WO2000008053A1 - Proteine recepteur couplee a une nouvelle proteine g et son adn - Google Patents

Proteine recepteur couplee a une nouvelle proteine g et son adn Download PDF

Info

Publication number
WO2000008053A1
WO2000008053A1 PCT/JP1999/004233 JP9904233W WO0008053A1 WO 2000008053 A1 WO2000008053 A1 WO 2000008053A1 JP 9904233 W JP9904233 W JP 9904233W WO 0008053 A1 WO0008053 A1 WO 0008053A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
present
salt
ligand
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1999/004233
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Osamu Ohara
Takahiro Nagase
Nobuo Nomura
Shinichi Mogi
Koji Yamamoto
Tsutomu Kurokawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kazusa DNA Research Institute Foundation
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Kazusa DNA Research Institute Foundation
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kazusa DNA Research Institute Foundation, Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Kazusa DNA Research Institute Foundation
Priority to EP99935069A priority Critical patent/EP1103562A4/en
Priority to AU50651/99A priority patent/AU5065199A/en
Priority to CA002335648A priority patent/CA2335648A1/en
Publication of WO2000008053A1 publication Critical patent/WO2000008053A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein derived from human brain (G protein-coupled receptor protein) or a salt thereof, a DNA encoding the same, and the like.
  • G proteins conjugated guanine nucleotide-binding protein
  • M-receptor proteins seven-time M-receptor proteins.
  • the G protein co-receptor protein is present on the surface of living cells and various functional cells, and is a very good target for regulating the functions of these living cells and cells, such as hormones, neuronal ⁇ 3 ⁇ 4 substances, and physiologically active substances. Plays an important role.
  • the physiological functions of the brain are regulated under the regulation of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • substances are distributed to various parts of the brain, each of which regulates its physiological functions through the JiTT receptor protein.
  • W feii substances There are many unknown W feii substances in the brain
  • the structure of cDNA encoding the receptor Yuichi protein may not have been reported in many cases. Furthermore, it was unknown whether there was a subtype of «1 receptor Yuichi protein.
  • Clarifying the relationship between substances that regulate complex functions in the brain and their specific receptor proteins is a very important tool for drug development.
  • the remaining functions of the receptor proteins expressed in the brain must be elucidated and expressed appropriately. It had to be expressed in the system.
  • the present invention relates to a novel DNA (G protein-coupled receptor protein) derived from human brain, a partial peptide or a salt thereof, a DNA containing the DNA encoding the protein or a partial peptide thereof, A recombinant vector, a transformant transformed with a vector, an MB method for the protein or a salt thereof, an antibody against the protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, the protein (G protein A method for determining a ligand for a conjugated receptor protein (I), a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and the protein (G protein-coupled receptor protein), the screening kit, Binding between a ligand obtained by using a screening method or a screening kit and the protein (G protein-coupled receptor protein) Compound or its salt that changes, and the ligand and the protein compound is variable I inhibit the binding property between (G protein co transliteration receptions evening one protein) or etc.
  • a pharmaceutical agent compris
  • the present inventors have obtained a novel protein derived from human brain (G protein co- He decided to work on cDNA encoding the protein, and to base the entire nucleotide sequence. Then, when this base sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh secretion regions were confirmed on the 3 ⁇ 4 ⁇ plot, and the protein encoded by these cDNAs was translocated seven times. It was confirmed to be a G protein-coupled receptor protein. The present inventors have further stacked stones based on these findings, and have completed the present invention.
  • a protein G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • nucleotide containing the nucleotide sequence encoding the protein described in (1) (15) a nucleotide containing the nucleotide sequence encoding the protein described in (1), and (16) a part of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the protein described in (1). And other nucleotides.
  • the protein is the amino acid sequence represented by ⁇ @ 2 column number: 1; the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably: about! To about 30, more preferably 1 to ⁇ 9 mm, more preferably several ( ⁇ or 2) amino acids deleted amino acid sequence, 2 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably 1-30, More preferably, 1 to 10 S3 ⁇ 4, more preferably several (1 or 2) amino acids are cited by an amino acid sequence, @@ own sequence number: 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by ( Preferably, an amino acid sequence in which:! To 30, more preferably 1 to 10 ⁇ , and still more preferably several (1 or 2) amino acids are substituted with another amino acid; (1) which is a protein containing the combined amino acid sequence The protein or a salt thereof according to the above,
  • (22) (i) when the labeled ligand is brought into contact with cells containing the protein according to (1), and (ii) when the labeled ligand and the test compound are converted to the protein according to (1). Measure the amount of labeled ligand bound to the cells when they are brought into contact with the cells, and compare A method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding between a ligand and a protein or a salt thereof according to item (1);
  • a method for screening a compound or a salt thereof is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neurobeptidide, opioid, purine, vasopressin, Oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (basoactive intestinal and related polypeptide), somatosin, dopamine , Motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene-related peptide), leukotriene, pancreas, sutin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and 3-chemokine (eg, IL— 8, GROa, GRO] 3, GR pair
  • a compound or a salt thereof which can be obtained by the screening method according to any one of (20) to (27), which alters the binding property between the ligand and the protein according to (1) or a salt thereof,
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof that alters the binding property to the protein or a salt thereof according to (1);
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence deduced from the donkey sequence of the DNA encoding the human brain-derived G protein-coupled protein of the present invention obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows a hydrophobicity plot of the human brain-derived G protein-coupled protein of the present invention prepared based on the amino acid sequence shown in FIG. : The part indicated by! To 7 indicates the 7K sex domain.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence contained in ⁇ 4615.
  • the 1st to 2959th sequences correspond to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in FIG. 1 (continued from FIG. 4).
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence contained in # 04615.
  • the 2nd to 2959th sequences correspond to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in FIG. 1 (continuation of FIG. 3).
  • the protein of the present invention has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [the amino acid sequence represented by FIG. 1].
  • Receptor protein hereinafter, the protein of the present invention (G protein-coupled receptor protein) or a salt thereof may be abbreviated as the protein of the present invention).
  • the protein of the present invention can be used, for example, in any cells of humans and mammals (for example, guinea pigs, rats, mice, puppies, bushes, sheep, pits, monkeys, etc.). , Splenocytes, god cells, glial cells, knee cells, bone invertebrates, mesangial cells, Langeru relehan cells, cells, epithelial cells, endothelial cells, stria fibroblasts, mm, ⁇ vesicles, adipocytes, ⁇ m (e.g.
  • Macrophages ⁇ cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, eosinophils, eosinophils, occupations), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts Cells, breast cells, ffHffl vesicles or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, etc., and cells of the blood cell lineage (eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, WEH 1-3, HL—60, J OSK-1, K562, ML—1, M OLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT- HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP -1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01), or any of the fibers where
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, about 50% or more, preferably 70% or more, It is preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably an amino acid sequence having a homology of 95% or more.
  • the protein of the present invention having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 However, a protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • substantially the same activity examples include ligand binding activity and signal information iSi action. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the ligand binding activity and the signal information iSi action are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative analysis of these activities and the amount of protein Elements may be different.
  • Ligand binding activity and signal information Measurement of activities such as iSi action can be performed in accordance with the method of itself, but for example, ⁇ determining a mysterious ligand ⁇ measuring according to a screening method be able to.
  • 1 or 2 or more preferably 1 to 30 ⁇ , more preferably 1 to 10 ⁇ , even more preferably Is an amino acid sequence that has lost several (1 or 2) amino acids, (1 or 2 or more (preferably 1 to 30 amino acids apart from the amino acid sequence represented by the sequence number: 1;
  • An amino acid sequence to which 1 to 10 amino acids are added, more preferably several (one or two) amino acids, and one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by ⁇ 1 ⁇ Is an amino acid sequence in which one to ten, more preferably several (one or two) amino acids have been substituted with another amino acid; or Proteins containing the combined amino acid sequences are also used.
  • the protein of the present invention including a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 at the left end is N (amino, and S is C «(carboxyl) in accordance with the convention of peptide labeling,
  • the C-terminal is usually a carboxyl group (-C ⁇ H 1 j
  • R in the ester for example, methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl or n- butyl, for example, C 3, such as carboxymethyl Le cyclopentyl, cyclohexylene -.
  • cycloalkyl group for example, phenyl, C 6, such as ⁇ - naphthyl - 1 2 Ariru group, for example, a- naphthyl benzyl, such as phenylene Roux ( ⁇ _ 2 alkyl or ⁇ - naphth Rumechiru such phenethyl - ⁇ such as C Bok 2 alkyl groups such as 7 _ 1 4 Viva Roy Ruo carboxymethyl group fineness as ho force oral ester Ararukiru group is used.
  • a- naphthyl benzyl such as phenylene Roux ( ⁇ _ 2 alkyl or ⁇ - naphth Rumechiru such phenethyl - ⁇ such as C Bok 2 alkyl groups such as 7 _ 1 4 Viva Roy Ruo carboxymethyl group fineness as ho force oral ester Ararukiru group is used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, an ester such as the one described above (: * 3 ⁇ 4 is used.
  • the amino group of the N-terminal methionine residue in the protein described above is protected (for example, , A formyl group, an acetyl group, etc.), protected by N-IJ in vivo, a daltamyl group formed by pyroglutamine oxidation, and a substituent on the side chain of the amino acid in For example, 1 OH, 1 C ⁇ H, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc. ⁇ 1 Protecting group (for example, formyl group, acetyl group, etc. _ 6 acetyl group) Protected or complex proteins such as so-called glycoproteins with male chains attached are also included.
  • a human-derived (more preferably, human brain-derived) protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention may be any partial peptide of the protein of the present invention which has been hated.
  • the protein molecules those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • peptide containing a part that was analyzed as ⁇ Part A peptide containing a part that was analyzed as ⁇ ). Peptides containing hydrophobic WSL in ⁇ can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention may be at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention.
  • Rubeptide is preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence is at least about 50%, preferably at least about 70%, more preferably at least about 80%, still more preferably at least about 90%, most preferably at least about 90%
  • the amino acid sequence has a homology of 95% or more.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above. “Substantially the same activity” can be measured in the same manner as in MIS.
  • the partial peptide of the present invention has one or more (preferably 1 to: L 0 3 ⁇ 43 ⁇ 4, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the above amino acid sequence deleted. Or one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 or 2)) amino acids are added to the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably 1 to 10 3 ⁇ 43 ⁇ 4, more preferably 1 to 5 m. And still more preferably several ⁇ or 2) amino acids in the amino acid sequence It may be substituted.
  • the C-terminus is usually a carboxyl group (-COOH) or a carboxylate (one COO—).
  • the C-terminus has an amide (—CONH 2). ) Or an ester (_CO ⁇ R).
  • the partial peptide of the present invention has a N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected with a protecting group, and is formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • the C-terminus of the partial peptide of the present invention is usually a carboxyl group (-COOH) or carboxylate (_coo-).
  • the c-terminus is an amide (one-sided).
  • It may be C ONH 2) or an ester (one COR).
  • an acid addition salt which is particularly acceptable in physiology is preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, ass, phosphoric acid, odor is phosphoric acid, lime), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid,
  • inorganic acids eg, ass, phosphoric acid, odor is phosphoric acid, lime
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • salts with co-octanoic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid are used.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-described human or mammalian cells or fibers by a method known per se for purifying the protein, or a protein containing a DNA encoding the protein of the present invention described below.
  • the ability to cultivate transformants is also important.
  • the protein can also be produced by the protein synthesis method described later or according to the method.
  • the human or mammalian fibers or cells When using human or mammalian fibers or cells, the human or mammalian fibers or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography, ion-exchange chromatography and the like. Purification can be performed by combining Darafi.
  • resins for protein synthesis can be used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 —Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4— (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl) Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin and various protecting groups are added at the same time.
  • a disulfide bond formation reaction is carried out to obtain a target protein or an amide thereof.
  • carbopimides examples include DCC, ⁇ , ⁇ ′ -diisopropyl carbopimide, ⁇ -ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like.
  • the protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is activated in advance as an acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. After the process, it can be added to the resin.
  • a racemization inhibitor eg, HOBt, HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin may be selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulphoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate; And the like.
  • the reaction temperature is selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from about —20 ° (approximately: iGi in the range of ⁇ 50 ° C.
  • the obtained amino acid derivative is usually used in the form of 1.5 to 4i3 ⁇ 4ifij As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation ability is sufficient, it is sufficient to repeat the condensation reaction without removing the protecting group. When a sufficient condensation force is not obtained even after repeating the reaction, unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include, for example, Z, Boc, sulfuric acid pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z And adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • Carboxyl groups can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, Butyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc., linear, branched or cyclic alkyl esterification, aralkyl esterification (eg benzyl ester, Nitrobenzyl ester, 4-Methoxybenzyl ester, 4-methylbenzyl ester, Benzhydryl esterification), phenacyl esterification, Benzoxycarbonyl hydrazide formation, Yuichi Shari-butoxycarbonilyl hydrazide, Trityl hydrazide Power to protect by alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, Butyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl,
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or esterification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower alkanol groups such as acetyl group, arylyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzylyl group, a tetrahydroviranyl group, and a t-butyl group.
  • Examples of the protective group for the phenolyl phenolic acid group of tyrosine include Bzl, CI 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, Yuichi Sharybutyl and the like.
  • imidazole protecting group for histidine examples include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HOB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenolimide, and esteryl with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HOB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenolimide, and esteryl with HOBt.
  • activated amino group of the raw material for example, phosphoric acid amide is used.
  • Examples of the ⁇ ⁇ ( ⁇ ) method of the protecting group include a method of joining in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd-carbon, or an anhydrous fu! Acid treatment with iodine, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, or chloride with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc. Also, reduction with sodium in liquid ammonia is used. The desorption reaction by the above-mentioned acid treatment is performed by applying a force of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C. to H3 ⁇ 4 in the acid treatment.
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisole, methacresol, paracresol,
  • a cation scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, U-ethanedithiol, etc.
  • a cation scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, U-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is treated with thiophenol!
  • the formyl group used as the indole protecting group of tributophan is not only deprotected by acid treatment in the presence of 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanedithiol, etc., but also dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia ⁇ 3 ⁇ 4 is also obtained by alkali treatment.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be selected from the above group or the means of ⁇ 0.
  • a peptide (protein) chain is extended to a desired chain length on amino fiber U, A protein from which only the ⁇ -amino group protecting group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed and a protein from which only the protecting group at the carboxyl group at the C-terminal was removed were prepared, and both proteins were prepared as described above.
  • Condensate in a mixed solvent Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are ligated by the above-mentioned method to obtain a desired fig white matter. The crude protein is purified using various purification means, and the main fraction is dried and dried to obtain an amide of the desired protein.
  • the desired protein ester is obtained in the same manner as the protein amide. be able to.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be prepared by a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention and the remaining portion are reduced.
  • the product has a protecting group
  • the desired peptide can be obtained by removing the protecting group. Examples of the condensation method and the elimination of the protective group include the methods described below.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as, for example, a distillation method such as distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • a distillation method such as distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by the method of, or conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to an image by the method of be able to.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from abominable cell-fiber, cDNA library derived from abhorrent S-cell, and a synthetic DNA.
  • the vector used in the library may be a bacteriophage, a plasmid, a cosmid, a phagemid, or the like.
  • amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a DNA sequence comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under conditions of eight stringents.
  • Any protein can be used as long as it encodes a protein having an activity (eg, ligand binding activity, signal information action, etc.).
  • Examples of the DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. Most preferably, DNA containing a nucleotide sequence having about 95% or more homology is used.
  • Hybridization is carried out by a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can perform according to. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, the reaction can be carried out according to no-stringent conditions.
  • High stringent conditions include, for example, a sodium difficulty of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a jet of 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 6 5.
  • Conditions are particularly preferable. Particularly, it is most preferable that the amount of sodium is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
  • a nucleotide (oligonucleotide) comprising a base sequence encoding the protein of the present invention or containing a part of a base sequence complementary to the base sequence is a protein of the present invention or a portion thereof. It is used to include not only DNA encoding a peptide but also RNA.
  • an antisense 'oligonucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein ⁇ of the present invention has been cloned or determined. It can be designed and synthesized based on sequence information. Such (ori: i) nucleotides (nucleic acids) are capable of inhibiting the synthesis or function of the RNA of the G protein-coupled protein, and are capable of inhibiting the synthesis or function of the RNA. Controls and regulates the expression of G protein-coupled protein genes through interaction with related RNAs .
  • to means having homology or complementarity with a nucleotide, base sequence, or a specific sequence of pennic acid, including the residue ⁇ .
  • the term “pair” between a nucleotide, a base sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) generally refers to an amino acid of a peptide (protein) specified by a sequence derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. ing.
  • the translation region, the 3 'end palindrome region, and the 3' end hairpin loop can be selected as preferred inspection regions, but any region within the G protein-coupled protein can be selected as a target acid.
  • the relationship with at least the complementary (ori :) nucleotide in the region can be said to be "antisense" with the (ori :) nucleotide capable of hybridizing with the image.
  • Antisense-(ori :) nucleotides are 2-deoxy-D-report-containing polydeoxynucleotides, D-report-containing polydeoxynucleotides, N- of purine or pyrimidine bases.
  • Other evening polynucleotides that are daricosides or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds Polymers include base pairs that are found in DNAs and RNAs (including nucleotides having a configuration that permits the attachment of bases).
  • RNA hybrids as well as unmodified polynucleotides or unmodified oligonucleotides, and ⁇ with modifications, such as those with labels known in the art, caps, methylated, one or more natural nucleotides replaced by analogs , Nucleotides modified in the liver, such as those having non-bonds (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate , Such as proteins (nucleases, nucleases' inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides) Etc., those with side groups, such as those having an intercurrent compound (eg, acridine,
  • nucleoside may include those having other modified heterocyclic bases other than purine and pyrimidine bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other complex rings. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified in terms of a »moiety, for example, one or more hydroxyl groups have been replaced with octylogen or lunar groups, or functional groups such as ethers or amines. It may be converted to a group.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid.
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphoate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to oligonucleoside amides. .
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. In other words, it makes the antisense nucleic acid more stable in the cell, enhances the cell permeability of the antisense nucleic acid, increases the affinity for the target sense strand, and is toxic. If so, make the toxicity of the antisense nucleic acid smaller.
  • the antisense nucleic acids of the present invention contain altered or modified sugars, bases, or bonds. It can be given in the form of liposomes, microspheres, etc., can be converted by post-treatment, or can be given in the form of a pill. In the ⁇ -form, polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, enhance interaction with the human body, or increase only nucleic acids.
  • Lipids eg, phospholipids, cholesterol, etc.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.).
  • These can be attached to the 3 'end or the 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or internal nucleoside bond.
  • Other groups include capping groups that are specifically located at the 3 'end or the 5' end of nucleic acids to prevent ⁇ by nucleases such as exonuclease and RNase. Examples of such capping groups include hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol; ⁇ , but are not limited thereto.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the receptor protein.
  • the nucleic acid itself can be applied to cells by various methods known per se.
  • any DNA may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from abused cells 'filament fiber', cDNA library derived from abused cells 'filtration', and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be directly carried out by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • SEQ ID NO: 2 a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by 2
  • substantially the same activity as the protein peptide of the present invention eg, ligand binding activity, signal information transmission action, etc.
  • a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a protein having the same activity as the protein peptide of the present invention eg, ligand binding activity, signal information transmission action, etc.
  • Examples of the DNA capable of hybridizing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 70 or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, Preferably, DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 95% or more is used.
  • a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the protein of the present invention is used.
  • IlSij can be done by The hybridization method can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, the procedure can be performed according to the method described in the “Explanation of the shelf”.
  • Conversion of the nucleotide sequence of DNA can be performed using known kits such as Mutant TM -G (Takara Shuzo Co., Ltd.) and Mutant TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) using known methods such as the Gupped duplex method and the Kunkel method. It can be carried out according to a method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is or as desired by digestion with a linker, or by using a linker [I].
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ side and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ side. These translation initiation codon and translation termination codon can also be obtained using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the protein of the present invention includes, for example, (a) DNA encoding the protein of the present invention; A DNA fragment of interest is cut out from the DNA fragment, and (mouth) the DNA fragment is ligated downstream of the promoter in the appropriate expression vector.
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSH19, pSHl 5), pacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, noculovirus, etc., as well as pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, etc.
  • a plasmid derived from Escherichia coli eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast eg, pSH
  • any promoter may be used as long as it is appropriate for the host used for the expression of the target.
  • SRa promoter SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV Promoter and SRa promoter are preferred. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the trp promoter, 1 ac promoter, recA promoter, HI PL promoter, 1 pp promoter, etc., and if the host is a Bacillus genus, the SP ⁇ 1 promoter, In the case of SPO2 promoter, penP Promo Ichiichi, etc., if the host is the mainstay, PH05 promoter I, PGK promoter Yuichi, GAP promoter, ADH promoter etc. are preferred. When the host is a kon cell, polyhedrin promoter overnight, P10 promoter overnight, and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyAII signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori), if desired.
  • selectable markers include dihydro ⁇ enzyme (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) residue ⁇ 5 ⁇ [methotrexet (MTX) Mm, ampicillin ⁇ ! ⁇ '! 43 ⁇ 4 ⁇ ⁇ (hereinafter abbreviated as Amp) Neomycin resistance (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance [4]).
  • dh fr residue ⁇ 5 ⁇
  • MTX metalhotrexet
  • Amp Neomycin resistance
  • Neo Neo, G418 resistance [4]
  • a signal sequence suitable for the host is applied to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a Pho A signal sequence, an Omp A signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, a single amylase * signal sequence, a subtilisin MFa ⁇ signal sequence, SUC 2 ⁇ signal sequence, etc. when the host is an abundant host. Insulin signal sequence, ⁇ -integral feron signal sequence, antibody liver ⁇ when the host is an animal cell. Signal sequence etc. can be used for lij.
  • transformants can be transformed.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Notylus bacteria, yeast, vesicles, insects, animal cells and the like are used.
  • bacterium belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli Kl 2 ⁇ DH 1 [Processings of the national academy of the sciences of the ' pros . Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research], (Nucleic Acids Research), 9 volumes, 309 (1981)], J ⁇ 221 [Journal of Ob 'Molecular] 'Biology (Journal of Molecular Biology)], 120, 517 (1978)], HB 101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)).
  • Bacillus bacteria examples include, but are not limited to, Bacillus subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry], 95 , 87 (1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae A
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of a night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni,
  • High Five TM cells derived from Trichoplusia ni eggs, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea can be used.
  • viruses When the virus is BmNPV, Bombyxmori N (BmN cells) and the like are used.
  • Sf cells include, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, J.L., et al., In Vivo
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Neichiya (Nature)
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells
  • CH ⁇ cell CHO (hereinafter abbreviated as CH ⁇ cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CH
  • CHO (dhfr ⁇ ) cells mouse L cells
  • mouse AtT-20 mouse murine cells
  • rat GH3 human FL cells
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio Z Technology (Bio / Technology), 6, 47-55 (1988)). In order to transform animal cells, for example, Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Test Protocol. 263-2-267 (19995) (published by Shujunsha), Virology, Virology, 5 It can be carried out according to the method described in Vol. 2, 456 (1973).
  • a liquid medium is suitable as a culture medium, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources include, for example, glyrecose, dextrin, soluble '14 «, sucrose, etc.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonium: ⁇ , ⁇ salts, corn sip, lica, peptone, casein, meat extract, Inorganic or organic substances such as soybean meal and potato extract, and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast, vitamins, raw fiiSl factor and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a culture medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal 'Ob'Experiment'in'Molecular, etc.) Experiments in Molecular Genetics), 431-43, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3] 3-indolylacrylic acid can be added to make the promo work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or ⁇ ⁇ can be added.
  • the culture medium may be, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., "Procedures of the National Academy of Cultures”. S.A.C.Sci. USA, 77, 450 (1980) and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bi. t ter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (19), "Procedings of the National Academy of Sciences of the USA.”
  • I can do it. It is preferable to adjust the pH of the medium to 5-8. Cultivation ttffi Always perform at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and add aeration or if necessary.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is a kelp cell or an insect, the culture medium was 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TC, Nature, 195, 788 (1962)). It is used as an additive for blood drunk.
  • the ⁇ of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually carried out at about 27 ° C for about 3 to 5 days, with aeration and halving as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is a unicellular cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal calf serum [Seience, 122, 501 (1952)], D MEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium (Journal of the American Medical Association) 199, 519 (1967) )], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine], Vol. 73, 1 (1950)].
  • the pH is preferably about 6 to 8.
  • the culture is usually carried out at about 30 ° C. (about 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration is added.
  • the G protein-coupled protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by the method of ⁇ , suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave and lysozyme exchange. After the bacterial cells or cells are destroyed by centrifugation or freezing, a method of obtaining a protein effluent by centrifugation or filtration is appropriately used. Proteins such as urea and guanidine hydrochloride in the buffer A denaturing agent or a surfactant such as Triton X-100 TM . If the protein is secreted during the cultivation, after the cultivation, the cells or cells are separated from the supernatant by the method of itself ⁇ ], and the supernatant is collected.
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining separation and purification methods known per se.
  • the methods for separating and purifying these compounds are mainly the methods of salt solubility, such as the salt-solving method, dialysis, jump filtration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • K7K such as a method that uses the difference in charge, a method that uses the difference in charge, such as ion-exchange chromatography, a method that uses specific affinity, such as affinity mouth chromatography, and a reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method for determining the difference in isoelectric point such as a method using a sex difference for IJ, an electrophoresis method, or the like is used.
  • the protein obtained by force When the protein obtained by force is obtained in a free form, it can be converted to a salt by the method of itself or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in the form of a salt, It can be converted into the body or other salts by a method or a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the protein of the present invention or a salt thereof thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a different antibody, or the like.
  • the antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof. Is also good.
  • an antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention) can be prepared by using the protein or the like of the present invention as a protein and according to the antibody itself or the method of purification. Can be manufactured. [Preparation of monoclonal antibody]
  • the protein or the like of the present invention is present at a site capable of producing antibodies upon administration to a mammal.
  • Administered with ⁇ Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • ⁇ g was immunized »» j, for example, an individual with an antibody titer was selected from the mouse, and Mi or lymph nodes were collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing A hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer during purification can be performed, for example, by reacting the labeled protein of the present invention described below with ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , and then measuring the activity of the target i ⁇ bound to the antibody. it can.
  • the method of fusion operation for example, according to the method of Kayla and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • Sendai virus Preferably, PEG is used.
  • Bone lffi cells include, for example, NS-1, P3U1, SP2 / 0, etc., but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen storm cells) and the number of bone itm cells used is 1 ::! To 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 min.
  • Various methods can be used for screening of monoclonal antibody-produced ⁇ ipridomas.
  • the culture supernatant of a hybridoma on a solid phase eg, a microplate plate
  • a solid phase eg, a microplate plate
  • Antibody is used to detect monoclonal antibody bound to the solid phase, or to add a hybridoma culture supernatant to the solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed
  • a method for detecting a solid-phased monoclonal antibody by adding the protein of the present invention or the like labeled with an enzyme or the like may be used.
  • the monoclonal antibody can be prepared according to the method itself or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in an animal cell culture medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As Peri and Sffl media, any media can be used as long as hybridomas can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, 1 to: GIT medium containing 0% L fetal bovine serum (Wakuyaku Kogyo ( ) A serum-free medium (S FM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can also be used. The culture is usually at 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in 0M blue as described above.
  • Monoclonal antibody can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibody, as can the separation and purification of ⁇ ⁇ ⁇ globulin [eg, salting out method, alcohol method, etc., electrophoresis, electrophoresis, etc.
  • antibody transfer method eg, DEAE
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immune thigh (receptor protein and the like) and a carrier protein is formed, and the complex is administered to a mammal in the same manner as in the above monoclonal antibody i3 ⁇ 4i method. It can be obtained by collecting the antibody content and separating and purifying the antibody. 3 j
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and octapten are different from those of hapten immunized by cross-linking carrier.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently prepared.
  • Examples include weight-separation of serum albumin, thyroglobulin, keyhole limbet, hemocyanin, etc.
  • a method of pulling the hapten at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to one hapten is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, etc. are used.
  • the condensation product is administered to an animal at a site where antibody production is possible, by itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 HPgg.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the serum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separating and purifying 3 ⁇ 4globulin as in the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the protein of the present invention its partial peptide or a salt thereof, and the DNA encoding them are as follows: (1) Determination of the ligand for the protein of the present invention; Construction of protein expression system, ⁇ ⁇ Development of receptor binding system using the same expression system and screening of drug candidate compounds, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Drug design based on comparison with structurally similar ligands and receptors, (4) It can be used as a reagent for preparing probes and PCR primers for diagnostics, as a transgenic animal, or as a drug such as a preventive or therapeutic agent for HiS ⁇ .
  • a receptor binding assay system using the recombinant protein expression system of the present invention.
  • a protein, a partial peptide or a salt thereof of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter abbreviated as a DNA of the present invention)
  • the use of the antibody against the protein or the like of the present invention (hereinafter, sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) will be specifically described below.
  • the protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof is useful as a reagent for searching for or determining a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for a protein of the present invention, which comprises contacting a protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide or a salt thereof of the present invention with a test compound. .
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxotocin, PACAP, secretin, dalkagon, Calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Related Polypeptide), somatos, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGR P (Calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatastin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and —chemokine (eg IL_8, GR ⁇ a, GR ⁇ j3, GR ⁇ , NAP—2,
  • the ligand determination method of the present invention uses the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs a recombinant protein expression system, and uses the expression system to construct a receptor.
  • a cell stimulating activity eg, arachidone occlusion, acetylcholine substitution, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositollin
  • Compounds that have an activity of inhibiting or increasing the activity of raw, fine ⁇ potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH (14) (eg, peptides, proteins, non-peptide compounds) , Synthetic compounds, fermented products, etc.) or their salts are the methods to determine.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof is brought into contact with a test compound, for example, the binding of a test compound to the protein or the partial peptide, It is characterized by measuring its activity.
  • the present invention relates to a method for labeling a test compound, which is carried out when the test compound identified as H is transported to the protein or its salt of the present invention or the partial peptide or its salt of the present invention.
  • a method for determining a ligand for a protein or a salt thereof according to the present invention which comprises measuring a binding amount to the protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof;
  • test compound identified When the test compound identified is separated into cells or cells that contain the protein of the present invention, the amount of binding of the labeled test compound to the cells or 1 minute is measured.
  • test compound thus identified is transformed into a protein that is expressed on the cell surface by culturing a transformant containing the DNA encoding the protein of the present invention, the protein or the labeled test compound
  • the protein of the present invention is characterized in that the amount of binding to the salt is measured. How to determine the ligand for,
  • test compound when contacted with a cell containing the protein of the present invention, fine ⁇ properties via protein (e.g., Arakidon San ⁇ , acetylcholine release, intracellular C a 2 tau fireman's standard, intracellular c AMP Production, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.) Determining a ligand for the protein of the present invention or a salt thereof, wherein
  • a compound When a compound is brought into contact with a protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the protein of the present invention, cell-stimulating activity via the protein (for example, arachidone ⁇ ⁇ , Acetylcholine release, intracellular Ca 2+ «, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, fine potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, p And a method for determining a ligand for the protein of the present invention or a salt thereof, characterized by measuring the activity of promoting or suppressing H reduction.
  • test compound binds to the protein of the present invention.
  • the protein used in the ligand determination may be any of the protein of the present invention which has been hated or any protein which contains the partial peptide of the present invention. Revealed proteins are suitable.
  • the above-mentioned expression method is used for producing the protein of the present invention, but it is preferably carried out by expressing DNA encoding the protein in mammalian cells.
  • Complementary DNA is usually used for the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited to this.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce a DNA fragment encoding the protein of the present invention into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be expressed in a nuclear polyhedrosis virus (nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using an insect as a host).
  • polyhedrosis vi rus It is preferably incorporated into the downstream of a motor, a retrovirus promoter, a meta- mouth thynein promoter, a human heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SRa promoter, etc.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, it can be carried out according to the method described in »CNambi, P. et al.,“ The Journal of Ob ”, Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, pp. 19555-19559, 1992]. it can.
  • m cells when cells containing the protein of the present invention are used, m cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein of the present invention refers to a host cell that has expressed the protein of the present invention.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, kelp cells, animal cells, and the like are used.
  • the fine fraction refers to a fraction containing a large amount of fine particles obtained by the method of ⁇ 0 itself after cell disruption.
  • Cell crushing methods include crushing the cells with a Potter-Eehj em-type homogenizer, Warlinda blender ⁇ polytron (crushing with Kinematica, crushing with ultrasonic waves, and pressing the cells with a thin nozzle while pressing with a French press, etc. Centrifugal separation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used for fine fractionation.
  • the amount of protein of the protein cells and that in ⁇ Ru including ⁇ ⁇ the will, 1 0-1 0 8 minutes per cell It is preferably offspring, preferably from 10 5 to 10 7 liver.
  • the protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having the same activity as the protein fraction.
  • the equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal information iSi action, and the like.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer which does not inhibit the binding between the ligand and the protein of the present invention.
  • various proteins such as surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas ft), digitonin, and deoxycholate, serum albumin, and gelatin can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Laboratories), and peptide suptin can be added for the purpose of suppressing the receptor and the ligand ⁇ by the protease. . 0.01Ml ⁇ : to the receptions evening over a solution of L 0 m 1, a certain amount of (5000 c pm ⁇ 500000 c pm) [3 Eta], [1 2 iota], ⁇ 1 ⁇ C
  • a test compound having a count (B-NSB) of less than Ocpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from (ii) can be selected as a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof.
  • a solution for the protein of the present invention or a salt thereof is provided.
  • Intense activity eg, arachidone 3 ⁇ 4 » acetylcholine release, intracellular Ca wakefulness, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, cf os activity , Lower pH, etc.
  • E.g., activity to suppress or inhibit can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the protein of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Prior to ligand determination, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant. Quantify the product produced according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to the nitrogen contained in the cells, the inhibitor may be added to the cell to perform the assay. For activities such as suppression of cAMP production, For example, it can be detected as a production inhibitory effect on cells whose target production amount has been increased.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • the kit for determining a ligand that binds to the protein of the present invention or a salt thereof comprises the protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide of the present invention or a salt thereof, a cell containing the protein of the present invention, or a protein of the present invention. It contains the membrane fraction of the containing cells.
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C., 5% C02, 95% air for 2 days.
  • the ligand capable of binding to the protein of the present invention or a salt thereof includes, for example, substances specifically present in the brain, pituitary gland, kidney and the like.
  • angiotensin bombesin, canapinoid , Cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, two europeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxitocin, PACAP, secretin, Dal gongon, calcitonin, adrenomedullin, somatostin, GHRH, CRF, ACTH, GRP , PTH, VIP (basoactive intestinal and related polypeptide), somatostin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostag Langin, thromboxane, adenosine, adrenaline, a and i3—chemokines (eg, IL_8, GROa, GR ⁇ 3, GROr, NAP—2, ENA—78, PF4, IP10, GCP-2, M
  • the DNA encoding the protein of the present invention can be prevented or treated for the protein deficiency of the present invention in accordance with the action of the ligand. Can be used as a medicine.
  • a DN of the present invention or a DN encoding the protein of the present invention when there is a patient in whom the physiological action of a ligand cannot be expected due to a decrease in the protein of the present invention in vivo, (a) a DN of the present invention or a DN encoding the protein of the present invention.
  • A is administered to the patient and allowed to express, or the DNA encoding the protein of the present invention is inserted and expressed in the cells serving as the (mouth), and then the expression cells are transferred to the patient.
  • the protein of the present invention or a DNA encoding the protein is useful as a safe and low-toxic drug for preventing or treating the protein deficiency of the present invention.
  • the DNA of the present invention may be used as an occupational or retroviral vector.
  • an appropriate vector such as an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting uptake, by means of a catheter such as a gel or a gel catheter.
  • the protein of the present invention or (2) DNA encoding the protein may be orally coated as a capsule, an elixir, a microcapsule, etc., coated with sugar if necessary, or feK or a pharmaceutical thereof. It can be used parenterally in the form of an injectable solution, such as a sterile solution with an orally acceptable solution, or.
  • an injectable solution such as a sterile solution with an orally acceptable solution, or.
  • the DNA of the present invention together with a physiologically acceptable carrier, fragrance, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. is required for the implementation of the formulation identified in “ ⁇ ” in the form of a single infl. The amount of the 3 ⁇ 4 component in these can be adjusted so that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further added to the self-type material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as by dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .
  • Aqueous liquids for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants
  • leak-releasing agents such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), It may be used in combination with an ionic surfactant (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50).
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • TM polysorbate 80
  • HCO-50 ionic surfactant
  • oily liquid for example, sesame oil, oil and the like are used, and may be used in combination with a coalescing aid such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • the above-mentioned prophylaxis can be performed, for example, in the form of slow-moving U (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agent (eg, benzalkonidum chloride, intractable pro-in), and cheap (eg, human) Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added.
  • slow-moving U eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agent eg, benzalkonidum chloride, intractable pro-in
  • cheap eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants and the like may be added.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate inflation.
  • the preparations obtained in this way are safe and highly susceptible, for example, to humans and mammals (for example, rats, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • the dose of the protein of the present invention may vary depending on the subject of administration, the organ, symptom, administration method, etc. However, in the case of oral administration, in general, for an adult (as 60 kg), it is about 0% per day. lmg to 100mg, preferably about 1.0 to 5Omg, more preferably about 1.0 to 2Omg
  • Parenteral administration may vary depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc. For example, in the case of an injection, it is usually used in adults (as 6 O kg) per day. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 mg of Omggg per iv. For other animals, doses per 60 kg can be administered.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, about 0.1 l / day for an adult (as 6 O kg) is generally used. mg to; L 0 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg .
  • the single dose varies depending on the subject of administration, sm, symptom, administration method, etc.
  • the daily dose is About 0.01 to 3 O mgg ⁇ , preferably about 0.1 to 20 mg @ ⁇ , and more preferably about 0.1 to about: mg mg LO can be administered by intravenous injection. In the case of other animals, it is possible to administer the amount converted to 560 kg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to obtain a protein or a portion thereof of the present invention in humans or mammals (for example, rats, puppies, higgies, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Since abnormalities (genetical abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the peptide can be detected 10, for example, damages, mutations or decreased expression of the DNA or mRNA, and increases or excessive expression of the DNA or ttmRNA can be detected. Useful as a diagnostic agent.
  • the above-mentioned diagnosis using the DN ⁇ of the present invention can be performed, for example, by the method of Northern Eight hybridization or the PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879).
  • the protein or the like of the present invention has a binding property to a ligand, the ligand itS in vivo can be quantified with high sensitivity.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, by combining it with a competition method. That is, by bringing the sample into contact with the protein of the present invention, the concentration of the ligand in the sample can be measured. Specifically, for example, it can be used according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • a method for screening a compound that changes the binding property between the protein and the ligand of the present invention Using the protein or the like of the present invention, or constructing an expression system for a recombinant protein or the like, A compound that changes the binding 14 between a ligand and the protein of the present invention by using a binding system for the receptor (eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) Or the ability to screen its salts efficiently.
  • a binding system for the receptor eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.
  • Such compounds include (ii) G-protein sympathetic receptors (eg, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34
  • the present invention relates to (i) a case where the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand, and (ii) a protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof, and a ligand. And a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and a protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, wherein the comparison is performed with a case where the compound is brought into contact with the compound. I will provide a.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of binding of the ligand to the protein or the like and the activity of the cell I are measured and compared.
  • the present invention provides
  • the binding between the ligand and the protein of the present invention is determined by measuring the ratio. Screening method of a compound or a salt thereof,
  • the identified ligand was brought into contact with the cell containing the protein or the like of the present invention or the SIS of the cell, and the labeled ligand and the test compound were added to the cell containing the protein or the like of the present invention or the membrane of the cell.
  • a compound that changes the binding property between the ligand and the protein of the present invention which is characterized by measuring the amount of binding of the labeled ligand to the cell or the fraction in the case of fractionation and comparing the amount;
  • a screening method for the salt
  • the labeled ligand and the test compound are converted to the DNA of the present invention by contacting the recognized ligand with a protein or the like expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • a transformant containing the protein is cured by the protein of the present invention or the like expressed on the fine ⁇ by culturing, the amount of binding of the labeled ligand to the protein or the like is measured and compared.
  • a compound that activates the protein or the like of the present invention eg, a ligand for the protein or the like of the present invention
  • a cell containing the protein or the like of the present invention e.g, a cell containing the protein or the like of the present invention.
  • the test compound is transformed into cells containing the protein of the present invention, and the like, and the healing activity through the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine flattening, intracellular
  • a cell, fiber or a cell thereof containing a G protein-coupled receptor receptor protein such as a rat is used.
  • Obtain the inversion compound using the ⁇ ® component primary screening
  • Testing two-part screening was required. If cells, fibers or cell fractions were used as they were, other receptor proteins would also be present, so it was difficult to actually screen for agonists or target gonists against the desired receptor protein.
  • the human-derived receptor protein of the present invention by using the human-derived receptor protein of the present invention, primary screening is not required, and a compound that inhibits binding between a ligand and a G protein-coupled protein can be efficiently produced. Can be screened. Further, it is possible to easily determine whether the screened compound is an agonist or an engonist.
  • the protein or the like of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-described protein or the like of the present invention. Fine fractions of animals are preferred.
  • human-derived ⁇ ⁇ is extremely difficult to obtain, it is suitable to use, for example, a human-derived receptor protein expressed using a human body, etc. for screening. I have.
  • the above-mentioned method is used for producing the protein or the like of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in a mammalian cell or a cell.
  • Complementary DNA is used for a DNA fragment that encodes the protein portion of interest, but is not necessarily limited to this.
  • a residual fragment or synthetic DNA may be used.
  • DNA encoding the protein of the present invention In order to introduce the fragments into host cells and express them efficiently, the DNA fragment is required to be derived from the nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to the baculovirus using ⁇ as a host.
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • Polyhedrin Promoter "", Promoter from SV40, Retrovirus promoter, Meta-oral Thionine promoter, Human heat shock promoter, Cytomegalovirus promoter, SRa promoter, etc. Downstream
  • the amount and quality of the resulting receptor can be determined in a manner known per se. For example, i.
  • the protein or the like of the present invention may be a protein or the like purified according to the method itself, or may be a cell containing the protein or the like. Alternatively, a membrane fraction of a cell containing the protein or the like may be used.
  • the blasts may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to its own method.
  • the cell containing the protein or the like of the present invention refers to a host cell that expresses the protein or the like, and the host cell is preferably a bacterium, Bacillus subtilis, yeast, kelp cell, animal cell, or the like.
  • the fine fraction refers to a fraction containing a large amount of Hosoto obtained by crushing cells and then by a method known per se.
  • Cell crushing methods include crushing cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Warlinda blender ⁇ polytron (Kinematica ⁇ ⁇ ), crushing with ultrasonic waves, and pressing cells with a French press.
  • the crushing force caused by jetting the gas from a thin nozzle can be applied.
  • the fractionation by centrifugal force such as differential centrifugation and density gradient IS centrifugation, is mainly used for careful fractionation.
  • cell disruption is centrifuged at low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at high speed (1500 rpm). Centrifugation at ⁇ 300 000 rpm) for 30 minutes to 2 hours.
  • the fraction contains a large amount of expressed proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the protein of the protein or the like containing Ru cells Ya ⁇ a is preferably from 10 3 to 10 8 minutes terminal per cell, that is 10 J to l 0 7 liver are preferred.
  • the higher the expression level the greater the ligand binding activity per ⁇ minute (specific activity), which not only enables the construction of a highly sensitive screening system, but also enables the measurement of a large number of samples in the same mouth. become able to.
  • a naturally occurring Receptu Yuichi protein fraction or a Gansan II type Receptu Yuichi protein fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal information action, and the like.
  • labeled ligand As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used. For example [3 Eta], [1 25 I], [14 C], etc. Li ligand is labeled with like [35 S] used.
  • a protein preparation is prepared by adding the protein to a buffer suitable for the protein.
  • the buffer contains p
  • H4 Any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the protein, such as a phosphate buffer of 1 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer, may be used.
  • a phosphate buffer of 1 preferably pH 6 to 8
  • a tris-hydrochloride buffer may be used.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Ichi Atlas II), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer to reduce non-specific binding.
  • the specific binding amount (B-NSB) ) i For example, a test compound having a concentration of 50% or less can be selected as an inhibitory substance.
  • protein-mediated activity eg, arachidon ⁇
  • Acetylcholine release Intracellular Ca
  • Intracellular cAMP production Intracellular cGMP production
  • Inositol phosphate production Secretion potential fluctuation
  • Intracellular protein phosphorylation e.g., c-fos activation
  • Activity that promotes or suppresses a decrease in PH, etc. can be measured using known methods or a commercially available measurement kit.
  • cells containing the protein or the like of the present invention are cultured on a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. Then, the produced product is quantified according to each method. If the production of a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity (eg, arachidonic acid) is difficult due to the amount of the component contained in the cells, an inhibitor for the component is added to perform the assay. You may. In addition, activities such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity eg, arachidonic acid
  • cells that express appropriate proteins are required.
  • a cell line expressing the protein or the like of the present invention in a natural form, or a cell line expressing the aforementioned male-type protein or the like are preferable.
  • peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermented ⁇ M products, cell extracts, plant extracts, animal fiber extracts, etc. are used.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property of a ligand to the protein or the like of the present invention includes a protein of the present invention, a cell containing the protein or the like of the present invention, or a protein or the like of the present invention. And those containing the membrane fraction of the containing cells.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the solution may be sterilized by filtration through a 0.45 m filter and kept at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • C ⁇ cells G protein-coupled receptor protein (C ⁇ cells) expressing the protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 holes, and were cultured at 37, 5% CO 2 and 95% air. Cultured for days.
  • the ligand is dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (Sigma) so as to be ImM, and kept at 1-20.
  • a CHO cell expressing the protein of the present invention cultured in a 12-well set of nutrient plates is washed twice with 1 ml of a measurement buffer, and 4901 measurement buffer is added to each well.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between a ligand and the protein or the like of the present invention.
  • B Intense fibril activity via G-protein coupled receptor (eg, arachidon ⁇ » acetylcholine ⁇ , intracellular Ca 2+ » intracellular cAMP generation, intracellular cGMPm inositol phosphate production, (A so-called agonist against the protein of the present invention), which has an activity of causing or inhibiting cell potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of cfos, decrease in pH, and the like.
  • G-protein coupled receptor eg, arachidon ⁇ » acetylcholine ⁇ , intracellular Ca 2+ » intracellular cAMP generation, intracellular cGMPm inositol phosphate production, (A so-called agonist against the protein of the present invention)
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermented products. These compounds may be ttf-specific compounds, or may be known compounds.
  • the agonist against the protein or the like of the present invention has the same action as the physiological activity of the ligand for the protein or the like of the present invention, it can be used as a safe and low-toxic drug according to the ligand activity. Useful.
  • Angonist against the protein or the like of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand for the protein or the like of the present invention, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the ligand activity. .
  • the compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the protein of the present invention.
  • the compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the ligand for the protein or the like of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as a ⁇ M pharmaceutical thread, it can be carried out in a conventional manner.
  • a class, a capsule, an elixir, a microcapsule, a sterile solution, a suspension, and the like can be prepared in the same manner as the drug containing the DNA of the present invention that has returned.
  • preparations obtained in this way are safe and insoluble, they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, puppies, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the subject of administration, the symptoms, the administration method, and the like. However, in the case of oral administration, it is considered that "about 0.0 kg per day for adults (as 60 kg). 1 to: I 0 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg
  • the single dose is the subject, although it differs depending on the organs, symptoms, administration method, etc., for example, in the form of an injection, it is usually about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0 to 3 Omg per day for an adult (as 6 O kg). It is convenient to administer about 1 to 2 Omg by intravenous injection, more preferably about 0. 1 to about 1 Omg In the case of other animals, it is also possible to administer the amount per 6 Okg. it can.
  • the antibody of the present invention is capable of specifically recognizing the protein or the like of the present invention, it can be used for quantification of the protein or the like of the present invention in a test wave, particularly for quantification by a sandwich immunoassay.
  • the present invention provides, for example, (.i) reacting the antibody of the present invention with a test solution, a protein to be identified, or the like competitively, and measuring the ratio of the labeled protein or the like bound to the body.
  • a method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test solution
  • one antibody is an antibody recognizing the N-terminal of the protein or the like of the present invention and the other antibody is an antibody that is warped against the C-terminal of the protein or the like of the present invention.
  • the protein of the present invention and the like can be measured using a monoclonal antibody against the protein and the like of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and detection by fine staining or the like can also be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab ⁇ or Fab fraction of the antibody liver may be used.
  • the measurement method using the antibody against the protein or the like of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody or the antibody-viewing complex corresponding to the measured amount (eg, protein fi) during the night to be measured is measured.
  • Any method may be used as long as it is a method for detecting by a chemical or physical means, and calculating from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are suitably used, but a sandwich method is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • Radioactive elements for example, radioactive elements, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances and the like are used. Radioisotopes include, for example, 5 I],
  • I: 1 3 1 I], [3 H], C 1 4 C) can remain mosquitoes ⁇ like.
  • a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 3-S-galactosidase, ⁇ -dalcosidase, lipophosphatase, bar oxidase, and linco 7-enzyme are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, or the like is used.
  • quality for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ to the target.
  • insolubility of the antibody or the antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic fibers such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insoluble monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction the labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in reverse order, simultaneously, or at a different time.
  • the labeling agent and the method of insolubility may be the same as those of the self.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeled IHffl antibody does not necessarily need to be one type.
  • a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity, etc. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein or the like of the present invention.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably Is an antibody that recognizes the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a sandwich assay system, for example, a competitive assay, an immunometric assay, or a nephrometry.
  • a sandwich assay system for example, a competitive assay, an immunometric assay, or a nephrometry.
  • the competition method after ⁇ in the test wave and the labeled 3 ⁇ 43 ⁇ 4E are competitively reacted with the antibody, unreacted labeled ⁇ and (F) are separated from the labeled i3 ⁇ 4 (B) bound to the antibody ( (B / F separation) Measure the amount of labeling, B or F, and quantify the amount in the test wave.
  • a soluble antibody was used as the antibody, and BZF Separation is carried out by a liquid phase method using polyethylene glycol, a second antibody against the above antibody, or a solid-phased antibody is used as the first antibody, or the first antibody is soluble and is used as the second antibody.
  • This is referred to as a solid phase immobilization method using a phased antibody.
  • a solid phase and a liquid phase are separated after a source in a test wave and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, or 3 ⁇ 4 in the test wave is detected. And an amount of labeled antibody, and then immobilized i3 ⁇ 4 is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount in the test solution. In nephrometry, the amount of insoluble sediment generated as a result of a thigh antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of thigh in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, it is preferably used as a laser nef mouth meter utilizing laser scattering.
  • the protein of the present invention or a salt thereof is sensitive.
  • each protein can be diagnosed by quantifying the protein of the present invention or a salt thereof using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody probe used for purifying the protein or the like of the present invention detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, and analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells And so on.
  • Non-human animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, sea lions, cats, dogs, monkeys, etc.) (hereinafter abbreviated as animals). In particular, mice and egrets are solid.
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of expressing the DNA in animal cells.
  • a promoter capable of expressing the DNA in animal cells For example, when transferring the DNA of the present invention derived from Egret, homologous to the DNA construct of the present invention bound to downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from animals in animal cells, for example, DN
  • the promoter for example, a promoter derived from a virus or a ubiquitous expression promoter such as metallothionein may be used.
  • the NGF fragment or the enolase peptide which is preferably and specifically expressed, is used.
  • a motor or the like is used.
  • the transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured so that all of the germ cells and somatic cells of the animal can be obtained.
  • the fact that the protein or the like of the present invention is present in the germinal cells of the animal from which the DNA was produced means that all of the offspring of the produced animal will have the protein or the like of the present invention in all of its germ cells and gonococytes. I do.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the hereditary germ cells and cells all have the protein of the present invention.
  • the DNA-transferred animal of the present invention was confirmed to have a stable i3 ⁇ 4f by breeding. 00
  • A-bearing animal As an A-bearing animal, it is capable of performing rearing in a normal rearing environment. Furthermore, by crossing male and female animals that retain the target DNA, a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, all progeny have the DNA. Can be replaced.
  • the animal to which the DNA of the present invention has been transferred has high expression of the protein or the like of the present invention, and thus is useful as an animal for screening for an agonist or an angonisto against the protein or the like of the present invention. is there.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be used as a cell source for feeding.
  • the protein and the like of the present invention can be analyzed.
  • the cells of the fiber containing the protein or the like of the present invention are cultured by standard fiber cultivation ⁇ , and the functions of cells from fibers that are difficult to culture in HIS such as those derived from the brain or peripheral fibers can be used. Can be.
  • the protein or the like of the present invention can be produced therefrom.
  • RNA liponucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid dATP Deoxyadenosine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate
  • Tr t Trityl
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of human brain-derived S white matter of the present invention.
  • Example 1 The transformant Escherichia coli JM109, ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ obtained in Example 1 of the mouth was obtained from August 7, 1999 by the Ministry of International Trade and Industry Deposited with the Industrial Tissue Research Institute (NI BH) under the deposit number FE RM BP—6445.
  • NI BH Industrial Tissue Research Institute
  • Fig. 2 As a result of examining the hydrophobicity plot, the result was as shown in Fig. 2, and it was found that it encodes a seven-transmembrane (G protein-coupled) receptor. Further, a plasmid PHK04615 carrying a DNA encoding the protein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (the amino acid sequence represented by FIG. 1) was introduced into E. coli JM109, and E. coli JM109ZpHK04615 was introduced. Obtained. Industrial use
  • the G protein-coupled protein of the present invention is as follows: (1) Determination of ligand (agonist); (3 ⁇ 4Construction of expression system for replacement protein, 4Development of receptor assay system using the same expression system and pharmaceutical products «Screening of compounds, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Comparison with structurally similar ligand 'Recept Yuichi' Implementation of drug design based on the above, d Preparation of probes and reagents for PCR primers for diagnosis, ⁇ Preparation of transgenic animals or use as medicines for prevention, treatment, etc. it can.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質およびその DN A
漏分野
本発明は、 ヒト脳由来の新規蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） またはその塩お よび、それをコードする DNAなどに関する。
背景擺
多くのホルモンや神経伝達物質は、 細胞膜に存在する特異的なレセプ夕一蛋白質を通じて 生体の機能を調節している。 これらのレセプ夕一蛋白質の多くは共役している guanine nucleot ide-binding protein (以下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細 胞内のシグナル伝達を行ない、 また 7個の ^¾通領域を有する共通した構造をもっているこ と力ゝら、 G蛋白質共 ¾Mレセプター蛋白質あるいは 7回^ M通型レセプ夕一蛋白質と »さ れる。
G蛋白質共 ¾ レセプ夕一蛋白質は生体の細胞や の各機能細胞表面に存在し、 それら 生体の細胞や の機能を調節する好、 例えばホルモン、 神経 β¾物質および生理活性物 質等の標的として非常に重要な役割を担っている。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質 、 特には G蛋白質共 ¾ レセプ夕一蛋白質との関係を明らかにすることは、 各種生体の細胞 や ¾の機能を解明し、 それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供 することとなる。
例えば、 脳などの中枢神経系の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達物 質あるいは生理活性物質などによる調節のもとで脳の生理的な機能の調節が行なわれている 。 特に、 物質は脳内の様々な部位に し、 それぞれに対 JiTTるレセプ夕一蛋白質 を通してその生理機能の調節を行っている。 脳内には未だ未知の W feii物質も多ぐ その レセプ夕一蛋白質をコードする c DN Aの構造に関しても、 これまで報告されていないもの も多いと考えられる。 さらに、 «1のレセプ夕一蛋白質のサブタイプが るかどうかに ついても分かっていなかった。
脳における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一蛋白質との関係を明らか にすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセプ夕一蛋白質に対するァ ゴニス卜、 アン夕ゴニストを効率よくスクリーニングし、 医薬品を開発するためには、 脳内 で発現しているレセプター蛋白質の遺 の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現さ せることが必 であった。
近年、 生体内で発現している遺 を餅斤する手段として、 c DNAの配列をランダムに 解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D NAの断片配列が Expressed Sequence Tag (E S T) としてデータベースに登録され、 公開されている。 しか し、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能を推定することは困難である。 発明の開示
本発明は、 ヒト脳由来の新規蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） ， その部分ぺプ チドまたはそれらの塩、 該蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DN Aを含有する D NA、 該 DNAを含; る組換えベクター、 言¾|赚ぇベクターで形質転換された形質転換体 、 該蛋白質またはその塩の MB法、 該蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する 抗体、 該蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） に対するリガンドの決 法、 リガン ドと該蛋白質 （G蛋白質共役型レセプター蛋白質） との結合性を変ィ匕させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法もしくはス クリーニングキットを用いて得られるリガンドと該蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白 質） との結合性を変化させる化合物またはその塩、 およびリガンドと該蛋白質 （G蛋白質共 翻レセプ夕一蛋白質） との結合性を変ィヒさせる化合物またはその塩を含有してなる医薬な どを提供する。
本発明者らは、 fct職を重ねた結果、 ヒト脳由来の新規な蛋白質 （G蛋白質共翻レセ プ夕一蛋白質） をコードする cDNAを職し、 全塩基配列を餅斤することに颇した。 そ して、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、 第 1〜第 7隱通領域が ¾τΚ性プロ ット上で確認され、 これらの c DNAにコードされる蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役 型レセプター蛋白質であることを確認した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さら に石 を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含 ることを特徴とする蛋白質 （G蛋白質共役型レセプター蛋白質） またはその塩、
(2) 第 （1) 項記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
(3) 第 （1) 項記載の蛋白質をコードする塩基配列を有する DNAを含有する DNA、
(4) 配列番号： 2で表わされる塩基配列で表される塩基配列を る第 （3) 項記載の D NA、
(5) 第 （4) 項記載の DN Aを含 る,えべクタ一、
(6) 第 （7) 項記載の繊ぇベクターで形質転換された形質転換体、
(7) 第 （8) 項記載の形質転換体を培養し、 第 （1) 項記載の蛋白質を生成 ·蓄積せしめ ることを特徴とする第 (1) 項記載の蛋白質またはその塩の^ i法、
(8) 第 （1) 項記載の蛋白質もしくは第 (2) 項記載の部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体、
(9) 第 （1) 項記載の蛋白質もしくは第 (2) 項記載の部分ペプチドまたはその塩を用い ることを特徴とする第 (1) 項記載の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
(10) 第 （1) 項記載の蛋白質もしくは第 (2) 項記載の部分ペプチドまたはその塩を用 いることを特徴とするリガンドと第 （1) 項記載の蛋白質との結合性を変化させる化合物ま たはその塩をスクリーニングする方法、
(11) 第 （1) 項記載の蛋白質もしくは第 (2) 項記載の部分ペプチドまたはその塩含有 することを特徴とするリガンドと第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 (12) 第 （10) 項記載のスクリーニング方法または第 （11) 項記載のスクリーニング 用キットを用いて得られうる、 リガンドと第 (1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性 を変化させる化合物またはその塩、 ·
(13) 第 （10) 項記載のスクリーニング方法または第 (11) 項記載のスクリーニング 用キットを用いて得られうる、 リガンドと第 (1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性 を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(14) 第 （3) 項記載の DNAとハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする D NA、
(15) 第 （1) 項記載の蛋白質をコードする塩基配列を含 るヌクレオチド、 および (16) 第 （1) 項記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含有し てなるヌクレオチドなどを提供する。
より具体的には、
(17) 蛋白質が、 φ@2列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 ；!〜 30個程度、 より好ましくは 1〜9 mm ,さらに好ましくは数個 （ιまたは 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ② 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個 、 より好ましくは 1〜10個 S¾、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が 口したァミノ匿列、 @@己列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 ( 好ましくは、 ：!〜 30個 、 より好ましくは 1〜10個^、 さらに好ましくは数個 (1 または 2個） ) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または Φ¾·れらを組 み合わせたアミノ酸配列を含 る蛋白質である第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩、
(18) 第 （1) 項記載の蛋白質もしくはその塩または第 (2) 項記載の部分ペプチドもし くはその塩と、 iJ ^化合物とを接触させることを特徴とする第 （9) 項記載のリガンドの決 法、
(19) リガンドがアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グ ル夕ミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレ ッシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメ ジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VI P (バソ アクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン 、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレー ティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロン ボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび ;3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L_8、 GROa、 GR〇j3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP—1、 HC14、 MCP— 3、 1—309、 ΜΙΡ1 α、 MIP—1/3 、 RANT ESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシ ン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまたはガラニンである第 （9) 項記載のリ ガンドの決定方法、
(20) (i) 第 （1) 項記載の蛋白質もしくはその塩または第 (2) 項記載の部分べプチ ドもしくはその塩と、 リガンドとを搬させた場合と、 （ii) 第 （1) 項記載の蛋白質もし くはその塩または第 (2) 項記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドおよび試験化 合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする第 （10) 項記載のスクリー二 ング方法、
(21) (i) 標識したリガンドを第 （1) 項記載の蛋白質もしくはその塩または第 （2) 項記載の部分べプチドもしくはその塩に漏させた場合と、 (i 標識したリガンドおよび 化合物を第 （1) 項記載の蛋白質もしくはその塩または第 (2) 項記載の部分ペプチド またはその塩に接触させた場合における、 標識したリガンドの第 （1) 項記載の蛋白質もし くはその塩または第 (2) 項記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを とするリガンドと第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) (i)標識したリガンドを第 （1) 項記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場 合と、 (ii) 標識したリガンドおよび式験化合物を第 （1) 項記載の蛋白質を含^ Tる細胞 に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞に対する結合量を測定し、 比較する ことを徹とするリガンドと第 (1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(23) ( i ) 標識したリガンドを第（ 1 ) 項記載の蛋白質を含 #Tる細胞の薩分に嫌 させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を第 （1) 項記載の蛋白質を含有 する細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞の膜画分に対する 結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと第 （1) 項記載の蛋白質またはその 塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(24) (i) 標識したリガンドを第 （6) 項記載の形質転換体を培養することによって該 形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合と、 (ii) 標識したリガンドおよび 試験化合物を第 （6) 項記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細讓に 発現した蛋白質に觀させた場合における、 標識したリガンドの該蛋白質に対する結合量を 測定し、 比較することを特徴とするリガンドと第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩との結 合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(25) (i) 第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を第 （1) 項記載 の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩 を活性化する化合物および式験化合物を第 （1) 項記載の蛋白質を含^ Τる細胞に撤させ た場合における、 蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガン ドと第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
(26) 第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を第 （6) 項記載の形質 転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合と 、 第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物および ¾験化合物を第 （6) 項 記載の形質転換体を培養することによつて該形質転換体の細 «に発現した蛋白質に S»さ せた場合における、 蛋白質を介する細^ ij激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガ ンドと第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法、 (27) 第 （1) 項記載の蛋白質を活性化する化合物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロべプチ ド丫、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グ ルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 AC TH、 GRP、 PTH、 VI P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテツ ド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアス 夕チン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび 3— ケモカイン （chemokine) (例えば、 IL— 8、 GROa、 GRO]3、 GR〇ァ、 NAP— 2 、 ENA_78、 PF4、 I P10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP_3、 I -309, ΜΙΡ 1 α、 M I P— 1 /3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガス トリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまた はガラニンである第 （25) 項または第 (26) 項記載のスクリーニング方法、
(28) 第 （20) 項〜第 （27) 項記載のスクリーニング方法で得られうる、 リガンドと 第 （1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(29) 第 （20) 項〜第 （27) 項記載のスクリーニング方法で得られる、 リガンドと第
( 1 ) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させるの化合物またはその塩を含有す ることを とする医薬、
(30) 第 （1) 項記載の蛋白質を含有する細胞を含有することを特徴とする第 （11) 項 記載のスクリーニング用キット、
(31) 第 （1) 項記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴とする第 （ 11) 項記載のスクリーニング用キット、
(32) 第 （6) 項記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細謹に発現 した蛋白質を含 することを特徴とする第 (11) 項記載のスクリーニング用キット、 (33) 第 （30) 項〜第 （32) 項記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと第 (1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその (34) 第 （30) 項〜第 （32) 項記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 リガンドと第 (1) 項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその 塩を含 ることを特徴とする医薬、
(35) 第 （8) 項記載の抗体と、 第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分べプチ ドまたはそれらの塩とを ¾ させることを特徴とする第 （1) 項の蛋白質、 第 （2) 項記載 の部分べプチドまたはそれらの塩の定量法、
(36) 第 （8) 項記載の抗体と、 被検波およ 識化された第 （1) 項記載の蛋白質、 第
(2) 項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反応させ、 1¾¾体に結合した標 識化された第 (1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の割 合を測定することを特徴とする被検液中の第 （1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分 ぺプチドまたはそれらの塩の定量法、 および
(37) 被検波と担体上に不溶化した第 （8) 項記載の抗体およ ¾識化された第 （8) 項 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定 することを特徴とする被検液中の第 (1) 項記載の蛋白質、 第 （2) 項記載の部分ペプチド またはそれらの塩の定量法などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明のヒ卜脳由来 G蛋白質共役型蛋白質をコードする DNAの 驢配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
図 2は図 1に示したアミノ酸配列をもとに作成した、 本発明のヒト脳由来 G蛋白質共役型蛋 白質の疎水性プロットを示す。 ：!〜 7で示した部分は ¾7K性ドメインを示す。
図 3は ρΗΚ〇4615に含まれる塩基配列を示す。 図中第 1番目〜第 2959番目の配列が 図 1で記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当する （図 4に続く） 。
図 4は ΡΗΚ0461 5に含まれる塩基配列を示す。 図中第 2番目〜第 2959番目の配列が 図 1で記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当する （図 3の続き） 。 „
発明を実施するための最良の形態
本発明の蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質） は、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列 〔図 1で表されるアミノ酸配列〕 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するレセプ夕一蛋白質である （以下、 本発明の蛋白質 （G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 ) またはその塩を本発明の蛋白質と略記する場合がある） 。
本発明の蛋白質 （G蛋白質共翻レセプ夕一） は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モ ルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例 えば、 脾細胞、 神細胞、 グリア細胞、 膝臓 細胞、 骨翻胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲ リレハンス細胞、 細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 条纖芽細胞、 mm , β胞、 脂肪細胞 、 ^m (例、 マクロファージ、 τ細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好 中球、 好塩綱、 好酸球、 職） 、 巨核球、 滑麵胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨 細胞、 乳腺細胞、 ffHffl胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは ガン細胞など） や血球系の細胞 （例えば、 MEL, Ml, CTLL-2, HT— 2， WEH 1—3， HL— 60， J OSK- 1, K562, ML— 1, MOLT— 3， MOLT— 4, MOLT - 10， CCRF-CEM, TALL - 1， J u r k a t, CCRT— HSB— 2 ， KE— 37， SKW - 3, HUT - 78， HUT— 102， H9, U937, THP- 1 ， HEL， JK- 1, CMK， KO-812, MEG—01など） 、 またはそれらの細胞が るあらゆる繊、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 顧核、 M ,海馬、 ネ紘 職下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状 核、 脳染、 黒質） 、 誦、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生藤、 甲状腺、 胆のう、 骨髄 、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 i ,睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に 、 脳や脳の各部位） に由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば 、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 50%以上、 好ましく〖¾勺 70%以上、 より 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましく 約 9 0 %以上、 最も好ましく【お勺 9 5 %以上の 相同性を るアミノ酸配列など力 S挙げられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 る蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ ノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋 白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報 iSi作用などが 挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質であることを示す。 したがつ て、 リガンド結合活性やシグナル情報 iSi作用などの活性が同等 （例、 約 0. 5〜2倍） で あること力好ましいが、 これらの活性の や蛋白質の^ Ρ量などの量的要素は異なってい てもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報 iSi作用などの活性の測定は、 自体^ Πの方法に準じて 行なうことができるが、 例えば、 ί謎するリガンドの決定方法ゃスクリ一二ング方法に従つ て測 することができる。
また、 本発明の蛋白質としては、 ©SH列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個^、 より好ましくは 1〜1 0個^、 さらに好ましく は数個 （1または 2個） ) のアミノ酸力次失したアミノ酸配列、 （ϋ己列番号： 1で表わされ るアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個離、 より好ましくは 1〜1 0個 、 さらに好ましくは数個 （ 1または 2個） ） のァミノ酸が付加したアミノ酸配列、 (Β1Ξ列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 ；!〜 3 0個 . より好ましくは 1〜1 0個體、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ) のァミノ 酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または ® ^れらを組み合わせたアミノ酸配列 を含有する蛋白質なども用いられる。
本明細書における蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N （ァミノ 、 ¾Sが C« (カルボキシル である。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をはじめとする、 本発明の蛋白質は、 C末端が通常カルボキシル基 （― C〇〇H 1 j
) またはカルボキシレート（— C〇0_) であるが、 C末端がアミド （—C ONH2) または エステル （一 C OO R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては.、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロ ピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシ ルなどの C 3—8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6— 1 2ァリール 基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー (^_2アルキル基もしくは α—ナフチ ルメチルなどの a—ナフチル— C卜 2アルキル基などの〇7_1 4ァラルキル基のほ力 経口用 エステルとして細されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明の蛋白質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している 場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含ま れる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した (：*¾のエステルなど力用いられる。 さらに、 本発明の蛋白質には、 上記した蛋白質において、 N末端のメチォニン残基のアミ ノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの ァシル基など） で保護されて いるもの、 N纏 IJが生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸化したもの 、 内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一 OH、 一 C〇〇H、 アミノ基、 イミダゾ ール基、 インドール基、 グァニジノ基など） 力 ¾1当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの _6ァシル基など） で保護されているもの、 あるい〖雄鎖が結合したいわゆる 糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明の蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含 有するヒト由来 （より好ましくはヒト脳由来） の蛋白質などが用いられる。
本発明の蛋白質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する場合がある） としては、 嫌己した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 本 発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプ夕一結合活性を るものなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分ペプチドとし ては、 〔図 2〕 で示される ¾?K性プロット解析において細胞外領域 （ϋ*性 (Hydrophi l ic 1
) 部 ίί) であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 (Hydrophobic) WSL を^^に含むペプチドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチド も用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチドでも良い。
本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列の うち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のァミノ 酸配列を るべプチドなどが好ましレ
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは 約 9 5 %以上の相同性を るアミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同質の活性」 の 測定は MISと同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜： L 0個 ¾¾、 さらに好ましくは数個 ( 1または 2個） ) のァミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ) のアミノ酸が付加し、 または、 その アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個¾¾、 より好ましくは 1〜5 m . さらに好ましくは数個 αまたは 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて いてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 (- C OOH) またはカルボ キシレート （一 C OO— ) であるが、 前記した本発明の蛋白質のごとく、 C末端がアミド （ — C ONH2) またはエステル （_ C O〇R) であってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N末端のメチォ ニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した
Gin力 Sピログルタミン酸化したもの、 肝内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で 保護されているもの、 あるい〖嫌鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなど ち含まれる。 また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 (- C OOH) またはカルボ キシレート（_coo— ) であるが、 ΐ ΐ己した本発明の蛋白質のごとく、 c末端がアミド （一
C ONH 2 ) またはエステル （一C OO R) であってもよい。
本発明の蛋白質またはその部分べプチドの塩としては、 とりわけ生理^]に許容される酸 付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 驢、 リン酸、 臭ィは素 酸、 鍾） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレ イン酸、 コ八ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベ ンゼンスルホン酸） との塩などが'用いられる。
本発明の蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の細胞または繊から自体公知 の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、 後述する本発明の蛋白質をコードす る DNAを含 る形質転換体を培養することによつても ¾ϋすること力 ?きる。 また、 後 述の蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の繊または細胞から する場合、 ヒトゃ哺乳動物の繊または細胞を ホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン 交換ク口マトグラフィ一などのクロマトダラフィ一を組み合わせることにより精製 «する ことができる。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成に は、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば 、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル榭 脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルァ ミド樹脂、 4— (2' , 4' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4 - ( 2' , 4' -ジメトキシフエ二ル一 Fmocアミノエチル）フエノキシ樹脂などを挙げることができる 。 このような樹脂を用い、 ひ一ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的と する蛋白質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最 後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を!^し、 さらに高希釈溶液中で^ f内 ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的の蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用い ることができる力 特に、カルポジイミド類がよい。カルポジイミド類としては、 DCC、 Ν, Ν' - ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル -N' - (3-ジメチルァミノプロリル）カルポジイミド などが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOBt, HOOBt)と ともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 酸無水物または HOBt エステルあ るいは HOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添力 tr ることが'できる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 蛋白質縮合反応に使用 しうることが知られている溶媒から ¾iS択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムァ ミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチ レン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコ一 ル類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロ フランなどのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチ ル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの 31 ：の混合物などが用いられる。 反応温 度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から¾ 1択され、 通常約 — 2 0 ° (：〜 5 0 °Cの範囲から適: iGi択される。 活性化されたァミノ酸誘導体は通常 1 · 5〜 4i¾ifijで用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合力坏十分な場合には 保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができ る。 反応を繰り返しても十分な縮合力場られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダ ゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 Boc、 夕一シャリ一ペンチルォキシカルボ ニル、イソボルニルォキシカルポニル、 4ーメ卜キシベンジルォキシカルボニル、 C卜 Z、 Br- Z 、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二 トロフエニルスルフエニル、 ジフエ二ルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。 カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 夕ーシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロ ォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化） 、 ァ ラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一二トロべンジルエステル、 4—メト キシベンジルエステル、 4一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエ ナシルエステル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕一シャリ一ブトキシカルボ ニリレヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護すること力 きる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化または工一テル化によって保護することができる 。 このエステルイ匕に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低級アルカノィル基、 ベ ンゾィル基などのァロイリレ基、 ベンジルォキシカルボニル基、 エトキシカルボ二ル基などの 炭酸から誘導される基など力用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジリレ基、 テトラヒドロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノ一リレ 酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 CI 2-Bz l、 2—ニトロべ ンジル、 Br-Z、 夕一シャリーブチルなどカ佣いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4-メトキシ -2, 3, 6-トリメチ ルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum, Boc、 Trt、 Fmocなど力用いられ る。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水物、 アジド 、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2, 4, 5—トリクロロフエノ ール、 2， 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H0 B、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフ夕レイミド、 HOBt) とのエステリレ〕 などが用いら れる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対 るリン酸アミドが用い られる。
保護基の^ ¾ (β)方法としては、 例えば、 P d黒あるいは P d-炭素などの触媒の存在 下での水素気流中での接 元や、 また、 無水フツイ！ ^素、 メタンスルホン酸、 トリフルォ ロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、 ジィ ソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩 理 、 また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反 応は、 H¾に約— 2 0 °C〜4 0°Cの S¾で行なわれる力 酸処理においては、 例えば、 ァニ ソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフ イド、 1, 4-ブタンジチオール、 U-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が 有効である。 また、 ヒスチジンのィミダゾール保護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエ二 ル基はチオフエノール処理により！^され、 トリブトフアンのインドール保護基として用い られるホルミル基は上記の 1， 2-エタンジチオール、 1, 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸 処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても^ ¾される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは么 の基または^ 0の手段から »1択しうる。 蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ アミノ酸の α —カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ纖 Uにペプチド （蛋白質） 鎖を所望の 鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端の α—ァミノ基の保護基のみを除いた夕ンパク 質と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、 この両蛋白質を上 記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合 により得られた保護蛋白質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を絲し、 所望の fig白質を得ることができる。 この粗蛋白質 の各種精製手段を駆使して精製し、 主要 画分を 結乾燥することで所望の蛋白質のァミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ ¾アミノ酸のひ—カルボキシル基 を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白質のアミド体と同様にして 、 所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
本発明の蛋白質の部分べプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチドの合成法に従って、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによって M することができ る。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い 。 すなわち、 本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮 合させ、 生成物が保護基を る場合は保護基を脱 ることにより目的のぺプチドを することができる。 zム^]の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下 に記載 された方法が挙げられる。
① NL Bodanszky および M il Ondet t i , ペプチド シンセシス （Pept ide Synthesis), Intersc ience Publ ishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Pept ide) , Academic Press, New York (1965 年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の と実験、 丸善 (株） （1975年）
敏島治明おょ 原俊平、 生化^！験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 （1977年） (！庆島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ぺプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶馳出 '蒸留 'カラムクロマトグラフィー' 液体クロマトグラフィー .再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離する ことができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、 の方法によつ て適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 の方法によって画 体に変換することができる。
本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、 前述した本発明の蛋白質をコードする塩基 配列を含 るものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム D NAライブラリー、 嫌己した細胞 -繊由来の c DNA、 嫌 Sした細胞 '繊由来の c DN Aライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するべクタ一は、 バク テリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどレ、ずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より total R NAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T- P C R法と略称する） に よって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わ される塩基配列を含 る DNA、 または配列番号： 2で表わされる塩基配列と八イストリ ンジェントな条件下で八イブリダィズする塩基配列を有し、 本発明の蛋白質と実質的に同質 の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報 作用など） を る蛋白質をコードする D Ν Αであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 2で表わされる塩基配列と約 7 0以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含^ Tる DN Aな どが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキ ユラ一クロ一ニンク (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと力できる。 また、 市販のライブラ リ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好 ましくは、 ノ、ィストリンジェン卜な条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリゥム難が約 1 9 ~4 0 mM、 好まし く 約 1 9〜 2 0 mMで、 カ 勺 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5。(：の条件を示す 。 特に、 ナトリゥム難が約 1 9 mMで が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含 る蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を る DNAなどが用いられる。 本発明の蛋白質をコ一ドするの塩基配列を含 る、 または該塩基配列と相補的な塩基配 列の一部を含有してなるヌクレオチド （オリゴヌクレオチド） とは、 本発明の蛋白質または その部分べプチドをコ一ドする DNAを包含するだけではなく、 RNAをも包含する意味で 用いられる。
本発明に従えば、 本発明の蛋白質遺 β÷の複製又は発現を阻^ Tることのできるアンチセ ンス 'オリゴヌクレオチド （核酸） を、 クローン化したあるいは決定された蛋白質をコード する塩基配列の塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうした （オリ: i) ヌクレオチ ド （核酸） は、 G蛋白質共役型蛋白質遺 の RNAと八イブリダィズすること力でき、 該 RNAの合成又は機能を阻 ¾Τること力できるか、 あるいは G蛋白質共役型蛋白質関連 RN Aとの相互作用を介して G蛋白質共役型蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる 。 G蛋白質共 ί煙蛋白質関連 RN Aの選択された配列に相補的な （オリコ） ヌクレオチド、 及び G蛋白質共役型蛋白質関連 RNAと特異的に八イブリダィズすることができる （オリゴ ) ヌクレオチドは、 生体内及び生体外で G蛋白質^ 蛋白質遺伝子の発現を調節 '制御す るのに有用であり、 また病気などの治療又は診断に有用である。
用語 「対 る」 とは、 遺 β÷を含めたヌクレオチド、 塩基配列又〖嫩酸の特定の配列に 相同性を するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列又は核酸と ペプチド （蛋白質） との間で 「対 J»る」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列又はその相補 体から誘導される指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共 蛋白質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5， 端 6 _ベースペア'リピート、 5 ' 端非翻 訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 OR F翻訳開始コドン、 3， 端 非翻訳領域、 3， 端パリンドローム領域、 及び 3 ' 端ヘアピンループは好ましい檢領域と して選択しうるが、 G蛋白質共役型蛋白質遺 内の如何なる領域も対象として選択しうる 目赚酸と、 趣領域の少なくとも ~ ^こ相補的な （オリ： ) ヌクレオチドとの関係は、 像物とハイブリダィズすることができる （オリ: ) ヌクレオチドとの関係は、 「アンチセ ンス」 であるということができる。 アンチセンス - (オリ: ) ヌクレオチドは、 2—デォキ シ一 D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D—リポースを含有している ポリデォキシヌクレオチド、 プリン又はピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他の夕 イブのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば 、 市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を含 るその他 のポリマー （但し、 該ポリマーは DN Aや RN A中に見出されるような塩基のペアリナグゃ 塩基の付着を許 ¾fる配置をもつヌクレオチドを含 る） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本鎖 RNA、 1本鎖 RNA、 さらに DNA： RNAハイブ リッドであること力でき、 さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾ォリゴヌクレオチド、 さらには^ Πの修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キヤッ プの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した もの、 肝内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非 結合 （例えば、 メチルホスホネ ート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を 有する結合又は硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエー卜、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレア一ゼ'インヒビ夕一、 トキシン、 抗体 、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） など の側鎖基を有しているもの、 インターカレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレンな ど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放 I活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の 金属など） を含 るもの、 アルキル化剤を含 るもの、 修飾された結合を持つもの （例 えば、 ひァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチ ド」 及び 「核酸」 とは、 項とのプリン及びピリミジン塩基を含 るのみでなぐ 修飾され たその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化 されたプリン及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるいはその他の複 素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドはまた »分が修飾されていてよぐ 例えば 1個以上の水酸基が八ロゲンとか、 月旨脑基などで置 換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された核酸である。 修飾さ れた核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレ オシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの^に抵抗性のものカ举げられるが、 それに限 定されるものではなレゝ。 本発明のァンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されう る。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の 細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そ してもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており。 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al. ed. , Ant isense Research and Appl icat ions, CRC Press, 1993などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有し ていて良く、 リポゾ一ム、 ミクロスフエアのような赚な形態で^^されたり、 遺 治療 により翻されたり、 ¾ロされた形態で与えられること力できうる。 こうして働 α形態で用 いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリ カチオン体、 細謹との相互作用を高めたり、 核酸の みを増大せしめるような脂質 （例 えば、 ホスホリッピド、 コレステロールなど） といった ffi7性のもの力挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロロホ ルメート、 コール酸など） カ げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5， 端に 付着させることができ、 塩基、 糖、 内ヌクレオシド結合を介して付着させることができ うる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5， 端に特異的に配置されたキャップ用 の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 RN a s eなどのヌクレアーゼによる^を阻止するための ものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエ チレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙 げられる;^、 それに されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体外の遺 発現系、 あるいはレセプ夕一蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる 。 該核酸其れ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分ペプチドをコ ードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DN Α、 ゲノム DNAライブラリ一、 嫌己した細胞'糸纖由来の c DNA、 嫌己した細胞'糸滅 由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するべク 夕一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであっても よい。 また、 前記した細胞 ·組織より mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 RT- P C R法と略称する） によって増 幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 2 で表わされる塩基配列を る DNAの部分塩基配列を る DNA、 または 列番号： 2で表わされる塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする塩基配列を 有し、 本発明の蛋白質ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情 報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有する DNAなどが 用いられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列ハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2で表わされる塩基配列と約 7 0以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を る塩基配列を含 る DN Aなど が用いられる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明の蛋白質と略記する） を完全にコ ードする DN Aのクローニングの手段としては、 本発明の蛋白質の部分塩基配列を有する合 成 DNAプライマ一を用いて P C R法によって増幅する力 または適当なベクタ一に組み込 んだ DNAを本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼーションによって ilSijすることができる。 ハ イブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー 'クロ一ニング（Molecular Cloning ) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など に従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 '謝の棚説明 書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 のキット、例えば、 Mutant™-G (宝酒造（株） )、 Mutant ™-K (宝酒造 （株） ) などを用いて、 Gupped duplex法や Kunkel法などの自体公知の方法 あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された蛋白質をコードする DNAは目的によりそのまま、 または所望により制 隨素で消化したり、 リンカ一を働 [Iしたりして使用すること力できる。 該 DNAはその 5 ' 側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3 ' 側には翻訳終止コドンとし ての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止 コドンは、 適当な合成 DN Aアダプターを用いて ¾ΓΤることもできる。
本発明の蛋白質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明の蛋白質をコードする DNAか ら目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモ —夕—の下流に連 することにより することができる。 ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 PBR322, pBR325, pUC 12， pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUBl l O, pTP 5, pC 194 ) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSH19, pSHl 5) 、 λファージなどのパクテリオフ ァ一ジ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， ノ キュロウィルスなどの動物ウィルスなど の他、 pAl— 11、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RSV、 pcDNAI/Neo などが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺^の発現に用レ る宿主に対応して適切な プロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿主として用いる場合は 、 SRaプロモ一夕一、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 CMVプロモータ一 、 HSV- TKプロモー夕一などが挙げられる。
これらのうち、 CMVプロモー夕一、 SRaプロモーターなどを用いるの力好ましい。 宿 主がェシェリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 1 a cプロモーター、 r e c A プロモー夕一、 久 PLプロモーター、 1 ppプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SP〇1プロモーター、 SPO 2プロモーター、 penPプロモ一夕一など、 宿 主力聰母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプロモー夕一、 GAPプロモーター 、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆 細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモ 一夕一、 P 10プロモ一夕一などが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシグナル、 ポ リ A ¾シグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以下、 SV40o r iと略称す る場合がある） などを含有しているものを用いることができる。 選択マーカーとしては、 例 えば、 ジヒドロ^ 元酵素 （以下、 dh f rと略称する場合がある） 遺 ί5Τ 〔メソトレキ セ一ト （MTX) Mm、 アンピシリン ί!ί'!4¾β^ (以下、 Amp と略称する場合がある ) 、 ネオマイシン耐隨 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G418耐 [4) 等が挙 げられる。 特に、 CHO (dh f r ~) 細胞を用いて dh f r遺 を選択マーカーとして 使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N端末側に付力 PT る。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 Pho A ·シグナル配列、 Omp A ·シグナル配列 などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ一アミラ一ゼ*シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主力解母である場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグ ナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュリン.シグナル配列、 α—イン夕 一フエロン ·シグナル配列、 抗体肝 ·シグナル配列などがそれぞ l ij用できる。
このようにして構築された本発明の蛋白質をコードする DNAを含有するベクターを用い て、 形質転換体を i ^することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 ノ チルス属菌、 酵母、 昆 胞、 昆虫、 動物 細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) Kl 2 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ · ォブ 'ザ*ユーエスエー （proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60巻， 160 (1968) 〕 ， JM103 〔ヌクイレック .ァシッズ'リサーチ， (Nucleic Acids Research) , 9卷 ， 309(1981)〕， J Α221〔ジャーナル'ォブ'モレキュラー'バイオロジー（Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル ·ォ ブ ·モレキュラー ·ノィォロジ一， 41巻， 459(1969)) , C600 〔ジエネティッ クス （Genetics) , 39巻， 440(1954)) など力用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 ノチルス 'サチルス （Bacillus subtil is) MI 114 〔 ジーン， 24巻， 255(1983)〕 ， 207-21 〔ジャーナル'ォブ 'ノ イオケミスト リー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) A
H22, AH22R—， NA87— 11A, DKD-5D, 20B— 12、 シゾサッカロマ イセス ボンべ （Schizosaccharomycespombe) NCYC 1913， NCYC2036、 ピキ ァ パストリス （Pichia pastoris) などが用いられる。 昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、
Trichoplusia ni の卵由来の High Five TM細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞など力用いられる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株 ィ匕細胞 (Bombyxmori N； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J. Lら、 イン ·ヴイボ （In Vivo
) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 （Nature)
， 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, V ero, チャイニーズハムスター細胞
CHO (以下、 CH〇細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH
O (以下、 CHO (dh f r ~) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス AtT— 20， マウ スミエロ一マ細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などカ佣いられる。
ェシェリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル'アカデミー ·ォブ .サイェンジィズ .ォブ ·ザ ·ユーエスエー（Proc. Nat 1. Acad. Sci.
USA) , 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) ， 17巻， 107 (1982)など に記載の方法に従って行なうことができる。 ノ 'チルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキユラ—アンド 'ジエネラリレ 'ジェネティックス (Molecular & General Genetics
) , 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ'イン ·ェンザィモロジ一 （Methods in
Enzymology) ， 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシージングズ 'ォブ 'ザ 'ナ ショナル 'アカデミー.ォブ.サイェンシィズ ·ォブ ·ザ'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA) ， 75巻， 1929 (1978) などに記載の方法に従って行なうことができ る。
昆虫細胞また 虫を形質転換するには、例えば、バイオ Zテクノロジー（Bio/Technology ) ,6, 47-55(1988)) などに記載の方法に従って行なうことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工^ ϋ験プロトコール. 2 6 3 - 2 6 7 ( 1 9 9 5 ) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジ一 (Virology) ， 5 2巻， 4 5 6 ( 1 9 7 3)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 本発明の蛋白質をコードする DN Aを含貧する発現ベクターで形質転換 された形質転換体が得られる。
宿主が工シエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に麵され る培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒 素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グリレコース、 デキスト リン、 可溶 '14«、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム：^、 碰塩類、 コーンスチ一プ ·リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液など の無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生 fiiSl因子などを添 加してもよい。 培地の p Hは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Mi l ler) , ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンッ 'イン'モレキュラー •ジェ不ティックス (Journal of Experiments in Molecular Genet ics) ， 4 3 1—4 3 3 , Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2 ] が好ましい。 ここに必要によりプ ロモ一夕一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 ]3—インドリル アクリル酸のような薬 剤を加えること力できる。 宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 で 約 3〜 2 4時間行ない、 必要により、 通気ゃ辦を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜4 0°Cで約 6〜2 4時間行ない、 必要に より通気や ί ^を加えることもできる。
宿主が 母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホールダ一 ( Burkholder) 最小培地 [Bost ian, K. L. ら、 「プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー ·ォブ.サイェンシィズ 'ォブ ·ザ'ユーエスエー （Pro at l. Acad. Sci. USA) , 7 7巻， 4 5 0 5 ( 1 9 8 0)〕や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D培地〔Bi t ter, G. A. ら、 「プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ .ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィ ズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81巻， 5330 (19
84) 〕 カ举げられる。 培地の pHtt勺 5〜8に調 STるのが好ましい。 培養 ttffi常約 20 °C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や を加える。
宿主が昆細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. ,ネイチヤー (Nature) , 195, 788(1962)) に非動化した 10%ゥシ血 醉の添加物を ¾ ¾ロえたものなどが用いられる。 培地の ρΗは約 6. 2〜6. 4に調 るのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撤半を加 える。
宿主が 1¾物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 20 %の 胎児牛血清を含む MEM培地〔サイエンス （Seience) ， 122巻， 501 (1952)〕 ， D MEM培地〔ヴイロロジ一（Virology) ， 8巻， 396 (1959)) , RPMI 1640培 地〔ジャーナル'ォブ *ザ*アメリカン ·メディカル 'アソシエーション（The Jounal of the American Medical Association) 199卷， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージ ング'ォブ'ザ ·ソサイエティ 'フォー ·ザ'バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p H 約 6〜 8であるのが好ましレ 培養は通常約 30 ° (：〜 40 °Cで約 15-60時間行な レ、 必要に応じて通気ゃ»を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明の G蛋白質共役型蛋白質を生成せしめる ことができる。
上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法により行なうこ とができる。
本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 ^の方法で 菌体あるい ί細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸獨し、 超音波、 リゾチームおょぴンまた は凍結薩などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過により蛋白質の «出液を得る方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白 質変性剤や、 トリトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培 中に 蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体^]の方法で菌体あるい〖細胞と上清 とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、 自体公 知の分離'精製法を適切に組み合わせて行なうこと力できる。 これらの の分離、 精製法 としては、 塩^^溶獻澱法などの溶解度を禾棚する方法、 透析法、 跳ろ過法、 ゲルろ過 法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として^ の差を利用す る方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を禾 ij用する方法、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーな どの ¾7K性の差を禾 IJ用する方法、 等 電気泳動法などの等電点の差を禾拥する方法などが 用いられる。
力べして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体 の方法あるいはそれに準 じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合には自体么^]の方法ある いはそれに準じる方法により、 体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が 生する蛋白質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用さ せることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ ーゼ、 プロテインキナ一ゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明の蛋白質またはその塩の活性は、 標識したリガンドとの結合実験 およ 異抗体を用レゝたェンザィムィムノアッセィなどにより測^ rることができる。 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノ クローナル抗体の何れであつてもよい。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白質等と略記す る） に対する抗体は、 本発明の蛋白質等を舰として用い、 自体么 の抗体または ¾ΐώΐ清の 法に従つて製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明の蛋白質等は、 哺 物に対して投与により抗体産生力河能な部位にそれ自体ある レ ^は担体、 希！^とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイ ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜6週 毎に 1回ずつ、 計 2〜10回禾 SJ 行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル 、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよ びラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 ¾¾gを免疫された »»j物、 例えば、 マ ウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に Miまたはリンパ節を採 取し、 それらに含まれる抗体産 胞を骨t®細胞と融合させることにより、 モノクロ一ナ ル抗体産^ Aイブリドーマを調製することができる。 馳清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化した本発明の蛋白質等と ί¾ήι清とを反応させたのち、 抗体に結合した標 i ^の 活性を測 ¾τることにより行なうことができる。 融合操作 の方法、 例えば、 ケーラ一 とミルスタインの方法〔ネィチヤ一 （Nature), 256巻、 495頁（1975年） 〕 に従い "ることができる。 融合腿剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられる力 好ましくは P E Gが用いられる。
骨 lffi細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P3U1、 SP2/0などカ げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾嵐細胞） 数と骨 itm細胞数との 好ましい比率は 1 ： ：!〜 20： 1禾£¾であり、 PEG (好ましくは、 PEG1000〜PE G6000) が 10〜80%程度の濃度で添加され、 約 20〜40°C、 好ましくは約 30〜 37°Cで約 1〜； L 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産^ Λィプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法力使用できるが 、 例えば、 本発明の蛋白質等 を直接あるいは担体とともに吸着させた固相 （例、 マイク 口プレート） に八イブリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗 免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン 抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出 する方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培 養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明の蛋白質等を加え、 固相に し たモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の ϋ ^は、 自体^ Πあるいはそれに準じる方法に従って行なうことが できるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細 麵培地などで行なうことができる。 ¾¾リおよび Sffl培地としては、 ハイプリドーマが生 育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1 - 2 0 %, 好ましくは 1 0 〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R PM I 1 6 4 0培地、 1〜： L 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和 薬工業 （株） ) また ¾Aイブリドーマ培麵無血清培地 (S FM- 1 0 1、 日水製薬 （株） ) などを用いることができる。 培養 ^^は、 通常 2 0〜4 0°C、 好ましくは 約 3 7 である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養 は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記 のお 0M青中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクロナール抗体の精製
モノク口一ナル抗体の分離精製は、 通常のポリク口一ナル抗体の分離精製と同様に赚グ ロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール 法、 等鼇 法、 電気泳動法、 ィォ ン交換体 （例、 D EAE) による P遞着法、 織 去、 ゲルろ過法、 舰結合固相またはプ ロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を纏さ せて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうこと力できる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作
本発明のポリク口一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製 造することができる。 例えば、 免疫腿 （レセプ夕ー蛋白質等観） とキャリアー蛋白質と の複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の i¾i法と同様に哺乳動物に髓を行ない、 該^ ί¾物から本発明の蛋白質等に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なう ことにより^ tできる。 3 j
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、 キ ャリァ一蛋白質の種類およびキヤリァ一と八プテンとの混合比は、 キヤリァ一に架橋させて 免疫したハプテンに対して抗体が ¾)率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋さ せてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ·リンべ ット 'へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0. 1〜2 0、好ましくは約 1〜5の 割合で力プルさせる方法が用レ、られる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリ ジル基を含 る活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 動物に対して、 抗体産生が 能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈 剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバン 卜や不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜6週毎に 1回ず つ、 計約 3〜 1 0 HPgg行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは 血液から採取することができる。
脑清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測 定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様 の^ ¾グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質、 その部分べプチドまたはそれらの塩、 およびそれらをコ一ドする D N A は、 ①本発明の蛋白質に対するリガンドの決 法、 @¾体おょ0¾¾清の入手、 （^應え 型蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系の開発と医薬品候 補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似したリガンド .レセプターとの比較にもとづい たドラッグデザィンの実施、 ⑥遺 診断におけるプローブや P C Rプライマ一を作成する ための試薬、 ⑦卜ランスジエニック動物の作製または (H iS^予防 ·治療剤等の医薬などと して用いることができる。
特に、 本発明の組換え型蛋白質の発現系を用いたレセプ夕一結合ァッセィ系を用いること によって、 ヒ卜や哺乳動物に特異的な G蛋白質共役型レセプ夕一に対するリガンドの結合性 を変化させる化合物 （例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストなど） をスクリーニングすることが でき、 該ァゴニストまたはアン夕ゴニス卜を各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用するこ とができる。
本発明の蛋白質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白質等と略記する場 合がある） 、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） および本発明の蛋白質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体 と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。
(1) 本発明の蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト） の決定方法
本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩は、 本発明の 蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） を探索し、 または決定するための試薬 として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べプチドもしく はその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする本発明の蛋白質に対するリガンド の決 法を提供する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 力ナビ ノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 ダルカゴ ン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VI P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポ リペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGR P (カルシ卜ニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコ卜リエン、 パンクレアスタチン 、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび —ケモカ イン （chemokine) (例えば、 IL_8、 GR〇a、 GR〇j3、 GR〇ァ、 NAP— 2、 EN A— 78、 PF4、 IP10、 GCP— 2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 30 9、 MI PIひ、 MI P— l i3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン 、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまたはガラ ニンなど） の他に、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラッ卜、 ブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の繊抽出物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 纖抽出物 、 細胞培養上清などを本発明の蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドもしくは それらの塩を用いるか、 または組換え型蛋白質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ 夕一結合アツセィ系を用いることによって、 本発明の蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例え ば、 ァラキドン隱離、 アセチルコリン讓、 細胞内 C a 遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン 生、 細 β電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化 、 c— f o s活性化、 p Hの低下などを碰する活性または抑制する活' 14) を る化合物 (例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵^ g物など） または その塩を決 ¾Tる方法である。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明の蛋白質またはその部分べプチドと試験化 合物とを接触させた場合の、 例えば、 該蛋白質または該部分ペプチドに対する試験化合物の 結合 S^、 細鹏轍活性などを測 ¾Tることを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、 ®H識した試験化合物を、 本発明の蛋白質もしくはその塩ま た ί鉢発明の部分べプチドもしくはその塩に搬させた場合における、 標識した試験化合物 の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分べプチドもしくはその塩に対する結合量を測定す ることを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
(D^識した試験化合物を、 本発明の蛋白質を含 る細胞または翻胞の麵分に碰させ た場合における、 標識した試験化合物の細胞または ¾ 1分に対する結合量を測 ¾Tるこ とを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
@i 識した試験化合物を、 本発明の蛋白質をコードする DNAを含^ る形質転換体を培養 することによって細 «上に発現した蛋白質に させた場合における、 標識した試験化合 物の該蛋白質またはその塩に対する結合量を測定しすることを特徴とする本発明の蛋白質に 対するリガンドの決定方法、
@¾験化合物を、 本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 蛋白質を介し た細 撤活性 （例えば、 ァラキドン酸醒、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 τ纏、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細謹電位変動、 細 胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制す る活性など） を測定することを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの 決 去、 および
化合物を、 本発明の蛋白質をコ一ドする DNAを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現した蛋白質に接触させた場合における、 蛋白質を介する細胞刺激活 性 （例えば、 ァラキドン ^β、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 + «、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細 «電位変動、 細胞内蛋白質の リン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定することを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法を提 供する。
特に、 上言 の を行ない、 試験化合物力体発明の蛋白質に結合することを確認し た後に、 上言 の を行なうことが好ましい。
まず、 リガンド決 法に用いる蛋白質としては、 嫌己した本発明の蛋白質また【鉢発明 の部分べプチドを含有するものであれば何れのものであってもよいが、 動物細胞を用いて大 S¾現させた蛋白質が適している。
本発明の蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 該蛋白質をコードする DNAを哺乳動物細胞ゃ昆細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的とする 蛋白質部分をコードする DN A断片には、 通常、 相補 DNAが用いられるが、 必ずしもこれ に制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DNAを用いてもよい。 本発明の蛋 白質をコ一ドする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるために は、 該 DNA断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （ nuclear polyhedrosis vi rus； NPV) のポリヘドリンプロモ一夕一、 S V 4 0由来のプロ モーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモ一夕一、 ヒ卜ヒ一トシ ョックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R aプロモ一夕一などの下流 に組み込むのが好ましい。 発現したレセプ夕一の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行う ことができる。 例えば、 » CNambi, P. ら、 ザ'ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル ·ケ ミストリー （J. Biol. Chem. ) ， 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行 うことができる。
したがって、 本発明のリガンド決 法において、 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドま たはそれらの塩を含 るものとしては、 それ自体么^ Πの方法に従って精製した蛋白質、 そ の部分べプチドまたはそれらの塩であってもよいし、 該蛋白質を含 W "る細胞またはその細 月 画分を用いてもよい。
本発明のリガンド決 法において、 本発明の蛋白質を含有する細胞を用いる場合、 m 胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知 の方法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質を含有する細胞としては、 本発明の蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、 縮據胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆細胞、 動物細胞などが用いられる。 細 «®分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体 ^0の方法で得られる細«が多く含 まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Pot ter— E ehj em型ホモジナイザーで 細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン （Kinemat ica による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させるこ とによる破砕などカ げられる。 細纏の分画には、 分画遠心分離法や密度勾! ^心分離法 などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 ( 5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 ( 1 5 0 0 0 r pm〜3 0 0 0 0 r pm) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を麵分と する。 該 β分中には、 発現した蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多 く含まれる。
該蛋白質を含^ Τる細胞やその麵分中の蛋白質の量は、 1細胞当たり 1 0 〜 1 0 8分 子であるのが好ましく、 105〜107肝であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほ ど,分当たりのリガンド結合活性 （比活' 14)が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構 築が^!能になるばかりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する前記の (∑ Dの方法を実施する ためには、 適当な蛋白質画分と、 標識した試験化合物が必要である。
蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそれと同等の活性を有す る組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合 活性、 シグナル情報 iSi作用などを示す。 標識した試験化合物としては、 〔3H I〕 、 〔14C〕 、 〔 S〕 などで 標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 ノ ノプレツシン、 ォ キシトシン、 PACAP、 セクレチン、 ダル力ゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VI P (バソアクティブ インテスティナル アンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドぺプチ ド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデ ノシン、 アドレナリン、 《および )3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 IL— 8、 GRO a、 GRO/3, GRO了、 NAP— 2、 ENA-78, PF4、 I P10、 GCP— 2、 M CP— 1、 HC14、 MCP_3、 I一 309、 ΜΙΡ 1 α、 MI P_l /3、 RANTES など） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パ ンクレアティックポリぺプタイドまたはガラニンなどが好適である。
具体的には、 本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法を行なうには、 ま ず本発明の蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸 濁することによりレセプ夕一標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリスー塩酸バッファ一などのリガンドと本発明の蛋白 質との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減さ せる目的で、 CHAPS, Tween-80™ (花王—アトラス ft) 、 ジギトニン、 デォ キシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの各種蛋白質をバッフ ァ一に加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるリセプ夕ーやリガンドの^を抑 える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研^ f製） 、 ぺプス夕チンなどの プロテアーゼ阻害剤を添力 ΙΓΤることもできる。 0.01ml〜： L 0m 1 の該レセプ夕ー溶液 に、 一定量 （5000 c pm〜500000 c pm) の 〔3Η〕 、 〔1 2 Ι〕 、 ί1 ^ C
〕 、 i° °S) などで標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結^ * (NSB) を知る ために ΜΙの未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0でから 5 O ：、 望ましく【¾勺4でから37でで、 約 20分から 24時間、 望ましく【お勺 30分から 3 時間行なう。 反応後、 ガラス繊隹麵等で し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラ ス繊雜 に残 "する放 活性を ί夜体シンチレーションカウンターあるいはァ一カウン夕一 で計測する。 全結合量 (Β) から非特異的結合量 (NSB) を引いたカウント （B— NSB ) が Ocpmを越える試験化合物を本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二 ス卜） として選択することができる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリ
Figure imgf000039_0001
ためには、 該蛋白質を介する細鹏!！激活性 （例えば、 ァラキドン ¾»、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 Ca 「醒、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c-f osの活性化、 pHの低下などを
{©1する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測 定することができる。 具体的には、 まず、 本発明の蛋白質を含有する細胞をマルチウエルプ レー卜等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞 に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュ ペートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従 つて定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細 胞が含 る^素によって 困難な場合は、 該^素に対する阻害剤を添加してァ ッセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリン などで細胞の 的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出するこ とができる。
本発明の蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明の蛋白質もしく はその塩、 本発明の部分ペプチドもしくはその塩、 本発明の蛋白質を含有する細胞、 または 本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キッ卜の例としては、 次のものカ举げられる。
1. リガンド決定用試薬
定用緩衝液およ 争用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコネ！^) に、 0.05 %のゥシ血清アルブミン （シ ダマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4 で保 fるか、あるいは用時調製しても 良い。
② G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質標品
本発明の蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5X10 "個/穴で継代し 、 37°C、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 25 I〕 、 4C〕 、 [° °S] などで標識した化合物、 または 適当な方法で標識化したもの
7j溶液の;!え態のものを 4°Cあるいは— 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 M に希釈する。 水に難溶性を示 1ί式験化合物については、 ジメチルホルムアミド、 DMS〇、 メタノール等に溶解する。
④非標識隱化合物
標識化合物と同じものを 100〜 1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組 養用プレートにて培養した本発明の蛋白質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 490^ 1の測定用緩衝液を各穴に加える。 (DH識試験化合物を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るために は非標識試験化合物を 5 n 1加えておく。
③反 夜を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識試験化合物 を 0.2N NaOH— 1%SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
体シンチレ一シヨンカウン夕一 （ベックマンネ ±¾) を用いて放射活性を測定する。 本発明の蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとしては、 例えば、 脳、 下 垂体、 塍臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 二 ユーロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セ クレチン、 ダル力ゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VI P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラ ジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パ ンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 a および i3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L_8、 GROa、 GR〇 3、 GROr、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP - 1、 HC14、 MC P— 3、 I一 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 MI P— l i3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェ ンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ タイド、 ガラニンなどが用いられる。
(2) 本発明の蛋白質欠乏症の予防 ·治療剤
上記 (1) の方法において、 本発明の蛋白質に対するリガンドが明らかになれば、 該リガ ンドが有する作用に応じて、 本発明の蛋白質をコードする DN Aを本発明の蛋白質欠乏症の 予防 ·治 などの医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明の蛋白質が減少しているためにリガンドの生理作用が期待 できない患者がいる場合に、 （ィ） 本発明の蛋白質または本発明の蛋白質をコ一ドする DN Aを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） となる細胞に本発明の蛋 白質をコ一ドする DNAを挿入し発現させた後に、 言細胞を該患者に移 ¾Tることなどによ つて、 患者の体内における蛋白質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させること ができる。 したがって、 本発明の蛋白質または該蛋白質をコードする DNAは、 安全で低毒 性な本発明の蛋白質欠乏症の予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
本発明の蛋白質をコードする DNA (以下、 本発明の DN Αと略記する場合がある） を上 記予防 ·治麵として使用する場合は、 本発明の DN Aを職あるいはレトロウイルスべク 夕一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテッドウィルスベクタ一などの 適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の DNAは 、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺 や八イド口ゲルカテー テルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 ①本発明の蛋白質または②該蛋白質をコードする DNAは、 必要に応じて糖衣を 施した翻、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるい feKもしくはそ の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または などの注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明の DN Aを生理学的に認められる担体、 香 i 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに"^に認められた製剤実施 に要求される単iffl量形態で混和することによって^ tすることができる。 これら にお ける ¾成分量は された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
翻、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーン スターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油 またはチェリーのような香味剤などが用いられる。 調剤単位形態が力プセルである場合には 、 歸己タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含 ること力できる。 注射のための 無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる 。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液
(例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶漏助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピ レングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活'醜 （例、 ポリソルべ一ト 8 0 (TM) 、 HCO- 5 0) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 油などが用いられ、 溶纏助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併 用してもよい。
また、 上記予防 '治読は、 例えば、 緩翻 U (例えば、 リン酸驢衝液、 酢酸ナトリウム 緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 難プロ力インなど） 、 安 （例 えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルァ ルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液〖¾1常 、 適当なアンフレに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で ί«性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例え ば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与すること ができる。
本発明の蛋白質の投与量は、 投与対象、 対 «器、 症状、 投与方法などにより差異はある が、経口投与の場合、 Η¾的に成人（6 0 k gとして） においては、一日につき約 0. l mg 〜1 0 0mg、 好ましくは約 1 . 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O mgである
。 非経口的に投与する^ &は、 その 1回投与量は投与対象、 . 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人 （6 O k gとして） においては、一 日につき約 0. 0 1〜3 0mg離、 好ましくは約 0. l〜2 0mg 、 より好ましくは 約 0. 1〜： 1 Omgggを静脈注射により投与するの力好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに した量を投与することができる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異はある が、経口投与の場合、 的に成人（6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. l mg 〜； L 0 0mg、 好ましくは約 1 . 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 0 mgである 。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 sm, 症状、 投与方法など によっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人 （6 0 k gとして） においては、 一 日につき約 0. 0 1〜3 O mgg^、 好ましくは約 0. l〜2 0 mg@^、 より好ましくは 約 0. 1〜： L O mg髓を静脈注射により投与するの力好都合である。 他の動物の場合も、 5 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
( 3 ) 遺 診断剤
本発明の DNAは、 プローブとして細することにより、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明の蛋白質ま たはその部分ペプチドをコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出する 10 ことができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や 、 該 DNAまた ttmRNAの増加あるいは発現過多などの遺 診断剤として有用である。 本発明の DN Αを用いる上記の遺 診断は、 例えば、 自体^ Πのノーザン八イブリダィ ゼ一シヨンや P C R— S S C P法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5巻， 8 7 4〜8 7 9頁
( 1 9 8 9年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン l o ンっズ ·ォブ *ュ一エスエー (Proceedings of the Nat inal Academy of Sciences of the Uni ted States of America) ， 第 8 6巻， 2 7 6 6〜2 7 7 0頁 （1 9 8 9年） ） などにより実; ることができる。
(4) 本発明の蛋白質に対するリガンドの定量法
本発明の蛋白質等は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内におけるリガン 0 ド itSを感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることができる。 す なわち、 被検体を本発明の蛋白質等と接触させることによって被検体中のリガンド濃度を測 定することができる。 具体的には、 例えば、 以下の①または②などに記載の方法あるいはそ れに準じる方法に従って用いることができる。
5 ①入江 mil「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行）
②入江 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） ( 5 ) 本発明の蛋白質とリガンドとの結合性を変ィ匕させる化合物のスクリ一ニング方法 本発明の蛋白質等を用いるか、 または組換え型蛋白質等の発現系を構築し、 該発現系を用 レ こレセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 リガンドと本発明の蛋白質等との結 合 14を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵继物など） またはその塩を効率よくスクリーニングすること力 ?きる。
このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共 ί煙レセプターを介して細赚饊活性（例えば
、 ァラキドン m«、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a τ遊離、 細胞内 c AMP 、 細 胞内 c GMP生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細續電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C— f o sの活性化、 p Hの低下などを する活性または抑制する活性など） を るィ匕 合物 （いわゆる、 本発明の蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細 S棘 U激活性を有しない 化合物 （いわゆる、 本発明の蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 ひ、） リガンドと本発明の 蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の蛋白質との結合力 を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 前記したリガンド決定 方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。
すなわち、 本発明は、 ( i ) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩と、 リ ガンドとを接触させた場合と （i i) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩と 、 リガンドおよび 化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガン ドと本発明の蛋白質、 その部分べプチドまたはそれらの塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 ( i ) と （i i ) の場合における、 例えば、 該蛋 白質等に対するリガンドの結合量、 細 I撒活性などを測定して、 比 ることを特徴とす る。
より具体的には、 本発明は、
©f識したリガンドを、 本発明の蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試 験化合物を本発明の蛋白質等に機させた場合における、 標識したリガンドの該蛋白質等に 対する結 を測定し、 比^ rることを « [とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性 を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
識したリガンドを、 本発明の蛋白質等を含有する細胞または該細胞の SIS分に接触させ た^と、 標識したリガンドおよび ¾式験化合物を本発明の蛋白質等を含 る細胞または該 細胞の膜画分に させた場合における、 標識したリガンドの該細胞または該 分に対す る結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
® ^識したリガンドを、 本発明の DNAを含 Τる形質転換体を培養することによって細胞 膜上に発現した蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明 の DNAを含有する形質転換体を培養することによって細 β上に発現した本発明の蛋白質 等に ί癒させた場合における、 標識したリガンドの該蛋白質等に対する結合量を測定し、 比 ¾Τることを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリ一二ング方法、
④本発明の蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明の蛋白質等に対するリガンドなど ) を本発明の蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合と、 本発明の蛋白質等を活性化する 化合物および試験化合物を本発明の蛋白質等を含有する細胞に させた場合における、 レ セプ夕一を介した細麟癒活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン扁、 細胞内
C a 2 +薩、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活 性または抑制する活性など） を測定し、 比 ることを特徴とするリガンドと本発明の蛋白 質等との齢性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
⑤本発明の蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明の蛋白質等に対するリガンドなど ) を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによつて細 β上に発現した本発 明の蛋白質等に ί纖させた場合と、 本発明の蛋白質等を活性化する化合物およ 式験化合物 を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによつて細 β上に発現した本発明 の蛋白質等に接触させた場合における、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン^ ϋΙ、 アセチルコリン画、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c G i r
45
MP«、 イノシト一ルリン β生、 細 «電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f ο sの活性化、 p Hの低下などを «する活性または抑制する活性など） を ij定し、 比 ¾ "する ことを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変ィ匕させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法を提供する。
本発明の蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプ夕一ァゴニストまたはアン夕 ゴニストをスクリ一ニングする場合、 まずラットなどの G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を 含む細胞、 繊またはその細 β®分を用いて翻化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実際にヒ卜の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合 を阻 ¾ るか否かを確認する試験 （二欠スクリーニング） が必要であった。 細胞、 繊また は細胞 分をそのまま用いれば他のレセプ夕一蛋白質も混在するために、 目的とするレセ プター蛋白質に対するァゴニストまたはアン夕ゴニストを実際にスクリ一ニングすることは 困難であった。
し力 ^しながら、 例えば、 本発明のヒト由来レセプ夕一蛋白質を用いることによって、 一次 スクリ一ニングの必要がなくなり、 リガンドと G蛋白質共役型蛋白質との結合を阻害する化 合物を効率良くスクリーニングすることカできる。 さらに、 スクリーニングされた化合物が ァゴニス卜かアン夕ゴニストかを簡便に することができる。
本発明のスクリ一二ング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質等としては、 前記した本発明 の蛋白質等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 本発明の蛋白質等を含有 する哺乳動物の ¾の細 «画分が好適である。 しカゝし、 特にヒト由来の ¾は入手が極め て困難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 «え体を用いて大 現 させたヒト由来のレセプ夕一蛋白質等などが適している。
本発明の蛋白質等を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本発明の DNAを哺乳動 物細胞や昆 細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコ —ドする DNA断片には相補 DN A力用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではな レ^ 例えば、 遺 ^断片や合成 DNAを用いてもよい。 本発明の蛋白質をコードする DNA 断片を宿 ±ft物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を^ を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc lear polyhedrosis vi rus ； N P V) のポリヘドリンプロモー夕""、 S V 4 0由来のプロモー夕一、 レトロウイルスの プロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒ一卜ショックプロモ一夕一、 サイト メガロウィルスプロモー夕一、 S R aプロモーターなどの下流に組み込むの力好ましい。 発 現したレセプ夕一の量と質の髓はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例えば、 i .
[Nambi, P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·ノ 'ィォロジカル 'ケミストリ一 （J. Biol. Chem.
) , 267巻, 19555〜19559頁, 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質等を含有するものと しては、 それ自体^の方法に従って精製した蛋白質等であってもよいし、 該蛋白質等を含 有する細胞を用いてもよく、 また該蛋白質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質等を含有する細胞を用いる場合、 翻胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体 の方法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質等を含 る細胞としては、 該蛋白質等を発現した宿主細胞をいうが、 該 宿主細胞としては、 菌、 枯草菌、 酵母、 昆 細胞、 動物細胞などが好ましい。
細 «®分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細藤が多く含 まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモジナイザーで 細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン （Kinemat icaネ ±¾) のよる破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させるこ とによる破砕など力，げられる。 細謹の分画には、 分画遠心分離法や密度勾 IS 心分離法 などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破赚を低速 ( 5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 ( 1 5 0 0 0 r pm〜3 0 0 0 0 r pm) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる を 分と する。 該 分中には、 発現した蛋白質等と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が 多く含まれる。 該蛋白質等を含 る細胞ゃ麵分中の該蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜 108分 子であるのが好ましく、 10 J〜l 07肝であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほ ど β分当たりのリガンド結合活性 （比活性） 力稿くなり、 高感度なスクリーニング系の構 築が可能になるばかりでなく、 同一口ッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の ®~ を実施するためには、 例えば、 適当な蛋白質画分と、 標識したリガンドが必要である
蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそれと同等の活性を有す る細奐ぇ型レセプ夕一蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガン ド結合活性、 シグナル情報 作用などを示す。
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化合物などが 用いられる。 例えば〔3Η〕、 〔1 25 I〕、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識されたリ ガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物のスクリ一ニン グを行なうには、 まず本発明の蛋白質等を含有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリー二 ングに適したバッファーに薩することにより蛋白質標品を調製する。 バッファーには、 p
H4〜： L 0 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 トリス一塩酸バッファーなどの リガンドと蛋白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異 的結合を低減させる目的で、 CHAPS, Twe en-80™ (花王一アトラス ¾) 、 ジ ギトニン、 デォキシコレートなどの界面活'鬧をバッファーに加えることもできる。 さらに
、 プロテアーゼによるレセプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン
、 E— 64 (ペプチド石 製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること もできる。 0.0 lml〜l 0mlの該レセプ夕一溶液に、一定量（5000 cpm〜500
000 c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10一4 M〜l 0一 1 0 Mの試験化合 物を共存させる。 非特異的結合量 (NSB) を知るために大過剰の未標識のリガンドを加え た反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 50°C、 望ましくは約 4 °Cから 37でで、 約 2 0分から 2 4時間、 望ましく〖 約 3 0分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊隹 で濾 過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊隹舰に残存する放碰性を液体シンチ レ一ションカウン夕一またはァ一カウンターで計根 ijする。 拮抗する物質がない場合のカウン ト（B 0 )力ら非特異的結合量（N S B) を引いたカウント （B 0—N S B) を 1 0 0 %とし た時、 特異的結合量 (B -N S B) i 例えば、 5 0 %以下になる試験化合物を 阻害能 力のある «物質として選択することができる。
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物スクリ一二ングする前記の④ ~®の方法を実 るためには、 例えば、 蛋白質を介する細赫撤活性 （例えば、 ァラキド ン^ ί»、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a薩、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生 成、 イノシトールリン酸産生、 細隱電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活 性化、 P Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の 測定用キットを用レて測 ることができる。
具体的には、 まず、 本発明の蛋白質等を含 る細胞をマルチウエルプレート等に培養す る。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さな い適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを添加して一定時間ィンキュベ一トした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分 ^^素によつて検定困難な場合は、 該分 素に対する阻害剤を添加してァッセィを行なつ てもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基 礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。 細 IS¾激活性を測定してスクリ一ニングを行なうには、 適当な蛋白質を発現した細胞が必 要である。 本発明の蛋白質等を発現した細胞としては、 天然型の本発明の蛋白質等を る 細胞株、 前述の雄え型蛋白質等を発現した細胞株など力 ¾ましい。
化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵^ M物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物繊抽出液などが用いられ、 これら化合物 ttff 規な化合物であってもよいし、 の化合物であってもよい。 MN
49
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ用キットは、 本発明の蛋白質等、 本発明の蛋白質等を含有する細胞、 または本発明の蛋白 質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
®¾J定用緩衝液およ 浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコネ：!^) に、 0.05 %のゥシ血清アルブミン （シ グマ社製） を加えたもの。
？し径 0.45 mのフィル夕一で濾過滅菌し、 4°Cで保 Tるか、あるいは用時調製しても 良い。
② G蛋白質共役型レセプ夕一標品 本発明の蛋白質を発現させた C ΗΟ細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 穴で継代し 、 37 、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養したもの。
@ ^識リガンド 市販の 〔3H〕 、 〔1 25 I〕 、 〔14C〕 、 〔ύ ύ3〕 などで標識したリガンド 水溶 液の状態のものを 4°Cあるいは— 20でにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 に希釈 する。
④リガンド標準液
リガンドを 0. 1%ゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む PBSで ImMとなるように 溶解し、 一 20 で保 "る。
2. 測定法
① 12穴組 ^養用プレー卜にて培養した本発明の蛋白質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。
② 10— 3〜： L 0— 1 0Mの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え 、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに 10— Mのリガンドを 5 1加えておく。 ③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩種 ί液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識リガンドを 0.2Ν Na〇H— 1%SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕一 A (和舰薬 と 混合する。
@¾体シンチレーシヨンカウン夕一（ベックマン ¾¾)を用いて放射括性を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [ (B-NSB) / (B0-NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-spec ific Binding (非特異的結合
B 0 ：最大結合量
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また はその塩は、 リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる作用を有する化合物であ り、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細繊 ϋ激活性 （例えば、 ァラキ ドン^ »、 アセチルコリン β、 細胞内 Ca2+»、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cG MPm イノシトールリン酸産生、 細 «電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c-f o sの活性化、 pHの低下などを碰する活性または抑制する活性など） を る化合物 （い わゆる、 本発明の蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） ΐ細麟 §敫活性を有しない化合物 ( いわゆる、 本発明の蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本発明の G蛋白質 Λ¾ 蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白質共 ίδ 蛋白質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵继物 などが挙げられ これら化合物 ttf†規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても い。
本発明の蛋白質等に対するァゴニス卜は、 本発明の蛋白質等に対するリガンドが有する生 理活性と同様の作用を有しているので、 該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として 有用である。
本発明の蛋白質等に対するアン夕ゴニストは、 本発明の蛋白質等に対するリガンドが有す る生理活性を抑制することができるので、 該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬と して有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型蛋白質との結合力を増強する化合物は、 本発明の蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用で ある。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型蛋白質との結合力を減少させる化合物は、 本発明の蛋 白質等に対するリガンドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有 用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また はその塩を ±¾ϋの医薬糸 M物として使用する場合、 常套手段に従って実 することができる 。 例えば、 歸己した本発明の DNAを含 る医薬と同様にして、 綱、 カプセル剤、 エリ キシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸獨 などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で麟性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例え ば、 ラッ卜、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与すること が きる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 , 症状、 投与方法などにより差異 はあるが、経口投与の場合、 "^的に成人（6 0 k gとして） においては、一日につき約 0. 1〜： I 0 Omg、 好ましくは約 1 . 0〜5 O mg、 より好ましくは約 1 . 0〜2 Omgであ る。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対 «器、 症状、 投与方法な どによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人 （6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 0 1〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましく は約 0. ；!〜 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も 、 6 O k g当たりに した量を投与することができる。
( 6 ) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、 本発明の蛋白質等を特異的に認識すること力 ?きるので、 被検波中の本 発明の蛋白質等の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量などに使用することができ る。 すなわち、 本発明は、 例えば、 （.i ) 本発明の抗体と、 被検液およ 識化蛋白質等と を競合的に反応させ、 体に結合した標識化蛋白質等の割合を測^ ることを特徴とする 被検液中の本発明の蛋白質等の定量法、
(i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体およ 識化された本発明の抗体とを同時 あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標!^の活性を測^ることを赚とす る被検液中の本発明の蛋白質等の定量法を提供する。
上記 (i i) においては、 一方の抗体が本発明の蛋白質等の N端部を認識する抗体で、 他方 の抗体が本発明の蛋白質等の C端部に反 る抗体であること力好ましい。
本発明の蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクローナル抗体と称 する場合がある） を用いて本発明の蛋白質等の測定を行なえるほか、 繊染色等による検出 を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体 肝の F ( a b' ) 2 、 F a b\ あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明の蛋白質等に対 する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測 夜中の ¾ 量 （例え ば、 蛋白質 fi) に対応した抗体、 もしくは抗体—観複合体の量を化学的または物理的 手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出す る測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィ ムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標 f ^としては、 例えば、 放射性同 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同 素としては、 例えば、 5 I〕 、
I：1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 C 1 4 C) などカ佣いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性 の大きなものが好ましく、 例えば、 3—ガラクトシダーゼ、 β—ダルコシダーゼ、 アル力リ フォスファタ一ゼ、 バーオキシダーゼ、 リンコ «7Κ素酵素など力 S用いられる。 蛍光物質と しては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる 。 /質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン などが用いられる。 さらに、 抗体あるいは ¾¾^と標 との結合にピオチン一アビジン系を 用いることもできる。
ί¾Ιあるいは抗体の不溶ィ匕に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質ある いは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。 担体とし ては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン 、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合繊脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液を反応させ （ 1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ （2次反応） たのち 、 不溶化担体上の標!^の活性を測 ¾Τることにより被検液中の本発明の蛋白質量を定量す ることができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよ いし時間をずらして行なってもよい。 標識化剤および不溶ィ匕の方法は Ι Ι己のそれらに準じる ことができる。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標 IHffl抗体に用い られる抗体は必ずしも 1種類である必要はなぐ 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以 上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明の蛋白質等の測定法においては、 1次反応と 2次反 応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明の蛋白質等の結合する部位が相異なる 抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明の蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いら れる抗体は、 好ましくは C端部 、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法 の測定システム、 例えば、 競合法、 ィ ムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検波 中の ^と標識 ¾¾Eとを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識舰と（F)と 抗体と結合した標識 i¾ (B) とを分離し （B/F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定 し、 被検波中の ί¾Ε量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分 離をポリエチレングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とカ佣いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中のお源と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して 競合反応させた後固相と液相を分 るか、 あるいは、 被検波中の ¾ と翻量の標識化抗 体とを反応させ、 次に固相化 i¾ を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相 と液相を分 »る。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の舰量を定量する。 また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で腿抗体反応の結果、 生じた不溶性 の沈降物の量を測 る。 被検液中の腿量が僅かであり、 少量の沈降物しか得られない場 合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフ口メトリ一など力好適に用いられる。
これら個々の艘学的測定法を本発明の測 法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通 常の ft^的酉爐を加えて本発明の蛋白質またはその塩の測定系を構築すればよい。 これらの 的な 術手段の詳細については、 総説、 齒などを参照することができる 〔例えば、 入 江 m l 「ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 「続ラジオィ ムノアツセィ〕 （講談社、 昭禾ロ 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素赚測定法」 （医学書院 、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」 （第 2 f¾) (医学書院、 昭和 5 7年 発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3船 （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メ ソッズ 'イン ·ェンジモノジー （Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Par t B)) . 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selec ted Immunoassays) ) , 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoc lonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I :Hybr idoma Technology and Monoc lonal Ant ibodies)) (以上、 ァカデミツ クプレス社発行)など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の蛋白質またはその塩を感度 _
55 良く定量すること力できる。 さらに、 本発明の抗体を用いて本発明の蛋白質またはその塩を 定量することによって、 各 の診断をすることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明の蛋白質等を検出す るために使用することができる。 また、 本発明の蛋白質等を精製するために使用する抗体力 ラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の蛋白質等の検出、 被検細胞内における本発明の蛋 白質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 7) 本発明の G蛋白質共翻蛋白質をコードする DNAを有する非ヒト動物の作製 本発明の DNAを用いて、 本発明の蛋白質等を発現するトランスジエニック非ヒト動物を 作製することができる。 非ヒト動物としては、 哺¾»物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ 、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下、 動物と略記する） 力襻げれる が、 特に、 マウス、 ゥサギなどが固である。
本発明の DNAを対象動物に転移させるにあたっては、 該 DN Aを動物細胞で発現させう るプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラク卜として用いるのが一般に有利である 。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の DN Aを転移させる場合、 これと相同性が ぃ動物由来の 本発明の DN Aを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンス トラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の 蛋白質等を高産生する DN A転移動物を作出できる。 このプロモー夕一としては、 例えば、 ウィルス由来プロモー夕一、 メタロチォネィン等のュビキアスな発現プロモーターも使用し うるが、 好ましく〖 で特異的に発現する NG F遺^?プロモー夕一やエノラ一ゼ プ 口モーターなどが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 顺動物の胚芽細胞および体細胞の全 てに ¾fるように確保される。 DN A転 麦の作出動物の胚芽細胞において本発明の蛋白 質等が ^することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及 ϋ淋細胞の全てに本発明の蛋 白質等を ることを意味する。 遺 を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞お よ »細胞の全てに本発明の蛋白質等を る。
本発明の DNA転移動物は、 交配により遺 を安定に i¾fすることを確認して、 該 DN 00
A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うこと力できる。 さらに、 目的 DNAを保 る雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザィゴ ―卜動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 DNAを有する ように繁,代することができる。
本発明の DN A力 ¾移された動物は、 本発明の蛋白質等が高発現させられているので、 本 発明の蛋白質等に対するァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスクリーニング用の動物などと して有用である。
本発明の DN A転移動物を、 養のための細胞源として使用することもできる。 例え ば、 本発明の DNA転移マウスの繊中の DNAもしくは RNAを直接分析するか、 あるい 伝子により発現された本発明の蛋白質が ¾Eする組織を分析することにより、 本発明の 蛋白質等について分析することができる。 本発明の蛋白質等を る繊の細胞を標準繊 培養 δΤ術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢繊由来のような HISに培養 困難な繊からの細胞の機能を ることができる。 また、 その細胞を用いることにより 、 例えば、 各猶纖の機能を高めるような医薬の選択も可能である。 また、 高発糊胞株が あれば、 そこから、 本発明の蛋白質等を «|製することも可能である。
本明細書および面面において、 塩基ゃァミノ酸などを略号で表示する場合、 I UPAC - I UB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣 用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し^異性体があり得る は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C RNA リポ核酸 mRNA メッセンジャーリボ核酸 dATP デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 dCTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
Leu ロイシン
I 1 e
S e r セリン
Th r スレ才ニン
Cy s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスノ、"ラギン酸
L y s リジン
Ar g アルギニン
H i s ヒスチジン
Phe フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
Trp
Pro プロリン As n ：ァスパラギン
Gi n ：グルタミン
PG 1 u ：ピログルタミン酸
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
Ph ：フエ二ル基
TC ：チアゾリジン— 4 (R) —カルポキサミド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および式薬を下記の記号で表記 する。
To s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
CI 2Bzl : 2， 6—ジクロロべンジル
Bom ：ベンジル才キシメチル
Z ：ベンジル才キシカルボニル
C 1—Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r— Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
Boc ： t一ブトキシカルボニル
DNP ：ジニ卜口フエノール
Tr t ： 卜リチル
Bum ： t一ブトキシメチル
Fmoc ： N— 9 _フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ： 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt ： 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシー 4_ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2， 3-ジカルボキシイミド
D C C : N、 N' —ジシクロへキシルカルポジイミド
本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒト脳由 ¾S白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 )
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト脳由来蛋白質をコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
銜 の実施例 1で得られた形質転換体ェシェリヒア コリ （Escherichia col i) J M 1 0 9 ,ρ ΗΚ Ο 4 6 1 5は、 平成 1 0年 8月 7日から通商産業省工業 術院生命工学工業腿研 (N I BH) に寄託番号 F E RM B P— 6 4 5 5として寄託されている。 錢例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これら 発明の範囲を るものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺 β?操作法は、 モレキュラー 'クロ一ニング （ Molecular cloning) に記載されている方法に従った。
鍾例 1
ヒト脳由来の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の探索と塩基配列の決定
DNAリサーチ （DNA RE S EAR CH) 第 4巻、 第 5 3— 5 9頁 （1 9 9 7年） に 記載の方法またはそれに準じた方法に基づいて得られた c DN A (配列番号： 2；図 3およ び H4の謹配列中、 第 2番目〜第 2959番目の配列） にコードされるアミノ酸配列に対し て、 咖の受容体の配列；特にヒト OR F受容舰列を國にしてホモロジ一サーチをした ところ、 配列番号： 1 (図 1で表されるアミノ酸配列） で表されるアミノ酸配列が相同性を 示した。
その疎水性プロットを調べた結果、 図 2のようになり、 7回膜貫通型 （G蛋白共役型） の レセプ夕一をコードしていることが判明した。 さらに、 配列番号： 1 (図 1で表されるアミノ酸配列） で表されるアミノ酸配列で表され る蛋白質をコードする DNAを保持するプラスミド PHK04615を E. coli JM109 に導入して E. coli JM109ZpHK04615を得た。 産業上の利用可能
本発明の G蛋白質共役型蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 およびそれらをコ ードする DN Aは、 ①リガンド （ァゴ二スト） の決定、 （2航体およ OWL清の入手、 （¾且み 替え型蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合ァッセィ系の開発と医薬 品 «化合物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似したリガンド'レセプ夕一との比較にもと づいたドラッグデザィンの実施、 d遣 ^診断におけるプローブや P CRプライマ一の作成 のための試薬、 ⑦トランスジェニック動物の作製または (遣 予防 ·治 等の医薬等と して用いることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含 ることを特徴とする蛋白質またはその塩。
2. 請求項 1記載の蛋白質の部分べプチドまたはその塩。
3. 請求項 1記載の蛋白質をコードする塩基配列を有する DN Aを含有する DNA。
4. 配列番号： 2で表される塩基配列を有する請求項 3記載の DNA。
5. 請求項 3記載の DN Aを含有する組換えべクタ一。
6. 請求項 5記載の a ベクターで形質転換された形質転換体。
7. 請求項 6記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の蛋白質を生成 しめること を特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩の製造法。
8. 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその塩に対する抗体
9. 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその塩を用いること を特徴とする請求項 1記載の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。
1 0. 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその塩を用いるこ とを特徴とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリ一二ング方法。
1 1. 請求項 1記載の蛋白質もしくは請求項 2記載の部分ペプチドまたはその塩を含有する ことを とするリガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩のスクリ一ニング用キッ卜。
1 2. 請求項 1 0記載のスクリーニング方法または請求項 1 1記載のスクリーニング用キッ トを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩。
1 3. 請求項 1 0記載のスクリーニング方法または請求項 1 1記載のスクリーニング用キッ トを用いて得られうる、 リガンドと請求項 1記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
1 4. 請求項 3記載の DN Aとハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNA
1 5. 請求項 1記載の蛋白質をコードする塩基配列を含有するヌクレオチド。
1 6. 請求項 1記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含有してな るヌクレ才チド。
PCT/JP1999/004233 1998-08-07 1999-08-05 Proteine recepteur couplee a une nouvelle proteine g et son adn Ceased WO2000008053A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99935069A EP1103562A4 (en) 1998-08-07 1999-08-05 NEW G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR PROTEIN AND ITS DNA
AU50651/99A AU5065199A (en) 1998-08-07 1999-08-05 Novel g-protein coupled receptor protein and dna thereof
CA002335648A CA2335648A1 (en) 1998-08-07 1999-08-05 A novel g protein-coupled receptor protein and its dna

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10225059A JP2000050875A (ja) 1998-08-07 1998-08-07 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP10/225059 1998-08-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000008053A1 true WO2000008053A1 (fr) 2000-02-17

Family

ID=16823406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1999/004233 Ceased WO2000008053A1 (fr) 1998-08-07 1999-08-05 Proteine recepteur couplee a une nouvelle proteine g et son adn

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1103562A4 (ja)
JP (1) JP2000050875A (ja)
AU (1) AU5065199A (ja)
CA (1) CA2335648A1 (ja)
WO (1) WO2000008053A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001088119A1 (fr) * 2000-04-28 2001-11-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine recepteur couplee a une proteine g et adn associe
WO2002006466A1 (fr) * 2000-07-14 2002-01-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine gr et son adn
WO2002022665A1 (fr) * 2000-09-11 2002-03-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteines de recepteur couple a la proteine g et adn correspondants
WO2001068702A3 (en) * 2000-03-16 2002-05-30 Bayer Ag Regulation of human g protein-coupled receptor
WO2002016548A3 (fr) * 2000-08-04 2002-06-27 Japan Science & Tech Corp Recepteur couple a une proteine g
WO2002053593A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1376132A4 (en) 2001-03-30 2005-02-23 Suntory Ltd STRUCTURAL MODEL FOR A G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR AND METHOD FOR DESIGNING LIGANDING BINDING TO THE G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR USING THE STRUCTURE MODEL

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0789076A2 (en) * 1996-02-07 1997-08-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. G protein coupled receptor proteins, their production and use
EP0805204A2 (de) * 1996-04-29 1997-11-05 Institut für Hormon- und Fortpflanzungsforschung GmbH Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung
EP0807684A1 (en) * 1996-05-16 1997-11-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Human G-protein coupled receptor (HIBCD07)

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0789076A2 (en) * 1996-02-07 1997-08-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. G protein coupled receptor proteins, their production and use
EP0805204A2 (de) * 1996-04-29 1997-11-05 Institut für Hormon- und Fortpflanzungsforschung GmbH Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung
EP0807684A1 (en) * 1996-05-16 1997-11-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Human G-protein coupled receptor (HIBCD07)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAROLINE OSTERHOFF ET AL: "Cloning of a Human Epididymis-specific mRNA, He6, Encoding a Novel Member of the Seven Transmembrane-Domain Receptor Superfamily", DNA AND CELL BIOLOGY, vol. 16, no. 4, April 1997 (1997-04-01), pages 379 - 389, XP002925525 *
JUNPEI ABE ET AL: "Ig-Hepta, a Novel Member of the G Protein-coupled Hepta-helical Receptor (GPCR) Family that has Immunoglobulin-like Repeats in a Long N-terminal Extracellular Domain and Defines a New Subfamily of GPCRs", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 274, no. 28, 9 July 1999 (1999-07-09), pages 19957 - 19964, XP002925400 *
See also references of EP1103562A4 *
TAKAHIRO NAGASE ET AL: "Prediction of the Coding Sequences of Un-identified Human Genes XI. The Complete Sequences of 100 New cDNA Clones from Brain Which Code for Large Proteins In Vitro", DNA RESEARCH, vol. 5, no. 5, 1998, pages 277 - 286, XP002925524 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001068702A3 (en) * 2000-03-16 2002-05-30 Bayer Ag Regulation of human g protein-coupled receptor
WO2001088119A1 (fr) * 2000-04-28 2001-11-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine recepteur couplee a une proteine g et adn associe
WO2002006466A1 (fr) * 2000-07-14 2002-01-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine gr et son adn
WO2002016548A3 (fr) * 2000-08-04 2002-06-27 Japan Science & Tech Corp Recepteur couple a une proteine g
WO2002022665A1 (fr) * 2000-09-11 2002-03-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteines de recepteur couple a la proteine g et adn correspondants
WO2002053593A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU5065199A (en) 2000-02-28
EP1103562A4 (en) 2002-03-13
JP2000050875A (ja) 2000-02-22
EP1103562A1 (en) 2001-05-30
CA2335648A1 (en) 2000-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2000049046A1 (fr) Nouvelle proteine de recepteur couplee a la proteine g et adn
WO2000008053A1 (fr) Proteine recepteur couplee a une nouvelle proteine g et son adn
WO2001016316A1 (fr) Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant
WO2000020456A1 (fr) Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g, et son adn
WO2000020580A1 (fr) Nouvelle proteine recepteur couplee a la proteine g et adn associe
WO2002004640A1 (fr) Nouvelle proteine du type recepteur couple aux proteines g et adn correspondant
US20040067553A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
JP2000166576A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプタ―蛋白質およびそのｄｎａ
WO2001096567A1 (fr) Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g et adn de ce recepteur
JP2000175691A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプタ―蛋白質およびそのｄｎａ
WO2001073021A1 (fr) Nouvelle proteine receptrice couplee a une proteine g et adn associe
JP2000189174A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプタ―蛋白質およびそのｄｎａ
JP2000295995A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
US20040072751A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
JP2000175690A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプタ―蛋白質およびそのｄｎａ
WO2002057309A1 (fr) Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g et adn de cette proteine
WO2002002767A1 (fr) Proteine de recepteur couple a la proteine g et adn correspondant
JP2002335977A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2001136981A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
US20040048263A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
JP2001340093A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JPWO2000020455A1 (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2002000281A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2000279183A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2002355053A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AL AM AU AZ BA BB BG BR BY CA CN CR CU CZ EE GD GE HR HU ID IL IN IS KG KR KZ LC LK LR LT LV MD MG MK MN MX NO NZ PL RO RU SG SI SK SL TJ TM TR TT UA US UZ VN YU ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999935069

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2335648

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09744503

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999935069

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999935069

Country of ref document: EP