WO2000049148A1 - Nouvelle proteine de type recepteur de cytokines - Google Patents

Nouvelle proteine de type recepteur de cytokines Download PDF

Info

Publication number
WO2000049148A1
WO2000049148A1 PCT/JP2000/000939 JP0000939W WO0049148A1 WO 2000049148 A1 WO2000049148 A1 WO 2000049148A1 JP 0000939 W JP0000939 W JP 0000939W WO 0049148 A1 WO0049148 A1 WO 0049148A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
dna
present
seq
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2000/000939
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshio Kitamura
Keishi Fujio
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to AU25741/00A priority Critical patent/AU2574100A/en
Priority to EP00904039A priority patent/EP1152059A4/en
Publication of WO2000049148A1 publication Critical patent/WO2000049148A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons

Definitions

  • the present invention provides a novel cytokine receptor-like protein expressed in blood cells, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, a host cell carrying the vector, an antibody against the protein,
  • the present invention relates to a method for screening a compound used, and a compound which can be isolated by the screening method.
  • cytokines a group of humoral factors
  • a number of site forces have been identified so far, and as a result of their analysis, many site forces have a wide range of physiological activities, and one site force in can be used for various cells. It has been shown to act and exert various effects on cells.
  • These cytokines form a communication network between cells such as hematopoietic cells, lymphoid cells, and endothelial cells, and are thought to regulate the differentiation, proliferation, and activation of these cells. (Mariko Ozu et al., 1992, Cytokine therapy, Nankodo, PP2-14).
  • Site power-in is expected to have clinical applications, especially in the medical field, and is being applied to the treatment of various diseases, including cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, and thrombosis.o
  • Type I cytokine receptors include many influenza leukin receptors, including the IL-2; S receptor, the colony stimulating factor receptor, the erythropoietin receptor, and the like, and the hemopoietin receptor family. —Also called perfamily.
  • Type I cytokine receptor families have structurally common features, a WS box consisting of tributophan-serine-X-tributophan-serine residues immediately above the cell membrane, and the four cystine residues usually located at the front end.
  • the group has a fibronectin type III similar structure.
  • boxl there is a relatively homologous part called boxl near the membrane in the intracellular region and box2 on the C-terminal side. These regions are considered essential for intracellular communication.
  • family cytokine receptor families such as the type II cytokine family that includes inulin ferrons / receptors and the TNF receptor / NGF receptor family.
  • cytokine receptors Although a large number of cytokine receptors have been identified in this way, there are many unknowns in cytokine signaling, and unknown signaling molecules that are involved in the complex information network of blood cells are still being identified. It seems that there is more than one. Therefore, identifying new cytokine receptors that are expressed on lymphoid cells and hematopoietic cells is not limited to elucidation of such site-in signaling but also various diseases involving cytokines. It is also crucial in developing therapeutic and preventive measures against illness. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel cytokine receptor-like protein expressed in blood cells and its gene. Another object of the present invention is to provide a vector into which the gene is inserted, a host cell holding the vector, and an antibody that binds to the protein. Still another object of the present invention is to provide a method of screening for a compound that binds to the protein, such as a ligand, using the protein.
  • the present inventors have proposed a novel factor or a receptor thereof involved in immune and differentiation functions.
  • the proprietary signal-sequence trap (SST) method Japanese Patent Application No. 9-324912 was used to generate polymorphic RNA derived from lymphocytes that had been induced to differentiate.
  • the cDNA encoding the secreted membrane protein was screened.
  • the present inventors have proposed a receptor belonging to the type I site force-in receptor super family 1 (Miyajima, A. et al., Ann. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331).
  • a gene encoding a novel receptor-like protein having homology to was successfully isolated.
  • This gene was expressed in the heart, lung, liver, and spleen of mouse tissues, as well as in myeloid lymphocyte cell lines such as Ba / F3, DA-1, and CTLL2.
  • the membrane-proximal region of the protein encoded by the gene could replace the membrane-proximal region of human EP0R in transmitting propagation signals and activating JAK2.
  • the receptor-like protein of the present invention has a region that can be presumed to be a boxl'box2 region that transmits a signal into a cell. It is suggested that it functions as a signal transduction molecule from outside to the cell, especially in the immune system. Therefore, the protein is useful as a tool for purification and cloning of factors involved in immune / differentiation functions, and also for screening drug candidate compounds for immune function-related diseases.
  • the present invention relates to novel receptor-like proteins expressed in hematopoietic cells, their genes, and their production and use.
  • the method for producing a protein according to (4) comprising culturing the host cell according to (3) and recovering the protein expressed from the host cell or a culture supernatant thereof.
  • nucleotide having a chain length of at least 15 bases which hybridizes with DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a complementary strand thereof,
  • ligand refers to a protein that activates its function by binding to the protein of the present invention expressed on a cell membrane.
  • agonist refers to a protein capable of causing the same phenomenon (activation of the protein of the present invention) as the binding of the protein of the present invention to a ligand.
  • ligand refers to molecules that can bind.
  • angiagonist refers to a molecule that specifically inhibits the function of the protein of the present invention by binding thereto.
  • the present invention provides a novel cytokine receptor-like protein expressed in blood cells.
  • the nucleotide sequences of the two mouse-derived cDNAs isolated by the present inventors are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively, and the amino acid sequences of the proteins encoded by the cDNAs are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively. This is shown in Fig. 4 (see Fig. 1).
  • These proteins have homology to a known protein belonging to the type I cytokine receptor superfamily, have a signal sequence at their N-terminus, and have the protein described in SEQ ID NO: 2. It has an amino acid region rich in hydrophobicity that is expected to be a transmembrane region in the middle (see Fig. 2).
  • the protein discovered by the present inventors is considered to be a novel protein belonging to the type I cytokine receptor superfamily. Also, since the protein proximal region substitutes for the human EP0R membrane proximal region in transmitting proliferation signals and activating JAK2, the protein is formed by complexing with a heterologous receptor. It is suggested that it is involved in signal transduction through activation of JAK2.
  • the gene coding for the protein was cloned from lymphocytes, and Northern blot analysis showed expression in heart, lung, liver, spleen, Ba / F3, DA-1, Expression was also observed in myeloid and lymphoid cell lines such as CTLL2. Therefore This receptor-like protein is thought to play a regulatory role in immunity and hematopoiesis, and purifies and clones factors related to the function of the immune system. It can be used as a useful tool for screening compounds. It can also be used for the treatment of various infectious diseases, autoimmune diseases, and gene therapy in tumor immunity.
  • the present invention also includes a protein functionally equivalent to the protein described in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • “functionally equivalent” means that the target protein functions as a receptor protein.
  • the protein functionally equivalent to the protein described in SEQ ID NO: 2 preferably has characteristics as a type I cytokine receptor.
  • Such features include, for example, boxl and box2 regions.
  • boxl is a region consisting of 8 amino acids that are present in the intracellular region near the membrane of the site force-in receptor and contains a large amount of proline
  • box2 is located from the C-terminus and contains the LEVL sequence. It is a region consisting of amino acids. Both are thought to be important for intracellular signal transduction.In particular, boxl is thought to be important for the interaction between Jak (Janus kinase) and the cytokine receptor (Ning Jiang, J.
  • the protein functionally equivalent to the protein described in SEQ ID NO: 4 preferably has characteristics as a soluble cytokine receptor.
  • the soluble site force-in receptor is a protein consisting only of the extracellular domain, and may be the entire extracellular domain or a part of the extracellular domain as long as it has a ligand-binding activity. Soluble site force-in receptors can be both ligand inhibitors and promoters depending on their signaling pathways (Smith, DH, Science, 238, 1704-1707 (1987); Novick, D., Cytokine). , 4, 6-11 (1992)).
  • the protein has an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the number of amino acids to be mutated in such a mutant is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, more preferably within 5 amino acids, and further preferably within 3 amino acids. .
  • the amino acid residue to be mutated is mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • the properties of the amino acid side chain include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, ⁇ , ⁇ ), a sulfur atom-containing side Chain-containing amino acids (C, M), carboxylic acids and amino acids with amide-containing side chains (D, N, E, Q), aminoyl having a base-containing side chain, K, ⁇ ), and amino acid having an aromatic-containing side chain (H, F, Y, W). Represents the one-letter designation of amino acids).
  • Examples of the protein obtained by adding one or more amino acid residues to the protein of SEQ ID NO: 2 or 4 include a fusion protein containing the protein of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the fusion protein is a fusion of the protein of SEQ ID NO: 2 or 4 or a partial peptide thereof with another peptide or protein, and is included in the present invention.
  • Other peptides to be fused include tags used for the purpose of facilitating protein purification and detection, and other cytokine receptor or partial peptides thereof (see FIG. 5).
  • a method for producing a fusion protein includes, for example, linking a DNA encoding the protein of the present invention with a DNA encoding another peptide or protein such that the frames match, introducing the DNA into an expression vector, and expressing the DNA in a host. Any method may be used, and a method known to those skilled in the art can be used. Other peptides or proteins to be fused with the protein of the present invention are not particularly limited.
  • a protein functionally equivalent to the above-mentioned protein is also included in the protein of the present invention.
  • proteins include homologues of mammals other than mice (for example, proteins encoded by human genes).
  • Hybridization for isolating DNA encoding functionally equivalent proteins can be performed, for example, under conditions where the stringency is 10% formamide, 5xSSPE, 1X dendrogen solution, and lx salmon sperm DNA. It can be carried out. More preferable conditions (more stringent conditions) are the conditions of 25% formamide, 5xSSPE, 1X dendrogen solution, and lx salmon sperm DNA, and more preferable conditions (more stringent conditions) , 50% formamide, 5xSSPE, lx Denhardt's solution, lx salmon sperm DNA.
  • the protein functionally equivalent to the protein of SEQ ID NO: 2 or 4 encoded by DNA isolated by these hybridization techniques or gene amplification techniques is usually the protein of SEQ ID NO: 2 or 4. And has high homology in the amino acid sequence.
  • a high homology is usually 70% or more homology, preferably 80% or more homology, more preferably 95% or more homology.
  • the homology of proteins can be determined by following the algorithm described in the literature (Wirlbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730).
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or as a natural protein by methods known to those skilled in the art. If the protein is a recombinant protein, for example, if it is a protein expected to be membrane-bound, a portion of the protein other than the region required for membrane binding is secreted out of the cell. Then, the culture of this cell After collecting and concentrating the culture supernatant, it is subjected to chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the protein of the present invention is immobilized on a column, or Further, it is possible to purify by combining a plurality of these columns.
  • chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the protein of the present invention is immobilized on a column, or Further, it is possible to purify by combining a plurality of these columns.
  • the protein of the present invention is expressed in host cells (eg, animal cells, E. coli, etc.) as a fusion protein with glutathione s transferase protein or as a recombinant protein to which multiple histidines are added. Then, the expressed recombinant protein is purified using a glutathione column or a nickel column. Thereafter, if necessary, a region other than the target protein in the fusion protein can be prepared by a method of cutting and removing the region with thrombin or factor-Xa or the like. If the protein is a natural protein, it is isolated, for example, by subjecting an extract of a cell expressing the protein of the present invention to an affinity column to which an antibody of the present invention described later is bound to purify the protein. be able to.
  • host cells eg, animal cells, E. coli, etc.
  • the expressed recombinant protein is purified using a glutathione column or a nickel column.
  • the present invention also includes partial peptides of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 8 amino acids or more, preferably 15 amino acids or more, more preferably 50 amino acids or more (for example, 70 amino acids, 100 amino acids, or 130 amino acids or more).
  • the partial peptide can be used, for example, for preparing an antibody against the protein of the present invention, for screening a compound such as a ligand that binds to the protein of the present invention, and for preparing a competitive inhibitor of the protein of the present invention.
  • Examples of the partial peptide of the present invention include a protein in which a signal peptide is removed from the protein of the present invention and a protein in which a region in a cell is removed.
  • a partial peptide (functioning as a competitive inhibitor of the protein of the present invention) which has a binding ability to a ligand but does not have a signal transmitting ability to cells is included.
  • the partial peptide of the present invention can be produced by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • the present invention also provides a DNA encoding the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized MA.
  • DNAs having any base sequence based on the degeneracy of the genetic code are included as long as they can encode the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from cells expressing the protein of the present invention, and a part of the DNA sequence of the present invention (for example, the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or 3) is used as a probe for hybridization. It can be prepared by performing chilling.
  • RNA is prepared from cells expressing the protein of the present invention, and oligo DNA is synthesized based on the sequence of the DNA of the present invention (for example, the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or 3). It can also be prepared by performing a PCR reaction using as a primer and amplifying a cDNA encoding the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be used to produce the protein of the present invention as a recombinant protein. Further, when the MA encoding the protein of the present invention is defective, application to antisense function inhibition, gene therapy for replacing a normal gene, and the like can be considered.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can express the MA of the present invention in a host cell.
  • the vector is amplified in Escherichia coli (for example, JM109, DH5H, HB10K XLlBlue), etc., and the ⁇ ori '' to be amplified in Escherichia coli is required for large-scale preparation.
  • a transformed Escherichia coli selection gene for example, a drug resistance gene that can be identified by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)
  • M13 system vector, pUC system vector, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like can be mentioned.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector may have the above-mentioned characteristics such that the vector is amplified in Escherichia coli, and may be used in a host such as JM109, DH5 or HB10K XLlBlue.
  • a promoter eg, lac, T7, etc.
  • Examples of such a vector include pGEX, pEGFP, or pET (in this case, BL21 expressing T7 MA polymerase is preferable as a host) in addition to the vectors described above.
  • the promoter required for expression in cells (SV40, MMLV-LTR, EF1, and CMV promoter, etc.) ) Is essential, and it is more preferable to have a gene for selecting cell transformation (for example, a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.)).
  • Vectors having such properties include, for example, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, p0P13, and the like.
  • a vector having a DHFR gene complementary to a CH0 cell lacking a nucleic acid synthesis pathway can be used to amplify with methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • COS having a gene expressing the SV40 T antigen on the chromosome can be used.
  • a vector such as pcD having SV40 replication mechanism.
  • a method for expressing the DNA of the present invention in an animal body a method of incorporating the DNA of the present invention into an appropriate vector and introducing the DNA into a living body by a retrovirus method, a ribosome method, a cationic liposome method, an adenovirus method, or the like is used. And so on.
  • pAdexlcw and pZIPneo are examples.
  • Can be General genetic manipulation such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used. Examples of Escherichia coli include JM109, DH5 and HB101, and examples of animal cells include CH0 cells, COS cells, 3T3 cells, and HeLa cells. For the purpose of expressing a large amount in animal cells, CH0 cells are particularly preferable.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed, for example, by a method such as the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the electrolysis, and the lipofection.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a monoclonal antibody as well as a polyclonal antibody. It also includes antisera obtained by immunizing egrets and the like with the protein of the present invention, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies of all classes, and human antibodies and humanized antibodies obtained by genetic modification.
  • the antibody of the present invention can be prepared by the following method.
  • a polyclonal antibody for example, a small animal such as a heron is immunized with the protein of the present invention to obtain a serum, which is then subjected to an affinity column in which the protein of the present invention is coupled.
  • the fraction can be prepared by obtaining a fraction that recognizes only the protein, and further purifying immunoglobulin G or M from this fraction using a protein A or protein G column.
  • a monoclonal antibody In the case of a monoclonal antibody, a small animal such as a mouse is immunized with the protein of the present invention, the spleen is excised from the mouse, and the resulting spleen is crushed into cells, and mouse myeloma cells and a reagent such as polyethylene glycol are used. A clone that produces an antibody against the protein of the present invention is selected from the fused cells (hybridoma) thus obtained.
  • the obtained hybridoma was transplanted intraperitoneally into the mouse, and The ascites is collected, and the obtained monoclonal antibody is purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, futin G column, DEAE ion exchange chromatography, or an affinity column to which the protein of the present invention is coupled. It can be prepared.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the protein of the present invention, and is also a candidate for an agonist and an agonist of the protein of the present invention. It is also conceivable to apply the antibody of the present invention to antibody therapy for immune-related diseases. When used for antibody therapy, human or humanized antibodies are preferred to reduce immunogenicity.
  • a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes is immunized with a protein serving as an antigen, a protein-expressing cell or a lysate thereof to obtain antibody-producing cells, and the resulting cells are fused with myeloma cells using a hybridoma.
  • a human antibody to the protein may be obtained (see International Patent Application Publication Nos. W092-03918, W093-Z227, W094-02602, W094-25585, W096-33735, and W096-34096).
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or modified antibody thereof as long as it binds to the protein of the present invention.
  • an antibody fragment Fab, F (ab ') 2, Fv or a single chain Fv (scFv) obtained by linking an Fv of an H chain and an L chain with an appropriate linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and introduced into an expression vector. Expressed in cells (eg, Co, MS et al., J. Immunol.
  • modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” of the present invention also includes these modified antibodies. Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. These methods are already established in this field.
  • the present invention also provides a nucleotide that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 or a complementary strand thereof and has a chain length of at least 15 bases.
  • This nucleotide preferably hybridizes specifically with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, or a complementary strand thereof.
  • the term "specifically hybridize” as used herein means that under normal hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions, cross-hybridization with DNA encoding other proteins is performed. Means not to occur significantly.
  • nucleotides include probe-primers, nucleotides or nucleotide derivatives capable of specifically hybridizing with the DNA encoding the protein of the present invention or its complementary strand (eg, antisense oligonucleotides-ribozymes, etc.). Is included.
  • the present invention also provides a method for screening for a compound that binds to the protein of the present invention, using the protein of the present invention.
  • This screening method comprises: (a) a step of bringing a test sample into contact with the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and (b) selecting a compound having an activity of binding to the protein of the present invention or a partial peptide thereof. Process.
  • the protein of the present invention used for screening may be any of a recombinant type, a natural type and a partial peptide. Further, the protein may be a purified protein or a partial peptide thereof, or may be a form expressed on a cell surface or a form as a membrane fraction.
  • the test sample is not particularly limited, and includes, for example, cell extracts, cell culture supernatants, proteins, peptides, and synthetic low-molecular compounds.
  • As a method for isolating a ligand for the protein using the protein of the present invention many methods known to those skilled in the art can be used.
  • a cDNA library using a phage vector is prepared from cells that are expected to express the ligand (eg, T cells, etc.), and this is prepared on LB-agarose. Immobilize the protein expressed in the filter and expressed in the filter, purify the protein of the present invention as a biotin label or a fusion protein with GST protein, and react with the filter to express the protein to be bound.
  • a cDNA library is prepared that is expressed in a form that is fused with E. coli.
  • the cDNA library is introduced into the yeast cells described above, library-derived cDNA is isolated from the detected positive clones, introduced into E. coli, and expressed (in yeast cells).
  • the reporter gene is activated by the binding of the two, and a positive clone can be confirmed.
  • “Two hybrid system” (MATCHMARKER Two-Hybrid Systemj, “Maminaliaii MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit, MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (all manufactured by clontech), HybriZAP Two-Hybrid Vector Systemj (stratagene), literature rDaltoii S, an d Treisman R (1992) Character i zat i on of SAP-1, a protein recruited by serum respons e factor to the c-fos serum response element.Cell 68, 597-612 '') is there.
  • screening for a ligand that specifically binds to the protein of the present invention comprises screening the extracellular domain of the protein of the present invention and an intracellular domain containing a transmembrane domain of a known receptor protein such as a hemopoietin receptor having signal transduction ability. And expressing the chimeric receptor produced on the cell surface of an appropriate cell line, preferably a cell line that can survive and grow only in the presence of an appropriate growth factor (growth factor-dependent cell line). Thereafter, the cell line can be cultured by adding a material expected to contain various growth factors, cytodynamic factors, hematopoietic factors and the like.
  • This method utilizes the fact that the above-mentioned growth factor-dependent cell line can survive and proliferate only when the test material contains a ligand that specifically binds to the extracellular domain of the protein of the present invention.
  • Known hemopoietin receptors include, for example, thrombopoietin receptor, erythropoietin receptor, G-CSF receptor, gpl30, and the like.Partners of the chimeric receptor used in the screening system of the present invention include these known partners.
  • the present invention is not limited to the hemopoietin receptor, and any cytoplasmic domain having a structure necessary for signal transduction activity may be used.
  • the 0X40 receptor belonging to the TNF receptor superfamily can be selected as a partner of the chimeric receptor (Mallet, S. et al., EMBO J., 19, 1063-1068 (1990)). Since the 0X40 receptor can transmit a positive signal into cells, screening of ligands can be performed using proliferative responses as an index (Baum, PR et al., EMBO J., 13, 3992). -4001 (1994)).
  • a growth factor-dependent cell line for example, an IL3-dependent cell line such as BaF3 or FDC-P1 can be used.
  • the protein of the present invention is expressed in cells that do not express the ligand, and then the expressed cDNA library constructed from cells that are expected to express the ligand is expressed in the cells.
  • the culture supernatant obtained by the introduction into the cell is added, and a ligand is searched for using a certain change of the cell (for example, including a functional change such as a proliferation activity or a morphological change) as an index.
  • a certain change of the cell for example, including a functional change such as a proliferation activity or a morphological change
  • the culture supernatant of cells expected to express the ligand of the present invention is placed on an affinity column on which the protein of the present invention is immobilized, and the protein that specifically binds to the column is purified.
  • the DNA encoding the ligand is obtained by analyzing the amino acid sequence of the obtained protein (ligand), synthesizing oligo DNA based on the amino acid sequence, and screening a cDNA library using the DNA as a probe. It is possible.
  • a quinula protein consisting of the extracellular region of the protein of the present invention and the Fc region of an antibody (for example, human IgG [antibody]) and purified using a protein A column or the like. Since such an antibody-like chimeric protein has ligand binding activity, it can be appropriately labeled with a radioisotope or the like and then used for ligand screening (Suda, T. et al., Cell, 175, 1169-1178 (1993)).
  • cytokines such as one molecule of the TNF family
  • the reaction of various cells with the antibody-like chimeric protein and the cells that have exhibited binding activity It may be possible to isolate the ligand.
  • the ligand can be similarly isolated using cells into which the cDNA library has been introduced.
  • the antibody-like chimeric protein can be used as an agonist.
  • an agonist against the protein and examples of the method for isolating the angiotensin and angiogonist include a method of allowing a compound, a natural product bank, or a random phage peptide display library to act on the immobilized protein of the present invention, and screening for binding molecules.
  • a screening method using high throughput by combinatorial chemistry technology (Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ.
  • the thus isolated ligand, agonist, and antagonist are candidates for a drug for promoting or inhibiting the activity of the protein of the present invention, and diseases involving the protein of the present invention (for example, immune system). (Related diseases).
  • the compound isolated by the screening method of the present invention can be used as a pharmaceutical preparation by a known pharmaceutical production method.
  • it is administered to a patient together with a pharmacologically acceptable carrier or vehicle (saline, vegetable oil, suspension, surfactant, stabilizer, etc.).
  • Administration will be transdermal, intranasal, transbronchial, intramuscular, intravenous, or oral, depending on the nature of the compound.
  • the dosage varies depending on the patient's age, body weight, symptoms, administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage.
  • the dose of the compound having the binding activity to the protein of the present invention varies depending on the symptom.
  • the dose of the compound having the binding activity to the protein of the present invention varies depending on the symptom.
  • the dose of the compound having the binding activity to the protein of the present invention varies depending on the symptom.
  • for an adult assuming a body weight of 60 kg
  • about 0.1 to 100 mg per day Preferably it is about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 m.
  • the single dose depends on the subject, target organ, symptoms, Depending on the method of administration, for example, in the form of an injection, for an adult (assuming a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day is injected intravenously. Conveniently for administration. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the cloned Deltal cDNA.
  • the numbers on the far right indicate nucleotide positions.
  • Bold underlines indicate putative signal sequences and transmembrane regions.
  • Thin underlines indicate Box 1 and Box 2 areas. The enclosed area is a WSXWS box-like array.
  • FIG. 2 shows the identities and similarities between Deltal and other known cytokine receptors.
  • FIG. 3 is a photograph showing the expression of Deltal in mouse tissues. MA molecular weight Shows the maximum mobility in kilobases.
  • FIG. 4 is a photograph showing Northern plot hybridization of a mouse multi-tissue plot. The mobility of the RNA molecular weight marker is shown in kilobase.
  • FIG. 5 is a diagram showing the structure of a chimeric receptor. The wild-type Deal and EP0R are shown schematically with the textured EP0-DeltalR, hEDER, and hMPL-DeltalR. The fused domains are indicated by restriction sites generated within the homologous cDNA.
  • FIG. 6 is a diagram showing factor reactivity of FDC-P1 transfectants. The time course of proliferation of FDC-P1 cells transduced by retroviruses with various receptor constructs was shown.
  • FIG. 5 is a photograph showing activation of JAK2 kinase through chimeric EDER ectopically expressed in FDC-P1 cells.
  • FIG. 8 is a photograph showing immunoprecipitation of tagged Real expressed on Ba / F3 cells. The position of the Delta Flag (point of the arrow) and the molecular weight are shown.
  • FIG. 9 shows a map of Deltal in the central region of mouse chromosome 5. Deltal was located on mouse chromosome 5 by interspecific backcross analysis. The pattern of separation of Deltal and adjacent genes in 106 backcross animals typed for all loci is shown at the top of the figure. Each column represents a chromosome identified in the backcross progeny inherited from the (C57BL / 6JXM. Spretus) F1 parent. The shaded box indicates the presence of the C57BL / 6J allele, and the white box indicates the presence of the M.
  • OVA-23-3 T cell receptor specific for amino acids 323-339 of mouse ovalbumin (OVA) Yuichi's transgenic mouse, OVA-23-3, has already been established (Sato et al., 1994, Eur. J. Immunol., vol.24, p.1512). Spleen cells of OVA-23-3 mice should be cultured in the presence of OV A323-339 peptide, antigen presenting cells, Inuichi Leukin 2, Inuichi Leukin 12, and anti-inu Leukin 4 monoclonal antibody.
  • polyA (+) RNA was prepared from lymphocytes differentiated into TM type and Th2 type by the method of Ohta et al. Using Fast Track (Invitrogen). Double-stranded cDNA was synthesized using a random hexamer of the Superscript Choice System (GIBC0 BRL). After blunt-ending the cDNA, BstXI adapter 1 (Invitrogen) was added, and a cDNA of 400 bp or more was fractionated using a SizeSep 400 Spun Column (Pharmacia). Separately BstXI (Takara Shuzo) and BAP treated pMX GM (-) V- (see Japanese Patent Application No.
  • Hei 9-324912 mpl M 2 and linked by ligated with T4 DNA ligase after mixed-. This was introduced into E. coli DH10B (GIBCO BRL) by electroporation using Gene Pulser (Bio Rad) to construct a cDNA library.
  • Plasmids extracted from the recombinant E. coli were purified using a JETstar column (GEN0M ED). Plasmid cDNA library was transfected into packaging cell B0SC23 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90: 8392-8396, brief) using LipofectAMINE (LIFE TECHNOLOGIES).
  • B0SC23 10% Inoculated in 6 cm dish (Corning) with Dulbecco's Modified Eagel Medium (D MEM, tIFE TECHNOLOGIES) containing fetal serum (FCS, JRH BIOSCIENCES), washed 16 hours later, washed with DMEM, and diluted with 200 1 DMEM first 18 1 LipofectAMINE and 3 g of plasmid diluted with 200 H DMEM were mixed and left at room temperature for 15 minutes, and 1.6 ml of DMEM was mixed and added to the cells. Five hours later, 2 ml of DMEM containing 20% FCS was added, and the cells were cultured for 19 hours.
  • D MEM Dulbecco's Modified Eagel Medium
  • FCS fetal serum
  • FCS JRH BIOSCIENCES
  • IL-3 mouse interleukin-3
  • lO jug / ml hexadiraethrine bromide were added, and Ba / F3 cells were suspended and infected. Twenty-four hours after the infection, the cells were washed three times with a phosphate buffer, and cultured with RPMI1640 containing 10% FCS.
  • Chromosomal DNA was extracted from the clones grown in the absence of IL-3, and primers (5, -gggggtggaccatcctcta-3so sequence numbers: 5, and 5, -cgcgcagctgtaaacggtag-3, / SEQ ID NO: 6) was used to perform PCR to recover a cDNA fragment.
  • PCR was performed on a reaction solution containing 500 ng chromosomal DNA, 500 pM each primer, 2.5 units of TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo), 2.5 mM MgCl 2 , 0.3 mM dNTPs, and buffer attached to the enzyme under the following conditions using the GeneAmpPCR System 2400. .
  • a Th2-type lymphocyte cDNA library was synthesized with an oligo dT primer, and the above cDNA fragment was screened with a probe.
  • double-stranded cDNA was synthesized from Th2-type lymphocyte polyA (+) RNA using the oligo dT primer of the Superscript Choice System (GIBC0 BRL).
  • Bs after cDNA blunting A tXI adapter (Invitrogen) was added, and a cDNA of 400 bp or more was fractionated using a SizeSep 400 Spun Column (Pharmacia).
  • 0.1 ⁇ g of the DNA fragment previously obtained by the SST method was converted into type ⁇ into its internal primer (50 pmoles) (22115; 5, -ggtgatgtcacagtcgtctgccatg-3, / SEQ ID NO: 7, and 22113; 5, -acggtccgcaggagtagcagtaa- 3, / SEQ ID NO: 8), 2.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dATP, dGTP, dCTP, O.
  • Plasmid was extracted from the obtained colony, and the recA reaction was repeated again to select a recombinant on a medium containing ampicillin. Colony PCR was performed using 221L5 and 221L3 under the same conditions. Plasmid was extracted from a positive colony having a band of about 400 bases, and the base sequence of the inserted cDNA was determined.
  • the other (referred to as “215S”) consists of 804 bases (SEQ ID NO: 3) and has an open reading frame (positions 98 to 661) encoding 188 amino acid residues (SEQ ID NO: 4). . Up to 175 amino acids below the signal sequence are completely homologous to 215 L, but lack the site corresponding to the transmembrane domain and below, suggesting that it is a soluble form commonly found in various cytokine receptors.
  • a mouse multi-tissue northern plot (Clontech's Laboratories) was probed with a 407 bp DEL-1 specific PCR fragment prepared using the primer set described above. Plot in 50% formamide, 5 x SS 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 6 x Denhardt's reagent, and 100 / g / ml salmon sperm DNA was hybridized overnight at 42 ° C. with a P-labeled random priming probe, washed at 55 ° C. in 0, lx SSt, 0.1% SDS and then exposed to X-ray film.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • RNA samples (3 ⁇ g) prepared from various mouse cell lines using the Fast Track 2.0 Kit (Invitrogen) were electrophoresed on a 1% agarose formamide gel. Separated and transferred to Hybond N + (Amersham) Nylon Fill Yuichi. Hybridization was carried out using the above-mentioned probe, followed by washing.
  • the present inventors first overexpressed Deltal in Ba / F3 cells that proliferated or survived in response to IL-3 or IL-4, respectively. However, Ba / F3 response to these cytokines did not increase when Deal was overexpressed.
  • these cytokines do not induce tyrosine phosphorylation of Delta Flag in Ba / F3 cells overexpressing Deltal, which indicates that Deltal is not involved in IL-3 and IL-4 signaling (Data not shown).
  • cytoplasmic domain of Deltal A chimeric receptor between Deltal and hE POR or hMPL was constructed to investigate the effect of homodimer formation of the cytoplasmic domain of Deltal.
  • Deltal membrane proximal region including box 1
  • EDER chimeras were generated by replacing the membrane proximal region of hEPOR with the membrane proximal region of Deltal.
  • chimeric receptors were constructed as follows. To express wild-type hEPO, full-length hEPOR (Noguchi CT. Et al., Blood 78: 2548 (1991)) was cloned into the EcoRI and NotI sites of the pMX-puro retroviral vector (Onishi M. et al., Mol. Cell. Biol. 18: 3871 (1998)). When constructing the chimeric receptors hEPOR-DeltalR and hMPL-DeltalR, an EcoRI site was inserted between the extracellular and transmembrane domains of each cDNA.
  • cytoplasmic domain of Deltal cDNA obtained by PCR using the high-precision DNA polymerase Pyrobest (Yukara) was cloned into pMX-puro at the 5, -EcoRI and 3, -Notl sites,
  • the EcoRI fragment containing the extracellular domain of hEPOR or hMPL was cloned into the 5'-EcoRI site (FIG. 5).
  • the primers were: 5,1-aaaagaattcccgcccctcctgcccctgggc-3, / 3 ⁇ 43 ⁇ J3 ⁇ 4 ⁇ : 9 and 5,1-gctggc ggccgcacctgcaggcgc-3, / SEQ ID NO: 10 Using.
  • 5 -aaagaattcgggggctgtatcatggac-3 '/ sequence number: 11 and 5, -aaagaa cggggtccaggtcgctagg-3, / sequence number: 12 were used as primers.
  • an Hpal site was inserted between the extracellular domain and the transmembrane domain, and an Xhol site was inserted downstream of the tributophan residue conserved in the cytoplasmic domain of hEPOR ( Figure 5).
  • the Box 1 region of the Deltal cDNA was cloned into the EcoRI and NotI sites of pMX-puro.
  • the cytoplasmic domain of hEPOR was then cloned into EcoRI and NotI sites and Was cloned into EcoRI and Hpal sites.
  • the primers were: ⁇ 5, -aaactcgagctgtaccagaatgatggc-3 '/ rooster [J number: 17 and 5, -aaagcggccgc tcacttgtcagagcaagccacatagct -3 ', 5, -aaagcggccgctcagtcatcagagcaagccacata get-3, ⁇ 5, -aaagcggccgctcagtccttagagcaagccacatagct-3' ⁇ and 5, -aaagcgg ccgctcagtaatcagagcaagccacatagct-3, / SEQ ID NOS: 18 to 21 were used.
  • the resulting expression plasmid was introduced into FDC-PI by retroviral infection as described (Kitamura T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9146 (1995)). Infected cell lines were selected in the presence of 1 ⁇ g / ml pure mouth mycin (Sigma) to obtain stable transfectants.
  • FDC-P1 cells expressing parental FDC-P1 and hEP0R, hEPOR-DeltalR, E thigh, and hMPL-DetaltalR were lng / ml mIL-3, 2U / ml hEPO, 2U / ml hEPO ⁇ 2U / ml hEPO , And 100 ng / ml hTPO, and the cells were counted at the indicated times.
  • FDC-P1 cells expressing EDER grew efficiently in response to hEPO (Fig. 6), while expressing the chimeric receptors hEPO-DeltalR or hMPL-DeltalR. FDC-P1 cells did not transmit proliferative signals in response to EP0 or TP0, respectively.
  • Phosphorylation of JAK kinase by EDE chimeric receptor Whether or not the chimeric receptor EDER mediates hEPO-dependent activation of JAK kinase was determined by immunoprecipitation with an antibody against JAK2, and an antibody against phosphotyrosine (monoclonal). Attachment was performed by Western blotting using antibody 4G10). After stripping, analysis was performed again using an anti-JAK antibody. A similar analysis was performed using anti-JAK1, anti-JAK3 and anti-Tyk-2 antibodies.
  • Immunoprecipitation and Western blotting were performed as follows. Cell lysis buffer and dissolved in (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl , 1% tri-ton X- 10 0, l mM EDTA, 0.2 mM Na 3 V0 4, 2 mM PMSF) therein. Lysates were cleaned of debris by centrifugation at 12,000 xg for 40 minutes, and the supernatant was incubated with the antibody for 2 hours at 4 ° C.
  • the immune complexes are precipitated with Protein A Sepharose (Pharmacia), washed with lysis buffer, and the proteins are buffered for SDS-PAGE using the same buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% It was eluted with glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.02% promophenol.
  • the eluted protein was electrophoresed on an 8-16% gradient gel (Gradiva, Northride, Australia).
  • the membrane was examined using antibody or streptavidin / horseradish / peroxidase (HRP0) (Vector Laboratories) as a probe, and visualized using an enhanced chemiluminescence detection system (Amersham) according to the manufacturer's manual.
  • a DeUaut Flag was designed by fusing a Flag sequence (DYKDDDDK / SEQ ID NO: 24) with the C-terminus of Deltal.
  • the Delta-Flag PCR fragment was cloned into the pMX-puro retrovirus vector at the 5, -EcoRI and 3, -NotI sites.
  • the constructed vector was introduced into Ba / F3 cells by retroviral infection.
  • Ba / F3 cells and parental cells transduced with the evening-eared Deal are surface labeled with sulfo-NHS-LC biotin, cell lysates are precipitated with anti-Flag antibody, and then blocked with streptavidin-HRPO. Ting was performed (Fig. 8).
  • the expressed Deltal protein had a molecular weight of 50 kDa, which was greater than the calculated molecular weight of 37791 daltons. This difference is probably due to the sugar moiety binding to some of the two putative N-linked glycosylation sites found in the extracellular domain of Deal.
  • Pro part is 407 bp fragment of mouse cDNA, using a random priming labeling kit (Stratagene), Non 32 P] labeled by dCTP; washing final stringency diene Sea 1.0 x SSCP, 0.1 % SDS, performed at 65 ° C.
  • C57BL / 6J and M. spretus DNA are digested with several enzymes to obtain informative restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) using the mouse cDNA Deltal probe. Analysis by Southern plot hybridization was performed. 8.7 kb or 11.0 kb Seal fragments were detected in C57BL / 6J DNA or M. spretus DNA, respectively. The presence or absence of the 11.0 kb Sea I M. spread-specific fragment was followed in backcrossed mice.
  • the recombination frequency [the standard error of the distance of the gene expressed in centiMorgans (cM)] was as follows: “Central Meir-Fgf5—2.7 ⁇ 1.3— [Dmpl ⁇ Deltal, Gfil ] —2.8 ⁇ 1.4—Crybb2 ”. In 136 commonly typed mice, no recombination was detected between Dmpl and Deltal, or mouse 154 ⁇ between Deal and Gfil, indicating that the two loci in each pair were This suggests that they lie within the range of 2.2 and 1.9 cM, respectively (95% CI upper limit). Industrial applicability
  • novel cytokine receptor-like proteins which are considered to belong to the cytokine receptor superamylie and their genes are provided.
  • a large number of molecules with different functions have been identified in the cytokine family superfamily, and it is known that all of them play an important role mainly in the immune system in vivo. Therefore, the protein or gene of the present invention can be used as a useful tool for purification and cloning of new factors involved in the immunological differentiation function, and also for screening of drug candidate compounds.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

明細書 新規サイ トカイン受容体様タンパク質 技術分野
本発明は血球系細胞で発現する新規なサイ トカイン受容体様タンパク質、 該夕 ンパク質をコードする DNA、 該 DNAを含むベクタ一、 該ベクターを保持する宿主 細胞、 該タンパク質に対する抗体、 該タンパク質を利用した化合物のスクリー二 ング方法、 並びに該スクリーニング方法により単離しうる化合物に関する。 背景技術
免疫系、 造血系の細胞は、 サイ トカインと呼ばれる一群の液性因子により、 そ の増殖や活性が調節されていることが知られている。 これまでに数多くのサイ ト 力インが同定され、 それらの解析が進んだ結果、 多くのサイ ト力インは広範な生 理活性を有しており、 1つのサイ ト力インが多様な細胞に作用し、 細胞によりさ まざまな作用を示すことが明らかとなってきている。 これらのサイ トカインによ り、 造血細胞やリンパ系細胞、 内皮細胞などの細胞間で情報伝達のネットワーク が形成されており、 これらの細胞の分化や増殖、 活性化が制御されていると考え られている （小津真理子ら， 1992， サイ トカイン療法， 南江堂， PP2-14) 。 サ イト力インは、 特に医療分野における臨床応用が期待されており、 癌、 感染症、 自己免疫疾患、 血栓症を含む種々の疾患に対する治療への応用が試みられている o
近年、 多くのサイ トカイン受容体が単離されており、 それらの構造上の特徴か ら、 いくつかのグループに分類されている。 例えば I型サイ トカイン受容体フ アミリーには、 IL- 2;S 受容体を含む多くのイン夕一ロイキン受容体やコロニー 刺激因子受容体、 エリスロポエチン受容体などが含まれ、 へモポェチン受容体ス —パーフアミリーとも呼ばれる。 I型サイ トカイン受容体フアミリーは構造的に 共通する特徴を有し、 細胞膜直上にトリブトフアン—セリン一 X—トリブトファ ン一セリン残基からなる WSボックス、 通常それより先端に位置する 4つのシス ティン残基、 フイブロネクチン I I I型類似構造を有する。 また、 細胞内領域の 膜の近くに boxl、 その C末側に box2と呼ばれる比較的相同性の高い部分がある 。 これらの領域は、 細胞内情報伝達にとって必須な領域と考えられている。 その ほかのサイ トカイン受容体フアミリ一としては、 イン夕一フエロン / 受容 体等が含まれる I I型サイ トカイン受容体フアミリーや、 TNF受容体/ NGF受容体 フアミリーなど、 複数のフアミリーが知られている （Miyajima, A. et al.， An n. Rev. Immunol . ( 1992) 10， 295-331)。
このように多数のサイ トカイン受容体が同定されているものの、 サイ トカイン の情報伝達には未知の部分も多く、 血球系細胞の複雑な情報ネットワークに関与 している未知の情報伝達分子が、 まだ複数存在しているものと思われる。 従って 、 リンパ球系細胞や造血系細胞で発現する新たなサイ トカイン受容体を同定する ことは、 このようなサイ ト力インのシグナル伝達の解明に留まらず、 サイ トカイ ンが関与する種々の疾患に対する治療や予防の手段を開発する上でも極めて重要 である。 発明の開示
本発明は、 血球系細胞で発現する新規なサイ トカイン受容体様タンパク質およ びその遺伝子を提供することを課題とする。 また、 本発明は、 該遺伝子が挿入さ れたべクタ一、 該ベクターを保持する宿主細胞、 該タンパク質に結合する抗体を 提供することを課題とする。 さらに、 本発明は、 該タンパク質を利用した、 リガ ンドなどの該タンパク質に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する ことを課題とする。
本発明者らは、 免疫 ·分化機能に関与する新たな因子若しくはその受容体のク ローン化を目指し、 独自に開発したシグナルシーケンストラップ （signal sequ ence trap; SST)法 （特願平 9- 324912号） を利用して、 分化誘導を行ったリン パ球由来のポリ A RNAを材料に、 分泌 '膜タンパク質をコードする cDNAのスク リーニングを行った。 その結果、 本発明者らは、 I型サイ ト力イン受容体スーパ 一ファミリ一 （Miyajima, A. et al .， Ann. Rev. Immunol . ( 1992) 10, 295-33 1) に属する受容体と相同性を有する新規な受容体様タンパク質をコードする遺 伝子を単離することに成功した。 この遺伝子は、 マウス組織の心臓、 肺、 肝臓、 脾臓で発現していた他、 Ba/F3、 DA- 1、 CTLL2等の骨髄系 ' リンパ球系細胞株で も発現が見られた。 また、 該遺伝子がコードする蛋白質の膜近位領域は増殖シグ ナルの伝達および JAK2の活性化においてヒト EP0Rの膜近位領域の代わりとな ることができた。
サイ トカイン受容体スーパ一ファミリ一はこれまで多数の、 それぞれ機能の異 なる分子が同定されており、 いずれも生体で免疫系を中心として重要な役割を果 たしていることが知られている。 本発明の受容体様タンパク質は細胞内にシグナ ルを伝える boxl ' box2領域と推測できる領域を持っており、 遺伝子発現の組織 •細胞特異性やその構造上の特徴から、 該タンパク質が細胞における細胞外から 細胞内へのシグナル伝達分子として、 特に免疫系で機能することが示唆される。 従って該タンパク質は、 免疫 ·分化機能に関与する因子の精製やクローニング、 さらには免疫機能関連疾患の医薬品候補化合物のスクリーニングのためのツール として有用である。
本発明は血球系細胞で発現する新規な受容体様タンパク質およびその遺伝子並 びにそれらの製造および用途に関し、 より具体的には、
1 . 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA、
( a ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード する DNA
(b ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコ一ド領域を含む DM (c) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなり、 配 列番号： 2または 4に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な タンパク質をコ一ドする DNA
(d) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAとハイブリダィズ する DNAであって、 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタン パク質と機能的に同等なタンパク質をコ一ドする DNA
2. ( 1) に記載の DNAが挿入されたべクタ一、
3. (2) に記載のベクターを保持する宿主細胞、
4. ( 1) に記載の DNAがコードするタンパク質、
5. (3) に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から発 現させたタンパク質を回収する工程を含む、 （4) に記載のタンパク質の製造方 法、
6. (4) に記載のタンパク質に結合する抗体、
7. (4) に記載のタンパク質の部分ペプチド、
8. 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖 とハイブリダィズし、 少なくとも 15塩基の鎖長を有するヌクレオチド、
9. (4) に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物のスクリーニン グ方法であって、
(a) (4) に記載のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させ る工程、
(b) (4) に記載のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有す る化合物を選択する工程、 を含む方法、
10. (9) に記載の方法により単離されうる、 （4) に記載のタンパク質に 結合する化合物、
1 1. 天然由来である、 （ 10) に記載の化合物、 1 2 . リガンド、 ァゴニスト、 またはアン夕ゴニストである、 （ 1 0 ) に記載 の化合物、 を提供するものである。
なお、 本発明において、 「リガンド」 とは、 細胞膜に発現する本発明のタンパ ク質に結合することにより、 その機能を活性化するタンパク質を指す。
また、 本発明において 「ァゴ二スト」 とは、 本発明のタンパク質とリガンドと の結合と同様の現象 （本発明のタンパク質の活性化） を引き起こすことができる 、 本発明のタンパク質に特異的に結合できる分子を指す。
また、 「アン夕ゴニスト」 とは、 本発明のタンパク質に特異的に結合すること によってその機能を抑制する分子を指す。
本発明は、 血球系細胞で発現する新規なサイ トカイン受容体様タンパク質を提 供する。 本発明者らにより単離された 2つのマウス由来の cDNAの塩基配列をそ れぞれ配列番号： 1および 3に、 該 cDNAによりコードされるタンパク質のアミ ノ酸配列をそれぞれ配列番号： 2および 4に示す （図 1参照） 。 これらのタンパ ク質は、 I型サイ トカイン受容体スーパ一ファミリ一に属する既知のタンパク質 と相同性を有しており、 その N末端にシグナル配列を持ち、 配列番号： 2に記 載のタンパク質は中間部に膜貫通領域と予想される疎水性に富んだアミノ酸領域 を有する （図 2参照） 。 また、 データーベース上においては有意な相同性を示す アミノ酸配列を有するタンパク質は見出されなかった。 従って、 本発明者らによ り見出されたタンパク質は、 I型サイ トカイン受容体スーパーフアミリーに属す る新規なタンパク質であると考えられる。 また、 該タンパク質の膜近位領域は増 殖シグナルの伝達および JAK2の活性化においてヒト EP0Rの膜近位領域の代わ りとなることから、 該タンパク質が、 異種受容体との複合体形成により、 JAK2 の活性化を通じたシグナル伝達に関与していることが示唆される。
該タンパク質をコ一ドする遺伝子は、 リンパ球からクロ一ニングされたことに 加え、 ノーザンブロット解析の結果、 心臓、 肺、 肝臓、 脾臓に発現が見られ、 B a/F3、 DA- 1、 CTLL2等の骨髄系 · リンパ球系細胞株でも発現が見られた。 従って 、 この受容体様タンパク質は、 免疫や造血において調節的役割を果たしているこ とが考えられ、 免疫系の機能に関連する因子の精製やクロ一ニング、 さらには免 疫系関連疾患の治療薬候補化合物のスクリ一ニングなどのための有用なツールと して利用しうる。 また、 各種感染症 · 自己免疫疾患 ·腫瘍免疫における遺伝子治 療などの治療に利用し得る。
本発明は、 また、 配列番号： 2または 4に記載のタンパク質と機能的に同等な タンパク質を包含する。
本発明において 「機能的に同等」 とは、 対象となるタンパク質が受容体タンパ ク質として機能することを指す。 配列番号： 2に記載のタンパク質と機能的に同 等なタンパク質は、 好ましくは I型サイ トカイン受容体としての特徴を有する 。 このような特徴としては、 例えば boxlや box2領域が挙げられる。 boxlとは 、 サイ ト力イン受容体の膜近傍の細胞内領域に存在し、 プロリンを多く含有する 8アミノ酸からなる領域であり、 box2は、 C末端よりに存在し、 LEVL配列を含 む 10アミノ酸からなる領域である。 共に細胞内情報伝達に重要であると考えら れているが、 特に、 boxlは、 Jak (ャヌスキナーゼ） とサイ トカイン受容体との 相互作用に重要と考えられる (Ning Jiang, J. Biol . Chem. , 271, 16472-1647 6 ( 1996 )) 。 また、 配列番号： 4に記載のタンパク質と機能的に同等なタンパ ク質は、 好ましくは可溶型サイ トカイン受容体としての特徴を有する。 可溶性サ イ ト力イン受容体とは、 細胞外領域のみからなるタンパク質であり、 リガンドと の結合活性を有する限り細胞外領域全体であっても、 細胞外領域の一部であって もよい。 可溶性サイ ト力イン受容体は、 その情報伝達経路により、 リガンドの阻 害剤にも促進剤にもなり得る (Smith, D.H. , Science, 238, 1704-1707 ( 1987) ； Novick, D.， Cytokine, 4, 6-11 ( 1992)) 。
機能的に同等なタンパク質を単離するための、 当業者によく知られた方法とし ては、 タンパク質に変異を導入する方法が知られている。 例えば、 当業者であれ ば、 部位特異的変異誘発法 (Hashimoto- Gotoh, T， Mizuno, T， Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. ( 1995 ) An ol igodeoxyr ibonuc leot ide-directed dual ambe r method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271 - 275、 Zoller, MJ, and Smith, M. ( 1983) Oligonucleotide - directed mutagenesis of DNA fragm ents cloned into M13 vectors. Methods Enzymol . 100, 468-500、 Kramer, , DrutsaJ, Jansen具 Kramer, B, Pf lugfelder,M, and Fritz, HJ( 1984) The gapped duplex DNA approach to ol igonucleotide - directed mutation constr uction. Nucleic Acids Res. 12, 944卜 9456、 Kramer W, and Fritz HJ( 1987)
Oligonucleotide - directed construction of mutations via gapped du lex DNA Methods. Enzymol . 154, 350-367、 Kunkel , TA( 1985 ) Rapid and efficien t site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Aca d Sci U S A. 82, 488-492) などを用いて、 配列番号： 2または 4のアミノ酸 配列に適宜変異を導入することにより配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配 列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。 ま た、 アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。 このように、 配列番号： 2ま たは 4に記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したァ ミノ酸配列を有し、 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパ ク質と機能的に同等な夕ンパク質もまた本発明の夕ンパク質に含まれる。 このよ うな変異体における、 変異するアミノ酸数は、 通常、 30アミノ酸以内であり、 好ましくは、 15アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内であり 、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内であると考えられる。
また、 変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されてい る別のアミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばァミノ酸側鎖の性質として は、 疎水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I 、 P) 、 水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ) 、 硫黄原子含有側鎖を有 するアミノ酸 （C、 M) 、 カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩基含有側鎖を有するアミノ離 、 K、 Η) 、 芳香族含有側鎖を有 するアミノ酸 （H、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもァミノ 酸の一文字標記を表す） 。
配列番号： 2または 4に記載のタンパク質に 1又は複数個のアミノ酸残基が付 加された蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 2または 4に記載のタンパク質を 含む融合蛋白質が挙げられる。 融合蛋白質は、 配列番号： 2または 4に記載の夕 ンパク質またはその部分べプチドと他のぺプチド又は蛋白質とが融合したもので あり、 本発明に含まれる。 融合する他のペプチドとしては、 タンパク質の精製や 検出を容易にするためなどの目的で用いられるタグや他のサイ トカイン受容体ま たはその部分ペプチド （図 5参照） が挙げられる。 融合蛋白質を作製する方法は 、 例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNAと他のペプチド又は蛋白質を コードする DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導 入し、 宿主で発現させればよく、 当業者に公知の手法を用いることができる。 本 発明の蛋白質との融合に付される他のぺプチド又は蛋白質としては、 特に限定さ れない。
また、 機能的に同等なタンパク質を単離する当業者によく知られた他の方法と しては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 （Sambrook,J et al .， Molecular Clonin g 2nd ed.， 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) を利用した方 法が挙げられる。 即ち、 当業者であれば、 配列番号： 2または 4に記載のタンパ ク質をコードする DNA配列 （それぞれ配列番号： 1または 3 ) もしくはその一 部を基に、 これと相同性の高い DNAを単離して、 該 MAから配列番号： 2また は 4に記載のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することも通常行い うることである。 このように、 配列番号： 2または 4に記載のタンパク質をコー ドする DNA配列もしくはその一部からなる DNAとハイブリダイズする DNAがコ ードするタンパク質であって、 配列番号： 2または 4に記載のタンパク質と機能 的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。 このようなタンパ ク質としては、 例えば、 マウス以外の哺乳動物のホモログ （例えば、 ヒト遺伝子 がコードするタンパク質） が挙げられる。
機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを単離するためのハイブリダィ ゼ一シヨンは、 例えば、 ストリンジエンシーが、 10%ホルムアミ ド、 5xSSPE、 1 Xデンノヽルト溶液、 lxサケ精子 DNAの条件で行うことができる。 より好ましい 条件 （よりストリンジェン卜な条件） としては、 25%ホルムアミ ド、 5xSSPE、 1 Xデンノヽルト溶液、 lxサケ精子 DNAの条件であり、 さらに好ましい条件 （さら にストリンジェントな条件） としては、 50%ホルムアミ ド、 5xSSPE、 lxデンハ ルト溶液、 lxサケ精子 DNAの条件である。 但し、 ハイプリダイゼーションのス トリンジヱンシ一に影響する要素としては上記ホルムアミ ド濃度以外にも複数考 えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェン シ一を実現することが可能である。 また、 ハイブリダィゼ一シヨンにかえて、 夕 ンパク質をコードする DNA (配列番号： 1または 3 ) の一部をプライマーに用い る遺伝子増幅法、 例えば、 PCR法を利用して単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術により単離される D NAがコードする配列番号： 2または 4に記載のタンパク質と機能的に同等な夕 ンパク質は、 通常、 配列番号： 2または 4に記載のタンパク質とアミノ酸配列に おいて高い相同性を有する。 高い相同性とは、 通常、 70%以上の相同性、 好ま しくは 80%以上の相同性、 さらに好ましくは 95%以上の相同性である。 蛋白質 の相同性を決定するには、 文献 （Wi lbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc . Nat 1. Acad. Sci . USA ( 1983 ) 80, 726-730) に記載のアルゴリズムにしたがえば よい。
本発明のタンパク質は、 当業者に公知の方法により、 組み換えタンパク質とし て、 また天然のタンパク質として調製することが可能である。 組み換え夕ンパク 質であれば、 例えば、 膜結合型と予想されるタンパク質であれば、 該タンパク質 の膜結合に必要な領域以外の部分を細胞外に分泌させる。 次いで、 この細胞の培 養上清を回収し、 濃縮した後、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマトグラ フィ二、 あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したァフィ二 ティ一クロマトグラフィーにかけることにより、 または、 さらにこれらのカラム を複数組み合わせることにより精製することが可能である。 また、 本発明のタン パク質をグル夕チオン s トランスフェラ一ゼタンパク質との融合タンパク質と して、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞 (例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させ、 発現させた組み換えタンパク 質をグル夕チオンカラム、 あるいはニッケルカラムにより精製する。 その後、 必 要に応じて融合夕ンパク質のうち目的のタンパク質以外の領域を、 トロンビンま たはファクタ一 Xaなどにより切断し、 除去する方法により調製できる。 天然の タンパク質であれば、 例えば、 本発明のタンパク質を発現している細胞の抽出物 に対し、 後述する本発明の抗体が結合したァフィ二ティーカラムを作用させて精 製することにより単離することができる。
本発明は、 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。 本発明の部分べ プチドは、 少なくとも 8アミノ酸以上、 好ましくは 15アミノ酸以上、 さらに好 ましくは 50アミノ酸以上 （例えば、 70アミノ酸、 100アミノ酸、 または 130ァ ミノ酸以上） のアミノ酸配列からなる。 該部分ペプチドは、 例えば、 本発明の蛋 白質に対する抗体の作製、 本発明のタンパク質に結合するリガンドなどの化合物 のスクリーニングゃ、 本発明のタンパク質の競合阻害剤の調製などに利用し得る 。 本発明の部分ペプチドとしては、 例えば、 本発明のタンパク質からシグナルべ プチドが除去された形態のタンパク質や細胞内の領域を除去した形態のタンパク 質が含まれる。 また、 例えば、 リガンドとの結合能を有するが細胞内へのシグナ ル伝達を行う能力のない部分べプチド （本発明のタンパク質の競合阻害剤として 機能する） が含まれる。 本発明の部分ペプチドは、 遺伝子工学的手法、 公知のぺ プチド合成法、 あるいは本発明の蛋白質を適切なぺプチダ一ゼで切断することに よって製造することができる。 また、 本発明は、 本発明のタンパク質をコードする DNAを提供する。 本発明 の DNAは、 本発明のタンパク質をコードしうるものであれば、 いかなる形態で もよい。 即ち、 mRNAから合成された cDNAであるか、 ゲノム DNAであるか、 化学 合成 MAであるかなどを問わない。 また、 本発明のタンパク質をコードしうる 限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有する DNAが含まれる。
本発明の DNAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば 、 本発明のタンパク質を発現している細胞より cDNAライブラリ一を作製し、 本 発明の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1または 3に記載の DNA配列） の一部 をプローブにしてハイブリダイゼ一シヨンを行うことにより調製できる。 また、 本発明のタンパク質を発現している細胞より RNAを調製し、 本発明の DNAの配 列 （例えば、 配列番号： 1または 3に記載の DNA配列） に基づいてオリゴ DNA を合成し、 これをプライマーとして用いて PCR反応を行い、 本発明のタンパク 質をコードする cDNAを増幅させることにより調製することも可能である。
本発明の DNAは、 本発明の夕ンパク質を組み換えタンパク質として生産する ために利用することができる。 また、 本発明のタンパク質をコードする MAに 欠陥がある場合には、 アンチセンスによる機能阻害や、 正常な遺伝子に置き換え る遺伝子治療などへの応用も考えられる。
また、 本発明は、 本発明の DNAが挿入されたべクタ一を提供する。 本発明の ベクタ一としては、 宿主細胞内において本発明の MAの発現させうるものであ れば特に制限はない。 例えば、 宿主を大腸菌とする場合には、 ベクタ一を大腸菌 (例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB10K XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製す るために、 大腸菌で増幅されるための 「ori」 をもち、 さらに形質転換された大 腸菌の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン 、 カナマイシン、 クロラムフエ二コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝 子） を有すれば特に制限はない。 例えば、 M13系べクタ一、 pUC系べクタ一、 pB R322, pBluescript, pCR- Scriptなどが挙げられる。 また cDNAのサブクロ一二 ング、 切り出しを目的とした場合も上記ベクターの他に、 pGEM- T、 pDIRECTs pT 7などがあげられる。 本発明のタンパク質を生産する目的においてべクタ一を使 用する場合には、 特に、 発現ベクターが有用である。 発現べク夕一としては、 例 えば、 大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクタ一が大腸菌で増幅されるよう な上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5ひ、 HB10K XLlBlueなどの大腸菌 とした場合においては、 大腸菌で効率よく発現できるようなプロモー夕一 （例え ば、 lac，T7など） を持っていることが不可欠である。 このようなベクターとし ては、 上記べクタ一の他に pGEX、 pEGFP、 または pET (この場合、 宿主は T7 MA ポリメラ一ゼを発現している BL21が好ましい）などが挙げられる。
また、 CH0細胞、 COS細胞 、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした 場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモー夕一 （SV40,MMLV- LTR, EF1 ひ， CMVプロモーターなど） を持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転 換を選抜するための遺伝子 （例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により 判別できるような薬剤耐性遺伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性 を有するベクターとしては、 例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV, pBK- CMV、 pOPRSV 、 p0P13などが挙げられる。
さらに、 細胞内でのコピー数の増幅を目的とした宿主べクタ一系においては、 安定産生細胞株の場合は、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する D HFR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を用いメ ト トレキセ一ト （ MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また一過性の発現を目的とする場合に は、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複 製機転を持つベクタ一 （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNA を適当なベクターに組み込みレトロウイルス法、 リボソーム法、 カチォニックリ ポソーム法、 アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられ る。 用いられるベクターに特に制限はないが、 pAdexlcwや pZIPneoなどが挙げ られる。 ベクターへの本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法 に従 " Τ行うことが可能である (Molecular Cloning , 5.61-5.63) 。
また、 本発明は、 本発明のベクタ一が導入された宿主細胞を提供する。 本発明 のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や種 々の動物細胞などを用いることが可能である。 大腸菌では、 例えば、 JM109、 DH 5ひ、 HB101 等が挙げられ、 動物細胞においては、 例えば、 CH0細胞、 COS細胞 、 3T3細胞、 HeLa細胞などが挙げられる。 動物細胞において、 大量発現を目的 とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例 えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 エレクトロボレ一シヨン、 リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能である。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。 本発明の抗 体の形態には、 特に制限はなく、 ポリクローナル抗体の他、 モノクローナル抗体 も含まれる。 また、 ゥサギなどに本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、 す ベてのクラスのポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体、 さらにヒト抗体 や遺伝子組み换ぇによるヒト型化抗体も含まれる。
本発明の抗体は、 以下の方法により調製することが可能である。 ポリクロ一ナ ル抗体であれば、 例えば、 本発明のタンパク質をゥサギなどの小動物に免疫し血 清を得て、 これを本発明のタンパク質をカツプリングさせたァフィ二ティ一カラ ムにより、 本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分から 免疫グロブリン Gあるいは Mを、 プロテイン A、 あるいはプロテイン Gカラムに より精製することにより調製することができる。 また、 モノクローナル抗体であ れば、 本発明のタンパク質をマウスなどの小動物に免疫を行い、 同マウスより脾 臓を摘出し、 これをすりつぶして細胞にし、 マウスミエローマ細胞とポリエチレ ングリコールなどの試薬により融合させ、 これによりできた融合細胞 （ハイプリ ドーマ） の中から、 本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択 する。 次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより 腹水を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 フ ティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のタンパ ク質をカツプリングしたァフィ二ティーカラムなどにより精製することで調製す ることが可能である。 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質の精製、 検出に用い られる他、 本発明のタンパク質のァゴニストやアン夕ゴニストの候補になる。 ま た、 本発明の抗体を免疫関連疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。 抗体 治療に用いる場合には、 免疫原性を低下させるため、 ヒト抗体やヒト型抗体が好 ましい。
また、 ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原 となる蛋白質、 蛋白質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し 、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリ ドーマを用いて蛋白質に対するヒ ト抗体を取得してもよい （国際特許出願公閧番号 W092- 03918、 W093-Z227, W09 4-02602、 W094- 25585、 W096- 33735および W096- 34096参照） 。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明の蛋白質に結合するかぎり、 その抗体断片や 抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab' )2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv) (Hu ston, J. S. et al .， Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. ( 1988) 85, 5879-5883 ) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処 理し抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築 し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol . ( 1994) 152, 2968-2976 ； Better, M. and H orwitz, A. H.， Methods Enzymol . ( 1989) 178， 476-496 ； Pluckthun, A. an d Skerra, A. , Methods Enzymol . ( 1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Metho ds Enzymol . (1986) 121 , 652-663 ； Rousseaux, J. et al . , Methods Enzymo 1. (1986) 121, 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W.， Trends Biotech nol. ( 1991 ) 9， 132- 137参照) 。 抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合した 抗体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含 される。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施す ことによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立され ている。
本発明はまた、 配列番号： 1または 3に示される塩基配列からなる DNAまた はその相補鎖とハイブリダィズし、 少なくとも 15塩基の鎖長を有するヌクレオ チドを提供する。 このヌクレオチドは好ましくは配列番号： 1または 3に示され る塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖と特異的にハイブリダィズするもの である。 ここで 「特異的にハイブリダィズする」 とは、 通常のハイブリダィゼ一 ション条件下、 好ましくはストリンジェン卜なハイプリダイゼーション条件下で 、 他の蛋白質をコ一ドする DNAとのクロスハイプリダイゼーシヨンが有意に生 じないことを意味する。 このようなヌクレオチドには、 本発明のタンパク質をコ ―ドする DNAまたはその相補鎖と特異的にハイプリダイズし得るプローブゃプ ライマ一、 ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 （例えばアンチセンスオリゴヌ クレオチドゃリボザィム等） が含まれる。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質を利用した、 本発明のタンパク質に結合 する化合物のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法は、 （a ) 本発明のタンパク質またはその部分べプチ ドに被検試料を接触させる工程、 （b ) 本発明のタンパク質またはその部分ぺプ チドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、 を含む。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え型、 天然型又は部分ぺプ チドのいずれであってもよい。 また、 精製した蛋白質やその部分ペプチドであつ ても、 細胞表面に発現させた形態、 膜画分としての形態であってもよい。 また、 被験試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 タンパ ク質、 ペプチド、 合成低分子化合物が挙げられる。 本発明の夕ンパク質を用いて、 該夕ンパク質に対するリガンドを単離する方法 としては、 当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。 例えば、 リガ ンドを発現していることが予想される細胞 （例えば、 T細胞など） よりファージ ベクタ一 （A gtll, ZAPなど） を用いた cDNAライブラリ一を作製し、 これを L B-ァガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、 本発 明のタンパク質をピオチンラベル、 あるいは GSTタンパク質との融合タンパク 質として精製し、 これを上記フィル夕一と反応させ、 結合するタンパク質を発現 しているプラークを、 ストレプトアビジン、 あるいは抗 GST抗体により検出す る 「ウェストウエスタンブロッテイング法」 （Skolnik EY, Margolis B, Moham madi M, Lowenstein E, Fischer R, Drepps A, Ullrich A, and Schlessinger J ( 1991 )Cloning of PI3 kinase associated p85 utilizing a novel method for express ion/ c loning of target proteins for receptor tyrosine kinas es. Cell 65, 83-90) により調製することが可能である。 また、 本発明のタン パク質を SRF結合領域または GAL4結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現さ せ、 リガンドを発現していることが予想される細胞より、 VP16または GAL4転写 活性化領域と融合する形で発現するような cDNAライブラリーを作製し、 これを 上記酵母細胞に導入し、 検出された陽性クローンからラィブラリ一由来 cDNAを 単離して大腸菌に導入して発現させる （酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合 するタンパク質が発現すると、 両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され 、 陽性のクロ一ンが確認できる） 「twoハイブリッドシステム」 （ 「MATCHMARKE R Two-Hybrid Systemj， 「Maminaliaii MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」， 「 MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (いずれも clontech社製)、 「HybriZAP Two-H ybrid Vector Systemj (stratagene社製)、 文献 rDaltoii S, and Treisman R ( 1992) Character i zat i on of SAP-1, a protein recruited by serum respons e factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597 - 612」 ) に従 い調製することも可能である。 また、 本発明蛋白質と特異的に結合するリガンドのスクリーニングは、 本発明 蛋白質の細胞外ドメインとシグナル伝達能を有するへモポェチン受容体などの既 知の受容体蛋白質の細胞膜貫通ドメインを含む細胞内ドメインとを連結せしめて 作製したキメラ受容体を、 適当な細胞株、 好ましくは適当な増殖因子の存在下で のみ生存および増殖可能な細胞株 （増殖因子依存性細胞株） の細胞表面に発現せ しめた後、 該細胞株を種々の増殖因子、 サイ ト力イン、 または造血因子等を含む ことが期待される材料を添加して培養することにより実施可能である。 この方法 は、 被検材料中に本発明蛋白質の細胞外ドメインと特異的に結合するリガンドが 存在する場合にのみ、 上記増殖因子依存性細胞株が生存および増殖が可能である ことを利用している。 既知のへモポェチン受容体としては、 例えば、 トロンボポ ェチン受容体、 エリスロポエチン受容体、 G- CSF受容体、 gpl30等が挙げられる が、 本発明のスクリーニング系に用いるキメラ受容体のパートナーは、 これら既 知のへモポェチン受容体に限定されるものではなく、 細胞質ドメインにシグナル 伝達活性に必要な構造を備えているものであれば何を用いても構わない。 例えば 、 TNF受容体スーパーフアミリーに属する 0X40受容体をキメラ受容体のパート ナ一として選択することができる （Mallet, S. et al . , EMBO J. ， 19， 1063 - 1068 ( 1990))。 0X40受容体は、 細胞内に正のシグナルを伝達することができる ことから、 増殖反応等を指標としてリガンドのスクリーニングを行うことができ る (Baum, P.R. et al . , EMBO J. , 13, 3992-4001 ( 1994)) 。 増殖因子依存 性細胞株としては、 例えば、 BaF3や FDC- P1を初めとした IL3依存性細胞株を利 用することが可能である。
さらに、 本発明のタンパク質を、 そのリガンドを発現していない細胞で発現さ せ、 次いで、 該細胞に、 リガンドを発現していることが予想される細胞より構築 した発現 cDNAラィブラリーを COSなどの細胞に導入して得た培養上清を添加し 、 そして該細胞のある種の変化 （例えば増殖活性などの機能的変化または形態的 変化を含む） を指標にリガンドを探索する 「ダイレクト発現クロ一ニング法」 （ Yokota T, Otsuka T, Mosmann T， Banchereau J， DeFrance T， Blanchard D, De Vrfes JE, Lee F, and Arai K. ( 1986 ) Isolation and characterization o f a human interleukin cDNA clone, homologous to mouse B - cell stimulato ry factor 1, that expresses B-cell- and T - eelト stimulating activities. Proc Natl Acad Sci U S A. 83， 5894-5898) により調製することも可能であ る。 これらのスクリーニング方法は、 本発明のタンパク質に対する抗体や、 本発 明のタンパク質に結合する化合物を被検試料として用いたァゴニストゃアン夕ゴ 二ストのスクリ一ニングに用いることも可能である。
さらにまた、 本発明のタンパク質を固定したァフィ二ティ一カラムに本発明の リガンドを発現していることが予想される細胞の培養上清をのせ、 カラムに特異 的に結合するタンパク質を精製することにより調製することも可能である。 得ら れたタンパク質 （リガンド） のアミノ酸配列を分析し、 それを基にオリゴ DNA を合成し、 該 DNAをプロ一ブとして cDNAライブラリ一をスクリーニングするこ とにより、 該リガンドをコードする DNAを得ることが可能である。
さらにまた、 本発明の蛋白質の細胞外領域と、 抗体 （例えばヒト IgG [抗体） の Fc領域とのキヌラ蛋白質として発現し、 プロティン Aカラム等を用いて精製 することができる。 このような抗体様キメラ蛋白質は、 リガンドの結合活性を有 することから、 適宜、 放射性同位元素等で標識した後、 リガンドのスクリ一ニン グに用いることができる (Suda, T. et al .， Cell, 175, 1169-1178 ( 1993)) 。 また、 TNFファミリ一分子などのある種のサイ トカインでは、 その多くが膜結 合型でも存在することから、 各種の細胞と抗体様キメラ蛋白質を反応させて、 結 合活性を示した細胞から、 リガンドを単離する事ができる可能性もある。 また、 cDNAライブラリーを導入した細胞を用いて同様にリガンドを単離することがで きる。 さらに、 抗体様キメラ蛋白質をアン夕ゴニストとして用いることも可能で める。
また、 本発明のタンパク質を用いて、 該タンパク質に対するァゴニスト、 およ びアン夕ゴニストを単離する方法としては、 例えば、 固定した本発明のタンパク 質に Γ化合物、 または天然物バンク、 もしくはランダムファージペプチドデイス プレイライブラリ一を作用させ、 結合する分子をスクリーニングする方法や、 コ ンビナトリアルケミストリ一技術によるハイスループットを用いたスクリ一ニン グ方法 （Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ. , Small pepti des as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64、 Verdine GL.， The combinatori al chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 pll-13, Hogan JC Jr. , Directed combinatorial chemistry. Nature ( ENGLAND ) Nov 7 1996， 384 pl7-9) が当業者に公知である。
これにより単離されたリガンド、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストは、 本発明の夕 ンパク質の活性を促進または阻害するための薬剤の候補となり、 本発明のタンパ ク質が関与する疾患 （例えば、 免疫系関連疾患） の治療への応用が考えられる。 本発明のスクリーニング法により単離される化合物を、 薬剤として用いる場合 には、 公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることが可能である。 例えば 、 薬理学上許容される担体または媒体 （生理食塩水、 植物油、 懸濁剤、 界面活性 剤、 安定剤など） とともに患者に投与される。 投与は、 化合物の性質に応じて、 経皮的、 鼻腔内的、 経気管支的、 筋内的、 静脈内、 または経口的に行われると考 えられる。 投与量は、 患者の年齢、 体重、 症状、 投与方法などにより変動するが 、 当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。
例えば、 本発明の蛋白質と結合活性を有する化合物の投与量は、 症状により差 異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0.1から 100mg、 好ましくは約 1.0から 50mg、 より好ましくは約 1 .0から 20m である。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして ) においては、 1日あたり約 0.01から 30mg、 好ましくは約 0.1から 20mg、 より 好ましくは約 0.1から 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは、 体表面積あたり に換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 クローニングした Deltal cDNAの塩基配列および推定アミノ酸配列 を示す図である。 右端の数字はヌクレオチド位置を示す。 太い下線は推定シグナ ル配列および膜貫通領域を示す。 細い下線はボックス 1およびボックス 2領域 を示す。 囲つた領域は WSXWSボックス様配列である。
図 2は、 Deltalとその他の既知のサイ トカイン受容体との同一性および類似 性を示す図である。
(A) Deltalおよびマウス共通ァ受容体 （ァ c) の細胞外ドメインの配置。
(B) 様々な造血増殖因子受容体の配列の比較。 Deltalとその他の受容体のァ ミノ酸残基のマッチを 「*」 （同一） または 「：」 （類似） によって示す。 これ までに定義された相同性領域、 相同性ボックス 1および 2と呼ばれる領域を示す 。 ボックス 1およびボックス 2は、 I型サイ トカイン受容体の膜近位領域 （Mura kami M.et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci . USA 88: 11349( 1991 )) において認められる 短い特徴的なモチーフである。 ボックス 1モチーフは、 疎水性配列の後に続く P XPモチーフ （プロリン、 X、 プロリン） によって定義される。 ボックス 2はいく つかの陰性荷電アミノ酸を有する疎水性アミノ酸の集団として定義される。 図 3は、 マウス組織における Deltalの発現を示す写真である。 MA分子量マ 一力一の移動度をキロベースで示す。
図 4は、 マウス多組織プロヅ トのノザンプロットハイプリダイゼ一シヨンを示 す写真である。 RNA分子量マーカ一の移動度をキロベースで示す。 図 5は、 キメラ受容体の構造を示す図である。 野生型 De alおよび EP0Rを キメ EP0- DeltalR、 hEDER、 および hMPL-DeltalRと共に略図で示す。 融合した ドメインは同種の cDNA内で産生された制限部位によって示す。
図 6は、 FDC- P1 トランスフエクタントの因子反応性を示す図である。 様々な 受容体構築物によってレトロウイルスによつて形質導入した FDC- P1細胞増殖の 経時的変化を示した。
図 Ίは、 FDC- P1細胞において異所発現させたキメラ EDERを通じての JAK2キ ナーゼの活性化を示す写真である。
図 8は、 Ba/F3細胞上に発現させた、 タグを付した De alの免疫沈降を示す 写真である。 Delta卜 Flagの位置 （矢印の先） および分子量マ一力一を示す。 図 9は、 マウス第 5染色体の中心領域における Deltalのマップを示す。 種間 戻し交雑分析によって Deltalはマウス第 5染色体上に位置した。 全ての座に関 してタイピングした戻し交雑動物 106例における Deltalと隣接遺伝子の分離パ ターンを図の上部に示す。 それぞれのカラムは、 （C57BL/6JXM.スプレヅス （M . spretus) ) F1親から受け継いだ戻し交雑子孫において同定された染色体を表 す。 影をつけた枠は C57BL/6J対立遺伝子の存在を示し、 白い枠は M. スプレツ ス対立遺伝子の存在を示す。 それぞれのタイプの染色体を受け継いでいる子孫の 数をそれぞれのカラムの下に記載する。 連鎖遺伝子に関連して Deltalの位置を 示す部分的第 5染色体連鎖マップを図の下に示す。 センチモルガンで示す座間の 組換え距離を染色体の左側に示し、 本試験において引用した座の位置は GDB (ゲ ノムデ一夕べ一ス） 、 すなわちジョンズ 'ホプキンス大学 （メリーランド州、 バ ルチモア） のウイリアム H.ウエルチメディカルライブラリによって維持されて いるヒト連鎖情報のコンビユー夕一データベースから得ることができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[実施例 1 ] シグナルシーケンストラップ （SST)法によるリンパ球 cDNAライ ブラリーのスクリ一ニング
マウスオボアルブミン （OVA) のアミノ酸 323〜339に特異的な T細胞レセプ 夕一のトランスジエニックマウス、 OVA- 23- 3は既に確立されている （Satoら， 1994, Eur. J. Immunol . , vol .24, p. 1512) 。 OVA- 23- 3マウスの脾臓細胞を OV A323- 339ペプチド、 抗原提示細胞、 イン夕一ロイキン 2、 イン夕一ロイキン 12 及び抗ィン夕一ロイキン 4モノク口一ナル抗体存在下で培養する事により、 Thl 型のサイ ト力インを分泌するリンパ球に分化し、 また 0VA323- 339ペプチド、 抗 原提示細胞、 イン夕一ロイキン 2、 イン夕一ロイキン 4及び抗イン夕一ロイキン 12モノクローナル抗体存在下で培養する事により Th2型のサイ トカインを分泌 するリンパ球に分化することが既に示されている （Ohtaら， 1997， Journal of Immunological Methods, vol .209, p.85) 。
そこで、 上記の Ohtaらの方法により TM型、 Th2型に分化させたリンパ球よ り Fast Track( Invitrogen)を用いて polyA( + )RNAを調製した。 Superscript Ch oice System(GIBC0 BRL)のランダムへキサマ一を用いて二本鎖 cDNAを合成した 。 cDNAの末端平滑処理後 BstXIアダプタ一（Inv rogen)を付加し、 SizeSep 40 0 Spun Column(Pharmacia)を用いて 400bp以上の cDNAを分画した。 別に BstXI (宝酒造） 及び BAP処理した pMX GM (-) V- mplM 2 (特願平 9-324912号参照） と混 合後 T4 DNA ligaseを作用させて連結した。 これを Gene Pulser (Bio Rad)を 用いて電気穿孔法にて大腸菌 DH10B (GIBCO BRL)に導入して cDNAライブラリ一 を構築した。
ライブラリ一組換え大腸菌から抽出したプラスミ ドを JETstarカラム （GEN0M ED)を用いて精製した。 パッケージング細胞 B0SC23(Proc. Natl . Acad. Sci . U SA, vol .90: 8392-8396, 簡）に LipofectAMINE (LIFE TECHNOLOGIES)を用 いてプラスミ ド cDNAラプラリ一をトランスフエクトした。 B0SC23を 10%ゥシ胎 児血清 (FCS, JRH BIOSCIENCES)を含む Dulbecco' s Modified Eagel Medium (D MEM, tIFE TECHNOLOGIES)で 6cm dish (Corning)に播き込み 16時間後、 DMEMで 洗浄し、 先に 200 1 DMEMで希釈した 18 1 LipofectAMINEと 200 H DMEMで 希釈したプラスミ ド 3 gを混ぜて 15分間室温で放置したものに 1.6mlDMEMを 混ぜて細胞に加えた。 5時間後 2ml の 20%FCSを含む DMEMを加え 19時間培養 した。 その後 3mlの 10% FCSを含む DMEMに置換し 24時間後にその培養上清を 回収した。 この組み換えウィルスを含む培養上清にマウス interleukin- 3( IL - 3) 及び lO ju g/ml hexadiraethrine bromideを加え、 これに Ba/F3細胞を懸濁して 感染させた。 感染させて 24時間後細胞をリン酸緩衝液にて 3回洗浄し 10%FCS を含む RPMI1640にて培養を続けた。
IL-3非存在下で増殖してきたクローンから染色体 DNAを抽出し、 cDNA揷入部 位を挟むように設定したプライマー （5，- gggggtggaccatcctcta- 3ソ配列番号： 5、 および 5，- cgcgcagctgtaaacggtag- 3，/配列番号： 6 ) を用いて PCRを行い cDNA断片を回収した。 PCRは 500ng染色体 DNA、 500pM各プライマ一、 TaKaRa L A Taq (宝酒造） 2.5単位、 2.5mM MgCl2、 0.3mM dNTPs及び酵素添付緩衝液を含 む反応液 について GeneAmpPCR System 2400で以下の条件にて行った。 98 °C、 60秒の変成後、 「98°C，20秒、 68°C, 120秒」 のサイクルを 30回行った。 PC R反応物をァガロース電気泳動にかけ増幅された断片を含む部分を切り出し、 M Aを精製した。 得られた MA断片についての塩基配列を決定したところ、 I型サ ィ トカイン受容体スーパーファミリ一受容体と相同性を有するサイ トカイン受容 体様タンパク質をコ一ドする cDNAの一部であることが明らかとなった。
[実施例 2 ] 全長 cDNAのクローニングと塩基配列決定
完全長 cDNAを得るために Th2型リンパ球 cDNAライブラリ一を oligo dTブラ イマ一で合成し、 上記 cDNA断片をプローブにスクリーニングした。 具体的には Th2型リンパ球 polyA( + )RNAから Superscript Choice System (GIBC0 BRL)の o ligo dTプライマーを用いて二本鎖 cDNAを合成した。 cDNAの末端平滑処理後 Bs tXIアダプタ一（Invitrogen)を付加し、 SizeSep 400 Spun Column (Pharmacia) を用いて 400bp以上の cDNAを分画した。 別に BstXI (宝酒造） 及び BAP処理した pME 18s (Liu, Y. C. et al .， Pro Natl . Acad. Sci . USA, 90( 19) , 8957-89 61 ( 1993)) と混合後 T4 DNA ligaseを作用させて連結した。 これを Gene Puis er (Bio Had)を用いて電気穿孔法にて大腸菌 DH10B (GIBCO BHL)に導入して cD NAライブラリ一を構築した。 ラィブラリ一組換え大腸菌から抽出したブラスミ ドを JETstarカラム（GEN0MED)を用いて精製した。
先に SST法にて得られた DNA断片 0.1〃gを錶型にその内部プライマ一（50pmo le) (22115; 5， - ggtgatgtcacagtcgtctgccatg- 3， /配列番号： 7、 および 22113; 5， - acggtccgcaggagtagcagtaa-3， /配列番号： 8 ) 、 2.5mM MgCl2、 0.2mM dATP, dGTP, dCTP、 O. lmM dTTPヽ 10 M Biotine- 2卜 dUTP、 2.5単位 TaKaRa LA Taq (宝酒造） 及び酵素添付緩衝液を含む反応液 50 1について GeneAmpPCR System 2400で 98°C、 60秒の変成後、 「98°C, 20秒、 59°C, 20秒、 74°C, 60秒」 の サイクルを 30回行いピオチン化した。 このピオチン化 DNA 100ngを含む 14.9 1水溶液を 100°C 5分変成急冷後、 2mM CoCl2、 30mM TrisHCl pH8.0、 8mM MgCl2 、 1.6mM ATP[ r S]、 80 ju M ATP (それぞれ最終濃度） 及び 4 g recAを加え、 37 °C15分間保温後上記ブラスミ ド cDNAライブラリーを 5 g加え（最終容量 30 μ 1 )更に 20分間保温した。 Hindl l l消化 A DMを 50ng加え 5分後、 10%SDSを 0.6 μ 1、 14mg/ml ProteinaseKを 0.4 1加え 10分間保温後 50mM P SFを 2 1カロ えて反応を停止させた。 ここに鮭精巣 DNAで blocking処理した Streptavidin M agneSphere (Promega)を加え、 20分間吸着させた。 0.05% Tween20を含む 10m M TrisHCl pH7.5, ImM EDTA, 1M NaClで 1回、 lOmM TrisHCl pH7.53 ImM EDTA , 2M NaClで 3回洗浄後、 さらに蒸留水で 1回洗浄し ImM EDTA, 0.1N NaOHで D NAを溶出させた。
これをエタノール沈殿後 Gene Pulser (Bio Had)を用いて電気穿孔法にて犬 腸菌 DH10B (GIBCO BRL)に導入し、 50// g/mlアンビシリン含有培地上にて組み 換え体を選択した。
得 5"れたコロニ一からプラスミ ドを抽出し、 上記の recA反応を再度行い、 ァ ンピシリン含有培地上にて組み換え体を選択した。 上記の 221L5及び 221L3を 用いて同様の条件にてコロニー PCRを行った。 約 400塩基のバンドが得られた陽 性コロニーからプラスミ ドを抽出して挿入 cDNAの塩基配列を決定した。
上記操作により 2種類のクローンが得られ、 一方（ 「Deltal」 と称する）は 127 8塩基の cDNA (配列番号： 1 ) が得られ、 359アミノ酸残基 (配列番号： 2 ) をコ ードするオープンリーディングフレーム（ 59〜： 1135位）が認められた。 1〜24ァ ミノ酸がシグナル配列、 231〜253アミノ酸が膜貫通ドメインと推定される。 ま た細胞外ドメインについては、 IL- 2 r等の I型サイ トカイン受容体スーパ一フ アミリ一で保存されているシスティン、 WSボックス（201〜205アミノ酸)領域等 について比較的高い相同性を示した。 また細胞内ドメインについては 262〜269 アミノ酸、 311〜322アミノ酸がそれぞれ boxl · 1)οχ2と呼ばれるサイ トカイン受 容体に共通で、 シグナル伝達に重要と推測されている構造との相同性を示した。 また、 Deltalは、 国際公開番号 W099/47538に記載のタンパク質と相同性を示し た。
もう一方（ 「215S」 と称する）は 804塩基 (配列番号： 3 ) よりなり、 188アミ ノ酸残基 （配列番号： 4 ) をコードするオープンリーディングフレーム（98〜66 1位)が認められた。 シグナル配列以下 175アミノ酸までは全く 215 Lと相同で あるが、 膜貫通ドメイン以下に相当する部位を欠失しており、 各種サイ トカイン レセプ夕一に多く見られる可溶型と考えられた。
[実施例 3 ] ノーザンブロッテイング
マウスの多組織ノーザンプロット （クロンテック 'ラボラトリーズ） を、 上記 のプライマーセヅトを用いて作製した 407 bpのデル夕 1特異的 PCR断片をプロ —ブとして調べた。 50%ホルムアミ ド、 5 X SS 1%ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 、 6 xデンハート試薬、 および 100 /g/mlサケ精子 DNA中で、 プロット を P-標識ランダムプライミングプロ一ブと 42°Cで一晩ハイブリダイズさせ、 0 , l x SSt, 0.1%SDS中で 55°Cで洗浄して、 その後 X線フィルムに露光した。 ファ スト トラック 2.0キット （インビトロゲン社） を用いて様々なマウス細胞株か ら調製したポリ（A)+RNA試料 （3〃g) を、 1%ァガロースホルムアミ ドゲルによ る電気泳動によって分離して、 ハイボンド N+ (アマシャム社） ナイロンフィル 夕一に移した。 上記プローブを用いてハイブリダィズし、 その後洗浄した。
ノーザンプロットの結果、 1.4キロべ一ス （kb) の単一の転写物が、 調べた全 ての骨髄細胞株、 CTLL、 ならびに休止期および活性化マウス Thlおよび Th2細 胞において同定されたが、 NIH3T3細胞を含む繊維芽細胞株 2株では同定されな かった。 Th2分化誘導細胞は Thl分化誘導細胞よりかなり高い発現を示した。 T 細胞活性化による発現のわずかなアップレギュレーションがいずれの T細胞培 養においても認められた （図 3 ) 。 多数の組織のノザンプロット分析において、 心臓、 脳、 脾臓、 肺、 腎臓および精巣では 1.4キロベース （kb) の単転写物が 同定されたが、 骨格筋では同定されなかった （図 4 ) 。
[実施例 4 ] Deltalの機能的分析
本発明者等は、 まず、 IL- 3または IL-4にそれぞれ反応して増殖または生存す る Ba/F3細胞において Deltalの過剰発現を行なった。 しかしながら、 De alが 過剰発現してもこれらのサイ トカインに対する Ba/F3反応は増強しなかった。
その上、 これらのサイ トカインは、 Deltalを過剰発現する Ba/F3細胞において Delta卜 Flagのチロシンリン酸化を誘導せず、 このことは Deltalが IL-3および IL-4シグナル伝達に関与していないことを示唆している （データは示していな い） 。
次に、 本発明者等は、 Deltalの細胞質ドメインの機能を調べた。 Deltalと hE PORまたは hMPLの間のキメラ受容体を作製して Deltalの細胞質ドメインのホモ ダイマ—形成が及ぼす影響を調べた。 ボックス 1を含む Deltalの膜近位領域の 機能を評価するために、 hEPORの膜近位領域を Deltalの膜近位領域と置換する ことによって EDERキメラを作製した。
キメラ受容体の構築および発現は、 次のように行なった。 野生型 hEPOを発現 させるため、 完全長の hEPOR (Noguchi CT. et al . , Blood 78:2548( 1991 )) を 、 pMX-puroレトロウイルスベクタ一の EcoRIおよび Not I部位にクロ一ニング した (Onishi M. et al . , Mol . Cel l . Biol .18: 3871( 1998)) 。 キメラ受容体 hEP OR-DeltalRおよび hMPL- DeltalRを構築する場合には、 EcoRI部位をそれぞれの cDNAの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間に挿入した。 次に、 高精度 DNAポ リメラ一ゼ Pyrobest (夕カラ） を用いた PCRによって得られた Deltal cDNAの 細胞質ドメインを、 5， -EcoRIおよび 3， -Notl部位で pMX- puroにクロ一ニングし 、 hEPORまたは hMPL (Vigon L et al. ,Proc. Natl . Acad. Sci . USA 89:5640( 1992 ) ) の細胞外ドメインを含む EcoRI断片を 5' - EcoRI部位にクロ一ニングした （ 図 5 )。 De al cDNAにおいて EcoRIおよび Not I部位の作製に、 プライマ一と して、 5，一aaagaattcccgcccctcctgcccctgggc—3，/¾3^J¾^^： 9および 5，一 gctggc ggccgcacctgcaggcgc- 3， /配列番号： 1 0を用いた。 hEPOR cDNAにおける EcoRI 部位の作製に、 プライマ一として、 5， -aaagaattcgggggctgtatcatggac-3' /配列 番号： 1 1および 5，- aaagaa cggggtccaggtcgctagg- 3，/配列番号： 1 2を用い た。 hMPL cDNAにおける EcoRI部位の作製に、 プライマーとして、 5，-ggtagggaa ttccggaatttcctcgagatg— 3， /酉己歹 ij番号： 1 3および 5，一 aaagaattcccaggcggtctcg gtggcggt- 3ソ配列番号： 1 4を用いた。 キメラ受容体 EDERを構築するために、 hEPORの膜貫通ドメインおよびボックス I領域をカバーするアミノ酸 57個の枝 を Deltalの対応する領域と置換した。 まず、 Hpal部位を細胞外ドメインと膜貫 通ドメインの間に挿入し、 Xhol部位を、 hEPORの細胞質ドメインにおいて保存 されたトリブトファン残基の下流に挿入した （図 5 ) 。 次に、 Deltal cDNAのボ ックス 1領域を pMX-puroの EcoRIおよび Not I部位にクロ一ニングした。 その 後 hEPORの細胞質ドメインを EcoRIおよび Not I部位にクローニングし、 hEPOR の細胞外ドメインを EcoRIおよび Hpal部位にクロ一ニングした。 膜貫通領域お よび膜近位領域に及ぶ Delta cDNAの末端で 5' -EcoRIおよび Hpal部位、 ならび に 3，- Xhol部位および Not I部位を作製するために、 プライマ一として、 5，-aa agaattcgttaacccgcccctcctgcccctgggg - 3- /酉 3歹！番号： 1 5および 5， - aaagcggcc gcctcgagccaggcctggaagttccc-3，/配列番号： 1 6を用いた。 hEPORの細胞質領 域において 5，- Xholおよび 3' -Not I部位を作製するために、 プライマ一として ヽ 5， -aaactcgagctgtaccagaatgatggc-3' /酉己歹 [J番号： 1 7並びに 5， -aaagcggccgc tcacttgtcagagcaagccacatagct-3'、 5， -aaagcggccgctcagtcatcagagcaagccacata get- 3，ヽ 5， -aaagcggccgctcagtccttagagcaagccacatagct-3'ヽ および 5， -aaagcgg ccgctcagtaatcagagcaagccacatagct- 3，/配列番号： 1 8から 2 1を用いた。 hEPO Rの細胞外領域における 5， -EcoRIおよび 3， -Hpal部位の作製に、 プライマ一と してヽ 5, - aaagaattcgggggctgtatcatggac - 3， /酉 3列番号： 2 2および 5, - aaagtta acggggtccaggtcgctagg- 3' /配列番号： 2 3を用いた。 全ての構築物は制限酵素 分析およびシークェンシングによつて確認した。
得られた発現プラスミ ドを、 記述通りに （Kitamura T. et al . , Proc. Natl .Aca d. Sci.USA 92 : 9146( 1995 )) レトロウィルス感染によって FDC- PIに導入した。 感染した細胞株は安定なトランスフエクタントを得るために 1〃g/mlピュー口 マイシン （シグマ社） の存在下で選択した。
親の FDC-P1および hEP0R、 hEPOR-DeltalR, E腿、 および hMPL- DeltalRを発 現する FDC-P1細胞は、 lng/ml mIL- 3、 2U/ml hEPO, 2U/ml hEPOヽ 2U/ml hEPO, および 100 ng/ml hTPOの存在下でそれぞれ培養し、 表示の時点で細胞数を計数 した。
その結果、 マイ トゲン特性に関しては、 EDERを発現する FDC- P1細胞は hEPO に反応して効率よく増殖した （図 6 ) のに対し、 キメラ受容体 hEPO- DeltalRま たは hMPL-DeltalRを発現する FDC-P1細胞は、 EP0または TP0に反応してそれそ れ増殖シグナルを伝達しなかった。 [実施例 5 ] EDEキメラ受容体による JAKキナーゼのリン酸化 キメラ受容体 EDERが JAKキナーゼの hEPO依存的活性化を媒介するか否かを 、 JAK2に対する抗体による免疫沈降、 およびホスホチロシンに対する抗体 （モ ノクローナル抗体 4G10) によるウエスタンブロッテイングによってアツセィし た。 ストリツビングの後、 抗 JAK抗体を用いて再度解析を行なった。 抗 JAK1、 抗 JAK3および抗 Tyk-2抗体を用いて同様の分析を実施した。
免疫沈降およびウエスタンブロッテイングは、 次のように行なった。 細胞を 溶解緩衝液 （50 mM トリス塩酸 （pH 7.5) 、 150 mM NaCl、 1 %トライ トン X- 10 0、 l mM EDTA、 0.2 mM Na3V04、 2 mM PMSF) 中で溶解した。 12, 000 x gで 40分 間遠心することによって溶解物からゴミを除去してきれいにし、 上清を抗体と共 に 4 °Cで 2時間ィンキュベ一トした。 免疫複合体をプロティン Aセファロース (フアルマシア社） によって沈殿させ、 溶解緩衝液で洗浄し、 蛋白質を SDS- PAG Eのために同じ緩衝液 （62.5 mM トリス塩酸 （pH 6.8) 、 2 %SDS、 10%グリセ ロール、 5 %2-メルカプトエタノール、 0.02%プロモフエノールブル一） で溶 出した。 溶出した蛋白質を 8〜16%勾配のゲル上で電気泳動した （グラディボ ァ社、 オーストラリアのノースライ ド） 。 膜を抗体またはストレプトアビジン · ホースラディッシュ ·ペルォキシダ一ゼ （HRP0) (ベクターラボラトリーズ） をプローブとして調べ、 強化化学発光検出システム （アマシャム社） を用いて製 造元のマニュアルに従って可視ィ匕した。
EDERのマイ トゲン活性は、 JAKキナーゼが hEPO誘導二量体形成によって活性 化されることが示唆された。 実際に、 ウエスタンプロット分析によって、 EDER を発現する細胞において hEPO-依存的 JAK2 リン酸化が検出された （図 7 ) 。 EDE Rを発現する細胞では hEPO刺激に反応して JAK1、 JAK3および TYK2をリン酸化 しなかった。 4個の JAKはいずれもキメラ受容体 hEPO- De alRまたは hMPL-Del talRをそれぞれ発現する細胞において EP0または TP0刺激に反応してリン酸化 されなかった （デ一夕は示していない） 。 [実施例 6] Deltal蛋白質の発現
タグを付した Deltalを構築するため、 Flag配列 （DYKDDDDK/配列番号： 24 ) を Deltalの C-末端と融合することによって DeUa卜 Flagをデザインした。 De ltal-Flagの PCR断片を 5， -EcoRI部位および 3， -Not I部位で pMX- puroレトロ ウィルスベクタ一にクロ一ニングした。 Deltalの C末端に Flag配列を加えるた めに、 プライマーとして、 5， - agggaattccggaatttcctcgagatc- 3， /配列番号： 2 5および 5， -aaagcggccgctcacttgtcgtcatcgtccttgtaatccagggtcatgtagccgctgt c - 3' /配列番号： 2 6を用いた。
構築されたべクタ一は、 レトロウィルス感染によって Ba/F3細胞に導入した 。 夕グをつけた De alによって形質導入した Ba/F3細胞および親細胞をスル ホ -NHS-LCピオチンで表面標識し、 細胞溶解物を抗 Flag抗体によって沈降させ 、 次にストレプトアビジン- HRP0によるブロッテイングを行った （図 8) 。 発現 された Deltal蛋白質は分子量 50 kDaであり、 これは計算した分子量 37791ダ ルトンより大きかった。 この差はおそらく糖部分が、 De alの細胞外ドメイン に認められる予想される 2つの N-結合グリコシル化部位と思われる部位のいく つかと結合したためである。
[実施例 7] 染色体の位置
Fl (C57BL/6JXM.スプレツス （M. spretus) ) の雌と C57BL/6Jの雄を交雑さ せることによって種間戻し交雑子孫を作製した （Copeland NG. , Jenkins ΝΑ. ,ΤΓ ends Genet 7:113(1991))。 N2マウスを全体で 205匹用いて Deltal座をマツ ビングした。 DNA単離、 制限酵素消化、 ァガロースゲル電気泳動、 サザンプロヅ ト トランスファ一、 およびハイプリダイゼ一シヨンは本質的に記述通り （ Jenki ns NA.et al.，J Virol43:26(1982)) に実施した。 全てのブロヅトをハイボンド N+ナイロンメンブレン （アマシャム社、 イ リノイ州アーリントン -ハイツ） に よつで調製した。 マウス cDNAの 407 bp断片であるプロ一ブを、 ランダムプラ イミング標識キット （ストラタジーン社） を用いて、 [ひ32 P]dCTPによって標識 した；洗浄は最終的なストリンジエンシー 1.0 x SSCP、 0.1%SDS、 65°Cで実施し た。 C57BL/6Jおよび M.スプレツス （Μ· spretus) DNAをいくつかの酵素によつ て消化して、 マウス cDNADeltalプローブをを用いて、 情報の多い制限断片長多 形 （RFLP) を得るためにるサザンプロットハイブリダィゼ一シヨンによる分析 を行なった。 8.7 kbまたは 11.0 kbの Seal断片を C57BL/6J DNAまたは M.スプ レヅス （M. spretus) DNAにおいてそれぞれ検出した。 11.0 kb Sea I M. スプ レヅス特異的断片の有無を戻し交雑マウスにおいて追跡した。
Fgf5、 Dmpl、 Gfilおよび Crybb2を含む Deltalに連鎖したプローブと RFLPに 関する記述はこれまでに報告されている (Liao X. et al. ,J Virol 69:7132( 199 5)、 George A.et al. ,J Biol Chem 271 :32869( 1996)) 。 組換えの距離はマップ マネ一ジャー、 バージョン 2.6.5.を用いて計算した。 遺伝子の順序は対立遺伝 子分布パターンを説明するために必要な組換えィベン卜の数を最小限にすること によって決定した。
マッピングの結果は、 Deltalが Fgf5、 Dmpl、 Gfilおよび Crybb2と連鎖して マウス第 5染色体の中心領域に位置することを示した。 マウス 106匹について 分離分析においてあらゆるマ一カーを分析して示したが （図 9 ) 、 いくつかのマ 一力一対に関するタイピングは 154匹までのマウスについて行った。 それぞれ の座を、 さらなるデ一夕を用いて組換え頻度に関して対として組合せて分析した 。 それぞれの座の対に関して分析したマウスの総数に対する組換え染色体を示し たマウスの総数の比および最も可能性が高い遺伝子順序は、 「セントロメァ— F gf5-4/151-Dmpl -0/136-Deltal-Gfil-4/145-Crybb2j であった。 組換え 頻度 [センチモルガン （cM) で表した遺伝子の距離士標準誤差]は、 「セント口 メァ一 Fgf5— 2.7±1.3— [Dmplヽ Deltal、 Gfil]— 2.8± 1.4— Crybb2」 である。 普通にタイピングしたマウス 136匹では、 Dmplと Deltalの間に、 またはマウス 154 ^は De alと Gfi lの間には組換えは検出されず、 このことは各対におけ る 2つの座は互いにそれぞれ 2.2および 1.9 cMの範囲内に存在することを示唆 している （95%信頼区間上限） 。 産業上の利用の可能性
本発明により、 サイ トカイン受容体スーパ一フアミリーに属すると考えられる 新規なサイ トカイン受容体様タンパク質およびそれらの遺伝子が提供された。 サ ィ トカイン受容体スーパ一ファミリ一はこれまで多数の、 それぞれ機能の異なる 分子が同定されており、 いずれも生体で免疫系を中心として重要な役割を果たし ていることが知られている。 従って、 本発明のタンパク質や遺伝子は、 免疫 '分 化機能に関与する新たな因子の精製やクロ一ニング、 さらには医薬品候補化合物 のスクリーニングのための有用なヅ一ルとして利用しうる。

Claims

請求の範囲
1 . 下記 （a ) から （d ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード する DNAo
( b ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなり、 配 列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な タンパク質をコードする DNA。
( d ) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAとハイブリダィズ する DNAであって、 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなる夕ン パク質と機能的に同等なタンパク質をコードする DNA。
2 . 請求項 1に記載の DNAが挿入されたベクター。
3 . 請求項 2に記載のベクターを保持する宿主細胞。
4 . 請求項 1に記載の MAがコードするタンパク質。
5 . 請求項 3に記載の宿主細胞を培養し、 該宿主細胞またはその培養上清から 発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 請求項 4に記載のタンパク質の製 造方法。
6 . 請求項 4に記載の夕ンパク質に結合する抗体。
7 . 請求項 4に記載のタンパク質の部分べプチド。
8 . 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる MAまたはその相補鎖 とハイブリダィズし、 少なくとも 1 5塩基の鎖長を有するヌクレオチド。
9 . 請求項 4に記載のタンパク質に結合する活性を有する化合物のスクリー二 ング方法であって、
( a ) 請求項 4に記載のタンパク質またはその部分べプチドに被検試料を接触さ せる工程、
( b ) "請求項 4に記載のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有 する化合物を選択する工程、 を含む方法。
10. 請求項 9に記載の方法により単離されうる、 請求項 4に記載のタンパク 質に結合する化合物。
11. 天然由来である、 請求項 10に記載の化合物。
12. リガンド、 ァゴニスト、 またはアン夕ゴニストである、 請求項 10に記 載の化合物。
PCT/JP2000/000939 1999-02-19 2000-02-18 Nouvelle proteine de type recepteur de cytokines Ceased WO2000049148A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU25741/00A AU2574100A (en) 1999-02-19 2000-02-18 Novel cytokine recfptor-like protein
EP00904039A EP1152059A4 (en) 1999-02-19 2000-02-18 NOVEL CYTOKINE RECEPTOR TYPE PROTEIN

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11/41936 1999-02-19
JP4193699 1999-02-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000049148A1 true WO2000049148A1 (fr) 2000-08-24

Family

ID=12622121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/000939 Ceased WO2000049148A1 (fr) 1999-02-19 2000-02-18 Nouvelle proteine de type recepteur de cytokines

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1152059A4 (ja)
AU (1) AU2574100A (ja)
WO (1) WO2000049148A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000068381A1 (en) * 1999-05-11 2000-11-16 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor mouse zcytor10

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5378808A (en) * 1989-02-03 1995-01-03 Genetics Institute, Inc. Recombinant erythropoietin receptor protein
WO1999047538A1 (en) * 1998-03-19 1999-09-23 Human Genome Sciences, Inc. Cytokine receptor common gamma chain like

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5378808A (en) * 1989-02-03 1995-01-03 Genetics Institute, Inc. Recombinant erythropoietin receptor protein
WO1999047538A1 (en) * 1998-03-19 1999-09-23 Human Genome Sciences, Inc. Cytokine receptor common gamma chain like

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONSTANCE TOM NOGUCHI ET. AL.: "Cloning of the human erythropoietin receptor gene.", BLOOD, vol. 78, no. 10, 15 November 1991 (1991-11-15), pages 2548 - 2556, XP002928876 *
KAREN EHRENMAN ET. AL.: "The erythropoietin receptor gene: Cloning and identification of multiple transcripts in an Erythroid Cell Line OCIMI.", EXPERIMENTAL HEMATOLOGY, vol. 19, no. 9, October 1991 (1991-10-01), pages 973 - 977, XP002928875 *
SATORU KUMAKI ET. AL.: "Cloning of the mouse inteleukin 2 receptor gamma chain: demonstration of functional differences between the mouse and human receptors.", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATION, vol. 193, no. 1, 28 May 1993 (1993-05-28), pages 356 - 363, XP002828874 *
See also references of EP1152059A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000068381A1 (en) * 1999-05-11 2000-11-16 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor mouse zcytor10

Also Published As

Publication number Publication date
EP1152059A1 (en) 2001-11-07
EP1152059A4 (en) 2005-06-08
AU2574100A (en) 2000-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5634674B2 (ja) 新規ヘモポエチン受容体蛋白質、ｎｒ１０
JP3737793B2 (ja) Ｉｌ−１３受容体ポリペプチド
EP0475746A1 (en) Human and murine interleukin-5 receptor
JP2002539773A (ja) 分泌タンパク質およびそれらをコードする核酸
RU2763320C2 (ru) Грызуны, имеющие сконструированный участок разнообразия тяжелой цепи
WO2001048189A1 (fr) Nouveaux recepteurs couples a une proteine de liaison au guanosine triphosphate, genes de ces derniers, et production et utilisation de ces derniers
CA2299619A1 (en) Human orphan receptor ntr-1
WO2002077230A1 (fr) Variants d'epissage nr10
US20030149236A1 (en) Novel haemopoietin receptor
JPH11235186A (ja) 神経組織のナトリウムチャンネルをコードする核酸
WO2000049149A1 (fr) Nouvelles proteines du type recepteurs des tnf
US20020048787A1 (en) Isolated human transporter proteins, nucleic acid molecules encoding human transporter proteins, and uses thereof
EP1152059A1 (en) Novel cytokine recfptor-like protein
US20020168721A1 (en) TSG-like gene
WO2000056764A1 (en) Dna molecules encoding human clax proteins and their soluble fusion proteins
CA2437571A1 (en) Receptors and membrane-associated proteins
JPWO2000049148A1 (ja) 新規サイトカイン受容体様タンパク質
WO1995027734A1 (en) A dna molecule encoding a mast cell function-associated antigen (mafa)
US20040253668A1 (en) Novel G-protein coupled receptor (GPCR) variants and methods of use thereof
US20020146767A1 (en) Human EMR1-like G protein-coupled receptor
US20030138802A1 (en) Novel protein having signal sequence
US20030162274A1 (en) Isolated human transporter proteins, nucleic acid molecules encoding human transporter proteins, and uses thereof
JP2002000279A (ja) 初期造血に関わるｙｓ６８遺伝子
JPWO2000049149A1 (ja) 新規ｔｎｆ受容体様タンパク質
JPH05219959A (ja) 新規なｄｎａおよびそれによってコードされる蛋白質

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2000 599873

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000904039

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09913728

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000904039

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642