WO2000008201A9 - Verfahren zur gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender polysaccharide aus hefe saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Verfahren zur gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender polysaccharide aus hefe saccharomyces cerevisiae

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    • A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast

Definitions

  • the invention relates to a method for obtaining high-molecular, biologically active immunomodulating polysaccharides from yeast Saccharomyces Cerevisiae.
  • the importance of the immune system to ward off diseases in human and animal organisms is well known. It is also generally known that there are polysaccharides in the cell wall of yeast which have an immunostimulating effect in animal and human organisms and can be used to ward off diseases. These polysaccharides are mannan and glucan.
  • the mannan consisting of 1, 2-, 1, 3- and 1, 6- ⁇ -glycosidically linked mannose units, is bound to a protein matrix and sits on the outer cell wall of the yeast cell, while the glucan 1, 3- ß-glycosidically linked with a few 1,6-ß-glycosidic side chains and is located in the inner cell wall.
  • the object of the invention is to design the method of the type mentioned at the outset in such a way that an optimal immunomodulating effect is achieved when the required process steps are reduced.
  • Extractions in the isolation of the polysaccharides avoid degradation, since extreme pH values are avoided by the use of enzymes.
  • the number of procedural steps required is significantly reduced.
  • the cell walls are first separated from the cell interior via a mechanical cell disruption and the cell wall sections obtained are cleaned and dried. Freeze drying is advantageous. However, the use of other freezing methods is also possible. Then there is an impact of technical Enzymes on the isolated cell wall sections of the yeast Saccharomyces Cerevisiae, whereby the substances can be isolated purely.
  • Both mannan and glucan are obtained, which can be used directly for immunostimulating purposes, for example in skin creams. Since the glucan is insoluble in water, it can be converted into water-soluble derivatives by chemical reactions.
  • mannan components can be isolated that have molecular weights in the range of 20,000 to 400,000 g / mol, show a specific, immunomodulating reaction and are not cytotoxic. Under certain circumstances, these Mannan components can also be used to combat asthma diseases, since they showed an immunosuppressive effect in in vitro tests.
  • Commercial enzymes can advantageously be used to isolate the polysaccharides, such as protease (SIGMA-ALDRICH), pronase (MERCK), both from Streptomyces griseus, Lyticase, also called zymoiase (SIGMA-ALDRICH), as well as enzyme cocktails from Helix pomatia and from Cytophaga ( MERCK). However, it is also possible to use other suitable enzymes or enzyme cocktails.
  • glucan derivatives and mannan are effective even without dose-effect optimization, and this even in the in vivo test to check the anti-tumor activity. A tumor does not grow again even after renewed incubation.
  • glucan derivatives and mannan there is no toxicity or only a low toxicity.
  • the agent obtained according to the invention can be used in a variety of ways. For wound healing, it is possible to use the agent physically as a moisture-storing cover and for open wounds to activate immune cells. The agent also works against pathogenic bacteria and viruses. In addition, the agent according to the invention has a regulating effect on autoimmune diseases such as e.g. Asthma and epilepsy.
  • the application can take place via ointments, emulsions, gel solutions, by spraying or microencapsulation, orally by pills or solutions or intramuscularly, for example by spraying into the abdominal cavity or intravenously, which has the greatest potential for action.
  • the agent according to the invention can be used in HIV infections, tumors in both humans and animals, tuberculosis, acute sepsis, bacteria, fungi, increased interferon production, to increase the number of leukocytes, to heal wounds, for example to protect against radiation damage and Infections and also to increase transplant immunity, to
  • the yeast cells 1 are mechanically torn in the first process stage A by the action of shear forces, so that the cell walls are separated from the cell interior.
  • a grinding container 2 is filled with a suspension of yeast cells and glass beads and shaken at a high frequency in a vibrating mill 3, for example. Glass beads with a diameter of 0.75-1.5 mm are preferably used.
  • the frequency of the vibratory mill 3 is, for example, 1600 s ' 1 .
  • the cell wall material 4 obtained in this way is then cleaned in a further process stage B by centrifugation, or else is cleaned on microporous membranes by washing.
  • the cell wall material 4 thus prepared is then freeze-dried.
  • the cell wall material 4 is subjected to an enzymatic digestion.
  • Specific enzymes such as pronase or glucanase or specific enzyme cocktails such as zymoiase, cytophaga, helicase or cellulase destroy the protein matrix in the outer cell wall of the cell wall material 4 and release soluble mannan 5.
  • the insoluble glucan 6 is separated by centrifugation and processed separately.
  • the Mannan 5 can be purified by dialysis or by chromatography.
  • the water-insoluble glucan obtained can be chemically converted into a soluble form by carboxymethylation, phosphation, sulfation, sulfonation, glycosidation or the like.
  • the solubility and thereby the bioavailability can be increased by the action of ultrasound and undesirable side effects for a person to be treated can be prevented.
  • the water-insoluble glucan can be autoclaved briefly at temperatures up to 200 ° C.
  • the water-insoluble glucan is autoclaved for more than 5 minutes, this can take place at temperatures up to 150 ° C.
  • the water-soluble glucan can also be subjected to a stretching process in a solvent DMSO. For this purpose, it is possible for the water-soluble glucan to be passed through an aperture plate, a porous ball bed, a roller mill or a device for a capillary flow.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae. In einer ersten Verfahrensstufe werden die Hefezellen durch Einwirkung von Scherkräften mechanisch soweit zerrissen, daß die Zellwände vom Zellinneren getrennt sind. Die Zellwandbestandteile werden von den Bestandteilen des Zellinneren getrennt. In einer zweiten Verfahrensstufe wird dann das gewonnene Zellwandmaterial gereinigt und getrocknet. Danach wird das Zellwandmaterial in einer dritten Verfahrensstufe einem enzymatischen Aufschluß unterzogen und das hierbei entstehende wasserunlösliche Glucan durch Zentrifugation als Feststoff und das wasserlösliche Mannan im Überstand gewonnen. Durch dieses Verfahren erfolgt eine hohe Ausbeute von Glucan und Mannan mit intakter nativer Struktur.

Description

Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae.
Die Bedeutung des Immunsystems zur Abwehr von Krankheiten in menschlichen und tierischen Organismen ist bekannt. Es ist ferner allgemein bekannt, daß es in der Zellwand von Hefe Polysaccharide gibt, die in tierischen und menschlichen Organismen immunstimulierend wirken und zur Abwehr von Krankheiten eingesetzt werden können. Diese Polysaccharide sind Mannan und Glucan. Das Mannan, bestehend aus 1 ,2-, 1 ,3- und 1 ,6-α-glykosidisch verknüpften Mannose-Einheiten, ist an eine Protein-Matrix gebunden und sitzt auf der äußeren Zellwand der Hefezelle, während das Glucan 1 ,3-ß- glykosidisch verknüpft ist mit wenigen 1 ,6-ß-glykosidischen Seitenketten und sich in der inneren Zellwand befindet. Zur Isolierung dieser beiden Polysaccharide wurden zahlreiche Verfahren entwickelt, bei denen durch Einwirkung von Säuren und Laugen die beiden Zellwandkomponenten getrennt werden. Bei diesen herkömmlichen Verfahren sind jedoch viele Verfahrensschritte erforderlich und darüber hinaus wird die native Struktur der Zeliwand-Polysaccharide beschädigt, so daß die immunabwehrfördemden Effekte beeinträchtigt werden.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, das Verfahren der eingangs genannten Art so zu gestalten, daß bei einer Verminderung der erforderlichen Verfahrensschritte ein optimaler immunmodulierender Effekt erzielt wird.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Nach der Erfindung wird gegenüber den herkömmlichen sauren und alkalischen
Extraktionen bei der Isolierung der Polysaccharide eine Degradation vermieden, da durch den Einsatz von Enzymen extreme pH-Werte vermieden werden. Außerdem wird die Anzahl der erforderlichen Verfahrensschritte deutlich reduziert. Gemäß der Erfindung werden zunächst über einen mechanischen Zellaufschluß die Zellwände vom Zellinneren abgetrennt und die erhaltenen Zellwandabschnitte gereinigt und getrocknet. Vorteilhaft ist eine Gefriertrocknung. Es ist aber auch die Anwendung anderer Gefrierverfahren möglich. Dann erfolgt eine Einwirkung von technischen Enzymen auf die isolierten Zellwandabschnitte der Hefe Saccharomyces Cerevisiae, wodurch die Substanzen rein isoliert werden können. Man erhält sowohl Mannan als auch Glucan, welche direkt für immunstimulierende Zwecke z.B. in Hautcremes eingesetzt werden können. Da das Glucan in Wasser unlöslich ist, kann es durch chemische Umsetzungen in wasserlösliche Derivate überführt werden. Hierzu sind zahlreiche Derivatisierungsmethoden bekannt. Es können spezielle Mannan- Komponenten isoliert werden, die Molmassen im Bereich von 20.000 bis 400.000 g/mol haben, eine spezifische , immunmodulierende Reaktion zeigen und dabei aber nicht cytotoxisch wirken. Diese Mannan-Komponenten können unter Umständen auch zur Bekämpfung von Asthma-Erkrankunen genutzt werden, da sie in in vitro Tests eine immunsuppressive Wirkung zeigten. Zur Isolierung der Polysaccharide können vorteilhaft kommerzielle Enzyme eingesetzt werden, wie Protease (SIGMA-ALDRICH), Pronase (MERCK), beide aus Streptomyces griseus, Lyticase, auch Zymoiyase genannt (SIGMA-ALDRICH), wie auch Enzymcocktails aus Helix pomatia und aus Cytophaga (MERCK). Es ist aber auch die Verwendung anderer geeigneter Enzyme oder Enzymcocktails möglich.
Der Vorteil der enzymatischen Isolierung von Hefeinhaltsstoffen besteht darin, daß Glucanderivate und Mannan bereits ohne Dosis-Wirkungsoptimierung wirksam sind und dies sogar im in vivo Test zur Überprüfung der Anti-Tumoraktivität. Ein Tumor wächst auch nach erneuter Inkubation nicht wieder an. Durch Anwendung der Glucanderivate und Mannan besteht auch keine Toxizität, bzw. nur eine geringe Toxizität.
Das nach der Erfindung gewonnene Mittel kann vielfältig angewandt werden. Für die Wundheilung ist es möglich, das Mittel rein physikalisch als feuchtigkeitsspeichemde Abdeckung und bei offenen Wunden zur Aktivierung von Immunzellen zu verwenden. Ferner wirkt das Mittel gegen pathogene Bakterien und Viren. Außerdem hat das erfindungsgemäße Mittel eine regulierende Wirkung auf Autoimmunkrankheiten wie z.B. Asthma und Epilepsie.
Die Anwendung kann über Salben, Emulsionen, Gellösungen, durch Spritzen oder Mikroverkapselung, oral durch Pillen oder Lösungen oder intramuskulär z.B. durch Spritzen in die Bauchhöhle oder intravenös erfolgen, was ein höchstes Wirkungspotenzial hat. Der Einsatz des erfindungsgemäßen Mittels ist möglich bei HIV- Infektionen, Tumoren sowohl bei Menschen wie auch Tieren, Tuberkulose, akuter Sepsis, Bakterien, Pilze, gesteigerter Interferonproduktion, zur Steigerung der Leukozytenzahl, zur Wundheilung wie z.B. zum Schutz vor Strahlenschäden und Infektionen und darüber hinaus zur Erhöhung der Transplantationsimmunität, zur
Bekämpfung von Trauma, zur Erhöhung von Blutbildung und zur Impfunterstützung.
Ferner ist ebenso eine umfangreiche Anwendung bei Tieren zur Immunförderung möglich.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der in der Zeichnung schematisch dargestellten Verfahrensabläufe näher erläutert.
Die Hefezellen 1 werden in der ersten Verfahrensstufe A durch Einwirkung von Scherkräften mechanisch zerrissen, so daß die Zellwände vom Zellinneren getrennt werden. Hierzu wird ein Mahlbehälter 2 mit einer Suspension aus Hefezellen und Glasperlen gefüllt und in z.B. einer Schwingmühle 3 mit hoher Frequenz geschüttelt. Als Glasperlen werden vorzugsweise solche mit einem Durchmesser von 0,75 - 1 ,5 mm verwendet. Die Frequenz der Schwingmühle 3 beträgt z.B. 1600 s'1. Das so gewonnene Zellwandmaterial 4 wird dann in einer weiteren Verfahrensstufe B durch Zentrifugation gereinigt oder aber an mikroporösen Membranen durch Waschen gereinigt. Das so aufbereitete Zellwandmaterial 4 wird dann gefriergetrocknet. In der dann folgenden Verfahrensstufe C wird das Zellwandmaterial 4 einem enzymatischen Aufschluß unterzogen. Spezifische Enzyme wie Pronase oder Glucanase oder spezifische Enzymcocktails wie Zymoiyase, Cytophaga, Helicase oder Cellulase zerstören in der äußeren Zellwand des Zellwandmaterials 4 die Proteinmatrix und setzen lösliches Mannan 5 frei. Das unlösliche Glucan 6 wird durch Zentrifugation abgetrennt und gesondert aufbereitet. Das Mannan 5 kann durch Dialyse oder chromatographisch gereinigt werden.
Nachstehend werden zwei Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben:
1. Ausführungsbeispiel
5,0 g Hefezellwände aus dem mechanischen Aufschluß wurden in 115 ml Trispuffer Lösung (Tri(hydroxymethyl)aminoethan, mit Salzsäure auf pH = 7,5 eingestellt) suspendiert und auf 37,0°C temperiert. 10,6 mg Pronase E (Streptomyces griseus, Fa. MERCK) wurden in 5 ml Puffer-Lösung gelöst und zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Nach sechs Stunden wurde der Feststoff abzentrifugiert und der Überstand dialysiert. Nach Gefriertrocknung erhielt man Mannan aus dem Überstand, während im Feststoff 2,9 g Glucan zu finden sind. 2. Ausführungsbeispiel
1 ,55 g Hefezellwände aus dem mechanischen Aufschluß wurden in 60 ml Trispuffer-
Lösung (Tri(hydroxymethyl)aminoethan, mit Salzsäure auf pH = 7,5 eingestellt) suspendiert und auf 37,0°C temperiert. 462 mg Protease (Streptomyces griseus, Fa. SIGMA) wurden in 5 ml Puffer-Lösung gelöst und zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Nach 6,5 Stunden wurde der Feststoff abzentrifugiert und der Überstand dialysiert. Nach Gefriertrocknung erhielt man 352 mg Mannan aus dem Überstand, während im Feststoff 522 mg Glucan zu finden sind.
Das gewonnene wasserunlösliche Glucan kann chemisch durch Carboxymethylirung, Phosphatierung, Sulfatierung, Sulfonierung, Glycosidierung oder dergleichen in eine lösliche Form gebracht werden. Bei dem gewonnenen wasserunlöslichen Glucan kann durch Einwirkung von Ultraschall die Löslichkeit und dadurch die Bioverfügbarkeit erhöht und für eine zu behandelnde Person unerwünschte Nebenwirkungen verhindert werden. Es ist auch möglich, das gewonnene wasserunlösliche Glucan sowohl chemisch, wie auch durch Ultraschall zu behandeln. Ferner ist es möglich, das gewonnene wasserunlösliche Glucan bei unterschiedlichen Temperaturen zu behandeln. Kurzzeitig kann das Autoklavieren des wasserunlöslichen Glucans bei Temperaturen bis 200 C erfolgen. Bei einer Zeit des Autoklavierens des wasserunlöslichen Glucans länger als 5 min kann dies bei Temperaturen bis 150 C erfolgen. Das wasserlösliche Glucan kann auch in einem Lösungsmittel DMSO einem Dehnströmvorgang unterworfen werden. Hierzu ist es möglich, daß das wasserlösliche Glucan durch eine Lochblende, eine poröse Kugelschüttung, eine Rollenmühle oder eine Einrichtung für eine Kapillarströmung geführt wird.

Claims

P atent a sprü che 1. Verfahren zur Gewinnung hochmolekularer biologisch aktiver immunmodulierender
Polysaccharide aus Hefe Saccharomyces Cerevisiae, dadurch gekennzeichnet, daß in einer ersten Verfahrensstufe A die Hefezellen durch Einwirkung von Scherkräften mechanisch soweit zerrissen werden, daß die Zellwände vom Zellinneren getrennt sind und daß dann die Zellwandbestandteile von den Bestandteilen des Zellinneren getrennt werden, daß dann in einer zweiten Verfahrensstufe B das in der ersten Verfahrensstufe A gewonnene Zellwandmaterial gereinigt und getrocknet wird und daß dann das Zellwandmaterial in einer dritten Verfahrensstufe C einem enzymatischen Aufschluß unterzogen und das hierbei entstehende wasserunlösliche Glucan durch Zentrifugation als Feststoff und wasserlösliche Mannan im Überstand gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das in der ersten Verfahrensstufe A gewonnene Zellwandmaterial gefriergetrocknet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die in der ersten
Verfahrensstufe A gewonnenen Zellwandbestandteile durch Zentrifugation von den Bestandteilen des Zellinneren getrennt und vor der Gefriertrocknung gereinigt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die in der ersten Verfahrensstufe A gewonnenen Zellwandbestandteile an mikroporösen Membranen von den Bestandteilen des Zellinneren getrennt und durch Waschen vor der Gefriertrocknung gereinigt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die gefriergetrockneten Zellwandbestandteile in einem Puffersystems bei einem pH-Wert von 3,0 bis 11 bei
Temperaturen zwischen 20°C und 50°C über einen Zeitraum von vier bis 30 Stunden mit enzymatischen Aufschlußmitteln zur Reaktion gebracht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als enzymatisches Aufschlußmittel Proteasen aus Streptomyces griseus und/oder Lyticase (Zymoiyase) verwendet werden.
1 7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als enzymatiscnes
Aufschlußmittel Enzymcocktails aus Helix pomatia und/oder aus Cytophaga verwendet werden.
5 8. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß als enzymatisches Aufschlußmittel ein Gemisch aus Enzymen und Enzymcocktails verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene
10. wasserunlösliche Glucan chemisch durch Carboxymethylirung, Phosphatierung, Sulfatierung, Sulfonierung, Glycosidierung oder dergleichen in eine lösliche Form gebracht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß bei dem gewonnenen
15 wasserunlöslichen Glucan durch Einwirkung von Ultraschall die Löslichkeit erhöht und für eine zu behandelnde Person unerwünschte Nebenwirkungen vermindert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene wasserunlösliche Glucan sowohl chemisch wie auch durch Ultraschall behandelt wird.
20
12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene wasserunlösliche Glucan bei unterschiedlichen Temperaturen behandelt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Autoklavieren des 25 wasserunlöslichen Glucans kurzzeitig bei Temperaturen bis 200 C erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, daß das Autoklavieren des wasserunlöslichen Glucans länger als 5 min bei Temperaturen bis 150 C erfolgt.
30 15. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Glucan in einem Lösungsmittel DMSO einem Dehnströmungsvorgang unterworfen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Glucan durch eine Lochblende, eine poröse Kugelschüttung, eine Rollenmühle oder eine 35 Einrichtung für eine Kapillarströmung geführt wird.
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122 Ep: pct application non-entry in european phase