ミ ノ ブテ リ ンおよびチ ミ ジ ンを含む培養液） で培養することにより選択される。 当該 H A T培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するの に十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希 釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのス ク リ 一二ングおよびク ローニ ングが行われる。

また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイ プリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球、 例えば E Bウ ィ ルスに感染したヒ ト リ ンパ球 を i n v i t r oでガンキ リ ンポ リ ペプチ ド、 ガンキ リ ンポ リ ペプチ ド発 現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リ ンパ球をヒ ト由来の永久分 裂能を有する ミ エローマ細胞、 例えば U 2 6 6 と融合させ、 ガンキ リ ンポ リべプチ ドへの結合活性を有する所望のヒ ト抗体を産生する ハイプリ ドーマを得るこ と もできる （特開昭 63- 17688) 。

さ らに、 ヒ ト抗体遺伝子のレバ一 卜 リ ーを有する トラ ンスジェニ ッ ク動物に抗原となるガンキリ ンポ リ べプチ ド、 ガンキ リ ンポ リぺ プチ ド発現細胞又はその溶解物を免疫して抗ガンキリ ンポ リ べプチ ド抗体産生細胞を取得し、 これを ミ エロ一マ細胞と融合させたハイ プリ ドーマを用いてガンキリ ンポ リ べプチ ドに対する ヒ ト抗体を取 得してもよい （国際特許出願公開番号 W 0 9 2 — 0 3 9 1 8 、 W〇 9 3 - 2 2 2 7 、 W 0 9 4 - 0 2 6 0 2 . W 0 9 4 — 2 5 5 8 5 、 WO 9 6 — 3 3 7 3 5 および W 0 9 6 — 3 4 0 9 6参照） 。

このようにして作製されるモノ ク ロ ーナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養するこ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存する こ とが可能である。

当該ハイプリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に移植して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。

ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する 感作リ ンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子 （oncogene) により不死化さ せた細胞を用いてもよい。

このよ う に得られたモノ ク ローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技 術を用いて産生させた組換え型抗体と して得るこ とができる。 例え ば、 組換え型抗体は、 抗ガンキ リ ンポ リペプチ ド抗体遺伝子をハイ プリ ドーマ又は抗体を産生する感作リ ンパ球等の免疫細胞から ク ロ —ニ ングし、 適当なベクタ一に組み込んで、 これを宿主に導入し産 生させる。 本発明には、 この組換え型抗体を用いる こ とができる （ 例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by AC ILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照） 。

具体的には、 抗ガンキ リ ンポ リ ぺプチ ド抗体を産生するハイ ブリ ドーマから、 抗ガンキ リ ンポ リペプチ ド抗体の可変領域 （V領域） をコー ドする m R N Aを単離する。 m R N Aの単離は、 公知の方法 、 例えば、 グァニジ ン超遠心法（Chirgwin, J. . et al. , Biochem istry (1979) 18, 5294-5299) 、 A G P C法 （Chomczynsk i， P. an d Sacchi, N.， Anal. Biochem. ( 1987) 162， 156- 159) 等により全 R N Aを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用 し て全 R N Aから m R N Aを精製する。 また、 QuickPrep mRNA Purif ication Kit (Pharmacia) を用いるこ とにより m R N Aを直接調製 すること もできる。

得られた m R N Aから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の c D N A を合成する。 c D N Aの合成は、 AMV Reverse Transcriptase Fir st- strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業） 等を用いて行う こ と もできる。 また、 c D N Aの合成および増幅を行う には 5 ' - Ampl i FINDER RACE Kit (C 1 on t ech)およびポ リ メ ラーゼ連鎖反応 （poly me rase chain reaction ； P C R) を用いた 5 ' — R A C E法（Fro man, M. A. et al. , Pro atl. Acad. Sci. U. S. A. ( 1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. ( 1989) 17, 2919-2932) を使用することができる。

得られた P C R産物から目的とする D N A断片を調製し、 ベク タ — D N Aと連結する。 さ らに、 これより組換えベク ターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベク ターを調 製する。 目的とする D N Aの塩基配列を公知の方法、 例えば、 ジデ ォキシヌ ク レオチ ドチヱイ ン夕一 ミ ネ一シ ヨ ン法により確認する： 目的とする抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体の V領域をコー ドする D N Aが得られれば、 これを所望の抗体定常領域 （ C領域） をコ— ドする D N Aと連結し、 これを発現ベク ターへ組み込む。 又は、 抗 体の V領域をコー ドする D N Aを、 抗体 C領域の D N Aを既に含む 発現べク タ一に組み込んでもよい。 抗体 C領域と しては、 V領域と 同じ動物種由来の抗体 C領域を用いてもよいし、 V領域と異なる動 物種由来の抗体 C領域を用いてもよい。

本発明で使用される抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体を製造するに は、 抗体遺伝子を発現制御領域、 例えば、 ェンハ ンサー、 プロモー ターの制御のもとで発現するよう発現ベク ターに組み込む。 次に、 この発現べク タ一により宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させる 抗体遺伝子の発現は、 抗体の重鎖 （H鎖） 又は軽鎖 （ L鎖） をコ ー ドする D N Aを別々 に発現ベク ターに組み込んで宿主細胞を同時 形質転換させてもよいし、 あるいは H鎖および L鎖をコー ドする D N Aを単一の発現ベク ターに組み込んで、 宿主細胞を形質転換させ てもよい （国際特許出願公開番号 W〇 9 4 - 1 1 5 2 3参照） 。 本発明で使用される抗体は、 ガンキ リ ンポ リ ペプチ ドに結合する かぎり、 その抗体断片や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断 片と しては、 F a b、 F ( a b ' ) 2、 F v又は H鎖と L鎖の F v を適当なリ ンカ一で連結させたシングルチェイ ン F v ( s c F V ) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ぺプ シンで処理し抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコ — ドする遺伝子を構築し、 これを発現ベク ターに導入した後、 適当 な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, . S. et al.， J. Immunol . ( 1994) 152, 2968-2976 ； Better, M. and Horwi tz, A. H. , Met hods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra ， ， ethods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ； Lamoy i, E.， Met hods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al. , Me thods Enzymol. ( 1986) 121, 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9， 132- 137参照） 。

s c F vは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域を連結するこ とによ り得られる。 この s c F Vにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域はリ ン力一、 好ま し く は、 ペプチ ドリ ンカ一を介して連結される （Hus t on, J. S. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1988) 85, 5 879-5883) 。 s c F vにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、 上 記抗体と して記載されたもののいずれの由来であつてもよい。 V領 域を連結するべプチ ドリ ンカーと しては、 例えばァ ミ ノ酸 1 2 〜 1 9残基からなる任意の一本鎖べプチ ドが用いられる。

s c F Vをコー ドする D N Aは、 前記抗体の H鎖又は、 H鎖 V領 域をコー ドする D N A、 および L鎖又は、 L鎖 V領域をコー ドする D N Aを铸型と し、 それらの配列のう ちの所望のァ ミ ノ酸配列をコ 一 ドする D N A部分を、 その両端を規定するプライマ一対を用いて P C R法により増幅し、 次いで、 さ らにペプチ ドリ ンカ一部分をコ - ドする D N Aおよびその両端を各々 H鎖、 L鎖と連結されるよ う に規定するプライマー対を組み合わせて増幅するこ とにより得られ る。

— i s c F vをコー ドする D N Aが作製されれば、 それらを含有 する発現べク タ一、 および該発現べク タ一により形質転換された宿 主を常法に従って得る こ とができ、 また、 その宿主を用いて常法に 従って、 s c F vを得るこ とができる。

また、 抗体断片は、 一部の配列が変異、 置換、 欠失又は挿入を受 けた抗体断片であってよい。 これら抗体断片は、 前記と同様に して その遺伝子を取得し発現させ、 宿主により産生させるこ とができる 。 本願特許請求の範囲でいう 「抗体」 にはこれらの抗体断片も包含 される。

抗体修飾物と して、 ポ リエチレングリ コール （P E G) 等の各種 分子と結合した抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体を使用するこ と もで きる。 本願特許請求の範囲でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物 も包含される。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に 化学的な修飾を施すことによって得る こ とができる。 これらの方法 はこの分野において既に確立されている。

また、 本発明の抗ガンキ リ ンポリ ペプチ ド抗体は、 公知の技術を 使用 してキメ ラ抗体又はヒ ト型化抗体と して得るこ とができる。 前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得するこ とができる。 例えば、 本明細書に記載したガンキ リ ン ポリぺプチ ドの産生のためのプロモータ一 Zェンハンサ一を用いる こ とができる。

本発明の抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体の製造のために、 任意の 産生系を使用する こ とができ、 本明細書に記載したガンキ リ ンポ リ ペプチ ドの産生のための産生系を用いるこ とができる。 例えば、 抗 ガンキリ ンポ リ ペプチ ド抗体製造のための産生系は、 in V i t r 0およ び in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系と しては、 真核細胞 を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。 in vivoの産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物を使用する産 生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用い る産生系がある。

哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥ シ、 例え ばそれらの トラ ンスジヱニッ ク動物を用いるこ とができる（Glaser, V.， SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) 。 また、 昆虫 と しては、 カイ コを用いることができる。 さ らに、 植物を使用する 場合、 例えばタバコ、 例えばニコティ アナ タバカ ム（Ni co ana t abacum) を用いることができる（Ma， J. K. et al. , Eur. J. Immun ol. (1994) 24， 131-138) 。

これらの動物又は植物に上記のように抗体遺伝子を導入し、 動物 又は植物の体内で抗体を産生させ、 回収する。

上述のように in vitro又は in v i voの産生系にて抗体を産生する 場合、 抗体 H鎖又は L鎖をコー ドする D N Aを別々 に発現ベク ター に組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい。 あるいは H鎖およ び L鎖をコー ドする D N Aを単一の発現ベク ターに組み込んで、 宿 主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 WO 9 4 - 1 1 5 2 3参照） 。

前記のように発現、 産生された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製するこ とができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製は通常のタ ンパク質で使用されている分離、 精製方法を使 用すればよ く 、 何ら限定される ものではない。

例えば、 ァフ ィ 二ティ ーク ロマ ト グラフ ィ 一等のク ロマ ト グラフ ィ 一カ ラ ム、 フ ィ ルタ一、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDS ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせ れば、 抗体を分離、 精製するこ とができる（Antibodies ： A Labora tory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor し a boratory, 1988) 。

ァフ ィ 二ティ ー ク ロマ ト グラ フ ィ 一に用いる カ ラ ム と しては、 プ 口ティ ン Aカ ラ ム、 プロテイ ン Gカ ラ ムが挙げられる。 例えば、 プ 口ティ ン Aカ ラ ムを用いたカ ラ ム と して、 Hyper D, POROS, Sephar ose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。

ァフ ィ 二ティ 一ク ロマ ト グラフ ィ ー以外のク ロマ ト グラフ ィ ーと しては、 例えば、 イ オ ン交換ク ロマ ト グラフ ィ ー、 疎水性ク ロマ ト グラフ ィ 一、 ゲル濾過、 逆相ク ロマ トグラフ ィ ー、 吸着ク ロマ 卜 グ ラフ ィ ー カく挙けりれる (Strategies for Protein Purification a nd Characterization ： A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Mar shak e t al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 ) 。 これらのク ロマ トグラフ ィ ーは H P L C、 F P L C等の液相ク ロマ 卜グラフ ィ一を用いて行う こ とができる。

上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫 吸着検定 (Enzyme - 1 inked immunosorbent assay ； E L I S A ) により行う ことができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には 、 得られた抗体を P B Sで適当に希釈した後、 2 8 0 nmの吸光度を 測定し、 種およびサブク ラスにより吸光係数は異なるが、 ヒ ト抗体 の場合 1 mg/mlを 1 . 40Dと して算出する。

また、 E L I S Aによる場合は以下のよう に測定するこ とができ る。 すなわち、 0. 1 M重炭酸緩衝液 （pH9. 6 ) で 1 i g /mlに 希釈したャギ抗ヒ ト I g G抗体 1 0 0 1 を 9 6穴プレー ト （ N u n c ) に加え、 4 °Cで一晩イ ンキュベー シ ョ ン し、 抗体を固相化す る。 ブロ ッキングの後、 適宜希釈した本発明の抗体又は抗体を含む サンプル、 あるいは濃度標準品と して既知の濃度のヒ ト I g G 1 0 0 〃 1 を添加し、 室温にて 1 時間イ ンキュベー シ ョ ンする。

洗浄後、 5 0 0 0倍希釈したアルカ リ フ ォ スフ ァ タ一ゼ標識抗ヒ ト I g G抗体 1 0 0 〃 1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュベー トす る。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベー シ ョ ンの後、 MICR0PLATE READER Model 3 5 5 0 (Bio-Rad) を用いて 4 0 5 nmでの吸光度を 測定し、 目的の抗体の濃度を濃度標準ヒ ト I g Gの吸光度より算出 する。

また、 抗体の濃度測定には、 B I A c 0 r e (Pharmacia) を使用 することができる。 本発明の抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体の活性の評価は、 通常知 られた方法を使用することができる。 ガンキリ ンポ リべプチ ドを固 定したプレー 卜に ^{1 25} I標識抗ガンキ リ ンポ リべプチ ド抗体を添加 し、 公知の方法に従い洗浄して、 放射活性を測定するこ とにより、 抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体の活性を評価するこ とができる（An t i bod i es ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Col d Spring Harbor Laboratory, 1988) 。

また、 本発明で使用される抗ガンキ リ ンポ リペプチ ド抗体の抗原 結合活性を測定する方法と して、 E L I S A、 E I A (酵素免疫測 定法） 、 R I A (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いる こ とができる。

例えば、 E L I S Aを用いる場合、 抗ガンキ リ ンポ リ ペプチ ド抗 体を固相化したプレー 卜にガンキリ ンポ リべプチ ドを添加し、 次い で目的の抗ガンキリ ンポリペプチ ド抗体を含む試料、 例えば、 抗ガ ンキリ ンポ リぺプチ ド抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える 。 酵素、 例えばアルカ リ フ ォ スフ ァ ターゼ等で標識した抗ガンキリ ンポ リぺプチ ド抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレー トをイ ン キュベーシ ヨ ン、 洗浄した後、 p—二 ト ロフ ヱニル燐酸などの酵素 基質を加えて吸光度を測定するこ とで抗原結合活性を評価する こ と ができる。 ガンキリ ンポ リペプチ ドと してガンキリ ンポ リベプチ ド の断片、 例えばその C 末端からなる断片あるいは N 末端からなる断 片を使用 してもよい。 本発明の抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体の活 性評価には、 B I A c 0 r e (Pharmacia) を使用する こ とができる これらの手法を用いるこ とにより、 本発明の抗ガンキ リ ンポ リ べ プチ ド抗体と試料中に含まれるガンキリ ンポ リべプチ ドが含まれる と予想される試料とを接触せしめ、 前記抗体とガンキリ ンポ リ ぺプ チ ドとの免疫複合体を検出又は測定するこ とから成るガンキリ ンポ リベプチ ドの検出又は測定方法を実施する こ とができる。

具体的には、 例えば E L I S Aを用いる場合、 抗ガンキ リ ンポ リ ぺプチ ド抗体を固相化したプレー 卜にガンキリ ンポ リべプチ ドを含 む試料を添加し、 次いで抗ガンキリ ンポ リぺプチ ド抗体を加える。 酵素、 例えばアルカ リ フ ォ スフ ァ タ一ゼ等で標識した抗ガンキリ ンポリぺプチ ド抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレー トをイ ン キュベーシ ヨ ン、 洗浄した後、 p —ニ ト ロ フ ヱニル燐酸などの酵素 基質を加えて吸光度を測定するこ とで試料中のガンキリ ンポ リ ぺプ チ ドの存在を評価することができる。 ガンキリ ンポ リべプチ ドと し てガンキリ ンポ リペプチ ドの断片、 例えばその C 末端からなる断片 あるいは N' 末端からなる断片を使用 してもよい。 本発明の抗ガンキ リ ンポリべプチ ド抗体の活性評価には、 B I A c o r e (Pharmac i a ) を使用するこ とができる。

本発明のガンキリ ンポ リべプチ ドの検出又は測定方法は、 ガンキ リ ンポ リべプチ ドを特異的に検出又は測定するこ とができるため、 ガンキ リ ンポ リべプチ ドを用いた種々の実験等に有用である。

本発明には、 本発明の遺伝子と選択的にハイプリ ダイズし得るヌ ク レオチ ド （關 A 又は RNA ) 又はヌ ク レオチ ド誘導体、 例えばア ン チセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ド、 リ ポザィム等が含まれる。 本発明は 例えば、 配列番号 ： 1 に示される塩基配列中のいずれかの箇所にハ イブリ ダイズするアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドを含む。 このァ ンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドは、 好ま し く は配列番号 ： 1 に示さ れる塩基配列中の連続する少な く と も 2 0個以上のヌ ク レオチ ドに 対するアンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ドである。 さ らに好ま し く は 、 前記連続する少な く と も 2 0個以上のヌ ク レオチ ドが翻訳開始コ ドンを含む、 前記のアンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドである。 例え ば、 本発明のアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドは、 配列番号 ： 8 を 有するものである。 また例えば、 本発明のアンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドは、 配列番号 ： 9 を有する ものである。

ここでいう 「アンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ド」 とは、 DNA 又は mRNAの所定の領域を構成するヌ ク レオチ ドに対応するヌ ク レオチ ド が全て相補的である もののみならず、 DNA 又は mRNAとオ リ ゴヌ ク レ ォチ ドとが配列番号 ： 1 に示される塩基配列に選択的に安定にハイ ブリ ダィズできる限り、 1 又は複数個のヌ ク レオチ ドの ミ スマ ッチ が存在していてもよい。 選択的に安定にハィブリ ダイズするとは、 少なく と も 20個、 好ま し く は 30個の連続したヌ ク レオチ ド配列領域 で、 少なく と も 70 % 、 好ま し く は少な く と も 80 % 、 より好ま し く は 90 ¾ 、 さ らに好ま し く は 95 % 以上の塩基配列上の相同性を有する も のを示す。

本発明の 1 つの態様によれば、 アンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ド は配列番号 ： 8 に示される塩基配列を有する。 また、 本発明の 1 つ の態様によれば、 アンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドは配列番号 ： 9 に示される塩基配列を有する。

本発明において使用されるオ リ ゴヌ ク レオチ ド誘導体がデォキシ リ ボヌ ク レオチ ドの場合、 各々の構造は式 I に示したとおりである

式 （ I )

ここで、 X は独立して酸素 （◦ ) 、 ィォゥ （ S ) 、 低級アルキル 基あるいは一級ア ミ ン又は二級ア ミ ンのいずれであってもよい。 Y は独立して酸素 （0 ) あるいはィォゥ （S ) のいずれでもよい。 B はアデニ ン、 グァニ ン、 チ ミ ン、 あるいはシ ト シ ンのいずれかから 選ばれ、 主と してヒ トガンキリ ン遺伝子の DNA 又は mRNAの相捕的ォ リ ゴヌ ク レオチ ドである。 R は独立して水素 （ H ) 又はジメ トキシ ト リ チル基あるいは低級アルキル基である。 n は 7 - 28である。

好ま しいオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体と しては、 修飾されていない オリ ゴヌ ク レオチ ドだけではな く 、 下に示すごと く 、 修飾されたォ リ ゴヌ ク レオチ ドでもよい。 このよう な修飾体と して、 例えばメ チ ルホスホネー ト型又はェチルホスホネ一 卜型のような低級アルキル ホスホネー ト修飾体、 ホスホロチォェ一 卜修飾体又はホスホ口 ァ デー ト修飾体等が挙げられる。

I

0

I

X— P=Y の例

I

0

メ チルホスホネ一 ト CH₃— Ρ=0

ホスホロチォエー ト S—— =0

ホスホロ ジチォエー ト S——

ホスホロア ミ デー ト リ ン酸 ト リ エステル CH₃0— Ρ = 0

(式 II) これらのオリ ゴヌ ク レオチ ド修飾体は、 次の通り常法により得る ことができる。 化 1 の X 及び Y が 0 であるオリ ゴヌ ク レオチ ドは巿 販の DNA 合成装置、 例えば Appl ied B i osy s t ems製によって容易に合 成される。 合成方法はホスホロア ミ ダイ トを用いた固相合成法、 ノ、 ィ ドロ ジヱ ンホスホネー トを用いた固相合成法等で得る ことができ る (Atkinson, T. & Smith, M. in Ol igonucleotide Synthesis: A

Practical Approach, ed. Gai t, . J. IRL Press, 35-81 (1984) 、 Caruthers, . H. Science ( 1985) 230, 281、 Kume, A. et al. ,

J. Org. Chem. (1984) 49, 2139、 Froehler, B. C. et al. , Tetr ahedron Lett. (1986) 27, 469、 Garegg, P. J. et al. , ibid (19 86) 27, 4051、 Sproat, B. S. et al. , in Ol igonucleotide Synth esis: A Practical Approach, ed. Gai t, M. J. IRL Press, 83-11 5 (1984)、 Beaucage, S. L. & Caruthers, M. H. Tetrahedron Let t. (1981) 22, 1859-1862 、 Matteucci, M. D. & Caruthers, . H . Tetrahedron Lett. (1980) 21, 719 - 722、 Matteucci, M. D. & C aruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc (1981) 103, 3185-3191 ) 。

X が低級アルコキシ基である リ ン酸 ト リ エステル修飾体は、 常法 、 例えば化学合成で得られたオ リ ゴヌ ク レオチ ドを 卜 シルク 口 リ ド の DMF/メ タノ ール /2， 6- ルチジン溶液で処理するこ とにより得る こ と力くできる （Moody, H. M. et al. , Nuclein Acids Res. (1989) 1 7, 4769-4782) 。

X がアルキル基であるアルキルホスホネー ト修飾体は、 常法、 例 えばホスホア ミ ダイ トを用いて得るこ とができる （Dorman, . A. et al. , Tetrahedron Lett. (1984) 40， 95-102 、 Agarwal, K. L.

& Rif tina, F. Nucleic Acids Res. (1979) 6， 3009-3024 ) 。

X が S であるホスホロチォェ一 ト修飾体は、 常法、 例えばィォゥ を用いた固相合成法 （Stein, C. A. et al. , ucleic Acids Resea rch (1988) 16, 3209- 3221) あるいはテ 卜ラエチルチウラム ジス ノレフ ィ ドを用いて、 固相合成法により得ることができる （Vu, H. & Hirschbein, B. L. Tetrahedron Lett. (1991) 32, 3005-3008 )

X 、 Y が共に S であるホスホロ ジチォエー ト修飾体は、 例えばビ スア ミ ダイ トをチォア ミ ダイ 卜に変換し、 ィォゥを作用させる こ と により固相合成法により得るこ とができる （Bri ll, W. K-D. J. Am . Che. So (1989) 111, 2321-2322 ) 。

X がー級ァ ミ ンあるいは二級ァ ミ ンであるホスホロァ ミ デ一 ト修 飾体は、 例えばハィ ドロ ジニ ンホスホネー トを一級あるいは二級ァ ミ ンで処理することにより固相合成法により得るこ とができる （Fr oehler, B. et al. , Nucleic Acids Res. ( 1988) 16, 4831 -4839) 。 あるいは、 ア ミ ダイ トを ter t- ブチルハイ ドロパーォキサイ ドで 酸化しても得るこ とができる （Ozaki, H. et al. , Tetrahedron し e tt. (1989) 30, 5899-5902) 。

精製及び純度確認は、 高速液体ク ロマ ト グラフ ィ ー、 ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動で行う こ とができる。 分子量の確認は、 Elec trospray Ionization Mass Spectrometry 又は Fast Atom Bonbar dm ent-Mass Spectrometry で行う ことができる。 本発明のアンチセン スオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体はヒ トガンキリ ンポ リ ペプチ ドをコ一 ドする DNA 又は mRNAの塩基配列にハイブリ ダィズする配列を有する ものであつれば、 その合成法や由来はいずれでもよい。

本発明のア ンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は、 後述の実施 例 7 に示す通り ヒ トガンキリ ンポ リべプチ ドの産生細胞に作用 して 、 ヒ トガンキリ ンポ リべプチ ドをコ一 ドする DNA 又は mRNAに結合す るこ とにより、 その転写又は翻訳を阻害したり、 mRNA の分解を促 進したり して、 ヒ トガンキリ ンポ リべプチ ドの発現を抑制する こ と により、 結果的にヒ トガンキリ ンポ リぺプチ ドの作用を抑制する効 果を有する。 本発明のアンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ド誘導体によ り抑制される ヒ トガンキ リ ンポ リ ペプチ ドの作用と しては、 後述の 実施例 7 に記載される細胞の軟寒天中でのコ ロニ一形成能の抑制が 挙げられる。

本発明のアンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は、 それらに対 して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤等の外用剤と することができる。

また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤 、 防腐剤、 無痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 顆粒剤、 カプセル剤、 リ ボソームカプセル剤、 注射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さ らに凍結乾 燥剤とすることができる。 これらは常法に したがって調製するこ と ができ る。

本発明のアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体は患者の患部に 直接適用するか、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到 達し得るように患者に適用する。 さ らには、 持続性、 膜透過性を高 めるア ンチセ ンス封入素材を用いる こ と もできる。 例えば、 リ ポソ ーム、 ポ リ -し- リ ジ ン、 リ ピ ッ ド、 コ レステロール、 リ ボフ ヱ ク チ ン又はこれらの誘導体が挙げられる。

本発明のアンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体の投与量は、 患 者の状態に応じて適宜調整し、 好ま しい量を用いるこ とができる。 例えば、 0. 1 〜 1 00 m g/ k g好ま し く は 0. 1 〜50 m g / k g の範囲で投与す るこ とができる。

本発明のア ンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドはガンキ リ ンポ リ ぺプ チ ドの発現を阻害し、 したがってガンキリ ンポ リ べプチ ドの生物学 的活性を抑制することにおいて有用である。 また、 本発明のア ンチ センスオリ ゴヌ ク レオチ ドを含有するガンキリ ンポ リべプチ ドの発 現阻害剤は、 ガンキ リ ンの生物学的活性、 すなわち癌原性を抑制す ることができ、 癌や過増殖性疾患の治療剤と して有用である。

実施例

次に、 本発明を実施例により さ らに具体的に説明する。

実施例 1 . サブ トラ ク シ ョ ン法による c D N Aのク ローニング サブ トラ ク シ ヨ ン法 ( Nakayama, H. e t al. , Develop. Growth D i f fer. ( 1996) 38, 141-151) を用いて、 肝癌に特異的に発現する遺伝 子の c D N Aをク ローニングした。

5 5歳男性の手術標本から原発性肝癌取扱い規約 （日本肝癌研究 会編） に規定されるステー ジ 3 の肝癌組織と正常肝組織とを採取し た。 各々の組織から T R I s 0 1 試薬 （GIBCO BRL 製） を使用 して 全 R N Aを抽出 した。 この全 R N Aから c D N A合成キッ 卜 （Phar macia 製） を使用 して o 1 i g o — d Tプライマーで二本鎖 c D Aを合成した。 ついで、 この c D N Aを制限酵素 R s a I で消化 後、 リ ンカ一アダプタ— (Nakayama, H. et al. , Develop. Growth D i f fer. (1996) 38, 141-151) を付加し、 P C R法によりプライマ一 (Nakayama, H. et al. , Develop. Growth Differ. (1996) 38, 141 -1 51) を用いてこれらの c D N Aを増幅した。 なお、 正常肝組織由来 の c D N Aを PCR 法で増幅する際、 末端をピオチ ンで標識したブラ イマ一を用いた。

過剰量の正常肝組織由来の二本鎖 c D N Aを、 少量の肝癌組織由 来二本鎖 c D N Aに混ぜて、 熱変性で一本鎖にした後に、 二本鎖へ ァニ一 リ ングした。 肝癌組織由来 c D N Aのう ち正常肝組織にも発 現していたものは、 そのほとんどが大量に混在する正常肝由来の対 応する c D N Aと二本鎖を形成し、 ピオチン標識を持つよ う になる 。 しかし肝癌組織に特異的な分子は、 肝癌組織由来の c D N A同士 で二本鎖を形成しピオチ ン標識を持たない。 そ こでピオチ ン標識を 持つ c D N A二本鎖を除去し、 肝癌組織に特異的な c D N A分子を 濃縮した。

濃縮した肝癌組織に特異的な c D N A分子を P C R法を用いて増 幅し、 同様の操作を繰り返して計 5 回濃縮を行った。 こ う して、 ヒ ト肝臓組織由来の肝癌組織に特異的な 2 5 0 bpの c D N A断片を得 た。 全長 c D N Aを単離するため、 ヒ トの胎盤、 マウス N I H / 3 T 3細胞系、 及びラ ッ 卜の胎盤から常法にしたがい c D N Aライブ ラ リ ーを作製し、 λ Ζ Α Ρ Ι Ιフ ァ ージべク タ一 （Strategene製） に 連結した。 上記の 2 5 0 bpのヒ ト c D N A断片をプローブと して用 いて、 高ス ト リ ンジヱ ン ト条件下に前記ヒ ト胎盤 c D N Aライブラ リ ーをスク リ ーニングした。

すなわち、 ハイブリ ダィゼ一シ ヨ ン溶液 （ 5 X S S P E、 5 0 % ホルムア ミ ド、 5 x D e n h a r d t ' s溶液、 0 . 5 % S D S、 1 0 0 gZml変性 D N A、 1 0 %硫酸デキス トラ ン） 中で、 4 2 °Cでハイブリ ダィズさせ、 次いで 0 . 1 X S S C、 1 . 0 % S D S 、 6 5 °Cの条件で洗浄した （Sambrook, J. et al. , olecular Clon i ng, Cold Spring Harbour Laboratory Press ( 1989)) ₀ その結果 、 678b の ORF を含む 1542bpの ヒ ト cDNAを得た。

この cDNA中の 6 7 8 bpの 0RF を P C R増幅し、 これをプローブと して、 低ス ト リ ンジヱ ン ト条件下にラ ッ ト胎盤及びマウ ス N I H / 3 T 3細胞系の c D N Aライブラ リ ーをスク リ ーニングした。 すな わち、 ハイブリ ダィ ゼ一シ ヨ ン溶液 （ 5 X S S P E、 5 0 %ホルム ア ミ ド、 5 x D e n h a r d t ' s溶液、 0 . 5 % S D S、 1 0 0 〃 g Z ml変性 D N A、 1 0 %硫酸デキス ト ラ ン） 中で 3 7 °Cにてハ イブリ ダィズさせ、 次いで 1 X S S C、 1 . 0 % S D S 3 7 °Cの 条件で洗浄した (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)) ₀ その結果、 ラ ッ ト及びマウス由来の c D N Aを単離した。 これら の c D N Aの塩基配列を常法により決定し、 それらの塩基配列から ァ ミ ノ酸配列を決定した。 ヒ ト、 ラ ッ ト、 マウスの推定ァ ミ ノ酸配 列を 1 文字標記により記載して比較した結果を次の表 1 に示す。 こ のア ミ ノ酸配列を有するポ リべプチ ドをガンキリ ン （ganky r i n ) と 命名した。 ヒ トガンキ リ ン遺伝子とマウ スガンキ リ ン遺伝子は塩基 配列レベルで 9 0 %の相同性を有し、 ア ミ ノ酸配列レベルで 9 3 % の相同性を有していた。 また、 ヒ トガンキ リ ン遺伝子とラ ッ トガン キ リ ン遺伝子は、 塩基配列レベルで 9 1 %の相同性を有し、 ァ ミ ノ 酸配列レベルで 9 4 %の相同性を有していた。

¾ L

ヒ ト MEGCVSNLMVCNLAYSGKLEELKES I LADKSLATRTDQDSRTALHWACSAGHTE I VEFLL マウス MEGCVSN IM I CNLAYSGKLDELKER I LADKSLATRTDQDSRTALHWACSAGHTE I VEFLL ラッ ト MEGCVSNLMVCNLAYNGKLDELKES I LADKSLATRTDQDSRTALHWACSAGHTE I VEFLL ヒ ト QLGVPVNDKDDAGWSPLH I AASAGRDE I VKALLGKGAQVNAVNQNGCTPLHYAASKNRHE マウス QLGVPVNDKDDAGWSPLH I AASAGRDE I VKALLVKGAHVNSVNQNGCTPLHYAASKNRHE ラッ ト QLGVPVNEKDDAGWSPLHIAASAGRDEIVKALLIKGAQVNAVNQNGCTALHYAASKNRHE ヒ ト I AVMLLEGGANPDAKDHYEATAMHRAAAKGNLKM I H I LLYYKASTN I QDTEGNTPLHLAC マウス 1 SVMLLEGGANPDAKDHYDATAMHRAAAKGNLKMVH I LLFYKAST I QDTEGNTPLHLAC ラッ ト 1AVMLLEGGANPDAKNHYDATAMHRAAAKGNLKMVH 1LLFYKASYN I QDTEGNTPLHLAC ヒ ト DEERVEEAKLLVSQGAS IYI ENKEEKTPLQVAKGGLGL I LKRMVEG (配列番号： 2) マウス DEERVEEAKFLVTQGAS I YI ENKEEKTPLQVAKGGLGULKRLAESEEASM (配列番号： 3) ラッ ト DEERVEEAKLLVTQGAS IYIENKEEKTPLQVAKGGLGULKR IVESEEASM (配列番号： 4) なお、 ヒ トガンキリ ンの塩基配列を配列番号 ： 1 に、 ア ミ ノ酸配 列を配列番号 ： 2 に示す。 マウ スガンキ リ ンの塩基配列を配列番号

： 3 に、 ア ミ ノ酸配列を配列番号 ： 4 に示す。 ラ ッ トガンキリ ンの 塩基配列を配列番号 ： 5 に、 ア ミ ノ酸配列を配列番号 ： 6 に示す _c なお、 ガンキリ ンのア ミ ノ酸配列において 1 位のア ミ ノ酸 M e t か ら 1 3位のァ ミ ノ酸 L e uまではシグナル配列であるこ とが推測さ れた。

得られたヒ トガンキリ ンポ リ べプチ ドのア ミ ノ酸配列は 5 . 5個 のア ンキ リ ン リ ピー 卜 （ankyrin repeat) (Lambert, S. et al. , Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, (1990) 87, 1730- 1734)を有していた。 この 様子を次の表 2 に示す。

表 2

ANK consensus G TPLHLAAR GHVEVVKLしし D GADVNA TK

A I SQ NNLDIAEV K NPD D

V K T M R Q SI N

E

1st repeat DSRTALHWACSAGHTEIVEFLLQLGVPVNDKDD

2n t repeat AGWSPLHIAASAGRDEIVKALLGKGAQVNAVNQ

3rd repeat NGCTPLHYAASKNRHEIAV LLEGGANPDAKDH

4th repeat YEATAMHRAAAKGNLKMIHILLYYKASTN1QDT

5th repeat EGNTPLHLACDEERVEEAKLLVSQGASIYIENK

6th repeat EEKTPLQVAKGGLGLILKRMVEG この表において、 上の 3 行は典型的なア ンキリ ンの配列を示し、 下の 6行は本発明のガンキリ ンポ リ べプチ ドのァ ミ ノ酸配列中のァ ンキリ ン リ ピー トを示す。 また、 図 1 5 には、 種々の蛋白質中のアンキリ ン リ ピー トの存在 位置及びリ ピー ト数を示す。

ガンキ リ ン遺伝子の染色体上の位置を決定するため、 蛍光 i n si t u ノヽイブ'リ タイセ'ーシ ヨ ン ( in si tu hybridization ) を ί亍った。 すなわち、 ヒ トの血液から単離したリ ンパ球を、 1 0 %ゥ シ胎児血 清及びフ ィ 卜へマグルチニン （ P H A ) を補充した最少必須培地 （ M E M) 中で 3 7 °Cにて 6 8 〜 7 2 時間培養した。 この リ ンパ球培 養物を 0 . 1 8 mgZmlの B r d U (Sigma 製） で処理することによ り細胞集団の細胞周期を同調させた。 細胞周期を同調させた細胞を 無血清培地で 3 回洗浄した。 細胞周期の停止を解除し、 2 . 5 g /mlのチ ミ ジン （Sigma 製） を含有する M E M中で 3 7 °Cにて 6 時 間再培養した。 細胞を集め、 そ して低張圧処理、 固定及び空気乾燥 を含む標準的方法を用いて染色体標本スライ ドを作製した。

約 8 . 0 kbのガンキ リ ン遺伝子揷入部を有するフ ァ ー ジ D N A ( Sambrook, J. e t al . , Moleculor Cloning 前出) を、 BRL BioNick ラベルキッ トを用い、 指示書にしたがって d A T P及びピオチン一 1 6 — d C T P によ り 1 5 °Cにて 1 時間ニ ッ ク ト ラ ンス レー シ ョ ン を行う ことにより ビォチン標識した （Herg et al. , Pro atl. A cad. Sci. USA, 89 ： 9509-9513 (1992)) 。

これをプローブと して用いて、 蛍光ィ ン · サイチュー · ハイプリ ダイゼ一 シ ヨ ン (Fluorescence in si tu hybridization ； F I S H ) を行った （Herg et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 ： 95 09-9531 (1992) ； Herg et al. , Chromosoma, 102 ： 325-332 (199 3)) 。

すなわち、 まずスライ ドを 5 5 °Cにて 1 時間処理し染色体をスラ ィ ドグラ スに固着させた。 R N a s e処理の後、 スラ イ ドを 2 x S S C中 7 0 %ホルムア ミ ドにより 7 0 °Cにて 2分間変性し、 次にェ タノ ールにより脱水した。 5 0 %ホルムア ミ ド、 1 0 %硫酸デキス トラ ン及びヒ ト co t I D N Aを含むハイブリ ダィゼーシ ヨ ン混合物 中で 7 5 °Cにて 5分間、 プローブを変性した。 反復配列を抑制する ために 3 7 °Cにて 1 5分間イ ンキュベー ト した後、 前記の変性処理 したスライ ド上に前記のプローブを添加した。 一夜ハイプリ ダィゼ —シ ヨ ンを行った後、 スライ ドを 2 X S S C中 5 0 %ホルムア ミ ド により 3 7 °Cにて洗浄し、 さ らに 1 X S S C中で 6 0 °Cにて洗浄し た。

蛍光標識 F I T C—結合ア ビジ ン（Vector Labora t or i es製） によ り ピオチンを検出した後、 D N Aを染色する蛍光試薬である D A P I (Sigma 製） を用いて染色し、 染色体上に G / Q—バン ドパター ンを生じさせた。 この方法を用いるこ とにより、 DNA を染色する蛍 光試薬で染色体に特有な濃淡バン ドパターンを作成するこ とができ 、 染色体の帰属と染色体地図 （位置） の作成が可能となる。

微弱な光を検出可能な TVカメ ラである冷却 CCD カメ ラ（coo led ch arge-coupl ed device カメ ラ ) (Photometries 製） を用いて 2 1 の metaphase (分裂期） 像を写真にと った。 F I S Hシグナルと D A P I バン ド形成染色体とを重ねる こ とにより、 F I S Hマップデー 夕を染色体バン ドに帰属させた （Hery et al. , Methods in Molecu 1 ar Biology ： I n situ hybridization protocols (K. H. A Choo. ed), p.35-49 (1994), Human Press, CI if ton, NJ. ) 。

使用 した条件下で、 このプローブについて、 ハイブリ ダィ ゼー シ ヨ ン効率は約 8 1 %であった。 すなわち、 検査して 1 0 0個の分裂 図 （mitotic figure) 中 8 0個が 1 対の染色体上にシグナルを示し た。 特定の染色体を同定するために D A P I バン ド形成を用いたの で、 プローブからのシグナルは X 染色体の長腕 （long arm) に帰属 された。 さ らに、 1 0枚の写真をま とめるこ とにより詳細な位置決 定を行った。 結果を図 1 に示す。 使用 した条件下で F I S H検出に より検出されるその他の遺伝子座は存在しなかったので、 プローブ T 4 一 1 1 は染色体 X領域 q 2 1 . 3 — q 2 2. 2 に位置付けられ た。

得られた i n situ ハイブリ ダィゼー シ ヨ ンの結果 （蛍光染色） を 図 2 に示す。

実施例 2. ガンキリ ン遺伝子の組織発現レベルの検討

ガンキリ ン遺伝子の発現を調べるため、 種々の組織及び細胞を T R I z o 1 試薬（GIBCO BRL製） 中でホモジナイズした。 全 R N A ( 2 0 / g ) を変性し、 そ して 2. 2 Mホルムアルデヒ ドを含有する 1 . 0 %のァガロースゲル中での電気泳動により分離した。

ゲルを H y b o n d N+ ナイ ロ ン膜 （ Amersham製） にブロ ッ ト し 、 そして迅速ハイブリ ダィゼ一シ ヨ ン緩衝液 （Rapid-hyb buffer, Amersham製） 中で 2 時間、 〔 a— ³² P〕 d C T P— ラベル c D N A 断片 （ 2 5 0 bpの ヒ トガンキ リ ン c D N A ) にハイ ブ リ ダィ ズさせ た。 ハイブリ ダィゼ一シ ヨ ンの後、 0 . 1 X S S C及び 0 . 1 % S D Sを含む洗浄緩衝液中 6 5 °Cにて 3 0分間からなるス ト リ ン ジ ェ ン ト条件下でフ ィ ルターを洗浄し、 そ して次に一 8 0 °Cにてフ ィ ル ムに露出 した。 フ ィ ルタ一を細長く切り、 そ して内部標準と しての 1 8 S r R N A用のプローブと再度ハイプリ ダイズさせた。 ォー トラ ジオグラムを走査デン シ ト メ ーター （ア ト一社製） により定量 するこ とにより R N Aの発現レベルを評価した。

肝癌組織 （T) 及び肝非癌組織 （N) からのサ ンプルの結果を図 3 に示す- 下方は内部標準の結果を示し、 上方はヒ トガンキ リ ン c D N Aプローブにより検出 した結果を示す。 ガンキリ ン m R N Aは 肝癌組織のみで過剰発現しているこ とが示された。

肝臓以外のヒ 卜癌組織についての結果 （陽性数 7被験数） を下に 示す,

R C C (腎細胞癌） 0 2 0

精巣癌 0 5

卵巣癌 0 5

4 4

上記の結果、 被験癌組織中、 胃癌の組織にも、 ガンキ リ ン m R N Aが過剰発現されていた。

種々の細胞系、 すなわち、 ヒ ト細胞系 H e p G 2 (レー ン 1 ) 、 H e 1 a (レー ン 2 ) 、 K 5 6 2 ( レー ン 3 ) 、 N C 6 5 ( レー ン 4 ) 、 N E C 8 ( レー ン 5 ) 、 T 2 4 (レー ン 6 ) 、 及び I MR 9 0 ( レー ン 7 ) の結果を図 4 に示す。 幾つかの細胞系においてガン キリ ン mR N Aは発現されていた。

種々のヒ ト正常組織、 すなわち、 肝臓 （レー ン 1 ) 、 脾細胞 （レ — ン 2 ) 、 膊臓 （レー ン 3 ) 、 心臓 （ レー ン 4 ) 、 副腎 （ レー ン 5 ) 、 甲状腺 （レー ン 6 ) 、 胎盤 （ レー ン 7 ) 、 卵巣 （ レー ン 8 ) 、 睾丸 （レー ン 9 ) 、 腎臓 （ レー ン 1 0 ) 、 及び肺 （ レー ン 1 1 ) の 結果を図 5 に示す。 図 5 に示す通り、 ヒ 卜正常組織でのガンキ リ ン m R N Aの発現はわずかであった。

以上の結果、 癌組織におけるガンキリ ン m R N Aの特異的な高発 現が確認された。

実施例 3. ガンキリ ンポ リべプチ ドに対する抗体の調製及び免疫 組織化学的分析

抗ガンキリ ンポ リ べプチ ド抗体の調製のため、 ガンキ リ ンの C一 末端領域に対応するぺプチ ド Meい Glu- Gly- Cys- Val-Ser- Asn- Leu- Me t-Val-Cys-Asn-Leu-Ala-Tyr (配列番号 ： 7 ) を合成した。 このべ プチ ドをキーホールリ ンぺッ 卜へモ シァニ ンに連結し、 そ してゥサ ギに免疫感作した。 免疫感作から 1 4 、 4 2及び 5 6 日後に再度ゥ サギを免疫感作し、 抗血清を得た。

得られた抗血清を固相化した上記ペプチ ドを用いてァフ ィ 二ティ

—精製し、 ポ リ ク ローナル抗体を得た （Fmoc Chemistry, Research Gevetic I nc. )。 本抗体のガンキ リ ンポ リペプチ ドに対する反応性 ' 特異性は、 ウェスタ ンブロ ッ ト解析により確認した。 すなわち、 ガンキ リ ン遺伝子発現プラ ス ミ ドを T N T発現系 （Promega 製） に 加え翻訳生成物 （ガンキリ ンポ リ ぺプチ ド） を得た。 この際、 [³⁵ S ] メ チォニンを系に添加するこ とにより 〔³⁵ S〕 メ チォニ ン標識 ヒ トガンキリ ンポ リペプチ ドを合成した。 同 じ条件を用いて非標識 ガンキリ ンポリべプチ ドも合成した。

： ³⁵ S ] メ チォニン標識および非標識ヒ トガンキ リ ンポ リべプチ ドを SDS ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （条件は後述） し、 非標 識体の泳動パターンをウェスタ ンブロ ッ ト法にて解析した。 すなわ ち、 非標識体泳動ゲルをィ モ ビロ ン転写膜 （Immobilon transfer m embrane) (Mil 1 ipore製） に転写し、 5 %ゥ シ血清アルブ ミ ン （ B S A ) を含有する T r i s緩衝液中でブロ ッ ク した。 次に、 上記プロ ッテ ィ ング膜を T r i s緩衝液、 0 . 1 % T w e e n — 2 0 及び B S A中に 1 ： 2 0 0 0 〜 1 ： 1 0 0 0 0 に希釈した本ポ リ ク ロ一 ナル抗体と 4 °Cにて 1 6 時間イ ンキュベー ト した。

ブロ ッテイ ング膜を、 T r i s緩衝液、 0. 1 % T w e e n - 2 0 中で室温にて繰り返し洗浄した。 そ して、 二次抗体と してのホ ースラディ ッ シュパーォキシダ一ゼ標識した抗ゥサギィムノ グロブ リ ン抗体と共に室温にて 1 時間ィ ンキュベ一 ト した。 これを洗浄の 後、 電気化学発光試薬 （Amersham製） により発色せしめた。

一方、 標識体泳動ゲルについてはォ一 ト ラ ジオグラフ ィ ーにより 、 ガンキ リ ンポ リペプチ ドの泳動位置を確認した。 その結果、 標識 体のォー トラ ジオグラフ ィ ーバン ドに一致して、 非標識体のウェス タ ンブロ ッ 卜のバン ドが得られ、 本ポ リ ク ロ一ナル抗体がガンキ リ ン遺伝子産物を認識することが示された。

また、 同時に行った、 铸型 DNA を含まない TNT 発現系やルンフ エ ラ一ゼ cDNA発現産物の本ポリ ク 口一ナル抗体を用いたゥエスタ ンブ ロ ッ ト解析ではこのような特異的なバン ドは得られなかったこ と力、 ら、 本ポ リ ク ローナル抗体のガンキ リ ンポ リべプチ ドに対する特異 性が確認された。 図 8 の Aに、 イ ンビ ト ロ翻訳された標識ガンキ リ ン遺伝子生成物の結果を示す。 铸型 （一） （レー ン 1 ) 、 陽性対照 (〜 6 0 kDa に相当するルシフ ヱ ラーゼ c D N A ) ( レー ン 2 ) 、 ガンキ リ ン （レー ン 3 ) 。 イ ン ビ ト ロで翻訳されたガンキ リ ン遺伝 子産物 （未標識） を抗ガンキリ ンポ リ ペプチ ド抗体を用いるウェス タ ンブロ ッ トにより分析した結果を図 8 の Bに示す。 各レーンは、 铸型 （一） （レー ン 1 ) 、 陽性対照 （〜 6 0 kDa に相当するルシフ エ ラーゼ c D N A) (レー ン 2 ) 、 ガンキ リ ン （レー ン 3 ) を示す

3人の肝癌患者の肝非癌組織 （N) 及び肝癌組織 （T) の溶解物 中のガンキリ ンポ リ べプチ ドを上記と同様にァフ ィ 二テ ィ ー精製し た抗ガンキリ ンポ リべプチ ド抗体を用いてウエス タ ンプロ ッ 卜法に て検出 した結果を図 6 に示す。 実施例 2 で示した mRNAレベルと同様 、 非癌部肝臓に比し、 肝癌組織中により多く のガンキ リ ンポ リ ぺプ チ ドが検出された。

ヒ ト細胞系、 すなわち H e p G 2 ( A T C Cカタロ グ 1994 (Amer ican Type Cul ture Collection)) ( レー ン 1 ) 、 H e L a ( A T C Cカタログ 1994 (American Type Cul ture Collection)) (レー ン 2 ) 、 T 2 4 ( A T C Cカタログ 1994 (American Type Cul ture Col 1 ecti on)) (レー ン 3 ) 、 N C 6 5 (Hoehn, W. and Schroeder, F. H. , Invest. Urol. ( 1978) 16， 106) ( レー ン 4 ) 、 N E C 8 ( ヒ ユー マ ンサイエンス研究資源バンク、 細胞 . 遺伝子カタ ログ第 2版、 平 成 7 ( 1 9 9 5 ) 年） （レー ン 5 ) 、 J u r k a t (A T C Cカ タ ログ 1994 (American Type Culture Col lection)) (レー ン 6 ) 、 2 9 3 (A T C Cカタログ 1994 (American Type Culture Collection )) (レー ン 7 ) 及び C〇 S — 7 ( A T C Cカ タ ログ 1994 (American Type Culture Collection)) (レーン 8 ) の全細胞溶解物のガンキ リ ンポ リペプチ ドを、 上記と同様にァフ ィ 二ティ 一精製した抗ガン キリ ンポリペプチ ド抗体を用いてウェスタ ンブロ ッ ト法で検出 した 結果を図 7 に示す。 その結果、 全ての株化細胞においてガンキリ ン ポリべプチ ドの発現が確認された。

全細胞抽出物及び組織抽出物を、 5 0 mM T r i s — H C 1 、 pH 7 . 4 、 4 0 0 mM N a C 1 % S D S、 I % Tri ton X - 1 0 0 、 1 %デォキシコール酸、 5 mM E D T Aからなる放射性同位元 素標識免疫沈降法用の改変緩衝液中で溶解した 3 〜 5 X I 0 ⁶ 個の 細胞から調製し、 そ して次に短時間超音波処理して D N Aを剪断し た。 すべての抽出液に、 使用直前に 1 5 mM 5—グリ セロールホス フ ェー ト、 2 mMピロ リ ン酸ナ ト リ ウム、 1 mM N a ₃ V 0 , 力ヽらな るホスフ ァ ターゼ阻害剤及びァプロチニン、 ロイぺプチン及びフ エ ニルメ チルスルホニルフルォ リ ドからなるプロテアーゼ阻害剤を添 加した。

サンプルを S D S —ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （ P A G E ) により分離し、 そ して S D S — P A G Eに用いたゲルをィモビ口 ン 写 ( I mmob i 1 on transfer membrane) (Mi U i pore製リ に 写し 、 そ して 5 %ゥ シ血清アルブミ ン （ B S A) を含有する T r i s緩 衝液中でブロ ッ ク した。 次に、 上記ブロ ッテイ ング膜を T r i s緩 衝液、 0. 1 % T w e e n — 2 0及び B S A中に 1 : 2 0 0 0 〜

1 : 1 0 0 0 0 に希釈した上記一次抗血清又は抗体と 4 °Cにて 1 6 時間又は室温にて 1 時間イ ンキュベー ト した。 プロ ッティ ング膜を 、 丁 1~ 1 3緩衝液、 0 . 1 % T w e e n — 2 0 中で室温にて繰り 返し洗浄した。 そ して、 二次抗体と してのホースラディ ッ シ ュパー ォキシダ一ゼ標識した抗ゥサギィムノ グロプリ ン抗体又は抗マウ ス ィムノ グロプリ ン抗体と共に室温にて 1 時間ィ ンキュベ一 ト した。 これを洗浄の後、 電気化学発光試薬 （Amersham製） により発色せし めた。

実施 fij £. ガンキリ ンポリべプチ ドの特徵づけ

ヒ トガンキリ ンポ リペプチ ドをコー ドする 6 7 8 bpの c D N A ( 実施例 1 ) を、 p M K I T— N E O哺乳類発現べク タ一 （新細胞ェ 学実験プロ ト コ一ル P . 2 5 9 、 東大医科研編、 秀潤社） に、 セ ン ス方向及びア ンチセ ンス方向に連結した。 このべク ター中の S R a プロモーターは、 揷入された D N Aからの R N Aの合成を構成的に 指令することができる。 p M K I T— N E Oベク ターは、 形質転換 体の選択に適当なネオマイ シ ン耐性遺伝子を有する。

3 0 ； gのプラ ス ミ ド構成物を リ ン酸カルシウ ム法によ り N I H 3 T 3細胞 ( Jainchi 11, J. F. et al. , J. Virol (1969) 4， 549-553 ) に ト ラ ンスフ ヱ ク 卜 した。 ト ラ ンスフ ヱ ク 卜 して 4 8 時間後、 培 地に 1 0 0 0 〃 g / mlの濃度で G 4 1 8 を添加した。 個々のコロニ 一を単離し、 さ らなる解析のために増殖せしめた。 こ う して、 5個 のセ ンスク ロー ン、 5 個のア ンチセ ンス ク ロー ン、 及び 5個の対照 ク ロー ンを樹立し、 これらのク ロー ンをイ ンビ ト ロ増殖、 形態、 細 胞周期及び造腫瘍性 （tumorigenici ty) により特徴付けた。

増殖曲線から倍化時間を決定した。 下層 （ D M E M、 1 0 % F C S、 0 . 6 %寒天） 及び上層 （ D M E M、 1 0 % F C S、 0 . 3 % 寒天） から成る 2層の軟寒天中で細胞を培養した。 3 5 難の軟寒天 プレー トに 5 X 1 0 ³ 個の細胞を接種し、 3 7 °Cにて 4 〜 5週間ィ ンキュペー ト した後細胞をカウ ン ト した。 細胞数 1 5個以上から成 るコロニーの数の 5 ク ロー ンの平均は、 対照ク ロー ンで 2 5 ± 2 、 センスク ローンで 1 2 3 ± 1 であった。 したがって、 ガンキリ ンポ リペプチ ドを発現する細胞の軟寒天中でのコロニー形成能の増加が 示された。

4週令の雌性ヌー ドマウス （Flanagan, S. P. Genet. Res. (1966) 8 , 295- 309)皮下に 1 x 1 0 ⁶ 個の細胞を移植する こ とにより N I Η 3 Τ 3細胞系での造腫瘍性を試験した。 モ ッ ク構成物を含有する 5 種類のク ローン性細胞系及びセ ンスヒ トガンキリ ン構成物を含有す るク ローン性細胞系のそれぞれを、 3匹のマウス （合計 1 8 匹のマ ウス） に 1 X 1 0 ⁶ 細胞/マウスを皮下移植した。 皮下移植の後 3 ヶ月間にわたり腫瘍の形成を観察した。 腫瘍の測定は、 同一の観察 者による 2 つの直角方向に、 直線キヤ リパーを用いて行った。 また 、 細胞周期の解析のためフローサイ トメ ト リ ーを用いた。

その結果、 対照べク ターを含む細胞を接種した場合腫瘍の形成は 4 ク ローン中 0 ク ローン （腫瘍形成な し） であったのに対して、 セ ンスベク タ一を含む細胞ク ロー ンを接種した場合の腫瘍形成は 4 ク ローン中 3 ク ローンであった。 したがって、 ガンキ リ ンポ リべプチ ド発現細胞をマウ スに移植すると造腫瘍能を示すこ とが明らかにな つた。 なお、 腫瘍を形成しなかった 1 ク ロ一ンは他の 3 ク ロー ンよ りガンキリ ン mRNAの発現レベルが低かった。

培養ヒ ト腎癌細胞株 2 9 3 は培地中より血清を除く こ とにより、 アポ 卜一シスが誘導され死細胞が増加する。 この細胞系を用い、 ガ ンキリ ン遺伝子のアポ ト一シス誘導に対する作用を検討した。 実験 に先立ち、 1 0 〃 8の上記の 1\41く 1 丁— ^' £ 0べク ターを用ぃ、 各遺伝子をリ ン酸カルシウム共沈法により 2 9 3細胞に ト ラ ンスフ ェ ク 卜 し、 G418選択培地にてそれぞれの遺伝子を安定に導入された 複数個のク ロー ンを得、 以降の実験に供した。

なお、 この際、 3 回の ト ラ ンスフ ヱ ク シ ヨ ン実験の G418選択培地 より得られたコロニーフ ォーカス数の平均値は、 対照ク ロー ンで 5 6 ± 4 、 セ ンス ク ロー ンで 7 0 ± 4 、 そ してア ンチセ ンス ク ロー ン で 2 3 ± 3であった。 したがって、 ガンキリ ンポ リ ペプチ ドが細胞 増殖促進ないしアポ ト ー シス誘導抑制に作用 しているこ とが示され た。

各 2 9 3細胞ク ロー ンを用い、 2 X 1 0 ⁵ 細胞を 6 0 mmの組織培 養用ペ ト リ皿 （N u n c G m b H) にそれぞれ播き込んだ。 血清 を除去した後、 細胞を ト リプシン処理し、 浮遊細胞と付着細胞の数 、 および ト リパンブルー染色により死細胞数をカウ ン ト し、 全細胞 数に対する死細胞数の割合を求めた。

また、 アポ ト ー シス細胞数の解析には組織化学的方法を用いた。 すなわち、 各ク ロー ン細胞をカバーグラ ス上で 4 8 時間 6 0 %飽和 密度に達するまで増殖させ、 血清除去後、 A p o p T a gアポ トー シス検出キッ ト（Oncor製） により アポ トーシス細胞を染色し、 光学 顕微鏡撮影を行い全接着細胞数に対するアポ トーシス細胞の割合を 計測した。

上記 2実験において、 全細胞数に対する ト リパンブルー染色全細 胞数の比率 （％ ) と、 全細胞数に対するアポ トーシス細胞の数の比 率 （％ ) はそれぞれ、 対照ク ロー ンでは 3 3 ± 5 %と 4 5 ± 5 %で あり、 セ ンスク ローンでは 5 9 ± 6 %と 3 0 二 2 %であった。 した がって、 ガンキ リ ン遺伝子産物によるアポ トーシスおよび細胞死が 抑制されるこ とが示された。

各ク ロー ン、 2 X 1 0 ⁶ 個の細胞を 1 0 cmのペ ト リ皿に播手した 。 そ してィ ンキュベ一 ト した後に血清を除去しアポ トーシスを誘導 した。 アポ ト 一 シス細胞の顕著な特徴である、 ヌ ク レオソ一ム間で の遺伝子 DNA 断片化を解析するため、 所定の時間後に上記細胞を穏 やかに剝がし取り、 付着細胞と一緒に上清に集めた。 細胞を、 0. 2 5 %の N P _ 4 0及び 0. 1 mg/mlの R N a s eを含有する T B E ( 4 5 mM T r i s —硼酸塩、 l mME D T A、 pH8 . 0 ) 0 . 2 5 mlに再懸濁した。

3 7 °Cにて 3 0分間のイ ンキュベーシ ョ ンの後、 抽出物を 1 mg/ mlのプロティナーゼ Kにより さ らに 3 0 分間、 3 7 °Cで処理した。 次に、 3 0 1 の抽出物を 0. 5 gZ mlの臭化工チジゥムの存在 下で 1 . 7 %ァガロースゲル電気泳動を行った。 その結果、 セ ンス ガンキ リ ン遺伝子を導入した細胞では対照細胞に比し、 ヌ ク レオソ ーム間 DNA 断片化による梯子状の電気泳動パターンが減少していた 。 したがって、 これら 3実験よりガンキ リ ン遺伝子産物がアポ トー シス誘導に対し抑制的に働く ことが示された。 これは他のいく つか の癌原性遺伝子に認められる特徴であり、 ガンキ リ ン遺伝子が癌原 性遺伝子であることを支持している。

実施例 5. ガンキ リ ンポ リ べプチ ドの相互作用

サイ トメ ガロウ ィ ノレスのェ ンハ ンサ一 Zプロモータ一を有し且つ イ ンフルエンザウ イ ルス H A (へモグルァチニ ン） ェピ ト ープの塩 基配列を有する P C M V 4 — 3 H A ' ベク タ一 （Brockman, J. A. et al. , Moleculor and Cel lulor Biology (1995) 15, 2809-2818 ) に、 実施例 1 で得たヒ トガンキリ ン c D N Aを連結して、 ガンキ リ ンとィ ンフルェンザウ ィ ルス H Aからなる融合ポ リべプチ ドを発現 するプラス ミ ド p C MV 4 — 3 H A + gankyrinを作製した。

さ らに、 ベク タ一 p G E X (Pharmacia 製） にヒ トガンキリ ンコ ー ド配列を挿入するこ とにより G S T (グルタチオン ， S · ト ラ ン スフ エラーゼ） とガンキリ ンからなる融合ポ リべプチ ドを発現する プラス ミ ド p G E X— gankyrinを作製した。 1 0 〃 gの p C MV 4 — 3 H A + gankyrinを用いてリ ン酸カルシ ゥム法により 2 9 3細胞を一時的に ト ラ ンスフ ヱ ク 卜 した。 大腸菌 に p G E X— gankyrinを導入し、 そ して I mM I P T Gにより G S T一ガンキリ ン融合ポ リべプチ ドの生産を誘導した。 4 °Cでの遠心 分離により細胞を回収し、 そして Tr it on— X I 0 0 を含む P B S中 での音波処理により細胞を溶解した。 この細胞溶解物を、 2 9 3細 胞形質転換体からの全細胞抽出物と混合し、 そ して 4 °Cにて 1 6 時 間イ ンキュベー ト した。

G S T融合ポ リぺプチ ドをグルタチォンー Sepharose 4 B (Pharm acia製） 上に集め、 そして抗 R b抗体、 抗 N F B p 5 0抗体、 及 び抗 N F /c B p 6 5 ( いずれも Santa Crutz 製） を用いるウェス夕 ンブロ ッ ト法により分析した。

細胞抽出物及び免疫沈澱の調製は次のようにして行った。 5 0 mM

H E P E S ( H 7. 5 ) 、 1 5 0 mM N a C l 、 2 . 5 mM E G T A、 1 mM D T T、 0. 1 % T w e e n — 2 0 、 1 0 %グリ セ ロール、 プロテアーゼ阻害剤及びフ ォ スフ ァ ターゼ阻害剤を含有す る I P緩衝液に細胞を懸濁し、 音波処理し、 そ して次に 4 °Cにて 1 0 分間 1 0 0 0 0 X gで遠心分離した。 抗 H A抗体、 抗 R b抗体、 抗 N F /c B p 5 0抗体又は抗 N F /c B p 6 5抗体によりプレコ一 ト されたプロテイ ン A— Sepharose C L 4 B (Pharmac i a製） を用いて 、 4 °Cにて 1 6 時間、 上清を沈降せしめた。

ビーズ上の免疫沈降した蛋白質を I P緩衝液によ り 1 0 回洗浄し た。 2 X S D Sサンプル緩衝液中の沈澱を S D S —ポ リ アク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動により分離し、 そ して抗 H A抗体、 抗 R b抗体、 抗 N F c B p 5 0抗体又は抗 N F /c B p 6 5 抗体を用いるウェス夕 ンブロ ッ ト法により分析した。

次に結果を示す。 ィ ン ビ ト ロで細胞の溶解物を用いた結果を図 9 に示す。 G S Tの みあるいは G S Tとガンキリ ンの融合ポ リべプチ ドを大腸菌で発現 させ、 これを回収した。 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物と先に得られた G S Tのみあるいは G S T —ガンキ リ ン融合ポ リ ペプチ ドを混ぜ、 グ ル夕チオ ン結合セフ ァ ロ ースで沈降させこれを電気泳動した。

電気泳動したゲルをニ ト ロセルロース膜に転写し （ A ) 抗 R b抗 体、 （ B ) 抗 p 5 0抗体および （ C ) 抗 p 6 5抗体で検出 した結果 を示す。 （A ) において、 レーン左から、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物 のみ、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物と大腸菌で発現させた上記 G S Tポ リベプチ ドをまぜ、 グルタチオン結合セフ ァ ロースで沈降させたも の、 および、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物と大腸菌で発現させた融合ポ リベプチ ドをまぜ、 グルタチオ ン結合セフ ァ ロ ースで沈降させたも のの結果を示す。

( B ) において、 レー ン左から、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物のみ、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物と大腸菌で発現させた G S Tポ リべプチ ド をまぜ、 グルタチオ ン結合セフ ァ ロ一スで沈降させたもの、 および 、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物と大腸菌で発現させた融合ポ リ べプチ ド をまぜ、 グルタチオン結合セフ ァ ロースで沈降させたものの結果を 示す。 （ C ) において、 レー ン左から、 ヒ 卜 2 9 3細胞の溶解物の み、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物と大腸菌で発現させた G S Tポ リぺプ チ ドをまぜ、 グルタチオン結合セフ ァ ロースで沈降させたもの、 お よび、 ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物と大腸菌で発現させた融合ポ リ ぺプ チ ドをまぜ、 グルタチオン結合セフ ァ ロースで沈降させたものの結 果を示す。

細胞のイ ンビボ実験を図 1 0 に示す。 H Aと融合させたガンキリ ンを発現する ヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を （A ) 抗 R b抗体、 （ B ) 抗 P 5 0抗体あるいは （ C ) 抗 p 6 5抗体で免疫沈降し、 次いで抗 H A抗体で検出すると H A融合ガンキリ ンポ リぺプチ ドが検出され た。 （A ) において、 ガンキリ ン遺伝子を含まないベク ターで形質 転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィムノ グロブリ ン （レ — ン 1 ) 又は抗 R b抗体 （レー ン 2 ) で沈降させ、 それを電気泳動 して抗 H A抗体で検出 したもの、 ガンキ リ ン遺伝子を含むベク タ一 で形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィムノ グロプリ ン （レー ン 3 ) 又は抗 R b抗体 （ レー ン 4 ) で沈降させ、 それを電 気泳動して抗 H A抗体で検出したものの結果を示す。

( B ) において、 レーンは、 ガンキ リ ン遺伝子を含まないベク タ 一で形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィムノ グロブ リ ン （ レー ン 1 ) 又は抗 p 5 0抗体 （ レー ン 2 ) で沈降させ、 それ を電気泳動して抗 H A抗体で検出 したもの、 ガンキリ ン遺伝子を含 むべクタ一で形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィ ム ノ グロブリ ン （ レー ン 3 ) 又は抗 p 5 0抗体 （レーン 4 ) で沈降さ せ、 それを電気泳動して抗 H A抗体で検出 したもの、 およびガンキ リ ン遺伝子を含むベク ターで形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物 を電気泳動したもの （ レー ン 5 ) を抗 H A抗体で検出 したものの結 果を示す。

( C ) において、 レー ンは、 ガンキ リ ン遺伝子を含まないベク タ 一で形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィ ムノ グロブ リ ン （レー ン 1 ) 又は抗 p 6 5抗体 （ レー ン 2 ) で沈降させ、 それ を電気泳動して抗 H A抗体で検出 したもの、 ガンキ リ ン遺伝子を含 むベク ターで形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィ 厶 ノ グロブリ ン （レーン 3 ) 又は抗 p 6 5 抗体 （ レー ン 4 ) で沈降さ せ、 それを電気泳動して抗 H A抗体で検出 したもの、 およびガ ンキ リ ン遺伝子を含むベク ターで形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物 ( レー ン 5 ) を電気泳動したものを抗 H A抗体で検出 したものの結 果を示す。

細胞のイ ンビボ実験の結果を図 1 1 に示す。 H Aとガンキ リ ンか らなる融合ポ リペプチ ドを発現する ヒ 卜 2 9 3細胞の溶解物を抗 H A抗体で免疫沈降し、 （A ) 抗 R b抗体あるいは （ B ) 抗 p 6 5抗 体で検出すると各々 R bあるいは p 6 5 が検出された。

( A ) において、 レー ンは、 ガンキ リ ン遺伝子を含まないベク タ —で形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を電気泳動して抗 R b抗 体 （レー ン 1 ) で検出したもの、 ガンキ リ ン遺伝子を含まないべク ターで形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィ ムノ グロ ブリ ン （レー ン 2 ) 又は抗 H A抗体 （レーン 3 ) で沈降させ、 それ を電気泳動して抗 R b抗体で検出 したもの、 ガンキリ ン遺伝子を含 むベク ターで形質転換したヒ 卜 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィム ノ グロブ リ ン （レー ン 4 ) 又は抗 H A抗体 （レー ン 5 ) で沈降させ 、 それを電気泳動して抗 R b抗体で検出 したものの結果を示す。

( B ) において、 レーンは、 ガンキリ ン遺伝子を含まないベク タ —で形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解物を、 非特異的ィ ムノ グロ ブ リ ン （レー ン 1 ) 又は抗 H A抗体 （ レー ン 2 ) で沈降させ、 それ を電気泳動して抗 P 6 5抗体で検出 したもの、 ガンキリ ン遺伝子を 含むベク ターで形質転換したヒ 卜 2 9 3細胞の溶解物を非特異的ィ ムノ グロブリ ン （レー ン 3 ) 又は抗 H A抗体 （レー ン 4 ) で沈降さ せ、 それを電気泳動して抗 P 6 5抗体で検出 したもの、 およびガン キリ ン遺伝子を含むベク ターで形質転換したヒ ト 2 9 3細胞の溶解 物 （レー ン 5 ) を電気泳動したものを抗 p 6 5抗体で検出 したもの の結果を示す。

これらの結果、 ガンキリ ンポ リペプチ ドは細胞内 （ i n v i v o ) で R b又は N F κ B と相互作用するこ とが示された。

実施例 6 . 細胞周期とガンキリ ン遺伝子発現 N I H / 3 T 3細胞を 7 2時間にわたる血清飢餓 （serum starva tion) により細胞周期を初期 G 1 期に固定し、 そ して血清の再添加 により細胞周期を同調させた。 細胞を溶解し、 mR N Aを抽出 して 、 ガンキリ ン c D N Aをプローブと して検出を行った。 すなわち、 マウスガンキリ ンのコ一ディ ング領域の c D N Aを铸型と し P C R 法により増幅した後、 ³² Pを用いてラ ンダムプライ ミ ングで標識し たものをプローブと して用い、 ノ ーザンブロ ッ ト法にて m R N Aを 検出した。

各々の細胞手段の細胞周期解析にはフローサイ トメ ト リ ー （ F 1 0 w C y t o m e t r y ) を用いた。 すなわち、 C a ²⁺及び M g ^{2 +}を含有しない P B Sにて細胞を洗浄し、 ト リ ブシ ン処理を行った 。 次いで、 1 0 % F C Sを含む D M E Mで細胞を洗浄して回収し、 サ ンプルバ ッ フ ァ ーで も う一度洗浄して再懸濁した後、 7 0 %エタ ノ ールで細胞を固定した。 これを P I ( P r o p i o d i u m i o d i n e ) で染色してフローサイ トメ 一ターで測定した。

図 1 2 に結果を示す。 図 1 2 において、 各レーンは血清再添加後 、 1 時間 （ レー ン 1 ) 、 3時間 （ レー ン 2 ) 、 6時間 （ レー ン 3 ) 、 9時間 （ レー ン 4 ) 、 1 2時間 （ レー ン 5 ) 、 1 5 時間 （ レー ン 6 ) 、 1 8時間 （ レー ン 7 ) 、 2 1 時間 （ レー ン 8 ) 、 2 4時間 （ レー ン 9 ) 、 2 7時間 （ レー ン 1 0 ) 、 3 0時間 （ レー ン 1 1 ) 及 び 3 3時間 （ レー ン 1 2 ) の結果を示す。 1 〜 9時間 （ レー ン 1 〜 4 ) は G 1期であり、 1 2〜 1 8時間 （ レー ン 5〜 7 ) は S期であ り、 2 1 〜 2 4時間 （レー ン 8〜 9 ) は〇 2 + 1期でぁり、 2 7時 間 （レー ン 1 0 ) 以後再び G 1 期にもどる。

種々の細胞濃度で増殖した細胞中に発現している m R N Aの検出 の結果を図 1 3 に示す。 この図において、 細胞濃度 1 X 1 0 ⁶ 細胞 Z 1 0 0 mmデイ ツ シ ュ （ レー ン 1 ) 、 2 X 1 0 ⁶ 細胞 （ レー ン 2 ) 、 3 x 1 0 ⁶ 細胞 （レー ン 3 ) 及び 4 X 1 0 ⁶ 細胞 （ レー ン 4 ) の 結果を示す。

部分的肝切除を行った後のマウスの肝再生過程で発現する m R N Aの検出結果を図 1 4 に示す。 部分的肝切除前 （ レー ン 1 ) 、 並び に部分的肝切除から 1 時間後 （ レー ン 2 ) 、 6 時間後 （ レー ン 3 ) 、 2 4時間後 （レー ン 4 ) 、 4 8 時間後 （ レー ン 5 ) 、 7 2 時間後 (レー ン 6 ) 及び 1 6 8時間後 （レー ン 7 ) の結果を示す。

細胞周期を同調した N I H 3 T 3細胞にてガンキ リ ンの m R N A を調べると、 ガンキリ ンは細胞周期にしたがい発現が変化した。 ま た、 部分肝切除マウスの肝でも同様に細胞周期に したがい発現が変 ィ匕した。 これらのことからガンキ リ ンは細胞周期の進行に伴い、 G 1 期から S 期に発現が亢進するこ とが示され、 細胞周期制御との関連 が示唆された。

実施例 7 . ア ンチセ ンス鎖による肝癌細胞抑制効果

ヒ 卜肝癌細胞株 H e p G 2 を用いて、 ヒ トガンキリ ン · アンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体 （配列 ： CCTGTCGCTTTACCTCCCCA) ( 配列番号 ： 8 ) 及び （TACCTCCCCACACACAGATT) (配列番号 ： 9 ) の 肝細胞増殖抑制効果を調べた。 培養液と して 2 %ゥ シ胎児血清 （ F C S ) を加えた R P M I 1 6 4 0 (ニッスィ） を用いた。

1 mlの培養液を入れた 3 5 mm培養皿をー晚 3 7 °C、 5 % C 0 ₂ ィ ンキュベータ一で保存し、 これに 0 . 2 5 % ト リ プシ ン処理と ピぺ ッティ ングにより単一細胞にした H e p G 2細胞を 1 X 1 0 個ず つ加えた。 2 4 時間後、 ガンキリ ン遺伝子の開始コ ド ンを含むヒ ト ガンキ リ ンア ンチセ ンスオリ ゴヌ ク レオチ ド （ 0 、 2 . 5及び 1 0 β g /ml) を含む 1 mlの培養液と交換し、 さ らに 4 日間培養した。 3 0個以上の細胞塊をコ ロニーと して定義し、 倒立顕微鏡下でそれ ぞれの個数を数えた。 すなわち、 蒸留水を加えた対照を 1 0 0 %と して、 センスオ リ ゴヌ ク レオチ ドを添加した場合のコ ロニー数は 9 5 土 7 %であるのに対してアンチセンスヌ ク レオチ ドを添加した場 合にはコ ロニー数は 7 0 ± 5 %に減少した。

ヒ トガンキリ ンアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ドはコロニーの形 成に対する抑制効果を示した。 この結果、 ガンキリ ン遺伝子の開始 コ ドンを含むアンチセンスオリ ゴヌ ク レオチ ドは肝癌細胞株 H e p G 2 の細胞増殖を抑制することが明らカ、になつた。 産業上の利用可能性

本発明のガンキリ ンポリぺプチ ドは細胞のコロニ一形成能の増加 、 マウスにおける造腫瘍能及びアポ ト ー シス誘導の抑制等の作用を 示すことから、 癌原性を有するこ とが示された。 ガンキリ ンポ リ べ プチ ドおよびそれをコー ドする DNA は、 発癌の作用機序の解明のた めに有用である。 また、 ガンキリ ンポ リペプチ ドを使用 したスク リ —ニング方法、 ガンキリ ンポ リペプチ ドに対する抗体、 それを用い たガンキリ ンポ リべプチ ドの検出又は測定方法およびガンキリ ンポ リ ぺプチ ドをコ一 ドする DNA に対するアンチセ ンスオ リ ゴヌ ク レオ チ ドも同様に発癌の作用機序の解明のために有用である。 特許協力条約第 13規則の 2 の寄託された微生物への言及及び寄託 機関

寄託機関 名 称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所

あて名 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 一 3 微生物（1) 表 示 ： Escherichia col i DH5 a 〔pBS- U - 11 〕

寄託番号 ： FERM BP-6128

寄託日 ： 1997年 9 月 29曰 8 9

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200 205 210

GGC CTG GGT TTA ATA CTC AAG AGA ATG GTG GAA GGT TAAACA 780 Gly Leu Gly Leu l ie Leu Lys Arg Met Val Glu Gly

215 220 225 配列 ： 2

配列の長さ ： 2 2 6

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 蛋白質

配列

Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val Cys Asn Leu Ala Tyr Ser

1 5 10 15

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210 215 220

GAA AGT GAA GAG GCT TCT ATG TAG 720 Glu Ser Glu Glu Ala Ser Met

225 230

配列 ： 4

配列の長さ ： 2 3 1

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 蛋白質

配列

Met Glu Gly Cys Val Ser Asn He Met lie Cys Asn Leu Ala Tyr Ser

1 5 10 15

Gly Lys Leu Asp Glu Leu Lys Glu Arg He Leu Ala Asp Lys Ser Leu

20 25 30

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

GAA AGT GAA GAG GCT TCT ATG TAG 720 Glu Ser Glu Glu Ala Ser Met

225 230

配列 ： 6

配列の長さ ： 2 3 1

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： 蛋白質

配列

Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val Cys Asn Leu Ala Tyr Asn

1 5 10 15 Gly Lys Leu Asp Glu Leu Lys Glu Ser He Leu Ala Asp Lys Ser Leu

20 25 30

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35 40 45

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130 135 140

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165 170 175

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Leu Gin Val Ala Lys Gly Gly Leu Gly Leu He Leu Lys Arg He Val 210 215 220 Glu Ser Glu Glu Ala Ser Met

225 230

配列 ： 7

配列の長さ ： 1 5

配列の型 ： ア ミ ノ酸

トポロジー ： 直鎖状

配列の種類 ： ぺプチ ド

配列

Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val Cys Asn Leu Ala Tyr

1 5 10 15

酉己歹 ij ： 8

配列の長さ ： 2 0

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： Synthetic D N A

配列

CCTGTCGCT TTACCTCCCCA 20 酉己歹 |J ： 9

配列の長さ ： 2 0

配列の型 ： 核酸

鎖の数 ： 一本鎖

トポロ ジー ： 直鎖状

配列の種類 ： Synthetic D N A

配列

TACCTCCCCA CACACAGATT 20

Claims

ま 求 の 範

1 . 配列番号 ： 2 に示す 1 4位の A 1 aから 2 2 6位の G 1 yま でのァ ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ン （gank y r i n) の生物学 的活性を有するポ リべプチ ド。

2 . 配列番号 ： 2 に示す 1 4位の A 1 aから 2 2 6位の G 1 y ま でのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失、 付加及 び Z又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ酸配列か ら成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持しているポ リべプチ ド'。

3 . 配列番号 ： 2 に示す 1 位の M e t から 2 2 6位の G 1 yまで のア ミ ノ酸配列から成り、 ガンキリ ンの生物学的活性を有するポ リ ぺプチ ド。

4 . 配列番号 ： 2 に示す 1 位の M e t から 2 2 6位の G 1 y まで のア ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のア ミ ノ酸の欠失、 付加及び ノ又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ酸配列から 成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持しているポ リべプチ ド

5 . 配列番号 ： 1 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ンジ ェ ン 卜な条件下でハイブリ ダィズする こ とができる D N Aにより コ — ドされており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有するポ リぺプ チ ド。

6 . 配列番号 ： 4 に示す 1 4位の A 1 aから 2 3 1 位の M e t ま でのァ ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ン （gank y r i n) の生物学 的活性を有するポ リ ベプチ ド。

7 . 配列番号 ： 4 に示す 1 4位の A 1 aから 2 3 1 位の M e t ま でのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失、 付加及 び/又は他のア ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ酸配列か ら成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持しているポ リべプチ K o

8 . 配列番号 ： 4 に示す 1 位の M e t 力、ら 2 3 1 位の M e t まで のア ミ ノ酸配列から成り、 ガンキリ ンの生物学的活性を有するポ リ ぺプチ ド。

9 . 配列番号 ： 4 に示す 1 位の M e t から 2 3 1 位の M e まで のァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失、 付加及び /又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ酸配列から 成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持しているポ リペプチ ド

1 0. 配列番号 ： 3 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ン ジ ェ ン 卜な条件下でハイプリ ダイズすることができる D N Aにより コ 一ドされており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有するポ リ ぺプ チ ド。

1 1. 配列番号 ： 6 に示す 1 4位の A 1 a力、ら 2 3 1 位の M e t ま でのァ ミ ノ酸配列から成り、 且つガンキリ ン （gank y r i n ) の生物学 的活性を有するポ リべプチ ド。

12. 配列番号 ： 6 に示す 1 4位の A 1 a力、ら 2 3 1 位の M e t ま でのァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失、 付加及 び Z又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されたァ ミ ノ酸配列か ら成り、 且つガンキリ ンの生物学的活性を維持しているポ リ べプチ ド'。

13. 配列番号 ： 6 に示す 1 位の M e t カヽら 2 3 1 位の M e t まで のア ミ ノ酸配列から成り、 ガンキリ ンの生物学的活性を有するポ リ ぺプチ ド。

1 4. 配列番号 ： 6 に示す 1 位の M e t 力、ら 2 3 1 位の M e t まで のァ ミ ノ酸配列において 1 又は複数個のァ ミ ノ酸の欠失、 付加及び

/又は他のア ミ ノ酸による置換により修飾されたア ミ ノ酸配列から 成り、 且つガンキ リ ンの生物学的活性を維持しているポ リペプチ ド

1 5. 配列番号 ： 5 に示す塩基配列を有する D N Aと、 ス ト リ ン ジ ェ ン トな条件下でハイブリ ダィズする ことができる D N Aにより コ - ドされており、 且つガンキリ ンの生物学的性質を有するポ リ ぺプ チ ド。

1 6. 請求項 1 、 2、 5 、 6 、 7 、 1 0 、 1 1 、 1 2又は i 5 に記 載のポ リペプチ ドにシグナル配列が付加されたシグナル付加ポ リ ぺ プチ ド。

17. 請求項 1 〜 1 6 のいずれか 1 項に記載のポ リぺプチ ドと他の ぺプチ ド又はポ リべプチ ドとから成る融合ポ リべプチ ド。

1 8. 請求項 1 〜 1 7 のいずれか 1 項に記載のポ リ ペプチ ドをコー ドする D N A。

1 9. 請求項 1 8 に記載の D N Aを含んで成るベク タ一。

20. 請求項 1 9 に記載のベク タ一により形質転換された宿主。

2 1 . 請求項 1 〜 1 7 のいずれか 1 項に記載のポ リ ベプチ ドの製造 方法であって、 該ポ リペプチ ドをコ一 ドする D M Aを含んで成る発 現ベク ターにより形質転換された宿主を培養し、 該培養物から目的 ポリペプチ ドを採取することを特徴とする方法 _c

22. 請求項 1 〜 1 7 のいずれか 1 項に記載のポ リ ベプチ ドに対し て特異的に反応する抗体。

23. モノ ク ロ ーナル抗体である請求項 2 2 に記載の抗体。

24. ポリ ク ローナル抗体である、 請求項 2 2 に記載の抗体。

25. 請求項 2 2 〜 2 4のいずれか 1 項に記載の抗体と、 ガンキ リ ンポ リペプチ ドが含まれると予想される試料とを接触せしめ、 前記 抗体とガンキリ ンポ リべプチ ドとの免疫複合体の生成を検出又は測 定することを含んで成るガンキリ ンポ リべプチ ドの検出又は測定方 法。

26. 配列番号 ： 1 に記載の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブ リ ダイズするアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ド。

27. 配列番号 ： 1 に記載の塩基配列中の連続する少なく と も 2 0 個以上のヌ ク レオチ ドに対するア ンチセンスオ リ ゴヌ ク レオチ ド _c

28. 前記連続する少な く と も 2 0個以上のヌ ク レオチ ドが翻訳開 始コ ドンを含む、 請求項 2 7 に記載のアンチセンスオ リ ゴヌ ク レオ チ ド。

29. ガンキリ ンポ リべプチ ドと R b との結合に対するガンキ リ ン ポ リ べプチ ドのァ ゴニス ト又はア ンタ ゴニス トのス ク リ 一ニ ング方 法において、 R bの存在下でガンキリ ンポ リ べプチ ド又はガンキリ ンポリべプチ ド含有物と、 ガンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス ト又 はアンタゴニス トを含むと予想される試料とを接触せしめ、 そ して 遊離のガンキリ ンポ リペプチ ド又は R bを検出する、 こ とを特徴と する方法。

30. 前記ガンキ リ ンポ リ べプチ ド含有物が、 ガンキ リ ンポ リ べプ チ ドを発現する細胞の溶解物である、 請求項 2 9 に記載の方法 _c

3 1. ガンキリ ンポ リべプチ ドと N F κ B との結合に対するガンキ リ ンポ リべプチ ドのァ ゴニス ト又はア ンタ ゴニス 卜のス ク リ ーニ ン グ方法において、 N F Bの存在下でガンキリ ンポ リ べプチ ド又は ガンキリ ンポ リべプチ ド含有物と、 ガンキリ ンポ リ べプチ ドのァゴ ニス ト又はア ンタゴニス トを含むと予想される試料とを接触せしめ 、 遊離のガンキリ ンポ リペプチ ド又は N F Bを検出する、 こ とを 特徴とする方法。

32. 前記ガンキ リ ンポリ ペプチ ド含有物が、 ガンキリ ンポ リ ぺプ チ ドを発現する細胞の溶解物である、 請求項 3 1 に記載の方法。

33. 請求項 2 9 〜 3 2 のいずれか 1 項に記載のスク リ ーニング方 法により得られたガンキリ ンポ リべプチ ドのァゴニス 卜。

34. 請求項 2 9〜 3 2のいずれか 1 項に記載のスク リ ーニング方 法により得られたガンキリ ンポ リべプチ ドのアンタゴニス ト。