WO2000048614A2 - Verfahren zur herstellung antitumoraler th1-zellen - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical preparation containing anti-tumor Thl cells, a process for the production of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) producing anti-tumor Thl cells and their use for the therapy of solid tumors and haematopoietic tumors such as lymphomas.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • Mammalian immune systems including humans, have a number of strategies to protect against, or even fight, various tumors. It is thus possible to elicit immune responses against tumor antigens, which are (glyco-) proteins that are specifically expressed on the surface or inside tumor cells. Immune responses to these antigens can protect against the establishment of solid tumors and tumors of the hematopoietic system.
  • tumor antigens which are (glyco-) proteins that are specifically expressed on the surface or inside tumor cells. Immune responses to these antigens can protect against the establishment of solid tumors and tumors of the hematopoietic system.
  • the literature shows that most immune responses against tumors depend on both the CD4 + T helper cells (Th) and the cytotoxic CD8 + T cells (Tc). However, it is recognized that the cytotoxic Tc in particular are important for effective tumor defense. The role of Th has so far been little investigated in this regard.
  • TIL tumor infiltrating T lymphocytes
  • LAK lymphokine activated killer cells
  • CD8 + T lymphocytes CD8 + T lymphocytes
  • WO99 / 51720 describes a (post-published) very special method with which Thl cells can be generated. However, it does not allow CD2 positive cells or T cells to develop effectively specifically recognize an antigen, such as a tumor antigen.
  • Thl lymphocytes can lyse tumor cells in the culture dish.
  • this approach can be applied directly to the in vivo situation.
  • the present invention has for its object to provide a preparation for the prophylaxis and therapy of tumor diseases.
  • it is a matter of specifically developing tumor-reactive cells in vitro which are effective against tumors in vivo.
  • the goal of any tumor therapy is to destroy the tumor as much as possible while protecting all other cells in the body.
  • the conventional therapies achieve this inadequately. For this reason, attempts have been made to develop specific tumor therapies.
  • the only therapeutic approach that is currently tumor-specific is immunotherapy because, thanks to its antigen receptor, the lymphocytes only recognize those target cells against which they have been activated.
  • the preparation according to the invention is intended to protect against possible tumor development and, in particular, is also effective in the case of already established tumors. Furthermore, the preparation according to the invention should be able to be adapted to the tumor to be controlled in each case. The preparation is intended to mimic or strengthen the natural mechanisms of tumor defense and thus have little or no side effects.
  • a pharmaceutical preparation which contains tumor-specific Th, which are characterized by a Thl-like cytokine pattern, i.e. by a high IFN- ⁇ production Pl (100 ⁇ Pl ⁇ 100000 U / ml) and a low one IL-4 production P2
  • T lymphocytes are administered together with pharmaceutically acceptable excipients and excipients. Furthermore, a method for the production of tumor-specific Thl cells is established. They are cells that contain the tumor or tumor-associated antigens
  • the invention also relates to the use of this thl for prophylaxis and / or therapy of solid tumors and tumors of the hematopoietic system.
  • Th in particular Thl and Thl-like cells
  • Thl By cultivating Thl, which specifically recognize (glyco-) proteins of the tumor to be controlled, effective medication for the prevention / control of the tumor can be produced.
  • Preparations containing these cells are administered to the organism by the parenteral route, usually intraperitoneally, intravenously or subcutaneously.
  • the Thl administered activate or strengthen the immune response against the tumor either by direct induction of cell death or by production of their specific cytokines. These can either be directly cytotoxic to the tumor or lead to the fact that toxic effector cells, Tc or macrophages, are recruited and activated for the tumor. As a result, they play a decisive role in the immune-mediated remission or regression of the tumor.
  • Thl cells can be produced against any type of tumor.
  • the production of Thl is preferably effective against lymphomas, but solid tumors are also important target structures.
  • the corresponding tumor types can therefore be combated with the preparation according to the invention.
  • the type and posology of administration are determined by a doctor in accordance with the type and severity of the tumor to be treated, the condition of the patient and the duration of therapy.
  • the preparation is in a dosage of Ixl0 6 -100-1000xl0 6 Cells / kg body weight administered in a single dose or repeated.
  • the preparation can be administered to both humans and animals.
  • the Thl cells according to the invention can protect against hematopoietic tumors; they are also suitable for the treatment of established lymphomas and solid tumors can at least be controlled with such Thl cells.
  • the inventive method also allows tumor-specific Thl cells to be obtained from animals that are already ill with an advanced tumor. It is possible to grow from the multitude of different immune cells exactly the few families of T lymphocytes that either specifically or primarily recognize the tumor. Through the adoptive transfer of tumor-specific Thl cells, effective anti-tumor immune responses can be built up very quickly, which then also become effective in therapy very quickly and safely - i.e. are largely free of side effects.
  • MHC class II restricted tumor peptides are so far hardly known. For this reason, a system was developed that allows tumor-specific Thl to be established without knowing specific tumor peptides.
  • Tumor cells inhibited in their proliferation by radiation or chemotherapeutic agents such as mitomycin C are combined with auto- Logen / syngeneic APC and Th cultivated in vitro.
  • the studies have so far been carried out on a B-cell lymphoma that can present its own tumor antigens via MHC II.
  • CD4 + Th were obtained from mice which already have A20-B cell lymphoma or from mice which were immunized against this lymphoma. These Th were then cultivated in vitro using the method described below to produce tumor-specific Thl, Th which produce large amounts of IFN- ⁇ but little or hardly any IL-4. When measured using a commercially available ELISA test, effective IFN- ⁇ levels were between 10 2 and 10 5 U / ml; measured with CT4S cells, IL-4 had to be below 1000 U / ml. Again it was important that the ratio of IFN- ⁇ to IL-4 was> 10: 1. These tumor-specific Thl were then used for tumor therapy.
  • Murine A20 cells (ATCC-TIB-208) were cultivated in RPMI1640, which contained 10% FCS and 50 mM ⁇ -mercaptoethanol, at 37 ° C. in a water-saturated atmosphere and 5% CO 2 . Before being used for in vitro culture with the Th, the tumor cells were irradiated with 65 Gray.
  • Th (> 95% purity) were obtained by negative selection using Biotex-T cell acids (Tebu, Frankfurt). Other methods for obtaining Th by means of positive or negative enrichment are equally suitable. These Th were in vitro in Dulbecco's MEM (culture medium), which was enriched by 10% FCS, penicillin and streptomycin, 50 uM ß-mercaptoethanol and MEM amino acids, at 37 ° C in water-saturated Atmosphere and 7.5% C0 2 cultivated. Other media also allow the establishment of Th lines, some without the use of serum.
  • APC were enriched by treatment of BALB / c spleen cells with anti-CD4 and anti-CD8 antibodies and complement (Behring-Werke, Marburg). Before being used for the in vitro culture of Th, they were irradiated with 30 Gray.
  • CpG-ODN 1668 Phosphothioate-modified CpG dinucleotide-containing oligonucleotide
  • MWG Movable Gated Device
  • Anti-IL-4 antibodies are from clone 11B11, human rIL-2 was purchased commercially. Such antibodies have also been developed against human IL-4; furthermore, Thl can also be produced by using solublem IL-4 receptor molecule (Breit et al. 1996, Eur. J. Immunol. 26, 1860-1865).
  • 0.2 x 10 6 Th + irradiated tumor cells 0.2 x 10 6 A20
  • 0.3 x 10 6 APC + anti-IL-4 antibody e.g. 10 ⁇ g / ml 11B11
  • anti-IL-4 antibody e.g. 10 ⁇ g / ml 11B11
  • immunostimulatory oligonucleotides e.g. 0 , 2 ⁇ M CpG-ODN 1668
  • the cell suspension is transferred to a 24-well culture plate and fed with a medium containing IL-2. Day 5-10
  • the medium is changed and the cells are fed with a medium containing IL-2. Depending on the cell density, the culture is distributed to further culture dishes.
  • the cell suspension is transferred to a 24-well culture plate and fed with a medium containing IL-2.
  • the medium is changed and the cells are fed with medium containing IL-2. Depending on the cell density, the culture is divided into further culture dishes.
  • the Th can be restimulated and expanded further every 10-14 days, for a third time and more on day 2JX according to the protocol for the second stimulation (day 11-20). Alternatively, they are used for adoptive transfer therapy.
  • Th lines generated in this way are:
  • syngeneic spleen cells which present the tumor peptides of the A20 tumor via their MHC class II molecules, they produce a lot of IFN- ⁇ and little or no IL-4 (see production information on p. 6 and Fig. 1) .
  • the Th is cultivated with syngeneic spleen cells that do not present tumor antigens or antigens of another tumor, MCPll-B cell lymphoma, they produce no or only small amounts of cytokines.
  • These cells are pharmaceutical preparations that can be used specifically to treat A20 lymphoma.
  • T lymphocytes from mice injected with both A20 tumors and A20-specific Thl still produced IFN- ⁇ even if they were stimulated with tumor-specific antigens by syngeneic APC more than 10 days after tumor transfer (Fig . 2).
  • the adoptive transfer of A20-specific Thl induced a prolonged Thl immune response against the A20 tumor.
  • the Thl were then used to treat already established tumors.
  • 0.5 x 10 6 A20 tumor cells were injected intravenously.
  • the animals were again given an intravenous vaccination of 0.5 x 10 6 A20-specific Thl lines, that is to say about 25 times 10 6 Thl cells per kg body weight.
  • the data from five experiments showed that (1) tumor growth was delayed considerably in almost all animals and (2) up to 70% of the animals were considered cured by the transfer of the THI (FIG. 4).
  • the therapy was effective at a time when immunotherapies have not yet been described and at which the tumor load on the spleen was approximately 100 times greater than in the immunization protocols described so far.
  • Thl can also be used very efficiently and safely not only in prevention but also in tumor therapy.
  • Fig. 1 shows the production of IFN- ⁇ and IL-4 by A20-specific Thl-Zeil lines after in vitro stimulation.
  • the A20-specific IFN- ⁇ production of a CD4 + T cell line was generated with CpG ODN and anti-IL-4 antibodies against the lymphoma in vitro within two weeks.
  • CD4 + T cells (Th) were isolated from Balb / c mice which had been immunized by an A20 tumor. The Th obtained was stimulated in vitro in the presence of syngeneic antigen-presenting cells (APC), A20 tumor cells, anti-IL-4 antibodies, IL-2 and CpG-ODN 1668 and expanded over 10 days. On day 11, the cultured Thl were restimulated in the presence of APC alone or additional A20 cells for 24 hours. The IL-4 and IFN- ⁇ content was determined from the culture supernatant.
  • APC syngeneic antigen-presenting cells
  • A20-specific immune response by adoptive transfer of A20-specific Thl.
  • the adoptive transfer of A20-specific Thl significantly extends the tumor-specific immune response against A20-B cell lymphoma.
  • Balb / c mice were immunized by intravenous injection of 0.5 million A20 tumor cells alone or together with 0.5 million A20-specific Thl.
  • the spleens of the mice were prepared on d5, 7, 10 and 1 million cells in vitro with or without irradiated A20 for 48
  • BALB / c mice die rapidly after adoptive transfer of the A20 lymphoma (tumor) and long-term survival of BALB / c mice after administration of the A20 lymphoma and simultaneous adoptive transfer of A20-specific Thl.
  • Balb / c mice were injected intravenously with 0.5 million A20 tumor cells alone or simultaneously with 0.5 million A20-specific THl and the course of therapy was monitored visually.
  • Fig. 4 shows the therapy of an established A20 B cell lymphoma by adoptive transfer of A20-specific Thl.
  • BALB / c mice die quickly after adoptive transfer of A20 lymphoma and long-term healing occurs in up to> 80% of BALB / c mice if A20-specific THI was adoptively transferred seven days after administration of A20 lymphoma .
  • the tumor burden is 100 times higher than with the most successful therapy with cytokine-transferred tumor cells.
  • Balb / c mice were injected with 0.5 million A20 tumor cells in 500 ⁇ l PBS intravenously. Seven days after A20 injection (100 CFU / spleen), 500 ⁇ l PBS alone or 0.5 million A20-specific Thl in 500 ⁇ l PBS were intravenously injected into the mice and the course of therapy was monitored visually.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat, das tumorreaktive Th1-ähnliche Zellen, die eine hohe Produktion von Interferon-η aufweisen und wenig oder kein Interleukin-4 produzieren, zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Exzipientien und Hilfsstoffen umfasst, sowie ein Verfahren zur Herstellung von tumorreaktiven Th1-ähnlichen Zellen, die eine hohe Produktion von Interferon-η aufweisen und wenig oder kein Interleukin-4 produzieren.

Description

Verfahren zur Herstellung antitumoraler Thl-Zellen
Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat, das antitumorale Thl-Zellen enthält, ein Verfahren zur Herstellung von Interferon-γ (IFN-γ) produzierenden, antitumoralen Thl-Zellen sowie deren Verwendung zur Therapie von soliden Tumoren und hämatopoietischen Tumoren wie Lymphomen.
Das Immunsystem der Säuger, einschließlich das des Menschen verfügt über eine Reihe von Strategien, um vor verschiedenen Tumoren zu schützen oder sogar sie zu bekämpfen. So ist es möglich, Immunantworten gegen Tumorantigene, das sind (Glyko-) Proteine, die speziell auf der Oberfläche oder im Inneren von Tumorzellen exprimiert werden, hervorzurufen. Immunantworten gegen diese Antigene können vor dem Etablieren von soliden Tumoren und Tumoren des hämatopoietischen Systems schützen. Aus der Literatur geht hervor, daß die meisten Immunantworten gegen Tumoren sowohl von den CD4+T-Helfer- zellen (Th) als auch den zytotoxischen CD8+T-Zellen (Tc) abhängig sind. Es gilt jedoch als anerkannt, daß insbesondere die zytotoxischen Tc für eine wirksame Tumorabwehr von Bedeutung sind. Die Rolle der Th wurde bisher in dieser Hinsicht nur wenig untersucht .
Es wurden zahlreiche Medikamente und Verfahren zur Immunisierung gegen verschiedene Tumortypen entwickelt. Als besonders wirksam in der Tumorprävention haben sich beispielsweise Immunisierungen mit den dendritischen antigenpräsentierenden Zellen (APC) , die Koapplikation von proinflammatorischen Mediatoren, insbesondere Interleukin- (IL) -12 und die T-Zellaktivierung durch Modulation des CTLA4-Moleküls erwiesen. Weitere Strategien beinhalten Vakzinierungen mit Präparaten, die entweder tumorinfiltrierende T-Lymphozyten (TIL) , lymphokin- aktivierte Killerzellen (LAK) oder CD8+ T-Lymphozyten enthalten. Derartige Ansätze erwiesen sich jedoch als nur eingeschränkt wirksam.
Obgleich zahlreiche Immunisierungsprotokolle zur Tumorprävention beschrieben wurden, gibt es bisher kaum über das Immunsystem wirkende Medikamente, die bei bereits etablierten Tumoren wirksam sind. Das einzig wirklich wirksame Therapieprotokoll ist der adoptive Transfer allogener T-Lymphozyten in der Behandlung von Leukämien. Die Daten der letzten 20 Jahre belegen, daß IFN-γ produzierende T-Lymphozyten eine wichtige Rolle bei der zellulären Tumorabwehr spielen. Bisher wurden vor allem Tumorimmunantworten untersucht, die sich insbesondere gegen Antigene richten, die über die Haupthisto- kompatibilitäts-Antigene der Klasse I (MHC I) an Tc präsentiert werden. MHC-Klasse Il-restringierte Th werden als Regulatorzellen angesehen. Ihre Gegenwart scheint für eine effiziente Tumorprävention wichtig. Trotzdem kennt man weder ihre genaue Rolle bei der antitumoralen Immunantwort, noch sind, von wenigen Ausnahmen abgesehen, ihre Zielpeptide bekannt (Immunity 95: 2, 45-57). Wegen dieser Schwierigkeiten wurden sie bisher nicht als Medikament im Sinne von Immuntherapien gegen spezifische Tumor entwickelt .
In WO99/51720 ist ein (nachveröffentlichtes) sehr spezielles Verfahren beschrieben, mit dem Thl-Zellen generiert werden können. Es erlaubt aber nicht, wirksam CD2-positive Zellen oder T-Zellen zu entwickeln, die spezifisch ein Antigen, wie z.B. ein Tumor-Antigen erkennen .
Ein bekanntes Verfahren (Kuge et al 1995 J. Immunol 154(4), 1777-85) beschreibt, daß Thl-Lymphozyten Tumorzellen in der Kulturschale lysieren können. Hinweise auf eine in vivo-Therapie sind dieser Schrift jedoch nicht entnehmbar. Auch läßt sich dieser Ansatz nicht direkt auf die in vivo-Situation übertragen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Präparat zur Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen bereitzustellen. Insbesondere geht es darum, spezifisch tumorreaktive Zellen in vitro zu entwickeln, die in vivo gegen Tumoren wirksam sind. Ziel einer jeden Tumortherapie ist es, den Tumor soweit als möglich zu zerstören und dabei alle anderen Zellen des Körpers zu schonen. Die herkömmlichen Therapien erreichen dies nur unzureichend. Aus diesem Grunde hat man versucht, spezifische Tumortherapien zu entwickeln. Der einzige Therapieansatz, der nach heutigem Verständnis tumorspezifisch ist, ist eine Immuntherapie, da die Lymphozyten dank ihres Antigenrezeptors nur jene Ziel- zellen erkennen, gegen die sie aktiviert wurden.
Wegen ihrer Fähigkeit, Tumorzellen direkt zu töten, setzt die Forschung von heute ganz überwiesend auf eine anti- tumorale Therapie mittels tumorspezifischer Tc . Von Autoimmunkrankheiten her ist aber bekannt, daß nicht Tc, sondern Th Autoimmunkrankheiten besonders dramatisch auslösen (Racke et al . 1994). Besonders schwere, oftmals akut tödlich verlaufende Formen von Autoimmunkrankheiten werden durch den adoptiven Transfer von IFN-γ produ- zierenden Th, die auch Thl genannt werden, ausgelöst. Da diese adoptiv transferierten Thl zwar das Zielorgan zerstören, dabei aber alle anderen Gewebe vollständig verschonen, sollte sich der adoptive Transfer tumorspezifischer Thl besonders gut zur Tumortherapie eignen.
Das erfindungsgemäße Präparat soll vor einer möglichen Tumorentwicklung schützen und insbesondere bei bereits etablierten Tumoren ebenfalls wirksam sein. Ferner soll das erfindungsgemäße Präparat dem jeweils zu bekämpfenden Tumor angepaßt werden können. Das Präparat soll die natürlichen Mechanismen der Tumorabwehr nachahmen bzw. verstärken und somit keine oder nur geringe Nebenwirkungen besitzen.
Gelöst wird diese Aufgabe zum einen durch ein pharmazeutisches Präparat, das tumorspezifische Th enthält, die durch ein Thl-ähnliches Zytokinmuster charakterisiert sind, sich also durch eine hohe IFN-γ-Produktion Pl (100 < Pl < 100000 U/ml) und eine niedrige IL-4-Produktion P2
(P2 < 1000 U/ml) auszeichnen. Von besonderer Bedeutung ist dabei das Verhältnis P1:P2, welches in der Größenordnung 10:1 oder größer liegen soll. Die T- Lymphozyten werden zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Exzipientien und Hilfsstoffen verabreicht. Des weiteren wird ein Verfahren zur Herstellung von tumorspezifischen Thl-Zellen etabliert. Es sind Zellen, die den Tumor oder tumorassoziierte Antigene
(Aminosäuren/ Eiweißsequenzen) erkennen und gegen diese reagieren. Sie zeigen aber kaum oder keine Reaktivität gegenüber anderen Antigenen, die im Körper effizient präsentiert werden. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Thl zur Prophylaxe und/oder Therapie von soliden Tumoren und Tumoren des hämatopoietischen Systems .
In Anlehnung an die Experimente zur Pathogenese von Autoimmunkrankheiten wurde gefunden, daß Th, insbesondere Thl und Thl-ähnliche Zellen, in der Tumorabwehr eine signifikante Bedeutung besitzen. Durch Züchten von Thl, die speziell (Glyko- ) Proteine des zu bekämpfenden Tumors erkennen, können wirksame Medikamente zur Prophylaxe/Bekämpfung des Tumors hergestellt werden. Präparate, die diese Zellen enthalten, werden dem Organismus auf parenteralem Weg, meist intraperitoneal, intravenös oder subkutan verabreicht . Die verabreichten Thl aktivieren bzw. verstärken die gegen den Tumor gerichtete Immunantwort entweder durch direkte Induktion von Zelltod oder durch Produktion ihrer spezifischen Zytokine . Diese können entweder für den Tumor direkt zytotoxisch sein oder dazu führen, daß für den Tumor toxische Effektorzellen, Tc oder Makrophagen, rekrutiert und aktiviert werden. Dadurch haben sie entscheidenden Anteil an der immunvermittelten Remission bzw. Regression des Tumors .
Erfindungsgemäß können Thl-Zellen gegen beliebige Tumorarten produziert werden. Bevorzugt ist die Produktion von Thl gegen Lymphome wirksam, aber auch solide Tumoren sind wichtige Zielstrukturen. Mit dem erfindungsgemäßen Präparat können daher die entspechenden Tumorarten bekämpft werden. Die Art und Posologie der Verabreichung werden von einem Arzt entsprechend der Art und Schwere des zu behandelnden Tumors, dem Zustand des Patienten und der Therapiedauer bestimmt. Erfindungsgemäß wird das Präparat in einer Dosierung von Ixl06-100-1000xl06 Zellen/kg Körpergewicht in einer einmaligen Dosis oder wiederholt verabreicht . Das Präparat kann sowohl Menschen als auch Tieren verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Thl-Zellen können vor hämatopoietischen Tumoren schützen; sie eignen sich auch zur Behandlung etablierter Lymphome und es können mit derartigen Thl-Zellen auch solide Tumoren zumindest kontrolliert werden.
Das erfindungsmäßige Verfahren erlaubt ferner, tumorspezifische Thl-Zellen auch aus Tieren zu gewinnen, die bereits an einem fortgeschrittenen Tumor erkrankt sind. Dabei ist es möglich, aus der Vielzahl der unterschiedlichen Immunzellen genau die wenigen Familien von T-Lymphozyten zum Wachsen zu bringen, die entweder spezifisch oder vor allem den Tumor erkennen. Durch den adoptiven Transfer tumorspezifischer Thl-Zellen können sehr schnell wirksame antitumorale Immunantworten aufgebaut werden, die dann auch in der Therapie sehr schnell wirksam und dabei sicher - d.h. weitgehend frei von Nebenwirkungen sind.
Um die Rolle von tumorreaktiven MHC-Klasse II restringierten CD4+Th näher zu untersuchen, war es nötig, ein Kultursystem zu entwickeln, das es erlaubt, tumorspezifische Thl zu generieren. MHC-Klasse II restringierte Tumorpeptide sind bisher kaum bekannt . Aus diesem Grund wurde ein System entwickelt, das es erlaubt, tumorspezifische Thl zu etablieren, ohne spezifische Tumorpeptide zu kennen. Durch Bestrahlung oder Chemo- therapeutika wie Mitomycin C in ihrer Proliferation gehemmte Tumorzellen werden zusammen mit auto- logen/syngenen APC und Th in vitro kultiviert . Aus Gründen der Praktibilität wurden die Untersuchungen bisher an einem B-Zell-Lymphom durchgeführt, das seine eigenen Tumorantigene über MHC II präsentieren kann. Aus Mäusen, die das A20-B-Zell-Lymphom bereits tragen, oder aber auch aus Mäusen, die gegen dieses Lymphom immunisiert wurden, wurden CD4+Th gewonnen. Diese Th wurden dann in vitro mit der unten beschriebenen Methode so kultiviert, daß tumorspezifische Thl entstehen, Th, die große Mengen an IFN-γ, aber wenig oder kaum IL-4 produzieren. Gemessen mit einem handelsüblichen ELISA- Test lagen wirksame IFN-γ-Spiegel zwischen 102 und 105 U/ml; gemessen mit CT4S-Zellen mußte IL-4 unter 1000 U/ml liegen. Wieder war wichtig, daß die Ratio von IFN-γ zu IL-4 > 10:1 betrug. Diese tumorspezifischen Thl wurden dann zur Tumortherapie verwendet .
Material-Herstellung tumorspezifischer Thl
Murine A20-Zellen (ATCC-TIB-208) wurden in RPMI1640, das 10 % FCS und 50 mM ß-Mercaptoethanol enthielt, bei 37°C in wassergesättigter Atmosphäre und 5 % C02 kultiviert. Vor dem Einsatz zur in vitro Kultur mit den Th wurden die Tumorzellen mit 65 Gray bestrahlt.
Th (> 95% Reinheit) wurden durch negative Selektion unter Verwendung von Biotex-T-Zellsäuren (Tebu, Frankfurt) gewonnen. Andere Verfahren zur Gewinnung von Th mittels positiver oder negativer Anreicherung sind in gleicher Weise geeignet . Diese Th wurden in vitro in Dulbeccos MEM (Kulturmedium) , das durch 10% FCS, Penicillin und Streptomycin, 50 μM ß-Mercaptoethanol und MEM-Aminosäuren angereichert worden ist, bei 37°C in wassergesättigter Atmosphäre und 7,5 % C02 kultiviert. Auch andere Medien erlauben, Th Linien zu etablieren, einige davon ohne die Verwendung von Serum.
APC wurden durch Behandlung von BALB/c-Milzzellen mit Anti-CD4- und Anti-CD8-Antikörper und Komplement (Behring-Werke, Marburg) angereichert. Vor dem Einsatz zur in vitro Kultur von Th wurden sie mit 30 Gray bestrahlt .
Phosphothioatmodifiziertes CpG-Dinucleotidhaltiges Oligo- nucleotid (CpG-ODN 1668) wurde von MWG (München) bezogen (Sequenz: 5 ' -TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3 • ) . Anti-IL-4- Antikörper stammen von dem Klon 11B11, humanes rIL-2 wurde im Handel bezogen. Derartige Antikörper sind auch gegen das IL-4 des Menschen entwickelt worden; weiterhin lassen sich Thl auch durch die Anwendung von solublem IL- 4 Rezeptormolekül herstellen (Breit et al . 1996, Eur . J . Immunol . 26, 1860-1865).
Beispiel für die Herstellung der tumorspezifischen Thl
Tag 1
1. Stimulation
0,2 x 106 Th + bestrahlte Tumorzellen (0,2 x 106 A20) + 0,3 x 106 APC + anti-IL-4 Antikörper (z.B. 10 μg/ml 11B11) +/- immunstimulatorische Oligonukleotide (z.B. 0,2 μM CpG-ODN 1668) + IL-2 in einer 6-Loch-Rundboden- Kulturplatten, 200 μl Volumen, in Kultur gegeben.
Tag 2
Wechsel von Medium, anti-IL-4 Antikörper, Oligonukleotid und IL-2. Tag 4
Die Zellsuspension wird in eine 24 -Loch-Kulturplatte überführt und mit einem IL-2-haltigen Medium ernährt. Tag 5 - 10
Alle 2 Tage (Tag 7, Tag 9) erfolgt ein Mediumwechsel und die Ernährung der Zellen mit einem IL-2 -haltigen Medium. Je nach Zelldichte wird die Kultur auf weitere Kulturschalen verteilt.
Tag 11
2. Stimulation der Zellen
0,1 x 106 Th + 0,2 x 106 bestrahlten A20 + 0,3 x 106 APC + anti-IL-4 Antikörper +/- immunstimulatorische Oligo- nukleotide in einer 96-Loch-Rundboden-Kulturplatte, 200 μl Volumen, in Kultur gegeben.
Tag 12
Wechsel von Medium, anti-IL-4 Antikörper, Oligonukleotid und IL-2.
Tag 14
Die Zellsuspension wird in eine 24 -Loch-Kulturplatte überführt und mit einem IL-2-haltigen Medium ernährt.
Tag 15 - 20
Alle 2 Tage (Tag 17, Tag 19) erfolgt ein Mediumwechsel und die Ernährung der Zellen mit IL-2 -haltigen Medium. Je nach Zelldichte wird die Kultur auf weitere Kulturschalen aufgeteilt .
Tag 21
3. Stimulation Je nach Bedarf können die Th alle 10-14 Tage, so an Tag 2JX noch ein drittes Mal und öfter, entsprechend dem Protokoll für die 2. Stimulation (Tag 11-20) restimuliert und weiter expandiert werden. Alternativ werden sie für die Therapie mittels adoptivem Transfer genutzt .
Bei Kontrolle exprimieren diese Linien Oberflächen- antigene, die aktivierte Th charakterisieren. Die so generierten Th-Linien sind:
(1) spezifisch für den Tumor, hier das A20-Lymphom und
(2) T-Zell-Linien von Thl Typ (Thl-ähnliche Zellen) .
Werden sie in vitro durch syngene Milzzellen stimuliert, die über ihre MHC Klasse II Moleküle die Tumorpeptide des A20 -Tumors präsentieren, produzieren sie viel IFN-γ und wenig oder kein IL-4 (vgl. Produktionsangaben auf S. 6 und Fig. 1) . Werden die Th jedoch mit syngenen Milzzellen kultiviert, die keine Tumorantigene oder Antigene eines anderen Tumors, des MCPll-B-Zell-Lymphoms, präsentieren, prodzieren sie keine, oder nur geringe Mengen an Zytokinen. Diese Zellen stellen pharmazeutische Präparate dar, die gezielt zur Therapie des A20-Lymphoms verwendet werden können.
Zunächst wurde die Auswirkung des adoptiven Transfers von A20 -spezifischen Thl auf die Immunantwort von Balb/c- Mäusen gegen den A20-Tumor untersucht. Dazu wurden Balb/c-Mäusen gleichzeitig 0,5 x 106 A20-Zellen und 0,5 x 10s A20 -spezifische Thl intraperitoneal injiziert. Nach 5, 7 und 10 Tagen wurden die Milzzellen aus den Mäusen isoliert und in vitro mit dem Tumor, hier dem 0,2 x 106 A20-Tumor, der durch syngene APC präsentiert wurde, stimuliert. T Lymphozyten von Mäusen, denen Tumorzellen verabreicht worden waren, produzierten IFN-γ nur dann, wenn sie innerhalb von 5 Tagen nach Tumorapplikation isoliert wurden. Im Gegensatz dazu produzierten T-Lymphozyten von Mäusen, die sowohl A20-Tumoren als auch A20- spezifische Thl injiziert bekamen, auch dann noch IFN-γ, wenn sie mehr als 10 Tage nach dem Tumortransfer durch syngene APC mit tumorspezifischen Antigenen stimuliert wurden (Fig. 2) . Durch den adoptiven Transfer von A20- spezifischen Thl wurde so eine prolongierte Thl Immunantwort gegen den A20-Tumor induziert.
Tumorprävention mit tumorreaktiven Thl
In Tumorpräventionsexperimenten wurden den Balb/c-Mäusen direkt nacheinander 0,5 x 106 A20-Tumorzellen und 0,5 x 106 A20-spezifische Thl intraperitoneal injiziert. Durch den adoptiven Transfer der Thl-Linien wurde die Überlebensrate der Mäuse erheblich verlängert (Fig. 3) . Je nach Experiment waren zwischen 70% und 100% aller Mäuse völlig geheilt. Dies war insofern erstaunlich, als der Tumor als sehr aggressiv gilt und viele herkömmliche Immuntherapien, die sonst wirksam eine Tumorprävention erlauben, bei diesem Tumor versagen. Ein zweites wichtiges Ergebnis war, daß ein adoptiver Transfer dieser Thl-Linien zwar vor der Tumorentwicklung schützt, daß er aber nicht zu Autoimmunerkrankungen führt : die Tiere können unter dem Schutz so lange leben, daß sie eines natürlichen Todes sterben. Auch nach einem Jahr weisen die Tiere weder klinisch noch in der Autopsie Anzeichen für Tumoren oder Autoimmunerkrankungen auf . Selbst wenn die Tiere immunsupprimiert werden, treten zu einem späteren Zeitpunkt keine Tumoren mehr auf . Tumortherapie mit tumorreaktiven Thl
Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden dann die Thl genutzt, um bereits etablierte Tumoren zu behandeln. 0,5 x 106 A20 -Tumorzellen wurden intravenös injiziert. An Tag 7 nach dem Transfer, einem Zeitpunkt, zu dem sich bereits große Mengen an Tumor in den lymphoiden Organen nachweisen lassen, erhielten die Tiere wiederum eine intravenöse Vakzinierung von 0,5 x 106 A20-spezifische Thl- Linien, also etwa 25 x 106 Thl-Zellen pro kg Körpergewicht. Die Daten aus fünf Experimenten ergaben, daß (1) bei fast allen Tieren das Tumorwachstum erheblich verzögert wurde und (2) bis 70 % der Tiere durch den Transfer der Thl als geheilt angesehen wurden (Fig. 4) . Die Therapie war noch zu einem Zeitpunkt wirksam, zu dem Immuntherapien bisher nicht beschrieben wurden und zu dem die Tumorlast der Milz etwa 100-fach größer war als bei den bisher beschriebenen Immunisierungsprotokollen.
Somit zeigen die Daten in Fig. 2, 3 und 4, daß adoptiv transferierte Thl sehr wirksame Immunantworten gegen Tumoren hervorrufen können. Erstmals wurde erfindungs- gemäß gezeigt, daß
1) Thl auch sehr effizient und sicher nicht nur in der Prävention sondern auch in der Tumortherapie eingesetzt werden können.
2) Die Therapie auch in immunkompetenten Tieren funktioniert .
3) Es ist davon auszugehen, daß mit der hier beschriebenen Methode auch Thl gegen Zellen von anderen, insbesondere soliden Tumoren induziert werden können, da die Präsentation der Antigene vorwiegend über auto- loge/syngene APC (in diesem Ansatz Milzzellen) erfolgt . Die Methode erlaubt somit wirksame Thl auch für eine Immunantwort gegen solide Tumoren, die kein MHC-II expri ieren, zu generieren.
Die beigefügten Figuren erläutern die Erfindung näher.
Die Fig. 1 zeigt die Produktion von IFN-γ und IL-4 durch A20-spezifische Thl-Zeil-Linien nach In Vitro- Sti ulation. Die A20-spezifische IFN-γ-Produktion einer CD4+T-Zell-Linie wurde mit CpG ODN und anti-IL-4- Antikörpern gegen das Lymphom innerhalb von zwei Wochen in vitro generiert. Dabei wurden CD4+-T-Zellen (Th) aus Balb/c-Mäusen isoliert, die durch einen A20 -Tumor immunisiert worden waren. Die gewonnenen Th wurden in vitro in Gegenwart von syngenen antigenprasentierenden Zellen (APC) , A20-Tumorzellen, Anti-IL-4-Antikörper, IL-2 und CpG-ODN 1668 stimuliert und über 10 Tage expandiert. An Tag 11 wurden die kultivierten Thl in Gegenwart von APC alleine oder zusätzlichen A20-Zellen für 24 Stunden restimuliert. Aus dem Kulturüberstand wurde der Gehalt an IL-4 und IFN-γ bestimmt.
Die Fig. 2 zeigt die Verlängerung einer A20-spezifischen Immunantwort durch adoptiven Transfer von A20- spezifischen Thl. Durch den adoptiven Transfer von A20- spezifischen Thl wird die tumorspezifische Immunantwort gegen ein A20-B-Zeil-Lymphom deutlich verlängert. Dabei wurden Balb/c-Mäuse durch intravenöse Injektion von 0,5 Millionen A20 Tumorzellen alleine oder zusammen mit 0,5 Millionen A20 -spezifischen Thl immunisiert. An d5, 7, 10 wurden die Milzen der Mäuse präpariert und 1 Million Zellen in vitro ohne oder mit bestrahlten A20 für 48
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Stunden bei 37°C inkubiert. Aus dem Kulturüberstand wurde dann ~TFN-γ bestimmt.
Die Fig. 3 zeigt die Prävention eines A20 B-Zell-Lymphoms durch adoptiven Transfer von A20-spezifischen Thl. Es kommt zu schnellem Sterben von BALB/c-Mäusen nach adoptivem Transfer des A20-Lymphoms (Tumor) und zu langfristigem Überleben von BALB/c-Mäusen nach Gabe des A20- Lyphoms und gleichzeitigem, adoptivem Transfer von A20- spezifischen Thl. Dabei wurden Balb/c-Mäusen 0,5 Millionen A20-TumorZeilen alleine oder gleichzeitig mit 0,5 Millionen A20-spezifischen Thl intravenös injiziert und der Therapieverlauf wurde visuell verfolgt.
Die Fig. 4 zeigt die Therapie eines etablierten A20 B- Zell-Lymphoms durch adoptiven Transfer von A20- spezifischen Thl. Es kommt zu schnellem Sterben von BALB/c-Mäusen nach adoptivem Transfer des A20-Lymphoms und zu Langzeitheilung bei bis zu > 80 % der BALB/c- Mäuse, wenn sieben Tage nach Gabe des A20-Lymphoms A20- spezifische Thl adoptiv transferiert wurden. Zu diesem Zeitpunkt ist die Tumorbelastung 100-fach höher als bei der bisher erfolgreichsten Therapie mit Zytokin transferierten Tumorzellen. Dabei wurden Balb/c-Mäusen 0,5 Millionen A20-Tumorzellen in 500 μl PBS intravenös injiziert. Sieben Tage nach A20-Injektion (100 CFU/Milz) wurden den Mäusen 500 μl PBS alleine oder 0,5 Millionen A20-spezifische Thl in 500 μl PBS intravenös injiziert und der Therapieverlauf visuell verfolgt .
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP

Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutisches Präparat, umfassend tumorspezifische Th-Zellen mit einem Thl-ähnlichen Zytokinmuster, die eine hohe Produktion von Interferon-γ aufweisen und wenig oder kein Interleukin-4 produzieren, zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Exzipientien und Hilfsstoffen.
2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion von Interferon-γ wenigstens 100 U/ml beträgt.
3. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion von Interleukin-4 höchstens 1000 U/ml beträgt .
4. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Interferon-γ-Produktion zur Interleukin-4-Produktion wenigstens 10:1 beträgt.
5. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es hohe Spezifizität für Tumorantigene besitzt.
6. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer für den adoptiven Transfer geeigneten Form vorliegt .
7 X Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von soliden oder hämatopoietischen Tumoren.
8. Verfahren zur Herstellung von tumorreaktiven Thl- ähnlichen Zellen, die gemäß Anspruch 1 eine hohe Produktion von Interferon-γ aufweisen und wenig oder kein Interleukin-4 produzieren.
9. Verwendung von tumorreaktiven Thl-ähnlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie gemäß Anspruch 1 eine hohe Produktion von Interferon-γ aufweisen und wenig oder kein Inter- leukin-4 produzieren, zur Prophylaxe und/oder Therapie von soliden oder hämatopoietischen Tumoren.
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