WO2000000816A1 - Verfahren und vorrichtung zur manipulation von partikeln in mikrosystemen - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for manipulating particles in fluidic microsystems, in particular for moving particles in microsystems along predetermined, at least sectionally straight paths, and devices for implementing such a method, in particular a fluidic microsystem, in which synthetic or biological particles in a suspension liquid manipulated, and applications of such a microsystem.
  • Fluidic microsystems with structures through which liquids flow e.g. channels
  • microelectrodes for influencing particles e.g. biological cells
  • high-frequency fields are based on negative or positive dielecrophoresis
  • Fluidic microsystems are usually flowed through by a liquid for propelling the particles.
  • the microelectrodes applied on both sides of the channel (top, bottom) lead to a compartmentalization of the channel by means of high-frequency electrical fields, with which the suspended particles can be deflected in the desired manner, for example via branches in adjacent channels or other structural elements. Difficulties are caused especially by the flushing in of the particles at each end of the channel and the setting of the generally low flow velocities (a few ⁇ l / h), which always entail serious restrictions with increasing miniaturization.
  • a general disadvantage of conventional fluidic microsystems is that a solution flow is required for the directed and adjustable particle movement, the control of which (eg the flow rate) causes problems.
  • a central flow system in which liquid flows in a microsystem are not adjusted with conventional pumps and valves, but under the action of centrifugal forces.
  • the microsystem is located in a disk-shaped carrier in the form of a CD-ROM disk.
  • the carrier is intended to be rotated at high speed (in the range from 100 to 10,000 revolutions per minute).
  • the liquids in the microsystem move radially outwards under the action of the centrifugal forces.
  • certain biochemical reactions take place in the microsystem. It is also contemplated to use the liquid movement to transport particles, such as in a conventionally pumped liquid flow.
  • the centrifugal technology according to MJ Madou et al. has the following disadvantages. Both the achievement of a sufficient fluid movement as well as a possible handicap-free entrainment of particles with the liquid in the disc-shaped, plane rotor inevitably require the high speeds of the carrier mentioned. This results in a limitation of the conventional centrifugal flow system to certain basic functions of conventional centrifugation or the achievement of biochemical reactions.
  • the above-mentioned microelectrode technology for generating high-frequency electrical fields in the microstructures cannot be used.
  • Another disadvantage relates to the particle sorting and realized with conventional centrifugal technology Counts. These are only possible by producing microchannels with a size that corresponds to the size of the particles to be processed. This means that a given microsystem is always limited to a certain particle size. In addition, the handling of biological particles (cells, cell components) quickly leads to interactions between the particles and the channel wall, which lead to channel blockages.
  • Centrifuge systems are also generally known, in which the sample material in the centrifuge not only the centrifugal forces, but also additionally e.g. Magnetic or electrical forces are exposed to achieve specific separation effects depending on the ratio of centrifugal and additional forces.
  • these centrifuge systems cannot be used to manipulate biological objects.
  • Biological objects e.g. cells
  • Such conductivities would lead to undesirable heating effects in the conventional centrifuge systems with relatively large electrode areas.
  • the conventional centrifuge systems are therefore based on conductivities of approx. 0.1 Siemens / m limited.
  • the object of the invention is to provide an improved method for manipulating particles in fluidic microsystems, with which the disadvantages of conventional microsystems are overcome and which has an expanded area of application.
  • the object of the invention is also to provide an improved fluidic microsystem with a directional particle movement that is simplified and adjustable with high accuracy.
  • the object of the invention is also to specify applications of such an improved microsystem.
  • a first important aspect of the invention is to deviate from the conventional centrifugal flow system with moving liquids to a procedure in which only the particles to be manipulated are moved in a fluidic microsystem under the action of centrifugal forces, with essentially no liquid flows or movements in the microsystem occur.
  • a series of measures are implemented, which include in particular the use of a fluidic microsystem which is closed at least on one side, the attachment of such a microsystem to a vibrating rotor centrifuge device and the operation of this centrifuge device at a predetermined speed at which the particles in the microsystem are in the desired manner move.
  • the method according to the invention enables centrifugation processes at low speeds. Due to the use of an oscillating rotor system, in which a rotor as a support for the microsystem rises from a vertical orientation (at standstill or at low speeds) to a horizontal orientation (at high speeds), the gravitational force increasingly influences the movement of the particles as the speed decreases in the microsystem. According to a further aspect of the invention, a particle movement is also described in microsystems which are closed on at least one side and which are at a standstill with the microsystem oriented vertically. The particle movement takes place as sedimentation under the effect of gravitational force.
  • microsystems which are equipped with microelectrode devices for dielectrophoretically influencing the particle movement, are combined in particular with the principle of centrifuging. Due to the centrifugal forces, the suspended particles move through the microchannels or other microstructures in a microsystem, in which they are separated (without being able to escape) under the action of electrical polarization forces, for example, brought into a predetermined position, fused, sorted or permeated.
  • An important advantage of the invention is that, for the first time in complexly structured microsystems with dielectrophoretic particle influence, the use of difficult to control and fault-prone pumps or valves can be dispensed with, without the functionality of the microsystem being restricted. There are no restrictions on the cross channel dimensions. It is possible to set the microsystem in rotation simultaneously with the associated control electronics. Interactions of particles (in particular biological particles) with wall areas of the microsystem can easily be avoided or can also be achieved in a predetermined manner with the appropriate structuring for the investigation of binding processes.
  • An important advantage of the invention is that all particles are equally exposed to the centrifugal force and move along predetermined channels according to a reference direction and the separation z. B. is achieved in different subchannels or reservoirs exclusively via deflection forces, which act particle-specific regardless of the centrifugal force.
  • the deflection forces have a direction deviating from the reference direction, the angle difference preferably being less than 90 °. Only the particle speed is set via the centrifugal force. After the separation, the additional forces can be switched off without the particles mixing again. It is an unexpected and important feature that the use of a vibratory rotor centrifuge prevents the contact of particles with sample chamber walls, which is particularly important for biological objects.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of an inventive construction of a centrifuge with a microsystem
  • Fig. 2 is a schematic plan view of a microsystem according to the invention, which is set up for particle separation, and
  • FIG. 3 shows a schematic top view of a programmable loading microsystem according to a further embodiment of the invention.
  • the embodiments of the invention described here relate to the combination of a microsystem which is equipped with a microelectrode device for performing negative or positive dielectrophoresis (dielectrophoretic microsystem) with an oscillating rotor centrifuge device.
  • dielectrophoretic microsystem an oscillating rotor centrifuge device.
  • Both the dielectrophoretic microsystem (apart from the fact that channel structures can be closed at least on one side) and the vibratory rotor centrifuge device are known per se, so that their technical details are not discussed further here.
  • each centrifuge device direction is included with at least one speed-dependent erectable rotor, which itself forms the microsystem and the associated control, in which the microsystem and the associated control are integrated or on which the microsystem and the associated control are placed.
  • the particles manipulated according to the invention can comprise synthetic particles or biological objects.
  • the synthetic particles are, for example, membrane-encased structures, such as liposomes or vesicles, or so-called beads or also macromolecules.
  • the biological objects include, for example, biological cells or components thereof (e.g. cell organelles), bacteria or viruses.
  • the particles can also be aggregates or agglomerations of such particles and / or objects.
  • the invention is preferably implemented with fluids relevant to cell physiology or medicine with conductivities below 5 Siemens / m.
  • FIG. 1 is a schematic overview representation of a device according to the invention for illustrating the attachment of a dielectrophoretic system to a centrifuge device.
  • the control electronics are connected to the microsystem 15 via cables 14, plugs or otherwise.
  • the control device is preferably supplied with power via an electrical connection (all-round contact) with the fixed laboratory system.
  • the microsystem has an input depot 16 which, depending on the application, can be of different sizes can and is filled with a particle or cell suspension before centrifugation.
  • a channel structure extends from the input depot 16 to collecting zones 17a, 17b, which form an end of the microsystem 15 that is closed at least during centrifugation.
  • the microsystem 15 is arranged on the receptacle 12 in such a way that when the centrifuge device is operating (rotation of the rotor about the axis of rotation 11 at the rotation frequency ⁇ ), the centrifugal forces acting on the microsystem 15 and particles therein are in the reference direction from the input depot 18 to Collection zones 17a, 17b are directed.
  • the receptacles 12 are pivotally attached to the rotor (not shown). When the centrifuge is at a standstill, the receptacle 12 is oriented essentially vertically or at a slight angle with respect to the axis of rotation. In centrifuge operation, the receptacles 12 align themselves in a larger angle, depending on the speed, up to the horizontal orientation perpendicular to the axis of rotation 11. Under the effect of the gravitational force (when the centrifuge is stopped) or As a result of the centrifugal forces, the particles pass through the electronically controlled microchannel system and collect in the collecting zones (eg at the closed end of the part of the microsystem pointing away from the rotor axis).
  • the particles are treated according to predetermined programs (see below). Since the particles perform different movements depending on their density and assume end positions, the advantage of centrifugal separation and movement is combined with the possibilities of programmable dielectrophoresis in the present invention. As a rule, negative dielectrophoresis, in exceptional cases positive dielectrophoresis of the particles is also used.
  • a further advantage of the invention is the control of the particle movement via the rotational speed ( ⁇ ) of the rotor 11. Since programmable variations can also be run through here, a second complex of definable parameters for the particle manipulation is given.
  • the centrifuge device is provided with a speed control (not shown), which is set up for reproducible and precise speed setting, in particular in low speed ranges.
  • the speed is selected depending on the application, depending on the desired speed of the particles to be manipulated and depending on the specific centrifuge design.
  • the particle speeds of interest for biological particles (eg cells) are below approx. 500 ⁇ m / s (preferably in the range from 50 to 100 ⁇ m / s) and for synthetic particles (eg latex beads) at higher speeds (eg a few mm / s).
  • the speed of the centrifuge device is selected according to the relationship between speed and centrifugal force depending on the size or mass density of the particles.
  • the following information relates to a distance of the microsystem from the rotor axis in the range of 1 to 10 cm.
  • the speeds can be in the range from 1 to 1000 U / mm, for example.
  • particles with a diameter of approx. 5 ⁇ m speeds up to 100 U / mm are preferred, although higher speeds can also be set. With particularly small particles, for example macromolecules, even higher speeds can be achieved.
  • centrifugal forces that can be achieved are in the range from pN to nN.
  • the centrifuge device is however also designed for higher speeds, which can be set especially for small particles or for cleaning or winding purposes. These increased speeds can range up to the range of speeds of conventional laboratory centrifuges.
  • the speed of the centrifuge is also selected depending on the dielectrophoretic forces that act on the particles in the microsystem.
  • the dielectrophoretic forces are dependent on the type and size of the particles as polarization forces.
  • the speed is preferably selected so that the centrifugal forces on the particles are less than or equal to the dielectrophoretic forces. If these are not known, the speed can also be selected in relation to the following criterion.
  • the particles have to move so slowly through the channel structure that there is sufficient time for dielectrophoretic deflection when passing the microelectrode devices.
  • the effectiveness or ineffectiveness of the dielectrophoretic deflection as a function of the speed can be detected optically or electrically using suitable sensors.
  • Fig. 2 shows schematically a microsystem for the separation of a particle mixture, consisting of larger particles 21 (e.g. cells) and small particles 22, which are in a suspension.
  • the centrifugal forces act in the direction of arrow 23 (reference direction).
  • the typical dimensions of the channel structure 24 are as follows:
  • Width a few 10 ⁇ m to a few mm
  • Length a few mm to a few cm
  • microelectrodes 27a, 27b are arranged opposite one another, which when actuated with an alternating voltage (usually a frequency in the MHz range and an amplitude of a few volts) produce field barriers across the channel which are negative (also requires positive) dielectrophoresis to deflect the particles (in the case shown here, the large particles).
  • an alternating voltage usually a frequency in the MHz range and an amplitude of a few volts
  • the channel structure 24 extends from the input depot 28 to the closed channel ends 29a, 29b, into which the straight channel branches in a central section.
  • a first pair of microelectrodes 27a, 27b is arranged directly at the channel-side end of the input depot 28 to form a field barrier which projects obliquely into the channel and has the task of forcing the large particles 21 into the part of the channel 24 which is on the right in plan view.
  • a second pair of the microelectrodes 27a, 27b is arranged immediately before the branching to the channel ends 29a, 29b and forms a field barrier which extends obliquely across the channel width into the branch leading to the channel end 29b and is intended for the large particles 21 to this Lead end of channel.
  • a manipulation method according to the invention which in this example is aimed at separating the particles, comprises the following steps.
  • the microsystem Before the centrifugation, the microsystem is filled with a suitable liquid.
  • the microsystem is already installed in a receptacle 12 in the centrifuge (see FIG. 1). Installation can also take place after the microsystem has been filled.
  • the electrodes 27a, 27b are activated and the suspension of the particles to be separated is added to the input depot 28, for example with a pipetting device.
  • the centrifuge device is initially still at rest, ie the microsystem is vertical or slightly inclined to the vertical. The gravitational force that acts on the particles leads to a mass-dependent drop in the channel structure (sedimentation).
  • the further movement of the particles towards the channel ends takes place e depending on the desired particle speed exclusively under the effect of the gravitational force or under the joint effect of the gravitational force and the centrifugal forces.
  • the centrifugation can thus be understood as sedimentation under the effect of an artificially increased acceleration of gravity.
  • the moving particles are separated depending on the size by the electric field of the first pair of microelectrodes.
  • FIG. 2 shows the conditions during sedimentation or centrifugation. Due to the precisely adjustable centrifugal forces via the rotation speed, the particles move into the lower part of the microsystem. According to the usual centrifugation principles, the particles with the highest density sediment first. Since the particles 21 are shifted to the right by the electrical field barrier in the channel, while the particles 22 remain unaffected thereby, a separation of the two types of particles results in the channel ends 29a, 29b. The particles in each of the channel ends also arrange themselves according to their density, as in conventional centrifugation.
  • the microsystem shown can be regarded as the basic form of a device according to the invention, which basic form can be enlarged, expanded or combined with other microstructures depending on the application.
  • a microsystem according to the invention can be expanded as desired, as is known per se from dielectrophoretic microsystems. Accordingly, the channel structure can in particular have a plurality of individual channels connected to one another via branches.
  • the channels can be straight or curved. Curved channel shapes (e.g. arches, meanders, bends, angles, etc.) can be used in particular to investigate differences in the binding of particles to the channel walls.
  • the microsystem can be rotatably attached to the receptacle 12 (see FIG. 1).
  • a first centrifugation process in a first microsystem orientation, e.g. 2.
  • the orientation of the microsystem is changed by 180 °, so that the gravitational and / or centrifugal forces act counter to the arrow 23.
  • the channel ends 29a, 29b then take over the function of input depots, from which, in the presence of suitable channel structures (additional lateral branches), a further distribution of the separated particles, subgroups or a specific treatment (loading with substances, electroporation and the like) can take place.
  • orientation changes other than the 180 ° reversal mentioned are also possible.
  • the possibility of designing the receptacle 12 in such a way that the microsystem is rotated during the centrifugation.
  • FIG. 3 Another embodiment of the invention, namely a programmable loading microsystem for cells or particles, is shown in FIG. 3.
  • the centrifugation channel is divided into three parts 31a, 31b, 31c. Openings 32 are located in the intermediate walls, through which electrodes 33 on the top and bottom of the channel extend again. The openings are adapted to the particle size (typically 5 to 20 times larger than the diameter).
  • different solutions are used in each of the channel parts 31a to 31c, which serve to chemically change or load the particles.
  • the particles are inserted into a channel part (here eg 31c).
  • the particles (for example first the black, then the light ones) reach the electrodes 33 through the centrifugation and can thus be automatically transferred via the electrical field barriers through the openings 32 into the neighboring solutions.
  • microsystems can have openings (inflows, flows, outflows) that can be closed so that the particles can be easily removed or inserted after centrifugation or before.
  • all the microelectrode elements holding electrodes for particles, microfield cages, etc.
  • the method according to the invention is an electrically controlled or active centrifugation.
  • combinations with the action of optical forces (laser tweezers), magnetic forces (action on magnetic particles) or mechanical forces in the form of ultrasound forces can be provided.
  • the invention is not restricted to specific solution or suspension liquids. It is advantageous if the viscosity of the liquid contained in the microsystem is known. If the viscosity is known, the speed of rotation for setting a specific particle speed can be determined on the basis of table values or by means of a program algorithm. Alternatively, however, it is also possible to record the actual speed of the particles in the microsystem during centrifugation (e.g. with an optical sensor) and to regulate the speed in order to set a certain particle speed. It can be provided that in different sections of the channel structures, e.g. Liquids with different viscosities are contained in parallel channels that are only connected to one another via an opening. In this case, however, viscosities are preferred in which it is ensured that the diffusion of the liquids through the opening over the centrifugation period is relatively small or negligibly small.
  • the invention can be implemented in a modified manner, in that particles are introduced on the side of the microsystem facing away from the axis of rotation and under the effect of the buoyancy or under the combined effect of the buoyancy and the centrifugal forces Walk end of the microsystem.
  • the microsystem is adapted depending on the application with regard to the channel structure and the alignment of the electrode devices.
  • the cross-channel dimensions are generally much larger than the diameter of the individual particles. This advantageously avoids clogging of the channels. If only particles with particularly small dimensions are to be manipulated (eg bacteria or viruses or cell organelles), the channel dimensions can be reduced accordingly, for example to amounts below 10 ⁇ m.
  • the invention is implemented with a microsystem that is closed on at least one side.
  • the closed end can be a closed channel end, a closed collecting zone or a closed cavity in the microsystem.
  • the invention provides for the speed of the centrifuge to be increased briefly in order to detach the particles adhering and move them further.

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Abstract

Zur Manipulation von Partikeln in einem fluidischen Mikrosystem (15), bei dem die Partikel in einer Suspensionsflüssigkeit in einer vorbestimmten Bezugsrichtung bewegt werden, wird das Mikrosystem (15) mindestens an seinem in der Bezugsrichtung liegenden Ende (17a, 17b) verschlossen. Die Partikel bewegen sich unter der Wirkung von Zentrifugal- und/oder Gravitationskräften in der in Bezug auf das Mikrosystem (15) ruhenden Suspensionsflüssigkeit, wobei die Zentrifugal- und/oder Gravitationskräfte im wesentlichen parallel zu der Bezugsrichtung verlaufen. Ausserdem sind die Partikel im Mikrosystem (15) Ablenkkräften ausgesetzt, deren Richtung von der Bezugsrichtung abweicht.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Manipulation von Partikeln in Mikrosystemen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Manipulation von Partikeln in fluidischen Mikrosystemen, insbesondere zur Bewegung von Partikeln in Mikrosystemen entlang vorbestimmter, zumindest abschnittsweise gerader Bahnen, und Vorrichtungen zur Implementierung eines derartigen Verfahrens, insbesondere ein fluidisches Mikrosystem, bei dem synthetische oder biologische Partikel in einer Suspensionsflüssigkeit manipuliert werden, und Anwendungen eines derartigen Mikrosystems .
Fluidische Mikrosysteme mit flüssigkeitsdurchströmten Strukturen (z.B. Kanälen), in denen Mikroelektroden zur Beeinflussung von Partikeln (z.B. biologische Zellen) in den durchströmten Kanälen durch hochfrequente Felder auf der Basis negativer oder positiver Dielekrophorese angebracht sind, werden beispielsweise in der Publikation von G. Fuhr et al . in "Naturwissenschaften" (Bd. 81, 1994, S. 528 ff.) beschrieben.
Gewöhnlich werden fluidische Mikrosysteme von einer Flüssigkeit zum Vortrieb der Partikel durchströmt. Die auf beiden Kanallängsseiten (oben, unten) aufgebrachten Mikroelektroden führen zu einer Kompartimentierung des Kanals mittels hochfrequenter elektrischer Felder, mit denen die suspendierten Partikel in der gewünschten Weise, z.B. über Verzweigungen in Nachbarkanäle oder andere Strukturelemente, abgelenkt werden können. Schwierigkeiten bereiten vor allem die Einspülungen der Partikel jeweils an einem Kanalende und die Einstellung der in der Regel geringen Strömungsgeschwindigkeiten (einige μl/h) , die mit steigender Miniaturisierung immer gravierende Einschränkungen mit sich bringen. Ein genereller Nachteil herkömmlicher fluidischer Mikrosysteme besteht darin, daß zur gerichteten und einstellbaren Partikelbewegung eine Losungsstromung erforderlich ist, deren Steuerung (z.B. der Stromungsgeschwindigkeit) Probleme bereitet.
Aus der Publikation von M. J. Madou et al . in "SPIE", Band 3259, 1998, S. 80 ff., ist ein Zentπfugal-Durchflußsystem bekannt, bei dem Flussigkeitsstromungen m einem Mikrosystem nicht mit herkömmlichen Pumpen und Ventilen, sondern unter der Wirkung von Zentrifugalkräften eingestellt werden. Hierzu befindet sich das Mikrosystem in einem scheibenförmigen Trager in Gestalt einer CD-ROM-Scheibe . Analog zum Betrieb von CD- Speichermedien ist der Trager dazu vorgesehen, mit hoher Geschwindigkeit (im Bereich von 100 bis 10000 Umdrehungen pro Minute) gedreht zu werden. Die Flüssigkeiten im Mikrosystem bewegen sich unter der Wirkung der Zentrifugalkräfte radial nach außen. Simultan zu dieser Flussigkeitsbewegung erfolgen im Mikrosystem bestimmte biochemische Reaktionen. Es ist auch vorgesehen, die Flussigkeitsbewegung zum Teilchentransport , wie m einer herkömmlich gepumpten Flussigkeitsstromung zu verwenden .
Die Zentrifugaltechnik nach M. J. Madou et al . besitzt die folgenden Nachteile. Sowohl die Erzielung einer genugenden Flussigkeitsbewegung als auch eine möglichst behinderungsfreie Mitnahme von Partikeln mit der Flüssigkeit im scheibenförmigen, ebenen Rotor erfordern zwangsläufig die genannten hohen Drehzahlen des Tragers. Dadurch ergibt sich eine Einschränkung des herkömmlichen Zentrifugaldurchflußsystems auf bestimmte Grundfunktionen des herkömmlichen Zentrifugierens oder der Erzielung biochemischer Reaktionen. Die obengenannte Mikro- elektrodentechnik zur Erzeugung hochfrequenter elektrischer Felder m den MikroStrukturen ist nicht anwendbar. Ein weiterer Nachteil bezieht sich auf die mit der herkömmlichen Zentrifugaltechnik realisierten Partikelsortierungen und -Zählungen. Diese sind nur möglich, indem Mikrokanäle mit einer Größe hergestellt werden, die der Größe der zu bearbeitenden Teilchen entspricht. Damit ist ein gegebenes Mikrosystem immer auf eine bestimmte Teilchengröße beschränkt. Außerdem kommt es bei der Handhabung von biologischen Partikeln (Zellen, Zellbestandteile) schnell zu Wechselwirkungen zwischen den Partikeln und der Kanalwand, die zu Kanalverstopfungen führen.
Es sind ferner Zentrifugensysteme allgemein bekannt, bei denen das Probenmaterial in der Zentrifuge nicht nur den Zentrifugalkräften, sondern auch zusätzlich z.B. magnetischen oder elektrischen Kräften ausgesetzt werden, um je nach dem Verhältnis der Zentrifugal- und der Zusatzkräfte spezifische Trenneffekte zu erzielen. Diese Zentrifugensysteme sind jedoch nicht zur Manipulierung biologischer Objekte verwendbar. Biologische Objekte (z.B. Zellen) werden nämlich in relativ stark leitfähigen Lösungen oder Suspensionen (Leitfähigkeiten im Bereich rd. 0.5 bis 3 Siemens/m) gehandhabt. Bei derartigen Leitfähigkeiten würde es in den herkömmlichen Zentrifugensystemen mit relativ großen Elektrodenflächen zu unerwünschten Aufheizungserscheinungen kommen. Die herkömmlichen Zentrifugensysteme sind daher auf Leitfähigkeiten von rd. 0.1 Siemens/m beschränkt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Manipulation von Partikeln in fluidischen Mikrosystemen anzugeben, mit dem die Nachteile herkömmlicher Mikrosysteme überwunden werden und das einen erweiterten Anwendungsbereich besitzt. Die Aufgabe der Erfindung ist es ferner, ein verbessertes fluidisches Mikrosystem mit einer gerichteten Partikelbewegung anzugeben, die vereinfacht und mit hoher Genauigkeit einstellbar ist. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Anwendungen eines derart verbesserten Mikrosystems anzugeben. Diese Aufgaben werden durch Verfahren und Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 bzw. 10 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendung der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Ein erster wichtiger Gesichtspunkt der Erfindung besteht darin, abweichend vom herkömmlichen Zentrifugaldurchflußsystem mit bewegten Flüssigkeiten zu einer Verfahrensweise überzugehen, bei der in einem fluidischen Mikrosystem unter der Wirkung von Zentrifugalkräften ausschließlich die zu manipulierenden Partikel bewegt werden, wobei im wesentlichen keine Flüssigkeitsströmungen oder -bewegungen im Mikrosystem auftreten. Hierzu werden eine Reihe von Maßnahmen realisiert, die insbesondere die Verwendung eines zumindest einseitig geschlossenen fluidischen Mikrosystems, die Anbringung eines solchen Mikrosystems an einer Schwingrotor-Zentrifugeneinrichtung und den Betrieb dieser Zentrifugeneinrichtung mit einer vorbestimmten Drehzahl umfassen, bei der sich die Partikel im Mikrosystem in gewünschter Weise bewegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht Zentrifugierungsvor- gänge mit geringen Drehzahlen. Wegen der Verwendung eines Schwingrotorsystems, bei dem sich ein Rotor als Träger für das Mikrosystem von einer vertikalen Ausrichtung (bei Stillstand oder niedrigen Drehzahlen) zu einer horizontalen Ausrichtung (bei hohen Drehzahlen) aufrichtet, beeinflussen bei abnehmenden Drehzahlen zunehmend auch die Gravitationskraft die Bewegung der Partikel im Mikrosystem. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird auch eine Partikelbewegung in mindestens einseitig geschlossenen Mikrosystemen beschrieben, die sich im Stillstand mit vertikaler Ausrichtung des Mikrosystems befinden. Die Partikelbewegung erfolgt als Sedimentation unter Wirkung der Gravitationskraft. Erfindungsgemäß werden insbesondere derartige Mikrosysteme, die mit Mikroelektrodeneinrichtungen zur dielektrophoretischen Beeinflussung der Partikelbewegung ausgestattet sind, mit dem Prinzip des Zentrifugierens kombiniert. Die suspendierten Partikel bewegen sich aufgrund der Zentrifugalkräfte durch die Mikrokanäle oder andere MikroStrukturen in einem Mikrosystem, in denen sie (ohne austreten zu können) unter Wirkung elektrischer Polarisationskräfte z.B. aufgetrennt, in eine vorher festgelegte Position gebracht, fusioniert, sortiert oder permeiert werden.
Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, daß erstmalig bei komplex strukturierten Mikrosystemen mit dielektropho- retischer Teilchenbeeinflussung auf den Einsatz von schwer steuerbaren und störanfälligen Pumpen oder Ventilen verzichtet werden kann, ohne daß eine Einschränkung der Funktionalität des Mikrosystems auftritt. Es bestehen keine Beschränkungen in Bezug auf die Kanalquerdimensionen. Es besteht die Möglichkeit, das Mikrosystem simultan mit der zugehörigen Steuerelektronik in Rotation zu versetzen. Wechselwirkungen von Partikeln (insbesondere biologischen Partikeln) mit Wandbereichen des Mikrosystems können ohne weiteres vermieden oder aber auch bei entsprechender Strukturierung zur Untersuchung von Bindungsvorgängen in vorbestimmter Weise erzielt werden.
Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, daß alle Partikel gleichermaßen der Zentrifugalkraft ausgesetzt werden und sich entsprechend einer Bezugsrichtung entlang vorbestim- mer Kanäle bewegen und die Trennung z. B. in verschiedene Teilkanäle oder Reservoire ausschließlich über Ablenkkräfte erzielt wird, die unabhängig von der Zentrifugalkraft partikelspezifisch wirken. Die Ablenkkräfte besitzen eine von der Bezugsrichtung abweichende Richtung, wobei der Winkelunterschied vorzugsweise kleiner als 90° ist. Über die Zentrifugalkraft wird lediglich die Partikelgeschwindigkeit eingestellt. Nach der Trennung können die Zusatzkräfte abgeschaltet werden, ohne das sich die Partikel wieder vermengen. Es ist ein unerwartetes und wichtiges Merkmal, daß durch den Einsatz einer Schwingrotorzentrifuge der Kontakt von Partikeln mit Probenkammerwandungen vermieden werden kann, was besonders bei biologischen Objekten von Bedeutung ist.
Einzelheiten und weitere Vorteile der Erfindung werden im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Perspektivansicht eines erfindungsgemäßen Aufbaus eines Zentrifuge mit einem Mikrosystem,
Fig. 2 eine schematische Draufsicht auf ein erfindungsgemäßen Mikrosystem, das zur Teilchentrennung eingerichtet ist, und
Fig. 3 eine schematische Draufsicht auf ein programmierbares Beladungsmikrosystem gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
Die hier beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auf die Kombination eines Mikrosystems, das mit einer Mikroelektrodeneinrichtung zur Ausübung negativer oder positiver Dielektrophorese ausgestattet ist (dielektrophoretisches Mikrosystem), mit einer Schwingrotorzentrifugeneinrichtung . Sowohl das dielektrophoretische Mikrosystem (abgesehen von der mindestens einseitigen Verschließbarkeit von Kanalstrukturen) als auch die Schwingrotorzentrifugeneinrichtung sind jeweils an sich bekannt, so daß auf deren technische Einzelheiten hier nicht weiter eingegangen wird. Es wird betont, daß der Begriff der Schwingrotorzentrifugeneinrichtung hier auch im weitesten Sinne dahingehend zu verstehen ist, daß jede Zentrifugenein- richtung mit mindestens einem drehzahlabhangig aufrichtbaren Rotor eingeschlossen ist, der selbst das Mikrosystem und die zugehörige Steuerung bildet, in den das Mikrosystem und die zugehörige Steuerung integriert oder auf den das Mikrosystem und die zugehörige Steuerung aufgesetzt sind.
Die erfmdungsgemaß manipulierten Partikel können synthetische Teilchen oder biologische Objekte umfassen. Die synthetischen Teilchen sind beispielsweise membranumhullte Gebilde, wie Liposomen oder Vesikeln, oder sogenannte Beads oder auch Makromoleküle. Die biologischen Objekte umfassen beispielsweise biologische Zellen oder Bestandteile von diesen (z.B. Zellorganellen), Bakterien oder Viren. Die Partikel können auch Aggregate oder Zusammenballungen derartiger Teilchen und/oder Objekte sein. Die Erfindung wird vorzugsweise mit zellphysiologisch oder medizinisch relevanten Fluiden mit Leitfähigkeiten unterhalb 5 Siemens/m implementiert.
Fig. 1 ist eine schematische Ubersichtsdarstellung einer er- findungsgemaßen Vorrichtung zur Illustration der Anbringung eines dielektrophoretischen Systems an einer Zentrifugeneinrichtung.
An einem üblichen oder anwendungsabhangig modifizierten Rotor einer Zentrifuge mit der Drehachse 11 befinden sich vier Aufnahmen 12, in die jeweils paßgerecht und für die applizierten Drehzahlen entsprechend ein Mikrosystem 15 und eine Steuerelektronik 13 zur Ansteuerung des Mikrosystems mit hochfrequenten Wechselsignalen verschiedener Phasenlage und Amplitude eingesetzt sind. Die Steuerelektronik ist über Kabel 14, Stecker oder anderweitig mit dem Mikrosystem 15 verbunden. Die Energieversorgung der Steuereinrichtung erfolgt vorzugsweise über eine elektrische Verbindung, (umlaufender Kontakt) mit dem festen Laborsystem. Das Mikrosystem hat ein Eingangsdepot 16, das anwendungsabhangig verschieden groß ausgelegt sein kann und vor der Zentrifugation mit einer Teilchen- oder Zellsuspension gefüllt wird. Vom Eingangsdepot 16 aus verläuft eine Kanalstruktur, deren Einzelheiten weiter unten erläutert werden, bis zu Auffangzonen 17a, 17b, die ein zumindest während des Zentrifugierens geschlossenes Ende des Mikrosystems 15 bilden. Dies bedeutet, daß das Ende des Mikrosystems entweder dauerhaft abgeschlossen oder bei Stillstand der Vorrichtung durch entsprechende Verbindungselemente geöffnet und an vorbestimmte Zusatzsysteme zur Probenübertragung angeschlossen werden kann. Das Mikrosystem 15 ist so auf der Aufnahme 12 angeordnet, daß bei Betrieb der Zentrifugeneinrichtung (Drehung des Rotors um die Drehachse 11 mit der Drehfrequenz ω) die auf das Mikrosystem 15 und in diesem befindliche Partikel wirkenden Zentrifugalkräfte in der Bezugsrichtung vom Eingangsdepot 18 hin zu den Auffangzonen 17a, 17b gerichtet sind. Die Aufnahmen 12 sind verschwenkbar am Rotor (nicht dargestellt) angebracht. Beim Stillstand der Zentrifuge sind die Aufnahme 12 im wesentlichen vertikal oder mit einem geringen Winkel gegenüber der Drehachse ausgerichtet. Beim Zentrifugenbetrieb richten sich die Aufnahmen 12 drehzahlabhängig in einen größeren Winkel bis hin in die horizontale Ausrichtung senkrecht zur Drehachse 11 auf. Unter der Wirkung der Gravitationskraft (bei Stillstand der Zentrifuge) bwz . der Zentrifugalkräfte durchlaufen die Teilchen das elektronisch gesteuerte Mikrokanalsystem und sammeln sich in den Auffangzonen (z.B. am geschlossenen Ende des von der Rotorachse wegweisenden Teils des Mikrosystems).
Bei diesem Durchlauf werden die Partikel nach vorbestimmten Programmen (s. unten) behandelt. Da die Teilchen in Abhängigkeit von ihrer Dichte verschiedene Bewegungen ausführen und Endpositionen einnehmen, wird in der vorliegenden Erfindung der Vorteil der Zentrifugaltrennung und -bewegung mit den Möglichkeiten der programmierbaren Dielektrophorese kombiniert. In der Regel wird negative Dielektrophorese, in Ausnahmefällen auch positive Dielektrophorese der Teilchen genutzt. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Steuerung der Teilchenbe- wegung über die Rotationsgeschwindigkeit (ω) des Rotors 11. Da hierbei ebenfalls programmierbare Variationen durchlaufen werden können, ist ein zweiter Komplex von festlegbaren Parametern bei der Partikelmanipulation gegeben.
Die Zentrifugeneinrichtung ist mit einer (nicht dargestellten) Drehzahlsteuerung versehen, die für eine reproduzierbare und genaue Drehzahlemstellung insbesondere m niedrigen Drehzahl- bereichen eingerichtet ist. Die Drehzahl wird anwendungsabhangig je nach der gewünschten Geschwindigkeit der zu manipulierenden Teilchen und in Abhängigkeit vom konkreten Zentrifugenaufbau gewählt. Die interessierenden Partikelgeschwindigkeiten liegen für biologische Partikel (z.B. Zellen) unterhalb von rd. 500 μm/s (vorzugsweise im Bereich von 50 bis 100 μm/s) und für synthetische Partikel (z.B. Latex-Beads) bei höheren Geschwindigkeiten (z.B. einige mm/s). Die Drehzahl der Zentrifugeneinrichtung wird entsprechend den Zusammenhangen von Drehzahl und Zentrifugalkraft in Abhängigkeit von der Große bzw. Massendichte der Partikel gewählt. Die folgenden Angaben beziehen sich auf einen Abstand des Mikrosystems von der Rotorachse im Bereich von 1 bis 10 cm. Für Partikeldurchmesser im Bereich von 50 bis 600 nm (z.B. Viren) können die Drehzahlen beispielsweise im Bereich von 1 bis 1000 U/mm liegen. Bei Partikeln mit einem Durchmesser von rd. 5 μm werden Drehzahlen bis zu 100 U/mm bevorzugt, wobei jedoch auch höhere Drehzahlen einstellbar sind. Bei besonders kleinen Partikeln, z.B. Makromoleküle sind auch noch höhere Drehzahlen realisierbar. Für biologische Zellen ergeben sich bei einem Abstand des Mikrosystems von rd. 5 bis 10 cm von der Drehachse 11 Drehzahlen im Bereich von wenigen Umdrehungen pro Minute bis zu einigen 100 (z. B. 600) Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise unterhalb 100 U/mm. Die erzielbaren Zentrifugalkräfte liegen im Bereich von pN bis nN . Die Zentrifugeneinrichtung ist jedoch auch für größere Drehzahlen ausgelegt, die insbesondere für kleine Partikel oder für Reinigungs- oder Spulzwecke eingestellt werden können. Diese erhöhten Drehzahlen können bis zum Bereich der Drehzahlen herkömmlicher Laborzentrifugen reichen.
Die Drehzahl der Zentrifuge wird auch in Abhängigkeit von den dielektrophoretischen Kräften ausgewählt, die auf die Partikel im Mikrosystem wirken. Die dielektrophoretischen Kräfte sind als Polarisationskrafte von der Teilchenart und -große abhangig. Die Drehzahl wird vorzugsweise so ausgewählt, daß die Zentrifugalkräfte auf die Partikel kleiner oder gleich den dielektrophoretischen Kräften sind. Falls diese nicht bekannt sind, kann die Drehzahl auch m Bezug auf das folgende Kriterium ausgewählt werden. Die Teilchen müssen sich so langsam durch die Kanalstruktur bewegen, daß beim Vorbeitritt an den Mikroelektrodenemrichtungen genügend Zeit zur dielektrophoretischen Ablenkung bleibt. Die Wirksamkeit oder Unwirksamkeit der dielektrophoretischen Ablenkung m Abhängigkeit von der Drehzahl kann mit geeigneten Sensoren optisch oder elektrisch erfaßt werden.
Fig. 2 zeigt in schematischer Weise ein Mikrosystem zur Auftrennung eines Partikelgemisches, bestehend aus größeren Teilchen 21 (z.B. Zellen) und kleinen Teilchen 22, die in einer Suspension vorliegen. Die Zentrifugalkräfte wirken Pfeil- richtung 23 (Bezugsrichtung) . Die typischen Abmessungen der Kanalstruktur 24 sind die folgenden:
Breite: einige 10 μm bis zu einigen mm
(typischerweise: 200 - 400 μm) Lange: einige mm bis zu einigen cm
(typischerweise: 20 - 50 mm) Hohe: einige μm bis zu einigen 100 μm
(typischerweise: 50 μm) Auf der Oberseite 25 und Unterseite 26 des Kanals 24 sind Mikroelektroden 27a, 27b gegenüberliegend angeordnet, die bei Ansteuerung mit einer Wechselspannung (in der Regel einer Frequenz im MHz-Bereich und einer Amplitude von einigen Volt) quer zum Kanal Feldbarrieren erzeugen, die über negative (bedingt auch positive) Dielektrophorese die Teilchen ablenken (im hier gezeigten Fall die großen Teilchen) .
Die Kanalstruktur 24 reicht vom Eingangsdepot 28 zu den geschlossenen Kanalenden 29a, 29b, in die sich der in einem mittleren Abschnitt gerade Kanal verzweigt. Ein erstes Paar der Mikroelektroden 27a, 27b ist unmittelbar am kanalseitigen Ende des Eingangsdepots 28 zur Ausbildung einer Feldbarriere angeordnet, die schräg in den Kanal hineinragt und die Aufgabe besitzt, die großen Teilchen 21 in den in Draufsicht rechten Teil des Kanals 24 zu drängen. Ein zweites Paar der Mikroelektroden 27a, 27b ist unmittelbar vor der Verzweigung zu den Kanalenden 29a, 29b angeordnet und bildet eine Feldbarriere, die schräg über die Kanalbreite bis in die zum Kanalende 29b führende Abzweigung reicht und dazu vorgesehen ist, die großen Teilchen 21 zu diesem Kanalende hin zu führen.
Ein erfindungsgemäßes Manipulationsverfahren, das bei diesem Beispiel auf eine Trennung der Teilchen gerichtet ist, umfaßt die folgenden Schritte.
Vor der Zentrifugation wird das Mikrosystem mit einer geeigneten Flüssigkeit gefüllt. Dabei ist das Mikrosystem bereits in eine Aufnahme 12 der Zentrifuge (s. Fig. 1) eingebaut. Der Einbau kann aber auch nach der Befüllung des Mikrosystems erfolgen. Kurz vor Beginn der Zentrifugation werden die Elektroden 27a, 27b angesteuert und im Eingangsdepot 28 wird z.B. mit einer Pipettiereinrichtung die Suspension der zu trennenden Teilchen zugegeben. Die Zentrifugeneinrichtung ist zunächst noch im Ruhezustand, d.h. das Mikrosystem ist vertikal oder zur Vertikalen leicht geneigt ausgerichtet. Die Gravitationskraft, die auf die Teilchen wirkt, fuhrt zu einem masseabhan- gig verschieden schnellen Absinken m die Kanalstruktur (Sedimentation) . Die weitere Bewegung der Teilchen hin zu den Kanalenden erfolgt e nach der gewünschten Teilchengeschwindigkeit ausschließlich unter der Wirkung der Gravitationskraft oder unter der gemeinsamen Wirkung der Gravitationskraft und der Zentrifugalkräfte. Die Zentrifugation kann somit als Sedimentation unter der Wirkung einer kunstlich erhöhten Fallbeschleunigung aufgefaßt werden. Die sich bewegenden Teilchen werden durch das elektrische Feld des ersten Paares der Mikroelektroden großenabhangig getrennt.
Die Darstellung in Fig. 2 zeigt die Verhaltnisse wahrend der Sedimentation bzw. Zentrifugation . Durch die exakt einstellbaren Zentrifugalkräfte über die Rotationsgeschwindigkeit bewegen sich die Teilchen in den unteren Teil des Mikrosystems. Entsprechend der üblichen Zentrifugationsprinzipien sedimen- tieren die Teilchen mit der größten Dichte zuerst. Da die Teilchen 21 durch die elektrische Feldbarriere im Kanal nach rechts verschoben werden, wahrend die Teilchen 22 davon unbeeinflußt bleiben, so ergibt sich in den Kanalenden 29a, 29b eine Trennung beider Teilchenarten . Die Teilchen jedem der Kanalenden ordnen sich zusatzlich wie bei der üblichen Zentri- fugation entsprechend ihrer Dichte an. Das dargestellte Mikrosystem kann als Grundform einer erfmdungsgemaßen Vorrichtung betrachtet werden, wobei diese Grundform anwendungsabhangig vergrößert, erweitert oder mit weiteren MikroStrukturen kombiniert werden kann. Der Vorteil besteht darin, daß keine Losungsstromung entsteht und dennoch die Partikelbewegung gerichtet und einstellbar ist. Derartige Systeme können auch entgegengesetzte Bewegungen erzeugen, wenn die Teilchen einen Auftrieb besitzen. Ausgehend von der dargestellten Grundform kann ein erfmdungs- gemaßes Mikrosystem beliebig erweitert werden, wie es an sich von den dielektrophoretischen Mikrosystemen bekannt ist. Demnach kann die Kanalstruktur insbesondere mehrere, über Verzweigungen miteinander verbundene Emzelkanale aufweisen. Die Kanäle können gerade oder gekrümmt sein. Gekrümmte Kanalformen (z.B. Bogen, Mäander, Biegungen, Winkel usw.) können insbesondere zur Untersuchung von Bindungsunterschieden von Partikeln mit den Kanalwanden verwendet werden.
Gemäß einer weiteren Modifikation kann das Mikrosystem an der Aufnahme 12 (s. Fig. 1) drehbar angebracht sein. Wahrend eines ersten Zentπfugationsvorganges erfolgt in einer ersten Mikro- systemorientierung z.B. eine Te lchentrennung gemäß Fig. 2. Anschließend wird die Orientierung des Mikrosystems um 180° verändert, so daß die Gravitations- und/oder Zentrifugalkräfte entgegengesetzt der Pfeilπchtung 23 wirken. Die Kanalenden 29a, 29b übernehmen dann die Funktion von Eingangsdepots, von denen bei Vorhandensein geeigneter Kanalstrukturen (zusätzliche seitliche Abzweigungen) eine weitere Verteilung der getrennten Teilchen Untergruppen oder eine bestimmte Behandlung (Beladen mit Stoffen, Elektroporation u. dgl . ) erfolgen kann. Es sind auch in Abhängigkeit von der Kanalstruktur andere Orientierungsanderungen als die genannte 180°-Umkehr möglich. Es besteht ferner die Möglichkeit, die Aufnahme 12 so zu gestalten, daß das Mikrosystem wahrend der Zentrifugation gedreht wird.
Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung, nämlich ein programmierbares Beladungsmikrosystem für Zellen oder Teilchen ist in Fig. 3 gezeigt. Hier ist der Zentrifugationskanal drei Teile 31a, 31b, 31c unterteilt. In den Zwischenwanden befinden sich Offnungen 32, durch die wieder Elektroden 33 auf der Ober- und Unterseite des Kanals hindurchreichen. Die Offnungen sind der Teilchengroße angepaßt (typischerweise 5- bis 20-fach größer als der Durchmesser) . Zu Beginn werden in jeden der Kanalteile 31a bis 31c verschiedene Lösungen eingefüllt, die der chemischen Veränderung oder Beladung der Partikel dienen. Danach werden in einen Kanalteil (hier z.B. 31c) die Teilchen eingefügt. Durch die Zentrifugation gelangen die Teilchen (z.B. zuerst die schwarzen, dann die hellen) an die Elektroden 33 und können so automatisch über die elektrischen Feldbarrieren durch die Öffnungen 32 in die Nachbarlösungen überführt werden.
Auch hier kommt es zu einer Sortierung in den drei Kanalenden 31d, 31e, 31f und gleichzeitig zu einer Anordnung der Teilchen entsprechend der Masseunterschiede.
Weitere Eigenschaften der Mikrosysteme bestehen darin, daß sie Öffnungen (Zuflüsse, Durchflüsse, Abflüsse) besitzen können, die sich verschließen lassen, so daß die Teilchen nach der Zentrifugation oder davor leicht entnommen oder eingefügt werden können. Ferner können all die Mikroelektrodenelemente (Halteelektroden für Teilchen, Mikrofeldkäfige etc.) eingebaut werden, die für die dielektrophoretische Beeinflussung von Teilchen an sich bekannt sind und bei herkömmlichen Mikrosystemen, die mit strömenden Flüssigkeiten arbeiten, eingesetzt werden. Aufgrund des Zusammenwirkens der Gravitations- bzw. Zentrifugalkräfte mit den dielekrophoretischen Kräften ist das erfindungsgemäße Verfahren eine elektrisch gesteuerte oder aktive Zentrifugation . Zusätzlich können Kombinationen mit der Einwirkung optischer Kräfte (Laser-Tweezer ) , magnetischer Kräfte (Einwirkung auf magnetische Partikel) oder mechanischer Kräfte in Form von Ultraschallkräften vorgesehen sein.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind insbesondere:
Zelltrennung/-fraktionierung, Zellsortierung, Zellbeladung (molekular, Nanoteilchen, Beads), Zellentladung (molekular) , Zellpermeation (sog. Elektroporation) , Zellfusion (sog. Elektrofusion) , Zellparchenbildung, und Zellaggregatbildung.
Die Erfindung ist nicht auf bestimmte Losungs- oder Suspen- sionsflussigkeiten beschrankt. Es ist vorteilhaft, wenn die Viskosität der im Mikrosystem enthaltenen Flüssigkeit bekannt ist. Bei bekannter Viskosität laßt sich die Drehzahl zur Einstellung einer bestimmten Partikelgeschwindigkeit auf der Grundlage von Tabellenwerten oder durch einen Programmalgo- πthmus ermitteln. Alternativ ist es jedoch auch möglich, die tatsächliche Geschwindigkeit der Partikel im Mikrosystem wahrend der Zentrifugation zu erfassen (z.B. mit einem optischen Sensor) und die Drehzahl zur Einstellung einer bestimmten Par- tikelgeschw digkeit zu regeln. Es kann vorgesehen sein, daß in verschiedenen Teilbereichen des Kanalstrukturen, z.B. in parallel verlaufenen Kanälen, die nur über eine Öffnung miteinander verbunden sind, Flüssigkeiten mit verschiedenen Viskositäten enthalten sind. In diesem Fall werden jedoch Viskositäten bevorzugt, bei denen sichergestellt ist, daß die Diffusion der Flüssigkeiten durch die Öffnung über den Zentri- fugationszeitraum verhältnismäßig klein oder vernachlassigbar klein ist.
Falls die Massendichte der Partikel kleiner als die Flüssigkeit im Mikrosystem ist, kann die Erfindung entsprechend abgewandelt implementiert werden, indem Partikel gegebenenfalls auf der der Drehachse abgewandten Seite des Mikrosystems eingebracht werden und unter Wirkung des Auftriebs oder unter kombinierter Wirkung des Auftriebs und der Zentrifugalkräfte zum anderen Ende des Mikrosystems wandern. Das Mikrosystem wird anwendungsabhängig in Bezug auf die Kanalstruktur und die Ausrichtung der Elektrodeneinrichtungen angepaßt. Die Kanalquerdimensionen sind in der Regel wesentlich größer als die Durchmesser der einzelnen Partikel. Dadurch wird vorteilhafterweise ein Verstopfen der Kanäle vermieden. Sind lediglich Partikel mit besonders geringen Dimensionen zu manipulieren (z.B. Bakterien oder Viren oder Zellorganellen) , so können die Kanaldimensionen entsprechend verringert werden, z.B. auf Beträge unterhalb 10 μm.
Die Erfindung wird mit einem Mikrosystem implementiert, das mindestens einseitig geschlossen ist. Das geschlossene Ende kann ein geschlossenes Kanalende, eine geschlossene Sammelzone oder auch ein geschlossener Hohlraum im Mikrosystem sein. Bei der erfindungsgemäßen Partikelmanipulation erfolgt im wesentlichen keine Flüssigkeitsbewegung hin zu dem geschlossenen Ende. Dies bedeutet, insbesondere bei Realisierung von Sammelzonen oder Hohlräumen am geschlossenen Ende, daß diese wie das gesamte Mikrosystem zu Beginn der Partikelmanipulation mit der Lösung oder Suspension für die Teilchen gefüllt ist.
Falls es beim Manipulieren der Partikel zu Zusammenballungen oder vorübergehenden Verstopfungen der Kanalstrukturen kommt, so ist erfindungsgemäß vorgesehen, die Drehzahl der Zentrifuge kurzzeitig zu erhöhen, um so die zusammenhaftenden Partikel abzulösen und weiter zu bewegen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Manipulation von Partikeln m einem fluidischen Mikrosystem (15, 24, 31), bei dem die Partikel (21, 22) in einer Suspensionsflussigkeit in einer vorbestimmten Bezugsrichtung bewegt werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem (15, 24, 31) mindestens an seinem in der Bezugsrichtung liegenden Ende (17a, 17b, 29a, 29b, 31d, 31e, 31f) verschlossen wird, die Partikel sich mit einer durch vorbestimmte Zentrifugal- und/oder Gravitationskräfte eingestellten Geschwindigkeit in der in Bezug auf das Mikrosystem (15, 24, 31) ruhenden Suspensionsflussigkeit bewegen, wobei die Zentrifugal- und/oder Gravitationskräfte im wesentlichen parallel zu der Bezugsrichtung verlaufen, und die Partikel im Mikrosystem (15, 24, 31) Ablenkkraften ausgesetzt werden, deren Richtung von der Bezugsrichtung abweicht.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Mikrosystem (15, 24, 31) an einer Schwingrotorzentrifugeneinrichtung angebracht ist, wobei die Partikelbewegung bei Stillstand der Schwingrotorzentrifugeneinrichtung als Sedimentation unter Wirkung der Gravitationskraft und bei Betrieb der Schwingrotorzentrifu- genemrichtung unter Wirkung der Zentrifugalkräfte erfolgt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Ablenkkrafte elektrische Polarisationskrafte, optische Kräfte, magnetische Kräfte oder Ultraschallkrafte umfassen.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die Drehzahl der Schwingrotorzentrifugenemrichtung so eingestellt ist, daß die auf die Partikel wirkenden Zentrifugalkräfte kleiner oder gleich als die Ablenkkräfte sind.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die Drehzahl der Schwingrotorzentrifugeneinrichtung so eingestellt ist, daß sich die Partikel so langsam bewegen, daß unter Wirkung der Ablenkkräfte eine Ablenkung der Partikel aus der Bezugsrichtung erfolgt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem die Drehzahl der Schwingrotorzentrifugeneinrichtung in Abhängigkeit von der mit einem optischen oder elektrischen Sensor erfaßten Geschwindigkeit der Partikel geregelt wird.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mehrere Partikelbewegungen unter Wirkung der Zentrifugalkräfte in getrennten Zentrifugationsschritten erfolgen, wobei zwischen den Zentrifugationsschritten eine Verstellung des Mikrosystems zur veränderten Ausrichtung in Bezug auf die Zentrifugalkräfte erfolgt.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Drehzahl der Schwingrotorzentrifugeneinrichtung in Abhängigkeit von der Größe oder Dichte der Partikel gewählt wird.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem sich die Partikel unter Wirkung von Auftriebskräften entgegengesetzt zur Richtung der Zentrifugal- und/oder Gravitationskräfte bewegen.
10. Mikrosystem (15, 24, 31) mit mindestens einem Kanal, der von einem Eingangsdepot (16, 28) zu Kanalenden (17a, 17b, 29a, 29b, 31d, 31e, 31f) verläuft, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem (15, 24, 31) zur Anbringung am Rotor einer Zentrifuge derart eingerichtet ist, daß beim Zentrifugenbetrieb die Zentrifugalkräfte, die auf Partikel im Kanal wirken, im wesentlichen parallel zur Kanalausrichtung verlaufen, und die Kanalenden (17a, 17b, 29a, 29b, 31d, 31e, 31f) geschlossen oder während des Zentrifugenbetriebs verschließbar sind.
11. Mikrosystem gemäß Anspruch 10, das eine Mikroelektroden- einrichtung aufweist, die Mikroelektroden zur Erzeugung von Feldbarrieren im Mikrosystem umfaßt.
12. Mikrosystem gemäß Anspruch 11, bei dem die Mikroelektroden an gegenüberliegenden Längsseiten des Kanals angeordnet und zur Beaufschlagung mit einer hochfrequenten Wechselspannung eingerichtet sind.
13. Mikrosystem gemäß Anspruch 12, bei dem die Mikroelektroden bandförmige Elektroden sind, die sich schräg zur Kanalausrichtung erstrecken und zur Erzeugung von Feldbarrieren im Kanal eingerichtet sind.
14. Mikrosystem gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, das am Rotor der Zentrifuge verschwenkbar angebracht ist.
15. Mikrosystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 10 bis 14, bei dem eine elektronische Steuerung des Mikrosystems am Rotor der Zentrifuge angebracht ist.
16. Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Trennung, Fraktionierung, Sortierung, Beladung, Entladung, Permeation, Fusion, Pärchenbildung und/oder Aggregatbildung synthetischer Teilchen und/oder biologischer Partikel.
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