WO1999062938A2 - Polypeptide, herkommlich von dem humanen herpesvirus 8 und deren diagnostische und medische verwendung - Google Patents

Polypeptide, herkommlich von dem humanen herpesvirus 8 und deren diagnostische und medische verwendung Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to (poly) peptides which are recognized by anti-HHV8 antibodies of HHV8-infected patients, these (poly) peptides being non-naturally occurring HHV8 proteins. Furthermore, the present invention relates to polymers comprising at least two identical or different peptides according to the invention, as well as conjugates which comprise the peptides and / or polymers according to the invention. Furthermore, mixtures are described which comprise the peptides and / or polymers of the invention and are used in methods to detect anti-HHV8 antibodies in a very sensitive and specific manner. The present invention also relates to a diagnostic kit which comprises the peptides, polymers and / or mixtures according to the invention and can be used for the detection of anti-HHV8 antibodies or for the diagnosis of an HHV8 infection.
  • HHV8 Human herpes virus 8
  • KS Kaposi's sarcoma
  • B-cell lymphomas Human herpes virus 8
  • KS Kaposi's sarcoma
  • AIDS-associated KS is characterized by an aggressive course and high mortality, while the course of the disease in classic KS is usually relatively indolent and slowly progressive.
  • Other forms of this disease are the so-called "endemic" KS, which mainly occurs in children and adolescents in sub-Saharan Africa, and the iatrogenic KS in immunosuppressed transplant recipients.
  • KS was first described as a relatively rare tumor more than 100 years ago, which mainly occurred in older men of Mediterranean or Eastern European origin (2). Externally, KS manifests itself through sharply defined, nodular lesions of the skin, mostly in the area of the extremities; the lesions are also observed on the mucous membranes and viscera. Characteristic histological feature these lesions are the presence of elongated, spindle-shaped cells, presumably of endothelial origin. There are also a number of other cell types such as
  • Monocytes Monocytes, fibroblasts, neovascular structures and extravascular erythrocytes. in the
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HHV8 Human Herpes Virus 8
  • the 140 kb genome has recently been cloned and sequenced (5).
  • DNA is also a prognostic indicator for the later development of a Kaposi
  • HHV8 is probably also due to the pathogenesis of certain lymphomas, such as
  • HHV8 may be involved in the pathogenesis of these diseases, a causal relationship has not yet been definitively proven. In some regions (e.g. Central Africa) HHV8 also appears in the
  • KS mainly affects people with an immune deficiency of any kind and can only be treated with moderate success chemotherapeutically, surgically or with ionizing radiation (there is currently no causal therapy or a definitive cure for this disease), it must be assumed that immunodeficient people are particularly at risk from the administration of HHV8-contaminated blood preparations are exposed to developing Kaposi sarcoma.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • HHV8-specific antibodies in the serum is an indication of (earlier) contact with the antigen. Under certain circumstances, this can turn out to be positive even if the amount of viral DNA is below the detection limit of the PCR.
  • the presence of HHV8-specific antibodies can also be examined using an indirect fluorescence assay (IFA) (24) and Western blot (29, 30).
  • the present invention relates to a (poly) peptide which is recognized by anti-HHV8 antibodies of HHV8-infected patients and which is characterized in that it
  • (a) comprises one of the amino acid sequences identified in SEQ ID NO: 1 to 8;
  • (b) consists of one of the amino acid sequences identified in SEQ ID NO: 1 to 8; or
  • (c) consists of an amino acid sequence that deviates from one of the amino acid sequences identified in (a) or (b) by one or more substitutions, deletions and / or insertions; the (poly) peptide is not a naturally occurring HHV8 protein.
  • Naturally occurring HHV8 proteins in the sense of this invention are those HHV8 proteins which have the complete amino acid sequence and are not degraded.
  • the (poly) peptide is recognized by anti-HHV8 antibodies in body fluids of HHV8-infected patients.
  • Methods for determining the antigenic property of the (poly) peptide according to the invention by means of anti-HHV8 antibodies and methods for their isolation, preferably from body fluids of HHV8-infected patients, are known to the person skilled in the art and include, for example, the ELISA.
  • body fluids includes, for example, blood, serum, lymph, tissue fluid and tissue extracts, for example from mucosae of respiratory, urogenital or gastrointestinal origin. Furthermore, this term includes body fluids that have been treated or prepared in such a way that they are suitable, for example, for use in the methods mentioned above. Examples of this are sera diluted in vitro, with preservatives (such as, for example, cold-protecting Substances) mixed body fluids or with anticoagulant substances
  • (poly) peptide as used in the invention includes both peptides and polypeptides.
  • (Poly) peptides according to the invention which comprise one of the amino acid sequences identified in SEQ ID NO .: 1 to 8 can be flanked, for example, by an HHV8 sequence and / or another sequence which is not derived from HHV8.
  • the (poly) peptide according to the invention is not a naturally occurring HHV8 protein, i.e. the (piy) peptide of the invention is not a full-length HHV8 protein as encoded by HHV8 genomes.
  • the (poly) peptides according to the invention preferably represent linear epitopes of different coding regions of the HHV8 genome and are preferably at most 50 amino acids in length. A length of at most 15 amino acids is more preferred, and a length of the (poly) peptides according to the invention of 10 or 12 amino acids is most preferred.
  • substitution encompasses both conservative and non-conservative amino acid exchanges.
  • Conservative amino acid exchanges include those in which, for example, a neutral, hydrophobic, a neutral, polar, a basic or an acidic amino acid is replaced by an amino acid of the same class.
  • the various classes of amino acids, the class membership of which is determined by the specific side groups, are well known to the person skilled in the art. It is essential that the three-dimensional structure of the (poly) peptides is not changed in such a way that they are no longer recognized by anti-HHV8 antibodies.
  • peptides according to the invention were identified in a screening of approximately 3000 peptides, which was carried out according to the following criteria:
  • the (poly) peptides according to the invention also comprise compounds produced by peptidomimetics, preferably (poly) peptides, which correspond to the aforementioned (poly) peptides in their immunological / diagnostic properties.
  • peptidomimetics preferably (poly) peptides, which correspond to the aforementioned (poly) peptides in their immunological / diagnostic properties.
  • Those skilled in the art know how such molecules e.g. can be designed and produced using L and D amino acids (e.g. Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777).
  • the present invention preferably relates to a peptide mix which consists of a combination of (poly) peptides according to the invention.
  • the peptide mix comprises the (poly) peptides with the amino acid sequences identified in SEQ ID NO .: 1, 3, 4 and 8.
  • the peptide mix according to the invention contains these (poly) peptides in a molar ratio of 1: 1: 1: 1.
  • Anti-HHV8 antibodies can be detected in a particularly advantageous manner using the peptide mix according to the invention, this detection surprisingly far exceeding both the sensitivity and the specificity of conventional detection methods (see below).
  • the (poly) peptide which comprises an amino acid sequence which differs from one of the amino acid sequences identified in (a) by one or more substitutions, deletions and / or insertions is a naturally occurring sequence variant.
  • Such peptides which represent sequence variants of the corresponding positions in the genome of HHV8 (5), can further increase the sensitivity of the detection. The specificity is retained, since the selection of the peptides, including those based on minimal homology to known (viral) proteins, excludes highly conserved areas from the outset.
  • the present invention relates to a polymer which comprises at least two identical or different (poly) peptides according to the invention.
  • the polymers include homopolymers consisting of several copies of a single (poly) peptide according to the invention, and also heteropolymers from any combination of the (poly) peptides according to the invention, such heteropolymers also being able to contain several copies of a (poly) peptide according to the invention .
  • the polymer according to the invention is characterized by an unbranched chain of polymerized (poly) peptides according to the invention.
  • the polymer according to the invention is characterized by branched chains of polymerized (poly) peptides according to the invention.
  • Polymers with branched chains of polymerized (poly) peptides are made, for example, by linking the (poly) peptides via an amino acid or an amino acid analog that have two amino groups and one carboxyl group, each group capable of forming a peptide bond.
  • Such synthesis processes are known to the person skilled in the art.
  • the present invention relates to polymers which comprise the peptides having the amino acid sequences identified in SEQ ID NO .: 1, 3, 4 and 8.
  • the (poly) peptide according to the invention or the polymer according to the invention is chemically synthesized.
  • the present invention preferably also relates to mixtures consisting of the polymers according to the invention.
  • the present invention relates to a fusion protein which comprises a (poly) peptide according to the invention or a polymer according to the invention.
  • the present invention relates to a polynucleotide which encodes a (poly) peptide, polymer or fusion protein according to the invention.
  • the polynucleotide is DNA or RNA.
  • the present invention further relates to a vector which is an inventive
  • the vector according to the invention is a
  • the term “expression vector” encompasses both prokaryotic and eukaryotic expression vectors.
  • the necessary regulatory elements for the expression of a (poly) peptide are well known to the person skilled in the art and can be selected according to the expression conditions.
  • the term “expression” can mean transcription as well as transcription and translation. Regulatory elements include in particular Promoters.
  • a number of promoters are available for the expression of a polynucleotide according to the invention in prokaryotic cells, for example the E. coli lac or trp promoter, the P R or PL promoter of the lambda phage, lad, lacZ,
  • Eukaryotic promoters are, for example, the CMV immediate early promoter, the HSV promoter, the thymidine kinase promoter, the SV40 promoter, the LTRs of retroviruses and the mouse metallothioninl promoter. It is already one
  • Promoters can also use vectors according to the invention for further elements
  • Examples include the SV40 enhancer, the polyoma enhancer, the cytomegalovirus early promoter enhancer and adenovirus enhancer.
  • the invention relates to a host cell which contains a vector according to the invention.
  • the term “host cell” includes both prokaryotic and eukaryotic host cells.
  • Preferred procaryotic host cells include e.g. E. coii cells, Streptomyces, Bacillus or Salmonella cells.
  • Preferred eukaryotic host cells include fungal cells, e.g. Yeast cells, in particular Saccharomyces cerevisae cells, insect cells such as e.g. Drosophila or SF9 cells, animal cells such as e.g. CHO or COS cells, plant cells or mammalian cells.
  • the invention relates to a method for producing a (poly) peptide, polymer or fusion protein according to the invention, which comprises the following steps:
  • the conditions which cause expression of a (poly) peptide are known to the person skilled in the art and can be selected in accordance with the host cell and the expression vector used.
  • the extraction of the expression product is also corresponding.
  • the (poly) peptide is obtained from the culture supernatant. If the expression takes place intracellularly, the expression product is isolated from the host cell.
  • the present invention relates to a conjugate which comprises a (poly) peptide, polymer or fusion protein according to the invention, or a (poly) peptide, polymer or fusion protein, produced by the method according to the invention.
  • the present invention relates to a composition which comprises at least one (poly) peptide according to the invention, and / or a polymer according to the invention, and / or a fusion protein according to the invention, and / or a (poly) peptide, polymer or fusion protein Process according to the invention, and / or a conjugate according to the invention, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier and / or a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the composition is a drug.
  • the medicament is a vaccine.
  • the peptides, individually or in combination, are preferably coupled to a carrier.
  • suitable carriers are polystyrene beads, streptavidin, BSA or KLH.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents are known to those skilled in the art and include e.g. Phosphate buffered saline, water, emulsions such as e.g. Oil / water emulsions, various types of wetting agents or detergents, sterile solutions, etc.
  • Drugs comprising such carriers can be formulated using known conventional methods. These drugs can be administered to an individual in an appropriate dose. Administration can be oral or parenteral, e.g. intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, locally, intranasally, intrabronchially or intradermally, or via a catheter at one location in an artery. The treating doctor determines the type of dosage according to the clinical factors.
  • the type of dosage depends on various factors, e.g. height or weight, body surface area, age, gender or general health of the patient, but also of the agent to be administered, the duration and type of administration, and of other medications which may be administered in parallel.
  • a typical dose may e.g. are in a range between 0.001 and 1000 ⁇ g, doses below or above this exemplary range being conceivable, especially taking into account the factors mentioned above.
  • the dose should be in a range between 1 ⁇ g and 10 mg units per day. If the composition is administered intravenously, which is not preferred to minimize the risk of anaphylactic reactions, the dose should be in the range between 1 ⁇ g and 10 mg units per kilogram of body weight per minute.
  • composition of the invention can be administered locally or systemically.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions.
  • non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and organic ester compounds such as ethyl oleate, which are suitable for injections are.
  • Aqueous carriers include water, alcoholic aqueous solutions, emulsions,
  • Intravenous carriers include e.g. Liquid, nutrient and
  • Electrolyte supplements such as those based on Ringer's dextrose.
  • the composition of the invention may also include preservatives and other additives such as e.g. antimicrobial compounds, antioxidants,
  • Differentiation factors, interferons, chemotactic proteins or a non-specific immunomodulatory agent can be included.
  • the present invention relates to a method for
  • step (b) Detection of the antibodies bound in step (a).
  • the method according to the invention is also suitable as a prognostic indicator for the possible development of Kaposi's sarcoma in HIV-infected people or people with other natural or iatrogenic immune defects.
  • a mixture of the (poly) peptides comprising the amino acid sequences identified in SEQ ID NO: 1, 3, 4 and 8 is used in this method.
  • Coating technology an average deviation of less than 5%).
  • Genome instead of individual recombinant antigens such as ORF65 (32) or the minor
  • Capsid Protein (33) recognized a wider range of HHV8 specific antibodies. This is especially important for sera from patients who have had before
  • Antibody titers are often very low. Other peptide-based immunoassays on the
  • Epitops are not sufficient to achieve a diagnostically usable detection rate of at least 90% of all positive sera.
  • the (poly) peptides according to the invention are chemically synthesized.
  • the (poly) peptides and / or polymers, and / or fusion proteins, and / or conjugates according to the invention are preferably biotinylated for use in the method according to the invention.
  • the biotinylated components are then bound to a streptavidin-coated solid phase via the highly specific biotin-streptavidin interaction. This coupling procedure also ensures in the case of mixtures of (poly) peptides of different charge according to the invention or
  • the mixture comprises these (poly) peptides in a molar ratio of 1: 1: 1: 1.
  • the method according to the invention is an enzyme-linked immunoabsorption assay (ELISA), an enzyme immunodotassay, an immunobead assay, a passive hemaggiutination assay (PHA) or a peptide-antibody-peptide sandwich assay.
  • ELISA enzyme-linked immunoabsorption assay
  • PHA passive hemaggiutination assay
  • peptide-antibody-peptide sandwich assay is an enzyme-linked immunoabsorption assay (ELISA), an enzyme immunodotassay, an immunobead assay, a passive hemaggiutination assay (PHA) or a peptide-antibody-peptide sandwich assay.
  • the biological sample is a treated or untreated form of blood, serum, tissue extract, tissue fluid, cell culture supernatant, or cell lysate.
  • treated form reference is made to the corresponding definition of the term “body fluids” mentioned above, which also applies to the possibilities of treatment or preparation in this context.
  • the method according to the invention comprises the further step:
  • step (c) Detection of non-specific bindings, which are caused by antibodies additionally present in the biological sample in step (a).
  • additional antibodies e.g. bind to the surface of the wells of a microtiter plate independently of the antigen or unspecifically and produce a false positive signal. False-positive results due to non-specific binding to the matrix are reliably recognized and eliminated by individual blank values. This is important for use in blood bank screening to avoid unnecessary donor blood removal due to false positive results for HHV8 detection.
  • the present invention further relates to a kit containing:
  • reporter molecule in the context of the present invention encompasses both enzymes such as e.g. Peroxidase or alkaline phosphatase (in these cases the detection system used can be based, for example, on a colorimetric reaction, for example the implementation of ABTS by a peroxidase), other enzymes, radioisotopes, fluorophores, bioluminescent molecules, chemiluminescent molecules or the like, as well as their conjugates, e.g. with a second antibody, e.g. recognizes human IgG or IgM antibodies.
  • enzymes such as e.g. Peroxidase or alkaline phosphatase (in these cases the detection system used can be based, for example, on a colorimetric reaction, for example the implementation of ABTS by a peroxidase), other enzymes, radioisotopes, fluorophores, bioluminescent molecules, chemiluminescent molecules or the like, as well as their conjugates, e
  • the kit according to the invention can be used for the detection of anti-HHV8 antibodies and for the diagnosis of HHV8 infections in mammals, preferably in body fluids such as e.g. Blood, serum, tissue extracts, tissue fluids, but also in vitro cell culture supernatants and cell lysates can be used as test reagents in an immunoassay.
  • Any suitable immunoassay can be used for this purpose, in particular an enzyme-linked immunoabsorption assay (ELISA), an enzyme immunodotassay, an immunobead assay, a passive hemagglutinination assay (PHA), a peptide-antibody-peptide sandwich assay or other methods known to the person skilled in the art.
  • the kit contains a mixture of the (poly) peptides which comprise or represent the amino acid sequences identified in SEQ ID NO .: 1, 3, 4 and 8.
  • the present invention relates to the use of at least one (poly) peptide according to the invention, and / or one Polymer according to the invention, and / or a fusion protein according to the invention, and / or a (poly) peptide, polymer or fusion protein, produced by the method according to the invention, and / or a conjugate according to the invention
  • the HHV8-associated diseases are Kaposi's sarcoma, Castleman's disease, primary effusion lymphoma, interstitial pneumonia, encephalitis and multiple myelomas.
  • the present invention relates to the use of at least one (poly) peptide according to the invention, and / or a polymer according to the invention, and / or a fusion protein according to the invention, and / or a (poly) peptide, polymer or fusion protein, produced by the method according to the invention , and / or a conjugate according to the invention for the production of antibodies.
  • antibodies The production of antibodies is known to the person skilled in the art and comprises, for example, the immunization of an animal with an antigen which is optionally coupled to a carrier and / or is administered in combination with other immunostimulating substances (see, for example, Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988).
  • Other known methods include screening antibody libraries using phage display technology and recombinant production of the desired antibody.
  • the present invention relates to the use of at least one (poly) peptide according to the invention, and / or a polymer according to the invention, and / or a fusion protein according to the invention, and / or a (poly) peptide, polymer or fusion protein, produced by the method according to the invention , and / or a conjugate according to the invention for the detection of anti-HHV8 antibodies.
  • Serum activity against the preferred peptide mix was determined in HIV + / KS + patients.
  • the columns show the mean and the standard deviation for (i) positive sera, (ii) sera from patients with a CD4 cell count of less than 50 / ⁇ l, (iii) negative sera.
  • the average serum activity is significantly lower in patients in advanced disease stages than for the whole group.
  • Serum activity and CD4 cell count in the course Serum samples from an HIV + / KS + patient were retrospectively tested in the HHV8 ELISA. HHV8-specific antibodies can already be detected in the patient's blood 14 months before the diagnosis of Kaposi sarcoma. The additional CD4 cell counts are a measure of the patient's relative immunodeficiency.
  • the method according to the invention in HIV patients usually reacts positively several years before the clinical diagnosis of Kaposi sarcoma. Since various anti-herpes agents are currently being tested as possible KS therapeutics, these or other antiviral substances (if they prove to be effective in the treatment of KS) could possibly be used preventively as soon as an infection with HHV8 is safe with the method / kit according to the invention is proven.
  • N-terminally biotinylated, 14 amino acid long peptides (10 amino acids of the respective antigen, Ser-Gly-Ser-Gly tetrapeptide as spacer) are used for the KS peptide ELISA.
  • the stock solution of the peptides (1 ⁇ mol / ml in 100% DMSO) becomes Coating of streptavidin microtiter plates (Combiplate 8, Life Sciences or MC,
  • the test material e.g. 1: 100 diluted patient serum
  • the plates are washed 5 times and then incubated with a 1: 10,000 dilution of a peroxidase-conjugated anti-human IgG or IgM antibody for 1 hour at room temperature. This is followed by 5 washes, the last two with PBS without tween.
  • HHV8 antibody ELISA Various control panels and control peptides were used to test the specificity of the HHV8 antibody ELISA.
  • An EBV control peptide (see Table 2) was used to investigate in how many cases comparable antibody titers against HHV8 or EBV (a herpes virus related to it) could be detected. In 56 out of 64 cases, the observed antibody titers were at least 30% divergent; the EBV infection rate was 86% in HIV patients and 72% in controversial sera.
  • Serum samples and preparations of genomic DNA from unfractionated peripheral blood cells were prepared from 100 subjects.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus contains G protein-coupled reeeptor and cyclin D homologs which are expressed in Kaposi's sarcoma and malignant lymphoma. J Virol 70, 8218-8223 (1996).
  • the prevalence of serum antibody to human herpesvirus 8 (Kaposi sarcoma-associated herpesvirus) among HIV-seropositive and high-risk HIV -seronegative women. Jama 277, 478-481 (1997).
  • the position information relates to the published sequence of the HHV8 genome by Russo et al. (5) (Genbank accession No. U75698).
  • the position information relates to HIV-1 HXB2 (Genbank accession no. M38432), Epstein-Barr virus strain B95-8 (V01555) and poliovirus type Sabin 1 (V01150).
  • the first 4 amino acids in italic letters (SGSG) were inserted as spacers.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft (Poly)peptide, die von anti-HHV8 Antikörpern HHV8-infizierter Patienten erkannt werden, wobei diese (Poly)peptide nicht natürlich vorkommende HHV8-Proteine sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Polymere, umfassend mindestens zwei gleiche oder verschiedene erfindungsgemäße Peptide, sowie Konjugate, die die erfindungsgemäßen Peptide und/oder Polymere umfassen. Des weiteren sind Gemische beschrieben, die die erfindungsgemäßen Peptide und/oder Polymere umfassen und in Verfahren eingesetzt werden, um sehr sensitiv und spezifisch anti-HHV8 Antikörper nachzuweisen. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit, der die erfindungsgemäßen Peptide, Polymere und/oder Gemische umfaßt und zum Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern bzw. zur Diagnose einer HHV8-Infektion eingesetzt werden kann.

Description

NEUE (POLY)PEPTIDE, DIE EPITOPE DES HUMANEN HERPESVIRUS 8
DARSTELLEN
Die vorliegende Erfindung betrifft (Poly)peptide, die von anti-HHV8 Antikörpern HHV8- infizierter Patienten erkannt werden, wobei diese (Poly)peptide nicht natürlich vorkommende HHV8-Proteine sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Polymere, umfassend mindestens zwei gleiche oder verschiedene erfindungsgemäße Peptide, sowie Konjugate, die die erfindungsgemäßen Peptide und/oder Polymere umfassen. Desweiteren sind Gemische beschrieben, die die erfindungsgemäßen Peptide und/oder Polymere umfassen und in Verfahren eingesetzt werden, um sehr sensitiv und spezifisch anti-HHV8 Antikörper nachzuweisen. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit, der die erfindungsgemäßen Peptide, Polymere und/oder Gemische umfaßt und zum Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern bzw. zur Diagnose einer HHV8-lnfektion eingesetzt werden kann.
Das humane Herpesvirus 8 (HHV8) ist das mutmaßliche ätiologische Agens des Kaposi Sarkoms und bestimmter B-Zell Lymphome. Das Kaposi Sarkom (KS) ist der weitaus häufigste Tumor bei AIDS Patienten. Man schätzt, daß 20 bis 30% aller Patienten im Laufe ihrer HIV Infektion an KS erkranken. In den U.S.A. ist die Inzidenz damit 20.000 x höher als in der Gesamtpopulation (1). In manchen geografischen Regionen, wie z.B. in den Ländern des Mittelmeerraums oder Afrika liegt die Gesamtinzidenz deutlich höher. AIDS-assoziiertes KS ist durch einen aggressiven Verlauf und hohe Mortalität gekennzeichnet, während der Krankheitsverlauf beim klassischen KS meist relativ indolent und langsam progredient ist. Weitere Formen dieser Erkrankung sind das sogenannte "endemische" KS, das vor allem bei Kindern und jugendlichen Erwachsenen in Afrika südlich der Sahara auftritt sowie das iatrogene KS bei immunsupprimierten Transplantationsempfängern.
KS wurde erstmals vor mehr als 100 Jahren als ein relativ seltener Tumor beschrieben, der vor allem bei älteren Männern mediterranen oder osteuropäischen Ursprungs auftrat (2). Äußerlich manifestiert sich KS durch scharf umgrenzte, noduläre Läsionen der Haut meist im Bereich der Extremitäten; die Läsionen werden aber auch an den Schleimhäuten und Viszera beobachtet. Charakteristisches histologisches Merkmal dieser Läsionen ist die Präsenz länglicher, spindelförmiger Zellen vermutlich endo- thelialen Ursprungs. Darüber hinaus findet man eine Anzahl weiterer Zelltypen wie
Monozyten, Fibroblasten, neovaskuläre Strukturen und extravasale Erythrozyten. Im
Tumorgewebe ist die Produktion von VEGF (vascular endothelial growth factor) signifikant erhöht; dies hat eine andauernde Angioneogenese und somit eine extreme
Vaskularisierung zur Folge.
Epidemiologische Untersuchungen ergaben schon vor einigen Jahren Hinweise auf die
Beteiligung eines infektiösen Agens (1, 3). Mittels einer neuen PCR Technik wurden
1994 in Biopsiematerial von KS Läsionen Sequenzen eines bis dato noch unbekannten humanen γ2-Herpesvirus gefunden (4). Das dazugehörige Virus wurde KSHV (Kaposi
Sarkom assoziiertes Herpesvirus) oder HHV8 (Humanes Herpesvirus 8) genannt. Das
140 kb große Genom ist vor kurzem kloniert und sequenziert worden (5).
Aufgrund einer ganzen Reihe von Arbeiten besteht heute kein Zweifel mehr daran, daß das Auftreten eines Kaposi Sarkoms gleich welcher Form zu praktisch 100% mit der
Präsenz von HHV8 in den Läsionen korreliert ist (6-11). Der PCR Nachweis von HHV8
DNA ist zudem ein prognostisches Indiz für die spätere Entwicklung eines Kaposi
Sarkoms (12). Unsere eigenen Arbeiten zeigen, daß eine Serokonversion im Mittel bereits 2 Jahre vor dem Auftreten eines Kaposi Sarkoms nachweisbar ist.
Wahrscheinlich ist HHV8 auch an der Pathogenese bestimmter Lymphome wie etwa
Castleman's Disease oder PEL (Primary Effusion Lymphoma) beteiligt (13, 14).
Darüber hinaus gibt es Hinweise, daß HHV8 auch bei interstitieller Pneumonie und
Enzephalitis eine Rolle spielen könnte (15). Schließlich wurde in einer kürzlich publizierten Arbeit eine Korrelation zwischen dem Auftreten von HHV8 und multiplen
Myeiomen postuliert (16). Obwohl verschiedene experimentelle Befunde (17-22) die
Hypothese stützen, daß HHV8 in die Pathogenese dieser Krankheiten involviert sein könnte, ist ein kausaler Zusammenhang bislang noch nicht endgültig bewiesen. In manchen Regionen (z.B. in Zentralafrika) scheint HHV8 nämlich auch in der
Gesamtbevölkerung relativ weit verbreitet zu sein (6, 8, 23, 24). Trotz einer erhöhten
Inzidenz des Kaposi Sarkoms in diesen Ländern scheint das Vorliegen einer Infektion mit HHV8 alleine ein zwar notwendiges, aber nicht hinreichendes Kriterium für die
Entwicklung der Krankheit zu sein.
Anhand der gefundenen viralen DNA Fragmente wurden verschiedene diagnostische
Verfahren entwickelt, die sowohl einen direkten als auch einen indirekten Nachweis von HHV8 erlauben. Durch einen relativ einfachen Test, der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR), können selbst sehr geringe Mengen viraler DNA in Blut- oder Gewebeproben bestimmt werden (25-28). Allerdings ist auch dieser Test für manche medizinisch relevanten Untersuchungen nicht sensitiv genug.
Künstlich immunsupprimierte Organtransplantierte entwickeln ebenfalls überdurchschnittlich häufig ein Kaposi Sarkom (bei Nierentransplantationen bis zu 5%), wobei die Zahl der Fälle stark je nach geografischer Herkunft variiert. So ist das KS in den Ländern des Nahen und Mittleren Ostens der häufigste Posttransplantationstumor und liegt weltweit an 3. Stelle. In den Industrieländern (Europa, Japan, U.S.A.) haben insgesamt 1-1 ,5 Millionen Menschen ein erhöhtes Risiko, an KS zu erkranken. Für diese Personen bestimmte Blutpräparate sollten daher sicherheitshalber unbedingt auf HHV8 Antikörper (als Indiz für eine mögliche Verseuchung mit HHV8) getestet werden, um deren Infektionsrisiko so gering wie möglich zu halten. Im erweiterten Sinn trifft dies auch andere Personenkreise, bei denen eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Beeinträchtigung des Immunsystems vorliegt, beispielsweise Patienten, die eine Chemotherapie erhalten, Dialysepatienten, ältere Patienten, Neonate etc. Da KS hauptsächlich Personen mit einer Immunschwäche gleich welcher Art betrifft und nur mit mäßigem Erfolg chemotherapeutisch, chirurgisch oder mit ionisierenden Strahlen behandelbar ist (es gibt derzeit weder eine kausale Therapie noch eine endgültige Heilung für diese Krankheit), muß man davon ausgehen, daß immun- defiziente Personen durch die Verabreichung HHV8-kontaminierter Blutpräparate einem besonderen Risiko ausgesetzt sind, ein Kaposi Sarkom zu entwickeln. In der Routinediagnostik kommen meist sogenannte ELISA (enzyme linked immuno- sorbent assay)-Testverfahren zum Einsatz, da sie sehr billig sind und sich auch für hohe Probenaufkommen eignen. Der Nachweis von HHV8-spezifischen Antikörpern im Serum ist ein Indiz für einen (früheren) Kontakt mit dem Antigen. Dieser kann unter Umständen auch dann noch positiv ausfallen, wenn die Menge an viraler DNA unterhalb der Nachweisgrenze der PCR liegt. Die Anwesenheit HHV8 spezifischer Antikörper kann außer mit dem ELISA (31-33) auch mittels indirektem Fluoreszenzassay (IFA) (24) und Westem-Blot (29, 30) untersucht werden.
Allerdings sind die bislang beschriebenen Verfahren entweder sehr zeitaufwendig (IFA bzw. Westem-Blot) oder nicht sensitiv genug (PCR aus Blutproben, ELISA mit herkömmlichen Antigenen). Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem war somit,
Reagenzien zur Verfügung zu stellen, deren Einsatz einen sehr sensitiven und spezifischen Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern ermöglicht.
Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein (Poly)peptid, das von anti- HHV8 Antikörpern HHV8-infizierter Patienten erkannt wird und dadurch gekennzeichnet ist, daß es
(a) eine der in SEQ ID NR.: 1 bis 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen umfaßt;
(b) aus einer der in SEQ ID NR.: 1 bis 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen besteht; oder
(c) aus einer Aminosäuresequenz besteht, die von einer der in (a) oder (b) gekennzeichneten Aminosäuresequenzen durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen abweicht; wobei das (Poly)peptid kein natürlich vorkommendes HHV8-Protein ist.
Natürlich vorkommende HHV8-Proteine im Sinne dieser Erfindung sind solche HHV8- Proteine, die die vollständige Aminosäuresequenz aufweisen und nicht degradiert sind. Üblicherweise oder vorzugsweise wird das (Poly)peptid von anti-HHV8 Antikörpern in Körperflüssigkeiten von HHV8-infizierten Patienten erkannt. Methoden zur Bestimmung der antigenen Eigenschaft des erfindungsgemäßen (Poly)peptids mittels anti-HHV8 Antikörper sowie Methoden zu deren Isolierung, vorzugsweise aus Körperflüssigkeiten HHV8-infizierter Patienten, sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise den ELISA.
Der Begriff "Körperflüssigkeiten" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung z.B. Blut, Serum, Lymphe, Gewebeflüssigkeit und Gewebeextrakte z.B. aus Mucosae respiratorischen, urogenitalen oder gastrointestinalen Ursprungs. Desweiteren umfaßt dieser Begriff Körperflüssigkeiten, die derart behandelt bzw. vorbereitet wurden, daß sie z.B. für den Einsatz in den oben erwähnten Methoden geeignet sind. Beispiele hierfür sind in vitro verdünnte Seren, mit Konservierungsstoffen (wie z.B. vor Kälte schützende Substanzen) versetzte Körperflüssigkeiten oder mit gerinnungshemmenden Stoffen
(z.B. Heparin) behandelte Körperflüssigkeiten.
Der Begriff "(Poly)peptid", wie erfindungsgemäß verwendet, umfaßt sowohl Peptide als auch Polypeptide. Erfindungsgemäße (Poly)peptide, die eine der in SEQ ID NR.: 1 bis 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen umfassen, können beispielsweise von einer HHV8-Sequenz und/oder einer anderen Sequenz flankiert sein, die nicht von HHV8 abstammt. Wie oben bereits erwähnt , ist das erfindungsgemäße (Poly)peptid jedoch kein natürlich vorkommendes HHV8-Protein, d.h. das erfindungsgemäße (Poiy)peptid stellt kein volle-Länge-HHV8-Protein dar, wie es von HHV8-Genomen codiert wird.
Vorzugsweise stellen die erfindungsgemäßen (Poly)peptide lineare Epitope verschiedener kodierender Regionen der HHV8-Genoms dar und besitzen eine Länge von vorzugsweise höchstens 50 Aminosäuren. Stärker bevorzugt ist eine Länge von höchstens 15 Aminosäuren, und am meisten bevorzugt ist eine Länge der erfindungsgemäßen (Poly)peptide von 10 oder 12 Aminosäuren.
Der Begriff "Substitution" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl konservative als auch nicht-konservative Aminosäureaustausche. Unter konservative Aminosäureaustausche fallen solche, bei denen beispielsweise eine neutrale, hydrophobe, eine neutrale, polare, eine basische oder eine saure Aminosäure durch eine Aminosäure derselben Klasse ersetzt wird. Dem Fachmann sind die verschiedenen Klassen von Aminosäuren, deren Klassenzugehörigkeit durch die spezifischen Seitengruppen bestimmt ist, wohl bekannt. Wesentlich dabei ist, daß die dreidimensionale Struktur der (Poly)peptide nicht derart verändert wird, daß sie von anti-HHV8 Antikörpern nicht mehr erkannt werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide wurden in einem Screening von ca. 3000 Peptiden identifiziert, das nach folgenden Kriterien durchgeführt wurde:
(a) Minimale Homologie mit Peptiden bekannter Proteine, vor allem mit entsprechenden Epitopen verwandter Herpesviren wie z.B. EBV und CMV; und
(b) Maximale Antigenität (laut Computervorhersage). Eine Vorselektion möglicherweise immundominanter, HHV8-spezifischer Peptide wurde durch den Einsatz einer vorteilhaften Kombination verschiedener Computerprogramme
(BLASTP, ANTIGENIC und BLASTALIGN) der Genetics Computer Group (GCG),
Wisconsin durchgeführt.
Alle Peptide, die in dieser Vorselektion ausgewählt wurden (292 Peptide), wurde dann einzeln mit einem Serumpool von KS Patienten und verschiedenen Kontrollpools von gesunden Probanden analysiert.
Die-aus diesem Initialscreen hervorgegangen Peptide wurden daraufhin an mehreren hundert Seren von KS Patienten und Kontrollen getestet, wobei spezielles Augenmerk darauf gerichtet wurde, ob Kreuzreaktionen mit EBV-, CMV- oder HSV spezifischen
Antikörpern auftraten.
Durch diese mehrfachen Tests wurden die erfindungsgemäßen Peptide, die das gewünschte Reaktionsprofil aufwiesen, identifiziert.
Die erfindungsgemäßen (Poly)peptide umfassen auch durch Peptidomimetics hergestellte Verbindungen, vorzugsweise (Poly)peptide, die den vorgenannten (Poly)peptiden in den immunologischen/diagnostischen Eigenschaften entsprechen. Dem Fachmann ist bekannt, wie solche Moleküle z.B. unter Verwendung von L- und D- Aminosäuren entworfen und hergestellt werden (z.B. Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777).
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptidmix, welcher aus einer Kombination erfindungsgemäßer (Poly)peptide besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Peptidmix die (Poly)peptide mit den in SEQ ID NR.: 1 , 3, 4 und 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Peptidmix diese (Poly)peptide in einem molaren Verhältnis von 1 :1 :1 :1.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Peptidmixes können anti-HHV8 Antikörper in besonders vorteilhafter Weise nachgewiesen werden, wobei dieser Nachweis überraschenderweise sowohl die Empfindlichkeit als auch die Spezifität herkömmlicher Nachweisverfahren weit übertrifft (siehe unten). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das (Poly)peptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die von einer der in (a) gekennzeichneten Aminosäuresequenzen durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen abweicht, eine natürlich vorkommende Sequenzvariante.
Solche Peptide, die Sequenzvarianten der entsprechenden Positionen im Genom von HHV8 (5) darstellen, können die Sensitivität des Nachweises noch weiter erhöhen. Die Spezifität bleibt dabei erhalten, da die Auswahl der Peptide, unter anderem nach minimaler Homologie zu bekannten (viralen) Proteinen, hochkonservierte Bereiche von vornherein ausschließt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polymer, das mindestens zwei gleiche oder verschiedene erfindungsgemäße (Poly)peptide umfaßt.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen die Polymere Homopolymere, bestehend aus mehreren Exemplaren eines einzigen erfindungsgemäßen (Poly)peptids, als auch Heteropolymere aus einer beliebigen Kombination der erfindungsgemäßen (Poly)peptide, wobei solche Heteropolymere auch mehrere Exemplare eines erfindungsgemäßen (Poly)peptids enthalten können.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Polymer durch eine unverzweigte Kette von polymerisierten erfindungsgemäßen (Poly)peptiden gekennzeichnet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Polymer durch verzweigte Ketten von polymerisierten erfindungsgemäßen (Poly)peptiden gekennzeichnet.
Polymere mit verzweigten Ketten von polymerisierten (Poly)peptiden werden z.B. durch Verknüpfung der (Poly)peptide über eine Aminosäure oder ein Aminosäure-Analogon hergestellt, die/das zwei Aminogruppen und eine Carboxylgruppe besitzen, wobei jede Gruppe fähig ist, eine Peptidbindung zu bilden. Dem Fachmann sind solche Synthese- Verfahren bekannt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Polymere, die die Peptide mit den in SEQ ID NR.: 1 , 3, 4 und 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen umfassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße (Poly)peptid oder das erfindungsgemäße Polymer chemisch synthetisiert.
Synthese-Verfahren zur chemischen Herstellung von Peptiden mittels Peptid- Synthesizer sind dem Fachmann bekannt.
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung auch Gemische bestehend aus den erfindungsgemäßen Polymeren.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform ein Fusionsprotein, das ein erfindungsgemäßes (Poly)peptid oder ein erfindungsgemäßes Polymer umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die voriiegende Erfindung ein Polynukleotid, das ein erfindungsgemäßes (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polynukleotid DNA oder RNA.
Die voriiegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der ein erfindungsgemäßes
Polynukleotid umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Vektor ein
Expressionsvektor.
Der Begriff "Expressionsvektor" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Expressionsvektoren. Die notwendigen regulatorischen Elemente zur Expression eines (Poly)peptids sind dem Fachmann wohl bekannt und können den Expressionsbedingungen entsprechend ausgewählt werden. Der Begriff "Expression" kann dabei Transkription als auch Transkription und Translation bedeuten. Regulatorische Elemente umfassen dabei insbesondere Promotoren. Für die Expression eines erfindungsgemäßen Polynucleotids in prokaryontischen Zellen stehen eine Reihe von Promotoren zur Verfügung, z.B. der E. coli lac- oder trp-Promotor, der PR- oder PL-Promotor des Lambda-Phagen, lad, lacZ,
T3, T7, gpt, etc. Eukaryontische Promotoren sind beispielsweise der CMV immediate early-Promotor, der HSV-Promotor, der Thymidinkinase-Promotor, der SV40-Promotor, der LTRs von Retroviren und der Maus Metallothioninl-Promotor. Es ist bereits eine
Vielzahl von Expressionsvektoren für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen beschrieben, z.B. für Eukaryonten pKK223-3 (Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Schweden) oder GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA), pSV2CAT, pOG44 und für Prokaryonten pQE70, pQE60, pBluescript SK, etc. Neben
Promotoren können erfindungsgemäße Vektoren auch Elemente zur weiteren
Steigerung der Transkription enthalten, wie z.B. sogenannte Transkriptions-Enhancer.
Beispiele dafür sind der SV40-Enhancer, der Polyoma-Enhancer, der Cytomegalovirus early Promoter-Enhancer und Adenovirus-Enhancer.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthält.
Unter den Begriff "Wirtszelle" fallen erfindungsgemäß sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirtszellen. Bevorzugte prokaryontische Wirtszellen umfassen z.B. E. coii-Zellen, Streptomyces-, Bacillus- oder Salmonella-Zellen. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen umfassen Pilzzellen, z.B. Hefezellen, insbesondere Saccharomyces cerevisae-Zellen, Insektenzellen wie z.B. Drosophila- oder SF9-Zellen, tierische Zellen wie z.B. CHO- oder COS-Zellen, Pflanzenzellen oder Säugerzellen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Züchtung der erfindungsgemäßen Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des (Poly)peptids, des Polymers oder des Fusionsproteins bewirken; oder
(b) in vitro Transkription und/oder Translation des erfindungsgemäßen Polynukleotids; und Gewinnung des in (a) oder (b) hergestellten (Poly)peptids, Polymers oder
Fusionsproteins.
Die Bedingungen, die eine Expression eines (Poly)peptids bewirken sind dem Fachmann bekannt und können entsprechend der verwendeten Wirtszelle und des eingesetzten Expressionsvektors gewählt werden. Entsprechend gestaltet sich auch die Gewinnung des Expressionsproduktes. Wird z.B. ein Expressionsvektor eingesetzt, der zur-Sekretion des synthetisierten (Poly)peptids führt, wird das (Poly)peptid aus dem Kulturüberstand gewonnen. Findet die Expression intrazellulär statt, wird das Expressionsprodukt aus der Wirtszelle isoliert.
Methoden zur in vitro Transkription und/oder Translation sind dem Fachmann ebenfalls wohl bekannt. Beispielsweise lassen sich solche Verfahren mittels kommerzieller Kits entsprechend den Instruktionen des Herstellers durchführen.
Vorzugsweise werden bei der Gewinnung des erfindungsgemäßen (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins zusätzliche, dem Fachmann bekannte Reinigungsschritte, wie z.B. säulenchromatographische Verfahren, durchgeführt, um Verunreinigungen (z.B. zelluläre Proteine, Nucleinsäuren, Komponenten des in vitro Transkriptions-/Translations-Systems) weitestgehend zu entfernen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Konjugat, das ein erfindungsgemäßes (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die mindestens ein erfindungsgemäßes (Poly)peptid, und/oder ein erfindungsgemäßes Polymer, und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, und/oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, und/oder ein erfindungsgemäßes Konjugat umfaßt und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung ein Arzneimittel. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Arzneimittel ein Impfstoff. In dieser Ausführungsform sind die Peptide, einzeln oder in Kombination, vorzugsweise an einen Carrier gekoppelt. Beispiele für geeignete Carrier sind Polystyrolkugelchen, Streptavidin, BSA oder KLH.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmittel oder Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z.B. intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z.B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 1000 μg liegen, wobei Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren, vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg-Einheiten pro Tag befinden. Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht, was nicht bevorzugt empfohlen wird, um die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktionen zu minimieren, sollte sich die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg- Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute befinden.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen,
Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen
Natriumchlorid-Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchiorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und
Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren). Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien,
Komplexbildner und inerte Gase. Desweiteren können, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, Verbindungen wie z.B. Interleukine, Wachstumsfaktoren,
Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen (Poly)peptid, und/oder einem erfindungsgemäßen Polymer, und/oder einem erfindungsgemäßen Fusionsprotein, und/oder einem (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, und/oder einem erfindungsgemäßen Konjugat, unter Bedingungen, die die Bindung von Antikörpern erlauben; und
(b) Nachweis der in Schritt (a) gebunden Antikörper.
Neben dem Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch als prognostisches Indiz für die mögliche Entwicklung eines Kaposi Sarkoms bei HIV Infizierten bzw. Personen mit anderweitigen natürlichen oder iatrogenen Immundefekten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei diesem Verfahren ein Gemisch der (Poly)peptide, die die in SEQ ID NR.:1 , 3, 4 und 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen umfassen, verwendet.
Die wesentlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber bisher beschriebenen Verfahren (24, 29-34) sind einerseits die sehr hohe Sensitivität (>96% der Seren von KS Patienten reagieren positiv, während die meisten in der Literatur beschriebenen Verfahren lediglich eine Sensitivität von 35-85% erreichen) und andererseits eine sehr gute Spezifität und Reproduzierbarkeit (bei Verwendung der ELISA-Technik zeigen Doppelbestimmungen als Resultat der gewählten
Beschichtungstechnik eine durchschnittliche Abweichung von weniger als 5%).
Insbesondere wird durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Kombination verschiedener (Poly)peptide aus verschiedenen offenen Leserastern des viralen
Genoms statt einzelner rekombinanter Antigene wie ORF65 (32) oder dem Minor
Capsid Protein (33) ein größeres Spektrum von HHV8 spezifischen Antikörpern erkannt. Dies ist vor allem wichtig bei Seren von Patienten, bei denen bereits vor dem
Erstkontakt mit HHV8 eine ausgeprägte Immundefizienz vorlag, da in diesen Fällen die
Antikörpertiter oft sehr niedrig sind. Andere Peptid-basierte Immunoassays auf der
Basis eines einzigen Peptids (31) erreichen eine weitaus geringere Sensitivität. Es ist zudem von anderen Herpesviren bekannt, daß die Verwendung eines einzelnen
Epitops nicht ausreicht, um eine diagnostisch verwertbare Erkennungsquote von mindestens 90% aller positiven Seren zu erreichen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens sind die erfindungsgemäßen (Poly)peptide chemisch synthetisiert.
Durch die Verwendung chemisch synthetisierter Peptide anstelle rekombinanter Antigene, wie sie in anderen beschriebenen Verfahren benützt wurden, die auf der Verwendung prokaryontischer Expressionssystemen bzw. ungereinigter Virusiysate aus infizierten Zellinien beruhen, ist somit eine Reaktion von nichtspezifischen Antikörpern (z.B. gegen E. coli Proteine aber vor allem auch gegen Proteine anderer humaner Herpesviren wie beispielsweise EBV oder CMV) praktisch ausgeschlossen. In den bisher beschriebenen Verfahren müssen hohe Ansprüche an die Aufreinigung des Anti- gens gestellt werden, da selbst geringste Mengen an Verunreinigungen mit z.B. E. coli Proteinen bei vielen Proben zu falschpositiven Resultaten führen können. Vorteilhafterweise erübrigen sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zeit- und damit kostenaufwendige Aufreinigungsschritte wie z.B. vorherige Adsorption der Testseren (z.B. an E. coli Lysat).
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen (Poly)peptide, und/oder Polymere, und/oder Fusionsproteine, und/oder Konjugate für den Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren biotinyliert. Die biotinyiierten Komponenten werden dann über die hochspezifische Biotin-Streptavidin Interaktion an eine Streptavidin- beschichtete feste Phase gebunden. Dieses Kopplungsverfahren gewährleistet auch bei Gemischen von erfindungsgemäßen (Poly)peptiden unterschiedlicher Ladung bzw.
Hydrophilie eine gleichbleibende Beschichtung.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens umfaßt das Gemisch diese (Poly)peptide in einem molaren Verhältnis von 1:1:1:1.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Enzym-gebundener Immunoabsorptionsassay (ELISA), ein Enzymimmunodotassay, ein Immunobead-Assay, ein passiver Hämaggiutinations-Assay (PHA) oder ein Peptid- Antikörper-Peptid Sandwich-Assay.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die biologische Probe eine behandelte oder unbehandelte Form von Blut, Serum, Gewebeextrakt, Gewebeflüssigkeit, Zellkulturüberstand, oder Zellysat. Bezüglich des Begriffs "behandelte Form" wird auf die entsprechende oben erwähnte Definition des Begriffs "Körperflüssigkeiten" verwiesen, die die Möglichkeiten der Behandlung bzw. Vorbereitung betreffend auch in diesem Zusammenhang anzuwenden ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren den weiteren Schritt:
(c) Nachweis von unspezifischen Bindungen, die von in der biologischen Probe zusätzlich vorhandenen Antikörpern in Schritt (a) verursacht werden.
Im Falle eines ELISAs können zusätzlich vorhandene Antikörper z.B. antigenunabhängig bzw. unspezifisch an die Oberfläche der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte binden und ein falsch-positives Signal bewirken. Falsch-positive Ergebnisse aufgrund unspezifischer Bindung an die Matrix werden durch individuelle Blankwerte sicher erkannt und eliminiert. Dies ist wichtig für den Einsatz im Screening von Blutbanken, um unnötiges Entfernen von Donorblut aufgrund falsch-positiver Ergebnisse für den HHV8 Nachweis zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Kit, enthaltend:
(a) mindestens ein erfindungsgemäßes (Poly)peptid, und/oder ein erfindungsgemäßes Polymer, und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, und/oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, und/oder ein erfindungsgemäßes Konjugat, wobei die Komponenten getrennt voneinander oder in Form eines Gemisches enthalten sind; und gegebenenfalls
(b) eine feste Phase, an die mindestens ein erfindungsgemäßes (Poly)peptid, und/oder ein erfindungsgemäßes Polymer, und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, und/oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, und/oder ein erfindungsgemäßes Konjugat gebunden werden kann;
(c) ein Probenverdünnungsmittel; und/oder
(d) eine Negativkontrolle; und/oder
(e) eine Positivkontrolle; und/oder
(f) ein Reportermolekül.
Der Begriff "Reportermolekül" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl Enzyme wie z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase (in diesen Fällen kann das verwendete Detektionssystem z.B. auf einer kolorimetrischen Reaktion beruhen, etwa der Umsetzung von ABTS durch eine Peroxidase), andere Enzyme, Radioisotope, Fluorophore, bioluminiszierende Moleküle, chemiluminiszierende Moleküle oder dergleichen als auch deren Konjugate z.B. mit einem Zweitantikörper, der z.B. menschliche IgG- bzw. IgM-Antikörper erkennt.
Der erfindungsgemäße Kit kann zum Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern und zur Diagnose von HHV8 Infektionen von Säugern vorzugsweise in Körperflüssigkeiten wie, z.B. Blut, Serum, Gewebeextrakten, Gewebeflüssigkeiten, aber auch in vitro Zell- kulturüberständen und Zellysaten als Testreagentien in einem Immunoassay verwendet werden. Hierfür kommt jeder geeignete Immunoassay in Frage, insbesondere ein Enzym-gebundener Immunoabsorptionsassay (ELISA), ein Enzymimmunodotassay, ein Immunobead-Assay, ein passiver Hämagglutininations-Assay (PHA), ein Peptid- Antikörper-Peptid Sandwich Assay oder andere dem Fachmann bekannte Methoden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit ein Gemisch der (Poly)peptide, die die in SEQ ID NR.: 1 , 3, 4 und 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzeπ umfassen oder darstellen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen (Poly)peptids, und/oder eines erfindungsgemäßen Polymers, und/oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, und/oder eines (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, und/oder eines erfindungsgemäßen Konjugats zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von HHV8-assoziierten Erkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung sind die HHV8-assoziierten Erkrankungen Kaposi Sarkom, Castleman's Disease, Primary Effusion Lymphoma, interstitieller Pneumonie, Enzephalitis und multiple Myelome.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen (Poly)peptids, und/oder eines erfindungsgemäßen Polymers, und/oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, und/oder eines (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, und/oder eines erfindungsgemäßen Konjugats zur Herstellung von Antikörpern.
Die Herstellung von Antikörpern ist dem Fachmann bekannt und umfaßt beispielsweise die Immunisierung eines Tieres mit einem Antigen, das gegebenenfalls an einen Carrier gekoppelt ist und/oder in Kombination mit anderen immunstimulierenden Substanzen verabreicht wird (siehe z.B. Harlow und Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988). Andere bekannte Methoden umfassen das Screening von Antikörperbibliotheken mittels "phage display" -Technologie und die rekombinante Herstellung des gewünschten Antikörpers.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen (Poly)peptids, und/oder eines erfindungsgemäßen Polymers, und/oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, und/oder eines (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren, und/oder eines erfindungsgemäßen Konjugats zum Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern.
Die in der vorliegenden Beschreibung zitierten Literaturstellen sind hiermit per Interpretation Teil der Beschreibung. Figur-Legenden:
Figur 1 :
Die Serumaktivität gegen den bevorzugten Peptidmix wurde bei HIV+/KS+ Patienten ermittelt. Die Säulen zeigen den Mittelwert sowie die Standardabweichung für (i) positive Seren, (ii) Seren von Patienten mit einer CD4-Zellzahl von weniger als 50/μl, (iii) negative Seren. Die durchschnittliche Serumaktivität ist bei Patienten in fortgeschrittenen Krankheitsstadien deutlich geringer als für das Gesamtkollektiv.
Figur 2:
Serumaktivität und CD4-Zellzahl im Verlauf. Serumproben eines HIV+/KS+ Patienten wurden retrospektiv im HHV8 ELISA getestet. Bereits 14 Monate vor der Diagnose eines Kaposi Sarkoms sind HHV8-spezifische Antikörper im Blut des Patienten nachzuweisen. Die zusätzlich aufgetragenen CD4-Zellzahlen sind ein Maß für die relative Immundefizienz des Patienten.
Figur 3:
Schematische Darstellung der Entwicklung des HHV8 ELISA-Tests.
Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, reagiert das erfindungsgemäße Verfahren (bei HIV Patienten) in der Regel schon mehrere Jahre vor der klinischen Diagnose eines Kaposi Sarkoms positiv. Da zur Zeit verschiedene Antiherpesmittel als mögliche KS Therapeutika in klinischer Erprobung sind, könnten diese oder andere antivirale Substanzen (sofern sie sich in der Behandlung von KS als wirksam erweisen) möglicherweise präventiv eingesetzt werden, sobald eine Infektion mit HHV8 sicher mit dem erfindungsgemäßen Verfahren/Kit nachgewiesen wird.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beipiel 1 : ELISA Test
Für den KS Peptid ELISA werden N-terminal biotinylierte, 14 Aminosäuren lange Peptide (10 Aminosäuren des jeweiligen Antigens, Ser-Gly-Ser-Gly Tetrapeptid als Spacer) eingesetzt. Die Stammlösung der Peptide (1 μmol/ml in 100% DMSO) wird zur Beschichtung der Streptavidin-Mikrotiterplatten (Combiplate 8, Life Sciences oder MC,
MicroCoat) 1 :400 in PBS/5% Tween 20 verdünnt; hiervon werden jeweils 100 μl pro Well der MTP eingesetzt (250 pmol, d.h. in lOfachem Überschuß gegenüber der verfügbaren Menge an gebundenem Streptavidin) und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden darauf 2x mit PBS/0,2% Tween 20 gewaschen und dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit PBS/5% Tween 20 geblockt. Vor der Inkubation mit dem Testmaterial (z.B. 1 :100 verdünntes Patientenserum) für 1 Stunde bei Raumtemperatur werden die Platten 3x mit PBS/0,2% Tween 20 gewaschen.
Nach der Inkubation mit dem Testmaterial werden die Platten 5x gewaschen und danach mit einer 1:10.000 Verdünnung eines Peroxidase-konjugierten anti-Human IgG oder IgM Antikörpers für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgen 5 Waschgänge, die beiden letzten mit PBS ohne Tween.
Zum Nachweis gebundenen Konjugats werden 200 μl einer 1 mg/ml ABTS Lösung in Peroxidase Arbeitspuffer (Boehringer Mannheim) pro Vertiefung der Mikrotiterplatte hinzugegeben und die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung der Absorption erfolgt bei 405 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 492 nm. Die Probe wird als positiv gewertet, wenn der Meßwert >200 mO.D. über dem Mittelwert der Kontrolle (ohne Peptidgemisch) liegt (200 mO.D. entsprechen mind. 4 Standardabweichungen des Mittelwerts).
Beipiel 2: KS Serumpanel
Zur serologischen Bestätigung der Wirksamkeit wurde zunächst ein Panel von 380 Einzelseren von 185 Patienten mit einem Kaposi Sarkom untersucht. Von den 256 Seren, die nach der KS Diagnose entnommen wurden, reagierten 246 positiv mit dem bevorzugten Gemisch 1 (Peptide Nr. 1, 3, 4 und 8). Dies entspricht einer Sensitivität von 96,1%. Da in diesem Panel etliche Seren von HIV Patienten vertreten sind, bei denen das Immunsystem durch die fortschreitende HIV Infektion bereits stark geschädigt war (dies schränkt auch die Aktivierung der Antikörper produzierenden Zellen ein) ist die Sensitivität des Tests mit anderen Panels vermutlich noch höher. 79 von 96 Seren von Patienten mit stark eingeschränkter Funktion des Immunsystems (CD4-Werte < 50) reagierten positiv mit dem beschriebenen Peptidgemisch; der Mittelwert der Absorption bei 405 nm betrug 0,342, die Standardabweichung 0,264. Für die negativen Seren wurde ein Mittelwert von 0,046 und eine Standardabweichung von 0,038 ermittelt. 120 Seren zeigten eine starke Immunreaktivität (O.D.405nm > 0,6). Für diese Seren liegt der Mittelwert der Absorption bei 405 nm von 1 ,15 ± 0,49 O.D. (Figur D-
Beipiel 3: Assay-Standardisierung
Zur Standardisierung des Assays wurden verschiedene Platten, Blockierungsmethoden und- Verdünnungsmittel getestet. Eine gleichbleibende Qualität der Plattenbeschichtung und optimierte Reaktionsbedingungen bestimmen sowohl die Sensitivität als auch die Reproduzierbarkeit des Assays maßgeblich mit. Der beschriebene KS ELISA weist mit dem bevorzugten Peptidgemisch sehr geringe Intra- und Interassay Varianzen auf. Der mittlere Varianzkoeffizient der 79 Doppelbestimmungen niedrigreaktiver Seren ist 4,39%. Bei den Patienten, von denen Verlaufsseren vorlagen, wurden keine Abweichungen in den Testergebnissen sukzessiver Serumproben festgestellt, nachdem eine Probe im Test einmal positiv war. Die Blankwerte (Inkubation nur mit Serum ohne Peptide) sind gut reproduzierbar (Mittelwert aus 30 Platten: 128 ± 45 milli O.D.)
Beipiel 4: Kontrollpanels
Verschiedene Kontrollpanels sowie Kontrollpeptide wurden eingesetzt, um die Spezifität des HHV8 Antikörper ELISAs zu testen. Mit einem EBV Kontrollpeptid (siehe Tabelle 2) wurde untersucht, in wie vielen Fällen vergleichbare Antikörpertiter gegen HHV8 bzw. EBV (ein damit verwandtes Herpesvirus) nachgewiesen werden konnten. In 56 von 64 Fällen waren die beobachteten Antikörpertiter um mindestens 30% divergent; die EBV Durchseuchungsrate lag bei den HIV Patienten bei 86%, bei den Kontroilseren bei 72%. 28 von 99 Seren zeigten sowohl gegen HHV8 als auch EBV eine hohe Immunreaktivität (O.D.405nm > 0,6), 39 von 99 Seren hatten hohe anti-HHV8 und niedrige anti-EBV Titer, 7 von 99 niedrige anti-HHV8 und hohe anti-EBV Titer, bei 25 der 99 Seren waren sowohl die anti-HHV8 als auch die anti-EBV Immunreaktivität kleiner als 0,6. Aus diesen Daten läßt sich folgern, daß keine signifikante Kreuzreaktion des Assays mit EBV-Antigenen vorliegt. Beipiel 5: Sensitivität
Ein hochreaktives Einzelserum wurde in Verdünnungen von 1 :50 bis 1 :12800 getestet. In dem kolorimetrischen Assay liefert selbst die höchste Serumverdünnung eine O.D.405nm > 1 - Die mögliche Bandbreite des Assays ist hier durch das relativ schmale nutzbare Fenster des kolorimetrischen Detektionssystems limitiert. Durch den Einsatz verbesserter Nachweisverfahren (z.B. Chemilumineszenz) dürften lineare Bestimmungen der Antikörpertiter über einen Bereich von mehr als 3 Zehnerlogarithmen möglich sein. So könnten sowohl hochtitrige Seren quantifiziert werden als auch geringe Antikörpertiter sicher erkannt werden.
Beipiel 6: Prognostischer Wert
Von 20 KS Patienten, welche über einen längeren Zeitraum in Behandlung waren, wurden sukzessive Serumproben auf Immunreaktivität HHV8-spezifιscher Antikörper untersucht. Der Zeitpunkt der jeweils ersten positiven Serumprobe lag im Schnitt 20,4±14,6 Monate vor der Erstdiagnose eines Kaposi Sarkoms. Da in den meisten Fällen die erste verfügbare Serumprobe bereits positiv getestet wurde, ist die tatsächliche "Inkubationszeit" wahrscheinlich länger. Der ELISA könnte somit Hinweise auf ein bestehendes Risiko für die Entwicklung eines Kaposi Sarkoms liefern. Die Verlaufskurve eines dieser Langzeitpatienten ist in Figur 2 dargestellt.
Beipiel 7: Ausschluß falschpositiver Test-Ergebnisse
Von insgesamt 589 getesteten KS und Kontrollseren reagierten 8 (1.36%) mit den leeren, nur mit Streptavidin allein beschichteten Kavitäten der Testmikrotiterplatten. Alle dieser Seren waren nach Vorinkubation auf Platten ohne Peptid negativ im HHV8 ELISA. Diese falsch-positiven Werte können durch die Verwendung probenspezifischer Blankwerte daher sicher ausgeschlossen werden. Solche serenspezifischen Blankwerte werden in keinem der bisher beschriebenen Testsysteme erfaßt, weswegen die aus unspezifisch reaktiven Seren resultierenden falschpositiven Ergebnisse nicht erfaßt werden können. Diese zusätzliche Kontrolle verhindert den unnötigen Ausschluß von Blutpräparaten und ist daher speziell für die Anwender in Blutbanken auch vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt her interessant. Wie erste Tests ergeben haben, scheint in Serumpanels aus südeuropäischen bzw. afrikanischen Ländern der Anteil unspezifisch reaktiver Seren zudem weit höher zu sein.
Beipiel 8: Vergleich des Antikörpertests mit DNA Nachweisverfahren
Von 100 Probanden wurden sowohl Serumproben als auch Präparationen genomischer DNA aus unfraktionierten peripheren Blutzellen hergestellt. Die Seren wurden in dem HHV8 Peptid-ELISA analysiert, die HHV8 DNAs mit einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit einer Nachweisgrenze von 5-10 Kopien/Reaktion (=1000-2000 Kopien/ml Blut) bestimmt. 5% der Probanden testeten positiv, obwohl der kontrollierte PCR- Nachweis negativ war.
Literatur
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Mit KS Seren reaktive Peptide. Die Positionsangaben beziehen sich auf die publizierte Sequenz des HHV8 Genoms von Russo et al. (5) (Genbank accession No. U75698).
Figure imgf000027_0001
TABELLE 2
Sequenzen der verwendeten Kontroll-Peptide. Die Positionsangaben beziehen sich auf HIV-1 HXB2 (Genbank accession no. M38432), Epstein-Barr Virus Stamm B95-8 (V01555) sowie Poliovirus Typ Sabin 1 (V01150). Die jeweils ersten 4 Aminosäuren in kursiven Lettern (SGSG) wurden als Spacer eingefügt.
Figure imgf000027_0002
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
( i ) ANMELDER :
(A) NAME: Dr. Octavian SCHATZ
(B) STRASSE: Steinbergst . 30
(C) ORT: Altomünster
(D) BUNDESLAND: Bayern
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 85250
(A) NAME: Dr. Juergen HAAS
(B) STRASSE: Brunellen eg 39
(C) ORT: München
(D) BUNDESLAND: Bayern
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 80689
(ii) ANMELDETITEL: Neue (Poly) peptide, die Epitope des humanen Herpesvirus 8 darstellen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 11
(iv) COMPUTER- ESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
Met Tyr Glu Val Phe Thr Asp Phe Pro Val 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2: Asp Pro Ala Tyr Thr Asn Asn Thr Glu Ala 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 3:
(x) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3
Arg His Met Tyr Lys Pro Ile Ser Pro Gin 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 4:
(l) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Met Ser Asn Phe Lys Val Arg Asp Pro Val 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 5:
(l) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(i ) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5:
Ala Arg Lys Pro Pro Ser Gly Lys Lys Lys 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 6:
( ) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminos ure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SΞQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:
Gin Glu Glu Gin Glu Leu Glu Glu Val Glu 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
Ala Ile Pro Pro Leu Val Cys Leu Leu Ala 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 8:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE : 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 8:
Pro Thr Tyr Arg Ser His Leu Gly Phe Trp Gin Glu 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 9:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 9:
Ser Gly Ser Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
Ser Gly Ser Gly Gin Glu Pro Pro Ala Pro Gin Ala Pro Ile 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE : 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SΞQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 11:
Ser Gly Ser Gly Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu Thr Gly Ala 1 5 10

Claims

Patentansprüche
1. (Poly)peptid, das von anti-HHV8 Antikörpern HHV8-infιzierter Patienten erkannt wird und dadurch gekennzeichnet ist, daß es
(a) eine der in SEQ ID NR.:1 bis 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen umfaßt;
(b) aus einer der in SEQ ID NR.:1 bis 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen besteht; oder
(c) aus einer Aminosäuresequenz besteht, die von einer der in (a) oder (b) gekennzeichneten Aminosäuresequenzen durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen abweicht; wobei das (Poly)peptid kein natürlich vorkommendes HHV8-Protein ist.
2. (Poly)peptid nach Anspruch 1(c), das eine natürlich vorkommende Sequenzvariante ist.
3. Polymer, das mindestens zwei gleiche oder verschiedene (Poly)peptide nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt.
4. Polymer nach Anspruch 3, das durch eine unverzweigte Kette von polymerisierten (Poly)peptiden nach Anspruch 1 oder 2 gekennzeichnet ist.
5. Polymer nach Anspruch 3, das durch verzweigte Ketten von polymerisierten (Poly)peptiden nach Anspruch 1 oder 2 gekennzeichnet ist.
6. (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, oder Polymer nach einem der Ansprüche 3 bis 5, das chemisch synthetisiert ist.
7. Fusionsprotein, das ein (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, oder ein Polymer nach Anspruch 3 oder 4 umfaßt.
8. Polynukleotid, das ein (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, ein Polymer nach Anspruch 3 oder 4, oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 7 codiert.
9. Polynukleotid nach Anspruch 8, das DNA oder RNA ist.
10. Vektor, der ein Polynukleotid nach Anspruch 8 oder 9 umfaßt.
11. Vektor nach Anspruch 10, der ein Expressionsvektor ist.
12. Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 11 enthält.
13. Verfahren zur Herstellung eines (Poly)peptids nach Anspruch 1 oder 2, eines Polymers nach Anspruch 3 oder 4 oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 12 unter Bedingungen, die die Expression des (Poly)peptids, des Polymers oder des Fusionsproteins bewirken; oder
(b) in vitro Transkription und/oder Translation des Polynukleotids nach Anspruch 8; und Gewinnung des in (a) oder (b) hergestellten (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins.
14. Konjugat, das ein (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, ein Polymer nach einem der Ansprüche 3 bis 5, ein (Poly)peptid oder Polymer nach Anspruch 6, ein Fusionsprotein nach Anspruch 7 oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, umfaßt.
15. Zusammensetzung, die mindestens ein (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, und/oder ein Polymer nach einem der Ansprüche 3 bis 5, und/oder ein (Poly)peptid oder Polymer nach Anspruch 6, und/oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 7, und/oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, und/oder ein Konjugat nach Anspruch 14 umfaßt und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, die ein Arzneimittel ist.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, die ein Impfstoff ist.
18. Verfahren zum Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit mindestens einem (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, und/oder einem Polymer nach einem der Ansprüche 3 bis 5, und/oder einem (Poly)peptid oder Polymer nach Anspruch 6, und/oder einem Fusionsprotein nach Anspruch 7, und/oder einem (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, und/oder einem Konjugat nach Anspruch 14, unter Bedingungen, die die Bindung von Antikörpern erlauben; und
(b) Nachweis der in Schritt (a) gebunden Antikörper.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei ein Gemisch der (Poly)peptide, die die in SEQ ID NR.:1 , 3, 4 und 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen umfassen, verwendet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die (Poly)peptide chemisch synthetisiert sind.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Gemisch die (Poly)peptide in einem molaren Verhältnis von 1 :1:1:1 umfaßt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , das ein Enzym-gebundener Immunoabsorptionsassay (ELISA), ein Enzymimmunodotassay, ein Immunobead- Assay, ein passiver Hämagglutinations-Assay (PHA) oder ein Peptid-Antikörper- Peptid Sandwich-Assay ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die biologische Probe Blut, Serum, Gewebeextrakt, Gewebeflüssigkeit, Zellkulturüberstand, oder Zellysat ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, das den weiteren Schritt umfaßt:
(c) Nachweis von unspezifischen Bindungen, die von in der biologischen Probe zusätzlich vorhandenen Antikörpern in Schritt (a) verursacht werden.
25. Kit, enthaltend:
(a) mindestens ein (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, und/oder ein Polymer nach einem der Ansprüche 3 bis 5, und/oder ein (Poly)peptid oder Polymer nach Anspruch 6, und/oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 7, und/oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, und/oder ein Konjugat nach Anspruch 14, wobei die Komponenten getrennt voneinander oder in Form eines Gemisches enthalten sind; und gegebenenfalls
(b) eine feste Phase, an die mindestens ein (Poly)peptid nach Anspruch 1 oder 2, und/oder ein Polymer nach einem der Ansprüche 3 bis 5, und/oder ein (Poly)peptid oder Polymer nach Anspruch 6, und/oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 7, und/oder ein (Poly)peptid, Polymer oder Fusionsprotein, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, und/oder ein Konjugat nach Anspruch 14 gebunden werden kann;
(c) ein Probenverdünnungsmittel; und/oder
(d) eine Negativkontrolle; und/oder
(e) eine Positivkontrolle; und/oder
(f) ein Reportermolekül.
26. Kit nach Anspruch 25, der ein Gemisch der (Poly)peptide, die die in SEQ ID NR.: 1, 3, 4 und 8 gekennzeichneten Aminosäuresequenzen umfassen oder darstellen, enthält.
27. Verwendung mindestens eines (Poly)peptids nach Anspruch 1 oder 2, und/oder eines Polymers nach einem der Ansprüche 3 bis 5, und/oder eines (Poly)peptids oder Polymers nach Anspruch 6, und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7, und/oder eines (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, und/oder eines Konjugats nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von HHV8- assoziierten Erkrankungen.
28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei die HHV8-assoziierten Erkrankungen Kaposi Sarkom, Castleman's Disease, Primary Effusion Lymphoma, interstitieller Pneumonie, Enzephalitis und multiple Myelome sind.
29. Verwendung mindestens eines (Poly)peptids nach Anspruch 1 oder 2, und/oder eines Polymers nach einem der Ansprüche 3 bis 5, und/oder eines (Poly)peptids oder Polymers nach Anspruch 6, und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7, und/oder eines (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, und/oder eines Konjugats nach Anspruch 14 zur Herstellung von Antikörpern.
30. Verwendung mindestens eines (Poly)peptids nach Anspruch 1 oder 2, und/oder eines Polymers nach einem der Ansprüche 3 bis 5, und/oder eines (Poly)peptids oder Polymers nach Anspruch 6, und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7, und/oder eines (Poly)peptids, Polymers oder Fusionsproteins, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, und/oder eines Konjugats nach Anspruch 14 zum Nachweis von anti-HHV8 Antikörpern.
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