WO2000026404A1 - Technique permettant de detecter un gene affecte par un agent perturbateur endocrinien - Google Patents

Technique permettant de detecter un gene affecte par un agent perturbateur endocrinien Download PDF

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WO2000026404A1
WO2000026404A1 PCT/JP1999/005964 JP9905964W WO0026404A1 WO 2000026404 A1 WO2000026404 A1 WO 2000026404A1 JP 9905964 W JP9905964 W JP 9905964W WO 0026404 A1 WO0026404 A1 WO 0026404A1
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gene
endocrine
genes
cell
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Akihiro Kondo
Hiroaki Sagawa
Junichi Mineno
Fusao Kimizuka
Ikunoshin Kato
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Takara Shuzo Co Ltd
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to an endocrine disrupting substance that affects homeostasis of a living body and a method for detecting a gene affected by the substance.
  • Endocrine disruptors are often referred to as environmental hormones, and collectively refer to chemicals released into the environment that have hormone-like or antihormonal effects. Effects on wildlife ecosystems include changes in fertility, especially male feminization, decreased fertility, decreased hatchability, decreased survival of offspring, and abnormal reproductive behavior. In addition, as effects on human health, decreased sperm count, endometriosis, infertility, ovarian cancer, uterine cancer, prostate cancer, etc. have been suspected, but have not been proven.
  • Estradiol a natural female hormone
  • getylstilbestrol a synthetic female hormone
  • isoflavone a component harmless to humans in beans
  • bisphenol A a substance suspected of being an endocrine disruptor
  • the method of measuring the binding activity to the hormone receptor and the inhibitory activity of the hormone synthase system in vitro satisfies the necessary conditions as a method for measuring endocrine disruptors, but it is by no means sufficient.
  • in vivo methods for examining the effects on growth and morphogenesis of rats, potatoes, fish, etc. are insensitive and complex, and require a long time to examine a large number of samples.
  • the above-mentioned conventional analysis method can analyze the relationship between a substance that may cause endocrine disruption and the receptor, but cannot analyze the signal transduction system thereafter.
  • the present inventors have made intensive studies and have established a method for detecting many types of genes that are rapidly and sensitively and simultaneously affected by endocrine disruptors. Further, the present inventors have found a method for detecting an endocrine disrupting substance using a DNA array on which the gene or a fragment thereof is immobilized. Furthermore, a method for detecting a substance that may cause endocrine disruption was constructed, and the present invention was completed.
  • the gist of the present invention is:
  • a method for detecting a gene affected by an endocrine disruptor comprising a nucleic acid sample containing mRNA or its cDNA derived from a cell, tissue or organism contacted with a sample containing an endocrine disruptor was prepared, and the nucleic acid sample was hybridized with a DNA array on which a gene or a DNA fragment derived from the gene that might be affected by endocrine disruptors was immobilized, and the result was used as a nucleic acid sample from a control sample.
  • a method for detecting a gene characterized by selecting a gene that is affected by endocrine disruptors as compared to
  • Rh family GTPase and genes involved in its regulator are involved in its regulator
  • [3] A method for detecting an endocrine disrupting substance, comprising measuring expression of a gene detected by the method according to [1] or [2],
  • a method for detecting a substance that may cause endocrine disruption comprising detecting mRNA or cDNA derived from a cell, tissue or organism contacted with a sample expected to contain the substance.
  • a nucleic acid sample containing the nucleic acid sample was prepared, and the nucleic acid sample was hybridized with the DNA affected by an endocrine disrupter or a DNA fragment having a DNA fragment derived from the gene immobilized thereon.
  • a method of detecting substances that may cause endocrine disruption compared to
  • Substances that may cause endocrine disruption belong to the following categories. Method for detecting endocrine disruptors described in [5]:
  • Rh family GTPase and genes involved in its regulator are involved in its regulator
  • the endocrine disruptor is also called an exogenous endocrine disruptor or an environmental hormone, but when taken up in an animal body, the normal endocrine disruptor normally operates in the body.
  • Exogenous substances that affect hormonal action including those that maintain, promote and suppress normal hormonal action. It also includes substances that can affect normal hormonal effects.
  • Category 1 organic chlorine-based compounds (eg, organic chlorine-based compounds in general, polychlorinated bicarbonate (PCB)), (2) Category 2: phenols ( For example, phenols in general, bisphenol A,
  • PCB polychlorinated bicarbonate
  • 2,4-Dichroic phenol, pentachlorophenol (3) Category 3: phthalates (eg, general phthalates), (4) Category 4: aromatic hydrocarbons (eg, benzo ( a) pyrene, di-2-ethylhexyl adipate (DEHA), benzophenone, 4-nitrotoluene, styrene dimer and trimer, 1,2-dibromo-3-chloropronocene, styrene, n -Butylbenzene), (5) Categories
  • Pesticides eg, pesticides in general, 2,4,5-T (trichlorophenoxyacetic acid), 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid), benomyl, amitrol, mesomil
  • Category 6 Organotin compounds
  • Category 7 Seven categories of estrogen, dioxins and power categories that are not classified as power categories. It is classified as exempt from Myrex, Toxaphen, Aldicarb, and Keepon (Chronore decon). Table 1 shows them.
  • PCP Pentachlorophenol
  • C5-C9 Alkyl phenol
  • Maneb is an endocrine disrupter but not power category vs. metyram
  • Endocrine disruptors are not limited to those listed above.
  • the effects and toxicity of getylstilbestrol (DES) and estrogen (female hormone), which are known to cause vaginal cancer in humans, have been confirmed.
  • Bis Huyunault Leu A etc. are also considered to have endocrine disrupting effects.
  • the primary actions of these substances include: 1) direct action with hormone receptors (eg, synthetic hormone preparations, DDT, phthalate, etc.), 2) action via other receptors (eg, dioxin, etc.), 3) Metabolic inhibitory effects (eg, steroid metabolism inhibitors, inhibitors of aromatase-5-reductase, etc.), 4) Other system-mediated effects (eg, substances that affect the nervous system and immune system), etc. And their modes of action are diverse [Chemistry, Vol. 53, No. 7, pp. 12-15 (1998)].
  • hormone receptors eg, synthetic hormone preparations, DDT, phthalate, etc.
  • Other receptors eg, dioxin, etc.
  • Other system-mediated effects eg, substances that affect the nervous system and immune system
  • modes of action are diverse [Chemistry, Vol. 53, No. 7, pp. 12-15 (1998)].
  • the gene affected by an endocrine disrupter described herein is defined as a gene whose expression is promoted or suppressed by the endocrine disrupter as compared with a control.
  • the gene may be of one type or a plurality of types. Therefore, the gene to be immobilized on the D NAT lei of the present invention should be selected from the viewpoint that the endocrine disrupter directly and / or indirectly participates in a factor that affects the expression thereof. Both those whose expression is promoted and those whose expression is suppressed can be suitably used.
  • the candidate for the gene (that is, a gene that may be affected by an endocrine disrupting substance) is not particularly limited.
  • nuclear receptor or nuclear receptor Oia genes involved in nuclear receptor or nuclear receptor transcriptional coupling, 2) ⁇ genes involved in kinase-type signal transduction; (3) gonad differentiation (4) genes involved in receptor-type kinase; (5) genes involved in undermediate filament markers;
  • Genes involved in cell cycle & growth regulators Genes involved in oncogenes and tumor suppressors, (8) Apoptosis Genes involved in DNA damage response, repair & recombination, (10) genes involved in receptors, (11) cell death and Genes involved in cell fate & development regulators, (1 2) cell adhesion, motility and invasion (cell genes involved in adhesion, motility & invasion), (1 3) genes involved in angiogenesis regulators, (14) cell invasion
  • spare precursor secreted protein acidic J03040 cell adhesion, motility & and rich in cysteine; osteonectin
  • vitronectin precursor serum spreading X03168 cell adhesion, motility &factor; S-protein (contains invasion
  • HSPG2 heparan sulfate proteoglycan
  • VEGF-G vascular endothelial growth factor C U43142 angiogenesis regulators precursor
  • PLGF-1 placenta growth factors 1
  • X54936 angiogenesis regulators integrin alpha 7B X74295 cell adhesion, motility & invasion
  • IGAE integrin alpha— E precursor
  • shi 25851 cell adhesion, motility & mucosal lymphocyte-1 antigen hml-1 invasion
  • FADK focal adhesion kinase
  • PYK2 motility & rich tyrosine kinase 2
  • ILK integrin-linked kinase
  • CAKbeta cell adhesion kinase beta
  • U43522 cell adhesion, motility & protein tyrosine kinase Pyk2 invasion
  • MDC9 metalloprotease / disintegrin / cysteine- U41 766 invasion regulators rich protein precursor
  • FGD1 dysplasia protein
  • ephrin type-- A receptor 2 precursor M59371 cell -cell interactions epithelial cell kinase (ECK); tyrosine- protein kinase receptor ECK
  • rho GDP dissociation inihibitor 2 (rho L20688 Rho family small GTPases & GDI 2); LY-GDI their regulator
  • rho GDP dissociation inihibitor 1 (rho X69550 Rho family small GTPases & GDI 1) their regulator
  • p2 -activated kinase p65-PAK
  • N-cadherin N-cadherin
  • S42303 cell -cell interactions cadherin-2
  • cadherin 3 placenta cadherin X63629 cell cell interactions precursor; P-cadherin
  • cadherin 5 vascular endothelial- X79981 cell cell interactions cadherin precursor; VE-cadherin; 7B4
  • CD144 antigen CD144 antigen
  • ⁇ ⁇ ⁇ As a gene that may be affected by secretory disruptors, more specifically, the estrogen receptor known to bind to the above-mentioned getylstilbestrol, bisphenol A or 17 ⁇ -estradiol Genes and genes involved in the signal transduction pathway thereof are exemplified.
  • the gene affected by the endocrine disrupting substance can be detected by the following method.
  • the DNII array used herein refers to an array in which a gene or a DNA fragment derived from the gene is immobilized on a support, and includes, for example, an array called a DNA chip.
  • the support is not particularly limited as long as it can be used for hybridization, and usually a slide glass, a silicon chip, a nitrosenololose or nylon membrane is used.
  • the gene or its DNA fragment immobilized on the support is not particularly limited, but can be prepared, for example, as follows. From the GeneBank Accession No.
  • a primer pair for PCR amplification optimal for the method of the present invention can be prepared.
  • a genomic DNA, genomic DNA library or cDNA library can be converted into a type II, and the desired PCR amplified fragment can be obtained according to the standard protocol conditions attached to a commercially available PCR kit.
  • the obtained DNA fragment can be purified using, for example, Microcon 100 (Takara Shuzo Nei) or the like. This purified DNA fragment can be suitably used in the method of the present invention.
  • the DNA array can be prepared by immobilizing the above-mentioned gene or a fragment thereof on a support into which an amino group has been introduced, for example.
  • a DNA array production apparatus for example, a DNA chip production apparatus manufactured by GMS, it is possible to produce a DNA array in which genes are aligned and immobilized at high density. it can.
  • nucleic acid sample By using such a DNA array, the amounts of various types of nucleic acid molecules contained in a nucleic acid sample can be measured simultaneously. Another advantage is that even small amounts of nucleic acid samples can be measured.
  • An arbitrary gene or a DNA fragment derived from the gene is immobilized on the DNA array used in the present invention.
  • a gene encoding a protein expected to have a function related to endocrine disrupting action or a DNA fragment derived from the gene is immobilized.
  • a chain length of about 1 kb can be suitably used. The length is not particularly limited. Even if the length is shorter or longer than the length, it can be used for hybridization with nucleic acid derived from a sample. Any chain length may be used as long as it specifically hybridizes.
  • Examples of such a gene include, but are not limited to, a hormone receptor gene, a gene encoding a cofactor of a receptor, a gene encoding a protein involved in signal transduction from a receptor, hormone biosynthesis, Examples include a gene encoding a protein involved in metabolism, or an oncogene.
  • nucleic acid sample examples include mRNA prepared from cells or tissues over time or day after contacting any endocrine disrupting substance with cells or tissues (organs) sensitive to endocrine disrupting substances, or cDNA obtained by reverse transcription reaction using mRNA as type III can be used.
  • the cells to be brought into contact with the sample containing endocrine disruptors may be those collected from an organism or cultured cells.
  • the tissue is not particularly limited as long as it is considered to be affected by endocrine disruptors. Further, the cells, tissues or organisms to be used are not particularly limited to humans.
  • the duration of contact with the endocrine disruptor can vary depending on the organism used, the endocrine disruptor and the genes affected by it.
  • a nucleic acid sample containing mRNA or its cDNA is prepared in the same manner as above from a cell, a fibrous tissue or an organism as a control, and hybridized under strict conditions. Appropriate labeling can be performed as described below so that the result of whether or not the nucleic acid sample has hybridized with DNA on the DNA array can be easily confirmed.
  • the labeling method is not particularly limited, and for example, a substance such as a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or an antigen recognized by a suitable antibody can be used.
  • a substance such as a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or an antigen recognized by a suitable antibody
  • hybridization may be performed without labeling the nucleic acid sample, and then an interactor substance that emits fluorescence or chemiluminescence may be used.
  • Hybridization of the nucleic acid sample thus obtained and DNA on the DNA array can be performed by a known method. It is natural that the hybridization and washing steps are performed under optimal conditions according to the length of the DNA on the DNA array, etc. manual), second clothes, 9.5-9.5.55 (19989).
  • a multi-wavelength detection fluorescent analyzer that can detect multiple labels, for example, two types of fluorescence, allows the use of a nucleic acid sample derived from cells, tissues, or living matter that has been brought into contact with an endocrine disruptor, and a control nucleic acid sample. Gene expression differences can be compared on the same DNAT layer. For example, a nucleic acid sample from a cell that has been contacted with an endocrine disruptor is fluorescently labeled with Cy3-dUPP, and a control nucleic acid sample is fluorescently labeled with Cy5-dUPP. By mixing the two in equal amounts and performing hybridization with the DNA array, the difference in gene expression between the two can be detected as a difference in color. Genes whose expression level changes significantly can be detected.
  • the gene is also useful as an indicator for detecting endocrine disruptors.
  • Selection of genes affected by endocrine disruptors is performed by comparing the signal intensity detected as an indicator of expression level with that obtained using a nucleic acid sample from a control sample. For example, if the value of the fluorescence signal for a sample containing endocrine disruptors divided by the fluorescence signal from a control sample is greater than 1.00, treatment with the test substance has enhanced the expression of that gene. And less than 1.00 indicates that the expression of the gene was suppressed by treatment with the test substance. A value of 1.00 indicates that the gene is unaffected by treatment with the test substance. If expression is promoted, the above value is greater than 1.10, preferably greater than 1.30, more preferably greater than 2.00. When the expression is suppressed, the above value is smaller than 0.90, preferably smaller than 0.80, more preferably smaller than 0.70, c
  • genes affected by endocrine disruptors by the method of the present invention for example, various types of genes involved in the nuclear receptor of a cell and downstream of its signal transduction pathway, can be simultaneously and rapidly performed in vitro. Sensitivity can be detected It is also possible to find that known genes are involved in new signaling pathways that have not been known before.
  • nucleic acid sample is prepared from cells, tissues or organisms that are considered to be affected by endocrine disruptors as described above, and hybridized in the same manner as described above. Can be measured. The results confirm the presence of endocrine disruptors.
  • a competitive RNA or DNA for the mRNA of a gene that has been confirmed to be affected by an endocrine disruptor is prepared, and is subjected to a competitive RT-PCR method using that as an internal standard.
  • the presence of endocrine disruptors can also be confirmed by quantitatively measuring the degree of expression of the gene in question.
  • the expression of genes affected by endocrine disruptors by the method of the present invention for example, the expression of nuclear receptors in cells and various genes downstream thereof, is used as an index to determine the substantial presence or absence of endocrine disruptors. The determination can be facilitated.
  • the substance that may cause endocrine disruption means a substance that may affect the normal hormonal action that is originally performed in the living body, and the action was confirmed. And those that have not yet been identified.
  • the genes that were confirmed to be affected by endocrine disrupters by the method described in (1) above were immobilized by the same method as above. And make it.
  • a nucleic acid sample is prepared from a cell, tissue, or organism that has been brought into contact with a sample expected to contain a substance that may cause endocrine disruption as described above, and hybridized as described above. Measure changes in gene expression as signal intensity differences be able to. From the results, the substance can be considered as an endocrine disruptor. In addition, not only when a change in signal is confirmed in all DNAs on the DNA array but also in a case where a change in signal is confirmed in a part of the DNA, the result indicates that the substance is regarded as an endocrine disrupting substance. You can think.
  • the detection method is optimized by further selecting the gene affected by the substance by the method described in (1) above, and the detection method is improved.
  • a substance that causes endocrine disruption of the substance can be detected.
  • a competitive RT-PCR method in which competitive RNA or DNA for mRNA of a gene that has been confirmed to be affected by endocrine disruptors as described above is prepared and used as an internal standard.
  • the degree of endocrine disruption can be quantitatively detected from gene expression. That is, there is no particular limitation on the method for detecting and quantifying the expression of the gene affected by the endocrine disrupting substance obtained by the method described in the above (1), as long as the method can detect and quantify the gene.
  • the above method can also be suitably used.
  • the DNA array of the present invention includes an array in which a gene or a fragment thereof is immobilized on a support, and includes, for example, an array called a DNA chip.
  • the support used for the DNA array of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for hybridization, and usually a slide glass, a silicon chip, a nitrocellulose or nylon membrane or the like is used. More preferably, any material may be used as long as it is non-porous and has a structure with a smooth surface, and is not particularly limited. For example, glass such as slide glass can be suitably used.
  • the surface of the support may be any as long as it can immobilize DNA by covalent or non-covalent bonds, and those having a hydrophilic or hydrophobic functional group on the surface of the support can be suitably used. There is no particular limitation.
  • those having a hydroxyl group, an amino group, a thiol group, an aldehyde group, a carboxyl group, an acyl group and the like can be preferably used.
  • These functional groups may be present as surface characteristics of the support itself, or may be introduced by surface treatment.
  • a surface-treated product for example, glass is used for a market such as aminoaminosilane. Examples include those treated with a commercially available silane coupling agent and those treated with a polycation such as polylysine or polyethyleneimine. Some of the treated slide glasses are commercially available.
  • the DNA array of the present invention may be any one as long as a gene or a DNA fragment derived from the gene that is affected by an endocrine disrupting substance is fixed, and the DNA fragment derived from the gene or the gene is double-stranded.
  • a DNA microarray in which DNAs are aligned and immobilized on the same support under denaturing conditions may be used, including those in which at least a part of the immobilized DNAs is single-stranded DNA.
  • the DNA array in the present specification may be a double-stranded DNA which is denatured and aligned on the same support and spotted.
  • the density of the array is not particularly limited. For example, a high-density DNA array may be used, and an array in which DNA of 100 dots or more Zcm 2 is immobilized can be suitably used.
  • the DNA fragment to be aligned and immobilized on the support is not particularly limited, but is generally a double-stranded polynucleotide or a derivative thereof having a chain length of 50 bases or more, and a PCR (polymerase chain).
  • a single-stranded DNA or a derivative thereof which is denatured at the time of immobilization on a DNA-immobilized support and which is prepared by enzymatic amplification by a reaction method or the like can be suitably used.
  • the derivative may be modified so that it can be immobilized on the surface of the support, and is not particularly limited. For example, an amino group ⁇ ⁇ ⁇ thiol group may be added at the 5 ′ end of DNA. And DNA into which a functional group such as has been introduced.
  • the gene or its DNA fragment immobilized on the support is not particularly limited.
  • DNA amplified by a genomic DNA library or a cDNA library with a type II cDNA library can be used. Can be used. Oligonucleotides synthesized based on a known nucleotide sequence can also be used. Nucleic acids other than DNA that are known in the art to be usable for hybridization, such as RNA prepared by in vitro transcription, can also be immobilized in place of DNA.
  • the above-mentioned gene or its fragment can be prepared by a known method, for example, by immobilizing it on a support into which an amino group has been introduced.
  • the above immobilization operation was performed using a DNA array production device, For example, by using a DNA chip production apparatus manufactured by GMS, a DNA array of the present invention in which genes are aligned and immobilized can be produced.
  • a gene encoding a protein having a function related to the expression of hormone action or a fragment thereof is immobilized.
  • a fragment for example, a chain length of about 100 b to about 1 kb can be suitably used, but it is not particularly limited. Any chain length may be used as long as it specifically hybridizes in the hybridization.
  • Examples of such a gene include, but are not limited to, a hormone receptor gene, a gene encoding a cofactor of a receptor, a gene encoding a protein involved in signal transduction from a receptor, and biosynthesis of hormones.
  • a gene encoding a protein involved in progeny tr, or an oncogene may be mentioned.
  • a gene affected by an endocrine disrupting substance obtained by the method described in the above (1) may be fixed. Furthermore, (1) Since all the genes affected by endocrine disruptors can be obtained by the method described above, it is necessary to prepare a DNA array for detecting genes affected by endocrine disrupters in which all of the genes are immobilized. Can be.
  • a nuclear receptor in a cell and a gene involved downstream of its signal transduction pathway can be measured quickly and with high sensitivity in vitro. Therefore, the presence or absence of a substance that may cause endocrine disruption can be substantially easily determined.
  • Example 1
  • Table 3 shows genes that may be affected by endocrine disruptors.
  • human and mouse-derived cells and fibroblast mRNA (Clontech was amplified by RT-PCR (reverse transcription-PCR) method. Analyze the nucleotide sequence of the amplified cDNA, confirm that the fragment is the target fragment, collect the amplified fragment by ethanol precipitation, and adjust to 1 ⁇ M with 10 OmM carbonate buffer (pH 9.5). Dissolved.
  • a ⁇ -actin gene was prepared as a housekeeping gene, and a plasmid pUC18 was prepared in the same manner as a negative control.
  • mice Ten 2-day-old female mice were divided into an endocrine disruptor-administered group and a non-administered group.
  • the administration group received 0.1 mg / mouse / getylstilbestrol (DES), which could cause endocrine disruption. They were injected intravenously for two days at the rate of day. On the fourth day, the ovaries were removed and mRNA was prepared using an mRNA extraction kit (Qiagen).
  • RNA Approximately 3 zg of mRNA, oligo dT primer, dNTP containing Cy3-dUTP (Amersham) for the treated group or Cy5-dUTP (Amersham) for the non-treated group, and reverse transcriptase ( (Gibco BRL), gel filtration, then concentration under reduced pressure, and dissolved in 4XSSCZ0.2% SDS to prepare fluorescently labeled cDNA.
  • the culture plates 1 2 Ueru, placed 2 X 1 0 5 cells per Ueru, Preserved in the same medium for 24 hours-After removing the medium, the DME medium containing 5% human serum from which steroid hormones have been removed by treatment with activated carbon-dextran, and the presence of 1 OpM 17-
  • FBS Shi fetal serum
  • CSFl receptor-1 Commercial primer 19.
  • CSFl receptor-2 3 1, 32
  • a DNA fragment of about 100 b to about 1 kb was prepared from cDNA using each primer pair shown in Table 4 by the method described in Example 1, and a DNA array on which the DNA fragment was spotted was prepared.
  • each gene of cathepsin G, NGF receptor, and CSF1 receptor was amplified using the primer for the gene in the Human UniGene DNA (manufactured by Research Genetics) set.
  • 24-hour treatment grown in DME medium containing 10% fetal serum (FBS) After the treated human breast cancer cells MCF-7 were treated with trypsin, 2 ⁇ 10 6 cells per dish were placed in a culture dish having a diameter of 10 cm and kept in the same medium for 24 hours. After removing the medium, a DME medium containing 5% human serum from which steroid hormones have been removed by treatment with activated carbon-dextran, 1 OnM of 17- ⁇ -estradiol ( ⁇ 2 ) and 1 OnM of getyl stillbest Roll (DES) or 5 ⁇
  • FBS fetal serum
  • the cells were cultured for 24 hours in the presence of bisphenol A (BisA).
  • Bisphenol A Bisphenol A
  • a sample in the absence of the above-mentioned chemical substance was prepared in the same manner.
  • the cells after each treatment were collected, and all RNA was extracted by the method described in Example 2 (1).
  • Reaction solution A Total RNA about 1300; ug, 10 / ig oligo dT primer (Takara Shuzo) and 20 ⁇ l getyl pyrocarbonate (DEPC, Wako Pure Chemical Industries) Treated water.
  • Reaction solution B Buffer for 5X AMV RTase (Life Science) 12 ⁇ m
  • reaction solution A was kept at 70 ° C. for 10 minutes, and then cooled on an ice bath. Thereafter, the reaction solution B was added, and the mixture was kept at 42 ° C for 5 minutes. Thereafter, about 60 U of AMV RTase (manufactured by Life Science) was further added, and the reaction solution was adjusted to 60/1 with DEPC-treated water. This RT reaction solution was kept at 42 ° C for 70 minutes. To this reaction solution was added a 500 mM EDTA solution (7.5 / 1) and 1 M sodium hydroxide (15 ⁇ l), and the mixture was kept at 60 ° C. for 1 hour to decompose type I RNA.
  • AMV RTase manufactured by Life Science
  • Immobilized gene name DE S treatment B is A treatment E 2 treatment
  • genes other than those that are overexpressed compared to control cells genes that are suppressed.
  • genes used in this embodiment as shown in Table 5, although often not Akirana parts in the pathway or mechanism or the like to the stimulus E 2, deep gene and considered related to estrogen It has been confirmed that many genes are affected and their expression is promoted (for example, p300 / CBP, ACTR, RIP 140, TI F2, PDGF receptor, VEGF receptor gene).
  • VEGF receptor gene The presence of the VEGF receptor gene was considered to have less effect on the gene than in the case of DES stimulation. However, in the case of 24-hour culture treatment, the expression of genes such as kinase type JNK2 and BMK2, and receptor type kinase VEGF receptor is suppressed. It was confirmed that gene expression was regulated in different patterns. As described above, the use of the chip of the present invention provides a method for observing significant signal fluctuations in expression for each treatment substance and each treatment time, and suppresses the expression of genes affected by endocrine disrupting substances, particularly, the expression. Genes could be clearly detected. Industrial applicability
  • the method of the present invention has an excellent effect that various kinds of genes affected by endocrine disrupting substances can be simultaneously detected in vitro rapidly and with high sensitivity.
  • the present invention also provides a DNA array capable of rapidly and highly sensitively detecting genes affected by endocrine disruptors. It is also useful as a method for detecting a gene involved in a new signaling pathway that has not been known before. Furthermore, the presence or absence of endocrine disrupting substances or substances that may cause endocrine disruption can be determined using the expression of various types of genes affected by endocrine disrupting substances obtained by the method of the present invention as an index. It has an excellent effect. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 1 Designed oligonucleotide primer to amplify Smad3 mRNA.
  • SEQ ID NO: 2 Designed oligonucleotide primer to amplify Smad3 mRNA.
  • SEQ ID NO: 3 Designed oligonucleotide primer to amplify VEGF receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 4 Designed oligonucleotide primer to amplify VEGF receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 5 Designed oligonucleotide primer to amplify ACTR mRNA.
  • SEQ ID NO: 6 Designed oligonucleotide primer to amplify ACTR mRNA.
  • SEQ ID NO: 7 Designed oligonucleotide primer to amplify N-CoR / SMRT mRNA.
  • SEQ ID NO: 8 Designed oligonucleotide primer to amplify N_ CoR / SMRT mRNA.
  • SEQ ID NO: 9 Designed oligonucleotide primer to amplify efp mRNA.
  • SEQ ID NO: 10 Designed oligonucleotide primer to amplify efp mRNA.
  • SEQ ID NO: 11 Designed oligonucleotide primer to amplify c- Myc-
  • SEQ ID NO: 12 Designed oligonucleotide primer to amplify c- Myc-1 mRNA.
  • SEQ ID NO: 13 Designed oligonucleotide primer to amplify vitamin D receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 14 Designed oligonucleotide primer to amplify vitamin D receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 15 Designed oligonucleotide primer to amplify c-Myc-
  • SEQ ID NO: 16 Designed oligonucleotide primer to amplify c-Myc-
  • SEQ ID NO: 17 Designed oligonucleotide primer to amplify Bax mRNA.
  • SEQ ID NO: 18 Designed oligonucleotide primer to amplify Bax mRNA.
  • SEQ ID NO: 19 Designed oligonucleotide primer to amplify JNKl mRNA.
  • SEQ ID NO: 20 Designed oligonucleotide primer to amplify JNKl mRNA.
  • SEQ ID N0: 21 Designed oligonucleotide primer to amplify p38 mRNA.
  • SEQ ID NO: 22 Designed oligonucleotide primer to amplify p38 mRNA.
  • SEQ ID NO: 23 Designed oligonucleotide primer to amplify TRIP 1 mRNA.
  • SEQ ID NO: 24 Designed oligonucleotide primer to amplify TRIP 1 mRNA.
  • SEQ ID NO: 25 Designed oligonucleotide primer to amplify ARA 70 mRNA.
  • SEQ ID NO: 26 Designed oligonucleotide primer to amplify ARA 70 mRNA.
  • SEQ ID NO: 27 Designed oligonucleotide primer to amplify insulin receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 28 Designed oligonucleotide primer to amplify insulin receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 29 Designed oligonucleotide primer to amplify PDGF receptor mRNA.
  • SEQ ID N0: 30 Designed oligonucleotide primer to amplify PDGF receptor mRNA.
  • SEQ ID N0: 31 Designed oligonucleotide primer to amplify CSFl receptor-2 mRNA.
  • SEQ ID NO: 32 Designed oligonucleotide primer to amplify CSFl receptor-2 mRNA.
  • SEQ ID N0: 33 Designed oligonucleotide primer to amplify FGF receptor mRNA.
  • SEQ ID NO: 34 Designed oligonucleotide primer to amplify FGF receptor mRNA.
  • SEQ ID N0: 35 Designed oligonucleotide primer to amplify p38 gamma mRNA.
  • SEQ ID N0: 36 Designed oligonucleotide primer to amplify p38 gamma mRNA.
  • SEQ ID NO: 37 Designed oligonucleotide primer to amplify Bel-X mRNA.
  • SEQ ID NO: 38 Designed oligonucleotide primer to amplify Bel- X mRNA.
  • SEQ ID N0: 39 Designed oligonucleotide primer to amplify c- Myc-
  • SEQ ID N0: 40 Designed oligonucleotide primer to amplify c-Myc-
  • SEQ ID N0: 41 Designed oligonucleotide primer to amplify pS2 protein mRNA.
  • SEQ ID N0: 42 Designed oligonucleotide primer to amplify pS2 protein mRNA.
  • SEQ ID NO: 43 Designed oligonucleotide primer to amplify lactoferrin mRNA.
  • SEQ ID N0: 44 Designed oligonucleotide primer to amplify lactoferrin mRNA.
  • SEQ ID N0: 45 Designed oligonucleotide primer to amplify RIP 140 mRNA.
  • SEQ ID N0: 46 Designed oligonucleotide primer to amplify RIP
  • SEQ ID N0: 47 Designed oligonucleotide primer to amplify TIF2 mRNA.
  • SEQ ID N0: 48 Designed oligonucleotide primer to amplify TIF2 mRNA.
  • SEQ ID N0: 49 Designed oligonucleotide primer to amplify JNK2 mRNA.
  • SEQ ID NO: 50 Designed oligonucleotide primer to amplify JNK2 mRNA.
  • SEQ ID NO: 51 Designed oligonucleotide primer to amplify Bax delta mRNA.
  • SEQ ID N0: 52 Designed oligonucleotide primer to amplify Bax delta mRNA.
  • SEQ ID NO: 53 Designed oligonucleotide primer to amplify BMK-l mRNA.
  • SEQ ID N0: 54 Designed oligonucleotide primer to amplify BMK-l mRNA.
  • SEQ ID NO: 55 Designed oligonucleotide primer to amplify BMK-2 mRNA.
  • SEQ ID N0: 56 Designed oligonucleotide primer to amplify BMK-2 mRNA.
  • SEQ ID NO: 57 Designed oligonucleotide primer to amplify Src-1 mRNA.
  • SEQ ID NO: 58 Designed oligonucleotide primer to amplify Src-1 mRNA.
  • SEQ ID NO: 59 Designed oligonucleotide primer to amplify p300 / CBP mRNA.
  • SEQ ID NO: 60 Designed oligonucleotide primer to amplify p300 / CBP mRNA.
  • SEQ ID N0: 61 Designed oligonucleotide primer to amplify ⁇ -act in mRNA.
  • SEQ ID NO: 62 Designed oligonucleotide primer to amplify ⁇ -act in mRNA.

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Description

明 細 書 内分泌かく乱物質によつて影響を受ける遺伝子の検出方法 技術分野
本発明は、 生体の恒常性に影響をおよぼす内分泌かく乱物質、 及ぴ該物質の影 響を受ける遺伝子の検出方法に関する。 背景技術
内分泌かく乱物質は、 しばしば環境ホルモンともよばれており、 環境中に放出 された化学物質のうちホルモン類似作用あるいは抗ホルモン作用が見出されたも のを総称して言う。 野生動物の生態系への影響としては、 生殖能の変化、 特に雄 の雌化、 生殖能の低下、 ふ化率の低下、 子の生存率の低下、 生殖行動の異常等が 報告されている。 また、 ヒ トの健康への影響としては、 精子数の減少、 子宮内膜 症、 不妊、 卵巣ガン、 子宮ガン、 前立腺ガン等が疑われているが、 証明はされて いない。
内分泌かく乱を引き起こすと考えられている物質 （群） については、 環境庁の 「外因性内分泌撹乱化学物質問題に関する研究班」 1 9 9 7年 7月の中間報告に おいて報告されている。 しかしながら、 こうした物質は、 今後の調査 ·研究の過 程でさらに増えていくことが予想されている。
一方、 内分泌かく乱物質の測定法としては、 インビトロとインビボの 2通りの 方法が知られており、 前者では、 エストロゲンレセプターやアンドロゲンレセプ ターとの結合活性を測定する方法や、 ホルモン合成酵素系の阻害活性を測定する 方法が知られている。 後者では、 出生後日齢の異なるラットの各種ホルモン産生 および組織形成異常を測定する方法、 力エルの変態異常を測定する方法、 サカナ の成熟異常を測定する方法等が知られている [アナリティカル ケミストリー (Analytical Chemi stry) 第 7 0卷、 第 1 5号、 第 5 2 8 A〜 5 3 2 A頁 （ 1 9 9 8 ) ] 0
しかしながら現在のところ、 注目されている内分泌かく乱物質と疑われている 物質が本当に内分泌かく乱を引き起こすのか、 もし引き起こすならどのようなメ 力二ズムで影響を及ぼしているのか、 さらに、 どのくらいの量をどれくらいの時 間摂取すると危険なのかについての明解な解答は得られていない。
例えば、 現在行われているホルモンレセプターとの結合試験は、 一次スクリー ニングという見地からすれば、 必要かつ重要な方法である。 しかし、 この方法で 得られる結果は、 内分泌かく乱物質であることを保証するものではない。 すなわ ち、 エストラジオール （天然女性ホルモン） もジェチルスチルベストロール （合 成女性ホルモン） もイソフラボン （豆に含まれるヒトには無害な成分） もビスフ ェノール A (内分泌かく乱物質と疑われている物質） も E C5 ()の値に差はあるも のの、 全てエストロゲンレセプターに結合するため、 このアツセィ方法ではどの 程度の内分泌かく乱作用を持っているか区別できない。 これは、 従来の酵母を用 いたアツセィ系、 培養細胞を用いる系、 ネズミの子宫重量を測定する系などのい ずれの方法でも同じである。
すなわち現在のホルモンレセプターへの結合活性やホルモン合成酵素系の阻害 活性を、 インビトロで測定する方法は、 内分泌かく乱物質測定法としての必要条 件は満たしているが、 決して十分条件ではない。 また、 ラット、 力エル、 サカナ 等の生育や形態形成に及ぼす影響をインビボで調べる方法は、 感度が低い上複雑 で、 多数のサンプルを調べるには長時間を必要とする。
また、 前述の従来の解析方法では、 内分泌かく乱の可能性がある物質と受容体 との関係は解析できても、 それ以降のシグナル伝達系についての解析はできなレヽ 上記のように環境ホルモンの問題においては、 内分泌かく乱物質を確定し、 ま た該物質が内分泌系に与える影響を調べる必要性がある。 つまり、 内分泌かく乱 物質において、 どのようなシグナル伝達経路に影響を与えているのか、 また内分 泌かく乱を引き起こすのはどういう物質なのかを解析する方法が求められている。 発明の目的
本発明の目的は、 （1 ) 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子の検出方法、 ( 2 ) 該方法により検出された遺伝子の発現を測定する内分泌かく乱物質の影響 を受ける遺伝子の検出方法、 （3 ) 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子もし くは該遺伝子由来の DN A断片を固定化した DN Aアレイ、 及び （4) 内分泌か く乱を引き起こす可能性のある物質の検出方法を提供することにある。 発明の要旨
本発明者らは鋭意研究の結果、 迅速、 高感度でしかも同時に内分泌かく乱物質 によって影響を受ける多種類の遺伝子を検出する方法を構築した。 また、 該遺伝 子もしくはその断片を固定化した DN Aアレイを用いて、 内分泌かく乱物質を検 出する方法を見出した。 さらに、 内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質の 検出方法を構築し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明の要旨は、
[1] 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を検出する方法であって、 内分泌 力べ乱物質を含む試料と接触させた細胞、 組織または生物体由来の mRN Aまた はその c D N Aを含む核酸試料を調製し、 該核酸試料を内分泌かく乱物質の影響 を受ける可能性のある遺伝子もしくは該遺伝子由来の DNA断片が固定された D NAアレイとハイブリダィズさせ、 その結果を対照試料由来の核酸試料を用いた ものと比較して内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を選択することを特徴と する遺伝子の検出方法、
[ 2 ] 下記遺伝子群から選択される遺伝子もしくは該遺伝子由来の D N A断片を 使用する [ 1 ]記載の遺伝子の検出方法：
(1) 核内レセプター又は核内レセプター転写共役に関与する遺伝子群、
(2) キナーゼ型伝達に関与する遺伝子群、
(3) 性腺分化に関与する遺伝子群、
(4) レセプター型キナーゼに関与する遺伝子群、
(5) 中間フィラメントマーカーに関与する遺伝子群、
(6) 細胞周期、 成長調節に関与する遺伝子群、
(7) オンコジーン及び腫瘍抑制に関与する遺伝子群、
(7) アポト一シスに関与する遺伝子群、
(8) DNA損傷反応、 修復、 再構成に関与する遺伝子群、
(9) レセプターに関与する遺伝子群、 (10) 細胞死及び分化調節に関与する遺伝子群、
(1 1) 細胞接着、 運動性及び浸潤に関与する遺伝子群、
(1 2) 血管新生促進に関与する遺伝子群、
(1 3) 細胞浸潤に関与する遺伝子群、
(14) 細胞間相互作用に関与する遺伝子群、
(1 5) Rh oファミリー GTP a s e及びその調節因子に関与する遺伝子 群、 又は
(16) 成長因子及びサイ トカインに関与する遺伝子群、
[3] [ 1 ]または [ 2 ]記載の方法により検出された遺伝子の発現を測定すること を特徴とする内分泌かく乱物質の検出方法、
[4] 内分泌かく乱物質が下記の分類から選択されることを特徴とする [ 3 ]記載 の内分泌かく乱物質の検出方法：
(1) ダイォキシン類、
(2) 有機塩素系化合物類、
(3) フエノール類、
(4) フタル酸エステル類、
(5) 芳香族炭化水素類、
(6) 農薬類、
(7) 有機スズ化合物、
(8) エストロゲン類、 又は
(9) マイレックス、 トキサフェン、 アルディカーブ又はキーポン、
[5] 内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質を検出する方法であって、 当 該物質が含まれると予想される試料と接触させた細胞、 組織または生物体由来の mRNAまたはその c DN Aを含む核酸試料を調製し、 該核酸試料を内分泌かく 乱物質の影響を受ける遺伝子もしくは該遺伝子由来の DNA断片が固定された D NATレイとハイブリダィズさせ、 その結果を対照試料由来の核酸試料を用いた ものと比較して、 内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質を検出することを 特徴とする検出方法、
[6] 内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質が下記の分類に属すること特 徴とする [5]記載の内分泌かく乱物質の検出方法：
1) ダイォキシン類、
2) 有機塩素系化合物類、
3) フエノール類、
:4) フタル酸エステル類、
5) 芳香族炭化水素類、
6) 農薬類、
7) 有機スズ化合物、
8) エストロゲン類、 又は
9) マイレックス、 トキサフェン、 アルディカーブ又はキーポン、
[ 7 ] 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子もしくは内分泌かく乱物質の影響 を受ける可能性のある遺伝子または該遺伝子由来の D N A断片が固定されている ことを特徴とする内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子検出用 DN Aアレイ、
[8 下記遺伝子群から選択される遺伝子あるいは該遺伝子由来の D N A断片が 固定されていることを特徴とする [7]記載の DNAアレイ ：
1 ) 核内レセプター又は核内レセプター転写共役に関与する遺伝子群、
2) キナーゼ型伝達に関与する遺伝子群、
3) 性腺分化に関与する遺伝子群、
4) レセプター型キナーゼに関与する遺伝子群、
5) 中間フィラメントマーカーに関与する遺伝子群、
6) 細胞周期、 成長調節に関与する遺伝子群、
7 ) オンコジーン及び月重瘍抑制に関与する遺伝子群、
8) アポトーシスに関与する遺伝子群、
9) DNA損傷反応、 修復、 再構成に関与する遺伝子群、
10) レセプターに関与する遺伝子群、
1 1) 細胞死及び分化調節に関与する遺伝子群、
1 2) 細胞接着、 運動性及び浸潤に関与する遺伝子群、
1 3) 血管新生促進に関与する遺伝子群、
14) 細胞浸潤に関与する遺伝子群、 (1 5) 細胞間相互作用に関与する遺伝子群、
(16) Rh oファミリー GTP a s e及びその調節因子に関与する遺伝子 群、 又は
(1 7) 成長因子及びサイトカインに関与する遺伝子群、 及び
[9] 遺伝子もしくは該遺伝子由来の DNA断片がスライ ドガラスに固定されて いることを特徴とする [7] 又は [8]記載の内分泌かく乱物質によって影響を受 ける遺伝子検出用 DN Aアレイに関する。 発明の詳細な説明
(1) 本発明の内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子の検出方法
本明細書において内分泌かく乱物質とは、 外因性内分泌かく乱物質もしく は環境ホルモンとも称されるが、 動物の生体内に取込まれた場合に、 本来、 その 生体内で営まれている正常なホルモン作用に影響を与える外因性の物質を意味し、 正常なホルモン作用を維持するもの、 促進するもの及び抑制するものも含まれる。 また、 正常なホルモン作用に影響を与える可能性のある物質も含まれる。
現在、 内分泌かく乱作用を持つと疑われている物質 （群） は、 約 70である。 更にこれらの物質は、 日本環境化学会、 第 24回日本環境化学会講演会資料集
(1 998) において、 該当物質の分析方法から、 （1) カテゴリー 1 ：有機塩 素系化合物 （例、 有機塩素系化合物一般、 ポリ塩ィヒビフユニール （PCB) ) 、 (2) カテゴリー 2 ： フエノール類 （例、 フエノール類一般、 ビスフエノール A、
2， 4 -ジクロ口フエノール、 ペンタクロロフエノール） 、 (3) カテゴリー 3 ： フ タル酸エステル類 （例、 フタル酸エステル類一般） 、 （4) カテゴリー 4 ：芳香 族炭化水素類 （例、 ベンゾ（a)ピレン、 アジピン酸ジ -2-ェチルへキシル （DEH A) 、 ベンゾフエノン、 4-ニトロ トルエン、 スチレン 2量体及び 3量体、 1，2 -ジ ブロモ -3-クロロプロノくン、 スチレン、 n-ブチルベンゼン） 、 （5) カテゴリー
5 ：農薬類 （例、 農薬類一般、 2, 4,5 - T (トリクロ口フ ノキシ酢酸） 、 2,4- D (ジクロロフエノキシ酢酸）、 べノミル、 アミ トロール、 メソミル） 、 （6) カテ ゴリ一 6 ：有機スズ化合物、 （7) カテゴリー 7 ：エストロゲンの 7つのカテゴ リー、 レ、ずれの力テゴリーにも分類されていないダイォキシン類及び力テゴリー 対象外であるマイレックス、 トキサフェン、 アルディカーブ、 キーポン （クロノレ デコン） に分類されている。 それらについて表 1に示す。
カテゴリ一分類ノ物質名 ノ J ノ ^ 1 丄 ノ ノ J ソ ヽソ Jm し ノエ < ノレ只 D ) ノク ?? 、ノヽ — Δ9— キ 7 / \
^ ^ - リ 匕し ― ノレ^ ¾ ね 、ヽ
i D ) ノク /レ^^
cノ丁 \ノノノレ
■^へ• -"t" - ジ 々ソ ロ ヘベン、 じ _t し " β ^リ ノク Π ノ ノ
_/\\ -ャt. - r"? r ^ ^^-^* ,3ffA -^c
ノグ /レ^ t ノノレ
i ~~ t 二
ノレフ ノグノレ ノェ ノレ
ζ·ί ヤンシ ノレ ノ j 、、
グノレ ノへ z /レ
trans ノ丁グ ロノレ tt
ノグノレ^ノ 、 Zノレ
Γ T1 ク Jj 0 iJ iJ 、 D D L) ン
/ ノ!レ^ 1卜ソ U ヽノ 一々 つ。 てソ K Uソ z ベソゾ ピレン
ディノレドリン ァジピン酸ジ - 2 -ェチルへキシノレ エンドスノレファン （ベンゾェピン） ベンゾフエノン
ヘプタク口ノレ 4—二 トロ 卜 レエン
ヘプタク口ルエボキサイ ド スチレンの 2及び 3量体
メ トキシク口ノレ スチレン
才クタク口ロスチレン η-ブチルベンゼン カテゴリー 2 カテゴリー 5
ペンタクロロフェノール （PCP) 2, 4, 5-トリクロロフエノキシ酢酸 アルキルフエノール （C 5〜C 9 ) 2, 4 -ジクロロフエノキシ酢酸
ビスフエノール A アミ トロール
2, 4—ジクロロフエノーノレ アトラジン
カテゴリー 5 (続き） カテゴリ一 6
ァラクロ一ノレ トリプチルスズ
シマジン トリフエニノレスズ
ェチノレパラチオン
カルノくリン カテゴリー 7
マラチ才ン エス トラジオ一ノレ
メソミル
ニトロフェン いずれのカテゴリーにも分類されていな トリフノレラリン レヽもの
べノミル ダイォキシン類
マンゼブ （マンコゼブ）
マンネブ 環境ホルモン物質であるが力テゴリー対 メチラム 象外
メ トリブジン マイレックス
シぺノレメ トリン トキサフェン
エスフェンノ レレート アルディカーブ
フェンバレレート キーポン （クロノレデコン）
ぺノレメ トリ ン
ピンクロゾリン
ジネブ
内分泌かく乱物質は上記で列挙したものに限定されるものではなく、 たとえば ヒ 卜の膣癌を引き起こすことが知られているジェチルスチルベストロール （D E S ) 、 エストロゲン （女性ホルモン） 作用と毒性が確認されているビスフユノー ル A等も内分泌かく乱作用を有すると考えられる。
これらの物質の一次作用としては、 1) ホルモンレセプターとの直接作用 （例 えば、 合成ホルモン製剤、 DDT、 フタル酸エステル等） 、 2) 他のレセプター を介する作用 （例えば、 ダイォキシン等） 、 3) 代謝阻害作用 （例えば、 ステロ イド代謝阻害剤、 ァロマターゼゃ 5ひ一レダクターゼの阻害剤等） 、 4) 他のシ ステムを介する作用 （例えば、 神経系や免疫系に影響を与える物質） などが知ら れており、 作用様式は多様である [化学、 第 53卷、 第 7号、 第 12〜15頁 (1998)] 。
本明細書記載の内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子とは、 上記の内分泌か く乱物質によってその発現が対照と比較して促進もしくは抑制される遺伝子と定 義する。 該遺伝子は、 1種類でも複数の種類であってもよい。 従って本発明の D NATレイに固定化する遺伝子は、 内分泌かく乱物質が直接的及び/又は間接的 にその発現に影響を与える因子に関与している遺伝子という観点から選択すれば ょレ、。 その発現が促進されるもの及び抑制されるもののいずれもが好適に使用で きる。 該遺伝子の候補 （すなわち、 内分泌かく乱物質の影響を受ける可能性のあ る遺伝子） としては、 特に限定されるものではないが、 たとえば、 表 2に示すよ うな、 （1) 核内レセプター又は核内レセプター転写共役 (nuclear receptor or nuclear receptor transcriptional coupling) に関 す oiais子群、 、2) キナーセ型伝達 (kinase- type signal transduction; に関与す οίΗ伝子群、 (3) 性腺分化 （gonad differentiation) に関与する遺伝子群、 （4) レセプ ター型キナーゼ （receptor-type kinase) に関与する遺伝子群、 （5) 中間フィ ラメントマーカー untermediate filament markers; に関与する遺 is子群、
(6) 細胞周期、 成長調節 （cell cycle & growth regulators) に関与する遺伝 子群、 (7) オンコジーン及び腫 抑制 (oncogenes & tumor suppressors) に 関与する遺伝子群、 （8) アポトーシス （apoptosis) に関与する遺伝子群、 (9) DNA損傷反応、 修復、 再構成 （DNA damage response, repair & recombination) に関与する遺伝子群、 （10) レセプター （receptors) に関与 する遺伝子群、 （1 1) 細胞死及び分化調節 （cell fate & development regulators) に関与する遺伝子群、 （1 2) 細胞接着、 運動性及ぴ浸潤 （cell adhesion, motility & invasion) に関与する遺伝子群、 （1 3) 血管新生促進 (angiogenesis regulators) に関与する遺伝子群、 （14) 細胞浸潤
(invasion regulators) に関与する遺伝子群、 （15) 細胞間相互作用 （cell- cell interactions) に関与する遺伝子群、 (16) Rh oファミリー GTP a s e及びその調節因子 （Rho family small GTPases & their regulator) に関 与する遺伝子群、 （1 7) 成長因子及びサイトカイン （growth factors & cytokines) に関与する遺伝子群が好適に使用できる。 また、 これ以外の遺伝子 であっても内分泌かく乱物質が、 直接的及び Z又は間接的にその発現に影響を与 える可能性のある因子に関与する遺伝子も本発明の内分泌かく乱物質の影響を受 ける遺伝子に含まれる。 表 2
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Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
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spare precursor (secreted protein acidic J03040 cell adhesion, motility & and rich in cysteine; osteonectin) (ON) invasion
thrombospondin 1 recursor X14787 cell adhesion, motility & invasion
thrombospondin 2 precursor L12350 cell adhesion, motility & invasion
vitronectin precursor; serum spreading X03168 cell adhesion, motility & factor; S - protein (contains invasion
somatomedin B)
fibronectin precursor (FN) X02761 cell adhesion, motility &
invasion
heparan sulfate proteoglycan (HSPG2) M85289 cell adhesion, motility & invasion
integrin alpha subunit X68742 cell adhesion, motility & invasion
vascular endothelial growth factor C U43142 angiogenesis regulators precursor (VEGF - G)
integrin alpha— 3 chain M5991 1 cell adhesion, motility & invasion
integrin alpha - 4 subunit precursor L12002 cell adhesion, motility & Untegnn alpha— IV; 1 1 bA4 ; VLA 4; invasion
CD49D antigen
placenta growth factors 1 (PLGF-1) X54936 angiogenesis regulators integrin alpha 7B X74295 cell adhesion, motility & invasion
integrin alpha9 D25303 cell adhesion, motility & invasion
integrin alpha— E precursor (ITGAE); し 25851 cell adhesion, motility & mucosal lymphocyte - 1 antigen; hml-1 invasion
antigen; OD 103 antigen
integrin betal M34189 cell adhesion, motility & invasion
integrin beta 4 X53587 cell adhesion, motility & invasion
integrin beta - 5 subunit (ITGB5) J05633 cell adhesion, motility & invasion
integrin beta8 M73780 cell adhesion, motility & invasion
focal adhesion kinase (FADK); proline- L13616 cell adhesion, motility & rich tyrosine kinase 2 (PYK2) invasion
integrin - linked kinase (ILK) U40282 cell adhesion, motility & invasion
cell adhesion kinase beta (CAKbeta); U43522 cell adhesion, motility & protein tyrosine kinase Pyk2 invasion
paxillin U14588 cell adhesion, motility & invasion
(alpha 1 ,2-mannosidase 1 B mRNA AF027156 cell adhesion, motility &
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
metalloprotease/disintegrin/cysteine- U41 766 invasion regulators rich protein precursor (MDC9)
Π υΠυΛΥοΩ·, DMAA
Figure imgf000024_0001
DoU4o 1 invasion regulators forkhead-like 7 AF048693 Rho family small GTPases & their regulator
rhoG X61 587 Rho family small GTPases & their regulator
Rho6 protein Y07923 Rho family small GTPases & their regulator
Rho8 protein X95282 Rho family small GTPases & their regulator
ephrin - B3 precursor, eph - related U66406 cell -cell interactions receptor tyrosine kinase ligand 8
(LERK-8)
ras - like protein TC10 M31 470 Rho family small GTPases &
their regulator
ras - like small GTPase TTF Z35227 Rho family small GTPases & their regulator
rhoHPI D8581 5 Rho family small GTPases & their regulator
rho - associated coiled - coil containing U431 95 Rho family small GTPases & protein kinase p160ROCK their regulator
CDC42 GTPase- activating protein U02570 Rho family small GTPases & their regulator
T-iymphoma invasion and metastasis U1 6296 Rho family small GTPases & inducing TIAM1 their regulator
rho/rac guanine nucleotide exchange U641 05 Rho family small GTPases & factor (rho/rac GEF); faciogenital their regulator
dysplasia protein (FGD1 )
ephrin type— A receptor 2 precursor; M59371 cell -cell interactions epithelial cell kinase (ECK); tyrosine- protein kinase receptor ECK
rho GDP dissociation inihibitor 2 (rho L20688 Rho family small GTPases & GDI 2); LY-GDI their regulator
rho GDP dissociation inihibitor 1 (rho X69550 Rho family small GTPases & GDI 1 ) their regulator
p2 -activated kinase; p65 - PAK; U241 52 Rho family small GTPases & serine/threonine - protein kinase PAK - their regulator
alpha
neurahcadherin precursor (N - cadherin); S42303 cell -cell interactions cadherin - 2
cadherin— 3 placenta卜 cadherin X63629 cell cell interactions precursor; P - cadherin
cadherin— 5 vascular endothelial- X79981 cell cell interactions cadherin precursor; VE - cadherin; 7B4
antigen; CD144 antigen
cadherin - 6 D31 784 cell -cell interactions
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內分泌かく乱物質の影響を受ける可能性のある遺伝子として、 さらに、 具体的 には、 上記ジェチルスチルベストロール、 ビスフエノール Aあるいは、 1 7 β— エストラジオール等が結合することが知られているエストロゲンレセプター遺伝 子及びそのシグナル伝達経路に関与する遺伝子等が挙げられる。
上記内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子は、 以下の方法により検出するこ とができる。
本明細書において使用される DN Αアレイとは、 支持体上に遺伝子または該遺 伝子由来の D N A断片が固定されているものを示し、 例えば D N Aチップと呼称 されているものを包含する。 支持体は、 ハイブリダィゼーシヨンに使用可能なも のであれば特に限定はなく、 通常スライ ドグラス、 シリコンチップ、 ニトロセノレ ロースやナイロンの膜等が使用される。 また、 支持体上に固定される遺伝子また はその DNA断片としては、 特に限定するものではないが、 例えば、 以下のよう に調製することができる。 固定したい遺伝子あるいは遺伝子産物名のジーンバン ク ァクセッション番号 （G e n B a n k A c c e s s i o n N o . ) より 得られる遺伝子の塩基配列をもとに、 オリゴ'1^ プライマー アナリシス ソ フトウェア （O 1 i g o™ P r i me r An a l y s i s S o f t w a r e、 宝酒造社製） のようなプライマー解析 ·構築ソフトを使用して、 本発明の 方法に最適な P C R増幅用プライマー対を作製することができる。 該プライマー 対を用いて、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリーあるいは、 cDNAライ ブラリーを踌型とし、 市販の PCRキットに添付されている標準プロトコール条 件に従い、 目的の PC R増幅断片を得ることができる。 得られた該 DN A断片は、 例えば、 マイクロコン一 100 (宝酒造ネ±¾) 等を用いて精製することができる。 この精製した DN A断片は、 本発明の方法に好適に使用する事ができる。 さらに、 上記の遺伝子またはその断片を公知の方法、 例えばアミノ基を導入した支持体上 に固定することにより該 DN Aアレイを作製することができる。 また、 上記固定 化の操作を D N Aアレイ作製装置、 例えば GM S社製の D N Aチップ作製装置を 使用して行なうことにより、 遺伝子が高密度に整列、 固定化された DN Aアレイ を作製することもできる。
このような DN Aアレイを使用することにより、 核酸試料中に含まれる多種類 の核酸分子の量を同時に測定することができる。 また、 少量の核酸試料でも測定 できるという利点がある。
本発明で使用される DN Aアレイには、 任意の遺伝子、 又は該遺伝子由来の D N A断片が固定される。 特に好ましくは、 内分泌かく乱作用に関連した機能を有 することが予想されるタンパクをコードする遺伝子または該遺伝子由来の D N A 断片が固定される。 断片の場合は、 例えば、 約 1 k bの鎖長が好適に使用できる 力 特に限定されるものではなく、 該鎖長より短いあるいは長いものであっても 検体由来の核酸とハイブリダイゼーションにおレ、て特異的にハイブリダイズする ものであれば、 いずれの鎖長でもよい。 このような遺伝子としては、 特に限定さ れるものではないが、 例えばホルモンレセプター遺伝子、 レセプターのコファタ タ—をコードする遺伝子、 レセプターからのシグナル伝達に関与するタンパクを コードする遺伝子、 ホルモンの生合成もしくは代謝に関与するタンパクをコード する遺伝子、 またはオンコジーン等が挙げられる。
また、 内分泌かく乱物質の影響によってその発現が変化している遺伝子を含む 核酸試料としては、 例えば内分泌かく乱物質に感受性を示す細胞や組織 （臓器） に任意の内分泌かく乱物質を接触させた後、 経時的あるいは経日的に細胞や組織 より調製される m R N A、 もしくは該 m R N Aを铸型とした逆転写反応により得 られる c D N Aを使用することができる。
内分泌かく乱物質を含んだ試料と接触させる細胞は、 生物体から採取したもの でも培養細胞でも良い。 また、 組織は、 内分泌かく乱物質によって影響が出てい ると思われる部位であれば特に限定はない。 さらに使用する細胞、 組織もしくは 生物体は、 特にヒ トに限定されるわけではない。 内分泌かく乱物質を接触させる 時間は、 使用する生物体、 内分泌かく乱物質およびその影響を受ける遺伝子など に応じて変動し得る。
一方、 対照とする細胞、 糸且織または生物体より m R N Aもしくはその c D N A を含む核酸試料についても上記と同様に調製し、 厳密な条件下でハイブリダィゼ ーシヨンさせる。 核酸試料が D N Aアレイ上の D NAとハイブリダィゼーシヨン しているか否かの結果を容易に確認できるように下記のように適当な標識をして おくことができる。
標識方法としては特に限定されるものではないが、 例えば放射性同位元素、 蛍 光物質、 化学発光物質、 適当な抗体により認識される抗原等の物質を使用するこ とができる。 また、 核酸試料を標識することなくハイブリダィゼーシヨンを行い、 その後に蛍光、 化学発光を発するインター力レーター物質を使用してもよレ、。 こうして得られた核酸試料と上記 D N Aアレイ上の D N Aとのハイブリダィゼ ーシヨンは、 公知の方法で実施することができる。 ハイブリダィゼーシヨン及び 洗浄工程は、 D N Aアレイ上の D N Aの鎖長等に応じて最適な条件で行なうこと は当然であるが、 例えばモレキュラー クロ一ユング、 ァ ラボラトリーマニュ ァノレ (Molecular cloning, A laboratory manual) 、 第 2服、 第 9 . 5 2〜 9 . 5 5頁 （ 1 9 8 9 ) に記載の条件で行なうことができる。
内分泌かく乱物質を含んだ試料と接触させた細胞、 組織または生物体由来の核 酸試料と対照の核酸試料とのハイブリダイゼーションの結果を比較することによ り、 両者でシグナルの強度に有意な差のある遺伝子を検出することができる。 具 体的には、 上記の方法で標識された核酸試料とハイブリダィゼーシヨンを行った アレイについて放射能、 蛍光、 発光等のシグナル強度を専用測定器、 例えばクロ マトスキャナ一もしくはイメージアナライザ一等を用いて検出することによって、 そのシグナル強度の差から当該内分泌かく乱物質の影響により、 その発現量が有 意に変化する遺伝子を検出することができる。
また、 複数の標識、 例えば 2種類の蛍光を検出することができる多波長検出蛍 光アナライザーを用いれば、 内分泌かく乱物質と接触させた細胞、 組織または生 物体由来の核酸試料と対照の核酸試料との遺伝子発現の差を同じ D N ATレイ上 で比較することができる。 例えば、 内分泌かく乱物質と接触させた細胞由来の核 酸試料は C y 3— d U T Pで蛍光標識し、 対照の核酸試料は C y 5— d U T Pで 蛍光標識する。 両者を等量混合して D N Aアレイとハイブリダィゼーシヨンを行 なうことで両者の遺伝子発現の差を色の違いとして検出することができ、 その結 果から当該内分泌かく乱物質の影響によりその発現量が有意に変化する遺伝子を 検出することができる。
さらに当該遺伝子は、 内分泌かく乱物質を検出するための指標としても有用で ある。
内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子の選択は、 発現レベルの指標として検 出されるシグナル強度を、 対照試料由来の核酸試料を用いて得られるものと比較 して実施される。 例えば、 内分泌かく乱物質を含む試料についての蛍光シグナル 値を対照試料由来の蛍光シグナル値で割った数値が 1. 00より大きい場合は、 試験 物質での処理によってその遺伝子の発現が促進されていることを示し、 1. 00より 小さレ、場合は、 試験物質での処理によつてその遺伝子の発現が抑制されているこ とを示す。 また、 この数値が 1. 00の場合は、 その遺伝子は試験物質での処理の影 響を受けないことを示す。 発現が促進される場合、 上記値は 1. 10より大きく、 好 ましくは 1. 30より大きく、 より好ましくは 2. 00より大きレ、。 発現が抑制される場 合、 上記値は 0. 90より小さく、 好ましくは 0. 80より小さく、 より好ましくは 0. 70 より小さレ、 c
以上のように本発明の方法によって内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子、 例えば細胞の核内レセプタ一及びそのシグナル伝達経路の下流で関与している多 種類の遺伝子の発現を同時にィンビトロで迅速、 高感度に検出することができる また、 既知の遺伝子が従来知られていない新しいシグナル伝達経路に関与するこ とを見出すこともできる。
( 2 ) 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子の発現を指標とした内分泌かく乱 物質の検出は、 以下の方法により実施することができる。
上記内分泌かく乱物質の影響を受けていることが確認できた遺伝子について、 上記のような方法で固定化した D N Aアレイを作製する。
次に内分泌かく乱物質によって影響を受けていると考えられる細胞、 組織また は生物体より上記のように核酸試料を調製し、 上記と同様にハイブリダィズさせ て、 シグナル強度の差から遺伝子発現の変化を測定することができる。 その結果 から内分泌かく乱物質の存在を確認することができる。
また、 別の態様としては、 内分泌かく乱物質の影響を受けていることが確認で きた遺伝子の m R N Aの競合 R N Aもしくは D N Aを作製し、 それを内部標準と した競合 R T— P C R法により影響を受けている遺伝子の発現の度合いを定量的 に測定することからも内分泌かく乱物質の存在を確認することができる。
以上のように本発明の方法によつて内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子、 例えば細胞の核内レセプター及びその下流の多種類の遺伝子の発現を指標にして、 内分泌かく乱物質の有無の実質的な判定を容易にすることができる。
( 3 ) 内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質の検出は、 以下の方法により 実施することができる。
本明細書において内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質とは、 本来、 そ の生体内で営まれている正常なホルモン作用に影響を与える可能性のある物質を 意味し、 その作用が確認されたものおよびいまだ確認されていないものも含まれ る。
内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質の検出のための D NAアレイは、 上記 （1 ) 記載の方法で内分泌かく乱物質の影響を受けていることが確認できた 遺伝子を上記と同様の方法で固定化して作製する。
次に内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質を含むと予想される試料と接 触させた細胞、 組織または生物体より上記のように核酸試料を調製し、 上記と同 様にハイブリダイズさせて、 遺伝子発現の変化をシグナル強度差として測定する ことができる。 その結果から該物質は、 内分泌かく乱物質と考えることができる。 また、 該 D N Aアレイ上の全 D N Aにおいてシグナルの変化が確認される場合 のみならずその一部の D N Aにおいてシグナルの変化が確認される場合において も同様にその結果から該物質は、 内分泌かく乱物質と考えることができる。 特に その一部の D N Aにおいてシグナルの変化が確認される場合には、 前述 （1 ) 記 載の方法で該物質の影響を受ける遺伝子をさらに別に選択することにより検出方 法を最適化し、 より的確に該物質の内分泌かく乱を引き起こす物質を検出するこ とができる。
また、 別の態様としては、 上記のように内分泌かく乱物質の影響を受けている ことが確認できた遺伝子の m R N Aの競合 R N Aもしくは D N Aを作製し、 それ を内部標準とした競合 R T— P C R法により内分泌かく乱を引き起こす度合いを 遺伝子の発現より定量的に検出することもできる。 即ち、 前述 （1 ) 記載の方法 で得られた内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を検出、 発現を定量する方法 は、 特に限定はなく、 該遺伝子の検出 ·定量ができる方法であれば、 いずれの方 法も好適に使用できる。
( 4 ) 本発明の D NAアレイ
本発明の D N Aアレイとは、 支持体上に遺伝子またはその断片が固定されてい るものをレ、い、 例えば D N Aチップと呼称されているものを包含する。
本発明の D N Aアレイに用いる支持体は、 ハイブリダィゼーシヨンに使用可能 なものであれば特に限定はなく、 通常スライ ドグラス、 シリコンチップ、 ニトロ セルロースやナイロンの膜等が使用される。 更に好ましくは、 非多孔性で、 表面 が滑らかな構造を有する材質であれば良く、 特に限定はないが、 例えばスライ ド ガラス等のガラスが好適に使用できる。 支持体の表面は、 共有結合または非共有 結合により D N Aを固定化できるものであればいずれでもよく、 支持体の表面に 親水性又は疎水性の官能基を有しているものが好適に使用でき、 特に限定はない 力 例えば、 水酸基、 アミノ基、 チオール基、 アルデヒ ド基、 カルボキシル基、 ァシル基等を有しているものが好適に使用できる。 これらの官能基は、 支持体自 体の表面特性として存在していてもよいが、 表面処理によって導入してもよい。 このような表面処理物としては、 例えば、 ガラスをァミノアルキルシラン等の市 販のシランカップリング剤で処理したものや、 ポリリジンやポリエチレンィミン 等のポリ陽イオンで処理したもの等が挙げられる。 また、 これらの処理を施した スライ ドガラスの一部は市販されている。
本発明の D N Aアレイは、 内分泌かく乱物質によつて影響を受ける遺伝子ある いは該遺伝子由来の DNA断片が固定されていればよく、 該遺伝子あるいは該遺 伝子由来の D N A断片が、 二本鎖 D N Aを変性条件において同一支持体に整列固 定化された DN Aマイクロアレイでもよく、 固定化された DN Aの少なくとも一 部が一本鎖 DNAであるものも含まれる。 また、 本明細書の DNAアレイは、 二 本鎖 DNAを変性下において、 同一支持体に整列させてスポットしたものでもよ い。 さらに本発明の DN Aアレイにおいて、 該アレイの密度について特に限定は ないが、 例えば、 高密度 DN Aアレイでもよく、 100ドット Zcm2以上の D N Aが固定化されたァレイが好適に使用できる。
本発明において支持体に整列固定化する D N A断片とは特に限定はなレ、が、 一 般的には鎖長が 50塩基以上の二本鎖ポリヌクレオチドまたはその誘導体であつ て、 PCR (polymerase chain reaction) 法等により、 酵素的に増幅して調製 されるものを、 DNAの固定化支持体への固定化時に変性し、 一本鎖 DNAまた はその誘導体としたものが好適に使用できる。 該誘導体としては、 支持体表面へ の固定化を可能にするような修飾を付されたものであれば良く、 特に限定するも のではないが、 例えば DNAの 5' 末端にアミノ基ゃチオール基等の官能基が導 入された DNAが挙げられる。
また、 支持体上に固定される遺伝子またはその DNA断片としては、 特に限定 するものではないが、 例えばゲノム DNAライブラリ一あるいは c DNAライブ ラリーを铸型とした PC R等によって増幅された DN Aを使用する事ができる。 公知のヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドを使用すること も可能である。 ハイプリダイゼーシヨンに使用できることが当該分野において公 知である DN A以外の核酸、 例えば、 インビトロ転写によって調製された RNA を、 DN Aの代わりに固定することもできる。 上記の遺伝子またはその断片を公 知の方法、 例えばアミノ基を導入した支持体上に固定することにより該 D NAT レイを作製することができる。 また、 上記固定化の操作を DN Aアレイ作製装置、 例えば GM S社製の D N Aチップ作製装置を使用して行なうことにより、 遺伝子 が整列、 固定化された本発明の D N Aアレイを作製することができる。
本発明で使用される D N Aアレイには、 ホルモンの作用発現に関連した機能を 有するタンパクをコードする遺伝子またはその断片が固定される。 断片の場合は、 例えば、 約 1 0 0 b〜約 1 k bの鎖長が好適に使用できるが、 特に限定されるも のではなく、 該鎖長より短いあるいは長いものであっても検体由来の核酸とハイ ブリダィゼ一シヨンにおいて特異的にハイブリダィズするものであれば、 いずれ の鎖長でもよい。 このような遺伝子としては、 特に限定されるものではないが、 例えばホルモンレセプター遺伝子、 レセプターのコファクターをコードする遺伝 子、 レセプターからのシグナル伝達に関与するタンパクをコードする遺伝子、 ホ ルモンの生合成もしくは代 trに関与するタンパクをコ一ドする遺伝子、 またはォ ンコジーン等が挙げられる。 さらに、 例えば、 前記 （1 ) 記載の方法で得られた 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を固定ィヒしてもよい。 さらに、 （1 ) 記 載の方法で内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を全て得ることができるため、 それらの遺伝子を全て固定化した内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子検出用 D N Aアレイを作製することができる。
以上のように本発明の方法及び本発明の D N Aアレイを用いることによって、 例えば細胞の核内レセプター及びそのシグナル伝達経路の下流で関与している遺 伝子をインビトロで迅速、 高感度で測定できるため、 内分泌かく乱を引き起こす 可能性のある物質の有無を実質的に容易に判定することができる。
以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、 本発明は実施例の範 囲に限定されるものではない。 実施例 1
内分泌かく乱物質の影響を受ける可能性のある遺伝子を表 3に示した。 表 3 因子名 （遺伝子産物） GenBank登録番号
1 . 核内レセプター又は核内レセプター転写共役因子
P300/CBP U47741
SRC-1 U40396
N-CoR/SMRT AF044209/U37146
ACTR AF036892
RIP140 X84373
TRIP1 L38810
TIF2 X97674
Smad3 AB004924 efp D21205 lactoferrin X53961 progesteron receptor M15716 cathepsin G J04990 pS2 protein X52003 prolactin E02152
ARA70 L49399 vitamin D receptor J03258
2 .キナーゼ型伝達因子
p38 L35253 p38 gamma U66243
JNK1 L26318
JNK2 U09759
JNK3 AA992006
ERK1 M76585
ΒΜΚα,β,γ U29725-U29727 因子名 （遺伝子産物） GenBank登録番号
3. 性腺分化因子
DAX1 U31929
S0X9 Z46629
WT1 X51630
SRY L10101
Ad響/ SF- 1 D84206-D84209
EMX2 X68880
4. オンコジーン
c~Fos K00650/M16287
c-Myc J00120/K01908
Bel- 2 M13994- 13995
Bax α,β,γ L22473-L22475
Bax δ U19599
Bcl-x U72398
5. レセプター型キナーゼ
NGF receptor M14764
FGF receptor M34641
VEGF receptor AF016050
PDGF receptor M21616
CSF1 receptor M33208-M33210
EGF receptor 29366
insulin receptor M10051
これらの遺伝子の c DNAの 3 ' 側非翻訳領域を含む約 1 k bの断片を、 以下 のようにして調製した。
すなわち、 ヒ トおよびマウス由来の細胞および糸且織 mRNA (クローンテック 社製） を铸型に、 それぞれ RT— PCR (逆転写一 PC R) 法により目的の cD NA断片を増幅した。 増幅した cDN Aの塩基配列分析を行って、 目的の断片で あることを確認するとともに、 エタノール沈殿法により増幅断片を回収し、 10 OmM 炭酸バッファー （pH9. 5) で 1 μ Mとなるように溶解した。 この他、 ハウスキーピング遺伝子として β—ァクチン遺伝子を、 また、 ネガティブコント ロールとしてプラスミ ド pUC l 8をそれぞれ同様に調製した。 これらを DNA チップ作製装置 （GMS社製） を用いてアミノ基導入スライ ドガラス （シグマ社 製） にスポットし、 UV照射により固定した。 スライドを 0. 2%SDS、 次い で蒸留水で洗浄乾燥して DN Aアレイとした。 実施例 2
(1) マウスへの投与
10匹の 2日齢の雌マウスを、 内分泌かく乱物質投与群と非投与群に分け、 投 与群には内分泌かく乱を引き起こす可能性のあるジェチルスチルべストロール (DES) を 0. 1 mg/マウス/ d a yの割合で、 2日間静脈注射した。 4日 目に卵巣を摘出し、 mRNA抽出キット （キアゲン社製） を用いて mRNAを調 製した。
約 3 z gの mRNA、 オリゴ dTプライマー、 投与群には C y 3— d UT P (アマシャム社製） または非投与群には Cy 5— dUTP (アマシャム社製） を 含む dNTP、 および逆転写酵素 （ギブコー BRL社製） を用いて cDNA合成 反応を行い、 ゲルろ過、 次いで減圧濃縮し、 4 XSSCZ0. 2%SDSに溶 解して蛍光標識 c D N Aを調製した。
(2) 培養細胞の処理
5%ゥシ胎児血清 （FBS) を含む DME培地で生育させたヒ ト乳がん細胞 M C F— 7をトリプシン処理した後、 1 2ゥエルの培養プレートに、 ゥエル当り 2 X 1 05の細胞を入れ、 同上培地で 24時間保持した- 培地を除去した後、 活性 炭一デキストラン処理でステロイドホルモン類を除去したヒ ト血清を 5%含む D ME培地で、 1 O pMの 1 7— |3エストラジオールの存在下または非存在下に 7 2時間培養した。 細胞を回収し、 実施例 2— (1) と同様に mRNAを抽出した c 約 の mRNA、 オリゴ dTプライマー、 1 7— jSエストラジオール接触 細胞の場合は Cy 3— dUTP、 または 1 7— j3エストラジオール非接触細胞の 場合は Cy 5— dUTPを含む dNTP、 および逆転写酵素 （ギブコー BRL社 製） を用いて cDNA合成反応を行い、 ゲルろ過、次いで減圧濃縮し、 4 XS SC/0. 2%SDSに溶解して蛍光標識 c DNAを調製した。
(3) 標識 c DNAと DNAアレイとのハイブリダィゼーシヨン
(1) で調製した Cy 3—標識 cDNAと Cy 5—標識 c D N Aを等量混合し、 熱変性した後その 5 μ 1を実施例 1で作製した DNAアレイに滴下し、 力バーグ ラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。 これを 40〜45°Cで 10時間保持し た後、 カバーグラスを除いて、 ◦. 2 X S SCZ0. 1%SDS中で 30分、 次いで 0. 2 X S S C中で 30分洗浄し、 風乾した： これをマイクロアレイス キヤナー （GMS社製） にかけて各スポットの蛍光シグナルを解析した。 また、 (2) で得た標識 c DN Aについても同様の操作を行った。
その結果、 いずれの場合においても DE Sを投与したマウスの卵巣および 1 7 — ]3エストラジオールを接触させた MCF— 7細胞において、 有意なシグナルの 変動が見られ、 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を検出することができた。 実施例 3
(1) DN Aアレイの作製.
実施例 1の表 3記載の遺伝子から 33種類の遺伝子を選択した。 その遺伝子を 表 4に示す。 ハウスキーピング遺伝子として ]3—ァクチン遺伝子を、 ネガティブ コントロールとしてプラスミ ド pBR322をそれぞれ使用した。 4
gene No. 固定化した遺伝子名 使用する Primerの組み合わせ ― (遺伝子産物名） (配列番号）
1. ¾raad3 2
2. VEb receptor 3 4
3. ACTR 5 6
4. N- CoR/SMRT 7 8
5. efp 9 0
6. c-Myc-1 2
7. Vitamin D receptor 3 4
8. cathepsin G 巿販プライマー
9. c - Myc— 2 15、 16
10. Bax 1 7, 18
11. JNK1 1 9, 20
12. p38 21, 22
13. TRIP 1 23、 24
14. ARA 70 25、 26
15. insulin receptor 27、 28
16. NGF receptor 巿販プライマー 17. PDGF receptor 29、 30
18. CSFl receptor - 1 市販プライマー 19. CSFl receptor- 2 3 1, 32
20. FGF receptor 33、 34
21. p38 gamma 35、 36
22. Bel- X 37、 38
23. c- Myc - 3 39, 40
24. pS2 protein 41, 42
25. lactoferrin 43、 44
26. RIP 140 45、 46 27. TIF2 47, 48
28. JNK2 49、 50
29. Bax delta 51、 52
30. BMK-1 53, 54
31. BMK-2 55, 56
32. Src-1 57, 58
33. P300/CBP 59、 60
34. β -act in (positive control) 61、 62
35. pBR 322 (negative control)
これらの遺伝子について実施例 1記載の方法で表 4に記載の各プライマー対を 使用し、 cDNAで約 100 b〜約 1 k bの DNA断片を調製し、 該 DNA断片 をスポットした DNAアレイを作製した。 なお、 cathepsin G、 NGF receptor, CSF1 receptorの各遺伝子については、 Human UniGene DNA (リサーチジエネティ ックス社製） セット中の該遺伝子用プライマーを用いて増幅した。
(2) 内分泌かく乱物質の影響の検討
培養細胞に対する各種内分泌かく乱物質の影響を処理時間が 2時間あるいは 2 4時間の場合について検討した。
2時間処理の場合： 10%ゥシ胎児血清 （FBS) を含む DME培地で生育さ せたヒ ト乳がん細胞 MC F— 7をトリプシン処理した後、 直径 10 c mのデッシ ュに、 デッシュ当り 2 X 10fi の細胞を入れ、 活性炭ーデキストラン処理でス テロイドホルモン類を除去したゥシ胎児血清を 5%含む DME培地で 24時間培 養した。 培地を除去した後、 1 OnMの 1 7— ]3エストラジオール （E2) 、 1 OnMのジェチルスチルベス トロール （DES) 、 あるいは 5 μ Mのビスフエノ ール A (B i s A) を含む同上培地で 2時間培養した。 また、 対照として、 前述 の化学物質の非存在下のものも同様に調製した。 各処理後の細胞を回収し、 実施 例 2 (1) 記載の方法で全 RN Aを抽出した。
24時間処理の場合： 10%ゥシ胎児血清 （FBS) を含む DM E培地で生育 させたヒト乳がん細胞 MC F— 7をトリプシン処理した後、 直径 1 0 c mの培養 デッシュに、 デッシュ当り 2 X 1 06 の細胞を入れ、 同上培地で 24時間保持 した。 培地を除去した後、 活性炭ーデキストラン処理でステロイドホルモン類を 除去したヒ ト血清を 5%含む DME培地で、 1 OnMの 1 7— βエストラジオ一 ノレ （Ε2) 、 1 OnMのジェチルスチルベストロール （DE S) 、 あるいは 5 μ
Μのビスフエノール A (B i s A) の存在下に 24時間培養した。 また、 対照と して、 前述の化学物質の非存在下のものも同様に調製した。 各処理後の細胞を回 収し、 実施例 2 ( 1 ) 記載の方法で全 RN Aを抽出した。
(3) (2) で調製した全 RNAの DN a s e処理を行った。 上記の全 RNA 約 1 00〜約 3 00 // g、 1 0 XAMVバッファー （ライフサイエンス社製）
1 0 μ I及び 1 0UのDN a s e I (宝酒造社製） を含む 1 2 μ 1の反応液を調 製し、 3 7°Cで 1 0分間インキュベートした後、 フエノール/クロ口ホルム抽出 を 2回行った後、 エタノール沈殿を行った。 得られた全 RN Aの一部を取って濃 度測定を行った。
(4) (3) で調製した全 RN Aを用いて逆転写反応を行った。 反応液組成を 以下に示す。
反応液 A：上記全 RNA約 1 3 0 ;u g、 1 0 /i gのオリゴ d Tプライマー （宝酒 造社製） 及び 2 0 μ 1のジェチルピロカーボネート （DE P C、 和光純薬社製） 処理水。
反応液 B ： 5 X AMV RT a s e用緩衝液 （ライフサイエンス社製） 1 2 μ
1、 各 0. 5mMの dATP、 d CT P、 d GT P及び 0. 2mMの d TTP、 6 OUの RN a s eインヒビター （宝酒造社製） 、 0. 1：111^の。 3—標識(1 UT P (アマシャムフアルマシア社製） 。
反応液 Aを 7 0°Cで 1 0分間保持した後、 氷浴上で冷却した。 その後、 反応液 Bを加え、 4 2°Cで 5分間保持した。 その後、 さらに AMV RT a s e (ライ フサイエンス社製） を約 6 0 U加え、 反応液量を DE PC処理水で 6 0 / 1にし た。 この R T反応液を 4 2 °Cで 7 0分間保持した。 この反応液に 5 00 mMの E DT A溶液 7. 5 / し 1 Mの水酸化ナトリウム 1 5 μ 1を加え、 6 0°Cで 1時間保持し、 铸型 RNAを分解させた。 室温まで冷却した後、 1 Mのトリス一 塩酸 （pH 7. 5) を 3 7. 5 μ 1添力!]した。 この溶液をマイクロコン ΥΜ— 3 0 (ミリポア社製） で 2 0 μ 1まで濃縮し、 1 mMの EDTAを含む 1 OmMの トリスー塩酸を 2 00 μ 1加えた後、 再度 20 μ 1まで濃縮した。 この C y 3— 標識 c D N A溶液を以降のハイブリダイズに使用した。
(5) (4) で調製した C y 3—標識 c DNAを熱変性した後、 全量を （1 ) で調製した DN Aアレイに滴下し、 カバーグラスをかけて周囲をフィルムで密閉 した。 これを 40〜4 5°Cで 1 0時間保持した後、 カバーグラスを除いて、 0. 2 X S S C/O. 1 %SD S中で 3 0分、 次いで 0. 2 X S S C中で 3 0分洗 浄し、 風乾した。 これをマイクロアレイスキャナー （GMS社製） にかけて各ス ポットの蛍光シグナルを解析した。 各物質処理後試料の蛍光シグナル を対照の 蛍光シグナル値で割った結果のうち代表的なものを表 5に示す。 表 5において、 数値が 1.00より大きい場合は、 各物質処理によってその遺伝子の発現が促進され ていることを示し、 1.00より小さい場合は、 各物質処理によってその遺伝子の発 現が抑制されていることを示す。 また、 数値が 1.00の場合は、 その遺伝子は各物 質処理の影響を受けないことを示す。
表 5
固定化した遺伝子名 DE S処理 B i s A処理 E2処理
_ (遺伝子産物名） 2hr—I 24hr — 2hr J _24hr 2hr 24hr 核内レセプター又は核內レセプター転写共役因子
P300/CBP 1.28 / 4.45 1.50 1.07 1.67 3.39
N-CoR/SMRT 0.62 / 1.42 1.17 1.08 1.86 1.51
ACTR 1.14 I 4.97 0.47 1.03 1.19 3.27
RIP 140 1.74 I 2.51 1.70 1.14 1.46 2.34
TIF2 1.19 I 3.04 2.66 0.84 2.17 3.30
ARA 70 0.63 I 1.37 1.31 0.93 1.47 1.45 キナーゼ型伝達因子
JNK2 0.72 I 1.85 1.30 0.71 1.86 I 1.71
BMK-2 1.15 I 6.06 1.04 0.29 1.13 I 0.05 オンコジーン
c-Myc-1 1.08 I 0.00 1.40 1.30 2.52 1.89
Bax 1.34 I 2.27 2.41 1.44 1.32 0.99 レセプター型キナーゼ
PDGF receptor 0.65 I 3.04 1.25 I 1.19 1.63 2.89
VEGF receptor 1.15 / 3.27 0.37 I 0.46 2.13 2.94
内分泌かく乱作用によってかく乱された結果起ったと考えられている野生動物 の生殖以上ゃヒ トにおける精子形成の低下などは、 内分泌作用のシグナルがある 段階で抑制あるいは停止されたものと考えられる場合が多い。 よって、 コント口 —ルの細胞と比較して過剰発現している遺伝子以外：こ抑制されている遺伝子にも 注目すべきであると考える。 例えば、 本実施例に用いた遺伝子のうち、 表 5に示 したように、 E2の刺激に対してパスウェイあるいはメカニズム等においては不 明な部分も多いが、 エストロゲン作用に関係の深い遺伝子と考えられる多くの遺 伝子が影響を受けて、 発現促進されていることが確認できた （例えば、 p 300 /CBP、 ACTR、 R I P 140、 T I F2、 PDGFレセプター、 VEG Fレセプターの遺伝子） 。 また、 内分泌かく乱作用を起こさせる DE Sによる刺 激に対しては、 24時間培養処理の場合では、 c— My cを除くほぼすベての遺 伝子が活性化されているが、 2時間培養処理の場合において、 核内レセプター 这核内レセプター転写共役因子の N— CORZSMRTや ARA 70、 キナー ゼ型伝達因子の p 38 g amma (データは示さず） 、 JNK2、 レセプター 型キナーゼの P D G Fレセプターなどの遺伝子発現が抑制されていることが確認 できた。 一方、 内分泌かく乱作用を疑われている B i s Aによる刺激に対しては、 2時間培養処理の場合、 発現抑制を受けている遺伝子は、 核内レセプター又は核 内レセプター転写共役因子のうち ACT R遺伝子、 レセプター型キナーゼのうち
VEGFレセプター遺伝子があり、 D E S刺激の場合に比較して遺伝子への影響 が少ないと考えられた。 しかしながら、 24時間培養処理の場合においては、 キ ナ一ゼ型伝達因子である J NK 2、 BMK2、 レセプター型キナーゼである VE GFレセプターなどの遺伝子が発現抑制を受けており、 DE S刺激とは異なった パターンで遺伝子の発現制御が起こっていることが確認できた。 このように本発 明のチップを用いることにより、 処理物質及び処理時間ごとに発現の有意なシグ ナルの変動を観察する方法が提供され、 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子、 特に発現が抑制される遺伝子を明確にを検出することができた。 産業上の利用の可能性
以上のように本発明の方法によって内分泌かく乱物質の影響を受ける多種類の 遺伝子を同時にインビトロで迅速、 高感度に検出できるという優れた効果を奏す る。 また本発明は、 迅速、 高感度に内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を検 出することができる DN Aアレイを提供する。 また、 従来知られていない新しい シグナル伝達経路に関与する遺伝子の検出方法としても有用である。 さらに本発 明の方法によって得られた内分泌かく乱物質の影響を受ける多種類の遺伝子の発 現を指標にして、 内分泌かく乱物質もしくは内分泌かく乱を引き起こす可能性の ある物質の有無を判定することができるという優れた効果を奏する。 配列表フリーテキスト
SEQ ID NO: 1： Designed oligonucleotide primer to amplify Smad3 mRNA.
SEQ ID NO: 2 : Designed oligonucleotide primer to amplify Smad3 mRNA.
SEQ ID NO: 3 : Designed oligonucleotide primer to amplify VEGF receptor mRNA.
SEQ ID NO: 4 : Designed oligonucleotide primer to amplify VEGF receptor mRNA.
SEQ ID NO: 5 : Designed oligonucleotide primer to amplify ACTR mRNA.
SEQ ID NO: 6 : Designed oligonucleotide primer to amplify ACTR mRNA.
SEQ ID NO: 7 : Designed oligonucleotide primer to amplify N- CoR/SMRT mRNA.
SEQ ID NO: 8 : Designed oligonucleotide primer to amplify N_ CoR/SMRT mRNA.
SEQ ID NO: 9 : Designed oligonucleotide primer to amplify efp mRNA.
SEQ ID NO: 10 : Designed oligonucleotide primer to amplify efp mRNA.
SEQ ID NO: 11 : Designed oligonucleotide primer to amplify c- Myc-
1 mRNA.
SEQ ID NO: 12 : Designed oligonucleotide primer to amplify c- Myc - 1 mRNA.
SEQ ID NO: 13 : Designed oligonucleotide primer to amplify vitamin D receptor mRNA.
SEQ ID NO: 14 : Designed oligonucleotide primer to amplify vitamin D receptor mRNA. SEQ ID NO: 15 : Designed oligonucleotide primer to amplify c-Myc-
2 mRNA.
SEQ ID NO: 16 : Designed oligonucleotide primer to amplify c-Myc-
2 mRNA.
SEQ ID NO: 17 : Designed oligonucleotide primer to amplify Bax mRNA.
SEQ ID NO: 18 : Designed oligonucleotide primer to amplify Bax mRNA.
SEQ ID NO: 19 : Designed oligonucleotide primer to amplify JNKl mRNA.
SEQ ID NO :20 : Designed oligonucleotide primer to amplify JNKl mRNA.
SEQ ID N0: 21 : Designed oligonucleotide primer to amplify p38 mRNA.
SEQ ID NO : 22 : Designed oligonucleotide primer to amplify p38 mRNA.
SEQ ID NO : 23 : Designed oligonucleotide primer to amplify TRIP 1 mRNA.
SEQ ID NO : 24 : Designed oligonucleotide primer to amplify TRIP 1 mRNA.
SEQ ID NO :25 : Designed oligonucleotide primer to amplify ARA 70 mRNA.
SEQ ID NO :26 : Designed oligonucleotide primer to amplify ARA 70 mRNA.
SEQ ID NO : 27 : Designed oligonucleotide primer to amplify insulin receptor mRNA.
SEQ ID NO: 28 : Designed oligonucleotide primer to amplify insulin receptor mRNA.
SEQ ID NO： 29： Designed oligonucleotide primer to amplify PDGF receptor mRNA.
SEQ ID N0: 30 : Designed oligonucleotide primer to amplify PDGF receptor mRNA.
SEQ ID N0: 31： Designed oligonucleotide primer to amplify CSFl receptor- 2 mRNA.
SEQ ID NO: 32 : Designed oligonucleotide primer to amplify CSFl receptor- 2 mRNA.
SEQ ID N0: 33 : Designed oligonucleotide primer to amplify FGF receptor mRNA.
SEQ ID NO: 34 : Designed oligonucleotide primer to amplify FGF receptor mRNA.
SEQ ID N0: 35 : Designed oligonucleotide primer to amplify p38 gamma mRNA.
SEQ ID N0:36 : Designed oligonucleotide primer to amplify p38 gamma mRNA.
SEQ ID NO : 37 : Designed oligonucleotide primer to amplify Bel - X mRNA.
SEQ ID NO: 38 : Designed oligonucleotide primer to amplify Bel- X mRNA.
SEQ ID N0: 39 : Designed oligonucleotide primer to amplify c- Myc -
3 mRNA.
SEQ ID N0:40 : Designed oligonucleotide primer to amplify c - Myc-
3 mRNA.
SEQ ID N0:41： Designed oligonucleotide primer to amplify pS2 protein mRNA.
SEQ ID N0: 42 : Designed oligonucleotide primer to amplify pS2 protein mRNA.
SEQ ID NO : 43 : Designed oligonucleotide primer to amplify lactoferrin mRNA. SEQ ID N0:44 : Designed oligonucleotide primer to amplify lactoferrin mRNA.
SEQ ID N0:45 : Designed oligonucleotide primer to amplify RIP 140 mRNA.
SEQ ID N0: 46: Designed oligonucleotide primer to amplify RIP
140 mRNA.
SEQ ID N0:47 : Designed oligonucleotide primer to amplify TIF2 mRNA.
SEQ ID N0:48 : Designed oligonucleotide primer to amplify TIF2 mRNA.
SEQ ID N0:49 : Designed oligonucleotide primer to amplify JNK2 mRNA.
SEQ ID NO: 50 : Designed oligonucleotide primer to amplify JNK2 mRNA.
SEQ ID NO: 51 : Designed oligonucleotide primer to amplify Bax delta mRNA.
SEQ ID N0: 52 : Designed oligonucleotide primer to amplify Bax delta mRNA.
SEQ ID NO : 53 : Designed oligonucleotide primer to amplify BMK-l mRNA.
SEQ ID N0: 54 : Designed oligonucleotide primer to amplify BMK-l mRNA.
SEQ ID NO: 55 : Designed oligonucleotide primer to amplify BMK- 2 mRNA.
SEQ ID N0: 56 : Designed oligonucleotide primer to amplify BMK - 2 mRNA.
SEQ ID NO : 57 : Designed oligonucleotide primer to amplify Src - 1 mRNA.
SEQ ID NO: 58 : Designed oligonucleotide primer to amplify Src- 1 mRNA.
SEQ ID NO: 59 : Designed oligonucleotide primer to amplify p300/CBP mRNA.
SEQ ID NO : 60 : Designed oligonucleotide primer to amplify p300/CBP mRNA.
SEQ ID N0:61： Designed oligonucleotide primer to amplify β - act in mRNA.
SEQ ID NO: 62 : Designed oligonucleotide primer to amplify β - act in mRNA.

Claims

1. 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を検出する方法であって、 内分 泌かく乱物質を含む試料と接触させた細胞、 組織または生物体由来の mRNAま たはその c DN Aを含む核酸試料を調製し、 該核酸試料を内分泌かく乱物質の影 響を受ける可能性のある遺伝子もしくは該遺伝子由来の DNA断片が固定された DNAアレイとハイブリダィズさせ、 その結果を対照試料由来の核酸試料を用い 雷
たものと比較して內分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を選択することを特徴 とする遺伝子の検出方法。
2. 下記遺伝子群から選択される遺伝子もしくは該遺伝子由来の DNA断片 車
を使用する請求項 1記載の遺伝子の検出方法：
囲
) 核内レセプター又は核内レセプター転写共役に関与する遺伝子群、
2) キナーゼ型伝達に関与する遺伝子群、
3) †生腺分化に関与する遺伝子群、
(4) レセプター型キナーゼに関与する遺伝子群、
5) 中間フィラメントマーカーに関与する遺伝子群、
6) 細胞周期、 成長調節に関与する遺伝子群、
7) オンコジーン及ひ重瘍抑制に関与する遺伝子群、
8) アポトーシスに関与する遺伝子群、
(9) DNA損傷反応、 修復、 再構成に関与する遺伝子群、
10) レセプターに関与する遺伝子群、
1 1) 細胞死及び分化調節に関与する遺伝子群、
1 2) 細胞接着、 運動性及び浸潤に関与する遺伝子群、
1 3) 血管新生促進に関与する遺伝子群、
(14) 細胞浸潤に関与する遺伝子群、
1 5) 細胞間相互作用に関与する遺伝子群、
1 6) Rh oファミリー GTP a s e及びその調節因子に関与する遺伝子 群、 又は
(1 7) 成長因子及びサイ トカインに関与する遺伝子群。
3. 請求項 1または請求項 2記載の方法により検出された遺伝子の発現を測 定することを特徴とする内分泌かく乱物質の検出方法。
4. 内分泌かく乱物質が下記の分類から選択されることを特徴とする請求項 3記載の内分泌かく乱物質の検出方法：
(1) ダイォキシン類、
(2) 有機塩素系化合物類、
(3) フユノール類、
(4) フタル酸エステル類、
(5) 芳香族炭化水素類、
(6) 農薬類、
(7) 有機スズ化合物、
(8) エストロゲン類、 又は
(9) マイレックス、 トキサフェン、 アルディ力一ブ又はキーポン。
5. 内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質を検出する方法であって、 当該物質が含まれると予想される試料と接触させた細胞、 組織または生物体由来 の mRNAまたはその c DN Aを含む核酸試料を調製し、 該核酸試料を内分泌か く乱物質の影響を受ける遺伝子もしくは該遺伝子由来の DN A断片が固定された DN Aアレイとハイブリダィズさせ、 その結果を対照試料由来の核酸試料を用い たものと比較して、 內分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質を検出すること を特徴とする検出方法。
6. 内分泌かく乱を引き起こす可能性のある物質が下記の分類に属すること 特徴とする請求項 5記載の内分泌かく乱物質の検出方法：
(1) ダイォキシン類、
(2) 有機塩素系化合物類、
(3) フエノール類、
(4) フタル酸エステノレ類、
(5) 芳香族炭化水素類、
(6) 農薬類、
(7) 有機スズ化合物、 (8) エストロゲン類、 又は
(9) マイレックス、 トキサフェン、 アルディカーブ又はキーポン。
7. 内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子もしくは内分泌かく乱物質の影 響を受ける可能性のある遺伝子または該遺伝子由来の DNA断片が固定されてい ることを特徴とする内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子検出用 D N Aアレイ。
8. 下記遺伝子群から選択される遺伝子あるいは該遺伝子由来の D N A断片 が固定されていることを特徴とする請求項 7記載の D NATレイ ：
1 ) 核内レセプター又は核内レセプター転写共役に関与する遺伝子群、
2) キナーゼ型伝達に関与する遺伝子群、
(3) 性腺分化に関与する遺伝子群、
：4) レセプター型キナーゼに関与する遺伝子群、
5) 中間フィラメントマーカーに関与する遺伝子群、
6) 細胞周期、 成長調節に関与する遺伝子群、
7 ) オンコジーン及び腫瘍抑制に関与する遺伝子群、
(8) アポトーシスに関与する遺伝子群、
9) DNA損傷反応、 修復、 再構成に関与する遺伝子群、
10) レセプターに関与する遺伝子群、
1 1) 細胞死及び分化調節に関与する遺伝子群、
1 3) 細胞接着、 運動性及び浸潤に関与する遺伝子群、
(14) 血管新生促進に関与する遺伝子群、
1 5) 細胞浸潤に関与する遺伝子群、
1 6) 細胞間相互作用に関与する遺伝子群、
1 7) Rh oファミリー GTP a s e及びその調節因子に関与する遺伝子 群、 又は
(1 8) 成長因子及びサイ トカインに関与する遺伝子群。
9. 遺伝子もしくは該遺伝子由来の DN A断片がスライドガラスに固定され ていることを特徴とする請求項 7又は請求項 8記載の D N Aアレイ。
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