WO1999048512A1 - Utilisation d'au moins un extrait proteique de graines de plantes du genre moringa et composition cosmetique et/ou pharmaceutique correspondante - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to the field of cosmetology and dermatology, more particularly cosmetic care for the skin and the integuments, and relates to the use, for cosmetic, dermatological and / or pharmaceutical applications, of at least a protein extract from the seeds of a plant of the Moringa genus, as well as a cosmetic and / or pharmaceutical composition containing at least one such extract.
  • the genus Moringa includes some 14 species of plants (including Moringa peregrina, M. aptera, M. concanensis, M. drouhardii, M. hildebrandtii, M. longituba), of which Moringa pterygosperma (synonym Moringa oleifera) is the best known.
  • the different parts of the tree (leaves, roots, root bark, flowers, seeds) are used in traditional medicine in the countries where it grows.
  • Moringa seeds are characterized by the presence of an oil whose content varies between 21 and 53% depending on the species and the maturity of the seeds.
  • Behenic acid (C22H44O2) is the saturated fatty acid typical of Moringa oil (content 2.6 to 4%).
  • Moringa oil also called Behen or Ben oil
  • This oil was used by cosmetic formulators until the last century and its use has been "rediscovered" recently.
  • Moringa seeds have recently attracted the attention of researchers because they are traditionally used for water clarification and therefore have economic potential for the treatment and purification of water in developing countries. development.
  • MO2.1, MO2.2 and MO2.3 new active fractions
  • MO2.2 appears to be homogeneous while MO2.3 is made up of several proteins.
  • the isoelectrofocusing shows that the isoelectric point of these flocculating proteins is 10.
  • the amino acid composition of MO2.1 has been determined and shows that this protein contains 60 amino acids with a high content of glutamine (15 residues), arginine (7 residues) and proline (7 residues), the terminal end being blocked by a pyroglutamate function. - 3 -
  • the inventors of the present invention have unexpectedly and surprisingly discovered that the protein extracts of Moringa seeds, known for their clarifying effects on turbid waters, also have new and original properties, the beneficial effects of which on the skin and the integuments. , combined with very good tolerance, make them directly usable in skincare cosmetics and pharmacology, in particular in dermatological applications.
  • the main object of the present invention consists in the use of at least one protein fraction extracted from the seeds of a plant of the genus Moringa belonging to the family of Moringaceae, as active principle, alone or in combination with at at least one other active ingredient, for the preparation of a cosmetic and / or pharmaceutical composition for topical use for the skin and / or the integuments.
  • the protein fraction (s) consists (s) of one or more extracts of the Moringa oleifera plant, this protein fraction (s) containing based on the dry extract, a protein content of between 0.01% and 100% by weight, preferably about 45% by weight.
  • the protein fraction (s) is (are) extracted (s) with water or an aqueous solution, in particular saline solutions at different pH, if necessary by means of an ultrasonic generator.
  • the protein fraction (s) is (are) constituted by an aqueous extract (s), extracts in saline media at different pH, or in buffered medium of whole or shelled seeds, partially or completely defatted, by a protein concentrate, by purified proteins or by a mixture of at least two of the aforementioned constituents and has (s) an isoelectric point greater than 7, preferably between 8 and 12.
  • the protein fraction (s) used as active principle are preferably obtained by:
  • Moringa oleifera almonds obtained after shelling the seeds and containing 33.4% (weight / weight) of oil are defatted by two successive extractions at reflux in hexane and, after filtration, the flour is dried in an oven at 40 ° C and has a residual oil content of 2.5%.
  • the insoluble material is removed by centrifugation for 15 min. at 5000 g.
  • the supernatant is collected and then filtered through 0.45 ⁇ m: 1.77 liter of yellow filtrate is thus obtained, containing 4.69% of dry extract and having a protein concentration measured by the Biuret technique of 21.54 g / 1 (i.e. a protein purity based on the dry extract of 45.92%).
  • the extract is dehydrated by atomization and 65.72 grams of atomisat having a protein content estimated at 54% (N x 6.25). If the peaks eluted between the excluded volume and the total volume of the column are taken into account, the chromatographic profile resulting from the gel permeation analysis on a Superose 12HR column of this extract (see FIG. 1 of the appended drawings) highlights a major fraction which represents 52% of the surface and which corresponds to molecular weights between 7,800 and 1,1000 Da. The presence of shoulders in this peak confirms the existence of several compounds and the range of molecular weights is close to that found in the literature. - 5 - for monomers (6,500 and 7,000 Da) and dimers (13,000 Da) of flocculating Moringa proteins.
  • Precipitation begins around pH 8.0 (net cloudiness of the solution) and after 30 minutes the solution is centrifuged for 15 min. at 5000 g. The sticky precipitate is collected (43.2 g wet) and then washed twice with 500 ml of distilled water at pH 11.8.
  • the precipitate is then dissolved in 270 ml of distilled water (ie 10% of the initial volume) and the pH of the solution is continuously adjusted to 4.5 with 6N HCl so as to allow the solubilization of the precipitate (the dispersion is facilitated by the use of a device of the type known under the designation Turax).
  • the almond oil obtained by dehulling the seeds of Moringa oleifera is extracted by pressure on a press of the type known under the designation KOMET and the oil cakes obtained are ground in order to obtain a homogeneous flour.
  • a crude extract is prepared from 1.24 kg of cake according to the procedure described in Examples 1 and 2.
  • the proteins are precipitated at pH 11.8 according to Example 2, but an additional step of settling overnight at + 4 ° C. is introduced in order to allow better precipitation of the proteins. - 6 -
  • the precipitate is treated under the same conditions as in Example 2 (the pH of the solution for reconstituting the precipitate however being 6 instead of 4.5).
  • the protein concentrate thus obtained (1.05 liter at 4.59% of dry extract) is dehydrated by atomization and 34.6 g of atomisat are collected, ie an atomization yield based on the dry extract of 71.5%.
  • the protein content based on the nitrogen determination (N x 6.25) is greater than 90% (approximately 95%).
  • EXAMPLE 4 (Preparation of the extract 4) A crude extract is prepared from 150 g of cake according to the procedure described in examples 1, 2 and 3.
  • CM52 Carboxymethylcellulose
  • WHATMAN Carboxymethylcellulose
  • the mixture is filtered on a Buchner fitted with a WHATMAN No. 42 filter, then the cellulose is collected and again equilibrated in 500 ml of water at pH 7.5.
  • the cellulose After removal of the aqueous medium by filtration, the cellulose is brought into contact, with stirring for one hour at room temperature, with the aqueous extract of almond cake from Moringa oleifera.
  • the non-adsorbed compounds (fractions whose chromatographic profile is shown in broken lines in FIG. 3) are removed by filtration on Buchner and the "charged" cellulose is then washed twice with one liter of distilled water at pH 7.5 then filtered on Buchner.
  • the cellulose is then brought into contact with 120 ml of a 60 g / 1 NaCl solution pH 7.5 for 30 minutes.
  • the proteins eluted in NaCl medium are recovered by filtration on Buchner (the chromatographic profile of the proteins adsorbed on CM 52 and eluted in NaCl medium 60 g / 1 is shown in solid line in FIG. 3).
  • the gel permeation analysis on a Superose 12HR column of this extract (see FIG. 3) reveals a major fraction which represents 70% of the surface and which corresponds to molecular weights of around 7,100 Da.
  • the solution can be desalted by dialysis, or by ultrafiltration and dehydrated by lyophilization, atomization or any other suitable means.
  • the protocol for evaluating the absorption of a substantive agent on hair keratin is based on the analysis of the substance desorbed under specific conditions.
  • the substantive protein of peptide nature was extracted from the hair under two different conditions:
  • FIG. 4A and 4B attached which illustrate, respectively for undamaged control hair (Fig. 4A) and for hair damaged by perming (Fig. 4B).
  • the evaluation protocol consisted in treating squares of the horny layer isolated from human skin, either with 2% solutions of substantive protein (extracts 1, 3 and 4), or with distilled water as a control.
  • FIGS. 5 A and 5B The results relating to the substantivity tests of the extracts 1, 3 and 4 on the stratum corneum evaluated by skin hydration measurements in vitro are summarized in FIGS. 5 A and 5B (Average of 10 tests / +/- SEM / ANOVA at 1 factor / Fischer a posteriori test). Note that extracts 3 and 4 accentuated and prolonged the hydrating effect of the stratum corneum: the increase in dielectric conductivity of 50% was significant up to 4 hours after application, with a hydrating effect observable up to 24 hours after application.
  • FIG. 6 of the appended drawings show that the hydration of the skin is more - 9 - important when the skin area is pretreated with the extract + Kollidon 30 mixture compared to an untreated control area or one containing the film-forming agent alone.
  • the solutions dosed at 1.5% extract + 1.5% Kollidon 30 therefore have a water-retentive activity by substantive effect.
  • Moringa proteins have also surprisingly and unexpectedly demonstrated an anti-pollution effect on human skin by capturing particles such as charcoal.
  • extract 1 as a skin depolluting agent against this smearing effect of carbon and against the penetration of polluting particles into the stratum corneum, has also been evaluated experimentally.
  • the test carried out under standardized conditions consisted in applying to the antero-internal face of the forearm a mixture of Moringa and Kollidon extract, each dosed at 1.5% in water, at a rate of 4 mg / cm 2 .
  • This treatment was followed by voluntary pollution of the skin with the same aqueous suspension of carbon dosed at 0.5%.
  • the skin was then rinsed with distilled water without rubbing, by sucking up the rinsing water. Then a "stripping" or exfoliation (lamination support) was applied to the skin, then removed.
  • the aforementioned extracts according to the invention can be used not only for skin care and hygiene applications (face and body products, day or night products, sun products, anti-wrinkle hygiene product , anti-pollution products), but also in the field of hair care and hygiene (lotion or shampoo, creams, foams, protective, repairing, softening and photoprotective products or products for perm and coloring), products for nails (creams, lotions, hydrating varnishes, film-forming, protective and repairing) and finally lip products (applicator sticks, lipstick, balm, moisturizer, film-forming).
  • the present invention also relates to a cosmetic and / or pharmaceutical composition, in particular for topical use for the skin or the integuments, characterized in that it contains, as active principle, unique or - 1 1 - associated with at least one other active principle, one or more protein fraction (s) as described above, with a weight content of between 0.01% and 80% , preferably around 2%.
  • the protein fractions obtained according to the present invention can be used either in native form (native proteins), without structural modification, or in a modified or functionalized form by any of the following treatments:
  • any suitable cosmetic carrier such as, for example, film-forming agents, liposomes, cyclodextrins, micelles, chylomicrons, macro-, micro- and nanoparticles as well as macro-, micro- and nano capsules, or even be absorbed or grafted onto organic polymers or mineral supports.
  • the protein fractions extracted have in particular substantive and hydrating activities of the skin, the lips and the integuments, in particular of the epidermis, and in particular of the stratum corneum and of the appendices.
  • skin namely skin, hair and nails, as well as physiological conditioning effects of the skin, lips and dander (nails and hair), restructuring, repairing and moisturizing of the skin and dander (nails and hair), effects anti-wrinkle and anti-pollution effects (skin, lips, hair).
  • composition according to the invention comprising at least one protein extract from seeds of the Moringa oleifera plant. - 12 - Example 1
  • a cosmetic product in the form of hydrating and repairing milk may, for example, have a weight composition, formed from the following aqueous and fatty phases, as indicated below.
  • Fat phase Isostearyl and Diglyceryl succinate 3.00
  • Aqueous phase Magnesium sulfate 0.80
  • the process for preparing the above-mentioned hydrating and restorative milk essentially consists in bringing the fatty phase to 80 ° C., in bringing the water of the aqueous phase also to 80 ° C. and in dissolving the preservative therein (Elestab 41 12), then pour the aqueous phase into the fatty phase with turbine stirring and cool) gradually with stirring, then add thereto, at around 50 ° C., the aqueous mother solution of Moringa protein extract, then the perfume and, finally, continue stirring until complete cooling.
  • a cosmetic product in the form of anti-wrinkle repair cream may, for example, have a weight composition, consisting of the following aqueous and fatty phases, as indicated below.
  • Ceteareth 6 (and) Stearyl Stearyl alcohol 1, 00
  • Aqueous phase Glycerin 10.00
  • the process for the preparation of the above-mentioned anti-wrinkle repairing cream essentially consists in bringing the fatty phase to 80 ° C., in bringing the aqueous phase also to 80 ° C. and in dissolving the Elestab 41 12 therein, in preparing the mother solution Moringa Oleifera protein extract, pour the fatty phase into the aqueous phase with turbine stirring, then, around 50 ° C, introduce the mother solution of Moringa extract and finally continue stirring until cooling .
  • Example 3 A cosmetic product in the form of a moisturizing and antipollution day cream may, for example, have a weight composition, constituted from the following aqueous and fatty phases, as indicated below.
  • Aqueous phase PVP 0.50
  • the process for the preparation of the aforementioned moisturizing and antipollution day cream essentially consists in bringing the fatty phase to 80 ° C., in bringing the aqueous phase also to 80 ° C. and in dissolving Elestab 388 and PVP therein, in pouring the fatty phase in the aqueous phase with turbine stirring at 80 ° C, then gradually cool with stirring, then introduce thereto, around - 14 -
  • a cosmetic product in the form of a non-rinsed anti-pollution and biofilmogenic repairing hair lotion may, for example, have a weight composition as indicated below.
  • the process for preparing the anti-pollution and biofilmogenic non-rinsing repairing hair lotion essentially consists in dissolving Elestab 505 and hydroxyethylcellulose in water heated to around 50 ° C, dispersing the perfume and Cremophar RH40 there, then bringing the mixture to temperature. ambient, then dissolve the Moringa proteins in it and finally carry out filtering.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un extrait protéique de graines de plantes du genre Moringa et une composition cosmétique et/ou pharmaceutique contenant au moins un tel extrait. Utilisation d'une fraction protéique extraite des graines d'une plante du genre Moringa appartenant à la famille des Moringaceae, en tant que principe actif, seul ou en association avec au moins un autre principe actif, pour la préparation d'une composition cosmétique et/ou pharmaceutique à usage topique pour la peau et/ou les phanères.

Description

Utilisation d'au moins un extrait protéique de graines de plantes du genre Moringa et composition cosmétique et/ou pharmaceutique correspondante
La présente invention concerne le domaine de la cosmétologie et de la dermatologie, plus particulièrement la cosmétique de soin pour la peau et les phanères, et a pour objet l'utilisation, pour des applications cosmétiques, dermatologique et/ou pharmaceutique, d'au moins un extrait protéique des graines d'une plante du genre Moringa, ainsi qu'une composition cosmétique et/ou pharmaceutique contenant au moins un tel extrait.
Le genre Moringa comprend quelques 14 espèces de plantes (dont notamment Moringa peregrina, M. aptera, M. concanensis, M. drouhardii, M. hildebrandtii, M. longituba), parmi lesquelles Moringa pterygosperma (synonyme Moringa oleifera) est la plus connue.
Il s'agit en l'occurrence d'un arbre à croissance rapide qui s'adapte très bien à des conditions variables, se développant partout dans les tropiques, en Asie, Afrique et Amérique du sud. Les fruits de 30 à 50 cm de long, pendent comme des baguettes de tambour d'où le nom anglais de "drumstic tree", et ses gousses vertes sont appréciées comme légume partout dans le monde. Il en résulte qu'on laisse rarement mûrir les graines en vue de la production d'huile.
Les différentes parties de l'arbre (feuilles, racines, écorce de racines, fleurs, graines) sont utilisées en médecine traditionnelle dans les pays où il pousse.
Les graines de Moringa sont caractérisées par la présence d'une huile dont la teneur varie entre 21 et 53 % selon l'espèce et la maturité des graines.
Pour l'espèce Moringa oleifera les teneurs mentionnées dans la littérature vont de 21 à 34 %.
La comparaison des huiles des graines de Moringa oleifera, M. peregrina, M. concanensis et M. drouhardii met en évidence une composition en acides gras très similaire, ces huiles présentant toutes un contenu très élevé en acide oléique (71 à 78 %) et en acides gras saturés.
L'acide béhénique (C22H44O2) est l'acide gras saturé typique de l'huile de Moringa (teneur 2,6 à 4J %).
Du fait de son excellente stabilité à l'oxydation et de ses bonnes propriétés de fixation de parfums, l'huile de Moringa, également appelée huile de Behen ou de Ben, fut dans les civilisations antiques, l'huile la plus utilisée par les formulateurs d'onguents à usages cosmétiques et religieux. - 2 - Cette huile a été utilisée par les formulateurs en cosmétique jusqu'au siècle dernier et son utilisation a été "redécouverte" récemment.
En dehors de leur contenu en huile, les graines de Moringa ont récemment retenu l'attention des chercheurs car elles sont utilisées traditionnellement pour la clarification des eaux et possèdent donc un potentiel économique pour le traitement et la purification des eaux dans les pays en voie de développement.
Il a en outre été montré que les graines des six espèces de Moringa les plus fréquentes et cultivées contiennent des composés floculants. Les composés responsables de cette activité ont été isolés et identifiés : il s'agit de composés de nature protéique (voir notamment les articles : "Isolation and caracterisation of a flocculating protein from Moringa oleifera lam", de GASSENSCHMIDT U., JANY K.D, TAUSCHE B et NIEBERGALL H.R, Biochimica et biophysica acta, 1243:477-481, 1995 - "Active agents and mechanism of coagulation of turbid waters using moringa oleifera", de NDABIGENGESERE A., SUBBA NARASIAH K. et TALBOT BG., Water research, 29, 2:703-710, 1995).
A partir de farine délipidée de graines de Moringa oleifera, ces protéines ont été extraites en milieu aqueux tamponné, puis isolées par chromatographie d'échange de cation.
Ces protéines floculantes sont éluées par un gradient NaCl et sont constituées par trois fractions actives appelées MOI , MO2, et MO3.
Une seconde étape chromatographique permet de séparer MO2 en trois nouvelles fractions actives appelées (MO2.1, MO2.2 et MO2.3). En électrophorèse PAGE en conditions non dénaturantes, MO2.1,
MO2.2 apparaissent comme homogènes alors que MO2.3 est constitué par plusieurs protéines.
Cependant en SDS-PAGE, deux bandes correspondant aux PM 6,5 kDa et 7 kDa sont observées pour les protéines MO2.1 et MO2.2 qui seraient donc des dimères.
L'isoélectrofocalisation montre que le point isoélectrique de ces protéines floculantes est de 10.
La composition en acides aminés de MO2.1 a été déterminée et montre que cette protéine contient 60 acides aminés avec un contenu élevé en glutamine (15 résidus), arginine (7 résidus) et proline (7 résidus), l'extrémité terminale étant bloquée par une fonction pyroglutamate. - 3 -
Les inventeurs de la présente invention ont découvert de façon inattendue et surprenante, que les extraits protéiques de graines de Moringa, connus pour leurs effets clarifiants sur les eaux turbides, présentaient également des propriétés nouvelles et originales dont les effets bénéfiques sur la peau et les phanères, associés à une très bonne tolérance, les rendent directement utilisables en cosmétique de soin et en pharmacologie, en particulier dans des applications dermatologiques.
Ainsi, le principal objet de la présente invention consiste en l'utilisation d'au moins une fraction protéique extraite des graines d'une plante du genre Moringa appartenant à la famille des Moringaceae, en tant que principe actif, seul ou en association avec au moins un autre principe actif, pour la préparation d'une composition cosmétique et/ou pharmaceutique à usage topique pour la peau et/ou les phanères.
Les propriétés nouvelles de ces extraits protéiques découlent directement de leur nature et propriétés particulières, notamment de leur point isoélectrique basique et de leur capacité floculante.
Il a notamment été constaté un effet adoucissant, des effets conditionneurs et hydratants en raison d'une substantivité importante et des effets chelateurs les rendant appropriées dans le cadre des actifs antipollution. Conformément à un mode de réalisation préféré de l'invention, la ou les fraction(s) protéique(s)consiste(nt) en un ou des extraits de la plante Moringa oleifera, cette ou ces fraction(s) protéique(s) contenant sur la base de l'extrait sec, une teneur en protéines comprise entre 0,01 % et 100 % en poids préférentiel lement d'environ 45 % en poids. Avantageusement, la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) extraite(s) par l'eau ou une solution aqueuse, notamment des solutions salines à différents pH, le cas échéant au moyen d'un générateur à ultrasons.
Ainsi, la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) constituée(s) par un ou des extrait(s) aqueux, des extraits en milieux salins à différents pH, ou en milieu tamponné de graines entières ou décortiquées, partiellement ou totalement délipidées, par un concentré protéique, par des protéines purifiées ou par un mélange d'au moins deux des constituants précités et présente(nt) un point isoélectrique supérieur à 7, préférentiellement compris entre 8 et 12.
La ou les fraction(s) protéique(s) utilisée(s) en tant que principe actif sont préférentiellement obtenue(s) par :
- précipitation au point isoélectrique à un pH compris entre 8 et 12
- chromatographie d'échange d'ions. - 4 - - un procédé d'extraction choisi dans le groupe formé par la chromatographie d'affinité, la filtration sur gel, l'ultrafiltration, la précipitation à l'aide de solvants, de sels comme le sulfate d'ammonium ou autre ou encore la précipitation à l'aide de polymères organiques ou de variations de température. En outre, il a été constaté que, dans le cas de la précipitation au point isoélectrique, l'obtention de la ou les fraction(s) protéique(s) était favorisée par une température inférieure à la température ambiante, notamment par une température autour de + 4° C.
A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on décrira ci-après différents procédés d'obtention et de préparation d'extraits de graines et de fractions protéiques de graines de Moringa, utilisables dans le cadre de la présente invention.
EXEMPLE 1 (Préparation de l'extrait 1)
Des amandes de Moringa oleifera obtenues après décorticage des graines et contenant 33,4 % (poids/poids) d'huile sont délipidées par deux extractions successives à reflux dans de l'hexane et, après filtration, la farine est séchée en étuve à 40° C et présente une teneur en huile résiduelle de 2,5 %.
Dans un réacteur on ajoute 200 g de farine délipidée à 2 litres d'eau distillée. Après 10 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 7,5 par addition de
NaOH 4N et l'extraction est ensuite réalisée pendant une heure à température ambiante en maintenant le pH à 7,5.
L'insoluble est éliminé par centrifugation pendant 15 min. à 5000 g. Le surnageant est recueilli puis filtré sur 0,45 μm : on obtient ainsi 1 ,77 litre de filtrat de couleur jaune, contenant 4,69 % d'extrait sec et présentant une concentration en protéines mesurée par la technique du Biuret de 21 ,54 g/1 (soit une pureté protéique sur la base de l'extrait sec de 45,92 %).
L'extrait est déshydraté par atomisation et 65,72 grammes d'atomisat présentant une teneur en protéines estimée à 54J % (N x 6,25). Si on tient compte des pics élues entre le volume exclu et le volume total de la colonne, le profil chromatographique résultant de l'analyse en perméation de gel sur colonne Superose 12HR de cet extrait (voir figure 1 des dessins annexés) met en évidence une fraction majeure qui représente 52 % de la surface et qui correspond à des poids moléculaires situés entre 7 800 et 1 1 000 Da. La présence d'épaulements dans ce pic confirme l'existence de plusieurs composés et la gamme de poids moléculaires est proche de celle trouvée dans la littérature - 5 - pour les monomères (6 500 et 7 000 Da) et les dimères ( 13 000 Da) de protéines floculantes de Moringa.
EXEMPLE 2 (Préparation de l'extrait 2)
On extrait 300 g de farine délipidée selon l'exemple 1 de manière à obtenir un extrait aqueux brut.
Le pH du filtrat (2J4 litres) est ajusté à 1 1 ,8 par addition progressive de NaOH 4N.
La précipitation débute vers pH 8,0 (trouble net de la solution) et après 30 minutes la solution est centrifugée pendant 15 min. à 5000 g. Le précipité collant est recueilli (43,2 g humide) puis lavé deux fois par 500 ml d'eau distillée à pH 1 1 ,8.
Le précipité est ensuite dissout dans 270 ml d'eau distillée (soit 10 % du volume initial) et le pH de la solution est ajusté en continu à 4,5 par HC1 6N de façon à permettre la solubilisation du précipité (la dispersion est facilitée par l'emploi d'un appareil du type connu sous la désignation Turax).
Après 30 min d'agitation le mélange est centrifugé pendant 15 min. à 5000 g pour éliminer l'insoluble et le surnageant est filtré sur Bϋchner muni d'un filtre Whatman n° 41.
On obtient ainsi 260 ml de concentré protéique, jaune et limpide, qui est déshydraté par lyophilisation.
De cette manière, 1 1,5 grammes de lyophilisât sont obtenus avec une teneur pondérale en protéines de 90-95 %.
L'analyse en perméation de gel sur colonne Superose 12HR de cet extrait (voir figure 2 des dessins annexés) met en évidence une fraction majeure qui représente 70 % de la surface et qui correspond à des poids moléculaires d'environ 8 800 Da.
EXEMPLE 3 (Préparation de l'extrait 3)
L'huile d'amandes obtenues par décorticage des graines de Moringa oleifera est extraite par pression sur une presse du type connu sous la désignation KOMET et les tourteaux obtenus sont broyés afin d'obtenir une farine homogène.
Un extrait brut est préparé à partir de 1 ,24 kg de tourteaux selon le mode opératoire décrit dans les exemples 1 et 2.
Les protéines sont précipitées à pH 1 1 ,8 selon l'exemple 2, mais une étape supplémentaire de décantation d'une nuit à + 4° C est introduite afin de permettre une meilleure précipitation des protéines. - 6 -
Le précipité est traité dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2 (le pH de la solution de reconstitution du précipité étant toutefois de 6 au lieu de 4,5).
Le concentré protéique ainsi obtenu ( 1 ,05 litre à 4,59 % d'extrait sec) est déshydraté par atomisation et 34,6 g d'atomisat sont recueillis, soit un rendement d'atomisation sur la base de l'extrait sec de 71,5 %.
La teneur en protéines sur la base du dosage de l'azote (N x 6,25) est supérieure à 90 % (environ 95 %).
EXEMPLE 4 (Préparation de l'extrait 4) Un extrait brut est préparé à partir de 150 g de tourteaux selon le mode opératoire décrit dans les exemples 1, 2 et 3.
Après filtration sur 0,45 μm, on obtient 1,35 litre de filtrat jaune limpide.
100 grammes de Carboxymethylcellulose (CM52, WHATMAN) sont mis à équilibrer pendant 30 minutes dans 500 ml d'eau distillée à pH 7,5.
Le mélange est filtré sur Buchner muni d'un filtre WHATMAN n° 42, puis la cellulose est recueillie et équilibrée de nouveau dans 500 ml d'eau à pH 7,5.
Après élimination du milieu aqueux par filtration, la cellulose est mise en contact, sous agitation pendant une heure à température ambiante, avec l'extrait aqueux de tourteaux d'amandes de Moringa oleifera.
Les composés non adsorbés (fractions dont le profil chromatographique est représenté en trait interrompu sur la figure 3) sont éliminés par filtration sur Buchner et la cellulose "chargée" est ensuite lavée par deux fois avec un litre d'eau distillée à pH 7,5 puis filtrée sur Buchner.
La cellulose est ensuite mise en contact avec 120 ml d'une solution de NaCl 60 g/1 pH 7,5 pendant 30 minutes.
Les protéines éluées en milieu NaCl sont récupérées par filtration sur Buchner (le profil chromatographique des protéines adsorbées sur CM 52 et éluées en milieu NaCl 60 g/1 est représenté en trait plein sur la figure 3).
On obtient ainsi 1 10 ml de filtrat avec une teneur d'extrait sec de 9,63 % et avec une concentration en protéines de 64,6 g/1 (soit une pureté protéique sur la base de l'extrait sec de 67 %).
L'analyse en perméation de gel sur colonne Superose 12HR de cet extrait (voir figure 3) met en évidence une fraction majeure qui représente 70 % de la surface et qui correspond à des poids moléculaires d'environ 7 100 Da. La solution peut être dessalée par dialyse, ou par ultrafiltration et déshydratée par lyophilisation, atomisation ou tout autre moyen approprié.
Les activités et avantages des produits préparés selon l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative des tests réalisés par les inventeurs et donnés ci-après simplement à titre d'illustration non limitative.
L'effet substantif des fractions protéiques de graines de Moringa préparées selon les exemples précédents (extraits 1, 3 et 4) a été évalué par le test de désorption sur cheveux humains naturels non endommagés et cheveux endommagés par permanentage.
Le protocole d'évaluation d'absorption d'un agent substantif sur la kératine des cheveux est basé sur l'analyse de la substance désorbée dans des conditions spécifiques.
La protéine substantive de nature peptidique a été extraite à partir des cheveux dans deux conditions différentes :
- température élevée (50° C, 1 heure),
- force ionique élevée (0,5 M NaCl, 16 heures), et dosée dans les liquides d'extraction après réaction avec la fluorescamine (réaction avec les aminés primaires) par méthode spectrofluorimétrique (Teglia et al, 1992). La réaction avec la fluorescamine a été effectuée dans le tampon borate à pH 8 pour l'extrait 1 et à pH 6 pour les extraits 3 et 4.
Les résultats sont résumés dans le tableau I ci-après et sur les figures
4 A et 4B annexés qui illustrent, respectivement pour des cheveux témoin non endommagés (Fig. 4A) et pour des cheveux endommagés par permanentage (Fig.
4B), l'effet substantif des extraits 1 , 3 et 4 appliqués sur des mèches de cheveux humains à la concentration de 2 % (évaluation par désorption).
Tableau I
Extraits Cheveux naturels non Cheveux endommagées par endommagés permanentage
1 3,53 mg/g cheveux 4,81 mg/g cheveux
3 1 ,24 mg/g cheveux 1 ,02 mg/g cheveux
Figure imgf000009_0001
4 0,84 mg/g cheveux 1 ,21 mg/g cheveux - 8 - L'effet substantif sur couche cornée des fractions protéiques de graines de Moringa a été évalué sur le modèle d'hydratation de la couche cornée in vitro (Obata et Tagami, 1990).
Le protocole d'évaluation a consisté à traiter des carrés de couche cornée isolée de peau humaine, soit par des solutions à 2 % de protéine substantive (extraits 1 , 3 et 4), soit par l'eau distillée comme témoin.
Après rinçage standard et séchage, la couche cornée est montée sur un modèle d'évaluation d'hydratation cutanée in vitro par mesure de la conductibilité diélectrique. Après mesure de la conductibilité diélectrique de départ en condition d'humidité contrôlée HR = 44 %, la couche cornée a été humidifiée de façon standard et des mesures de conductibilité ont été effectuées 1 , 2, 4, 6 et 24 heures après l'application de l'eau distillée.
La couche cornée en présence d'un produit substantif est hydratée plus longtemps (= meilleure rétention d'eau).
Les résultats relatifs aux tests de substantivité des extraits 1 , 3 et 4 sur la couche cornée évaluée par mesures d'hydratation cutanée in vitro sont résumés par les figures 5 A et 5B (Moyenne de 10 essais / +/- SEM / ANOVA à 1 facteur / Test a posteriori Fischer). On remarque que les extraits 3 et 4 ont accentué et prolongé l'effet hydratant de la couche cornée : l'augmentation de la conductibilité diélectrique de 50 % a été significative jusqu'à 4 heures après application, avec un effet hydratant observable jusqu'à 24 heures après application.
L'effet substantif des fractions protéiques de Moringa (extraits 1 , 3 et 4) a été vérifié in vivo chez l'homme par l'étude de la propriété d'hydrorétention d'une solution aqueuse dosée à 1 ,5 % d'extrait et à 1,5 % de polyvinyl pyrrolidone commercialisé par la société BASF sous la dénomination Kollidon 30 (produit filmogène).
Il a été procédé sur cinq zones cutanées de la face antéro-interne d'un avant-bras, à la mesure par capacitance électrique de l'hydratation apportée par une compresse imbibée d'eau purifiée, toutes les 30 secondes pendant 2 minutes. Une zone était non traitée, les trois suivantes étaient traitées au préalable par 4 μl/cm2 d'une solution aqueuse dosée à 1 ,5 % d'extrait 1 ,3 ou 4 et à 1,5 % de Kollidon 30 et la dernière par 4 μl/cm2 d'une solution aqueuse dosée à 1,5 % de Kollidon 30 seul.
Les résultats présentés sur la figure 6 des dessins annexés (illustrant l 'hydrorétention sur un sujet) montrent que l'hydratation de la peau est plus - 9 - importante quand la zone cutanée est prétraitée par le mélange extrait + Kollidon 30 comparativement à une zone témoin non traitée ou contenant le filmogène seul. Les solutions dosées à 1,5 % d'extrait + 1,5 % de Kollidon 30 possèdent donc une activité hydrorétentrice par effet substantif. Déjà connu pour leurs effets clarifiant sur les eaux turbides, les protéines de Moringa ont également démontré, de façon surprenante et inattendue, un effet anti-pollution sur la peau humaine par captation de particules comme le charbon végétal.
Cette propriété clarifiante des fractions protéiques de graines de Moringa a été vérifiée in vitro, en introduisant dans des tubes à essai, 0J5 ml d'une solution aqueuse de l'extrait 1 avec 3 ml de suspension aqueuse de charbon végétal officinal à 0,5 %, comparativement à 0J5 ml d'eau distillée mis également en contact avec 3 ml de la même suspension aqueuse de charbon.
Il a été observé, après une heure de contact, que dans le tube contenant l'extrait 1 , la suspension noire de charbon d'origine avait laissé la place à un précipité noir au fond du tube avec en surnageant une eau parfaitement limpide, alors que dans le tube sans l'extrait, la suspension aqueuse de charbon noire avait très peu évolué.
Il a été constaté par ailleurs que, de façon avantageuse, l'addition d'un composé filmogène comme le Kollidon 30 (marque déposée - Polyvinylpyrrolidone), accélérait encore le processus de clarification.
Un test in vivo chez l'homme spécialement mis au point, a permis d'observer qu'une suspension aqueuse de charbon végétal officinal polluante appliquée sur la peau, provoquait une salissure importante en surface avec pénétration des particules dans les niveaux superficiels de la couche cornée.
L'efficacité de l'extrait 1 comme dépolluant cutané contre cet effet salissant du charbon et contre la pénétration de particules polluantes dans la couche cornée, a également été évaluée expérimentalement.
Le test réalisé en conditions standardisées a consisté à appliquer sur la face antéro-interne de l'avant-bras un mélange d'extrait de Moringa et de Kollidon, dosés chacun à 1 ,5 % dans l'eau, à raison de 4 mg/cm2. Ce traitement a été suivi par une pollution volontaire de la peau avec la même suspension aqueuse de charbon dosée à 0,5 %. La peau a ensuite été rincée à l'eau distillée sans frotter, en réaspirant l'eau de rinçage. Puis un "stripping" ou gommage (support de pelliculage) a été appliqué sur la peau, puis retiré. - 10 - En microscopie au grossissement x 100, on a observé, d'une part, le stripping témoignant de l'état de la peau en surface et, d'autre part, le microrelief cutané avec les premiers niveaux de la couche cornée, après stripping ou gommage. Parallèlement, la même pollution a été appliquée sur une zone cutanée sans traitement préalable.
Les images de la peau sous grossissement xlOO après stripping ou gommage ont permis de mettre en évidence une très importante diminution de la pénétration des particules de charbon dans la couche cornée de la peau prétraitée par le mélange d'extrait de Moringa et de Kollidon (Fig. 7B) comparativement à la peau témoin (Fig. 7A) pour laquelle la pénétration était beaucoup plus importante.
Les images en microscopie des strippings effectués sur la peau prétraitée par le mélange extrait + Kollidon (Fig. 8B) ont montré une importante diminution de la quantité de particules de charbon, prouvant que le même mélange d'extrait et de Kollidon avait permis au cours de l'opération de rinçage, un nettoyage de la peau beaucoup plus efficace. En effet, par comparaison avec le stripping de la peau non traitée au préalable par l'extrait (Fig. 8A), les nombreuses particules de charbon qui n'avaient pas été éliminées par l'opération de rinçage, étaient restées collées sur le stripping. L'extrait de Moringa exerce donc une activité anti-pollution de deux façons distinctes et complémentaires :
- il capte les particules de charbon et, allié à un filmogène, il empêche ces dernières de pénétrer dans la couche cornée,
- en retenant les particules de charbon, il favorise leur élimination au cours d'une simple opération de rinçage.
Les extraits selon l'invention précités, peuvent être utilisés, non seulement pour des applications de soins et d'hygiène de la peau (produits pour le visage et le corps, produits de jour ou de nuit, produits solaires, produit hygiène anti-rides, produits antipollution), mais également dans le domaine des soins et de l'hygiène capillaires, (lotion ou shampooing, crèmes, mousses, produits protecteurs, réparateurs, adoucissants et photoprotecteurs ou encore produits pour permanente et de coloration), des produits pour les ongles (crèmes, lotions, vernis hydratants, filmogènes, protecteurs et réparateurs) et enfin des produits pour les lèvres (bâtons applicateurs, rouge à lèvres, baume, hydratant, filmogène). Ainsi, la présente invention a également pour objet une composition cosmétique et/ou pharmaceutique, notamment à usage topique pour la peau ou les phanères, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre de principe actif, unique ou - 1 1 - associé à au moins un autre principe actif, une ou plusieurs fraction(s) protéique(s) telle(s) que décrite(s) ci-dessus, avec une teneur pondérale comprise entre 0,01 % et 80 %, préférentiellement d'environ 2 %.
Les fractions protéiques obtenues selon la présente invention peuvent être utilisées soit sous forme native (protéines natives), sans modification de structure, soit sous une forme modifiée ou fonctionnalisée par l'un quelconque des traitements suivants :
- polymérisation des protéines natives extraites de la plante du genre Moringa, - fermentation par des cellules microbiennes ou végétales,
- hydrolyse chimique des protéines natives extraites de la plante du genre Moringa,
- hydrolyse enzymatique des protéines natives par des protéases d'origine animale végétales, microbienne ou fongique, - la fonctionnalisation chimique ou enzymatique,
- modification chimique par greffage de molécules ou de composés tels que, par exemple, des oses, des osides, des lipides ou autre.
Elles peuvent également être incorporées dans ou associées à tout vecteur cosmétique adéquat comme, par exemple, les agents filmogènes, les liposomes, les cyclodextrines, les micelles, les chylomicrons, les macro-, micro- et nano particules ainsi que macro-, micro- et nano capsules, ou encore être absorbées ou greffées sur des polymères organiques ou des supports minéraux.
Par conséquent, il a été constaté et démontré ci-dessus que les fractions protéiques extraites présentent notamment des activités substantive et hydratante de la peau, des lèvres et des phanères, en particulier de l'epiderme, et notamment de la couche cornée et des annexes cutanées, à savoir peau, cheveux et ongles, ainsi que des effets conditionneurs physiologiques de la peau, des lèvres et des phanères (ongles et cheveux), restructurant, réparateur et hydratant de la peau et des phanères (ongles et cheveux), des effets antirides et des effets antipollution (peau, lèvres, cheveux).
A titre d'exemples non limitatifs de réalisations pratiques de composition selon l'invention, on décrira ci-après différents produits ou préparations cosmétiques comprenant au moins un extrait protéique de graines de la plante Moringa oleifera. - 12 - Exemple 1
Un produit cosmétique sous forme de lait hydratant et réparateur pourra, par exemple, présenter une composition pondérale, constituée à partir des phases aqueuses et grasses suivantes, telle qu'indiquée ci-après. Phase grasse : Succinate d'Isostéaryle et de Diglycéryle 3,00
Huile de paraffine 15,00
Quaternium-18 Hectorite 0,50
Poly(PEG-22/Dodécyle Glycol) 1,00
Phase aqueuse : Sulfate de magnésium 0,80
Butylène glycol 4,00
Extr. protéinique de Moringa oleifera (selon Ex. 1) et 1 ,00
Eau distillée 9,00
Elestab 41 12 (Laboratoires Sérobiologiques) 0,35
Parfum 0,30
Eau distillée qsp 100,00
>
Le procédé de préparation du lait hydratant et réparateur précité consiste essentiellement à porter la phase grasse à 80° C, à porter l'eau de la phase aqueuse également à 80° C et à y dissoudre le préservateur, (Elestab 41 12), puis à verser la phase aqueuse dans la phase grasse sous agitation turbine et à refroidir ) progressivement sous agitation, à y ajouter ensuite, vers 50° C, la solution mère aqueuse d'extrait protéique de Moringa, puis le parfum et, enfin, à poursuivre l'agitation jusqu'à refroidissement complet. Exemple 2
Un produit cosmétique sous forme de crème réparatrice antirides . pourra, par exemple, présenter une composition pondérale, constituée à partir des phases aqueuse et grasse suivantes, telle qu'indiquée ci-après.
Phase grasse : Ceteareth 25 2,00
Ceteareth 6 (and) Stearyl Alcool stéarylique 1 ,00
Alcool cétylique 4,00
Stéarate de glycérol 4,00
Pétrolatum 5,00
Triglycérides capryliques / capriques 5,00 - 13 -
Phase aqueuse : Glycérine 10,00
Protéines de Moringa Oleifera (préparée selon ex. 2) et 1 ,50
Eau distillée 8,50
Préservateur Elestab 41 12 (Laboratoires Sérobiologiques) 0,40
Parfum 0,30
Eau distillée qsp 100
Le procédé de préparation de la crème réparatrice antirides précitée consiste essentiellement à porter la phase grasse à 80° C, à porter la phase aqueuse également à 80° C et à y dissoudre l'Elestab 41 12, à préparer séparément la solution mère d'extrait protéique de Moringa Oleifera, à verser la phase grasse dans la phase aqueuse sous agitation turbine, puis, aux environs de 50° C, à y introduire la solution mère d'extrait de Moringa et enfin à poursuivre l'agitation jusqu'au refroidissement. Exemple 3 Un produit cosmétique sous forme de crème de jour hydratante et antipollution pourra, par exemple, présenter une composition pondérale, constituée à partir des phases aqueuse et grasse suivantes, telle qu'indiquée ci- après.
Phase grasse : Stéarate de glycérol 14,00
Octyldodécanol 6,00
Adipate dibutylique 6,00
Ceteareth 12 1,50
Ceteareth 20 1 ,50
Phase aqueuse : PVP 0,50
Glycérine 4,00
Elestab 388 (Laboratoires Sérobiologiques) 2,00
Extrait protéique de Moringa (Ext. n° 2) et 1 ,00
Eau distillée 9,00
Parfum 0,20
Eau distillée qsp 100
Le procédé de préparation de la crème de jour hydratante et antipollution précitée consiste essentiellement à porter la phase grasse à 80° C, à porter la phase aqueuse également à 80° C et à y dissoudre Elestab 388 et PVP, à verser la phase grasse dans la phase aqueuse sous agitation turbine à 80° C, puis, à refroidir progressivement sous agitation, à y introduire ensuite, aux environs de - 14 -
50° C, la dispersion mère de protéines de Moringa et enfin à poursuivre l'agitation jusqu'au refroidissement.
Exemple 4
Un produit cosmétique sous forme de lotion capillaire non rincée réparatrice antipollution et biofilmogene pourra, par exemple, présenter une composition pondérale telle qu'indiquée ci-après.
Protéines de Moringa préparées selon exemple 4 0,50
Eau distillée 9,50
Hydroxyethylcellulose 0,50
Elestab 305 (Laboratoires Sérobiologiques) 0,50
Parfum 0,10
Cremophor RH40 0,30
Eau distillée qsp 100,00
Le procédé de préparation de la lotion capillaire non rincée réparatrice antipollution et biofilmogene consiste essentiellement à dissoudre Elestab 505 et hydroxyethylcellulose dans l'eau chauffée aux environs de 50° C, à y disperser le parfum et Cremophar RH40, puis à ramener le mélange à température ambiante, à y dissoudre ensuite les protéines de Moringa et enfin à réaliser un filtrage.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims

- 15 -
R E V E N D I C A T I O N S
1 ) Utilisation d'au moins une fraction protéique extraite des graines d'une plante du genre Moringa appartenant à la famille des Moringaceae, en tant que principe actif, seul ou en association avec au moins un autre principe actif, pour la préparation d'une composition cosmétique et/ou pharmaceutique à usage topique pour la peau, les lèvres et/ou les phanères.
2) Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s)consiste(nt) en un ou des extraits de la plante Moringa oleifera.
3) Utilisation selon les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) extraite(s) par l'eau ou une solution aqueuse, notamment des solutions salines à différents pH, le cas échéant au moyen d'un générateur à ultrasons.
4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) constituée(s) par un ou des extrait(s) aqueux ou en milieu tamponné de graines entières ou décortiquées partiellement ou totalement délipidées, par un concentré protéique, par des protéines purifiées ou par un mélange d'au moins deux des constituants précités.
5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) contien(en)t, sur la base de l'extrait sec, une teneur en protéines comprise entre 0,01 % et 100 % en poids préférentiellement d'environ 45 % en poids.
6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les fraction(s) protéique(s) comporte(nt) au moins un composé protéique dont le point isoélectrique est supérieur à 7, préférentiellement compris entre 8 et 12.
7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) obtenue(s) par précipitation au point isoélectrique à un pH compris entre 8 et 12. 8) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) obtenue(s) par chromatographie d'échange d'ions.
9) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) obtenue(s) par un - 16 - procédé de préparation choisi dans le groupe formé par la chromatographie d'affinité, la filtration sur gel, l'ultrafiltration, la précipitation à l'aide de solvants, de sels comme le sulfate d'ammonium ou autre ou encore la précipitation à l'aide de polymères organiques ou de variations de température. 10) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) consiste(nt) en des protéines natives.
1 1 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) consiste(nt) en un hydrolysat chimique ou enzymatique préparé à partir des protéines natives.
12) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) est (sont) obtenue(s) par polymérisation des protéines natives extraites de la plante du genre Moringa ou fermentation par des cellules microbiennes ou végétales. 13) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la ou les fraction(s) protéique(s) sont chimiquement modifiées par greffage de composés tels que, par exemple, des oses, des osides, des lipides ou analogues.
14) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les fractions protéiques sont incorporées ou associées à un vecteur cosmétique adéquat tels que, par exemple, des agents filmogènes, des liposomes, des cyclodextrines, des micelles, des chylomicrons, des macro-, micro- ou nano-particules ou encore des macro-, micro- ou nano-capsules.
15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les fractions protéiques sont absorbées ou greffées sur des polymères organiques ou des supports minéraux.
16) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les fractions protéiques extraites présentent des activités substantive et hydratante de la peau, des lèvres et des phanères, en particulier de l'epiderme, et notamment de la couche cornée et des annexes cutanées, à savoir peau, cheveux et ongles.
17) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les fractions protéiques extraites présentent des effets conditionneurs physiologiques de la peau, des lèvres et des phanères restructurant, réparateur et hydratant de la peau, des lèvres et des phanères ainsi que des, effets antirides et effets antipollution. - 17 - 18) Composition cosmétique et/ou pharmaceutique, notamment à usage topique pour la peau ou les phanères, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre de principe actif, unique ou associé à au moins un autre principe actif, une ou plusieurs fraction(s) protéique(s) selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, avec une teneur pondérale comprise entre 0,01 % et 80 %, préférentiellement d'environ 2 %.
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