WO1999020656A1 - Anticuerpos monoclonales anti-idiotipos, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, y composiciones que los contienen - Google Patents

Anticuerpos monoclonales anti-idiotipos, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, y composiciones que los contienen

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idiotype
idiotype monoclonal
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Eladio Iglesias Sierra
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the present invention relates in general to monoclonal anti-idiotype antibodies and their use as immunomodulators. More particularly, the present invention relates to a murine monoclonal antibody, which was developed against a murine monoclonal antibody reactive with gangliosides carrying N-glycolylated sialic acid and with antigens expressed in tumor cells, and their inhibitory effect on tumor growth.
  • Prior Art One of the strategies for the treatment of cancer has been the use of active immunotherapy, a treatment modality that aims to activate the natural potential of the host's immune system against the tumor. Since Niels Jerne in 1974 (Jerne, NK 1974. Ann Immunol 125C, 373-389) proposed his idiotypic network theory, new possibilities opened up in the study of effective cancer therapies.
  • An idiotype is immunologically defined by its reactivity with more than one anti-Id that recognizes an idiotype or idiotypic determinant within a given idiotype. Therefore, as a particular Abl expresses multiple idiotopes, when this Abl is administered to syngeneic animals, a heterogeneous population of anti-Id antibodies is obtained.
  • anti-Id antibodies The classification of anti-Id antibodies is based on their junctions within the site of binding to the antigen or some other region of the Id. If the binding of Ab2 with Abl is inhibited by the relevant antigen and if Ab2 is also capable of inducing an antibody response of the same specificity as that of Abl, this mimics the natural antigen and is classified as Ab2 ⁇ ; This type of Ab2 is referred to as internal image anti-Id and they can act as substitutes for antigens. Anti-Id that are not inhibited by the antigen are designated Ab2, these Ab2 react with Abl idiotypes that are not structurally related to the antigen binding site.
  • the first approach is based on the presentation of epitopes in a different molecular environment, using Ab2 ⁇ .
  • Vaccines containing this type of anti-Id antibodies have been able to induce protective responses against viruses, bacteria and parasites (Kennedy et al (1986) 232, 220-223; McNamara et al (1985) Science 226, 1325-1326) . Also they
  • the second approach is based on the manipulation of the network through regulatory idiotopes which are not linked to antigen binding, but involve shared idiotope with other antibodies or T cells. Evidence has accumulated that these anti-Id antibodies are also capable of producing immune responses and protective effects (Paul, WE and Bona, C. (1982) Immunology Today 3, 230-234; McNamara MK et al (1985) Science 226, 1325-1326; Kohler and cois (1992) Proc. 8th inter. Cong Immunol. Budapest, pp. 619).
  • Gangliosides are glyphosphingolipids that contain sialic acid and are expressed in most mammalian cell membranes. Although these antigens are present in normal tissues, they can be found in much larger quantities and expressed in a different conformation and organization on the surface of malignant cells (Hakomori, S. (1985), Cancer Res. 45, 2405-2415; Miraldi, F. (1989) Seminars in Nuclear Medicine XIX, 282-294; Hamilton et al (1993) Int J Cancer 53, 1-81).
  • gangliosides may be useful targets against which to direct immune responses, their immunogenicity is extremely poor, due to their saccharide nature and their own antigen condition (Livingston, P. et al,
  • the N-glycolylated variant of sialic acid is expressed in normal tissues of most mammals, but it is very difficult to detect in normal human tissues (atarai,
  • An anti-Id murine monoclonal antibody (AcM) (4C10) was generated against a human IgM AcM (L612) that recognizes GM3 on human melanoma.
  • Sera from mice immunized with this KLH-coupled anti-Id AcM reacted strongly with an antigen-positive melanoma cell line and with purified GM3 which suggested that this GM3 internal image anti-Id AcM (Ab2 ⁇ ) can be an effective tool for specific active immunotherapy in patients with melanoma (Yamamoto, S. et al (1990) J. Nati. Cancer. Inst. 82, 1757-1760; Irie, RF Patent Number US 5,208,146).
  • variable regions of the heavy and light chains (VL and VH) of this anti-Id AcM were cloned, sequenced and expressed as a human mouse / IgGl chimeric antibody (Hastmgs, A. et al (1992) Cancer Res 52, 1681-1686).
  • an anti-Id type-alpha AcM was generated against human L612 AcM useful for immunodiagnostic procedures (I ⁇ e, R. F. US Patent Number 5,208,146).
  • the BEC-2 AcM is a munno anti-Id AcM raised against a mouse AcM that recognizes the ganglioside GD3 (AcMR24), which can mimic the GD3 and consequently can induce antibodies against this ganglioside despite the expression of GD3 in normal rabbit tissue (Chapman, PB And Houghton, AN (1991) 88, 186-192).
  • AcMR24 ganglioside GD3
  • the results of a pilot study showed that said BEC-2 AcM plus BCG as an adjuvant significantly increased the survival of patients with small cell lung cancer (Sc ⁇ p Magazme (1996) pp 56-59; 33 rd American Society of Clinical Oncology annual meetmg (1997).
  • anti-Id mAbs were generated which, when tested as immunogens in mice, were able to stimulate antibodies that reacted with the GD3 ganglioside. This suggested that these anti-Id mAbs may be useful in vaccine construction (Cheung, NK.V. et al (1993) Int. J. Cancer 54, 499-505). Also, a human anti-Id AcM was generated using peripheral blood mononuclear cells obtained from a patient treated with the mAb mu ⁇ no 14G2, which is specific against GD2.
  • the present invention relates in general to anti-idiotype (anti-Id) monoclonal antibodies (AcM) and their use as immunomodulators for the treatment of cancer. More particularly, the present invention relates to a murine anti-Id AcM that was developed against a murine AcM that reacts with gangliosides carrying N-glycolylated sialic acid and with antigens expressed in tumor cells. The hybridoma producing said antibody has been deposited, in correspondence with the Treaty of
  • one of its objectives is to provide a new anti-Id mAb capable of inducing a predominant anti-idiotypic response in xenogenic models and producing a protective effect in mice or other animal species carrying malignant tumors.
  • a new anti-Id mAb capable of inducing a predominant anti-idiotypic response in xenogenic models and producing a protective effect in mice or other animal species carrying malignant tumors.
  • mice and other mammalian species are immunized with doses of 25-200 ⁇ g of purified anti-ganglioside AcMs, with or without adjuvant, and optionally coupled to a carrier protein.
  • Spleen cells should preferably be used, although other antibody producing cells may also be selected. These cells are fused with myeloma cells to give hybrid or hybridoma cells the reproduction or proliferation property both "in vi tro" and "m vivo.” Cell fusion can be carried out by any of the methods known for this purpose.
  • the antibodies produced by the hybridomas are tested by immunoassay methods, preferably by an immuno-enzymatic assay in which hybridoma supernatants are incubated with the AcM used as an immunogen and with other anti-ganglioside AcMs not used in immunizations.
  • the ability of the hybridoma supernatant to block the binding of the anti-ganglioside AcM used as an immunogen to its antigen is determined by incubating said supernatant with suitable dilutions of the anti-ganglioside AcM, followed by incubating said antibody with its antigen.
  • the selected hybridomas are cloned at least twice and the resulting mAbs are produced "micro" and "live” as described above.
  • the anti-idiotype mAbs obtained recognize the anti-ganglioside mAbs and have the ability to block the binding of the anti-ganglioside mAb to its antigen.
  • Each animal received 2 to 8 doses of 250 ⁇ g to 2 mg of the anti-idiotype AcMs at intervals of 7 to 30 days between doses.
  • the immunization routes can be mtradermic, subcutaneous, intravenous, mtraperitoneal or a combination of these. Animal blood samples are performed before and during the immunization protocol and the presence of Ab3 antibody response is monitored using any of the known immunoassay methods.
  • Administration to animals of the anti-idiotype AcMs produced by immunization with anti-ganglioside AcMs can induce a predominant antibody response against the idiotype of the anti-idiotype AcM used as a mmunogen, without the induction of antigen-specific antibody response .
  • Anti-idiotype AcMs are administered in an effective amount with or without adjuvants and optionally coupled to a carrier protein.
  • effective amount should be understood as the amount of the required anti-idiotype AcM to achieve an anti-tumor effect.
  • Treatment with anti-idiotype AcMs is performed before or after experimental administration of malignant cells in animals. 5 The animals received 1-5 doses of 10-200 ⁇ g of the anti-idiotype AcMs, at intervals of 7-30 days between doses.
  • the immunization routes can be intradermal, intraperitoneal, subcutaneous, intravenous or a combination of these.
  • mice Balb / c 6-8 weeks old were immunized with two doses of 50 ⁇ g of purified AcM P3 (antibody developed against gangliosides carrying 5 N-giicolylated sialic acid, Accession No. ECACC 94113026, European Patent Application EP 657471 Al; Hybridoma (1995) 14,551-556) coupled to KLH, at intervals of 14 days between doses.
  • AcM P3 antibody developed against gangliosides carrying 5 N-giicolylated sialic acid, Accession No. ECACC 94113026, European Patent Application EP 657471 Al; Hybridoma (1995) 14,551-556
  • spleens were removed from the mice that showed high serum G levels of Ab2 antibodies against the AcM P3 and a cell suspension was prepared by pressing the tissue through a stainless steel sieve or perfusion of the spleen.
  • mice The fusion was carried out by the method described by K ⁇ hler and Milstein (1975, Nature (Lond) 256, 495-497), with 3 slight modifications.
  • the spleen cells of mice were fused with the non-secretory murine myeloma cells P3 / X63 Ag8 6.5.3.,
  • the cells are cultured in the HAT selective medium (hypoxanthine-aminopterin and thymidine) at 37 ° C in a humid 5% C0 atmosphere.
  • HAT selective medium hypoxanthine-aminopterin and thymidine
  • the evaluation of the presence of antibodies in hybridoma supernatants was determined by an ELISA.
  • the ELISA plates (COSTAR) were incubated overnight at 4 ° C with 10 ⁇ g / ml of the AcM P3 and with another IgM anti-ganglioside AcM, in carbonate-bicarbonate buffer pH 9.8.
  • the washing step is repeated and 50 ⁇ l / well of the supernatants were added. After incubation for 2 hours, the plates are washed again and a ram antiserum is added against the Fe region of murine IgG, conjugated to alkaline phosphatase. After washing, 100 ⁇ l / well of the substrate solution (1 mg / ml of p-nitrophenyl phosphate diluted in diethanolamine buffer, pH 9.8) was added. The absorbance was measured at 405 nm in an ELISA reader.
  • the wells were washed 4 times with 200 ⁇ l of PBS and 50 ⁇ l of an anti-immunoglobulin mouse antiserum conjugated to alkaline phosphatase, suitably diluted, was added. After washing with PBS the wells were incubated with the substrate solution as described above. An anti-idiotype AcM, named 1E10, of the IgGl subclass was obtained. This AcM 1E10 anti-IdP3 proved to be very specific for the AcM P3 used as an immunogen.
  • the hybridoma producing said antibody has been deposited, in correspondence with the Budapest Treaty, on November 29, 1997 under accession number 97112901, at the Center for Applied Microbiology (CAMR) & European Cell Culture Collection (ECACC) , in the United Kingdom.
  • This selected anti-IdP3 AcM 1E10 does not react with other anti-ganglioside antibodies such as El, A3 and F6 ( Figure 1) and is capable of inhibiting the binding of AcM P3 to the NeuGcGM3 ( Figure 2) and to the tumor cell line of P3 positive breast.
  • Example 2 Generation of response of anti-anti-idiotype antibodies (Ab3) to the AcM anti-Id 1E10 in a xenogenic model.
  • the anti-IdP3 1E10 AcM precipitated in aluminum hydroxide was used to intradermally immunize Cynomolgus monkeys, at 14 days interval with a dose of 2 mg of AcM per injection. The animals received several doses of AcM.
  • ELISA plates (COSTAR) were incubated overnight at 4 ° C with 10 ⁇ g / ml of AcM 1E10 or its F (ab ') 2 fragments in carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.8.
  • the plates after being washed with PBS containing 0.05% Tween 20, were blocked with the same buffer containing 1% BSA for one hour at 37 ° C.
  • the washing step was repeated and 50 ⁇ l / well of the dilutions of the different sera were added. After incubation for 2 hours at 37 ° C, the plates were washed again and human anti-IgM or anti-IgG antisera, conjugated to alkaline phosphatase, were added. After washing, the substrate solution was added as described above.
  • Blocking experiments were carried out to distinguish between the responses of anti-isotypic and anti-idiotypic antibodies.
  • the sera of monkeys were incubated overnight at 4 ° C with 500 ⁇ g / ml of an AcM with the same isotype as that of the AcM 1E10, but with different specificity. Then, the remaining serum reactivity against AcM 1E10 was measured by ELISA, as described above.
  • the sera of the monkeys were checked for their ability to inhibit the binding of biotinylated AcM P3 to the F (ab ') 2 fragments of the AcM 1E10 in ELISA plates, using the ELISA method described above, but where after incubation the plates with the dilutions of the sera, 50 ⁇ l / well of the biotinylated AcM P3 was added. After an incubation for one hour at 37 ° C, the plates were washed and 50 ⁇ l / well of the avidin-biotin-peroxidase complex were added and said plates were incubated for one hour at 37 ° C. After washing, the substrate buffer (8 mg of o-phenylenediamine in 12 ml of phosphate citrate buffer, pH 5.0) was added. The absorbance at 492 nm was measured in an ELISA reader.
  • the sera of the monkeys also inhibited the binding of biotinylated AcM P3 to the anti-Id 1E10 AcM, indicating that Ab3 antibodies in the monkey's serum share the idotopes with the AcM P3 (Fig. 5).
  • a predominant IgG antibody response was generated against the AcM ant ⁇ -IdP3 1E10 (Fig. 6).
  • the sera obtained from the monkeys reacted with the F (ab ') 2 1E10 fragments even 4 months after the animals received the last immunization (Fig. 7), as well as Ab3 antibodies with inhibitory capacity of the binding of AcM P3 to 1E10 were also detected at that time. No antibodies against NeuGcGM3 were detected in the animals' serum.
  • the anti-idiotype 1M10 AcM is of the gamma type, since the 1E10 anti-idiotype is able to inhibit the binding of the Ac3 P3 with its antigen and is not capable of inducing the production of antibodies similar to the P3 in animals .
  • Example 3 Treatment of mice with the AcM anti-Id 1E10.
  • mice C57BL / 6 mice were immunized with five doses of 50 ⁇ g of AcM ant ⁇ -IdP3 1E10 precipitated in aluminum hydroxide at 14 day intervals. One week later, the mice were injected subcutaneously with 5 x 10 3 B16 melanoma cells. Animals that were treated in the same way, but did not receive the AcM 1E10, were used as controls. The Kaplan-Meyer survival curves are shown in the Figure 8, which shows that survival is significantly better in the group immunized with the AcM anti-IdP3 1E10 than in the control group.
  • Figure 2 Shows the results of an inhibition assay where the AcM P3 was incubated with the AcM anti-IdP3 1E10, and then the reactivity of the AcM P3 to the NeuGcGM3 is measured by ELISA.
  • Figure 3 Shows the reactivity of sera of a monkey with the F (ab ') 2 fragments of the AcM 1E10 measured by ELISA, after the animal received different doses of the AcM anti-Id 1E10 precipitated in aluminum hydroxide.
  • Figure 4 Shows the results of an inhibition test, where the reactivity was determined by ELISA of a monkey serum not pre-adsorbed with the AcM 1E10 (-B-) and not pre-adsorbed with an irrelevant AcM of the same ior isotype C5 (- • -), as well as the reactivity of said serum pre-adsorbed to AcM 1E10 (-Q-) and AcM ior C5 (-O-), using a serum dilution of 1 / 20,000.
  • FIG. 5 Shows the inhibition of the binding of AcM P3 to
  • Figure 6 Shows the kinetics of the IgG and IgM antibody response against AcM 1E10 in the serum of a monkey immunized with the anti-idiotype AcM, determined by ELISA.
  • the arrows indicate immunization time and the continuous lines the moment in which samples of the animal's serum are obtained.
  • Figure 7 Shows the recognition of F (ab ') 2 fragments of AcM 1E10 by pre-immune monkey serum; for the serum obtained after the monkey received the last dose of the anti-idiotype AcM 1E10 precipitated in aluminum hydroxide (indicated by the arrow), and for the serum obtained 4 months after the animal received the last immunization.
  • Figure 8 Kaplan-Meyer survival curves in mice treated with the ACM ant ⁇ -IdP3 1E10 and inoculated with B16 melanoma cells.

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que es específico contra anticuerpos murinos gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilado, particularmente contra aquellos que son expresados por células tumorales. El anticuerpo monoclonal es útil como inmunomodulador para el tratamiento del cáncer. Específicamente, el anticuerpo monoclonal anti-idiotipo de la presente invención es capaz de inducir una respuesta predominantemente anti-idiotípica en modelos xenogénicos. El anticuerpo monoclonal anti-idiotipo también ejerce un efecto protector contra tumores malignos en animales.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-IDIOTIPOS, SU USO EN LA INMUNOTERAPIA ACTIVA DE TUMORES MALIGNOS, Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN.
Sector Técnico
La presente invención se relaciona de forma general con anticuerpos monoclonales anti-idiotipos y su uso como inmunomoduladores . Más particularmente, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal murino, el cual fue desarrollado contra un anticuerpo monoclonal murino reactivo con gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilados y con antigenos expresados en células tumorales, y su efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral. Técnica Anterior Una de las estrategias para el tratamiento de cáncer ha sido el uso de la inmunoterapia activa, una modalidad de tratamiento que tiene como objetivo la activación del potencial natural del sistema inmune del hospedero contra el tumor. Desde que Niels Jerne en 1974 (Jerne, N. K. 1974. Ann Immunol 125C, 373-389) propuso su teoria de la red idiotipica, nuevas posibilidades se abrieron en el estudio de terapias efectivas contra el cáncer. La teoria de Jerne presentaba por primera vez, al sistema inmune como una red de anticuerpos que pueden interactuar entre si y con un gran número de epitopos naturales, a través de sus regiones variables o idiotipos (Id) . Este conjunto complejo de interacciones Id-anti-Id opera para regular las respuestas inmunes a los antigenos. Dichos anticuerpos desarrollados en respuesta al antigeno original, nombrados Abl, se convierten ellos mismos en antigenos y provocan la producción de un segundo conjunto de anticuerpos, llamados anticuerpos anti- idiotipos (anti-Id o Ab2), que también pueden ser regulados por otros anticuerpos referidos como anti-anti-Id (Ab3) . La teoria original de Jerne continúa siendo revisada, y ha sido reportado que el resultado de la interacción de Ab2 con linfocitos portadores de Abl no tiene por qué ser necesariamente la supresión de la respuesta inmune, sino que puede ser la estimulación de dicha respuesta. Además, Jerne limitó su teoria a los linfocitos B y a los anticuerpos, pero ahora resulta claro que las células T juegan un papel importante en la regulación a través de los idiotipos de los receptores de las células T (Teitelbaum, D. et al, 1984 J. Immunol 132,1282-1285; Zanetti, M. et al (1986) J. Immunol 137, 3140-3146; Powell, J. et al (1988) 140, 3266-3272; Baskin, J.G. et al (1990) J Immunol 145,202-208; Furuya a, A. et al (1992) Anticancer Res 12, 27-32; Raychaudhuri, S. et al. J. Immunol 131, 271-278 ; Raychaudhuri et al (1987) J. I munol 139, 3902-3910; Durrant et al (1994) Cáncer Res. 54, 4837-4840) .
Un idiotipo es inmunológicamente definido por su reactividad con más de un anti-Id que reconoce un determinante idiotipo o idiotopo dentro de un determinado idiotipo. Por lo tanto, como un Abl particular expresa múltiples idiotopos, cuando este Abl es administrado a animales singénicos, se obtiene una población heterogénea de anticuerpos anti-Id.
La clasificación de los anticuerpos anti-Id se basa en sus uniones dentro del sitio de unión al antigeno o a alguna otra región del Id. Si la unión del Ab2 con el Abl es inhibida por el antigeno relevante y si el Ab2 es también capaz de inducir una respuesta de anticuerpos de la misma especificidad que la del Abl, éste mimifica el antigeno natural y se clasifica como Ab2β; este tipo de Ab2 se refiere como anti-Id imagen interna y ellos pueden actuar como sustitutos de los antigenos. Los anti-Id que no son inhibidos por el antigeno se designan Ab2 , estos Ab2 reaccionan con idiotopos del Abl que no están estructuralmente relacionados con el sitio de unión al antigeno. En 1984 Bona y Kohler propusieron un tercer tipo de anticuerpos anti-Id (Ab2γ) , los cuales son inhibidos por el antigeno a causa de una interferencia estérica, este tipo de anti-Id reacciona con ídiotopos estructuralmente asociados con el sitio de unión al antigeno, pero ellos no mimifican el epitopo antigénico reconocido por el Abl (Bona and Kohler 1984, In Monoclonal and anti- ídiotypic antibodies: Probes for receptor structure and function, Venter JC, Frasser CM, Lmdstrom J (eds) , NY, Alan R. Liss, pp 141-149, 1984) . Basado en la teoria de Jerne se han desarrollado dos enfoques principales en la búsqueda de vacunas para un gran numero de antigenos, incluidos los antigenos tumor- asociados. El primer enfoque se basa en la presentación de epitopos en un ambiente molecular diferente, usando Ab2β. Las vacunas que contienen este tipo de anticuerpos anti-Id han sido capaces de inducir respuestas protectoras contra virus, bacterias y parásitos (Kennedy et al (1986) 232, 220-223; McNamara et al (1985) Ciencia 226, 1325-1326) . También, los
Ab2β se han usado para inducir respuestas inmunes a antigenos tumor-asociados y resultados positivos han sido obtenidos en modelos animales y en ensayos clínicos (Raychauhuri et al
(1986) J. Immunol37, 1743-1749; Raychauhuπ et al (1987) J.Immunol 139, 3902-3910; Bhattacharya-Chatterjee et al
(1987) J. Immunol 139, 1354-1360; Bhattacharya-Chatterjee et al (1988) J. Immunol 141, 1398-1403; Herlyn, D. et al
(1989) Intern. Rev. Immunol 4, 347-357; Chen, Z-J et al. Cell Imm. Immunother. Cáncer (1990) 351-359; Herlyn, D. et al (1991) In Vivo 5, 615-624; Furuya et al (1992) Anticancer Res 12, 27-32; Mittel an, A. et al (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89,466-470; Durrant, LG. et al (1994) Cáncer Res. 54, 4837-4840; Mittelman, A. et al (1994) Cáncer Res. 54, 415- 421; Schmitt, H. et al (1994) Hibπdoma 13, 389-396; Chakrobarty, M. et al (1995) J. Immunother. 18, 95-103; Chakrobarty, M. et al (1995) Cáncer Res. 55, 1525-1530; - Foon, K. A. et al (1995) Clin. Cáncer Res. 1, 1285-1294; Herlyn, D. et al (1995) Hybridoma 14, 159-166; Sclebusch, H. et al (1995) Hybridoma 14, 167-174; Herlyn, D. et al (1996) Cáncer Immunol. Immunother. 43, 65-76). No obstante, se ha demostrado que el carácter β de un Ab2 no es suficiente para producir el efecto biológico que podría inducir dicho Ab2 (Raychauhuri y cois, 1986, J. Immunol 137, 1743-1749; Raychauhuri y cois, 1987, J. Immunol 139, 231-278; Maruyama y cois, 1996, Int J Cáncer 65, 547-553) .
El segundo enfoque se basa en la manipulación de la red mediante idiotopos regulatorios los cuales no están vinculados a la unión al antigeno, pero involucran idiotopos compartidos con otros anticuerpos o células T. Se han acumulado evidencias de que estos anticuerpos anti-Id son también capaces de producir respuestas inmunes y efectos protectores (Paul, W. E. and Bona, C. (1982) Immunology Today 3, 230-234; McNamara M. K. et al (1985) Science 226, 1325- 1326; Kohler y cois (1992) Proc. 8th ínter. Cong Immunol. Budapest, pp. 619).
Los gangliósidos son glicoesfingolipidos que contienen ácido siálico y se expresan en la mayoría de las membranas de las células de los mamíferos. Aunque estos antigenos están presente en tejidos normales, ellos pueden encontrarse en cantidades mucho mayores y expresados en una conformación y organización diferente en la superficie de células malignas (Hakomori, S. (1985), Cáncer Res. 45, 2405-2415; Miraldi, F. (1989) Seminars in Nuclear Medicine XIX, 282-294; Hamilton et al (1993) Int J Cáncer 53, 1-81) .
Aunque los gangliósidos pudieran ser blancos útiles contra los cuales dirigir las respuestas inmunes, su inmunogenicidad es extremadamente pobre, debido a su naturaleza sacaridica y a su condición de antigeno propio (Livingston, P. et al,
(1995) Seminars in Cáncer Biology 6, 357-366).
La variante N-glicolilada del ácido siálico se expresa en tejidos normales de la mayoría de los mamíferos, pero es muy difícil detectarla en tejidos normales de humanos ( atarai,
S. et al (1995) J. Biochem 117, 1062-1069) . Por otra parte, la presencia de estos antigenos ha sido reportada en cáncer de colon, melanoma, retinoblastoma y cáncer de mama, entre otros (Higachi, H et al (1984) Jpn J Cáncer Res (Gann) 75,
1025-1029; Higachi, H et al (1985) Cáncer Res. 45, 3796-3802;
Hirabayashi, I. Et al (1987) Jpn J Cáncer Res (Gann) 78,
1614-1620; Higachi, H. et al (1988) Jpn J Cáncer Res (Gann)
79, 952-956; Miyake, M. et al (1990) Cáncer 65,499-505; Devine, P.L. et al (1991) Cáncer Res. 51,5826-5386; Vázquez,
A.M. et al (1995) Hybridoma 14,551-556; Marquina, G. et al
(1996) Cáncer Res. 56, 5165-5171).
La inmunización con vacunas que contienen gangliósidos ha resultado en la prolongación de la sobrevida de pacientes con melanoma quienes desarrollaron anticuerpos anti- gangliósidos (Livingston, P. et al (1987) Proc Nati Acad Sci USA 84, 2911-2915; Livingston, P. et al (1989) Cáncer Res 49, 7045-7050; Livingston, P. (1995) Immunological Reviews 145, 147-166) . No obstante, los problemas de la obtención de grandes cantidades del antigeno junto con su pobre inmunogenicidad han hecho el uso de los anticuerpos anti-Id una alternativa atractiva para la inmunoterapia activa en este modelo antigénico.
Un anticuerpo monoclonal (AcM) murino anti-Id (4C10) fue generado contra un AcM IgM humano (L612) que reconoce GM3 sobre melanoma humano. Sueros de ratones inmunizados con este AcM anti-Id acoplado con KLH, reaccionaron fuertemente con una linea celular de melanoma antigeno-positiva y con GM3 purificado lo cual sugirió que este AcM anti-Id portador de la imagen interna de GM3 (Ab2β) puede ser una herramienta efectiva para la inmunoterapia activa especifica en pacientes con melanoma (Yamamoto, S. et al (1990) J. Nati. Cáncer. Inst. 82, 1757-1760; Irie, R. F. Patent Number US 5,208,146). Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras (VL y VH) de este AcM anti-Id fueron clonadas, secuenciadas y expresadas como un anticuerpo quimérico ratón/IgGl humano (Hastmgs,A. et al (1992) Cáncer Res 52, 1681-1686) .
Además, un AcM anti-Id tipo-alfa se generó contra el AcM humano L612 útil para procedimientos de mmunodiagnóstico (Iπe, R. F. Patente Número US 5,208,146).
El AcM BEC-2, es un AcM anti-Id munno levantado contra un AcM de ratón que reconoce al gangliósido GD3 (AcMR24), el cual puede mimificar al GD3 y consecuentemente puede inducir anticuerpos contra este gangliósido a pesar de la expresión de GD3 en el tejido normal de conejo (Chapman, P. B. And Houghton, A. N. (1991) 88, 186-192) . Los resultados de un estudio piloto mostró que dicho AcM BEC-2 más BCG como adyuvante incrementó significativamente la sobrevida de pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas (Scπp Magazme (1996) pp 56-59; 33rd American Society of Clinical Oncology annual meetmg (1997).
En la inmunización de ratas con un AcM munno especifico contra GD2 (3F8), se generaron AcMs anti-Id que cuando se probaron como inmunógenos en ratones, pudieron estimular anticuerpos que reaccionaron con el gangliosido GD3. Esto sugirió que estos AcMs anti-Id pueden ser útiles en la construcción de vacunas (Cheung, N-K.V. et al (1993) Int. J. Cáncer 54, 499-505) . También, un AcM anti-Id humano se generó usando células mononucleares de sangre periférica obtenida a partir de un paciente tratado con el AcM muπno 14G2, el cual es especifico contra GD2. La inmunización de conejos con este AcM anti-Id humano indujo la producción de anticuerpos anti- GD2 y una respuesta DTH para células de tumor antigeno- positivas. Esto sugirió que este anticuerpo podría potencialmente usarse como una vacuna anti-Id en pacientes con melanomas malignos (Saleh, M. N. et al (1993) J. Immunol 151, 3390-3398) . Como es evidente a partir de los antecedentes arriba mencionados, hasta el momento ningún AcM anti-Id se ha generado contra AcMs que reconocen gangliósidos que contienen ácido siálico N-glicolilado. Tampoco han sido descritos AcMs anti-Id no beta en modelos gangliósido con un efecto anti-tumoral . En todos los trabajos previos se reclaman AcMs anti-Id como sustitutos del antigeno. Divulgación de la Invención.
La presente invención se relaciona de forma general con anticuerpos monoclonales (AcM) anti-idiotipos (anti-Id) y su uso como inmunomoduladores para el tratamiento del cáncer. Más particularmente, la presente invención se refiere a un AcM anti-Id murino que se desarrolló contra un AcM murino que reacciona con gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilado y con antigenos expresados en células tumorales. El hibridoma productor de dicho anticuerpo ha sido depositado, en correspondencia con el Tratado de
Budapest, el 29 de Noviembre de 1997 bajo el número de acceso 97112901, en el Centro para la Microbiología Aplicada
(CAMR) & Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) , en el Reino Unido. Según la presente invención, uno de sus objetivos es proporcionar un nuevo AcM anti-Id capaz de inducir una predominante respuesta anti-idiotipica en modelos xenogénicos y de producir un efecto protector en ratones u otras especies animales portadoras de tumores malignos. Descripción detallada de la Invención
Procedimiento de inmunización para obtener respuesta de anticuerpos anti-idiotipos (Ab2) a AcMs antigangliósidos.
Los ratones y otras especies de mamíferos son inmunizados con dosis de 25-200 μg de AcMs anti-gangliósidos purificados, con o sin adyuvante, y opcionalmente se acoplaron a una proteina transportadora.
Los animales recibieron de 2-6 dosis de AcMs antigangliósidos, a intervalos de 14 a 30 dias entre dosis. Las rutas posibles de inmunización son intraperitoneal, subcutánea, endovenosa o una combinación de éstas. Antes de y durante el periodo de inmunización, muestras del suero de la sangre del animal son tomadas y los niveles de respuesta de anticuerpos Ab2 son determinados mediante cualquier método de mmunoensayo conocido. Diluciones del suero del animal son incubadas con el AcM anti-gangliósido usado como mmunógeno, o con otros AcMs anti-gangliósidos no usados en el protocolo de inmunización.
También fueron llevados a cabo experimentos para definir la capacidad que los sueros de los animales inmunizados tenían para bloquear la unión a su antigeno, del AcM anti- gangliósido usado como inmunógeno .
Producción de AcMs anti-idiotipos contra AcMs anti- gangliósidos .
Ratones con altos títulos de anticuerpos Ab2 recibieron una re-mmunizacion con los AcM usados como inmunógeno, tres de dias antes de la obtención de las células productoras de anticuerpos. Deben emplearse preferentemente las células del bazo, aunque otras células productoras de anticuerpos pueden ser seleccionadas también. Estas células son fusionadas con células de mieloma para dar a las células híbridas o hibridomas la propiedad de reproducción o proliferación tanto "in vi tro " como "m vivo ". La fusión celular puede ser llevada a cabo por cualquiera de los métodos conocidos para este fin. Los anticuerpos producidos por los hibπdomas son probados por métodos de inmunoensayo, preferentemente mediante un ensayo inmuno-enzimático en el que sobrenadantes de los hibridomas se incuban con el AcM usado como inmunógeno y con otros AcMs anti-gangliósidos no usados en las inmunizaciones. La capacidad del sobrenadante del hibridoma de bloquear la unión del AcM anti-gangliósido usado como inmunógeno a su antigeno es determinada mediante la incubación de dicho sobrenadante con diluciones adecuadas del AcM anti- gangliósido, seguido por la incubación de dicho anticuerpo con su antigeno. Los hibridomas seleccionados son clonados por lo menos dos veces y los AcMs resultantes se producen "m vi tro " e "m vivo " como se describe anteriormente.
Los AcMs anti-idiotipos obtenidos reconocen los AcMs anti- gangliósidos y poseen la capacidad de bloquear la unión del AcM anti-gangliósido a su antigeno.
Procedimiento de inmunización para obtener respuesta de anticuerpos anti-anti-idiotipos (Ab3) a AcMs Ab2 en modelos xenogénicos . Monos u otra especie xenogénica son inmunizados con AcMs anti-idiotipos. Estos AcMs pueden ser administrados con o sin adyuvante y opcionalmente ser acoplados a una proteina transportadora, antes de ser usados como mmunogenos.
Cada animal recibió de 2 a 8 dosis de 250 μg a 2 mg de los AcMs anti-idiotipos a intervalos de tiempo de 7 a 30 dias entre dosis.
Las vias de inmunización pueden ser mtradermica, subcutánea, endovenosa, mtraperitoneal o una combinación de éstas. Los muéstreos de la sangre de los animales se realizan antes y durante el protocolo de inmunización y la presencia de respuesta de anticuerpos Ab3 es monitoreada usando cualquiera de los métodos de inmunoensayo conocidos.
La administración a los animales de los AcMs anti-idiotipos producidos por la inmunización con AcMs anti-gangliósidos, pueden inducir una respuesta de anticuerpo predominante contra el ídiotipo del AcM anti-idiotipo usado como mmunogeno, sin la inducción de respuesta de anticuerpos antigeno-especifica. Efecto anti-tumoral del tratamiento con AcMs anti- ídiotipos .
AcMs anti-idiotipos se administran en una cantidad efectiva con o sin adyuvantes y opcionalmente acoplados a una proteina transportadora. El termino de cantidad efectiva debe entenderse como la cantidad del AcM anti-idiotipo requerida para lograr un efecto anti-tumoral . El tratamiento con los AcMs anti-idiotipos se realiza antes o después de la administración experimental de las células malignas en los animales . 5 Los animales recibieron de 1-5 dosis de 10-200 μg de los AcMs anti-idiotipos, a intervalos de tiempo de 7-30 dias entre dosis.
Las rutas de inmunización pueden ser intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, endovenosa o una combinación de 0 éstas.
Después del tratamiento con los AcMs anti-idiotipos, la incidencia del tumor y la sobrevida en el grupo tratado con los AcKs anti-idiotipos fue comparada con la de los grupos controles . 5 Este ensayo reveló que el tratamiento con el AcM anti- idiotipo incrementó significativamente la sobrevida de los animales portadores de tumores y disminuyó las metástasis pulmonares en los mismos.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN: 0 Ejemplo 1: Generación de un anticuerpo anti-idiotipo contra el AcM P3 en un modelo singénico.
Ratones hembras Balb/c de 6-8 semanas, fueron inmunizadas con dos dosis de 50 μg del AcM P3 purificado (anticuerpo desarrollado contra gangliósidos portadores de ácido siálico 5 N-giicolilado, No. de Acceso ECACC 94113026, Solicitud de patente europea EP 657471 Al; Hibridoma (1995) 14,551 -556) acoplado a KLH, a intervalos de 14 dias entre dosis.
Tres dias después de la última inmunización, se extrajeron les bazos de los ratones que mostraron altos niveles en G suero de anticuerpos Ab2 contra el AcM P3 y se preparó una suspensión celular mediante el prensado del tejido a través de un tamiz de acero inoxidable o perfusión del bazo.
La fusión fue llevada a cabo mediante el método descrito por Kδhler y Milstein (1975, Nature (Lond) 256, 495-497), con 3 ligeras modi icaciones. Las células de los bazos de ratones fueron fusionadas con las células del mieloma murino no-secretor P3/X63 Ag8 6.5.3.,
No. de acceso ECACC. 85011420, en una relación 10:1, en 0.5 mi del medio de fusión que contiene 42% de polietilenglicol (PEG) en medio RPMI-1640.
Posterior a la fusión, las células son cultivadas en el medio selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina y timidina) a 37°C en una atmósfera húmeda 5% C0 .
Dentro de los diez a quince dias posteriores a la fusión, la evaluación de la presencia de los anticuerpos en los sobrenadantes de los hibridomas fue determinada mediante un ELISA. Las placas del ELISA (COSTAR) se incubaron durante la noche a 4°C con 10 μg/ml del AcM P3 y con otro AcM IgM anti- gangliósido, en tampón carbonato -bicarbonato pH 9.8. Los placas, después de lavadas con PBS conteniendo 0.05% de T een 20, fueron bloqueadas con el mismo tampón conteniendo 1% BSA durante una hora a 37°C.
El paso del lavado es repetido y 50 μl/pozo de los sobrenadantes fueron añadidos. Después de su incubación durante 2 horas, las placas son lavadas nuevamente y se agrega un antisuero de carnero contra la región Fe de IgG murina, conjugado a fosfatasa alcalina. Después del lavado, se añadieron 100 μl/pozo de la solución substrato (1 mg/ml de p- nitrofenilfosfato diluido en tampón dietanolamina, pH 9.8) . La absorbancia se midió a 405 nm en un lector de ELISA.
Además, la capacidad de los sobrenadantes de bloquear la unión del AcM P3 al NeuGcGM3 fue determinada mediante un
ELISA indirecto llevado a cabo sobre placas activadas de cloruro de polivinilo (ICN-FLOw) con NeuGcGM3 inmovilizado, según el método siguiente:
Cincuenta microlitros del gangliósido en metanol (4 μg/ml) se añadieron a cada pozo. El metanol se evapora incubando las placas a 37°C durante una hora. Luego se agregaron 150 μl./pozo de tampón TRIS-HCL 0.05 M pH 7.8 conteniendo 1% BSA y las placas se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Los sobrenadantes de los hibridomas se incubaron con 4 μg/ml del AcM P3 durante 3 horas a 37°C y entonces, 50 μl/pozo de las mezclas se agregaron y las placas se incubaron a 37°C durante 90 minutos. Los pozos fueron lavados 4 veces con 200 μl de PBS y se añadieron 50 μl de un antisuero anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado a fosfatase alcalina, adecuadamente diluidos. Después de lavar con PBS los pozos se incubaron con la solución substrato como se describió anteriormente. Un AcM anti-idiotipo, nombrado 1E10, de la subclase IgGl fue obtenido. Este AcM 1E10 anti-IdP3 resultó ser muy especifico para el AcM P3 usado como inmunógeno.
El hibridoma productor de dicho anticuerpo ha sido depositado, en correspondencia con el Tratado de Budapest, el 29 de Noviembre de 1997 bajo el número de acceso 97112901, en el Centro para la Microbiología Aplicada (CAMR) & Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) , en el Reino Unido.
Este AcM 1E10 anti-IdP3 seleccionado no reacciona con otros anticuerpos anti-gangliósidos tales como El, A3 y F6 (Figura 1) y si es capaz de inhibir la unión del AcM P3 al NeuGcGM3 (Figura 2) y a la linea celular de tumor de mama P3 positiva.
Ejemplo 2: Generación de respuesta de anticuerpos anti- anti-idiotipos (Ab3) al AcM anti-Id 1E10 en un modelo xenogénico.
El AcM anti-IdP3 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio fue empleado para inmunizar intradérmicamente monos Cynomolgus, a 14 dias de intervalo con una dosis de 2 mg de AcM por inyección. Los animales recibieron varias dosis del AcM.
Las muestras de los sueros se tomaron antes y después de las inmunizaciones. La presencia de respuesta de anticuerpos Ab3 en los sueros de los monos fue determinada por ELISA. Placas de ELISA (COSTAR) se incubaron durante la noche a 4°C con 10 μg/ml del AcM 1E10 o sus fragmentos F(ab')2 en tampón carbonate-bicarbonato, pH 9.8.
Las placas, después de ser lavadas con PBS conteniendo 0.05% de Tween 20, fueron bloqueadas con el mismo tampón conteniendo 1% BSA durante una de hora a 37°C.
El paso de lavado se repitió y 50 μl/pozo de las diluciones de los diferentes sueros fueron añadidas. Después de la incubación durante 2 horas a 37°C, las placas se lavaron nuevamente y fueron añadidos antisueros anti- inmunoglubulinas humanas, anti-IgM o anti-IgG, conjugados a fosfatasa alcalina. Después del lavado, la solución del substrato se agregó según lo anteriormente descrito.
Los experimentos de bloqueo se llevaron a cabo para distinguir entre las respuestas de anticuerpos anti- isotipica y anti-idiotipica. Los sueros de monos fueron incubados durante la noche a 4°C con 500 μg/ml de un AcM con el mismo isotipo que el del AcM 1E10, pero con diferente especificidad. Entonces, la reactividad remanente del suero contra el AcM 1E10 fue medida mediante ELISA, como se describió arriba.
Los sueros de los monos fueron chequeados en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de AcM P3 biotinilado a los fragmentos F(ab')2 del AcM 1E10 en placas de ELISA, usando el método de ELISA descrito anteriormente, pero donde después de incubar las placas con las diluciones de los sueros, se agregaron 50 μl/pozo del AcM P3 biotinilado. Después de una incubación durante una hora a 37°C, las placas se lavaron y 50 μl/pozo del complejo avidina-biotina- peroxidasa se agregaron y se procedió a la incubación de dichas placas durante una hora a 37°C. Después de lavar, el tampón substrato (8 mg de o-fenilendiamina en 12 mi de buffer fosfato- citrato, pH 5.0) se agregó. Se midió la absorbancia a 492 nm en un lector de ELISA.
Los sueros obtenidos a partir de monos inmunizados con AcM anti-IdP3 1E10 reaccionaron fuertemente con los fragmentos F(ab')2 1E10 (Fig. 3) . Los sueros obtenidos a partir monos inmunizados se unieron específicamente con el AcM 1E10 y con menos reactividad que con el AcM no relacionado (íor C5) . La presencia de anticuerpos contra el ídiotipo 1E10 se confirmó después de la incubación de los sueros de los animales con el AcM no relacionado, debido a una reactividad fuerte de los sueros adsorbidos con el AcM antι-IdP3 1E10; sorprendentemente la respuesta de anticuerpos anti-idiotipica inducida fue superior en comparación con la respuesta de anticuerpo anti-isotipica generada (Fig. 4) . Los sueros de los monos también inhibieron la unión del AcM P3 biotmilado al AcM anti-Id 1E10, lo que indica que anticuerpos Ab3 en el suero de los monos comparten los ídiotopos con el AcM P3 (Fig. 5) . Una respuesta predominante de anticuerpo IgG se generó contra el AcM antι-IdP3 1E10 (Fig. 6) . Los sueros obtenidos a partir de los monos reaccionaron con los fragmentos F(ab')2 1E10 aún 4 meses después que los animales recibieron la ultima inmunización (Fig. 7) , asi como anticuerpos Ab3 con capacidad inhibitoria de la unión del AcM P3 a 1E10 fueron detectados también en ese momento. No se detectaron anticuerpos contra NeuGcGM3 en el suero de los animales.
Todo esto demuestra que el AcM anti-idiotipo 1E10 es del tipo gamma, ya que el anti-idiotipo 1E10 es capaz de inhibir la unión del AcM P3 con su antigeno y no es capaz de inducir la producción de anticuerpos similares al P3 en los animales .
Ejemplo 3: Tratamiento de ratones con el AcM anti-Id 1E10.
Ratones C57BL/6 se inmunizaron con cinco dosis de 50 μg de AcM antι-IdP3 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio a intervalos de 14 dias. Una semana después, los ratones se inyectaron subcutáneamente con 5 x 103 células del melanoma B16. Los animales que se trataron del mismo modo, pero que no recibieron el AcM 1E10, se usaron como controles. Las curvas de sobrevida de Kaplan-Meyer se muestran en la Figura 8, en la cual se muestra que la sobrevida es significativamente mejor en el grupo inmunizado con el AcM anti-IdP3 1E10 que en el grupo control.
Ratones C57BL/6 se inocularon por via intravenosa con 50 x 103 células del tumor de Lewis (cáncer de pulmón) . Catorce dias después, 10 μg de 1E10 se administró por via intravenosa y 6 dias después, los ratones se sacrificaron y el número de metástasis pulmonares fue contado. Animales tratados con un AcM IgG irrelevante o que recibieron únicamente PBS, fueron empleados como controles. Siete de los 10 animales tratados con AcM anti-P3 1E10 no desarrollaron metástasis de pulmón, en los otros 3 animales el número total máximo de metástasis fue 3. En contraste, todos los animales tratados con el IgGl irrelevante o los que únicamente recibieron PBS desarrollaron metástasis de pulmonares. Estos resultados indican que el tratamiento con este AcM anti-Id tipo gamma produjo un efecto protector contra tumores. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS: Figura 1: Muestra la reactividad del AcM anti-IdP3 1E10 contra los AcMs anti-gangliósidos P3, El, A3 y F6.
Figura 2: Muestra los resultados de un ensayo de inhibición donde el AcM P3 se incubó con el AcM anti-IdP3 1E10, y luego la reactividad del AcM P3 al NeuGcGM3 es medida por ELISA.
Figura 3: Muestra la reactividad de sueros de un mono con los fragmentos F(ab')2 del AcM 1E10 medida por ELISA, después que el animal recibiera dosis diferentes del AcM anti-Id 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio. Figura 4: Muestra los resultados de un ensayo de inhibición, donde se determinó la reactividad mediante ELISA de un suero de mono no pre-adsorbido con el AcM 1E10 (-B-)y no pre-adsorbido con un AcM irrelevante del mismo isotipo ior C5 (-•-) , asi como la reactividad de dicho suero pre- adsorbido al AcM 1E10 (-Q-) y al AcM ior C5 (-O-) , empleando una dilución del suero de 1/20,000. Las flechas tiempo de inmunización y las lineas continuas el momento en que se obtienen muestras del suero del animal.
Figura 5: Muestra la inhibición de la unión del AcM P3 al
AcM anti-Id 1E10 por el suero de un mono inmunizado con el AcM 1E10, determinada por ELISA. Las flechas indican tiempo de inmunización y las líneas continuas el momento en que se obtienen muestras del suero del animal.
Figura 6: Muestra la cinética de la respuesta de anticuerpos IgG e IgM contra el AcM 1E10 en el suero de un mono inmunizado con el AcM anti-idiotipo, determinado por ELISA. Las flechas indican tiempo de inmunización y las líneas continuas el momento en que se obtienen muestras del suero del animal.
Figura 7: Muestra el reconocimiento de fragmentos F(ab')2 del AcM 1E10 por el suero de mono pre-inmune; por el suero obtenido después que el mono recibió la última dosis del AcM anti-idiotipo 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio (indicado con la flecha), y por el suero obtenido 4 meses después que el animal recibió la última inmunización. Figura 8: Curvas de sobrevida de Kaplan-Meyer en ratones tratados con el AcM antι-IdP3 1E10 e inoculados con células de melanoma B16.

Claims

REIVINDICACIONES :
1 . Anticuerpo monoclonal anti-idiotipo obtenido contra anticuerpos murmos anti-gangliosidos portadores de acido siálico N-glicolilado .
2. Anticuerpo monoclonal anti-idiotipo según la reivindicación 1 donde el anticuerpo muπno anti- gangliosidos N-glicolilados empleado como inmunogeno es el anticuerpo monoclonal designado como P3 producido por el hibridoma depositado bajo el numero de acceso ECACC 94113026.
3. Anticuerpo monoclonal anti-idiotipo según las reivindicaciones 1 y 2 capaz de inducir una respuesta anti-idiotipica predominante en animales xenogenicos y que ejerce un efecto protector contra tumores.
4. Anticuerpo monoclonal anti-idiotipo según las reivindicaciones anteriores donde dicho anticuerpo monoclonal anti-idiotipo es una mmunoglobulma tipo gamma .
5. Anticuerpo monoclonal anti-idiotipo según las reivindicaciones anteriores donde dicho anticuerpo monoclonal se identifica como 1E10.
6. Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 5 depositado el 29 de Noviembre de 1997 ba o el numero de acceso 97112901, en el Centro para la Microbiología Aplicada (CAMR) & Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), UK.
7. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-idiotipo según las reivindicaciones de la 1 a la 5, con un diluente, un adyuvante o una molécula transportadora apropiados .
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7 para ser usada en el tratamiento de neoplasias malignas.
PCT/CU1998/000007 1997-10-21 1998-10-21 Anticuerpos monoclonales anti-idiotipos, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, y composiciones que los contienen Ceased WO1999020656A1 (es)

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