WO1999027355A1 - Verfahren zur bildung lateral organisierter strukturen auf trägeroberflächen - Google Patents

Verfahren zur bildung lateral organisierter strukturen auf trägeroberflächen Download PDF

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Vladimir M. Mirsky
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
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    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays

Definitions

  • the present invention relates to an arrangement on the carrier surface of which molecular layers are immobilized in an electrically addressable manner, a method for electrically addressable immobilization of molecules, a device for carrying out this method and the use of this arrangement as a chemical and / or biosensor, in particular as a multi-sensor system for chemical , biological and physical determinations and for applications in combinatorial synthesis at the interface.
  • Both chemical sensors and biosensors i.e. Comparatively small measuring arrangements are increasingly required to carry out chemical or biochemical analyzes quickly and at the scene. They are of particular advantage to immunological detection systems because they are able to record, for example continuously, concentrations of (bio) chemical substances in a short time and oline complex sample preparation, preferably continuously.
  • a biosensor should therefore be small, which gives another advantage of the application due to the proximity to the location of the examination, e.g. diabetics can determine their blood sugar level in a few minutes with the help of enzymatic biosensors.
  • the immobilization methods known above have many disadvantages which limit the applicability of the methods.
  • the resolution of the micromechanical immobilization limited by the size of the individual spray particles.
  • an optical resolution of approx. 100 ⁇ m is achieved in the best case.
  • protective groups must always be used which require compliance with certain conditions (for example solvents, darkening due to photosensitivity and the like) and which have to be split off again at a certain point in time.
  • the Chrisey et al. (1996) is very time-consuming and costly since a large number of photomasks have to be used.
  • One solution to this problem is to provide an arrangement with electrically addressable immobilized molecules which has a support, one and / or more (1 to n) electrically conductive support surface (s) which is / are arranged on this support and one and / or several immobilized identical and / or different receptor (s).
  • the electrodes are separately assigned either an adsorption potential or a desorption potential, the uncoated electrode locations being kept inert by the desorption potential and the adsorption potential still applied to the already coated electrode locations preventing the desorption of molecules as well as the further adsorption of differently structured molecules, whereby the electrode site is occupied by the first type of molecule and the molecules are immobilized and firmly attached to the support surface and
  • the process is complete when a constant signal value is reached. e.g. Capacitance, impedance, or resonance frequency value.
  • the advantage of the inventive method is that the potential can be controlled within and outside the potential stability range, the desorption or adsorption of molecules with the ⁇ nde ⁇ * ing. With this principle it is possible to build up a certain lateral structure of the chemically adsorbed layer.
  • This method can be carried out with the device according to the invention, which consists of a changing device (1) for sample containers.
  • a pump (2) a flow cell (3) into which the desired molecule or receptor or into which the desired molecules or receptors are transported by means of the pump (2), a support (5) on which n electrodes are arranged, the support (5 ) with the n electrodes in the flow-through cell (3), a multiplexer (6), an address bus (7) which controls the multiplexer (6), whereby to the electrode (s) separately either an adsorption potential (8) or a desorption potential (9).
  • a changing device (1) for sample containers.
  • a pump (2) a flow cell (3) into which the desired molecule or receptor or into which the desired molecules or receptors are transported by means of the pump (2)
  • a support (5) on which n electrodes are arranged the support (5 ) with the n electrodes in the flow-through cell (3)
  • a multiplexer (6) an address bus (7) which controls the multiplexer (6), whereby to the
  • Reference electrode (10) is / are applied, and a collecting vessel (4), in which after the immobilization of the molecules by means of the
  • the arrangement according to the invention is used as a chemical and / or biosensor. used in particular as a multi-sensor system.
  • the arrangements according to the invention with the electrically addressable immobilized molecules can also be used for combinatorial synthesis by specifically releasing molecules bound on the electrode surface, which may be identical or different depending on the electrode, by applying the desorption potential and thus as a reaction partner during the system step supplies or if the synthesis was carried out on the surface, the products can be split off directly.
  • Electrodes of any size, shape and number are used for the electrically addressable immobilization, which are applied to a carrier made of a dielectric material. In this dielectric material, electrical leads for sensor spots can optionally be used be introduced. Immobilization takes place according to the schemes shown in FIGS. 1 and 2, which are described below. During the immobilization, different receptors (molecules A, B, C, etc.) that contain one or more thiol groups are specifically bound to different electrodes (/, 2, 3, etc.): receptor A on electrode El, receptor B on Electrode E2, etc. To achieve these bonds, the procedure is as follows: A suitable electrode potential (adsorption potential) is applied to electrode El in liquid electrolyte compared to a reference electrode which supports the binding with thiol groups.
  • a suitable electrode potential adsorption potential
  • the other electrodes (2, 3, etc.) are given an electrode potential (desorption potential) with respect to the same reference electrode, which is sufficient. to suppress the binding of the thiol groups to these electrodes. Therefore, the added receptor molecule A is only bound to the electrode El. Then the receptor molecules A in the liquid electrolyte are replaced by a liquid electrolyte solution with receptor molecules B and these molecules are addressed to the subsequent electrode position 2. Due to the bending of the desorption potential, the uncoated electrode positions are kept inert. The adsorption potential that is still applied to the already coated electrode sites prevents the desorption of molecules as well as the further adsorption of differently structured molecules because the electrode site is completely occupied by the first type of molecule. This process is repeated until the sensor arrangement is completely set up. A firm bond is formed between the immobilized molecule and the electrode. It is thus possible to generate a biosensor or a multisensor system (“.A ⁇ ay”) with any molecular structure.
  • one or more molecular layers for example antibodies, DNA strands via functional groups
  • one or more molecular layers can be attached to any number of (0 to n) electrodes on which the receptors are located, can be chemically and / or physically adsorbed and / or immobilized.
  • the adsorption potential is maintained for all coated electrodes and the liquid electrolyte solution of the molecules to be coupled is simultaneously pumped into the flow cell with a coupling reagent.
  • the coupling reagent can also be added first and after the activation of the base layer (s) the molecules to be coupled are added.
  • the coupling reagent can be dispensed with, for example with the avidin-biotin system, Ni-His tag, hydrophobic-hydrophobic interactions of liposomes with unfunctionalized alkane thiol chains.
  • rinsing with liquid electrolyte is carried out in order to remove unused or deactivated coupling reagent and / or non-coupled molecules from the cell.
  • this process can be repeated several times until the desired sensor structure is reached step by step.
  • two or more electrodes of the multi-sensor system can be coated with the aid of the adsorption potential and, if necessary, modified with a subsequent physical or chemical adsorption or coupling with one or more identical or different molecular layers certain electrodes have the desorption potential, after the desorption and washing out of the desorbed molecules another coating of these electrodes can be carried out, according to the method described above, this process can be repeated until the desired multisensor arrangement is produced.
  • Particularly suitable coupling reagents are carbodiimides and their derivatives, and N-succinimides and their derivatives.
  • any solid dielectric substrate in particular silicon, glass, non-conductive plastic such as Teflon, PVC, PE, and a conductive or semiconductive substrate which is insulated from the electrode (s) by a dielectric layer is suitable as a carrier.
  • Thin conductive materials that are firmly bonded to the carrier are used as electrodes.
  • Au, Pd, Pt, Ag, alloys such as Au / Pd, Au / Ag, Ag / Pd, GaAs and the like are particularly suitable, doped semiconductors and any other conductive or semiconducting inorganic or organic material such as TCNQ, TTF.
  • the electrodes generally used in electrochemistry such as Ag / AgCl etc. with and without a salt bridge, are used as reference electrodes.
  • Molecules whose binding to the electrodes can be controlled by the electrode potential are used as receptors which are bound to electrodes by means of the method for electrically addressable immobilization according to the invention.
  • These molecules have at least one thiol group or are coupled to at least one thiol group or have a sulfide or disulfide group. They are selected from the group consisting of HS- (CH 2 ) n -X, where n is a number from 2 to 24 and X is H. OH, SH, CH 3 , COOH, NH 2 , and any other molecular fragment stand,
  • Oligonucleotides DNA, RNA, viruses, bacteriophages, prions, oligosaccharides, natural and artificial receptors, redox-active substances, dyes, acids.
  • Bases, epitopes, antigens or antibodies which have at least one thiol group or are coupled to at least one thiol-containing compound.
  • These receptors can also have sulfide or disulfide groups.
  • the thiol groups can either be present originally in such molecules or they can only be introduced by chemical modification.
  • the S atom of the thiol group in all of the compounds mentioned above can be replaced by a Se atom.
  • the molecules that can additionally be arranged on the receptors are selected from the group consisting of toxins.
  • Hormones hormone receptors, peptides, proteins, enzymes, enzyme substrates, cofactors. Medicines, lectins, sugar. Oligonucleotides, DNA, RNA, viruses, bacteriophages, prions, oligosaccharides, natural and artificial receptors, redox-active substances, dyes, acids, bases, epitopes, antigens or antibodies that have at least one functional group or are capable of using the adsorbed receptor interactions, whereby they can be chemically and / or physically adsorbed and / or immobilized on the electrode (s).
  • An adsorption potential is understood to mean an electrical potential in which the binding of the electrode to the molecule is supported and / or maintained.
  • the adsorption potential is at pH values within a range from 4.0 to 8.0 in the range from 0 mV to +600 mV compared to the Ag / AgCl electrode in 100 mM KCI, preferably approximately +300 mV. This potential range is shifted at alkaline pH.
  • desorption potential means a potential outside the stability range defined above.
  • the desorption potential must be high enough to adsorb molecules used during the immobilization process. to prevent.
  • the desorption potential is at a pH within a range from 4.0 to 8.0 in the range from -300 mV or lower compared to the Ag / AgCl electrode in 100 mM KCI. preferably in the range from -600 mV to -1800 mV, in particular in the range from -800 mV to -1400 mV.
  • aqueous solutions organic electrolytes and mixtures thereof as well as a mixture of aqueous electrolytes and organic solvents or organic electrolytes and organic solvents can be used as electro-solutions.
  • Figure 1 shows schematically the device for performing the method for electrically addressable immobilization.
  • FIG. 2 shows the procedure for the electrically addressable coating of a chemo and / or biosensor, in particular a multisensor system (“arrays”) with n individual electrodes, where n is an integer.
  • FIG. 3 shows the reduction in capacity (as a function of time) of an uncoated gold electrode during the adsorption of 6-mercaptohexanoic acid at an electrode potential of +300 mV compared to an Ag / AgCl electrode in 100 mM KCI.
  • FIG. 4 shows the changes in capacitance of an uncoated gold electrode during several cycles of the adsorption / desorption of octanethiol at an electrode potential of -1400 mV compared to an Ag / AgCl electrode in 100 mM KCI. A final rinse completely removes the adsorbed thiol.
  • FIG. 5 shows the change in capacitance of an uncoated gold electrode, to which the desorption (-1400 mV) and adsorption potential (+300 mV) compared to an Ag / AgCl electrode in 100 mM KCI were applied. The adsorption of 6-mercaptohexanoic acid was monitored at both potentials.
  • FIG. 6 shows the changes in capacity of an arrangement consisting of two gold electrodes, in which the electrically addressable immobilization of 6-mercaptohexanoic acid and octanethiol was carried out at electrode potentials of +300 mV and -1400 mV compared to an Ag / AgCl electrode in 100 mM KCI.
  • FIG. 7 shows the change in capacitance of HSA immunosensors when the antigen is added, each symbol type representing a sensor.
  • the device shown in Figure 1 consists of a changing device (1) for sample containers and a pump (2) which transports the desired molecules or receptors into the flow cell (3).
  • n electrodes are arranged on a carrier (5).
  • Either an adsorption potential (8) or a desorption potential (9) is applied separately to these electrodes by means of a multiplexer (6), which is controlled by an address bus (7), with respect to a reference electrode (10).
  • the excess molecules are pumped into a collecting vessel (4) by means of the pump (2).
  • FIG. 2 shows the individual steps of the electrically addressable immobilization of x molecules on n electrodes in detail.
  • (11) represents the addition of a thiol-containing molecule
  • (12) the adsorption of this molecule
  • (13) the rinsing with electrolyte solution.
  • Molecule A is transported into the cell (3) via the pump (2).
  • the molecule A adsorbs on the electrode El, to which the adsorption potential is applied.
  • chemical adsorption on electrodes E2 to En is prevented by the deodorization potential applied there.
  • the adsorption is monitored by means of capacity measurements.
  • the adsorption of molecule A is complete and the cell can be rinsed with electrolyte solution.
  • the electrode potentials are changed in such a way that the adsorption potential is maintained at El and the desorption potential is retained at electrodes E3 to En.
  • the electrical potential is changed by applying the adsorption potential.
  • the molecule B is transported into the cell from the changing device (1) by means of the pump (2). There molecule B only absorbs on E2, because El is already coated with molecule A and the deodorization potential is applied to the electrodes E3 to En. The cleaning is carried out as described above.
  • the coating of the electrodes E3 to En with the molecules C to X is carried out analogously to the electrodes E1 and E2.
  • FIGS 3 to 5 show the changes in capacitance in the electrically addressable
  • Electrodes labeled with ultrapure water and chloroform An aqueous was used as the electrolyte phosphate-buffered KCl solution (100 mM) of pH 6.7 was used.
  • the figures also show the specific capacitance values.
  • the complete removal of the thiols adsorbed at - 1400 mV during the rinsing shows that these molecules were only physically adsorbed on the gold electrode (FIG. 4).
  • the majority of the thiols adsorbed at +300 mV was chemically adsorbed and therefore stable against the rinsing.
  • Figure 6 shows the result with a two-electrode system.
  • Aqueous phosphate-buffered KCl solution 100 mM of pH 6.7 was used as the electrolyte.
  • the addition of 6-mercaptohexanoic acid (16) and the rinsing (15) were carried out at electrode potentials of +300 mV (adsorption potential) for electrode El and -1400 mV (desorption potential) for electrode E2.
  • the addition of octanthiol (14) was carried out for both electrodes at electrode potentials of +300 mV.
  • the electrically addressable immobilization enables the construction of a multi-sensor system that is used, for example, in clinical diagnostics or chemical-biological analysis, e.g. High-throughput screening, can be used. Through the targeted construction of individual electrodes, an ensemble tailored to the user can be produced.
  • enzyme activities in electrolyte solutions or biological liquids, such as blood, urine and the like can be determined.
  • the activity of phospholipase A 2 can be determined by adding a liposome layer to an unmodified alkanethiol monolayer by hydrophobic-hydrophobic interactions. eg hexadecanethiol or octanethiol binds. If phospholipase A 2 is now present in the cell, the lipids are broken down. This can be demonstrated by increasing the capacity signal.
  • Another multi-sensor system can represent the combination of different affinity sensors. Detection of an excess of human serum albumin (HSA) in the urine, a Signs of microalbuminuria, one can use sensors that are constructed as follows.
  • HSA human serum albumin
  • FIGS. 3 to 7 show that it has been possible to adsorb different molecules on specific electrodes by means of electrically addressable immobilization and / or to desorb and / or immobilize. Furthermore it could be shown that the electrodes can be used as a multi-sensor in a system. It has also been possible to provide a detection system with which substances can be detected both quantitatively and qualitatively.
  • Silicon wafer pieces with a size of 3.20 mm x 10.02 mm and a thickness of 450 microns were in a general sputtering process with a gold electrode size 1.56 mm x 1.56 mm (reactive surface) and a lead 10 ⁇ m wide and 6.65 mm long.
  • the electrode was built up from a titanium and palladium layer (adhesion promoter, each 50 ⁇ m thick) and a covering gold layer (200 nm).
  • a silver-plated wire was soldered onto the upper end of the leads as a contact point for the measuring system.
  • the wafer plates were visually checked for damage using a reflected light microscope. The cleaning was done in several steps. First, the wafers were completely immersed in chloroform for 30 minutes.
  • the wafers were immersed in a 1: 1 (v / v) mixture of chloroform and methanol and treated in an ultrasound bath for 10 minutes. Analogous to the chlorofo ⁇ n used, ethanol (99%) and a mixture of ethanol and methanol can also be used in these cleaning steps.
  • the wafers were dried and immersed in a hot 3: 1 (v / v) mixture of concentrated sulfuric acid and 30% hydrogen peroxide solution for 5 minutes. In the last two steps, care was taken that only the reactive electrode surface and a maximum of 4.50 mm of the feed line were immersed in the mixture. The electrodes were thoroughly rinsed with ultrapure water (Millipore: Mili.Qp ⁇ us -185; 18.2 M ⁇ cm "1 ) and dried. All glass and Teflon devices were carefully cleaned according to the previous description before use.
  • the wafer with the sputtered gold electrode was fastened together with an Ag / AgCl reference electrode (surface area approx. 1 cm 2 ) to a Teflon holder, which served as a cover for the measuring cell (snap cover glass, 40 mm x 19 mm) and an opening for the addition and removal of liquids.
  • the cell was filled with electrolyte (100 mM KCI; pH 6.7; approx. 3 ml) until the reactive surface of the gold electrode and the reference electrode (Ag / AgCl) were completely immersed.
  • a magnetic stirrer ensured uniform mixing.
  • a lock-in amplifier with an integrated sine wave generator a constant sinusoidal signal with a frequency of 20 Hz and an amplitude of 10 mV.
  • the adsorption potential (+300 mV) was maintained and as much 6-mercaptohexanoic acid dissolved in the electrolyte was added that the concentration in the measuring cell was 50 ⁇ mol / 1.
  • the adsorption started immediately and was complete after approx. 2.5 hours (compare FIG. 3).
  • the half-life of the coating was approximately 10 minutes and the absolute capacitance value was 4.3 ⁇ F / cm 2, comparable to that of a gold electrode coated in chloroform or ethanol (1 mM 6-mercaptohexanoic acid).
  • the measuring cell was opened, the gold electrodes were rinsed with ultrapure water and immersed in chloroform for about 5 seconds in order to remove physically adsorbed thiol from the electrodes.
  • the reference electrode, measuring cell and stirrer were thoroughly cleaned with ultrapure water, chloroform, ethanol and acetone to remove 6-mercaptohexanoic acid.
  • the quality of the coating was then checked by measuring the capacitance again. Only a slight increase in capacity (1-2%) compared to the previously obtained values was measured.
  • a deodorization potential of -1400 mV was applied to the gold electrode and the stability of the capacitance value was awaited. Then so much octanethiol was added that there was a concentration of 250 ⁇ mol / 1 in the cell. The following decrease in capacity after 2 hours was approximately 30% with a half-life of 45 minutes (see FIG. 4).
  • the absolute capacitance value of 7.8 ⁇ F / cm 2 was significantly larger than that of the gold electrode, which had been coated while applying the adsorption potential. After cleaning the electrode with ultrapure water and chloroform (5 seconds), it was found that the decrease in capacity was only due to physically adsorbed thiol, because the initial values of 12-14 ⁇ F / cm 2 were reached again. The physical adsorption and the subsequent cleaning step were repeated several times and always gave the same result.
  • a deodorization potential of -1400 mV was applied to the gold electrode and the setting of a stable capacitance value was awaited. Sufficient 6-mercaptohexanoic acid dissolved in the electrolyte was then added to a concentration of 50 ⁇ mol / l in the measuring cell. The reduction in capacity was about 7% after 1 hour (see FIG. 5). The applied deodorization potential has now been replaced by the adsorption potential (+300 mV). The decrease in capacity caused by the change in potential was overlaid by the immediately beginning adsorption and could not be determined. After about 2 hours the adsorption was complete (half-life 8 minutes) and the absolute capacitance (4.9 ⁇ F / cm 2 ) was comparable to a gold electrode coated in organic solution. By cleaning the electrode with ultrapure water and ethanol (10 seconds), no adsorbed thiol was removed.
  • Silicon wafer pieces with a size of 3.20 mm x 10.02 mm and a thickness of 450 microns were in a common sputtering process with two gold electrodes
  • the electrode was built up from a titanium and palladium layer (adhesion promoter, each 50 nm thick) and a covering gold layer (200 nm). The distance between the electrodes was 1.56 mm. The attachment of the contact point and the cleaning process were carried out analogously to the method described above.
  • the wafer with the two gold electrodes was attached together with an Ag / AgCl reference electrode (surface area approx. 1 cm 2 ) to a Teflon holder, which served as a lid for the measuring cell (a snap-lid glass. 40 mm x 19 mm) and an opening for the Had addition and removal of liquids.
  • the cell was filled with electrolyte (100 mM KCI; pH 6.7; approx. 3 ml) until the reactive surface of the gold electrodes and the reference electrode (Ag / AgCl) were completely immersed.
  • a magnetic stirrer ensured uniform mixing.
  • a lock-in amplifier with an integrated sine generator generated a constant sine signal with a frequency of 20 Hz and an amplitude of 10 mV.
  • Electrode El measured. The potential of +300 mV applied to electrode E2 was shifted to - 1400 mV. There were changes in capacitance at electrode El due to this
  • the measuring cell is set up and filled with fresh electrolyte.
  • the absolute capacitance values were measured again.
  • the electrode El coated with 6-mercaptohexaanoic acid had a value of 4.2 ⁇ F / cm 2 .
  • the second electrode was followed during the second coating step.
  • octanthiol concentration in the cell 150 ⁇ mol / 1
  • the absolute capacitance values of the two gold electrodes were 1.4 ⁇ F / cm 2 for electrode E2 and 4J ⁇ F / cm 2 for electrode El.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung, auf deren Trägeroberfläche molekulare Schichten elektrisch adressierbar immobilisiert sind, ein Verfahren zur elektrisch adressierbaren Immobilisierung von Molekülen, eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens und die Verwendung dieser Anordnung als Chemo- und/oder Biosensor, insbesondere als Multisensorsystem für chemische, biologische und physikalische Bestimmungen und für Anwendungen in der kombinatorischen Synthese an der Grenzfläche.

Description

Verfahren zur Bildung lateral organisierter Strukturen auf Trägeroberflächen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung, auf deren Trägeroberfläche molekulare Schichten elektrisch adressierbar immobilisiert sind, ein Verfahren zur elektrisch adressierbaren Immobilisierung von Molekülen, eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens und die Verwendung dieser Anordnung als Chemo- und/oder Biosensor, insbesondere als Multisensorsystem für chemische, biologische und physikalische Bestimmungen und für Anwendungen in der kombinatorischen Synthese an der Grenzfläche.
Sowohl Chemsensoren als auch Biosensoren, d.h. vergleichsweise kleine Meßanordnungen, werden immer häufiger benötigt, um chemische oder biochemische .Analysen rasch und am Ort des Geschehens durchzufüliren. Sie sind insbesondere den immunologischen Nachweissystemen im Vorteil, da sie in der Lage sind, beispielsweise Konzentrationen von (bio)chemischen Stoffen in kurzer Zeit und oline aufwendige Probenvorbereitung, vorzugsweise kontinuierlich zu erfassen. Ein Biosensor sollte deshalb klein sein, wodurch ein weiterer Vorteil der Anwendung durch die Nähe zum Ort der Untersuchung gegeben ist, z.B. können Diabetiker ihren Blutzuckerspiegel mit Hilfe enzymatischer Biosensoren in wenigen Minuten bestimmen.
Chemo- bzw. Biosensorik bedeutet also sowohl erkennen als auch quantifizieren. Der Prozeß der molekularen Erkennung spielt z.B. in der Biologie eine entscheidende Rolle. Ein Zelle muß beispielsweise das Kaliumion erkennen und darf es nicht mit dem sehr ähnlichen Natriumion verwechseln, das Enzym Glucosedehydrogenase darf nur Glucose abbauen, aber nicht Fructose und das Immunsystem muß eingedrungene Feinde als solche erkennen, bevor es sie angreift. Für die Entwicklung von Chemo- und Biosensoren braucht man also Moleküle, die das Ziel erkennen. Gleichzeitig müssen die vielen anderen ebenfalls vorhandenen Stoffe ignoriert werden. Ein Biosensor muß also die Voraussetzung erfüllen, daß der Vorgang der Erkennung/Bindung nachgewiesen und in ein meßbares Signal ..übersetzt" werden kann. Diese „Übersetzung" stößt jedoch auf Schwierigkeiten, so daß ein Bedarf an einem einfach durchführbaren Nachweissystem besteht. Bei Systemen, die als Monosysteme eingesetzt werden, ist eine Immobilisierung der Moleküle nicht notwendig, da nur eine einzige Spezies erkannt und nachgewiesen werden soll. Will man jedoch multiple Systeme einsetzen, beispielsweise Multisensorsysteme mit denen verschiedene Moleküle gleichzeitig nachgewiesen werden sollen, ist es erforderlich, die molekularen Schichten immobilisiert auf der Trägeroberfläche zu adressieren, damit eine Signalerkennung nachgewiesen werden kann. Ein solches System ist aus dem Stand der Technik nicht bekannt.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren für die adressierbare Immobilisierung bekannt, mit deren Hilfe mehrere verschiedene Molekültypen gezielt auf einer Trägeroberfläche gebunden werden können. Yershov et al. (Yershov, G., Barsky, V., Belgovskiy, A.. Kirillov, E., Kreindlin, E., Ivanov, I., Parinov, S., Guschin. D., Drobishev, A., Dubiley, S., Mirzabekov. A., Proc. Natl. Acad. Sei. 43, (1996) 4913-4916) sowie Blanchard et al. (Blanchard, A.P.. Kaiser. R.J.. Hood, L.E.. Biosens. & Bioelectron. 11, (1996) 687-690) beschreiben die Verwendung dieser Technik beispielsweise zur Herstellung von DNA-Arrays. Darüber hinaus werden sie für die mikromechanische Adressierbarkeit und die optische Adressierbarkeit eingesetzt. Aus dem US-Patent Nr. 54 12 087 ist bekannt, daß die optische Immobilisierung durch die Verknüpfung funktioneller Gruppen mit photolabilen Schutzgruppen erfolgt. Die Aktivierung des Systems erfolgt durch Abspalten der Schutzgruppe mittels Photolyse. Chrisey et al. (Chrisey, L.A., O'Ferall, E., Spargo, B.J., Dulcey, C.S., Calvert, J.M., Nucl. Acids Res. 24, (1996) 3040-3047) beschreiben eine weitere Möglichkeit, die darin besteht, daß die Adsorption unter Verwendung der Photoresist-Technik durchgeführt wird.
Die oben gekannten Immobilisierungsverfahren weisen jedoch viele Nachteile auf, die die Anwendbarkeit der Verfahren einschränken. So ist z.B. die Auflösung der mikromechanischen Immobilisierung durch die Größe der einzelnen Sprühpartikel limitiert. Bei dem oben beschriebenen Verfahren von Yershov et al. (1996) und Blanchard et al. (1996) wird im besten Fall eine optische Auflösung von ca. 100 μm erreicht. Bei der optischen Immobilisierung gemäß dem US-Patent Nr. 54 12 087 muß immer mit Schutzgruppen gearbeitet werden, die die Einhaltung bestimmter Bedingungen (z.B. Lösungsmittel, Abdunklung wegen Lichtempfindlichkeit und dgl.) erfordern und die zu einem bestimmten Zeitpunkt wieder abgespalten werden müssen. Die oben genannte Photorestist-Methode von Chrisey et al. (1996) ist sehr zeit- und kostenaufwendig, da eine große Anzahl von Photomasken verwendet werden muß.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es. eine Anordnung bereitzustellen, die in der Lage ist, sowohl Moleküle zu binden als auch zu erkennen und damit qualitativ und quantitativ bestimmbar zu machen. Ein weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, bei der Moleküle auf einfache Weise auf Oberflächen elektrisch adressierbar immobilisiert oder desorbiert werden können, um damit die genannten Nachteile vermeiden zu können. Darüber hinaus ist es eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung, eine neue Vorrichtung zur Durchfülirung des erfindungsgemäßen Verfahrens und damit zur Herstellung der erfindungsgemäßen .Anordnung zu liefern.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung einer Anordnung mit elektrisch adressierbaren immobilisierten Molekülen, die einen Träger, eine und/oder mehrere (1 bis n) elektrisch leitende Trägeroberfläche(n), die auf diesem Träger angeordnet ist/sind und einen und/oder mehrere immobilisierte(n) identische und/oder verschiedene Rezeptor(en), umfaßt.
Obwohl bekannt ist. daß die chemische Adsorption von Molekülen auf eine Elektrode durch Veränderungen des angelegten chemischen Potentials beeinflußt werden kann und diese Potentialabhängigkeit auch für die chemische Adsorption von Thiolverbindungen auf Elektroden gilt, wurden nun die Bedingungen untersucht, bei denen beispielsweise die Gold- Schwefel-Bindung stabil ist. Überraschenderweise konnte jedoch nachgewiesen werden, daß eine chemisch adsorbierte Molekularschicht auf einer Elektrode nur innerhalb eines bestimmten pH-abhängigen Potentialbereichs stabil ist. Diese Ergebnisse gehen weit über die Erkenntnisse hinaus, die in der Literatur von Imabyashi et al. beschrieben sind (Imabyashi, S., Iida, M., Hobara, D., Feng, Z.Q., Niki, K., Kakiushi, T., J. Electroanal. Chem., 428 (1997), 33-38).
Die Lösung der Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung einer aAnordnung der oben beschriebenen hxX bereitzustellen, besteht darin, daß Moleküle in einfacher aArt auf Oberflächen adressierbar immobilisiert werden. Dieses Verfal ren besteht aus den Schritten:
(a) ein Träger mit n Elektroden, wobei n eine ganze Zahl ist, wird in eine Durchflußzelle, in der sich Elektrolytlösung zusammen mit den zu immobilisierenden Molekülen (Rezeptoren), befindet, eingebracht,
(b) die Elektroden werden separat entweder mit einem Adsorptionspotential oder einem Desorptionspotential belegt, wobei durch das Desorptionspotential die unbeschichteten Elektrodenplätze inert gehalten werden und das an den bereits beschichteten Elektrodenplätzen weiterhin angelegte Adsorptionspotential verhindert die Desorption von Molekülen ebenso wie die weitere Adsorption anders strukturierter Moleküle, wodurch erreicht wird, daß der Elektrodenplatz mit dem ersten Molekültyp besetzt ist und die Moleküle immobilisiert werden und fest an der Trägeroberfläche gebunden sind und
(c) die Adsorption von Molekülen an der/den Elektrode(n) als Signaländerung zu messen.
Das Verfahren ist abgeschlossen, wenn ein konstanter Signalwert erreicht ist. z.B. Kapazitäts-, Impedanz- oder Resonanzfrequenzwert.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß mit der Ändeι*ung des Potentials innerhalb und außerhalb des Potentialstabilitätsbereichs die Desorption oder Adsorption von Molekülen gesteuert werden kann. Mit diesem Prinzip ist es möglich, eine bestimmte laterale Struktur der chemisch adsorbierten Schicht aufzubauen.
Dieses Verfahren kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden, die aus einer Wechselvorrichtung (1) für Probenbehälter. einer Pumpe (2), einer Durchflußzelle (3), in die das gewünschte Molekül oder der Rezeptor oder in die die gewünschten Moleküle oder Rezeptoren mittels der Pumpe (2) transportiert werden, einem Träger, (5) auf dem n Elektroden angeordnet sind, wobei sich der Träger (5) mit den n Elektroden in der Durchflußzelle (3) befindet, einem Multiplexers (6), einem Adreßbus (7), der den Multiplexer (6) steuert, wodurch an die Elektrode(n) separat entweder ein Adsorptionspotential (8) oder ein Desorptionspotential (9). gegenüber einer
Referenzelektrode (10) angelegt wird/werden, und einem Auffanggefäß (4), in das nach erfolgter Immobilisierung der Moleküle mittels der
Pumpe (2) die überschüssigen Moleküle gepumpt werden, besteht.
Die erfindungsgemäße Anordnung wird als Chemo- und/oder Biosensor. insbesondere als Multisensorsystem verwendet.
Diese Verwendung wird vorteilhafterweise direkt im Probenmedium durchgefülrrt. so daß die Bestimmung und/oder der Nachweis in einfacher Weise durch die Messung einer Signaländerung, insbesondere Kapazität. Impedanz. Resonanzfrequenz gelingt. Damit wird ein System bereitgestellt, mit dem die oben geschilderten Probleme und Nachteile, der aus dem Stand der Technik bekannten Systeme, überwunden werden.
Die erfindungsgemäßen Anordnungen mit den elektrisch adressierbar immobilisierten Molekülen können auch für die kombinatorische Synthese eingesetzt werden, indem man auf der Elektrodenoberfläche gebundene Moleküle, die je nach Elektrode identisch oder verschieden sein können, durch Anlegen des Desorptionspotentials gezielt freigibt und so als Reaktionspartner während des durchgeführten Systheseschritts zufuhrt oder wenn auf der Oberfläche die Synthese durchgeführt wurde, die Produkte direkt abgespalten werden können.
Für die elektrisch adressierbare Immobilisierung werden Elektroden beliebiger Größe, Form und ./Vnzahl verwendet, die auf einen Träger aus einem dielektrischen Stoff aufgebracht sind, in diesem dielektrischen Stoff können gegebenenfalls elektrische Zuleitungen für Sensorspots eingebracht sein. Die Immobilisierung erfolgt nach den in den Figuren 1 und 2 gezeigten Schemata, die weiter unten beschrieben werden. Bei der Immobilisierung werden verschiedene Rezeptoren (Moleküle A, B, C, usw.), die eine oder mehrere Thiolgruppen enthalten, gezielt auf verschiedene Elektroden (/, 2, 3, usw.) gebunden: Rezeptor A auf Elektrode El, Rezeptor B auf Elektrode E2, usw. Um diese Bindungen zu erreichen, wird wie folgt vorgegangen: An Elektrode El wird in flüssigem Elektrolyt ein geeignetes Elektrodenpotential (Adsorptionspotential) gegenüber einer Referenzelektrode angelegt, die die Bindung mit Thiolgruppen unterstützt. Gleichzeitig werden die anderen Elektroden (2, 3, usw.) mit einem Elektrodenpotential (Desorptionspotential) gegenüber derselben Referenzelektrode belegt, die ausreichend ist. um die Bindung der Thiolgruppen an diesen Elektroden zu unterdrücken. Deshalb wird das zugegebene Rezeptormolekül A nur an die Elektrode El gebunden. Anschließend werden die Rezeptormoleküle A in der flüssiger Elekrolyt durch eine flüssige Elektrolytlösung mit Rezeptormolekülen B ersetzt und diese Moleküle an den nachfolgenden Elektrodenplatz 2 adressiert. Durch das biege des Desorptionspotential werden die unbeschichteten Elekrodenplätze weiterhin inert gehalten. Das an den bereits beschichteten Elektrodenplätzen weiterhin angelegte Adsorptionspotential verhindert die Desorption von Molekülen ebenso wie die weitere Adsorption anders strukturierter Moleküle, weil der Elektrodenplatz mit dem ersten Molekültyp vollständig besetzt ist. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis die Sensoranordnung vollständig aufgebaut ist. Zwischen dem immoblisierten Molekül und der Elektrode bildet sich eine feste Bindung. Somit ist es möglich, einen Biosensor oder ein Multisensorsystem („.Aιτay") mit beliebiger molekularer Struktur zu erzeugen.
Ein weiterer Vorteil in dem erfindungsgemäßen Verfahren besteht darin, daß im Anschluß an die elektrisch adressierbare Immobilisierung eine oder melirere Molekülschicht(en), z.B. Antikörper, DNA-Stränge über funktionelle Gruppen an eine beliebige Anzahl von (0 bis n) Elektroden, auf denen sich die Rezeptoren befinden, chemisch und/oder physikalisch adsorbiert und/oder immobilisiert werden kann/können. Zu diesem Zweck wird für alle beschichteten Elektroden das Adsorptionspotential beibehalten und die flüssige Elektrolytlösung der zu koppelnden Moleküle gleichzeitig mit einem Kopplungsreagenz in die Durchflußzelle gepumpt. Alternativ dazu kann auch zuerst das Kopplungsreagenz zugegeben werden und nach erfolgter Aktivierung der Basisschicht(en) die zu koppelnden Moleküle zugegeben werden. Wenn die Moleküle in der Lage sind, selbständig an die adressierte Schicht zu binden, kann auf das Kopplungsreagenz verzichtet werden, z.B. beim Avidin- Biotin-System, Ni-His-tag, hydrophoben-hydrophoben Wechselwirkungen von Liposomen mit unfunktionalisierten Alkanthiolketten. Nach erfolgter chemischer oder physikalischer Bindung mit der/den Basisschichten wird mit flüssigem Elektrolyt gespült, um nicht verbrauchtes oder deaktiviertes Kopplungsreagenz und/oder nicht gekoppelte Moleküle aus der Zelle zu entfernen. Dieser Vorgang kann je nach Einsatzgebiet des Detektorsystems mehrmals wiederholt werden, bis schrittweise die gewünschte Sensorstruktur erreicht wird.
.Analog zu dieser Anwendung können zwei oder mehrere Elektroden des Multisensorsystems (,,Arrays") mit Hilfe des Adsorptionspotentials beschichtet werden und gegebenenfalls mit einer anschließenden physikalischen oder chemischen Adsorption oder Kopplung mit einer oder mehreren identischen oder verschiedenen Molekülschichten modifiziert werden. Legt man nun an bestimmten Elektroden das Desorptionspotential an, kann/können nach Desoφtion und Auswaschen der desorbierten Moleküle eine andere Beschichtung dieser Elektroden, nach dem oben beschriebenen Verfahren, vorgenommen werden. Dieser Vorgang kann solange wiederholt werden, bis die gewünschte Multisensoranordnung hergestellt ist.
Als Kopplungsreagentien eignen sich insbesondere Carbodiimide und deren Derivate sowie N-Succinimide und deren Derivate.
Mit den oben beschriebenen Systemen ist es möglich, in einem Nachweisverfahren verschiedene Test auf einmal durchzuführen und so eine Möglichkeit zur schaffen, die bisher durchgeführten langwierigen Einzelnachweise zu umgehen.
Als Träger eignet sich jedes feste dielektrische Substrat, insbesondere Silizium, Glas, nichtleitender Kunststoff, wie Teflon, PVC, PE, sowie leitendes oder halbleitendes Substrat, das durch eine dielektrische Schicht von der/den Elektrode(n) isoliert ist. Als Elektroden werden dünne leitende Materialien verwendet, die fest an den Träger gebunden sind. Es eignen sich insbesondere Au, Pd, Pt, Ag, Legierungen, wie Au/Pd, Au/Ag, Ag/Pd, GaAs, und dergleichen, dotierte Halbleiter und jedes andere leitende oder halbleitende anorganische oder organische Material, wie TCNQ, TTF.
Als Referenzelektroden werden die allgemein in der Elektrochemie verwendeten Elektroden wie Ag/AgCl usw. mit und ohne Salzbrücke verwendet.
Als Rezeptoren, die mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren zur elektrisch adressierbaren Immobilisation an Elektroden gebunden werden, werden Moleküle verwendet, deren Bindung mit den Elektroden durch das Elektrodenpotential gesteuert werden kann. Diese Moleküle weisen mindestens eine Thiolgruppe auf oder sind mit mindestens einer Thiolgruppe gekoppelt oder weisen eine Sulfid- oder Disulfidgruppe auf. Sie werden aus der Gruppe, bestehend aus HS-(CH2)n-X, wobei n für eine Zahl von 2 bis 24 steht ist und X für H. OH, SH, CH3, COOH, NH2, sowie jedes andere Molekülfragment stehen,
X-(CH2)n-S-S-(CH2)m-Y oder X-(CH2)n-S-(CH2)m-Y, wobei m, n für eine Zahl von 2 bis 24 stehen und X, Y für H, OH, SH. CH3, COOH, NH2, sowie jedes andere Molekülfragment stehen, insbesondere ω-Mercapto säuren, n-Alkanthiole, wie Octanthiol. sowie Toxinen, Hormonen. Hormonrezeptoren, Peptiden. Proteinen. Enzymen, Enzymsubstraten. Cofaktoren, .Arzneimitteln, Lektinen. Zucker. Oligonukleotiden, DNA, RNA, Viren, Bakteriophagen, Prionen, Oligosacchariden, natürlichen und künstlichen Rezeptoren, redox-aktiven Substanzen, Farbstoffen, Säuren. Basen, Epitopen, Antigenen oder Antikörpern, die mindestens eine Thiolgruppe aufweisen oder mit mindestens einer thiolhaltigen Verbindung gekoppelt sind, ausgewählt. Ebenso können diese Rezeptoren Sulfid- oder Disulfidgruppen aufweisen. Die Thiolgruppen können in derartigen Molekülen entweder schon ursprünglich vorhanden sein oder aber erst durch chemische Modifikation eingeführt werden. Darüber hinaus kann in allen oben genannten Verbindungen das S-Atom der Thiolgruppe durch ein Se- Atom ersetzt sein. Die Moleküle, die zusätzlich auf den Rezeptoren angeordnet sein können, werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Toxinen. Hormonen, Hoπnonrezeptoren, Peptiden, Proteinen, Enzymen, Enzymsubstraten, Cofaktoren. Arzneimitteln, Lektinen, Zucker. Oligonukleotiden, DNA, RNA, Viren, Bakteriophagen, Prionen, Oligosacchariden, natürlichen und künstlichen Rezeptoren, redox-aktiven Substanzen, Farbstoffen, Säuren, Basen, Epitopen, aAntigene oder Antikörpern, die mindestens eine funktioneile Gruppe aufweisen oder in der Lage sind, mit dem adsorbierten Rezeptor Wechselwirkungen einzugehen, wodurch sie chemisch und/oder physikalisch an der/den Elektrode(n) adsorbiert und/oder immobilisiert werden können.
Unter einem Adsorptionspotential versteht man eine elektrisches Potential, bei dem die Bindung der Elektrode mit dem Molekül unterstütz und/oder aufrechterhalten wird. Für die Adsorption von Thiolen an Elektroden liegt das Adsorptionspotential bei pH-Werten innerhalb eines Bereichs von 4,0 bis 8,0 im Bereich von 0 mV bis +600 mV gegenüber der Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI, vorzugsweise bei ca. +300 mV. Bei alkalischem pH wird dieser Potentialbereich verschoben.
Unter dem Begriff Desorptionspotential versteht man ein Potential außerhalb des oben definierten Stabilitätsbereichs. Das Desorptionspotential muß ausreichend hoch sein, um die Adsorption von Molekülen, die während des Immobilisierungsverfahrens eingesetzt werden. zu verhindern. Das Desorptionspotential liegt bei einem pH- Wert innerhalb eines Bereichs von 4,0 bis 8.0 im Bereich ab -300 mV oder niedriger gegenüber des Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI. vorzugsweise im Bereich von -600 mV bis -1800 mV, insbesondere im Bereich von -800 mV bis -1400 mV.
Als Elektrohtlösungen können alle wäßrigen Lösungen, organischen Elektrolyte sowie deren Mischungen als auch Mischung aus wäßrigen Elektrolyten und organischen Lösungsmitteln oder organischen Elektrolyten und organischen Lösungsmitteln verwendet werden.
Die im folgenden beschriebenen Figuren zeigen die erfindungsgemäße Vorrichtung und Meßdaten des erfindungsgemäßen Verfahrens. Figur 1 zeigt schematisch die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur elektrisch adressierbaren Immobilisierung.
Figur 2 zeigt die Vorgehensweise der elektrisch adressierbaren Beschichtung eines Chemo- und/oder Biosensors, insbesondere eines Multisensorsystems („Arrays") mit n Einzelelektroden, wobei n eine ganze Zahl ist.
Figur 3 zeigt die Kapazitätserniedrigung (in Abhängigkeit von der Zeit) einer unbeschichteten Goldelektrode bei der Adsoφtion von 6-Mercaptohexansäure bei einem Elektrodenpotential von +300 mV gegenüber einer Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI.
Durch die folgende Spülung mit Elekrolytlösung wird nur ein geringer Teil des adsorbierten Thiols wieder entfernt.
Figur 4 zeigt die Kapazitätsänderungen einer unbeschichteten Goldelektrode bei mehreren Zyklen der Adsoφtion/Desoφtion von Octanthiol bei einem Elektrodenpotential von -1400 mV gegenüber einer Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI. Eine abschließende Spülung entfernt das adsorbierte Thiol vollständig.
Figur 5 zeigt die Kapazitätsänderung einer unbeschichteten Goldelektrode, an die nacheinander das Desoφtions- (-1400 mV) und Adsoφtionspotential (+300 mV) gegenüber einer Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI angelegt wurde. Bei beiden Potentialen wurde die Adsoφtion von 6-Mercaptohexansäure verfolgt.
Figur 6 zeigt die Kapazitätsänderungen einer Anordnung bestehend aus zwei Goldelektroden, bei der die elektrisch adressierbare Immobilisierung von 6-Mercaptohexansäure und Octanthiol bei Elektrodenpotentialen von +300 mV bzw. -1400 mV gegenüber einer Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI durchgeführt wurde.
Figur 7 zeigt die Kapazitätsänderung von HSA-Immunosensoren bei Zugabe des Antigens, wobei jeder Symboltyp einen Sensor darstellt. Die in Figur 1 gezeigte Vorrichtung besteht aus einer Wechselvorrichtung (1) für Probenbehälter und einer Pumpe (2), die die gewünschten Moleküle oder Rezeptoren in die Durchflußzelle (3) transportiert. In der Durchflußzelle (3), in der sich eine Elektrolytlösung befindet, sind n Elektroden auf einem Träger (5) angeordnet. An diesen Elektroden wird separat entweder ein Adsoφtionspotential (8) oder ein Desoφtionspotential (9) mittels eines Multiplexers (6), der durch einen Adreßbus (7) gesteuert wird, gegenüber einer Referenzelektrode (10) angelegt. Nach erfolgter Immobilisierung werden mittels der Pumpe (2) die überschüssigen Moleküle in ein Auffanggefäß (4) gepumpt.
In Figur 2 sind detailliert die Einzelschritte der elektrisch adressierbaren Immobilisierung von x Molekülen auf n Elektroden dargestellt. In dieser Figur stellt (11) die Zugabe eines thiolhaltigen Moleküls, (12) die Adsoφtion dieses Moleküls und (13) die Spülung mit Elektrolytlösung dar. Über die Pumpe (2) wird Molekül A in die Zelle (3) transportiert. Dort adsorbiert das Molekül A auf die Elektrode El, an die das Adsoφtionspotential angelegt ist. Gleichzeitig wird die chemische Adsoφtion auf die Elektroden E2 bis En durch das dort angelegte Desoφtionspotential verhindert. Die Adsoφtion wird mittels Kapazitätsmessungen verfolgt. Stellt sich ein konstanter Kapazitätswert für die El ein, ist die Adsoφtion von Molekül A abgeschlossen und die Zelle kann mit Elektrolytlösung gespült werden. Nach dem Auswaschen von Molekül A werden die Elektrodenpotentiale in der Weise geändert, daß an El das Adsoφtionspotential und an den Elektroden E3 bis En das Desoφtionspotential beibehalten wird. Bei Elektrode E2 verändert man das elektrische Potential unter Anlegen des Adsoφtionspotentials. Über die Pumpe (2) wird aus dem Wechselvorrichtung (1) das Molekül B in die Zelle transportiert. Dort absorbiert Molekül B nur auf E2, weil El bereits mit Molekül A beschichtet ist und an den Elektroden E3 bis En das Desoφtionspotential angelegt ist. Die Reinigung erfolgt wie oben beschrieben. Die Beschichtung der Elektroden E3 bis En mit den Molekülen C bis X wird analog zu den Elektroden El und E2 durchgeführt.
Die Figuren 3 bis 5 zeigen die Kapazitätsänderungen, die bei der elektrisch adressierbaren
Immobilisieinng mit Einzelelektroden auftreten. Mit (14) ist die Zugabe von Octanthiol, mit (16) die Zugabe von 6-Mercaptohexansäure und mit (15) das Spülen bzw. Waschen der
Elektroden mit Reinstwasser und Chloroform bezeichnet. Als Elektrolyt wurde eine wäßrige phosphatgepufferte KCl-Lösung (100 mM) von pH 6,7 verwendet. In den Figuren sind zusätzlich die spezifischen Kapazitätswerte angegeben. Die vollständige Entfernung der bei - 1400 mV adsorbierten Thiole bei der Spülung zeigt, daß diese Moleküle nur physikalisch auf der Goldelektrode adsorbiert waren (Figur 4). Im Gegensatz dazu war der größte Teil der bei +300 mV adsorbierten Thiole chemisch adsorbiert und aus diesem Grund gegenüber der Spülung stabil.
Figur 6 zeigt analog das Ergebnis mit einem Zweielektrodensystem. Als Elektrolyt wurde wäßrige phosphatgepufferte KCl-Lösung (100 mM) von pH 6,7 verwendet. Die Zugabe von 6- Mercaptohexansäure (16) sowie die Spülung (15) erfolgten bei Elektrodenpotentialen von +300 mV (Adsoφtionspotential) für Elektrode El und -1400 mV (Desoφtionspotential) für Elektrode E2. Die Zugabe von Octanthiol (14) wurde bei Elektrodenpotentialen von +300 mV für beide Elektroden durchgefülrt.
Die elektrisch adressierbare Immobilisierung ermöglicht den Aufbau eines Multisensorsystems, das beispielsweise in der klinischen Diagnostik oder der chemischbiologischen Analyse, z.B. High-Throughput-Screening, eingesetzt werden kann. Durch den gezielten Aufbau von Einzelelektroden kann ein auf den Anwender abgestimmtes Ensemble hergestellt werden.
Mit diesem Multisensorsystem können u.a. Enzymaktivitäten in Elektrolytlösungen oder biologischen Flüssigkeiten, z.B. Blut, Urin und dergleichen, bestimmt werden. Beispielsweise kann die Aktivität der Phospholipase A2 dadurch bestimmt werden, daß man eine Liposomenschicht durch hydrophobe-hydrophobe Wechselwirkungen an eine unmodifizierte Alkanthiolmonoschicht. z.B. Hexadecanthiol oder Octanthiol bindet. Ist nun Phospholipase A2 in der Zelle vorhanden, werden die Lipide abgebaut. Dies kann durch die Erhöhung des Kapazitätssignals nachgewiesen werden.
Ein weiteres Multisensorsystem kann die Kombination verschiedener Affinitätssensoren darstellen. Beim Nachweis eines Überschusses Human Serum Albumin (HSA) im Urin, einem Anzeichen für Mikroalbuminurie, kann man Sensoren verwenden, die wie folgt aufgebaut sind.
Nachdem zuerst ein ω-funktionalisiertes Alkanthiol, z.B. 16-Mercaptohexadecansäure, 11- Mercaptoundecansäure, 6-Mercaptohexansäure, 16-Mercaptohexadecanamin an die Elektrodenoberfläche adressiert wurde, erfolgt die kovalente Kopplung von monoklonalem anti-HSA an diese Monoschicht. Diese Sensorstruktur ermöglicht die Detektion von HSA im klinisch relevanten Bereich von 1 bis 30 μg/ml Flüssigkeit, z.B. Urin, Pufferlösung. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt.
Weitere Anwendungsbeispiele der erfindungsgemäßen Anordnung sind die Verwendung als Sensoren für Bakteriophagen, als Sensoren für Antigen-Antiköφer-Nachweise, als DNA- Sonden und als immobilisierte LDL-Rezeptoren.
Zusammenfassend läßt sich also feststellen, daß die Ergebnisse, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Sensoren erhalten wurden und die in den Figuren 3 bis 7 dargestellt sind, zeigen, daß es gelungen ist, verschiedene Moleküle durch elektrisch adressierbare Immobilisierung gezielt auf bestimmten Elektroden zu adsorbieren und/oder zu desorbieren und/oder zu immobilisieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die Elektronden in einem System als Multisensor einsetzbar sind. Es ist außerdem gelungen, ein Nachweissystem bereitzustellen, mit dem sowohl quantitativ als auch qualitativ Stoffe detektiert werden können.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Vorgehensweise und die Bedingungen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Anordnungen mit elelctrisch adressierbaren immobilisierten Molekülen auf einer Elektrode.
Beispiele
Beschichtung von Einzelelektroden Vorbereitung der Elektroden
Silizium- Wafer Stückchen mit einer Größe von 3,20 mm x 10,02 mm und einer Stärke von 450 μm wurden in einem allgemein üblichen Sputteφrozeß mit einer Goldelektrode der Größe 1,56 mm x 1,56 mm (reaktive Oberfläche) und einer Zuleitung von 10 μm Breite und 6,65 mm Länge versehen. Die Elektrode wurde aus einer Titan- und Palladiumschicht (Haftvermittler, jeweils 50 um dick) und einer deckenden Goldschicht (200 nm) aufgebaut. Als Kontaktstelle für das Meßsystem wurden am oberen Ende der Zuleitungen ein versilberter Draht angelötet. Die Wafeφlättchen wurden vor dem Reinigungsprozeß optisch mit einem Auflichtmiakroskop auf Beschädigungen übeφrüft. Die Reinigung erfolgte in mehreren Schritten. Zuerst wurden die Wafer 30 Minuten vollständig in Chloroform getaucht. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom wurden die Wafer in eine 1 :1 (v/v) Mischung aus Chloroform und Methanol getaucht und 10 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Analog zu dem verwendeten Chlorofoπn kann man bei diesen Reinigungsschritten auch Ethanol (99%) und eine Mischung aus Ethanol und Methanol benutzen. Die Wafer wurden getrocknet und für 5 Minuten in eine heiße 3:1 (v/v) Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30 %iger Wasserstoffperoxidlösung getaucht. Bei den letzten beiden Schritten wurde darauf geachtet, daß nur die reaktive Elektrodenfläche und maximal 4,50 mm der Zuleitung in die Mischung eintauchten. Die Elektroden wurden gründlich mit Reinstwasser (Millipore: Mili.Qpιus-185; 18.2 MΩ cm"1) gespült und getrocknet. Alle Glas- und Teflongeräte wurden vor ihrer Verwendung entsprechend der vorangegangenen Beschreibung sorgfältig gereinigt.
Durchführung der Messung
Die Wafeφlatte mit der aufgesputteten Goldelektrode wurde gemeinsam mit einer Ag/AgCl- Referenzelektrode (Oberfläche ca. 1 cm2) an einem Teflonhalter befestigt, der als Deckel für die Meßzelle (Schnappdeckelglas, 40 mm x 19 mm) diente und eine Öffnung für die Zugabe und Entnahme von Flüssigkeiten besaß. Die Zelle wurde mit Elektrolyt (100 mM KCI; pH 6,7; ca. 3 ml) soweit gefüllt, daß die reaktive Oberfläche der Goldelektrode und die Referenzelektrode (Ag/AgCl) vollständig eintauchten. Für eine gleichmäßige Durchmischung sorgte ein Magnetrührer. Ein Lock-in-Verstärker mit integriertem Sinus-Generator erzeugte ein konstantes Sinussignal mit einer Frequenz von 20 Hz und einer Amplitude von 10 mV. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt. Der Lock-in-Verstärker wurde auch zur Registrierung des kapazitiven Stroms verwendet. Zusätzlich zu der Wechselspannung wurde eine Gleichspannung über einen Spannungsgeber zugegeben. Erfolgte die Adsoφtion von Molekülen auf die Elektrodenoberfläche wurde dieses als Kapazitätsänderung gemessen. Das Meßsignal wurde auf einem x-t Schreiber aufgezeichnet und über einen 16 Bit A-D Umwandler in den Rechner übertragen. Zu Beginn der Messung wurde die absolute Kapazität der unbeschichteten Goldelektrode bei einem elektrischen Potential von +300 mV bestimmt. Man erhielt Werte von mindestens 12-14 μF/cm2.
Adsoφtionspotential
Nachdem die Elektrode einen stabilen Kapazitätswert erreicht hatte, wurde das Adsoφtionspotential (+300 mV) beibehalten und soviel 6-Mercaptohexansäure in Elektrolyt gelöst zugegeben, das in der Meßzelle eine Konzentration von 50 μmol/1 vorlag. Die Adsoφtion setzte sofort ein und war nach ca. 2,5 Stunden abgeschlossen (vergleiche Figur 3). Die Halbwertszeit der Beschichtung betrug ca. 10 Minuten und der absolute Kapazitätswert war mit 4,3 μF/cm2 vergleichbar mit dem einer in Chloroform oder Ethanol (1 mM 6- Mercaptohexansäure) beschichteten Goldelektrode. Nach dieser Beschichtung wurde die Meßzelle geöffnet, die Goldelektroden mit Reinstwasser gespült und ca. 5 Sekunden in Chloroform getaucht, um physikalisch adsorbiertes Thiol von den Elektroden zu entfernen. Die Referenzelektrode, die Meßzelle und der Rülirer wurden gründlich mit Reinstwasser, Chloroform, Ethanol und Aceton gereinigt, um 6-Mercaptohexansäure zur entfernen. Anschließend wurde die Qualität der Beschichtung durch erneute Messung der Kapazität übeφrüft. Es wurde nur eine geringfügige Kapazitätserhöhung (1-2%) gegenüber den zuvor erhaltenen Werten gemessen.
Desoφtionspotential
An die Goldelektrode wurde ein Desoφtionspotential von -1400 mV angelegt und die Stabilität des Kapazitätswerts abgewartet. Anschließend wurde soviel Octanthiol zugegeben, daß in der Zelle eine Konzentration von 250 μmol/1 vorlag. Die folgende Kapazitätserniedrigung betrug nach 2 Stunden ca. 30% bei einer Halbwertszeit von 45 Minuten (vergleiche Figur 4). Der absolute Kapazitätswert war mit 7,8 μF/cm2 deutlich größer als bei der Goldelektrode, die unter .Anlegen des Adsoφtionspotentials beschichtet worden war. Nach der Reinigung der Elektrode mit Reinstwasser und Chloroform (5 Sekunden) zeigte sich, daß die Kapazitätserniedrigung nur auf physikalisch adsorbiertes Thiol zurückzuführen war, weil die Startwerte von 12-14 μF/cm2 wieder erreicht wurden. Die physikalische Adsoφtion und der darauf folgende Reinigungsschritt wurden mehrmals wiederholt und lieferten stets das gleiche Ergebnis.
Desoφtions-/Adsoφtionspotential
An die Goldelektrode wurde ein Desoφtionspotential von -1400 mV angelegt und die Einstellung eines stabilen Kapazitätswertes abgewartet. Anschließend wurde soviel 6- Mercaptohexansäure in Elektrolyt gelöst zugegeben, daß in der Meßzelle einen Konzentration von 50 μmol/1 vorlag. Die Kapazitätserniedrigung betrug nach 1 Stunde ca. 7% (vergleiche Figur 5). Das angelegte Desoφtionspotential wurde jetzt durch das Adsoφtionspotential (+300 mV) ersetzt. Die Kapazitätserniedrigung, die durch die Potentialänderung verursacht wurde, wurde von der sofort beginnenden Adsoφtion überlagert und konnte nicht bestimmt werden. Nach ca. 2 Stunden war die Adsoφtion abgeschlossen (Halbwertszeit 8 Minuten) und die absolute Kapazität (4,9 μF/cm2) mit einer in organischer Lösung beschichteten Goldelektrode vergleichbar. Durch die Reinigung der Elektrode mit Reinstwasser und Ethanol (10 Sekunden) wurde kein adsorbiertes Thiol mehr entfernt.
Beschichtung eines Multisensorsystems
Vorbereitung der Elektroden
Silizium- Wafer Stückchen mit einer Größe von 3,20 mm x 10,02 mm und einer Stärke von 450 μm wurden in einem allgemein üblichen Sputteφrozeß mit zwei Goldelektroden der
Größe 1,56 mm x 1,56 mm (reaktive Oberfläche) und einer Zuleitung von 10 μm Breite und 6,65 mm Länge versehen. Die Elektrode wurde aus einer Titan- und Palladiumschicht (Haftvermittler, jeweils 50 nm dick) und einer deckenden Goldschicht (200 nm) aufgebaut. Der Abstand der Elektroden voneinander betrug 1,56 mm. Das .Anbringen der Kontaktstelle und der Reinigungsprozeß wurden analog dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Messung
Die Wafeφlatte mit den zwei Goldelektroden wurde gemeinsam mit einer Ag/AgCl- Referenzelektrode (Oberfläche ca. 1 cm2) an einem Teflonhalter befestigt, der als Deckel für die Meßzelle (ein Schnappdeckelglas. 40 mm x 19 mm) diente und eine Öffnung für die Zugabe und Entnahme von Flüssigkeiten besaß. Die Zelle wurde mit Elektrolyt (100 mM KCI; pH 6,7; ca. 3 ml) soweit gefüllt, daß die reaktive Oberfläche der Goldelektroden und die Referenzelektrode (Ag/AgCl) vollständig eintauchten. Für eine gleichmäßige Durchmischung sorgte ein Magnetrührer. Ein Lock-in-Verstärker mit integriertem Sinus-Generator erzeugte ein konstantes Sinussignal mit einer Frequenz von 20 Hz und einer Amplitude von 10 mV. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt. Der Lock-in-Verstärker wurde auch zur Registrierung des kapazitiven Stroms verwendet. Zusätzlich zu der Wechselspannung wurde eine Gleichspannung über einen Spannungsgeber zugegeben. Die zwei Potentialgeber ermöglichten das separate Anlegen von elektrischen Potentialen (Ul, U2) an die Goldelektroden (El, E2) vs. Ag/AgCl-Referenzelektrode. Die Adsoφtion von Molekülen auf die Elektrodenoberfläche wurde als Kapazitätsänderung gemessen. Das Meßsignal wurde auf einem x-t Schreiber aufgezeichnet und über einen 16 Bit A-D Umwandler in den Computer übertragen. Vor der Zugabe des ersten Thiols wurde die Kapazität der unbeschichteten Goldelektrode bei einem Elektrodenpotential Ul = U2 = +300 mV geprüft. Man erhielt Werte von mindestens 12-14 μF/cm", die typisch für unbeschichtete Goldelektroden sind.
Nachdem beide Elektroden stabile Kapazitätswerte erreicht hatten, wurde die Kapazität der
Elektrode El gemessen. Das an Elektrode E2 angelegte Potential von +300 mV wurde nach - 1400 mV verschoben. Es wurden Kapazitätsänderungen an Elektrode El auf Grund dieser
Potentialverschiebung abgewartet. Dann wurde soviel 6-Mercaptohexansäure in Elektrolyt lo
gelöst zugegeben, daß eine Konzentration von 50 μmol/1 in der Zelle vorlag. Die Adsoφtion setzte sofort ein und war nach ca. 2,5 Stunden abgeschlossen. Die Halbwertszeit der Beschichtung betrug ca. 15 Minuten und der absolute Kapazitätswert war mit 4 bis 5 μF/cm2 vergleichbar mit dem einer in Chloroform (1 mM 6-Mercaptohexansäure) beschichteten Goldelektrode. Nach dieser Beschichtung wurde die Meßzelle geöffnet, die Goldelektroden mit Reinstwasser gespült und ca. 5 Sekunden in Chloroform getaucht, um physikalisch adsorbiertes Thiol von den Elektroden zu entfernen. Die Referenzelektrode, die Meßzelle und der Rührer wurden gründlich mit Reinstwasser, Chloroform, Ethanol und Aceton gereinigt, um 6-Mercaptohexansäure zu entfernen. Die Meßzelle wird, wie bereits oben beschrieben, aufgebaut und mit frischem Elektrolyt befüllt. Bei einem Potential von Ul = U2 = +300 mV wurden erneut die absoluten Kapazitätswerte gemessen. Die mit 6-Mercaptohexaansäure beschichtete Elektrode El hatte einen Wert von 4,2 μF/cm2. die zweite Elektrode wurde während des zweiten Beschichtungsschrittes verfolgt. Bei Zugabe von Octanthiol (Konzentration in der Zelle 150 μmol/1) erfolgte eine sofortige Adsoφtion, die nach ca. 3 Stunden beendet war (Halbwertszeit 10,5 Minuten). Die absoluten Kapazitätswerte der beiden Goldelektroden betrugen nach einem erneuten Reinigungsschritt 1,4 μF/cm2 für Elektrode E2 und 4J μF/cm2 für Elektrode El.
Der Vergleich der bisher bekannten Immobilisierungsverfahren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der damit erhaltenen erfindungsgemäßen Anordnung zeigt, daß Chemo- und/oder Biosensoren bereitgestellt werden können, mit denen quantitative und qualitative Bestimmungen von unterschiedlichen Stoffen und Verbindungen durchgeführt werden können. Darüber hinaus gelingt der Nachweis der zu bestimmenden Substanzen in einfacher Weise über die Messung von Kapazitätsänderungen, vorzugsweise direkt im Medium.

Claims

Ansprüche
1. Anordnung mit elektrisch adressierbar immobilisierten Molekülen umfassend einen Träger, eine und/oder mehrere (1 bis n) elektrisch leitende Trägeroberfläche(n), die auf diesem Träger angeordnet ist/sind und einen und/oder mehrere identische und oder verschiedene immobilisierte(n) Rezeptor(en).
2. .Anordnung nach .Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem festen dielektrischen Substrat besteht, die Trägeroberfläche(n) eine und oder mehrere voneinander getrennte Elektrode(n) ist/sind, die sich auf dem Träger angeordnet sind, auf der oder denen der oder die Rezeptor(en) immobilisiert sind.
3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein festes dielektrisches Substrat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Silizium, Glas, nichtleitendem Kunststoff, insbesondere Teflon, PVC, PE, ist.
4. ./Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in dem dielelektrischen Stoff elektrische Zuleitungen für Sensorspots vorhanden sind.
5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode(n) eine dünne Schicht aus einem leitenden oder halbleitenden Materials, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Au, Pd, Pt, Ag, Legierungen, insbesondere GaAs, Au/Pd, Au/Ag, Ag/Pd, dotierten Halbleitern und anderen leitenden oder halbleitenden anorganischem oder organischem Material, ist.
6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der/die Rezeptor(en), der/die immobilisiert wird/werden, auswählt aus der Gruppe, bestehend aus HS-(CH2)n-X, wobei n für eine Zahl von 2 bis 24 steht ist und X für H, OH. SH, CH3, COOH, NH , sowie jedes andere Molekülfragment stehen,
X-(CH2)n-S-S-(CH2)m-Y oder X-(CH2)n-S-(CH2)m-Y, wobei m, n für eine Zahl von 2 bis 24 stehen und X, Y für H, OH, SH, CH3, COOH. NH2, sowie jedes andere Molekülfragment stehen, insbesondere ω-Mercaptosäuren, n-Alkanthiole, wie Octanthiol. sowie Toxinen, Hormonen. Hormonrezeptoren, Peptiden. Proteinen, Enzymen, Enzymsubstraten, Cofaktoren, Arzneimitteln, Lektinen, Zucker, Oligonukleotiden, DNA, RNA, Viren. Bakteriophagen, Prionen, Oligosacchariden, natürlichen und künstlichen Rezeptoren, redox-aktiven Substanzen. Farbstoffen, Säuren. Basen, Epitopen, Antigene oder Antiköφern, die mindestens eine Thiolgruppe oder eine Sulffid- oder Disulfidgruppe aufweisen oder mit mindestens einer thiolhaltigen Verbindung gekoppelt ist/sind.
7. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Thiolgnippe durch eine Selenolgruppe ersetzt ist.
8. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden auf demselben oder auf separaten Trägern angeordnet sind.
9. ^Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß auf die elektrisch adressierbare immobilisierte Schicht eine oder mehrere Molekülschicht(en) chemisch und/oder physikalisch über eine funktionelle Gruppe oder über Wechselwirkungen adsorbiert und oder immobilisiert ist/sind, wobei die Molekülschichten ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Toxinen, Hormonen, Hormonrezeptoren, Peptiden, Proteinen, Enzymen, Enzymsubstraten, Cofaktoren, ^zneimitteln, Lektinen, Zucker, Oligonukleotiden, DNA, RNA, Viren, Bakteriophagen, Prionen, Oligosacchariden, natürlichen und künstlichen Rezeptoren, redox-aktiven Substanzen, Farbstoffen, Säuren, Basen, Epitopen, ./Vntigene oder Antiköφern.
10. Verfaliren zur elektrisch adressierbaren Immobilisierung von Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bestehend aus den Schritten:
(a) ein Träger mit n Elektroden, wobei n eine ganze Zahl ist, wird in eine Durchflußzelle, in der sich Elektrolytlösung zusammen mit den zu immobilisierenden Molekülen (Rezeptoren) befindet, eingebracht,
(b) die Elektroden werden separat entweder mit einem Adsoφtionspotential oder einem Desoφtionspotential belegt, wobei durch das Desoφtionspotential die unbeschichteten Elelrtrodenplätze inert gehalten werden und das an den bereits beschichteten Elektrodenplätzen weiterhin angelegte Adsoφtionspotential verhindert die Desoφtion von Molekülen ebenso wie die weitere Adsoφtion anders strukturierter Moleküle, wodurch erreicht wird, daß der Elektrodenplatz mit dem ersten Molekültyp besetzt ist und die Moleküle immobilisiert werden und fest an der Trägeroberfläche gebunden sind und
(c) die Adsoφtion von Molekülen an der/den Elektrode(n) als Signaländerung zu messen.
11. Verfahren nach aΛnspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorgang der ImmobilisieiTing von Molekülen solange wiederholt wird, bis auf den Elektrodenplätzen (0-n) identische und/oder verschiedene Rezeptoren gebunden sind.
12. Verfallren nach einem der aΛnsprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die elektrisch adressierbare Immobilisi rung eine oder mehrere
Molekülschicht(en) an eine beliebige Anzahl von Rezeptoren, die an den Elektroden immobilisiert sind, chemisch und/oder physikalisch adsorbiert und/oder immobilisiert wird/werden, wobei für alle beschichteten Elektroden das Adsoφtionspotential beibehalten wird und eine Elektrolytlösung der zu koppelnden Moleküle gleichzeitig mit einem Kopplungsreagenz in die Durchflußzelle gepumpt wird.
13. Verfahren nach einem der Anspräche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die elektrisch adressierbare Immobilisierung eine oder mehrere Molekülschicht(en) an eine beliebige .Ynzahl von Rezeptoren, die an n Elelftroden immobilisiert sind, chemisch und/oder physikalisch adsorbiert und/oder immobilisiert wird/werden, wobei für alle beschichteten Elektroden das Adsoφtionspotential beibehalten wird und zunächst ggf. durch Zugabe des Kopplungsreagenz, die Basisschicht(en) aktiviert wird/werden und anschließend die zu koppelnden Moleküle zugegeben werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorgang der chemischen, biologischen oder physikalischen Beschichtung so lange wiederholt wird, bis schrittweise die gewünschte Sensorstruktur erreicht ist.
15. Verfal ren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, das die Stoffe, die zusätzlich auf die immobilisierte Schicht aufgebracht sind, ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Toxinen, Hormonen, Hormonrezeptoren, Peptiden, Proteinen, Enzymen. Enzymsubstraten, Cofaktoren, Arzneimitteln, Lektinen, Zucker. Oligonukleotiden, DNA, RNA, Viren, Bakteriophagen, Prionen, Oligosacchariden, natürlichen und künstlichen Rezeptoren, redox-aktiven Substanzen, Farbstoffen, Säuren, Basen, Epitopen, Antigene oder Antiköφem und mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen oder in der Lage sind, Wechselwirkungen mit den Rezeptoren einzugehen.
16. Verfahren nach einem der aAjisp.ruc.he 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Kopplungsreagenz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Carbodiimide und deren Derivate, N-Succinimide und deren Derivate.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsoφtionspotential bei pH- Werten innerhalb eines Bereichs von 4,0 bis 8,0 im Bereich von 0 bis +600 mV gegenüber einer Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI, vorzugsweise bei +300 mV bei pH 7,0 liegt.
18. Verfaliren nach einem der .Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Desoφtionspotential bei pH-Werten innerhalb eines Bereichs von 4,0 bis 8,0 im Bereich ab - 300 mV oder niedriger gegenüber der Ag/AgCl-Elektrode in 100 mM KCI, vorzugsweise im Bereich von -600 mV bis -1800 mV, insbesondere im Bereich von -800 mV bis -1400 mV liegt.
19. Verfahren nach einem der ./Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein festes dielektrisches Substrat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Silizium, Glas, nichtleitendem Kunststoff, insbesondere Teflon, PVC, PE, ist.
20. Verfahren nach einem der .Anspräche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in dem dielelektrischen Stoff elektrische Zuleitungen für Sensorspots vorhanden sind.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode(n) eine dünne Schicht aus einem leitenden oder halbleitenden Materials, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Au, Pd, Pt, Ag, Legierungen, insbesondere GaAs, Au/Pd, Au/Ag, Ag/Pd, dotierten Halbleitern und anderen leitenden oder halbleitenden anorganischem oder organischem Material, ist.
22. Verfahren nach einem der .Ansprüche 10 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der/die Rezeptor(en), der/die immobilisiert wird/werden, auswählt aus der Gruppe, bestehend aus
HS-(CH2)n-X, wobei n für eine Zahl von 2 bis 24 steht ist und X für H, OH, SH, CH3, COOH, NH2, sowie jedes andere Molekülfragment stehen,
X-(CH2)n-S-S-(CH2)m-Y oder X-(CH2)n-S-(CH2)m-Y, wobei m, n für eine Zahl von 2 bis 24 stehen und X, Y für H, OH, SH, CH3, COOH, NH2, sowie jedes andere Molekülfragment stehen, insbesondere ω-Mercaptosäuren, n-Alkanthiole, wie Octanthiol, sowie Toxinen, Hormonen, Hoπnonrezeptoren, Peptiden, Proteinen, Enzymen, Enzymsubstraten, Cofaktoren, Arzneimitteln, Lektinen, Zucker, Oligonukleotiden, DNA, RNA, Viren, Bakteriophagen, Prionen, Oligosacchariden, natürlichen und künstlichen Rezeptoren, redox-aktiven Substanzen, Farbstoffen, Säuren, Basen, Epitopen, Antigene oder Antiköφern, die mindestens eine Thiolgruppe oder eine Sulfid- oder Disulfidgruppe aufweisen oder mit mindestens einer thiolhaltigen Verbindung gekoppelt ist/sind.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Thiolgruppe der durch eine Selenolgruppe ersetzt ist.
24. Verfahren nach einem der Anspräche 10 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden auf demselben oder auf separaten Trägern angeordnet sind.
25. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zur elelctrisch adressierbaren Immobilisierung von Molekülen bestehend aus einer Wechsel Vorrichtung (1) für Probenbehälter, einer Pumpe (2), einer Durchflußzelle (3), in die das gewünschte Molekül oder der Rezeptor oder in die die gewünschten Moleküle oder Rezeptoren mittels der Pumpe (2) transportiert werden, einem Träger (5), auf dem n Elektroden angeordnet sind, wobei sich der Träger (5) mit den n Elektroden in der Durchflußzelle (3) befindet einem Multiplexers (6), einem Adreßbus (7), der den Multiplexer (6) steuert, wodurch an die Elel trode(n) wird/werden separat entweder ein Adsoφtionspotential (8) oder ein Desoφtionspotential (9), gegenüber einer Referenzelektrode (10) angelegt, und einem Auffanggefäß (4), in das nach erfolgter Immobilisierung der Moleküle mittels der
Pumpe (2) die überschüssigen Moleküle gepumpt werden.
26. Verwendung der Anordnung nach einem der Anspräche 1 bis 9 als Chemo- und/oderBiosensor, insbesondere als Multisensorsystem für chemische, biologische und/oder physikalische Bestimmungen.
27. Verwendung der .Anordnung nach einem der .Anspräche 1 bis 9 in der kombinatorischen Synthese in der Grenzfläche.
28. Verwendung der .Anordnung nach einem der Anspräche 1 bis 9 als Sensor für Antiköφer-Nachweise, zum Nachweis von Bakteriophagen oder als DNA-Sonden.
29. Verwendung der Anordnung nach einem der Anspräche 1 bis 9 zur quantitativen und qualitativen Bestimmung der nachzuweisenden Substanzen direkt im Probenmedium.
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