WO2000005383A1 - Novel protein and its dna - Google Patents

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WO2000005383A1
WO2000005383A1 PCT/JP1999/003865 JP9903865W WO0005383A1 WO 2000005383 A1 WO2000005383 A1 WO 2000005383A1 JP 9903865 W JP9903865 W JP 9903865W WO 0005383 A1 WO0005383 A1 WO 0005383A1
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WO
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protein
present
dna
cells
salt
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PCT/JP1999/003865
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English (en)
French (fr)
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Naoki Tarui
Takayuki Doi
Kazuo Nakahama
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein (a novel human phosphodiesterase V) exhibiting phosphodiesterase activity and the like, its DNA, and the like. Background thigh
  • Phosphodiesterase ⁇ Cyclic adenosine 3 ', 5'-monophosphate (c AMP) and cyclic guanosine 3', 5'-monophosphate (c GMP), an enzyme that functions as an intracellular signal 15 substance And is involved in the regulation of functional expression in various cells.
  • c AMP Cyclic adenosine 3 ', 5'-monophosphate
  • c GMP cyclic guanosine 3', 5'-monophosphate
  • type V is an enzyme that specifically acts on cGMP.
  • c GMP is involved in the inhibition of proliferation of smooth muscle ⁇ , smooth ⁇ -vesicles, inhibition of adhesion of blood cells to inner cells, inhibition of blood / ⁇ «, etc., and research on phosphodiesterase V that regulates its level is increasingly active in recent years. It is becoming. However, there are only reports on human phosphodiesterase VDNA from human phosphodiesterase (Kodera et al., Biochemistry, 69, 637 (1997)). Disclosure of the invention
  • Novel human-type protein of phosphodiesterase V an enzyme specifically acting on GMP, antibodies against the protein, screening methods for inhibitors using the protein, etc.
  • cardiovascular diseases effort and relief (coronary spasm and narrow dysmorphia)
  • hypertension depressed ', whole lung, high pulmonary ifiiffi disease, atherosclerosis, hypovascular patency, blood stenosis , Peripheral vascular disease, brain Stroke
  • obstructive Wi disease lift asthma, bronchitis, etc.
  • allergic tt ⁇ disease allergic asthma, allergic rhinitis, urticaria, etc.
  • disease characterized by the «I nature of consumption hyperersensitivity ttli ⁇ ) ⁇
  • glomerular extinction stromal stromal disease, renal failure, diabetic complications, glaucoma, erectile dysfunction of mammals including humans, dysfunction of female MJs including humans, Premature birth, dysmenorrhea, etc.
  • phosphodiesterase IV there is no known example of using ⁇ coli for expression of phosphodiesterase using Escherichia coli.
  • phosphodiesterase V was expressed using bacteria.
  • the present invention also enables the industrialization of phosphodiesterase V.
  • the present inventors have made extensive efforts to solve the above, and as a result, succeeded in cloning a cDNA having a novel; ⁇ S sequence from a human lung-derived cDNA library.
  • the encoded protein was found to be a phosphodiesterase.
  • the present invention relates to a compound for promoting or inhibiting the phosphodiesterase activity of a salt or a screening kit for a salt thereof.
  • a DNA comprising a DNA having a sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 under highly stringent conditions
  • Fig. 2 shows the amino acid sequence of human lung derived phosphodiesterase V of the present invention (continued in Fig. 1).
  • 1 shows an amino sequence of a partial peptide of phosphodiesterase V derived from human lung of the present invention.
  • the amino acid sequence of FIG. 1 and the amino acid sequence shown in “S 2” are deleted from the amino acid sequence in the amino acid sequence (consequent to FIG. 4).
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence of a partial peptide of phosphodiesterase V derived from human lung of the present invention.
  • the amino acid sequence shown in FIGS. 1 and 2 is the amino acid sequence SB in which 109 amino acids have been deleted from the amino acid sequence (continuation of FIG. 3).
  • FIG. 5 shows the sequence of DNA containing DNA encoding human lung phosphodiesterase V of the present invention (following FIG. 6).
  • FIG. 6 shows a DNA sequence containing DNA encoding phosphodiesterase V derived from human lung of the present invention (continuation of FIG. 5).
  • Figure 7 shows the sequence of the DNA encoding the partial peptide shown in Figures 3 and 4 (following Figure 8). ⁇ ).
  • FIG. 8 shows the sequence of the DNA encoding the partial peptide shown in FIGS. 3 and 4 (continuation of FIG. 7).
  • a protein having the same or substantially the same amino 3 ⁇ 4 @ 2 sequence as the amino acid 3 ⁇ 4 @ B sequence (FIGS. 1 and 2) represented by SEQ ID NO: 7 of the present invention (hereinafter referred to as the protein of the present invention)
  • Human cells eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, bushes, hidges, horses, monkeys, etc.
  • cells eg, cysts, cysts, vesicles, glial cells, and fibrous cells
  • Bone invasion Mesangium cells, Langerhans cells, mm, Upper cells, Inner cells, Fiber vesicles, Fibers, Translocations, Lipid cells, ⁇ (e.g., macrophages, ⁇ cells, ⁇ cells, natural killer cells , Mast cells, neutrophils, neutrophils, trophoblasts,), megakaryocytes, synovial cysts, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts,
  • Peripheral blood, anterior, testicle, Ovarian, placenta, uterus, bone, joints, skeletal muscle, etc., or spherical cells or their B cells eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1 , K562, ML—1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL—1, Jurkat, CCRT-HS B—2, KE-37, SKW-3, HUT-78 , HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01, etc.) or a synthetic protein .
  • B cells eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1 , K562, ML—1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL—1, Jurkat, CCRT-
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence @ 2 represented by SEQ ID NO: 7 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 ⁇ ⁇ > the 1st to 10th amino acids. Contains @ 5 columns, An amino ⁇ H sequence represented by SEQ ID NO: 7 and an amino ⁇ SB sequence having a homology of about 92% J3 ⁇ 4 ⁇ , preferably ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 495 ⁇ Lh, and particularly preferably ⁇ 98.
  • proteins encoded by the cDNA retained by the plasmid pPDE51 in the bacterium represented by the deposit number FERMBP-66417 of (1) are also included as the protein of the present invention.
  • the amino acid sequence @ 2 substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes the amino acids 1 to 10 from the male in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 7 contains the amino acid sequence of the 1st to 15th amino acids ⁇ 2 and the 5th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7;
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence H represented by SEQ ID NO: 7 includes the amino acid sequence represented by sequence number: 1, and the like.
  • the protein of the present invention which has an amino SH sequence substantially identical to the amino ⁇ SH sequence represented by Ban No.:7, is, for example, substantially the same as the amino amino sequence represented by SEQ ID NO: 7, the @@ B sequence.
  • An activity that is substantially the same as a protein having the same amino acid sequence @H and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (specifically, phosphodiesterase activity, more preferably phosphodiesterase activity V activity,
  • a protein having a phosphodiesterase activity, cGMP activity, etc., which the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 has specifically, is preferred.
  • Substantially the same indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologic or positive). Therefore, it is preferable that the activities are the same (eg, about 0.1 to 100 times, preferably 0.5 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as protein may vary.
  • Activity of a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (specifically, a phosphodiesterase activity, more preferably a phosphodiesterase activity V activity, and still more preferably, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7) Force-specific phosphodies The observation of teratase activity, cGMP activity, etc.) can be performed according to its own method, but can be measured, for example, according to a key screening method.
  • the protein of the present invention includes, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 from the Nth amino acid sequence to the 10th to 10th amino acids from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7; 1 or 2 or more amino acids (preferably about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably about 1 to 5 amino acids) , (3 ⁇ 4 1 or 2 or more amino acids in the column represented by column number: 7 (preferably 1 to 3 omm, preferably ⁇
  • ⁇ 10 amino acids, more preferably amino acids (1-5) amino acid sequence, 3, amino acid represented by number: 7 1 or 2 in column @ 5 ( ⁇ An amino acid sequence having 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, and more preferably a number (1 to 5) amino acids inserted therein. @ ⁇ 5 Amino acid represented by column number: 7 in column E An amino acid sequence in which one or more (preferably 1 to 30, preferably 1 to 10 m3 ⁇ 4, and more preferably a number (1 to 5)) amino acids have been substituted with another amino acid Also, so-called mucins such as proteins containing an amino acid obtained by combining ⁇ 3 ⁇ 4D and l are included.
  • the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above.
  • the specific position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited, but is represented, for example, by SEQ ID NO: 7.
  • the position of the amino acid sequence at the 437th to the 7th 24th position of the amino acid sequence, more preferably the position of the 4th to the 83rd position of the amino acid sequence at the 54th to 83rd position, and the like can be mentioned.
  • Proteins of the present invention including the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 at the left end are N3 ⁇ 43 ⁇ 4 (amino) and Tachibana are C (carboxyl) according to the convention of peptide labeling, The C-terminal is usually a carboxyl group
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, such as isopropyl or n- butyl
  • Bok 6 alkyl group for example, C 3, such as carboxymethyl Le cyclopentyl, cyclohexylene - s cycloalkyl group
  • C 6 -aryl such as phenyl, ⁇ -naphthyl Group
  • C 7 _ Ararukiru group such as an alkyl group, Viva Roy Ruo carboxymethyl group which is generally used as an ester for oral administration - alpha-naphthyl, such as alkyl or alpha-naphth Rumechiru Are used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester of this age for example, the esters described above (: * 3 ⁇ 4) are used.
  • the protein of the present invention the amino acid 3 ⁇ 4S (eg, Mechionin 3 ⁇ 4S) of N «amino group ⁇ (e.g., formyl group, such as -e Arukanoiru such Asechiru groups - such as 6 ⁇ Shi Le group) , which has been cleaved in vivo; which has been obtained by oxidation of G1n with pyroglutamine; substituents on the side chains of amino acids in (for example, 10H, 1SH, amino groups) , which imidazo Ichiru group, indole group, etc.
  • amino acid 3 ⁇ 4S eg, Mechionin 3 ⁇ 4S
  • N «amino group ⁇ e.g., formyl group, such as -e Arukanoiru such Asechiru groups - such as 6 ⁇ Shi Le group
  • Guanijino group is woven with a suitable protecting group (e.g., formyl group, a C 1-6 Ashiru group such as Flip Bok 6 Arukanoiru group such Asechiru group) Or complex proteins such as so-called glycoproteins to which ⁇ ⁇ is bound.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, a C 1-6 Ashiru group such as Flip Bok 6 Arukanoiru group such Asechiru group
  • complex proteins such as so-called glycoproteins to which ⁇ ⁇ is bound.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is the partial peptide of the protein of the present invention described above, wherein the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is 1st to 10th It preferably contains the same sequence as the protein of the present invention (specifically, a phosphodiesterase activity, more preferably a phosphodiesterase V activity, and more preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7). Any of the amino acids represented by the amino acid sequence represented by the following formula (phosphoesterase activity, cGMP activity, etc.) can be used.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 contains the 1st to 10th amino acids from N to @ 2 rows, and at least 20 or more, preferably 20 or more, of the amino acid rows constituting the protein of the present invention. It has 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably 200 or more amino acid sequences, and has the same activity as the protein of the present invention (specifically, Has a phosphodiesterase activity, more preferably a phosphodiesterase V activity, Ban No .: Peptides having phosphodiesterase activity, cGMP activity, etc., which are different from proteins having the amino acid sequence represented by 7 are used.
  • the 1st to 15th (more preferably the 1st to: L 0th) amino ⁇ a columns of the amino ⁇ 5 columns represented by SEQ ID NO: 7. At least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably 200 or more of the constituent amino acid sequences of the protein of the invention.
  • the amino acid ⁇ 1 from the column ⁇ 1 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like, and has the same activity as the protein of the present invention (specifically, phosphodiesterase activity, more preferably phosphodiesterase V activity, More preferably, a peptide having phosphodiesterer if activity, cGMP activity, etc., which is specific to the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, is used.
  • the partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (one COO—) at the C-terminus, but has an amide (one CONH 2 ) or ester at the C-terminus as in the protein of the present invention described above. (—COOR) (R is as defined above).
  • the partial peptides of the present invention include those in which the amino group of the amino acid of N (eg, methionine wisteria) is protected by a protecting group, as in the protein of the present invention, which is abominable.
  • G1n which has been cleaved in the body ⁇ Gn is pyroglutamine-oxidized, the substituent on the side chain of the amino acid in the liver is protected with an appropriate protecting group, or a so-called sugar chain with a male chain
  • Compound peptides such as peptides are also included.
  • the partial peptide of the present invention can be used as an antigen for producing an antibody, it is not always necessary to have a phosphodiesterase activity.
  • a physiologically acceptable acid eg, safety, organic acid
  • a salt with an associative eg, an alkali metal
  • Addition salts are preferred, such as, for example, salts with maleic acids (eg, ass, phosphoric acid, bromo acid, «) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid) Acid, maleic acid, succinic acid, ⁇ «, cunic acid, phosphorus: ⁇ , wm, benzoic acid, methane Sulfonic acid and salts with benzene sulfone are used.
  • maleic acids eg, ass, phosphoric acid, bromo acid, «
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid
  • Acid maleic acid, succinic acid, ⁇ «, cunic acid, phosphorus: ⁇ , wm
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof can be prepared by the above-mentioned method of purifying human or animal cells or ttffii ⁇ et al. It can also be produced by culturing a transfiber containing #f DNA. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • a protein synthetic resin Commercially available.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-1-momo Aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein and in accordance with its own difficult method.
  • the protein is cleaved from the resin and at the same time various protecting groups are added. Further, an internal disulfide bond formation reaction is performed in a high-temperature solution to obtain the target protein or an amide thereof.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carbodiimides include DCC, ⁇ , ⁇ ′-diisopropyl carbodiimide, ⁇ -ethyl Jl ⁇ N- (3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, and the like.
  • Activation by these can be accomplished by adding a protected amino acid directly to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt. HOOBt), or by adding!
  • the amino acid can be activated in advance as a steal or HOOBt ester before adding to the resin.
  • Mff can be used for activation of a protected amino acid or condensation with a resin, because it is known that it can be affected by protein condensation act.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, and N-methylpyrrolidone
  • halogenated carbons such as methylene chloride and chloroform
  • Alcohols sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and diethyl, and mixtures of these compounds. Used.
  • the reaction is selected from a range known to be able to be affected by the protein bond formation reaction, and is usually selected from a range of about ⁇ 20 to about 50.
  • Activated amino acid derivative tt® usually used in 1.5-4i3 ⁇ 4J.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z, and adamantyl. It is used for xycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • the carboxyl group can be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (e.g., benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl ester ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide , Can be protected by tritylhydrazide or the like.
  • a linear, branched or cyclic alkyl esterified eg, methyl, ethy
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification
  • Suitable groups for this esterification include, for example, those derived from ⁇ (C 1 ⁇ ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonate. Groups are used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • protecting group for the acid group of phenolic HfcK of tyrosine for example, Bzl, C12-Bzl, 2- nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
  • a protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Activated carboxyl groups in the cafe include, for example, acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, Esters with 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HOB, ⁇ -hydroxysuccinimide, ⁇ -hydroxyphenolimide, HOBt) are used.
  • active esters eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, Esters with 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HOB, ⁇ -hydroxysuccinimide, ⁇ -hydroxyphenolimide, HOBt
  • the activated amino group of the material for example, phosphoric acid amide is used.
  • Removal of the protecting group «) includes, for example, 3 ⁇ 4 £ ⁇ in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and fluorine anhydride, methanesulfonic acid, Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and treatment with sodium in liquid ammonia Used.
  • the elimination reaction by the above e treatment is carried out at about ⁇ 20 to about 40.
  • the acid treatment for example, anisol, phenol, thioanisole, methacrylol, paracresol, dimethyl sulfol Fluid, 1,4-butanedithiol, 1,2-eta
  • 2,4-dinitrophen used as an imidazole protecting group for histidine is also used.
  • the benzyl group is treated by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole group of tributofan is not only deprotected by acid treatment in the presence of 1.2-ethanedithiol and 1,4-butanedithiol as described above. It is also removed by alkaline treatment with sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the material that should not be involved in the raw material and the protection of the protecting group and its base, the activation of the government that participates in the reaction, etc., can be selected from the group of ⁇ ⁇ ⁇ and the means of iiM.
  • an amide form of a protein for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -carboxyl group of carboxy 5 ⁇ amino acid, a peptide (protein) chain is extended to a desired chain length in the amino group ij. Thereafter, the protein having only the protecting group for the ⁇ -amino group of N of the peptide chain is removed, and the protein having only the protecting group for the carboxyl group of C is combined. ig match. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups can be retained by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. The crude protein can be purified using various purification stages, and the main component can be fiberized to obtain the amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, carboxy- ⁇ -carboxyl group of an amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then, as in the amide of a protein, a desired protein An ester form can be obtained.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced by a method for synthesizing the peptide itself, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or an amino acid which can constitute the partial peptide of the present invention is condensed with a moiety, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the desired peptide. I can do it.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described below.
  • the partial peptide of the present invention can be purified by a combination of conventional purification methods, for example, elution, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method can be converted into an appropriate salt by the method of or a method analogous to it, and conversely, ⁇ obtained by the salt can be converted by a known method or an analogous method
  • the DNA that encodes the protein of the present invention can be converted into a body or another salt by any method. Any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention can be used. Is also good. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA from abominable cells * fibre, cDNA library from sickle cells / Fiber, and synthetic DNA.
  • the vector to be used in the library may be any one such as a nocteriophage, a plasmid, a cosmid, and a phagemid.
  • amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • DNA encoding the protein of the present invention examples include, for example, (DNA containing the ⁇ ⁇ sequence represented by US column number: 9, and «S3 represented by column number: 9; S sequence and high stringency It has a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions, and has substantially the same activity as the protein of the present invention (eg, phosphodiesterase activity, more preferably phosphodiesterase V activity, more preferably represented by SEQ ID NO: 7).
  • DNA encoding a protein having an amino acid sequence phosphodiesterase activity, cGMP activity, etc. Any one may be used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the salt sequence represented by SEQ ID NO: 9 under high stringency conditions include, for example, the 5 'to 30 salt SSS sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 DNA having a homology of about 92% or more, preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more with a sequence represented by SEQ ID NO: 9 is used.
  • the 5 'to 30 salt SSS sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 DNA having a homology of about 92% or more, preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more with a sequence represented by SEQ ID NO: 9 is used.
  • Ibridization is performed by the method of itself or a method analogous thereto, for example, as described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be done according to the method. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to eight stringent conditions.
  • Highly stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70, preferably about 60 to 6 mM.
  • the condition at 5 is shown.
  • the sodium separation is about 19 mM and the sculpture is about 65.
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (first nucleotide in FIGS. 5 and 6). To the 249th base sequence).
  • DNA having the salt SSH sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the like is used as the DNA encoding the protein having the amino acid B sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA that contains the aforementioned partial peptide of the present invention: »sequence.
  • any of a genomic DNA, a genomic DNA library, a cDNA derived from an abused cell or fiber, a cDNA library derived from an abused cell or a fiber, or a synthetic DNA may be used.
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention examples include, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 which contains 30 nucleotides from the base sequence; DNA having a partial sequence of DNA having the following sequence: It has a ⁇ SS sequence that hybridizes under high stringent conditions with a partial ⁇ SS sequence of DNA, and has substantially the same activity as a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (specifically, phosphodiesterase) Encoding a protein having an activity, more preferably a phosphodiesterase V activity, and even more preferably a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (an abnormally occurring phosphodiesterase activity, cGMP activity, etc.). DNA that is used in the SH sequence is used. More effective is a DNA containing 5 ⁇ to 30; ⁇ sequences in the sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a DNA having a ⁇ SSH sequence represented by SEQ ID NO: '4.
  • Means include amplifying the partial ⁇ SB sequence of the protein of the present invention by PCR using a synthetic DNA primer that #T, or incorporating the DNA incorporated into an appropriate vector into a part of the protein of the present invention.
  • selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment encoding the entire region or labeled with a synthetic DNA.
  • Hybridization can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). In addition, it can be performed according to the method described in the instruction manual of ⁇ ffl, which is a commercially available library.
  • the DNA base sequence can be converted using a known kit, for example, MutantTM-G (Takara Shuzo Co., Ltd.), MutantTM-K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc.
  • MutantTM-G (Takara Shuzo Co., Ltd.)
  • MutantTM-K (Takara Shuzo Co., Ltd.)
  • the ⁇ 1 (1111 1 method or the like method of ⁇ 0 ⁇ itself) can be performed according to a method according to them.
  • the DNA encoding the cloned protein can be digested as it is or, if desired, digested with a restriction enzyme or activated by a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention is, for example, (a) encoding the protein of the present invention.
  • a target DNA fragment is cut out from DNA, and (mouth) the DNA fragment can be produced by ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pPDE51), a plasmid derived from E. coli (eg, UB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSHl9, pSHl 5)
  • pacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retroviruses, vaccinia viruses, virus, and culoviruses, ⁇ -11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcD NA Ino Neo is used.
  • bacteria use host transformants.
  • a vector a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR3
  • any promoter may be used as long as it is appropriate for the host used for the expression of the target.
  • the age at which animal cells are used as hosts can be enhanced by SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, etc.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter cytomegalovirus
  • the host is Escherichia, trp promoter, 1 ac promoter, recA promoter, APL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., and if the host is Bacillus, SPOL promoter, SP02 promoter
  • the host is a mother, such as the penP promoter, the PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • the polyhedrin promoter is preferred.
  • P10 promoter is preferred.
  • the expression vector may include, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly A3 ⁇ 43 signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter abbreviated as SV40 or May be used).
  • selectable markers include, for example, dihydrogen (hereinafter abbreviated as dhfr) [methotrexate (MTX) m, ampicillin resistant ffite ⁇ (hereinafter abbreviated as Amp 1 )
  • Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes referred to as Neo F , G4181H4) and the like.
  • a dh fr gene is used as a selection marker using Chinese hamster cells deficient in dh fr
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is applied to the terminal side of the protein of the present invention.
  • the age at which the host is Escherichia is Pho A. signal sequence, Omp A. signal sequence, etc.
  • the age at which the host is Bacillus is ⁇ -amylase 'signal sequence, subtilisin' signal sequence, etc.
  • the host is a 3 ⁇ 4J cell, such as MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.
  • insulin, signal sequence, interferon 'signa ⁇ II / SH line, antibody liver' signa ! / SB column can be used for fu.
  • the host for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • the host in order to industrially express the protein of the present invention in large amounts, it is preferable that the host be of the genus Escherichia.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli Kl 2 ⁇ DH1 [Procedures' ob 'the' National 'Academy' ob, Siensee's' ob 'the' u ' Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research], (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], JA221 [Journal] 'Ob' Molecular 'Bio mouth Jiichi (Journa)
  • Notchils include, for example, Notyls' subtilis (Bacillus subtilis) MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95 Vol. 87 (1984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisie e
  • H22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris KM71 and the like are used.
  • MM vesicles examples include the virus, Ac NPV, the age of the larvae derived from ⁇ (Spodopter frugiperda cell; Sf cells), the MG1 cell from the midgut of Trichoplusia ni,
  • Estigmena acrea-derived cells and the like are used.
  • the strain may be a silkworm-derived strain im (Bombyx mori N cell; BmN cell, etc.)
  • Sf cell examples include Sf9 cell (ATCC CRL1711) and Sf21 cell ( Above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • Insects include, for example, silkworm larvae [Maeda et al., Nature
  • Animal cells include, for example, cell COS-7, Vero, Chinese 8 Musu Yuichi cell
  • CHO hereinafter abbreviated as CHO cell
  • CHO (dh fr-) cell dh fr-deficient Chinese hamster cell CHO
  • mouse L cell mouse AtT-20
  • mouse smear cell rat GH3
  • human FL cells CHO cells
  • Transformation of cells or cells can be carried out according to the method described in, for example, Noo Technology (Bio / Technology), 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, by the method described in Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (Hidejun Shuyuki), Virology, 52, 456 (1973). It can be done according to the method.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant may be contained therein.
  • Nitrogen sources and others are included.
  • the carbon source include glucose, dextrin, and soluble sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium; ⁇ ,, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • male or organic substances and inorganic substances for example, calcium chloride, phosphoric acid: sodium iodide, magnesium chloride and the like can be used.
  • Yeast, vitamins, raw: 1-factor, etc. may be added.
  • the ⁇ of the medium is preferably about 5-8.
  • the culture medium for culturing the genus Escherichia includes, for example, glucose and casamino acids.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 t: for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and / or ⁇ can be added.
  • the host is of the genus Bacillus, usually about 30-40, and is carried out for about 6 to 24 hours, and aeration may be added if necessary.
  • a medium such as Nork folder
  • Burkholder Minimal media [Bostian. KL, et al., Procedurals of the National Academic Prob. , 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, G. et al.
  • the medium used is Grace's Insert Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)).
  • a mixture of a 10% chlorinated additive and the like is used. It is preferable to adjust the ⁇ ⁇ of the culture medium to 6.2 to 6.4.
  • the cultivation is usually about 27 and is performed for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and halving are added.
  • the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Seience, 122, 501 (1952)], D MEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association] 199, 519 (1967) )], And 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine], Vol. 73, 1 (1950). It is preferable that pH ⁇ H6 to 8. Sewing ⁇ 3 ⁇ 41 Regularly about 30 t: ⁇ 40 for about 15 to 60 hours, add ventilation and ⁇ ⁇ as needed.
  • the protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
  • the protein of the present invention is extracted from cultured cells or cells, after the culture, the cells or cells are collected, and the cells are collected and placed in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasonication, lysolysis, There is a method of obtaining protein effluent by centrifugation or filtration after destroying the body or fiber by / or etc.
  • Protein modification such as urinary guanidine in the buffer solution Or a surface activity such as Triton X-1 0 1 1 1 1 ⁇
  • the age at which proteins are secreted during cultivation may be in the form of ⁇ ⁇ itself after cultivation. Separate the cells from the supernatant and collect the supernatant.
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or effluent obtained in this manner can be carried out by appropriately combining the separation and purification methods of the autogenous ⁇ ].
  • the separation and purification methods of these ⁇ 0 are mainly based on the differences in the amount, such as methods utilizing the solubility of salts «» 3 ⁇ 4, dialysis, filtration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Utilization method method of using charge difference such as ion exchange chromatography, method of specific affinity such as affinity chromatography, hydrophobicity such as reversed phase high performance liquid chromatography
  • a method that uses the difference in isoelectric point such as a method that uses the difference in
  • the protein When the protein is obtained by using the protein thus obtained, it can be converted into a salt by the method of itself or a method analogous thereto, and conversely, by using the method of the protein obtained by salt or a method analogous thereto, «Can be converted to body or other salts.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by using an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity or activity of the protein or a salt thereof of the present invention can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • the antibody against the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention. Good.
  • an antibody against the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention (hereinafter, these proteins and the like are simply abbreviated as the protein of the present invention in the description of the antibody) is obtained by using the protein of the present invention as an antigen. It can be produced according to a method for producing an antibody or a shirt known per se.
  • the protein of the present invention is administered together with a substance itself or a carrier, ⁇ TOj, in which the antibody production is ⁇ T-capable by administration to a substance.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the dose is usually given once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 mg.
  • the substance to be used for example, monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens are used, but mice and rats are preferably used.
  • ⁇ or lymph nodes are collected 2 to 5 days after selection of a substance sensitized with i3 ⁇ 4g, for example, an individual having an antibody titer from the mouse, and contained in them.
  • a substance sensitized with i3 ⁇ 4g for example, an individual having an antibody titer from the mouse, and contained in them.
  • monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the antibody titer in the serum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the clear, and then measuring the activity of the transcription bound to the antibody.
  • Fusion operation ⁇ io method for example, This can be done according to the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG) or Sendai virus can be used, but PEG is preferably used.
  • M ffl cell for example, a bone of a warm JlS) substance such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, or AP-1 can be used, but P3U1 cell is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells used and the number of osteoblasts is ⁇ : ⁇ ⁇ 2 ⁇ : iag, PEG (preferably PEG1000-PEG6000) is added at a ratio of 10-80, and 20-40: preferably Incubate at 30 to 37 for 1 to 10 minutes to improve the efficiency.
  • Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-produced ⁇ / and hybridomas. For example, adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, microplate) on which the protein is adsorbed directly or together with a carrier is used.
  • a solid phase eg, microplate
  • a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-sensitive globulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme are mouse or anti-mouse ⁇ 3 ⁇ 4 globulin antibodies
  • the method of detecting the variance can be considered.
  • the monoclonal antibody can be prepared by itself or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in an animal medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • R-1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% of bovine 3 ⁇ 401, GIT medium containing 1 to 10% of bovine 3 ⁇ 4fil (Wase Pharmaceutical Co., Ltd.) or Ibridoma A culture-free medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture is usually 20 to 40, preferably about 37.
  • the culture period is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant is It can be measured in the same manner as in the measurement of the antibody titer.
  • Monoclonal antibody separation and purification can be performed by the method of itself ⁇ ], for example, for the production of globulin (eg, m. Method, ultrafiltration, gel filtration, specific purification using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein or protein G to collect the antibody and dissociate the bond to obtain the antibody. Can be obtained.
  • globulin eg, m. Method, ultrafiltration, gel filtration, specific purification using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein or protein G to collect the antibody and dissociate the bond to obtain the antibody.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • mora protein itself or a complex thereof with a carrier protein may be formed and immunized with a substance in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are determined by cross-linking the carrier into eight octenes.
  • Any antibody can be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently prepared.
  • serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. can be used in a weight ratio of 1 to hapten.
  • a method of pulling force at a rate of about 0.1 to 20 and preferably 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to itself or together with a carrier or a sickle so that antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to: L 0 times.
  • the polyclonal antibody can be collected preferably from blood, ascites, or the like of the medulla obtained by the above method.
  • polyclonal antibody titer during purification can be performed in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer during purification.
  • Polyclonal antibodies can be produced according to the same immunoglobulin separation and purification method as in the monoclonal antibody production described above.
  • DNA of the present invention has a base sequence complementary to or substantially complementary to DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs are abbreviated as DNA of the present invention in the description of antisense DNA).
  • the antisense DNA any antisense DNA having a ⁇ SH sequence that is complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention and that has an action capable of suppressing the expression of the DNA is used. It may be DNA.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, a total salt SSB sequence or a partial ⁇ SB sequence of the salt SSB sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complement I of the DNA of the present invention). About 92% or more, preferably about 95% or more, and more preferably about 98. In particular, of the entire complementary strand of the DNA of the present invention; ⁇ SS sequence, the portion encoding the N of the protein of the present invention: the complementary sequence of the ⁇ SSS sequence (eg, salt SS2 sequence near the start codon).
  • An antisense DNA having a homology of about 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably about 95% or more. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • a protein, a partial peptide or a salt thereof of the present invention hereinafter abbreviated as a protein of the present invention
  • a DNA encoding the protein or a partial peptide of the present invention hereinafter abbreviated as a DNA of the present invention
  • the use of antibodies against the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention hereinafter, abbreviated as the antibody of the present invention
  • antisense DNA will be described.
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing various diseases caused by phosphodiesterase V.
  • a medicament such as an agent for treating or preventing various diseases caused by phosphodiesterase V.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA may be used alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adenovirus associated virus vector. After that, it can be administered to a human or a substance according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with a carrier recognized in the physiology, such as an auxiliary agent for promoting uptake, and can be administered through a catheter such as a delivery gel or a hydrogel catheter.
  • proteins of the present invention are, for example, sugar-coated according to '
  • the protein of the present invention is mixed with a physiologically acceptable carrier, miformant, vehicle, preservative, stabilizing agent, agent, etc. in the form of a single shelf required for carrying out the above-identified process. You can do it by doing.
  • the amounts of the components in these formulas (1) and (2) are such that an appropriate capacity within the specified range can be obtained.
  • a suitable bulking agent, a lubricant such as magnesium stearate, 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 such as sucrose, lactose or saccharin, an incense box such as peppermint oil, cocoa oil or cellulose are used.
  • the unit dosage form is forcepsel
  • the above type of material may further contain a carrier such as fat or oil.
  • Sterile compositions for injection include active substances in vehicles such as water for injection and natural substances such as sesame oil, coconut oil and the like. It can be formulated in accordance with normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the produced vegetable oil.
  • Grape and other isotonic solutions containing adjuvants eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • suitable dissolution aids eg, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, For example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic 14 surfactants (eg, Polysorbate 80TM, HCO-50, etc.)
  • suitable dissolution aids eg, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, For example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic 14 surfactants (eg, Polysorbate 80TM, HCO-50, etc.)
  • oily liquid for example, sesame oil, oil, or the like may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a leakage aid.
  • relaxation for example, phosphate buffer, sodium buffer, etc.
  • freezing agent for example, benzalkonium chloride, difficult-to-produce, etc.
  • stabilizer for example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Hohe J eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidant antioxidant and the like.
  • the prepared solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the vector containing the DNA of the present invention is also categorized in the same manner as described above, and is usually made parenterally.
  • transversions obtained in this way are safe and one-sex, for example, in humans or afilfl (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, birds, higgies, bushus, dogs, dogs, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • afilfl eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, birds, higgies, bushus, dogs, dogs, cats, Dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the protein of the present invention may vary depending on ⁇ disease, administration ⁇ , administration route, and the like.
  • “For adults (as 60 kg) About 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • a single dose of the protein is administered.
  • the amount may vary depending on the dose of the drug, such as the dose of the drug, but it may be, for example, that when the drug is administered to an adult (assuming a body weight of 60 kg) in the form of a drug, the protein may be used in an amount of about 0.01 to 1 per day.
  • Function of the protein of the present invention e.g., phosphodiesterase activity, more preferably phosphoesterase V activity, more preferably phosphodiesterase activity having a protein characteristic that has an amino acid ⁇ H sequence represented by SEQ ID NO: 7).
  • Compounds or salts thereof that inhibit GMP activity include, but are not limited to, vascular disorders, (effort and cheapness!
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound that promotes or inhibits the function of the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the function of the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof for example, phosphodiesterase activity, more preferably phosphodiesterase V activity, Preferably, a compound which promotes phosphodiesterase activity, cGMP activity and the like which the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 specifically has, or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as 3 ⁇ 4agent), or Function of the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof (for example, a phosphodiesterase activity, more preferably a phosphodiesterase V activity, more preferably a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 Phosphodiesterase activity, c G
  • the present invention provides a screening method for compounds that inhibit TMP (such as MP activity) (hereinafter sometimes abbreviated as “inversion”).
  • the limb may contain, for example, the (i) phosphodiesterase activity, more preferably the phosphodiesterase V activity, more preferably the sequence of the protein of the present invention at the ages (i) and (U).
  • the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by the number 7 is determined by comparing the protein roosting (phosphodiesterase activity, cGMP activity, etc.).
  • Any substrate can be used as long as it can serve as a substrate for the protein of the present invention.
  • conjugation product examples include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermented products, cell extracts, plant fiber extracts, animal fiber extracts, and the like. Or a compound of the formula: c GMP is preferably used.
  • the protein of the present invention is suspended in a buffer suitable for screening to prepare the protein preparation of the present invention.
  • a buffer suitable for screening to prepare the protein preparation of the present invention In the buffer
  • PH about 4 to: A buffer that does not inhibit the reaction between the protein of the present invention and the substrate, such as a phosphate buffer of L 0 (preferably, pH of about 6 to 8) and a buffer of Tris-HCl. Either is acceptable.
  • a buffer that does not inhibit the reaction between the protein of the present invention and the substrate such as a phosphate buffer of L 0 (preferably, pH of about 6 to 8) and a buffer of Tris-HCl. Either is acceptable.
  • the reaction temperature may be any value within the range of 10 to 50 (preferably 25 to 37).
  • the protein of the present invention is 0.1 t gZml to 50 gZml (preferably 1 g / m1 to
  • Activity of the protein of the present invention for example, phosphodiesterase activity, more preferably phosphodiesterase V activity, and still more preferably, phosphodiesterase activity specific to a protein having the amino sequence represented by SEQ ID NO: 7; cGMP Activity
  • phosphodiesterase activity for example, phosphodiesterase activity, more preferably phosphodiesterase V activity, and still more preferably, phosphodiesterase activity specific to a protein having the amino sequence represented by SEQ ID NO: 7; cGMP Activity
  • a test compound which increases the phosphodiesterase activity or the like in the case of the above (ii) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (i), according to the present invention is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (i).
  • Compounds that inhibit 1% or more can be selected as compounds that inhibit the activity of the protein of the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the protein of the present invention its partial peptide or a salt thereof
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermented products, cell extracts, It is a compound selected from plant extracts, animal extracts, and the like, and is a compound that inhibits the function of the protein of the present invention on the thigh or the #T.
  • the salt of the compound the same salt as that of the famousd protein of the present invention is used.
  • Function of the protein of the present invention eg, phosphodiesterase activity, more preferably phosphoesterase V activity, more preferably phosphodiesterase activity, cGMP in the protein mosquito having the amino g3 ⁇ 4B sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • Compounds or salts thereof that inhibit the activity include, but are not limited to, cardiovascular diseases (exercise and anxiety (coronary narrowing 'L' and 'dysmorphic narrowing' L ⁇ ), hypertension, congestive, whole, lung height) ioffi disease, atherosclerosis, pulse sclerosis, vascular patency, blood stenosis, peripheral vascular disease, stroke, etc., obstruction «disease (chronic asthma, bronchitis, etc.), allergic disease (allergic breath, allergic Rhinitis, hives, etc.) Etc.), glomerular disease, tubulointerstitial m, renal failure, diabet
  • the preparations obtained in this way are (g3 ⁇ 4) soluble in, for example, humans or objects (eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, porcines, puppies, birds, cats, dogs, monkeys, etc.). Etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, disease, administration, administration dose, and the like. For example, it inhibits the function of the protein of the present invention for the purpose of treating cardiovascular diseases.
  • the compound When the compound is administered orally, it is generally recommended that adults (assuming a body weight of 60 kg)
  • the compound is administered in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably 1.0 to 5 Omg, more preferably 0 to 20 mg.
  • the age at which the compound is parenterally administered depends on the dose of the compound, the disease, and the like.
  • a compound that inhibits the function of the protein of the present invention for the purpose of treating cardiovascular diseases may be used.
  • the compound may be administered in a daily dose of about 0.01 to 30 mg, preferably 0.1 to 2 OmgfiS, more preferably ⁇ . 3 ⁇ 40.1 ⁇ : LO It is convenient to administer it. For other animals it is also possible to administer doses per 60 kg.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter, abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention, so that the amount of the protein of the present invention in the test wave can be determined. In particular, it can be used for quantification by the sandwich measurement method.
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test wave.
  • one of the antibodies may be an antibody that recognizes the ⁇ end of the protein of the present invention, and the other antibody may be an antibody that reacts with the c end of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter referred to as “the monoclonal antibody of the present invention has an age of 3 ⁇ 4 ⁇ ”). Can also be detected.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (al3 ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, ⁇ , or antibody-antibody corresponding to the amount (eg, protein *) in the scythe Any of the Yodo methods may be used as long as the amount of the original complex is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing the amount of ⁇ 3 ⁇ 4. For example, it is used for the nephelometry, the competitive method, the immunometric method and the sandwich method. However, it is preferable in terms of sensitivity and specificity to use the sandwich method.
  • ⁇ used in the measurement method using a substance
  • a metabolic enzyme for example, mm, mm ⁇ substance, etc.
  • the thigh of the! ⁇ Containing for example, c 1 2 5 1], 3 1 1], [3 H], C 1 4 C] and the like.
  • a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 3-galactosidase, 3-darcosidase, alkaline phosphatase, passoxidase, linco WzK enzyme and the like are used.
  • fluorescamine, fluorescein isothiosinate, etc. are used as fireflies
  • 3 ⁇ 43 ⁇ 4 As the #J substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ to the target.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass and the like.
  • an insolubilized monoclonal antibody of the present invention is reacted with a 3 ⁇ 4 ⁇ solution (primary reaction), and is further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • the amount of the protein of the present invention in the test wave can be quantified by measuring the meaningful activity on the insolubilized carrier.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the method of solubilization can be the same as that of No.3.
  • the antibody used for the solid phase or the antibody used as the target antibody does not need to be one type, and two or more types of antibodies may be used for the purpose of improving the measurement sensitivity. Mixtures may be used.
  • the primary reaction and the secondary reaction The monoclonal antibody of the present invention used in the reaction is preferably an anti-protein which binds to the protein of the present invention but differs. That is, and the antibody used in the secondary reaction is, for example, 2; ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ? Is the age at which the C-terminal part of the protein of the present invention is recognized, and the antibody used in the primary anti-iS is preferably C » 3 ⁇ 4n, for example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a sandwich jew measurement system, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • the competition method after the i3 ⁇ 4i in the serum and the labeled 3 ⁇ 4 are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted ⁇ W m, (F) is compared with the antibody and the source (B) supplied. Separate (measure either B / F component, B or F, and quantitate the amount in solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody, BZF separation is performed using polyethylene glycol, A liquid phase method using a second antibody or the like, and a solid phase using a solid phase antibody as the first antibody, or a solid phase antibody using a soluble antibody and using a solid phase antibody as the second antibody Chemical formula is used.
  • the solid phase and the liquid phase are separated by competing 3 ⁇ 4 in the liquid and the solid phase il ⁇ for a certain amount of the labeled substance, or the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label is measured to determine the amount of ⁇ ; source in the test wave, and in nephrometry, the amount of insoluble lectures produced as a result of the antibody reaction is measured in the gel or in the neckline.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to the usual conditions and operations in each method. For details of these general methods, refer to reviews and summaries.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention in a test subject such as a pendant.
  • preparation of an antibody ram used for purifying the protein of the present invention detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, and analysis of the behavior of the protein of the present invention in the test cells And so on.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, by using a human or ⁇ Ifoft (for example, abnormalities in DNA or ttmRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide in rats, mice, guinea pigs, guinea pigs, birds, sheep, bush, pears, pomas, cats, dogs, monkeys, etc.) Since the DNA or mRNA can be detected, it is useful as a diagnostic agent for, for example, damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increase or increase of the DNA or mRNA.
  • a human or ⁇ Ifoft For example, abnormalities in DNA or ttmRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide in rats, mice, guinea pigs, guinea pigs, birds, sheep, bush, pears, pomas, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the above-mentioned humidification using the DNA of the present invention includes, for example, Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989). Years), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , Pp. 276-277 (p. 1989)).
  • the age at which the mRNA is produced by Northern hybridization is, for example, a circulatory disease, (exercise and anxiety), pancreatic narrowness and atypical narrowness, high altitude. , Depressive 'L whole, pulmonary alopecia, atherosclerosis, vascular patency, blood vessel stenosis, vascular disease, stroke, etc., obstruction ttM spring, (chronic asthma, qi, etc.) Rugie disease (allergic asthma, allergic inflammation, urticaria, etc.), diseases characterized by digestive tract recall (hypersensitivity ⁇ , etc.), glomerular disease, tubular interstitial disease, renal failure, diabetes mellitus, It can be associated with glaucoma, erectile dysfunction in mammals, including humans, Mi dysfunction in female mammals, including humans, premature birth, and dysmenorrhea.
  • glaucoma erectile dysfunction in mammals, including humans, Mi dysfunction in female mammals, including humans, premature birth, and dysmenorrhea.
  • An antisense DNA that complementarily binds to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA can suppress the function of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in a living body.
  • Circulatory disease exercise and low (coronary vasospasm ' ⁇ ⁇ and dysmorphic narrow', high ⁇ , depressed '!
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. You can follow the means.
  • the antisense DNA can be administered as it is, or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and then administered through a catheter such as a delta-delta hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as an oligonucleotide probe for ⁇ to examine the expression of the DNA of the present invention in cells and the expression thereof.
  • the present invention relates to a DNA encoding an exogenous protein of the present invention (hereinafter referred to as the present invention).
  • Non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA (hereinafter referred to as D of the present invention)
  • the NA-transferred animal is preferably used for embryos, non-human mammals at the stage of embryo development (more preferably, single cells or fertilized cells), for non-egg, eggs, eaves, and cells containing their progenitor cells.
  • the desired DNA is transferred by the calcium phosphate method, pulse method, lipofection method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. be able to.
  • the * ttDNA outside the present invention which is intended for somatic cells, living cells, cells, etc., can be transferred and used for cell culture, ffl ⁇ m culture, etc.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing cells with ⁇ ! Cells by the cell fusion method of itself.
  • rodents and biological cycles are particularly short in terms of oncogenesis and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems.
  • rodents particularly mice, which are easy to breed (for example, C57B LZ6 strain, DBA2 B6C3F1 system, BDF1 system, B6D2F1 system, BAL BZc system, ICR system, etc.) or rat (for example, Wistar, SD, etc.) are preferred.
  • Examples of the "nature" in the expression vector that can be expressed in the milk U human include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention that has been extracted from a mammal.
  • mutant DNA of the present invention those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, the working or deletion of a donkey, DNA or the like in which substitution has occurred is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention is derived from mammals of the same or different species as the target animal. It may be something.
  • the DNA is used as a DNA construct downstream of a promoter capable of expressing the DNA in animal cells.
  • the human DNA of the present invention is transferred and has homology thereto.
  • DNA constructs obtained by adding human DNA of the present invention downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention into fertilized eggs of mammalian cells, eg, mouse fertilized eggs
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as phage ⁇ , a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus, and a baculovirus.
  • Animal viruses such as viruses are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, and a plasmid derived from male mother are preferably used.
  • promoters that regulate the expression of DN ⁇ ⁇ include: (1) DNA derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus,? U virus, poliovirus, etc.) Promoters, promoters derived from (2) species of mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hams, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, ⁇ oplackin II, eras Ze, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial dysfunction ttM protein, glutathione S—transferase, platelet-derived growth factor; 3, keratins Kl, K10 and K14, collagen I and Type II, cyclic AMP-dependent protein kinase i3 I subunit, dystrophy , Liquor-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium ij urinary factor
  • the cytomegalovirus promoter which can be expressed at high levels throughout the body, the promoter for human polypeptide chain elongation factor 1a (EF-1 ⁇ ), the human and chicken 3 actin promoters, etc. Suitable for children.
  • EF-1 ⁇ human polypeptide chain elongation factor 1a
  • the vector has a sequence that transcribes a messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (referred to as a soybean mineral).
  • a DNA-transferred mammal referred to as a soybean mineral.
  • the sequence of each DNA derived from a animal can be used, and preferably, the SV 40 virus mineta of Simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DN ⁇ , enhancer region, intron of eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or the translation region for the purpose of further expressing the target exogenous DNA. It is also possible for the purpose to connect 3 'downstream of the above.
  • the normal translation region of the protein of the present invention includes liver, kidney, thyroid ffl vesicle, ⁇ 1 ⁇ 3 derived from humans or various mammals (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • Complementary D prepared in whole or in part from vesicle-derived DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or from liver, kidney, thyroid MB vesicles, and estrogen-derived RNA NA can be obtained as a raw material.
  • the extraordinarily extracted DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above cells or ⁇ by the spontaneous mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated to the downstream of a promoter of an aversion and optionally to the upstream of a transcription termination site.
  • * 1 ⁇ 2DNA transfer at the egg cell stage is dependent on ⁇ is reserved for all of the lateral cells.
  • the presence of the foreign DNA of the present invention in the animal of DNA translocation indicates that all the progeny of the animal producing the animal carry the foreign NA of the present invention in all of its J ⁇ 3 cells and vesicles. .
  • the progeny of this type of animal that has inherited the extra-fet DNA of the present invention will have the extra-DNA of the present invention in all of its cells and cells.
  • the non-human mammal to which the extracellular DNA of the present invention has been transferred can be expressed as follows:
  • the transfer of the outer DNA of the present invention at the egg cell stage is ensured so that all of the cells and somatic cells of the non-human mammal can be transformed.
  • the ET of DNA of the present invention means that the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of its cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention will awaken the exogenous DNA of the present invention in all of its ira vesicles and somatic cells.
  • the non-human mammal that expresses normal DNA expresses the normal DNA of the present invention, and the function of the protein of the present invention is experimentally determined by immobilizing the function of endogenous normal DNA.
  • the function of the protein of the present invention or the protein of the present invention can be used. It is Rikikawa Nori to elucidate the diseases of related diseases and to examine treatment methods for these diseases.
  • the mammal to which 53 ⁇ 4E normal DNA has been transferred in addition to the present invention has an increased symptom of the protein of the present invention on the thigh, screening for a therapeutic drug for diseases related to the protein of the present invention! Also available for hire.
  • the non-human mammalian Lfl product having the extraordinary DNA of the present invention can be transfected by ordinary breeding as the DNA-bearing animal by converting the extracellular DNA into a non-human Lfl product.
  • the desired foreign DNA can be incorporated into the above-described plasmid and used as a source material.
  • the DNA construct with the promoter can be compiled by ordinary DNA engineering techniques.
  • Metastasis of the abnormal DNA of the present invention at the egg cell stage can be carried out using It is ensured that it is present in all of the Li germ embryos a and m.
  • the abnormal DNA of the present invention in the E ⁇ ffl vesicles of the transgenic animal after the transfer of the DNA means that the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its JE cells and cells, and homozygote having the introduced DN in both homologous chromosomes.
  • the non-human mammal Ll product containing the abnormal DNA of the present invention has been expressed by the abnormal DNA of the present invention, and by inhibiting the function of endogenous normal DNA, the protein of the present invention is formed.
  • the function ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4g may be refractory and can be used as a model animal for the disease.
  • the function of the protein of the present invention can be elucidated and the method for treating this disease can be studied.
  • the abnormal DN ⁇ high-expressing animal of the present invention is characterized by the function inactivation of the protein of the present invention and the function of normal protein by the abnormal protein of the present invention in refractory disease. It is a model to elucidate the inhibition (dominant negative effect).
  • the non-human animal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred exhibits the above-mentioned increased symptoms of the protein of the present invention
  • screening of the function of the protein of the present invention for refractory disease is performed. It can also be used for fiber.
  • the above two kinds of DN ⁇ metastatic animals of the present invention may be used as other germ I ⁇ , for example, as a cell source for CM ⁇ cultivation,
  • the cells of DNA are cultivated by standard cultivation techniques, and these cells are ffled, and the function of the cells is difficult to achieve.
  • Examples include production of the mutant protein of the invention and production of its antibody.
  • the DNA-transferred animal of the present invention it is possible to examine clinical symptoms of a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. More detailed pathological glue findings were obtained in each of the disease models related to the Ming Dynasty protein, development of new treatments, and even the disease! To contribute to the occupation and treatment of medical diseases.
  • each of the DNA-transferred animals of the present invention is taken out, cut into small pieces, and then obtained with a protein such as trypsin to obtain DNA-transferred cells, culturing the cells, or systematizing the cells. It is possible to do it.
  • the protein of the present invention can be identified, apoptosis, its relationship with differentiation or proliferation, or its signal iSH structure can be examined, and its abnormalities can be examined. It is an effective resource for elucidating the function.
  • DNA-transferred animal of the present invention in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including the T-cell refractory function of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, the method and the quantification method described above. By using such methods, it becomes possible to provide a screening method for treating the disease and the disease.
  • DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous I4DNA expression vector of the present invention DNA therapeutic methods for diseases associated with the protein of the present invention can be studied and developed.
  • the present invention relates to a DNA-enhanced non-human mammalian embryonic stem cell of the present invention and a DN of the present invention.
  • the DNA is transformed into ⁇ S by introducing a reporter feT (e.g., a galactosidase residue ⁇ from bacterium), and the reporter residue is promoted under the control of the promoter for DNA of the present invention.
  • a reporter feT e.g., a galactosidase residue ⁇ from bacterium
  • the non-human mammal LSI product according to (6) which can be expressed;
  • the non-human mammalian embryonic stem cells transformed with the DNA of the present invention are referred to as DNAs of the present invention which are non-human mammals capable of artificially mutating DNA to suppress the expression ability of DNA.
  • DNAs of the present invention which are non-human mammals capable of artificially mutating DNA to suppress the expression ability of DNA.
  • the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells).
  • Examples of a method for artificially mutating the DNA of the present invention include, for example, deleting some or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by the d) method. be able to. These mutations may be used to produce the knockout DNA of the present invention, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of promoter or exon.
  • DNA-modified non-human mammalian L-embryonic stem cells of the present invention include, for example, The DNA of the present invention, which is a target non-human mammal, is isolated, and its exon portion is a drug resistance tt3 ⁇ 4 gene represented by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or 1 ac Z (/ 3- DNA sequence that destroys exon function by inserting galactosidase remnant ⁇ ), cat (repo allele representative of chloramphenico-l-acetyltransferase, etc.) or causes transcription of the exon in the intron part between exons (For example, a poly A addition signal) to prevent the synthesis of complete messenger RNA, resulting in the disruption of the genetic f A DNA strand having an NA sequence (hereinafter abbreviated as targeting vector
  • the DNA sequence on the evening getter vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the evening getter vector were analyzed by PCR using primers as primers. It can be obtained by evading the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is transformed by homology for example, those already established as described above may be used, or the method described in the known method of Evans and Kaufma may be used. A newly established one may be used.
  • mouse ES cells currently 129 ES cells are generally fluffed, but since the hullological background is not clear, it is a pure line alternative to this, and it is genetically inherited.
  • C57BLZ6 mice or BDF1 mice C1BLZ6 and DBAZ2 F1
  • Those established by using can also be used favorably.
  • BDF 1 mice have the advantage of high egg collection and robust eggs. Since C57BL / 6 mice are used as background, the ES cells obtained using these cells can be used to create a pathological model mouse. The BLZ 6 mouse can be used advantageously in terms of power.
  • any ES cell of fiber may be used, but the ES cell of the pass-key is more convenient for creating a live suspension chimera. It is also advisable to discriminate between males and females as soon as possible in order to eliminate complicated culture.
  • a method for judging the ES cell fiber a method of amplifying and detecting a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be cited as an example.
  • k About 10 ° cells were required for translational analysis, whereas about 1 colony of ES cells (about 50) was sufficient.
  • the primary selection of ES cells in the I-stage is performed by discrimination of fiber, which is a powerful feature. By enabling the selection of cells, the labor required in the initial stage of culture can be greatly reduced.
  • the first selection can be performed by, for example, confirming staining by a G-banding method.
  • the resulting ES cell staining ⁇ 3 ⁇ 4 is preferably 100% of the normal number.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but since they tend to lose their ontogenetic potential, it is best to subculture them.
  • a suitable feeder cell such as sTom in the presence of LIF (1-10000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% Culture at about 37 with carbon dioxide gas, 90% air, etc.
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, preferably 0.1% Bird Ribsin Z (lmM EDTA) treatment to form a gelatinoblast and inoculate it on a freshly prepared feeder cell.
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, the cells are cultivated. If morphologically abnormal cells are found, the cells may be regrown.
  • ES cells can be divided into various types of cells, such as parietal, visceral and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until they form clumps, under appropriate conditions.
  • CM J. Evans and ⁇ LR Kaufman Nature, 292, 154, 1981; GR Mart in Proceedings .Ob'National 'Academy'Ob' Science ' USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) Vol. 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Ob. 1985]
  • the DNA-expressing non-ffl cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful for in vitro cell production of the protein of the present invention in vitro.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • the non-human mammal the same non-human mammal is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be prepared, for example, by introducing the evening-targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the DNA of the present invention as one of the targeting vectors.
  • a cell in which the DNA of the present invention has been knocked out is a DNA sequence of the DNA of the present invention or a DNA sequence on or in the vicinity thereof, which is used as a probe, and a DNA sequence on Southern blot analysis or evening gettering vector.
  • This can be determined by a PCR method using a DNA sequence in the vicinity of the DNA of the present invention derived from the mouse used in the evening getter vector as a primer.
  • the age at which non-human mammalian embryonic stem cells are used depends on the homogeneity of the DNA.
  • the activated ⁇ strain is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of a non-human embryo or a non-human B ⁇ J ⁇ offspring pseudo-pregnantly derived from the obtained chimeric embryo. Move to the palace.
  • Animal created tt! E This is a chimeric animal composed of both cells having the DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all of the chimeric animals are artificially mutated as compared to those obtained by three times the chimera and normal.
  • An individual composed of cells having the added DNA locus of the present invention can be obtained by, for example, determining the color of the animal.
  • the individuals thus obtained usually have no heterologous expression of the protein of the present invention, and the heterozygous expression of the protein of the present invention is 3%.
  • an individual lacking the homo-expression of the protein of the present invention can be obtained.
  • the age at which the egg cell is turned over is determined, for example, by obtaining a transgenic non-human mammal in which the targeting vector has been introduced into the chromosome by axing the DNA solution into the nucleus of the egg by microinjection.
  • these transgenic non-human LI products they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous homologation.
  • the shelves obtained by the crossing are confirmed to be knocked out of the DNA, and then subcultured in normal breeding ⁇ . I can.
  • the acquisition of the raw group and ⁇ may be carried out in accordance with ordinary methods. That is, by breeding the animal of the fiber that retains the modified NA, a homozygote having the modified DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygote animal can be efficiently obtained by keeping one homozygote and one homozygote with respect to the animal. The homozygous and heterozygous animals having the TO-ligated DNA are bred by dividing the sex of the heterozygous animal by 3-5.
  • the DNA-activated non-human mammalian U stem cells of the present invention are very useful for producing the non-human mammalian U cells deficient in DNA expression of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, and thus is caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention.
  • This model is useful for investigating the cause of these pavements and examining therapies.
  • the age based on the abbreviation of amino acids such as assimilation amino acids, the abbreviation by IUPAC-I UB Commision on Biochemical Nomenclature, or the abbreviation commonly used in the relevant field is used.
  • Tr p Tribute fan
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • amino acid sequence of the human lung-derived phosphodiesterase V of the present invention represented by SEQ ID NO: 7 is substantially the same as that of SEQ ID NO: 7.
  • Example 1 shows a sequence of a synthetic primer used in the cloning of DNA encoding human lung phosphodiesterase V of the present invention in Example 1 of ⁇ .
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of phosphodiesterase V derived from human lung of the present invention.
  • SH ⁇ iJ number Indicates the J ⁇ SB sequence of the DNA encoding the amino ⁇ H sequence represented by 7.
  • SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid ⁇ B sequence.
  • Escherichia coli BL21 / PPDE51 obtained in Example 2 of ⁇ has been deposited on July 13, 1998 with the Ministry of International Trade and Industry: Ministry of Internal Affairs and Communications: Itsul ⁇ ⁇ Jf3 ⁇ 4m (NIBH) under accession number FERM BP— It was deposited on June 18, 1998 by Tiki, Ritsumeikan Foundation ⁇ m (IFO) with the deposit number IFO l6l85 as T.6417.
  • NIBH Ministry of International Trade and Industry
  • FERM BP It was deposited on June 18, 1998 by Tiki, Ritsumeikan Foundation ⁇ m (IFO) with the deposit number IFO l6l85 as T.6417.
  • Plasmid PDE 50 carrying DNA encoding human phosphodiesterase V derived from human lung of the present invention is introduced into bacteria (Escherichia coli) DH10B by the method of ⁇ ], and the transformant is transformed into a bacterial body: ⁇ bacteria (Escherichia col i) DH 10 BZp PDE 50 was obtained. 2 Construction of expression vector for bacteria
  • the cDNA encoding the phosphodiesterase V derived from human lung of the present invention was digested with EcoRI and XhoI, and ligated with pGEX4T-2 (Pharmacia) treated in the same manner.
  • E. coli (Escherichia coli) BL21 / pPDE51 expressing the human lung-derived phosphodiesterase V of the present invention was obtained by transforming BL21 (Funakoshi tt) using the Ligation solution.
  • the phosphodiesterase V of the present invention derived from the human lung, was obtained using the bacteria BL 21 / PPDE51 obtained in Male Example 2. Expression and purification in E. coli were performed according to the protocol attached to GST Gene Fusion System (Pharmacia 3 ⁇ 4t). as a result, About 1 OOkDa of the desired recombinant human lung phosphodiesterase was obtained in an amount of 12.5 mg from 1 L of Escherichia coli culture.
  • Example 4 Detection of phosphodiesterase activity of human lung phosphodiesterase V
  • sildenafil Drugs of Future, 22 (2), 1997), which is an inhibitor of phosphodiesterase V
  • sildenafil reduces the enzyme reaction to about 2 nM. Inhibited by 50%. From this, it was confirmed that the search for phosphodiesterase inhibitors was of T ability using this Atsushi system.
  • Example 6 6S Using the method set in Example 5, a search was made for a recombinant human lung-derived phosphodiesterase inhibitor. As a result, various compounds exhibited inhibitory activity. Examples of the " ⁇ " include compounds having a structure represented by the following chemical formula 1. The compound inhibited this enzyme reaction by 50% by 2.29 ⁇ .
  • the protein of the present invention is preferably a protein having the activity of the protein of the present invention (specifically, a phosphodiesterase activity, more preferably a phosphodiesterase V activity, and still more preferably, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7). It is useful as a reagent for screening compounds or salts thereof that promote or inhibit phosphodiesterase activity). Furthermore, since the antibody against the protein of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution.

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Description

明 細 書 新規タンパク質およびその DN A 蘭分野
本発明は、 ホスホジエステラーゼ活性などを示す新規タンパク質 （新規ヒトホスホジエス テラーゼ V) およびその DNAなどに関する。 背景腿
ホスホジエステラーゼ〖細胞内シグナル 15¾物質であるサイクリックアデノシン 3 '、 5 ' —一リン酸 ( c AMP) およびサイクリックグアノシン 3 ' 、 5 ' —一リン酸 (c GMP ) を力 tl水^^する酵素であり、 種々の細胞における機能発現の調節に関与している。 ホスホ ジエステラーゼには現在、 7種のアイソザィムが知られており、 このうち、 タイプ Vは c G MPに特異的に作用する酵素である。
c GMPは平滑筋の ¾ 、 平滑 β胞の増殖阻害、 血球の内 細胞への粘着阻害、 血/ ϋ «阻害などに関与しており、 そのレベルを制御するホスホジエステラーゼ Vの研究は近年 ますます盛んになりつつある。 しかし、 ヒト型ホスホジエステラーゼ VDNAに関する報告 はヒト由来のホスホジエステラーゼ （小寺ら、 生化学、 6 9 , 6 3 7 ( 1 9 9 7 ) ) がある のみである。 発明の開示
c GMPに特異的に作用する酵素であるホスホジエステラーゼ Vの新規なヒト型タンパク質 、 該タンパク質に対する抗体、 該タンパク質を用いた阻害薬などのスクリーニング方法など 力見出されれば、 ホスホジエステラーゼ Vに起因する種々の疾患 （例えば、 循環器系疾患 ( 労作性および安 （冠攣縮性狭 および異形狭 ） 、 高舰、 うつ血性' W全 、 肺高 ifiiffi症、 ァテローム 脈硬化症、 血管開存性低下症、 血 窄、 末梢血管疾患、 脳 卒中など） 、 閉塞 Wi疾患 （lift喘息、 気管支炎など） 、 アレルギー tt^患 （アレルギー性 喘息、 アレルギー性鼻炎、 じんましんなど） 、 消 ίビ の «I性に特微づけられる疾患 （過敏 ttli^丽など） 、 糸球滅患、 删管間質 患、 腎不全、 糖尿病合併症、 緑内障、 ヒト を含むォスの哺乳 物の勃起機能不全、 ヒトを含むメスの哺 MJ物の,機能不全、 早産 、 月経困難など） の予防や治療に役立つ新たな医薬品の開発力河能となる。
また、 ホスホジエステラーゼ IVを除いては、 大腸菌を用いて、 ホスホジエステラーゼの 発現に β ^力した例は知られておらず、 本発明は;^菌を用いて、 ホスホジエステラーゼ Vの 発現に したものであるので、 本発明はホスホジエステラーゼ Vの工業的 をも可能た らしめるものである。
本発明者らは、 上記の を解決するために貌意¼¾を重ねた結果、 ヒト肺由来の cDN Aライブラリ一から、 新規な;^ S配列を有する c D N Aをクローニングすることに成功し、 それにコ一ドされるタンパク質がホスホジエステラーゼであることを見出した。
本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を^ るに 至った。
よわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 有するタンパク質またはその塩、
(2) 実質的に同一のァミノ ¾@B列が IB列番号： 1で表されるァミノ MSB列である上記 (1 ) 記載のタンパク質、
(3) 寄託番号 FERM BP— 6417で表される大腸菌中のプラスミド pPDE51 に保持 される cDN Aにコードされる上記 (1) 記載のタンパク質、
(4) ホスホジエステラーゼ活性を有する上記 (1) 記載のタンパク質、
(5) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列の から第 1ないし 10番目のアミノ酸配 列を含 ることを難とする上記 (1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、 (6) 上記 (1) 記載のタンパク質または上記 （5) 記載の部分ペプチドをコードする塩基 配列を る D N Aを含 ¾ る D Ν Α、 (7) 嗣番号： 9で表わされる ¾¾§Η列を有する上記 (6) 記載の DNA、
(8) 上記 (6) 言^の DNAを含有 る組換えべクタ一、
(9) ¾ の発現べクタ一である上記 (8) 言 の繊えべクタ一、
(10) 上記 （8) 記載の纏えベクターを ί¾する形離換体、
(11) 宿主が^菌である上記 (10) 纖の形 体、
(12) 上記 （10) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパク質を^^、 蓄 しめ、 これを採取することを纖とする上記 (1) 記載のタンパク質またはその塩の製 ,
(13) 上記 (1) 記載のタンパク質、 上記 (5) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に 対する抗体、
(14) 上記 (1) 記載のタンパク質、 上記 (5) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を 用いることを とする上記 (1) 記載のタンパク質、 上記 (5) 記載の部分ペプチドまた はそれらの塩のホスホジエステラーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リーニング方法、
(15) 上記 (1) 記載のタンパク質、 上記 (5) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を 用いることを特徴とする上記 (1) 記載のタンパク質、 上記 (5) 記載の部分ペプチドまた はそれらの塩のホスホジエステラーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リ一ニング用キッ卜などに関する。
さらに本発明は
( 16 ) 上記 （ 14) 記載のスクリ一ニング方法または上記 （15) 記載のスクリ一二ング 用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
(17) 配列番号： 9で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下で八イブリダイ ズする 列を有 る D N Aを含 る D N A、
(18) 上記 （17) 記載の DN Aを含 "る,えベクター、
(19) 上記 （18) 記載の,えべクタ一を する形質転換体、
(20) 上記 （19) 記載の形質転換体を培養し、 タンパク質を生成、 しめ、 これを 採取することを とする上記 （17) 記載の DNAにコードされるタンパク質またはその 塩の ¾m
(21) 上記 (20) 言 の Sit法で されるタンパク質またはその塩、
(22) (i) 上記 (1) 言識のタンパク質、 上記 (5) 記載の部分ペプチドまたはそれら の塩に基質を接触させた場合と （i i) 上記 （1) 記載のタンパク質、 上記 （5) 記載の部 分ペプチドまたはそれらの塩に基質および！^化合物をさせた における、 上記 （1) 記 載のタンパク質、 上記 (5) 言 の部分ペプチドまたはそれらの塩のプロテア一ゼ （ホスホ ジエステラー if) 活性を測定して、 比 することを とする第 (11) 項記載のスクリ一 ニング方法などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1 ii*発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vのァミノ ¾§Ξ列を示す （図 2に続く） 図 2は本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vのアミノ酸配列を示す （図 1の続き） 図 3 ¾Φ発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vの部分べプチドのァミノ 列を示す 。 図 1および" S 2に示したアミノ^列の から 109個のアミノ酸が欠失したァミノ ¾Ε列である （図 4に続く） 。
図 4は本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vの部分べプチドのアミノ酸配列を示す 。 図 1および Ι 2に示したアミノ^ Ξ列の から 109個のアミノ酸が欠失したァミノ ¾SB列である （図 3の続き） 。
図 5は本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vをコ一ドする DNAを含む DN Aの配 列を示す （図 6に続く） 。
図 6は本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vをコードする DNAを含む DNAの配 列を示す （図 5の続き） 。
図 7は図 3および図 4に示した部分べプチドをコ一ドする DN Aの配列を示す （図 8に続 <) 。
図 8は図 3および図 4に示した部分べプチドをコ一ドする DN Aの配列を示す （図 7の続 さ） 。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 7で表わされるァミノ ¾@B列 （図 1および 2) と同一もしくは実質 的に同一のアミノ¾@2列を るタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質と ¾τΤる） は、 ヒ トゃ ΐ¾1»物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 議胞、 龍胞、 胞、 グリア細胞、 Β繊3細胞、 骨翻胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 mm ,上細胞、 内細胞、 纖 擁胞、 繊縐胞、 翻胞、 脂薩胞、 ^ (例、 マクロファージ、 τ細胞、 Β細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好^ Ϊ求、 請球、 )、 巨核球、 滑薩胞 、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 mm , 胞もしくは間質細胞、 またはこ れら細胞の前麵胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれらの細胞力 ¾¾ETるあら ゆる繊、 例えば、 脳、 脳の各 （例、 嚇、 m , M , mm,赚、 嫌下 部、 皮質、 延髄、 小脳） 、 隨、 麵、 下垂体、 胃、 諷 腎臓、 纖、 生赚、 甲状 腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺 、 腿、 w .末梢血、 前 、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 また 球系の細胞もしくはその培 ¾B胞 （例えば、 MEL, Ml, CTLL-2, HT— 2， WEHI -3, HL-60, JOSK - 1, K562, ML— 1， MOLT - 3, MOLT —4， MOLT— 10, CCRF-CEM, TALL— 1， J u r ka t, CCRT-HS B— 2, KE-37, SKW-3, HUT - 78, HUT— 102, H9， U937, TH P— 1， HEL, JK- 1, CMK, KO— 812， MEG— 01など） に由来するタンパ ク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 7で表わされるアミノ¾@2列と実質的に同一のアミノ舰列としては、 配列番 号： 7で表されるアミノ^ Ξ列の Ν¾¾^ζ>第 1ないし 10番目のァミノ ¾@5列を含有し、 配列番号： 7で表わされるアミノ^ H列と約 9 2 %J¾±、好ましく〖¾¾9 5^Lh、特に好ま しく〖ぉ勺9 8 の相同性を るアミノ^ SB列など力 げられる。
また、碰の寄託番号 F E RM B P - 6 4 1 7で表される 菌中のプラスミド pPDE51 に保持される c DN Aにコードされるタンパク質なども本発明の夕ンパク質としてあげられ る。
特に、 配^ 号： 7で表わされるアミノ麵列と実質的に同一のアミノ¾@2列としては、 配列番号： 7で表されるアミノ隱列の Ν雄から第 1ないし 1 0番目のアミノ^ Ε列を含 有し、 配列番号： 7で表わされるァミノ ¾H列の第 1 1〜1 5番目のアミノ^ 2列、 および 第5 4 6〜8 3 3番目 （より好ましくは、 第 4 3 7〜 7 2 4番目のアミノ^ H列） を #fる アミノ^ 5列など力 げられる。 より具体的には、 配列番号： 7で表わされるアミノ^ H列 と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配 播号： 1で表わされるアミノ舰列などがあ げられる。
本発明の配 潘号： 7で表わされるアミノ^ SH列と実質的に同一のアミノ SH列を^ Tる タンパク質としては、 例えば、 配列番号： 7で表わされるァミノ ¾@B列と実質的に同一のァ ミノ ¾@H列を有し、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を^"るタンパク質と実質的に 同質の活性 （具体的にはホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ 活性 V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を ¾ るタンパク 質が特異的に有するホスホジエステラーゼ活性、 c GMP活性など） を有するタンパク質な どが好ましい。
実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に （例、 生理化 に、 または麵 に） 同 質であることを示す。 したがって、 活性が同等 （例、 約 0. 1〜1 0 0倍、 好ましく〖お勺 0 . 5〜1 0倍、 より好ましくは 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程 度、 タンパク質の などの量的要素は異なっていてもよい。
配列番号： 7で表わされるアミノ 列を るタンパク質の活性 （具体的にはホスホジ エステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ活性 V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わされるアミノ¾¾列を^ Tるタンパク質力特異的に ¾ るホスホジエス テラ一ゼ活性、 c GM P活性など） の視啶は、 自体 の方法に準じて行なうことカ^きる が、 例えば、 鍵するスクリーニング方法に従って測^ ることが きる。
また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列の N から第 1ないし 1 0番目のァミノ ¾SH列を含有し、 墦号： 7で表わされるァミノ 酸配列中の 1または 2個以上 （^ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1：〜 5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ¾@2列、 （¾列番号： 7で 表わされるアミノ^ Ξ列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1 ~ 3 omm , 好ましくは ι
〜： 1 0個體、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が働口したアミノ隱列、 ③ ,番号： 7で表わされるァミノ @5列に 1または 2個 (^ましくは、 1〜3 0個¾¾ 、 好ましくは 1〜1 0個 、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入された アミノ酸配列、 @§5列番号： 7で表わされるァミノ ¾E列中の 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜3 0個 、 好ましくは 1〜1 0個 m¾、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァ ミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ醒列、 また〖¾D^れらを組み合わせたアミノ酸 ,を含 ¾ るタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにァミノ ¾Ε列が挿入、 欠失または置換されている^^、 その挿入、 欠失また は置換の具体的な位置としては、 特に H¾されないが、 例えば、 配列番号： 7で表わされる アミノ酸配列の第 4 3 7〜7 2 4番目、 より好ましくは、 第 5 4 6〜8 3 3番目のアミノ酸 配列 の位置などがあげられる。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N¾¾ (アミノ ) 、 橘が C (カルボキシル である。 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質をはじめとする、 本発明のタンパク質は、 C末端が通常カルボキシル基
(- C OOH) またはカルボキシレート（一 C OO—)であるが、 C末端がアミド （_ C ON H2) またはエステル （― C OO R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロ ピルもしくは n—ブチルなどの (：卜6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシ ルなどの C 3—sシクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6— アリール 基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル— アルキル基もしくは α—ナフチ ルメチルなどの α—ナフチル— ― アルキル基などの C 7_ ァラルキル基のほか、 経口用 エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有して いる場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク 質に含まれる。 この齢のエステルとしては、 例えば上記した (：*¾のエステルなどが用い られる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 N«のアミノ酸 ¾S (例、 メチォニン ¾S) のアミ ノ基が髓基（例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの —eアルカノィルなどの —6ァシ ル基など） で麵されているもの、 生体内で切断されて生; ¾Tる の G 1 nがピログル 夕ミン酸化したもの、 内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一〇H、 一 SH、 ァミノ 基、 イミダゾ一ル基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミ ル基、 ァセチル基などのじ卜6アルカノィル基などの C 1-6ァシル基など）で織されている もの、 あるい ίίί^が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる 。
本発明の夕ンパク質の部分べプチドとしては、 前記した本発明の夕ンパク質の部分べプチ ドであって、 配列番号： 7で表されるアミノ麵列の から第 1ないし 1 0番目のアミ ノ^ Η列を含有し、 好ましくは、 Ml己した本発明のタンパク質と同様の活性 （具体的にはホ スホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さらに好ましくは 、 配列番号： 7で表わされるアミノ^ H列を； るタンパク質力特異的に るホスホジェ ステラ一ゼ活性、 c GMP活性など） を有するものであればいずれのものでもよい。 例えば 、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列の N から第 1ないし 1 0番目のァミノ ¾@2列を 含有し、 本発明のタンパク質の構成アミノ麵列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ^ Ξ列を有し、 本発明のタンパク質と同様の活性 （具体的にはホスホ ジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さらに好ましくは、 配 潘号： 7で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質カ 異的に有するホスホジエステ ラ一ゼ活性、 c GMP活性など） を るペプチドなどが用いられる。
より具側には、 配列番号： 7で表わされるアミノ^ 5列の第 1〜1 5番目 （より好まし くは第 1〜： L 0番目） のアミノ^ a列を含有し、 力つ本発明のタンパク質の構成アミノ酸配 列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 よ り好ましくは 1 0 0偭以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ^ @Ξ列より具 ^1には、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列などを有し、 本発明のタンパク質と同様の活性 （具 体的にはホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さらに 好ましくは、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を るタンパク質が特異的に る ホスホジエステラー if活性、 c GMP活性など） を有するペプチドなどが用いられる。 また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 (- COOH) またはカルボ キシレート （一COO—)であるが、 前記した本発明のタンパク質のごとく、 C末端がアミド (一 CONH2) またはエステル （― COOR) (Rは上記と同意義を示す） であってもよ い。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 嫌己した本発明のタンパク質と同様に、 N のァ ミノ酸魁 （例、 メチォニン藤） のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N職が生 体内で切断され^ ^した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 肝内のアミノ酸の側鎖上 の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるい〖雄鎖が したいわゆる糖べプチ ドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原として用いることが きるので、 必ずしも ホスホジエステラーゼ活性を る必要はない。
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無 難、 有機酸） ゃ驢 （例、 アルカリ金属 などとの塩が用いられ、 とりわけ生理 に 許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 雄酸 （例えば、 驢、 リ ン酸、 臭は素酸、 «) との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 ©«、 クェン酸、 リン:^、 wm, 安息香酸、 メタン スルホン酸、 ベ tfンスルホン^) との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドもしくはそれらの塩は、 前述したヒトゃ& ί¾物 の細胞また ttffii^ゝら自体么^ Πのタンパク質の精^^法によって することもできるし、 腿するタンパク質をコードする DNAを含 #fる形質繊体を培養することによつても製 造することが きる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺? U¾物の組織または細胞から製造する場^ ヒトゃ哺学 U¾物の組織または細胞を ホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン 交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離する こと力 さる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドもしくはそれらの塩、 またはそれらのアミド体の 合成には、 通^ m販のタンパク質合删樹脂を用いること力 ?きる。 そのような樹脂として は、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミ ノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァ ミン樹脂、 PAM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリ アクリルアミド樹旨、 4一 （2'， 4' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹 脂、 4— (2' , 4' -ジメトキシフエニル一 Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げるこ とができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸 を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体 の各難合方法に従い、 樹脂上で縮合さ せる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を^ ¾し、 さらに高 «溶液中で 内ジスルフィド結合形成反応を し、 目的のタンパク質またはそれらの アミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に fflできる各種活性化試薬を 用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド類としては、 DCC 、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチ Jl^N - (3 -ジメチルァミノプロリル) カルボ ジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOBt. HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添力 [Γするかまたは、 対!^無水物または HOBt ェ ステルあるいは HOOBtエステルとしてあらかじめ アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂 に添力 P"することか * きる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる としては、 タンパク質縮合 act、に ^fflしうることが知られている,から M31択されうる。 例えば、 N， N—ジメチルホル ムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化 メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭 ίは素類、 トリフルォロエタノールなどのアル コール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒ ドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸 メチル， 瞧ェチルなどのエステル類あるいはこれらの戯の混合物など力用いられる。 反 応 は夕ンパク質結合形成反応に^ fflされ得ることが知られている範囲から 択され 、 通常約— 2 0で~ 5 0での範囲から 択される。 活性化されたアミノ酸誘導体 tt®常 1. 5〜4i¾»Jで用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場 合には保護基の誦を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうこ とが きる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチ ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を 与えないようにすることが きる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Boc、 t —ペンチルォキシカルボニル、 ィ ソボル二ルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォキシカルボニル、 C卜 Z、 Br- Z、 ァダ マンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフ ェニルスルフエニル、 ジフエ二ルホスフイノチオイル、 Fmocなど力用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—プチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル 、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキル エステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベン ジルエステル、 4一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル ί匕） 、 フエナシルェ ステル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルボニルヒドラジド化 、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護することが きる
。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの歷 ( C 1→) アルカノ ィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 エトキシカルボ二 ル¾¾どの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては 、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノーリ HfcK酸基の保護基としては、 例えば、 Bzl、 C 1 2-Bz l、 2—二トロべ ンジル、 Br- Z、 t—ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのィミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4-メ卜キシ- 2, 3, 6-トリメチ ルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc, Trt、 Fmocなどが用いられ る。
廳のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対 る酸無水物、 アジド 、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2, 4, 5-トリクロロフエノ ール、 2, 4-ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H0 B、 Ν-ヒドロキシスクシミド、 Ν-ヒドロキシフ夕ルイミド、 HOBt) とのエステ Jレ〕 などが'用いら れる。 料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対 るリン酸アミドが用い られる。
保護基の除去 «)方法としては、例えば、 P d—黒あるいは P d-炭素などの触媒の存 在下での水素気流中での ¾ £^、 また、 無水フッ ίは素、 メタンスルホン酸、 トリフル ォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、 ジ イソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処 理、 また液体アンモニア中ナトリウムによる ¾なども用いられる。 上言 e 処理による脱離 反応は、 に約— 2 0で〜 4 0での で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァ ニソール、 フエノール、 チオア二ソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスル フイド、 1, 4-ブタンジチオール、 1, 2 -エタ
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力 である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエ ニル基はチォフエノール処理により^ ¾され トリブトファンのィンドール髓基として用 いられるホルミル基は上記の 1. 2-エタンジチオール、 1, 4 -ブタンジチオールなどの存在下の 酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処 理によっても除去される。
原料の に関与すべきでない官肯 の保護ならびに保護基、 およびその織基の隱、 反応に関与する官^ sの活性化などは^の基または^の手段か iiM択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ 5 ^アミノ酸 の α—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ纏 ijにペプチド （タンパク質） 鎖 を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の N の α -ァミノ基の保護基のみを除レ寸こ タンパク質と C のカルボキシル基の保護基のみを したタンパク質とを し、 この 両タンパク質を上記したような混合灘中 ig合させる。 縮合反応の詳細について 記と 同様である。 縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を駐し、 所望の粗タンパク質を得ることか きる。 この粗タンパク質 の各種精 醉段を駆使して精製し、 主麵分を雜纖することで所望のタンパク質のアミド体を得 ることか^きる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ «アミノ酸の α—カルボキシ ル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タンパク質のアミド体と同 様にして、 所望の夕ンパク質のエステル体を得ることか きる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 自体^ Πのペプチドの合成法に従って、 あるいは 本発明の夕ンパク質を適当なぺプチダ一ゼで切断することによって^ すること力 ?きる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 す なわち、 本発明の部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と 分とを 縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製 造することか きる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の に記 載された方法力 げられる。
① M. Bodanszky および Mん Ondet t i , ペプチド ·シンセシス （Pept i de Synthes is) , Intersc ience Publ ishers, New York (1966年）、
② Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド（The Pept ide), Academic Press, New York (1965 年)、
聽屋信规、 ペプチド合成の碰と無， 丸善 (株） （1975年） 、
島治明およ 原俊平、 生化^!^講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年)、 島治明監修、 続医薬品の開発、 第 巻、 ペプチド合成、 広川書店。
また、 反 後〖¾1常の精製法、 例えば、 出 ·蒸留.カラムクロマトグラフィー ·液 体クロマトグラフィー.再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製 るこ と力 きる。 上記方法で得られる部分ペプチドが誦体である ¾^は、 の方法あるいは それに準じる方法によって適当な塩に変換することが きるし、 逆に塩で得られた^は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって «体または他の塩に変換すること力 ?きる 本発明のタンパク質をコードする DN Aとしては、 前述した本発明のタンパク質をコード する塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 嫌己した細胞 *繊由来の c DNA、 鎌己した細胞 ·纖由来 の c DNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。
ライブラリーに麵するベクタ一は、 ノ クテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファ —ジミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より total RN Aまたは m RN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 RT- P C R法と略 rする） によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 （US列番号： 9で表わされる ^ΙΒ列を含 る DNA、 また «S3列番号： 9で表わされる; S配列とハイストリンジェ ン卜な条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、 本発明の夕ンパク質と実質的に同質の 活性 （例、 ホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さら に好ましくは、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を るタンパク質力特異的に るホスホジエステラーゼ活性、 c GMP活性など） を有するタンパク質をコードする DNA であれば何れのものでもよい。
配列番号： 9で表わされる塩 列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズで きる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 9で表わされる塩基配列の 5' から 3 0個の塩 SSS列を含有し、 配列番号： 9で表ゎされる¾»列と約9 2 %以上、 好ましく 勺 9 5 % 以上、 最も好ましく〖お勺 9 8 %以上の相同性を る ¾s配列を含 る DNAなどが用い られる。
ノ、イブリダィゼーシヨンは、 自体 の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキ ユラ一 ·クローニング (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが きる。 また、 市販のライブラ リーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことが きる。 より好 ましくは、 八イストリンジェン卜な条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム献が約 1 9〜4 0mM、 好まし くは約 1 9〜2 0mMで、 温度が約 5 0〜7 0 ：、 好ましくは約 6 0〜6 5での条件を示す 。 特に、 ナトリウム離が約 1 9 mMで雕が約 6 5での が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を るタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 9で表わされる塩基配列を有する DN A (図 5〜図 6中、 第 1番目〜 2 4 9 9番目の塩基配列） などが用いられる。 また、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ^ B列を るタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 3で表わされる塩 SSH列を る D N Aなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分ペプチドをコ ードする: »配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DN A、 ゲノム DNAライブラリー、 嫌己した細胞 '繊由来の c DNA、 嫌己した細胞 ·繊 由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 9で表わされる塩 基配列の から 3 0個の塩基配列を含有し、 Φ§Ξ列番号： 9で表わされる^ SB列を有 する DNAの部分 配列を る DNA、 （HE列番号： 9で表わされる ¾S配列を^ る DNAの部分^ SS列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする^ SS列を有 し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を るタンパク質と実質的に同質の活性 （具体 的にはホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さらに好 ましくは、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を るタンパク質力 ¾異的に ¾ るホ スホジエステラーゼ活性、 c GMP活性など） を有するタンパク質をコードする DN Aの部 分; »SH列を ¾ る DNAなどが用いられる。 より具働には、 配列番号： 9で表わされる 列の 5 ' から 3 0個の;^配列を含有し、 配列番号.' 4で表わされる ^SSH列を有 する D N Aなどがあげられる。
本発明のタンパク質または部分ペプチド （以下、 これらタンパク質等をコードする DN A のクローニングおよび発現の説明においては、 これらタンパク質等を単に本発明のタンパク 質と略記する） を完全にコードする DN Aのクローニングの手段としては、 本発明のタンパ ク質の部分^ SB列を #Tる合成 DNAプライマーを用いて P C R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込んだ DNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコ ードする DNA断片もしくは合成 DNAを用いて標識したものとのハイブリダィゼ——ンヨン によって選別することが きる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー •クロ一ニング (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと力できる。 また、 市販のライブラリ一を ^fflする 、 耐の舰説明書に記載の方法に従って行なうこと力できる。
DNAの塩基配列の変換は、公知のキッ卜、例えば、 MutantTM-G (宝酒造（株) )、 MutantTM-K (宝酒造 （株） ) などを用いて、 6卯[½(1 (1叩16 法ゃ1(1111 1法などの自体^0の方法ぁるぃ はそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのまま、 または所望によ り制限酵素で消化したり、 リンカ一を働 Πしたりして魏することができる。 該 D NAはそ の 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドン としての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳 終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することもできる。 本発明のタンパク質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質をコードする
DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当な発現べクタ一中 のプロモータ一の下流に連結することにより製造することが きる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322, pBR325, pUC 12， pUC 13, pPDE51) 、 枯^ ffi由来のプラスミド （例、 UB 110, pTP 5, pC 194) , 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9, pSHl 5) λファージなど のパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， ノ、キュロウィルスなどの動 物ウィルスなどの他、 ρΑΙ— 11、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RSV、 p cD NA Iノ Ne oなどが用いられる。
また、 工業的に本発明のタンパク質を大量に発現させるためには、 ^菌が宿主の形質転 換体を用いることカ^?ましく、 ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR3
22， pBR325, pUC 12， pUC 13, p PDE 51) 力 ¾fましく用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺 の発現に用いる宿主に対応して適切な プロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿主として用いる齢は 、 SRaプロモー夕一、 SV40プロモータ一、 LTRプロモーター、 CMVプロモ一夕一 、 HSV- TKプロモ一夕一など力 げられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロモーターなど を用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t rpプロモーター、 1 a cプロモーター、 r ecAプロモータ一、 APLプロモーター、 l ppプロモーター、 T7 プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP02 プロモーター、 penPプロモーターなど、 宿主が 母である齢は、 PH05プロモー夕 一、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモ一夕一など力好ましレ 宿主 が昆 胞である場合は、 ポリヘドリンプロモー夕一、 P 10プロモーターなどが好ましい
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシグナル、 ポ リ A ¾3シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製オリジン （以下、 SV40o r iと略称す る場合がある） などを含有しているものを用いることか きる。 選択マーカ一としては、 例 えば、 ジヒドロ 素 （以下、 d h f rと略 る がある） 遣 〔メソトレキ セ一ト （MTX) m 、 アンピシリン耐 ffite^ (以下、 Amp 1 "と略称する がある
) 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 Neo Fと略称する場合がある、 G4181H4)等が 挙げられる。 特に、 dh f r遺 欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遣伝 子を選択マーカ一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選 択できる。
また、 必 に応じて、 宿主に合ったシグナ 列を、 本発明のタンパク質の Ν端末側に付 力 Ofる。 宿主がェシエリヒア属菌である齢は、 Pho A .シグナル配列、 Omp A .シグナル 配列などが、 宿主がバチルス属菌である齢は、 α-アミラーゼ 'シグナル配列、 サブチリ シン'シグナリ 列などが、 宿主カ聨母である齢は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 · シグナリレ配列など、 宿主が ¾J物細胞である場合には、 インシュリン.シグナル配列、 ィ ンターフェロン'シグナ^ II/SH列、 抗体肝'シグナ ! /SB列などがそれぞ fu用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有するベクターを 用いて、 形質^^体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物 細胞などが用いられる。 工業的に本発明の夕ンパク質を大量に発現させるためには、 宿主 がェシエリヒア属であること力好ましい。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア'コリ （Escherichia col i) Kl 2 · DH1 〔プロシ一ジングズ 'ォブ ·ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ，サイェン シィズ 'ォブ 'ザ 'ュ一エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160(1 968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ'リサーチ， （Nucleic Acids Research ) ， 9巻， 309(1981)〕 ， JA221 〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー'バイオ口 ジ一 （Journa
〔ジェネティックス （Genetics) . 39巻， 440(1954)〕 、 BL21 (フナコシ ¾) などが用いられる。
ノチルス属菌としては、 例えば、 ノ チルス'サブチルス （Bacillus subtil is) MI 114 〔ジーン， 24巻， 255(1983)〕 ， 207- 21 〔ジャーナル ·ォブ ·バイオケミス トリ一 （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisi e) A
H22, AH22R―， NA87-11 A, DKD-5D, 20B— 12、 シゾサッカロマ イセス ボンべ （Schizosaccharomycespombe) NCYC 1913, NCYC 2036、 ピキ ァ パストリス （Pichia pastoris) KM71などが用いられる。
MM胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの齢は、 ¾¾¾の幼虫由来株ィ 胞 (Spodopter frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、
Trichoplusia ni の卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株 im (Bombyx mori N細胞； BmN細 などカ佣いられる。 該 S f細胞としては、 例え ば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.Lら、 イン'ヴイボ （ In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫など力用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー （Nature)
， 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サ 胞 COS— 7, V ero， チャイニーズ八ムス夕一細胞
CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺 欠損チャイニーズハムスター細胞 CH O (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス AtT— 20， マウ スミエロ一マ細胞， ラット GH3, ヒト FL細胞など力 S用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ *ザ*ナショナ ル'アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ 'ォブ 'ザ*ユーエスェ一（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) , 17巻， 107 (1982)など に記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジェネラル ·ジエネ ティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 111 (1979)などに記載の 方法に従って行なうこと力できる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ ·イン 'ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology) ， 194巻， 182- 187 (1991) 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル'アカデミー ·ォブ'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ'ュ一エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978) などに記載の方法に従って行なうことが き る。
«胞また を形質転換するには、例えば、ノイォ Ζテクノロジー（Bio/Technology ) , 6, 47-55(1988)) などに記載の方法に従って行なうこと力できる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール. 263-267 (1995) (秀潤¾¾行） 、 ヴィロロジ一 （Virology) ， 52巻， 456 ( 1973)に記載の方法に従って行なうことが きる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現ベクターで形質 され た形質 体を得ることが きる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に麵され る培地としては液 地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒 素源、 その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキスト リン、 可溶 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム; ^、 , コーンスチープ'リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液など の雄または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸: Ιτ素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなど力 げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生: 1»因子などを添 加してもよい。 培地の ρΗは約 5〜 8が ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む
Μ9培地 〔ミラ一 （Miller) ， ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ 'イン 'モレキュラー 'ジエネティックス （Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 431-433
， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 力好ましい。 ここに必 によりプ ロモ一夕一を効率よく せるために、 例えば、 3 /3—インドリルアクリル酸のような翻 を加えることが きる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43t:で約 3〜24時間行ない、 必 要により、 通気や■を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の齢、 常約 30-40でで約 6〜 24時間行ない、 必 に より通気ゃ を加えることもできる。
宿主が ¾母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 ノークホールダ一 (
Burkholder) 最小培地 [Bostian. K. L. ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ 力デミ一'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ'ュ一エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. US A) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5%カザミノ酸を含 る SD培地 [Bitter, G.
A ら、 プロシ一ジングズ.ォブ *ザ*ナショナル ·アカデミー *ォブ'サイェンシィズ .ォ ブ'ザ ·ユーエスェ— (proc Natl Acad. sci. USA) , 81巻， 5330 (1984)
〕 カ举げられる。 培地の pH«¾5〜8に調 るの力 ましい。 常約 20T：〜 3 5 で約 24〜72時間行ない、 ^に応じて ffi^ゃ辦を加える。
宿主が S^ffl胞また〖1¾虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace' s Insec t Medium (Grace, T.C.C.,ネイチヤー (Nature) , 195, 788(1962)) に非動化した 10%ゥシ血 靜の添加物を Μ¾口えたものなどが用いられる。 培地の ρΗ〖お勺 6. 2〜6. 4に調 るのが好ましい。 培養は通常約 27でで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撤半を加 える。
宿主が ¾物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20%の 胎児牛血清を含む MEM培地〔サイエンス （Seience) ， 122卷， 501 (1952)〕 ， D MEM培地〔ヴイロロジ一 （Virology) , 8巻， 396(1959)〕 ， RPMI 1640培 地〔ジャーナル'ォブ ·ザ'アメリカン ·メディカル 'アソシエーション（The Jounal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジ ング ·ォブ ·ザ'ソサイエティ 'フォー ·ザ'バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻, 1 (1950)〕 などが用いられる。 p H«¾6〜8であるのが好ましい。 縫〖¾1常約 3 0 t：〜 4 0でで約 1 5〜6 0時間行な い、 必 に応じて通気や ί ^を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明のタンパク質を生成せしめること力 き る。
上 から本発明のタンパク質を分 §1^製するには、 例えば、 下記の方法により行な うこと力 きる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるい ί細胞から抽出するに際しては、 培養後、 の方 法 体あるい〖細胞を集め、 これを適当な緩衝液に «し、 超音波、 リゾ ^"ムおよび/ または などによつ Τ¾体あるい〖纖胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりタン パク質の 出液を得る方法などが いられる。 緩衝液の中に尿 グァ二ジンな どの蛋白質変 や、 トリトン X— 1 0 0 1 1^などの界面活 が含まれていてもよい。 培 中にタンパク質が分泌される齢には、 培纖了後、 それ自体^ Πの方法 ¾体あるい 胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるい 出液中に含まれるタンパク質の精製は、 自 体^]の分離.精製法を適切に組み合わせて行なうことが きる。 これらの^ 0の分離、 精 製法としては、 塩 «»¾などの溶解度を利用する方法、 透析法、 ろ過法、 ゲル ろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として 量の差を利 用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を禾 lj用する方法、 ァフィ二ティ 一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を禾 I佣する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ —などの疎水性の差を禾 ϋ用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法な どが用いられる
かくして得られるタンパク質力讓体で得られた場合には、 自体 の方法あるいはそれ に準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた には自体 の方法 あるいはそれに準じる方法により、 «体または他の塩に変換することが きる。
なお、 組換え体が 生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作 用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去することもでき る。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドぺプ チダーゼ、 プロティンキナーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
カゝくして ^^rrる本発明のタンパク質またはその塩の碰または活性は、 標識したリガン ドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定すること か さる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発明のタンパク 質、 部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノ クロ一ナレ抗体の何れであつてもよい。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 抗体の説明においては、 こ れらタンパク質等を単に本発明のタンパク質と略記する） に対する抗体は、 本発明のタンパ ク質を抗原として用い、 自体公知の抗体またはお恤清の製造法に従って製造すること力 き る。
〔モノクローナル抗体の作
(a) モノクロナ一リレ抗体産生細胞の
本発明のタンパク質は、 物に対して投与により抗体産生が^ T能な にそれ自体あ るいは担体、 ^TOjとともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロ ィン卜アジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6 週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0Θ¾¾行われる。 用いられる 物としては、 例えば、 サル 、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリカ举げられるが、 マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産^ g胞の作製に際しては、 i¾gで敏された 物、 例えばマウ スから抗体価の認められた個体を選択し の 2〜 5日後に βまたはリンパ節を採取 し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異 β物の骨 ffi ffl胞と融合させることに より、 モノクローナル抗体産^ Λイブリドーマを調製することができる。 ί¾ί[1清中の抗体価 の測定は、 例えば、 後記の標識化タンパク質と 清とを反応させたのち、 抗体に結合した 標翻の活性を測 ることにより行なうことができる。 融合操作《i oの方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 （Nature), 256、 495 (1975)] に従い実施する ことが きる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダ ィウィルスなど力 げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。
M ffl胞としては、 例えば、 NS—1、 P3U1、 SP2/0, AP— 1などの温 JlS) 物の骨 ¾ffi ^胞カ げられるが、 P3U1カ^?ましく用いられる。 用いられる抗体産 «胞 m 数と骨 胞数との好ましい比率は ι： ι〜2ο： iagであり、 PEG ( 好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 の で添加され、 20 〜40 ：、 好ましくは 30〜37でで 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく 合を«でさる。
モノクローナル抗体産^/、イブリドーマのスクリーニングには種々の方法が^ fflできるが 、 例えば、 タンパク質 を直接あるいは担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレ —ト） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗敏グ ロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの 、 抗マウス^ ¾グロブリン抗体が 用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方 法、 抗滅グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清 を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクロ一 ナル抗体を検出する方法などカ げられる。
モノクローナル抗体の は、 自体 あるいはそれに準じる方法に従って行なうことが できる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細細 培地で行なうことができる。 顧リおよび Sffl培地としては、 ハイプリドーマが生育できる ものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20% の牛胎 ¾01清を含む R ΡΜΙ 1640培地、 1〜 10 %の牛胎 ¾fil清を含む G I T培地（和 舰薬工業 （株） ) あるい イブリドーマ培養用無 清培地 (SFM- 101、 日水製薬 (株） ) などを用いること力 きる。 培養^は、 通常 20〜40 ：、 好ましくは約 37で である。 培辦間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことが きる。 ハイブリド一マ培養上清の抗体価は、 上記の脑清 中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体^]の方法、 例えば、 グロブリンの分,製 法 〔例、 m . アルコール請法、 等鼇 ίΜ¾、 動法、 イオン交換体 （例、 DE ΑΕ) による吸!^法、 超遠' 去、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Αあるい はプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特 異的精製 に従って行なうことが きる。
〔ポリクローナル抗体の繊
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造す ることができる。 例えば、 髓羅 （タンパク質 自体、 あるいはそれとキャリアー蛋 白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に 物に免疫を行 ない、 該^ ¾物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分 gim製 を行なうことにより ^することができる。
&fii»j物を免疫するために用いられる免 ί¾¾頃とキャリアー蛋白質との複合体に関し、 キ ャリァー蛋白質の種類およびキヤリァ一とハプテンとの混合比は、 キヤリァ一に架橋させて 髓した八プテンに対して抗体が 率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋さ せてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、 約 0. 1〜 2 0、 好ましく fお勺 1〜 5の割合で力プルさせる方法 が用いられる。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが きるが、 グルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリ ジル基を含 る活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 》i¾物に対して、 抗体産生が 能な離にそれ自体あるいは担体、 鎌 剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバン トゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜6週毎に 1回ず つ、 計約 3〜： L 0回^行なわれる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で髓された 物の血液、 腹水など、 好ましくは 血^ゝら採取することが、できる。
清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の 清中の抗体価の測定と同様にして 啶できる。 ポリクロ一ナル抗体の分 製は、 上記のモノクローナル抗体の分 製と同 様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことか きる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードする DNA (以下、 アンチセンス DNA の説明においては、 これらの DNAを本発明の DNAと略記する） に相補的な、 または実質 的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス DNAとしては、 本発明の DNAに相補的な、 または実質的に相補的な: ^SH列を有し、 該 DNAの発現を抑制し得る作用を有するもので あれば、 いずれのアンチセンス DNAであってもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNAに相補的な塩 SSB列 （すなわち、 本発明の DNAの相補 I) の全塩 SSB列あるいは部分^ SB列と約 9 2 %以上、 好ましく ¾¾ 9 5 %以上、 より好ましく〖¾¾ 9 8 の相同性を る J^SH列 などカ举げられる。 特に、 本発明の DN Aの相補鎖の全;^ SS列うち、 本発明のタンパク質 の N をコードする部分の: ^SSS列 （例えば、 開始コドン付近の塩 SS2列など） の相 補鎖と約 7 0 %以上、 好ましく «勺 8 0 %以上、 より好ましく ¾ ¾9 0 %以上、 最も好まし くは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンス DN Aが である。 これらのアンチセン ス DNAは、 公知の DNA合成装置などを用いて製造することか きる。
以下に、 本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明のタンパク 質と略記する がある） 、 本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードする DNA ( 以下、 本発明の DNAと略記する齢がある） 、 本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたは それらの塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する齢がある） 、 およびアンチセン ス DNAの用途を説明する。
( 1 ) 本発明の夕ンパク質が関与する各 の治療 ·予防剤
本発明のタンパク質および本発明の DN Aは、 ホスホジエステラーゼ Vに起因する種々の 疾患の治療 ·予防剤などの医薬として細すること力できる。 例えば、 生体内においてホスホジエステラーゼ Vカ滅少あるいは欠損している患者がいる に、 （ィ） 本発明の DN Aを 患者に投与し、 生体内で本発明のタンパク質を発現させ ることによって、 （口） 細胞に本発明の DNAを挿入し、 本発明のタンパク質を発現させた 後に、 細胞を患者に移 ¾fることによって、 または （八） 本発明のタンパク質を 患者に 投与することなどによって、 該患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、 あるいは 正常に発揮させることができる。
本発明の DNAを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 該 DNAを単独あるいはレ トロウィルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシェ一テッドウィル スベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは^ «物に 投与することか きる。 本発明の DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤 などの生理^ Wに認められる担体とともに觀化し、 遣 ^やハイドロゲルカテーテルの ようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質は、 例えば、 ' に応じて糖衣を施した翻、 カブセ ^、 エリキシ
) . マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるい《τκもしくはそ の薬物に許 容し得る液との無菌性溶液、 また 翻などの麵剤の形で非経口的に棚できる。 例 えば、 本発明のタンパク質を生理学的に認められる担体、 mi 陚形剤、 べヒクル、 防腐 剤、 安定剤、 剤などとともに ¾¾に認められた讓実施に要求される単棚量形態で混 和することによって することが きる。 これら■における 成分量は された範 囲の適当な容量が得られるようにするものである。
i カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチン、 コー ンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤 、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウム のような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような ¾·Μ、 ペパーミント、 ァカモノ 油またはチェリ一のような香欄などが用いられる。 調剤単位形態が力プセルである場合に は、 前記タイプの材料にさらに油脂のような 担体を含有することができる。 注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方すること力 き る。
醜用の水性液としては、 例えば、
Figure imgf000030_0001
ブドウ その他の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などカ げられ、 適当な溶編助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例 えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコールなど） 、 非イオン 14界面活删 （例 えば、 ポリソルべ一ト 8 0 TM、 HCO— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては 、 例えば、 ゴマ油、 油などカ举げられ 溶漏助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコールなどと併用してもよい。 また、 緩翻 （例えば、 リン酸驢衝液、 赚ナトリウ ム緩衝液など） 、 »化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 難プロ力インなど） 、 安定 剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保赫 J (例えば、 ベン ジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防 などと配合してもよい。 調製された謝液 は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明の DNA力禅入されたべクタ一も上記と同様に讓化され、 通常、 非経口的に される。
このようにして得られる翻は、 安全で 1»性であるので、 例えば、 ヒトまたは afilfl物 (例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ 、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することが、できる。
本発明のタンパク質の投与量は、 赚疾患、 投与媳、 投与ルートなどにより差異はある が、 例えば、 経口投与する齢、 "^的に成人 （6 0 k gとして） においては、 一日につき 該タンパク質を約 0. l mg〜l 0 0mg、好ましく tt*勺 1. 0〜5 0mg、より好ましくは 約 1. 0〜2 0mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該タンパク質の 1回投与量は投 与嫩、 文豫疾き、などによっても異なるが、 例えば、 麵剤の形で成人 （体重 6 0 k gとし て） に投与する場合、 一日につき該タンパク質を約 0. 0 1〜3 0mg離、 好ましく【お勺 0. l〜2 0mg¾S、 より好ましく ίお勺 0. 1〜： L 0mg¾gを患部に龍することによ り投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与する こと力できる。
( 2 ) に対する医薬^ M化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質の機能 （例、 ホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジェ ステラーゼ V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わされるアミノ^ H列を^ Tる夕 ンパク質カ 異的に有するホスホジエステラーゼ活性、 c GMP活性など） を阻害する化合 物またはその塩は、 例えば、 漏器系疾害、 （労作性および安!^^ 性狭' お よび異形狭' ^ 、 高 ώΕΕ、 うつ血性 'L不全、 肺高 ώϋ£症、 ァテロ一ム¾¾脈硬化症、 血管 開存性低下症、 血^^窄、 末梢血管疾害、、 »中など） 、 閉 S½ 疾砉、 （1114喘息、 気管支 炎など） 、 アレルギ 害、 （アレルギー性喘息、 アレルギー性鼻炎、 じんましんなど） 、 消 の翻性に赚づけられる疾害、 （過敏 ¾¾離など） 、 糸球嫉患、 測管間質性 疾害、、 腎不全、 糖尿病合併症、 緑内障、 ヒトを含むォスの哺乳麵物の勃起機能不全、 ヒト を含むメスの哺¾¾物の «機能不全、 早産、 月経困難などの治療.予防剤などの医薬とし て使用できる。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の機能を促進または阻害する化 合物またはその塩のスクリ一エングのための試薬として有用である。
よわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを とする 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の機能 （例えば、 ホスホジエステ ラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質が特異的に有するホスホジエステラーゼ活 性、 c GMP活性など） を促進する化合物もしくはその塩 （以下、 ¾剤と略記する が ある） 、 また〖鉢発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の機能 （例えば、 ホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さらに好ましく は、 配列番号： 7で表わされるアミノ^ Ξ列を るタンパク質が特異的に るホスホジ エステラーゼ活性、 c GMP活性など） を阻^ Tる化合物 （以下、 阻翻と略記する場合が ある） のスクリーニング方法を提供し、 より具体的には、 例えば、 ( 2 ) ( i ) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させた と （ω 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に基質および 化 合物を■させた場 との比較を行なうことを特徴とする {¾1剤または阻 のスクリー二 ング方法を する。
具脚には、 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i ) と （U) の齢におけ る、 本発明のタンパク質の （例えば、 ホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジ エステラーゼ V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わされるァミノ ¾@Ξ列を る タンパク質カ塒異的に "るホスホジエステラーゼ活性、 c GMP活性など） を測定して、 比 することを とするものである。
基質としては、 本発明のタンパク質の基質となり得るものであれば何れのものでもよい。
匕合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 物、 細胞抽出液、 植繊出液、 動物繊抽出液などカ襻げられ これら化合物〖錄 規な化合物であってもよいし、 の化合物であってもよいが、 c GMPカ ましく用いら れる。
上記のスクリーニング方法を実 ¾ るには、 本発明のタンパク質を、 スクリーニングに適し たバッファ一に懸濁することにより本発明の夕ンパク質の標品を調製する。 バッファーには
、 p H約 4〜： L 0 (望ましくは、 p H約 6〜8 ) のリン酸バッファー、 トリスー塩酸バッフ ァ一などの、 本発明のタンパク質と基質との反応を阻害しないバッファ一であればいずれで もよい。
反応温度は 1 0〜5 0で （望ましくは 2 5 ~ 3 7 ） の範囲であればいずれでもよい。 本発明のタンパク質 は 0. 1 t gZm l〜5 0 gZm l (望ましくは 1 g/m 1〜
2 5 g/m 1 ) の範囲であればいずれでもよい。
本発明のタンパク質の活性 （例えば、 ホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホ ジエステラーゼ V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わされるァミノ ¾@E列を るタンパク質が特異的に るホスホジエステラーゼ活性、 c GMP活性など） は、 の 方法 （ Thompson, W. J. ら Biochemistry 10, 311 (1971) , J. D. Johnson ら Anal. ChenL 162， 291 (1987)、 H J. Schill ingら Anal. Chen 216, 154(1994), Phosphodiesterase [3H] cGMP
SPA enzyme assay kit (アマシャム ¾) など） に従って測定することが出来る。
例えば、 上記 (ii) の場合におけるホスホジエステラーゼ活性などが上記 (i) の場合に 比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上上昇させる試 験化合物を本発明のタンパク質の活性を腿する化合物として、 一方、 上記 (ii) の齢に おけるホスホジエステラーゼ活性などが上記 (i) の場合に比べて、 約 20%以上、 好まし くは 30%以上、 より好ましく〖 50%以上阻 1 "る 化合物を本発明のタンパク質の 活性を阻 する化合物として選択することが'できる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれ らの塩を含有するものである。 本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが 挙げられる。
[スクリーニング用試
1. 視翻緩衝液
pH7. 5の Tr i s—HC Iバッファー
(MgC 12、 EGTA含有）
2. タンパク質標品
本発明の夕ンパク質、 その部分べプチドまたはそれらの塩
3. 基質
[3H]3， 、 5， 一サイクリックグアノシン一リン酸
4. 検出
加水適された [3H] 5 ' —グアノシンーリン酸の放衞性
腦
本発明のタンパク質に [3 H] 3， 、 5' —サイクリックグアノシン一リン酸を加え、 30で、 30分間反応させた後、カロ水 された [3H] 5' —グアノシン一リン酸の放 性を測 ¾T ることによってホスホジエステラ一セ'活性を測定する。 具体的には Phosphodiesterase [3H ] cGMP SPA enzyme assay kit (アマシャムネ： h) に従って測^ Tることが出来る。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キッ卜を用いて得られる化合物また はその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵 ^物、 細胞抽出液、 植％¾出液、 動物 抽出液、 «などから選ばれた 化合物であり、 本発明の夕ンパク質の機能を腿または阻 #Tる化合物である。
該化合物の塩としては、 謙己した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。 本発明のタンパク質の機能 （例、 ホスホジエステラーゼ活性、 より好ましくはホスホジェ ステラ一ゼ V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わされるァミノ g¾B列を る夕 ンパク質カ に Tるホスホジエステラーゼ活性、 c GMP活性など） を阻 る化合 物またはその塩は、 例えば、 循環器系疾患 （労作性および安 (冠 性狭' L お よび'異形狭' L^) 、 高 ώΐΙΞ、 うつ血性' 全、 肺高ioffi症、 ァテロ一ム ¾ί¾脈硬化症、 血管 開存性低下症、 血 t¾窄、 末梢血管疾患、 脳卒中など） 、 閉塞 «疾患 （慢性喘息、 気管支 炎など） 、 アレルギ 患 （アレルギー 息、 アレルギー性鼻炎、 じんましんなど） 、
Figure imgf000034_0001
ど） 、 糸球体疾患、 細管間質性 m、 腎不全、 糖尿病合併症、 緑内障、 ヒトを含むォスの哺乳觀物の勃起機能不全、 ヒト を含むメスの哺乳動物の雌性機能不全、 早産、 月経困難などの治療.予防剤などの医薬とし て有用である。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用レ ^て得られる化合物を上 述の治療 ·予防剤として麵する場合、 常套手段に従って ることができる。 例えば、 前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カブセリレ剤、 エリキシル 剤、 マイ
Figure imgf000034_0002
無菌性溶液、 議翻などとすることができる。
このようにして得られる製剤は で {g¾性であるので、 例えば、 ヒトまたは 物 ( 例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 遞 患、 投与鄉、 投与リ トなどによ り差異はあるが、 例えば、 循環器系疾患治療の目的で本発明のタンパク質の機能を阻 る 化合物を経口投与する場合、 Η¾的に成人 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき 該化合物を約 0. 1〜1 0 Omg、好ましく «勺 1. 0〜5 Omg、 より好ましく 0 〜2 0mg投与する。 非経口的に投与する齢は、 該化合物の 1回投与量は投与舰、 疾患などによっても異なるが、 例えば、 循環器系疾患治療の目的で本発明のタンパク質の機 能を阻 ¾Τる化合物を龍剤の形で通常成人 （6 O k gとして） に投与する 、 一日につ き該化合物を約 0. 0 l〜3 0mg 、 好ましく【お勺 0. 1〜2 OmgfiS、 より好まし く ¾ ¾0. 1〜： L O
Figure imgf000035_0001
り投与するのが好都合である。 他の動物の場合 も、 6 0 k g当たりに した量を投与すること力 きる。
(3) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する齢がある） は、 本発 明のタンパク質を特異的に認識すること力できるので、 被検波中の本発明のタンパク質の定 量、 特にサンドィッ 測定法による定量などに棚することが きる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 纖液およ 識化された本発明のタンパク質とを競合的に; ¾t、さ せ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする ¾ ^液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(i 0 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体およ 化された本発明の別の抗体とを 同時あるレ 的に反応させたのち、 不溶化担体上の標！^の活性を測 ¾ "ることを特徴 とする被検波中の本発明の夕ンパク質の定量法を提供する。
上記 (Π) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の Ν端部を認 i る抗 体で、 の抗体が本発明のタンパク質の c端部に反 ιίτする抗体であることが ましい。 また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクローナル 抗体と ¾ττる齢がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、
Figure imgf000035_0002
による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a l3' ) 2、 F a b'、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきものではな く、 翻鎌中の 量 （例えば、 タンパク質 *) に対応した抗体、 舰もしくは抗体—抗 原複合体の量を化 または物理的手段により検出し、 これを 量の ί¾ を含む標準液を 用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの 淀法を用いてもよい。 例 えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法力棚に用いら れるが、 感度、 特異性の点で、 るサンドイッチ法を用いるの力 ¾に好ましい。
物質を用いる測定法に用いられる^^としては、 例えば、 謝性同 酵素、 mm, ¾ ^質などが用いられる。 腿性同! ^素としては、 例えば、 c1 2 5 1〕 、 3 1 1〕 、 〔3 H〕 、 C 1 4 C] などが用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性 の大きなものが好ましく、 例えば、 3—ガラクトシダ一ゼ、 3—ダルコシダーゼ、 アルカリ フォスファターゼ、 パ一ォキシダ一ゼ、 リンコ WzK素酵素などが用いられる。 蛍 "6#i質と しては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる
。 ¾¾#J質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン などが用いられる。 さらに、 抗体あるいは ¾¾^と標 との結合にビォチン一アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常タンパク質あ るいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。 担体と しては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリ アクリルアミド、 シリコン等の合^^脂、 あるいはガラス等カ举げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に ¾ ^液を反応させ （ 1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクロ一ナル抗体を反応させ （2次反応） た のち、 不溶化担体上の 義の活性を測 ¾Tることにより被検波中の本発明のタンパク質量 を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なつ てもよいし時間をずらして行なってもよい。 ィ およ t 溶化の方法は嫌3のそれらに 準じることが きる。 また、 サンドイッチ法による赚測定法において、 固相用抗体あるい は標 抗体に用いられる抗体 ^ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる 等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明の夕ンパク質の測定法においては、 1次反応と 2次 反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパク質の結合する が相 異なる抗 ^好ましく用いられる。 すなわち、 および 2次反応に用いられる抗体は 、 例えば、 2 ;^¾ίΠ?用いられる抗体が、 本発明のタンパク質の C端部を認 る齢、 1 次反 iS 用いられる抗体は、 好ましくは C»¾n、 例えば N端部を認 る抗体が用いら れる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法 jewの測定システム、 例えば、 競合法、 ィ ムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いること力 きる。
競合法では、 碰液中の i¾iと標識 ¾ とを抗体に対して競合的に反応させたのち、 未反 < W m,(F) と、 抗体と給台した 識ぉ源 (B) とを分離し （B/F分 、 B， Fい ずれかの標 を測定し、 贿液中の 量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性 抗体を用い、 BZF分離をポリエチレングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用い る液相法、 および、 第 1抗体として固相ィ a¾体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性の ものを用い第 2抗体として固相ィ 体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 液中の ¾ と固相 il^ とを一定量の標識 体に対して 競合 させた後固相と液相を分 gl "るか、 あるいは、 被検波中の廳と翻量の標識ィ 体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相 と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検波中の ¾;源量を定量する。 また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは賺中で舰抗体反応の結果生じた不溶性の 講物の量を測 る。 纖液中の KM量が觀ゝであり、 少量の沈降物しカゝ得られない場合 にもレーザ一の散乱を禾幌するレーザ一ネフロメトリーなどが ffilに用いられる。
これら個々の免疫学 淀法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の言貌¾ ^、要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操 m¾に当難の通 常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な ίΤ ι手段の詳細については、 総説、 纏などを参照することが きる。
例えば、 入江 W 「ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 ロ4 9年発行） 、 入江
「続ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素 fe¾測定法 」 （医轉院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素敏測定法」 （第 21¾) (医^ *院 、 馳 5 7年発行） 、 石川離ら編 「酵素髓測定法」 （第 31¾) (医学書院、 昭和 6 2年 発行）、 rMethods i n ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Par t A) ) ¾ 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 7 (Immunochemical Techniques (Part 0)、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)) , 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Par t E : Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoc lonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行)などを参照す ることが^きる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質を感度良く 定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の^ ¾を定量することによって、 本 発明のタンパク質の Mmの増加カ¾出された 、 例えば、 循環器系疾患 （労作性および安
(冠纖性狭' および異形狭 、 高舰、 うつ血性 ' 全、 肺高厳症、 ァテロ一ム性動脈硬化症、 血管開存性低下症、 血管狭窄、 末梢血管疾患、 脳卒中など） 、 閉 疾患 （慢性喘息、 気管支炎など） 、 アレルギー '眺患 （アレルギー性喘息、 アレルギ Hi鼻炎、 じんましんなど） 、 消化管の麵性に特徴づけられる疾患 （過敏' Mi 離など ) 、 糸球 # ^患、 删管間質 14 ^害、、 腎不全、 糖尿病合併症、 緑内障、 ヒトを含むォスの哺 乳,物の勃起機能不全、 ヒ卜を含むメスの哺乳動物の itifi*機能不全、 早産、 月経困難など の疾病である、 または将 ¾¾ する可能性力稿いと診断すること力 きる。
また、 本発明の抗体は、 垂などの被検体中に る本発明のタンパク質を検出 するために舰することができる。 また、 本発明のタンパク質を精製するために使用する抗 体力ラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、 被検細胞内における本発 明の夕ンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
(4) 遺 診断剤
本発明の DNAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは^ Ifoft物 ( 例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DN A また ttmRNAの異常 （遺 異常） を検出することが きるので、 例えば、 該 DNAまた は mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加あるいは 発 ¾1多などの遣 診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺 謙は、 例えば、 自体 のノ一ザンハイブリダィ ゼ一シヨンや P C R— S S C P法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5巻， 8 7 4〜8 7 9頁 ( 1 9 8 9年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン シィズ ·ォブ ·ュ一エスエー (Proceedings of the Nat inal Academy of Sciences of the Uni ted States of America) , 第 8 6巻， 2 7 6 6〜2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） ） などにより ることが、できる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼ一ションにより該 mRNAの発 多力 出された齢 は、 例えば、 循環器系疾害、 （労作性および安^^' 攀縮性狭 および異形狭' « ) 、 高舰、 うつ血性 'L 全、 肺高雄症、 ァテローム髓脈硬化症、 血管開存性低下症、 血體窄、 血管疾患、 脳卒中など） 、 閉塞 ttM疾春、 （慢性喘息、 気 など） 、 ァレ ルギー舰患 （アレルギー性喘息、 アレルギー 炎、 じんましんなど） 、 消化管の誦性 に特徴づけられる疾患（過敏性 βなど） 、 糸球体疾患、 尿細管間質性疾患、 腎不全、 糖尿病合舰、 緑内障、 ヒトを含むォスの哺乳騰物の勃起機能不全、 ヒトを含むメスの哺 ¾ί¾物の Mi機能不全、 早産、 月経困難などの である可能性カ搞いと^^することがで きる。
( 5 ) アンチセンス DN Aを含有する医薬
本発明の DN Aに相補的に結合し、 該 DNAの発現を抑制すること力できるアンチセンス DNAは、 生体内における本発明のタンパク質または本発明の DNAの機能を抑制すること かできるので、 例えば、 循環器系疾患 （労作性および安 (冠攣縮性狭 'ί ^および 異形狭' 、 高 ώϋΞ、 うつ血性'!^全、 肺高 ώϋϊ^、 ァテローム Mi脈硬化症、 血管開存 性低下症、 血！ ¾窄、 末梢血管疾患、 脳卒中など） 、 閉塞 »疾患 （lift喘息、 気管 な ど） 、 アレルギー賊害、 （アレルギ 喘息、 アレルギ~^炎、 じんましんなど） 、 消ィ匕 管の S«i性に mづけられる疾 (過敏 ttKi離など） 、 糸球 ^^患、 翻管間質賊 、 腎不全、 糖尿病合離、 緑内障、 ヒトを含むォスの哺乳漏物の勃起機能不全、 ヒトを含 むメスの哺? LS]物の 機能不全、 早産、 月経困難などの治療.予防剤として^ fflすること か きる。
上記アン^ tンス DNAを上記の治療 ·予防剤として^ fflする 、 嫌己した本発明の D
NAを含 る各 @^の治療 ·予防剤と同様にして ること力 きる。
例えば、 該アンチセンス DN Aを用いる場合、 該アンチセンス DNAを単独あるいはレト ロウィルスべクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテッドウィルス ベクタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って ることができる。 該 アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認 められる担体とともに製剤 ί匕し、 遺 ίδ¾ゃ八ィドロゲルカテーテルのようなカテーテルに よって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 細胞における本発明の DNAの やその発現 兄を調べるための^ ^用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。 (6) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明の
る
»えべクタ一を提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の D N A転移動物と略記する） は、 未 卵、 卵、 軒およびその始原細胞を含む Ε¾胞 などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺 物の発生における胚発生の段階 （さらに好ましく は、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 パルス法、 リポフエクシヨン法、 マイクロインジェクション法、 パーティクル ガン法、 D EAE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作 出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の,、 胞など に目的とする本発明の外 *ttDNAを転移し、 細胞培養、 ffl^m養などに利用することもで き、 さらに、 これら細胞を ± の !∑¾胞と自体^ 0の細胞融合法により融合させることに より本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺 ¾ί¾物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モ ルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の 作成の面から個体発生および生物サイクルが比動短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 5 7 B LZ6系統， D BA 2系統など、 «系と して、 B 6 C 3 F 1系統， BD F 1系統， B 6 D 2 F 1系統， BAL BZ c系統， I C R系 統など） またはラット （例えば、 W i s t a r , S Dなど） などが好ましい。
哺孚 U¾物において発現しうる■えベクターにおける 「哺 物」 としては、 上記の非ヒ ト哺 物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性 DN Aとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNAではなく、 レ たん哺 物から戦 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異 など） 力生じたもの、 具体的には、 驢の働口、 欠損、 他の塩基への置換などが生じた DN Aなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DNAを意味し、 例えば 、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させる DNAなどが用いら れる。
本発明の外来性 D N Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来の ものであってもよい。 本発明の DN Aを対 ¾物に転移させるにあたっては、 該 DNAを動 物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Αコンストラクトとして用いるの カ^^に I〗である。 例えば、 本発明のヒト DNAを転移させる &、 これと相同性が ぃ 本発明の DN Aを有する各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス 夕一、 ラット、 マウスなど） 由来の DN Aを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発 明のヒト DNAを^した DNAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を 像哺? Li¾物の受 精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の DN A を高発現する DNA転移哺¾¾物を作出することが きる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプ ラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファージ、 モロニ一白血病 ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた « キュロウィルスなどの動物ゥ ィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドま た ί雄母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記の DN Α発現調節を行なうプロモータ一としては、 例えば、 ①ウィルス （例、 シミア ンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 ？ U ウィル ス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモーター、 （2洛種哺乳動物 （ヒ卜、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例 えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン 、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア難 ttM性タンパク質ク、 グルタチオン S —トランスフェラ一ゼ、 血小板由来成長因子; 3、 ケラチン K l , K 1 0および K 1 4、 コラ 一ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ i3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒 ¾抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウム禾 ij尿性因子、 内 皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノ シン 3リン酸化酵素 （N a , K-AT P a s e ) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォ ネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1垂インヒビ夕一、 MHCクラス 1 ( H- 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン 3—水酸化酵素、 甲觀ペルォキシダーゼ ( T P O) 、 ポリペプチド艇長因子 1 a (E F - 1 ) 、 βァクチン、 αおよび3ミオシン 重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 T h y— 1、 免 グロブリン、 H鎖 ¾K、部 (VN P) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン 、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロ モー夕一などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが 能なサイトメガロウィル スプロモーター、 ヒ卜ポリペプチド鎖延長因子 1 a (E F - 1 α) のプロモ一夕一、 ヒ卜お よびニヮトリ 3ァクチンプロモーターなど力 子適である。
上記べクタ一は、 D NA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R NAの転写を る配列 （ に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有していることが好ましぐ 例えば、 ゥ ィルス由来および各種哺¾¾物由来の各 D NAの配列を用いることが き、 好ましくは、 シ ミアンウィルスの S V 4 0夕一ミネタ一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 D N Αのスプライシング シグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの などをプロモーター領域の 5 '上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3 '下流に連結することも目 的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺¾¾物 （例えば、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状 ffl胞 、 ^1^3胞由来 DN Aおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリ一よりゲノム DN Aの全 てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状 MB胞、 繊薛細胞由来 RN Aより公知の 方法により調製された相補 D NAを原料として取得することが出来る。 また、 外撤の異常 DNAは、 上記の細胞また〖^^より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点 然変異誘 発法により変異した翻訳領域を作製すること力できる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 嫌己のプロモー ターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D NA工学的手法によ り作製すること力できる。
卵細胞段階における本発明の外 *½D NAの転移は、 據哺 物の 細胞および 側胞のすべてに ¾ τるように確保される。 DNA転難の作出動物の において 、 本発明の外通 DN Aが ることは、 作出動物の後代がすべて、 その J^^3胞および 胞のすべてに本発明の外 N Aを することを意味する。 本発明の外fettD N A を受け継いだこの種の動物の子孫はその 胞およ 細胞のすべてに本発明の外 D NAを "する。
本発明の外¾½1£常 DNAを転移させた非ヒト哺 物は、 により外 *¾DNAを安 定に^することを ¾ΐδして、
Figure imgf000044_0001
が出来る。
卵細胞段階における本発明の外 DNAの転移は、 難哺¾1¾物の 胞および 体細胞の全てに翻に? ¾Tるように確保される。 DNA転搬の作出動物の 胞にお いて本発明の外 ¾¾D N八カ¾1¾に ¾ETることは、 作出動物の子孫が全てその 胞ぉ よ 細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを に有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその ira^胞および体細胞の全てに本発明の外来 性 DNAを醒こ る。
導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この纖の動物を交 配することによりすべての子孫が該 D N Aを »jに "るように 代することが きる 本発明の正常 DNAを Tる非ヒト哺 ¾1¾物は、 本発明の正常 DN Αか 発現させられて おり、 内在性の正常 DN Aの機能を腿することにより驗的に本発明の夕ンパク質の機能 雄症を発 ることがあり、 その病態モデル動物として利用することが きる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能¾1症や、 本発明のタン パク質が関連する疾患の病 の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうこと 力河能である。
また、 本発明の外 5¾iE常 D NAを転移させた哺¾¾物は、 腿した本発明のタンパク質 の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリ 一二ング! ¾険にも利用可能である。 一方、 本発明の外 異常 DNAを る非ヒト哺? Lfl物は、 により外 *½DNAを に することを ¾|gして該 DNA保有動物として通常の飼 ¾ で継¾t¾ Tること が出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを前述のプラスミドに組み込んで原科として用い ることができる。 プロモーターとの DNAコンストラクトは、 通常の DNA工学的手法によ つて纏することが きる。 卵細胞段階における本発明の異常 DN Aの転移は、 纖哺 ？ Li¾物の胚^ a胞およ m ^胞の全てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動 物の E^ffl胞において本発明の異常 DN A力 "ることは、 作出動物の子孫が全てその胚 胞および体細胞の全てに本発明の異常 DNAを有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その JE¾胞およ 細胞の全てに本発明の異 常 DNAを ¾ る。 導入 DN Αを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 こ の «S¾の動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを有-するように繁 代するこ と力 きる。
本発明の異常 DNAを： る非ヒト哺学 Ll¾物は、 本発明の異常 DNAか 発現させられて おり、 内在性の正常 D N Aの機能を阻 ¾Tることにより ^^に本発明の夕ンパク質の機能 ^ ¾¾g 応症となることがあり、 その病態モデル動物として利用することができる。 例え ば、 本発明の異常 DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能^ Ι'β不応症の病 の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが 能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DN Α高発現動物は、 本発明のタンパ ク質の機能不活麵不応症における本発明の異常夕ンパク質による正常夕ンパク質の機能阻 害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 DNAを転移させた哺¾«1物は、 誦した本発明のタンパク質の 増加症状を ¾ ることから、 本発明のタンパク質の機能^ ί體不応症に対する治麟スク リーニング纖にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の DN Α転移動物のその他の禾 I佣可能性として、 例えば、 CM ^養のための細胞源としての使用、
②本発明の DN A転移動物の 中の DN Aもしくは RN Aを直接分析する力、 または DN Aにより発現されたタンパク質繊を分析することによる、 本発明のタンパク質により特異 的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
③ DNAを る繊の細胞を標準 ffi^養 ¾Τ術により培養し、 これらを fflして、 に 困難な からの細胞の機能の W¾、
④上 言 S¾の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、 および
発明の変異夕ンパク質を 製およびその抗体作製などカ垮ぇられる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症な どを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾¾の臨床症状を調べることが き、 また、 本発 明の夕ンパク質に関連する疾患モデルの各 «におけるより詳細な病理糊所見が得られ、 新しい治療 法の開発、 さらには、 該疾患による！^的疾患の職およ 療に貢献するこ と力 さる。
また、 本発明の DNA転移動物から各 ϋ§§を取り出し、 細切後、 トリプシンなどのタンパ ク質^ ^素により、 薩した DNA転移細胞の取得、 その培養またはその培 «胞の系統 化を行なうことが 能である。 さらに、 本発明のタンパク質産 胞の特定化、 アポトーシ ス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナル iSH 構を調べ、 それら の異常を調べることなどができ、 本発明の夕ンパク質およびその作用解明のための有効な研 ^才料となる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能 T¾體不応症を 含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、 上述の 法お よび定量法などを用いて、 ¾で舰な該疾患治麟のスクリ一ニング法を提供することが 可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物また ¾Φ発明の外来 I4DN A発現べクタ一を用 いて、 本発明のタンパク質が関連する疾患の DNA治療法を検討、 開発することが 能であ る。
( 8 ) ノックァゥ卜動物
本発明は、 本発明の DNAカ ¾性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明の DN A発現不全非ヒト ι¾¾Κ物を する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが^ ¾性化された非ヒト imSi物 E¾«、
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の 3—ガラクトシダーセ を導 入することにより^性化された第 ( 1 ) 項記載の Κ «、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1 ) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト 物がゲッ歯動物である第 （1 ) 項記載の膽細胞、
(5) ゲッ歯動物力マウスである第 （4) 項記載の麟細胞、
(6) 本発明の DNAが^ ¾性化された該 DNA発現不全非ヒト哺? Lft物、
(7) 該 DNAがレポ一夕一遣 feT (例、 §菌由来の ガラクトシダーゼ遺 βί) を導 入することにより^ S性化され 該レポーター遺 が本発明の DNAに対するプロモー夕 一の制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺学 LSI物、
(8) 非ヒト哺? Ll¾物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺? L¾物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺学 U¾物、 および
( 1 0) 第 （7) 項記載の動物に、 化合物を投与し、 レポ一夕一遺 の発現を検出す ることを難とする本発明の DNAに対するプロモーター活性を籠または阻 ¾Tる化合物 またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
本発明の DNAか^ ¾性化された非ヒト哺 物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺学 物力 る本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DN Aの発現能を抑制するか、 もし くは該 DN Aがコードしている本発明の夕ンパク質の活性を実質的に喪失させることにより 、 DN Aが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと ¾τΤることがある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をい う。
非ヒ卜哺乳動物としては、 fflf己と同様のものが用いられる。
本発明の DN Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺 エ^)手法により 該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または置換させることによって行なう ことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読み取り枠をずらしたり、 プロモー 夕一あるいはェキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト DNAを作製すれ ばよい。
本発明の DNA ¾性化された非ヒト哺? L¾物胚幹細胞 （以下、 本発明の DNA?f¾性 化 ES細胞また〖鉢発明のノックアウト ES細胞と略記する） の具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物カ^ "する本発明の DNAを単離し、 そのェキソン部分にネオマイ シン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐 tt¾伝子、 あるいは 1 a c Z (/3—ガラクトシダーゼ遺^) 、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフ ェラーセ を代表とするレポ一夕一遺 等を挿入することによりェキソンの機能を 破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺 の転写を させる DNA配列 (例えば、 poly A付加シグナルなど） を挿入し、完全なメッセンジャー RNAを合成できな くすることによって、 結果的に遺伝 fを破壊するように構築した D N A配列を する D N A 鎖 （以下、 ターゲッティングベクタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の 染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の DNA上あるいはその近傍の DNA配 列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいは夕一ゲッティングベクター 上の DNA配列と夕ーゲッティングベクター作製に使用した本発明の DNA以外の近傍領域 の DNA配列をプライマーとした PC R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を 避リすることにより得ることか きる。
また、 相同 »え ¾ ^により本発明の DN Aを 化させる元の ES細胞としては、 例え ば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kauf maの方法に 準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が^ fflされているが、 艘学的背景がはっきりしていないので、 これに 代わる純系で滅^]に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57BLZ6マウスや C57BL/6の採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善し た BDF 1マウス （C57BLZ6と DBAZ2との F 1) を用いて樹立したものなども良 好に用いうる。 BDF 1マウスは、 採卵数が多ぐ かつ、 卵が丈夫であるという利点に加え て、 C 57BL/ 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデル マウスを作出したとき、 C 57 B LZ 6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ 6マウスに代えること力河能である点で有利に用い得る。
また、 ES繊を樹立する齢、 ~«には魏後 3.5日目の胚垂を棚するが、 こ 外に 8細 胚を採卵し まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得 することが きる。
また、 纖いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通鍵の ES細胞の方が生縣列キメラ を作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を肖 I滅するためにもできるだけ早く雌 雄の判別を行なうことか * ましい。
ES細胞の纖の判 ¾ ^法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性決定領域の 遺 を増幅、 検出する方法が、 その 1例として挙げることができる。 この方法を麵すれ ば、 k.翻分析をするのに約 10 °個の細胞数を要していたのに対して、 1コロニー程 度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培 «I刀期における ES細胞の第一次セレクション を纖の判別で行なうこと力河能であり、 に删胞の選定を可能にしたことにより培養 初期の手間は大幅に肖 ϋ減できる。
また、 第 1セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 の確認 等により行うことが きる。 得られる ES細胞の染色 ^¾は正常数の 100%が ましいが
、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な齢は、 ES細胞の遺 をノックアウトした後
、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色碰が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングす ることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発生できる能 力を失いやすいので、 ^く継代培養することが'颇である。 例えば、 sTom のような適当なフィーダ一細胞上で L IF (1-10000 U/ml)存在下に炭酸ガス培養器 内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37でで培養するなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶 液（通常 0.001-0.5%トリプシン/ 0.1— 5mM EDTA、好ましく【お勺 0.1%卜 リブシン Z l mM EDTA)処理により糊胞化し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播 S-Tる方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1—3日毎に行なう力、 この際に細胞 の を行レゝ、 形態的に異常な細胞が見受けられた はその培■胞は;^することが まれる。
E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 塊を形 成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種々のタイプの細胞に分 化させることか^ ί能であり CM J. Evans及び \L R Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292 巻、 154頁、 1981年； G. R. Mart in プロシーディングス .ォブ 'ナショナル 'アカデミー •ォブ 'サイエンス 'ユーエスエー （Proc. Nat l. Acad. Sci. U. S. A. ) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジ一 'アンド 'ェクスぺ リメンタル ·モルフォロジ一、第 87巻、 27頁、 1985年〕 、本発明の E S細胞を分化させて 得られる本発明の D N A発現不^ ffl胞は、 インビトロにおける本発明の夕ンパク質の細胞生 ^^討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を用いて測定 して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別することが 能である。 該非ヒ卜哺乳動物としては、 嫌己と同様のものが用いられる。
本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製した夕ーゲッ ティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導入によりターゲッティ ングベクタ一の本発明の DNAが^ ¾性化された DNA配列力遺^相同 MMえにより、 マ ウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明の DNAと入れ換わる相同組換えをさ せることにより、 本発明の D N Aをノックアウトさせることができる。
本発明の DNAがノックァゥ卜された細胞は、 本発明の DNA上またはその近傍の DNA 配列をプローブとしたサザン八ィプリダイゼーション解析または夕一ゲッティングべク夕一 上の DN A配列と、 夕一ゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明の D NA の近^域の DN A配列とをプライマーとした P C R法による で判定すること力できる 。 非ヒト哺 ¾i¾物胚幹細胞を用いた齢は、 遺 相同繊えにより、 本発明の D N Aカ坏 活性化された β株をクロ一ニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト 物胚また に ¾λし、 讓したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト B ¾J¾物の子 宮に移itる。 作出された動物 tt!E常な本発明の DNA座をもつ細胞と人為的に変異した本 発明の DNA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生»胞の一部が 異した本発明の DN A座をもつ場合、 このようなキメ ラ»と正常 を 3¾することにより得られた より、 全ての,が人為的に変異を 加えた本発明の DNA座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等に より することにより得られる。 このようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパ ク質のへテロ発現不^ @体であり、 本発明の夕ンパク質のへテロ発現不^ 同志を 3¾し 、 それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることが きる。
卵細胞を翻する齢は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法で DNA溶 液を axすることにより夕一ゲッティングベクタ一を染色体内に導入したトランスジェニッ ク非ヒト哺? Li¾物を得ることが き、 これらのトランスジエニック非ヒト》 ?LI¾物に比べて 、遣 相同籠えにより本発明の DNA座に変異のあるものを選択することにより得られ る。
このようにして本発明の DN Aがノックァゥトされている個体は、 交配により得られた動 棚体も該 DNAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼育^^で飼 継代を行 なうことができる。
さらに、 生縣列の取得および赌についても常法に従えばよい。 すなわち、 該^ ¾化 N Aの保 る纖の動物を交配することにより、 該 化 DNAを相同染色体の両方に持 つホモザィゴ一ト を取得しうる。 得られたホモザィゴート動物は、 ¾»j物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 態で飼 ることにより効率的に得ること ができる。 ヘテロザィゴ一ト動物の雌雄を 3¾5することにより、 該 TO化 DNAを有するホ モザィゴー卜およびへテロザィゴート動物を繁 代する。
本発明の DNA力 ¾性化された非ヒト哺? U¾物胚幹細胞は、 本発明の DNA発現不全非 ヒ卜哺? U¾物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 本発明の DN A発現不全非ヒト哺 物は、 本発明のタンパク質により誘導され得 る種々の生物活性を欠失するため、 本発明の夕ンパク質の生物活性の不活性化を原因とする のモデルとなり得るので、 これらの舗の原因究明及 療法の検討に有用である。 本明細書および 面において、 驢ゃアミノ酸などを略号で表示する齢、 IUPAC- I UB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣 用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し 31 ^異性体があり得る 齢は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリ «酸
cDNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸
dATP デ才キシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デ才キシグアノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 パリン Leu ：ロイシン
I 1 e ：ィソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレ才ニン
Cy s ： ンスティン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸
L y s ： リジン
Ar g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
Phe ：フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
Tr p ： 卜リブ卜ファン
Pro ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
pG 1 u ：ピログリレ夕ミン酸
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
Ph フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) 一カルボキサミド基
To s p—トルエンスルフォニル
CHO ホルミル B z 1 ：ベンジル
C 12Bzl ： 2， 6—ジクロロべンジル
B om ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
C 1一 Z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r - Z 2—プロモベンジルォキシカルボニル
B o c t一ブトキシカルボニル
DN P ジニ卜口フエニル
T r t 卜 Uチル
B um tーブ卜キシメチル
Fmo c N- 9—フルォレニルメトキシカルボニリレ
HOB t 1一ヒドロキシベンズトリァゾ一ル
HOOB t 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1， 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB 卜ヒドロキシ- 5-ノルボルネン- 2， 3 -ジカルボキシイミド
D C C N, N' —ジシクロへキシルカルポジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1 ]
配列番号： 7で表される本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vのァミノ ¾@Ξ列を示す と実質的に同一のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 2]
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の Ν から 1 0 9個のアミノ酸が欠失している部分 アミノ«列を示す。
[配列番号： 3]
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードする DN Αの塩基配列を示す。
[配列番号： 4] SH^潘号： 2で表されるアミノ^ H列をコードする DNAの J^SE列を示す。
[配列番号： 5]
^の実施例 1において、 本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vをコードする DNA のクローニングに使用した合成プライマ一の 列を示す。
議番号： 6]
後述の ¾6S例 1において、 本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vをコードする DNA のクローニングに使用した合成プライマーの塩基配列を示す。
議番号： 7]
本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vのアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 8]
配列番号： 7で表されるアミノ^ Η列の から 109個のアミノ酸が欠失している部分 アミノ 配列を示す。
園番号： 9]
SH^iJ番号： 7で表されるアミノ^ H列をコードする DN Aの J^SB列を示す。
[配列番号： 10]
配列番号： 8で表されるアミノ^ B列をコードする DNAの塩基配列を示す。
舰の実施例 2で得られた形質繊体ェシェリヒア コリ（Escherichia coli)BL21/ PPDE51は、 平成 10年 7月 13日から通商産業省: Ιϋ術 命工学工業 i¾l¾Jf¾m (NIBH) に寄託番号 FERM BP— 6417として、 平成 10年 6月 18日力、ら財団 法人 · m ( I FO) に寄託番号 I FO l 6 l 85とし T¾託されている。 錢例
以下に、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそれに [^される ものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺^?操作法は、 モレキュラー 'クローニング （ Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 l ヒト肺由来ホスホジエステラーゼをコードする遺伝子のクローニング
cDNAのクロ一ニングは、 ジーントラッパ一ポジティプ選択システム （ギブコピーァー ルエル ¾) を用いて行った。
選択した大腸菌を培養後、 DNAを抽出し、 Thermo Sequenase Core Sequencing Kit (ァ マシャム ¾) を用いて跡を行ない、 SQ—3000 DNAシーケンサ一 （日立 ¾) によ り、 cDNA断片の mSSB列を決定した。 取得したクローンは、 配列番号： 9で表される 2 499個の^ SH^Jを含有する 3036個の^ SB列を有していた。 この c DNA断片には 、 配列番号： 7で表される 833個のアミノ酸からなる新規ホスホジエステラーゼ Vがコ一 ドされていた。 また、 公知のゥシ由来ホスホジエステラーゼ V (Linda M. McAllister ら J.Biol. Chem 268(30), 22863(1993) NCBI GenBank Accession No. LI 6545)とのアミノ酸レ ベルでの相同性は 92%であった。
本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vをコードする DN Aを保持するプラスミド PDE 50を^]の手法により、 菌 （Escherichia col i) DH10Bに導入して、 形質 ^体：^菌 （Escherichia col i) DH 10 BZp PDE 50を得た。 2 ^菌発現ベクターの構築
本発明のヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vをコードする c DNAを Ec oR Iと Xho Iで切断し、 同様に処理した pGEX4T— 2 (フアルマシア ¾) とライゲーシヨンした。 ライゲ一シヨン液を用いて «®BL21 (フナコシ tt) を形質転換し、 本発明のヒト肺由 来ホスホジエステラーゼ Vを発現する大腸菌 （Escherichia col i) BL2 l/pPDE51 を取得した。 3 ぇ型ヒト肺由来ホスホジエステラーゼ vの大腸菌での発現と精製
雄例 2で得られた:^菌 BL 21/PPDE51を用いて、 本発明の,え型ヒ卜肺由 来ホスホジエステラーゼ Vを取得した。 大腸菌での発現および精製は G S T Gene Fu s i on Sy s t ern (フアルマシア ¾t) 添付のプロトコ一ルに準じて行った。 その結果、 目的の約 1 OOkD aの組換え型ヒト肺由来ホスホジエステラーゼが 1 Lの大腸菌培養液か ら、 12. 5mg取得できた。 実施例 4 ヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vのホスホジエステラーゼ活性の検出
ヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vのホスホジエステラーゼ活性の検出は Phosphodiesterase [3H] cGMP SPA enzyme assay kit (アマシャム ¾) を用いて行った。 そ の結果、 実施例 2で得た酵素溶液にホスホジエステラーゼ活性が認められた。 また、 pGE X4T— 2を BL21に形質転換したものをコントロールとして用いたが、 これにはホスホ ジエステラーゼ活性は認められなかった。 無例 5 阻害剤麟系の!^
96穴プレート （OPT Iプレート、 パッカード ¾) に緩衝液 CO. 5M Tr i s-H C I (pH7. 5) 、 83mM MgC l2、 17mM EGTA) I O I、 実施例 3で 得られた謹え型ヒト肺由来ホスホジエステラーゼ V (0. 025mgXm 1 ) 10 1、
5 K 阻害剤サンプル 5 1、 [3H] c GMP 10 1を添加し、 30 にて 30分間反応した。反|»了後、 SPA be ad s赚〔18mgZml Yttrium silicate beads, 18mMZnS04) 50 1を添加し、 約 20分間、 室温で放置した後、 シンチレ ーシヨンカウンター （Topcoun t、 パッカード ¾) を用いて測定した。 娜加の場合 の放射活性 （1780 c pm) に対し、 組換え型ヒト肺由来ホスホジエステラーゼ Vを添加 した場合は、 10367 c pmの放射活性を示した。 この反応に各種濃度のホスホジエステ ラ一ゼ Vの阻害剤であるシルデナフィル （Drugs of Future, 22 (2) 、 1997) を添加 することによりホスホジエステラーゼ活性は阻害され シルデナフィルは約 2 nMでこの酵 素反応を 50%阻害した。 このことから、 本アツセィ系を用いて、 ホスホジエステラーゼ阻 害剤の探索が T能であることを確認、した。 実施例 6 阻割麵の雄 ¾6S例 5で設定した方法を用いて組換え型ヒト肺由来ホスホジエステラーゼ阻害剤の探索 を行った。 その結果、 多種類の化合物が阻害活性を示した。 その"^として下記の化 1で表 される構造を Tる化合物を挙げる。 本化合物は 2. 2 9 η Μでこの酵素反応を 5 0 %阻害 した。
化 1
Figure imgf000058_0001
艘上の利用可能性
本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性 （具体的にはホスホジエステラーゼ活 性、 より好ましくはホスホジエステラーゼ V活性、 さらに好ましくは、 配列番号： 7で表わ されるアミノ酸配列を有するタンパク質が特異的に有するホスホジエステラーゼ活¾) を促 進もしくは阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ングのための試薬として有用である。 さらに、 本発明のタンパク質に対する抗体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識すること か きるので、 被検液中の本発明のタンパク質の定量などに麵すること力 きる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配^!号： 7で表されるアミノ^ 5列と同一もしくは実質的に同一のァミノ m@5列を有 するタンパク質またはその塩。
2. 実質的に同一のアミノ,列が 1Ξ列番号： 1で表されるァミノ 列である請求項 1記 δ 載のタンパク質。
3. 寄託番号 F E RM B P— 6 4 1 7で表される:^菌中のプラスミド pPDE51 に麟さ れる c DNAにコードされる請求項 1記載のタンパク質。
4. ホスホジエステラーゼ活性を ¾ る請求項 1記載の夕ンパク質。
5. 配列番号： 7で表されるアミノ舰列の Ν から第 1ないし 1 0番目のアミノ酸配列 0 を含有することを とする請求項 1記載の夕ンパク質の部分べプチドまたはその塩。
6. 請求項 1記載のタンパク質または請求項 5記載の部分べプチドをコ一ドする塩基配列を ^ΤΤる D Ν Αを含 る D Ν Α。
7. 配 墦号： 9で表わされる塩基配列を有する請求項 6記載の DNA。
8. 請求項 6記載の DNAを含有する組換えべクタ一。
5 9. 大腸菌での発現べクタ一である請求項 8記載の■えべクタ一。
1 0. 請求項 8記載の,えベクターを する形質転換体。
1 1 . 宿主が ^菌である請求項 1 0記載の形質転換体。
1 2. 請求項 1 0記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質を 、 し め、 これを採取することを特徴とする請求項 1記載の夕ンパク質またはその塩の製造方法。0 1 3. 請求項 1記載のタンパク質、 請求項 5記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する 抗体。
1 4. 請求項 1記載のタンパク質、 請求項 5記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いる ことを特徴とする請求項 1記載のタンパク質、 請求項 5記載の部分べプチドまたはそれらの 塩のホスホジエステラーゼ活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニング5 方法。
1 5. 請求項 1記載のタンパク質、 請求項 5記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いる ことを とする請求項 1言 のタンパク質、 請求項 5記載の部分べプチドまたはそれらの 塩のホスホジエステラーゼ活性を■または阻 1 "る化合物またはその塩のスクリーニング 用キッ卜。
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