WO2000050456A2 - Kovalent verbrückte insulindimere - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to new insulin analogs, as well as a medicament containing such insulin analogs, a method for producing a medicament for the treatment of diabetes and a method for producing the insulin analogs.
  • the proteohormone insulin is produced in the ß cells of the Langerhans Islands.
  • One of its most important physiological effects is the lowering of the blood sugar level.
  • Insulin deficiency leads to the complex clinical picture of diabetes mellitus (type I), which is characterized by a different glucose metabolism.
  • insulin and insulin analogues are used in pharmaceutical preparations.
  • substitution therapy insulin is administered subcutaneously.
  • hypoglycaemia low blood sugar.
  • new insulin analogs are constantly being sought which are promising in terms of their effectiveness in combination with the reduction of side effects. For example, by swapping the amino acids proline 828 and lysine 629, a fast-acting "insulin lispro"
  • All insulins used to treat diabetes are always monomeric insulin molecules with a molecular weight of around 6000. All monomeric insulin analogs and derivatives have proven to be partial or full agonists of the insulin (S. Gammeltoft, Physiol Rev. 1984 , 64, p. 1321) and show a close correlation between receptor binding and triggering of the biological signal. Only in a few cases, such as with covalently bridged insulin dimers, was there a discrepancy between receptor binding and biological activity (A. Schüttler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, pp. 317-330, M. Weiland, C. Brandenburg, D. Brandenburg, HG Joost, Proc. Natl.
  • insulin dimers have proven useful for differentiating insulin receptors in different tissues (M. Breiner, M. Weiland, W. Becker, D. Müller-Wieland, R. Streicher, M. Fabry, HG Joost, Molecular Pharmacology 1993, 44, p . 271-276). They are therefore of fundamental importance for diagnostics in pathological cases.
  • insulin analogues consisting of two identical or different insulin monomers that are covalently linked to each other via a bridge
  • Insulin monomers are selected from a group comprising human insulin and animal insulins and derivatives of the aforementioned insulins, and wherein at least one of the two insulin monomers of an insulin analog represents a derivative; and physiologically acceptable salts thereof.
  • those analogues are used in which the C-termini of the B-chains are shortened and modified in position B26.
  • the insulin monomers can be bridged by substances suitable for linking proteins. Such substances and methods for linking proteins have been known for a long time.
  • the new insulin analogs have a bridge which is preferably located between the N-terminal amino groups of the B chains of the two insulin monomers and which is particularly preferably formed from a linear or branched bifunctional carboxylic acid residue of the form (CRR ' ) n (CO-) 2 is defined in which n, R, R 'are as defined below for formula I.
  • animal insulins are pork, monkey, beef and chicken insulins.
  • Insulin derivatives are derivatives of the insulins mentioned, which differ from the corresponding, otherwise identical, naturally occurring insulin by substitution and / or deletion of at least one naturally occurring amino acid residue and / or addition of at least one amino acid residue and / or organic residue.
  • an example of an insulin derivative monomer is Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) human insulin
  • an example of a dimeric insulin analogue according to the invention is B1, B1-Sub- [D-Ala B26 ] -Des- (B27-B30) -insuiin-B26-amide insulin dimer.
  • the insulin analogs can be described with the general formula I:
  • X independently of one another is a branched or unbranched Ci-Cio-alkyl group, mono- or polysubstituted aryl group, C 1 -C 10 -alkyl group, mono- or polysubstituted or unsubstituted O-aryl group, an amino acid or a derivative thereof, or a group of the formula NRR 'is;
  • n 0.1, 2 16.
  • the invention further relates to insulin analogs of the formula I, as described above, where X is an amino acid derivative in which the carboxylic acid group is amidated.
  • the invention further relates to insulin analogs of the formula I, as described above, where X is the amino acid sarcosine, the carboxylic acid group of which is amidated.
  • the invention further relates to insulin analogs of the formula I, as described above, the X radicals in the two B chains being different from one another.
  • the invention further relates to insulin analogs of the formula I, as described above, where X is an amino group.
  • the invention further relates to a medicament containing such insulin analogs, a method for producing a medicament for the treatment of diabetes and a method for producing the insulin analogs.
  • the insulin analogs are preactivated in a known manner by bridging two optionally partially protected monomer molecules with the Dicarboxylic acid produced (A. Schüttler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, pp. 317-330).
  • the monomeric analogs can be obtained by means of enzyme-catalyzed semisynthesis or using genetic engineering methods (see examples of the invention).
  • Another object of the invention is accordingly a method for producing the insulin analogs as described above, wherein
  • the monomeric insulin analogs are obtained by means of enzyme-catalyzed semisynthesis or by means of genetic engineering methods, (b) the monomeric insulin analogs from step (a) are optionally partially protected by protective groups; (c) the protected monomeric insulin analogues from step (b) and / or the monomeric insulin analogues from step (a) are reacted with a preactivated dicarboxylic acid, and (d) the insulin analogs obtained in step (c) are isolated from the reaction mixture.
  • the dimers according to the invention are distinguished by particularly high affinity for insulin receptors and superpotency in vitro, the latter up to twenty times the insulin action.
  • the novel dimers In contrast to the covalent insulin dimers known to date, the novel dimers have very high bioactivities. The ratio of bioactivity to receptor binding is at least 2, sometimes even 4 to 5. They are therefore biologically much more effective. If you compare these quotients with those of the B1, B1'-suberoyl dimer described in the literature, the result is at least a factor of 11 (0.18: 2) and a maximum of 28.
  • the advantages achieved with the insulin dimers according to the invention consist primarily in that 1. relative to insulin and all analogues currently used therapeutically, a relative hepatoselectivity and thus a more physiological mode of action (primary place of action of the liver and not the periphery) can be expected,
  • Alox aluminum oxide (Al 2 0 3 )
  • the peptide synthesis was carried out on a 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) phenoxy resin using the Fmoc protecting group tactics.
  • the Fmoc amino acid esters used for the coupling were formed by the TBTU / HOBt method and used in a 3-molar excess, based on the nominal resin loading.
  • the peptide synthesis was carried out according to the following synthesis protocol: Reagents / Time Repeats
  • the peptide was cleaved from the resin by acidolysis by adding 10 ml of the cleavage solution composed of 95% TFA, 4% H 2 0 and 1% triethylsilane as a cation scavenger. After stirring at room temperature for 2 hours, the resin was filtered off and washed thoroughly with dichloromethane. The filtrate was evaporated to dryness.
  • the peptide was further purified by RP-MPLC column chromatography with a linear 2-propanol gradient (0-40% 2-propanol in 400 ml each of 0.07% TFA start and feed buffer). Nucleosil 20 -C 8 served as the stationary phase. The flow rate was 180-200 ml / h (82.6% yield).
  • the shortened C-terminus of the B chain insulin was synthesized by enzymatic coupling of the tetrapeptide to N ⁇ A1 -Msc-Des- (B23-B30) insulin.
  • native insulin had to be broken down enzymatically to DOI, which was then partially provided with a protective group.
  • the further purification of the insulin derivative is carried out by preparative RP-HPLC using a Nucleosil 100-10C 8 (2.0 cm in diameter, 25.0 cm in length with a guard column of 5.0 cm (48.6% yield).
  • MW: 5290, 2nd Synthesis of B1, B1'-Sub- [Sar B26 1-Des- (B27-B30) -insulin-B26-amide insulin dimer 100 mg (18.9 ⁇ mol) N ⁇ A1 -Msc- [Sar ß26 ] -des- (B27 -B30) -insulin-B26-amide are dissolved with the addition of 5.5 equivalents of HOBt in 400 ⁇ l DMSO, 8.7 ⁇ l DMF and 9.5 ⁇ l NMM.
  • Tab. 1 Yields, purities according to RP-HPLC and CZE and masses in the synthesis of B1, B1'-sub- [Sar B26 ] -Des (B27-B30) -insulin-B26-amide insulin dimer
  • This truncated insulin dimer was synthesized analogously to the synthesis described in inventive example 1, with the exception that the synthetic tetrapeptide Gly-Phe-Phe-D-Ala-NH 2 was used. The corresponding yields, purities and masses are shown in Table 2.
  • This truncated insulin dimer was synthesized analogously to the synthesis described in inventive example 1, with the exception that the synthetic tetrapeptide Gly-Phe-Phe-Glu-NH 2 was used.
  • Table 3 shows the corresponding yields, purities and masses.
  • the biological properties of the dimers B1, B1'-Sub- [Sar, D-Ala or Glu B26 ] -Des (B27-B30) -insulin-B26-amide dimers described in Examples 1-3 were determined on the one hand by means of the receptor binding on the other hand, based on the bioactivity in vitro. Receptor binding was determined using displacement studies on IM-9 lymphocytes. The relative biological activity was determined on cultured 3T3-L1 adipocytes in the form of glucose transport. Table 4 shows the binding affinities and the relative biological activities of the synthesized insulin dimers.
  • Tab. 4 Relative receptor binding (determined on IM-9 lymphocytes) and relative biological activities (determined on cultivated 3T3-L1 adipocytes) of all insulin dimers in comparison to native insulin.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Insulinanaloga der Formel (I), wobei X unabhängig voneinander eine verzweigte oder unverzweigte C1-C10-Alkylgruppe, einfach oder mehrfach substituierte Arylgruppe, C1-C10-Alkylgruppe, einfach oder mehrfach substituierte oder unsubstituierte O-Arylgruppe, eine Aminosäure oder ein Derivat davon, oder eine Gruppe der Formel NRR' ist; R, R'=H, NH2, ein verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylrest oder eine einfach oder mehrfach substituierte oder unsubstituierte Arylgruppeist; n=0, 1, 2, ...16 ist, sowie ein Arzneimittel enthaltend solche Insulinanaloga, ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes sowie ein Verfahren zur Herstellung der Insulinanaloga.

Description

Kovalent verbrückte Insulindimere
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf neue Insuiinanaloga, sowie ein Arzneimittel enthaltend solche Insuiinanaloga, ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes sowie ein Verfahren zur Herstellung der Insulinanaloga.
Das Proteohormon Insulin wird in den ß-Zellen der Langerhansschen Inseln gebildet. Zu seiner wichtigsten physiologischen Wirkung gehört die Senkung des Blutzuckerspiegels. Insulinmangel führt zu dem komplexen Krankheitsbild des Diabetes mellitus (Typ I), das durch einen abweichenden Glukosestoffwechsel charakterisiert ist.
Zur Behandlung von Diabetes mellitus werden Insulin und Insulinanaloga in pharmazeutischen Zubereitungen eingesetzt. Bei der gebräuchlichsten Therapieform, der Substitutionstherapie, wird Insulin subcutan verabreicht. Als häufigste Nebenwirkung tritt dabei die Hypoglykämie (Unterzuckerung) auf. Trotz der stetigen Entwicklung pharmazeutischer Insulinzubereitungen für die Diabetestherapie wird ständig nach neuen Insuiinanaloga gesucht, die vielversprechend im Hinblick auf ihre Wirksamkeit in Kombination mit der Reduzierung von Nebenwirkungen sind. So wurde beispielsweise durch Vertauschen der Aminosäuren Prolin828 und Lysin629 ein schnellwirkendes "Insulin lispro"
(EP 0 383 472 B1 ) entwickelt. Ebenfalls entwickelt wurde durch Fettsäure-Acylierung an der ε-Aminogruppe des Lysins829 ein langwirkendes Insulinderivat (J. Markussen, S. Havelund, P. Kurtzhals, A.A. Andersen, J. Halstram, E. Hasselager, U.D. Larsen, U. Ribel, L Schäffer, K. Vad, I. Jonassen, Diabetologia 1996, 39, S. 281-288). Zwar läßt sich der zeitliche Verlauf der Insulinwirkung durch derartige Abwandlungen der nativen Struktur des humanen Insulins beeinflussen, wesentliche Probleme sind jedoch noch nicht gelöst: Es gibt noch kein therapeutisch anwendbares Insulinanalogon, welches durch auch nur partielle Gewebsspezifität, insbesondere eine Hepatoselektivität, eine gezieltere, den physiologischen Bedingungen entsprechende Therapie erlaubt. Ebensowenig ist ein Analogon bekannt, das infolge größerer Wirkstärke in geringeren Mengen als Humaninsulin oder tierisches Insulin nativer Struktur eingesetzt werden könnte.
Bei sämtlichen Insulinen, die zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden, handelt es sich immer um monomere Insulinmoleküle mit einer Molmasse um 6000. Alle monomeren Insuiinanaloga und -derivate haben sich als partielle oder volle Agonisten des Insulins erwiesen (S. Gammeltoft, Physiol Rev. 1984, 64, S. 1321 ) und zeigen eine enge Korrelation zwischen Rezeptorbindung und Auslösung des biologischen Signals. Nur in wenigen Fällen, wie beispielsweise bei kovalent verbrückten Insulindimeren, wurde eine Diskrepanz zwischen Rezeptorbindung und biologischer Aktivität beobachtet (A. Schüttler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, S. 317-330, M. Weiland, C. Brandenburg, D. Branden- bürg, H.G. Joost, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1990, 87, S. 1154-1158). Weiterhin haben sich die Insulindimere zur Differenzierung von Insulinrezeptoren in verschiedenen Geweben bewährt (M. Breiner, M. Weiland, W. Becker, D. Müller- Wieland, R. Streicher, M. Fabry, H.G. Joost, Molecular Pharmacology 1993, 44, S. 271-276). Damit sind sie von grundsätzlicher Bedeutung für die Diagnostik in pathologischen Fällen.
Bei allen bisher beschriebenen Dimeren handelt es sich um die kovalente Verbrückung zweier Insuline in ihrer nativen Länge. Insulindimere sind prinzipiell für die Therapie von besonderem Interesse, da sie im Tierexperiment eine relative Hepatoselektivität zeigen (demonstriert für B1 ,B1 '-Suberoyl-Insulindimer mit nativer Insulinstruktur, F. Shojaee-Moradie, N.C. Jackson, M. Boroujerdi, D. Brandenburg, P.H. Sönksen, R.H. Jones, Diabetologia 1995, 38, S. 1007-1013) und damit eine physiologischere Senkung des Blutzuckerspiegels erlauben als alle zur Zeit in der Diabetestherapie eingesetzten Insuline. Das dort eingesetzte B1 ,B1'-Suberoyl- Insulindimer hat jedoch eine wesentlich geringere Bioaktivität in vitro als
Rezeptorbindung (28,8% gegenüber 157 - 199%, M.A. Tatneil, R.H. Jones, K.P. Willey, A. Schüttler, D. Brandenburg, Biochem. J. 1983, 216, S. 687-694). Das Verhältnis Bioaktivität zu Rezeptorbindung ist also mit 0,15 - 0,18 sehr niedrig. Über eine Anwendung bzw. Weiterentwicklung dieser Befunde in Richtung Diabetestherapie ist uns nichts bekannt.
Wir haben jetzt neuartige Insulindimere konzipiert und synthetisiert, die aufgrund ihrer Eigenschaften vielversprechend im Hinblick auf eine Lösung der oben genannten Probleme und eine verbesserte Diabetestherapie sind und im folgenden auch als Insulinanaloga bezeichnet werden. Dabei ist gegenüber der bisherigen Therapie mit monomeren Insulinen das einzigartige an unserem Ansatz, daß Insulinanaloga bestehend aus zwei gleichen oder verschiedenen Insulinmonomeren, die über eine Brücke kovalent miteinander verbunden sind, wobei die
Insulinmonomere ausgewählt werden aus einer Gruppe enthaltend Humaninsulin und tierische Insuline und Derivate von den vorgenannten Insulinen, und wobei mindestens eines der beiden Insulinmonomere eines Insulinanalogons ein Derivat darstellt; und physiologisch akzeptable Salze davon, verwendet werden. Insbesondere werden solche Insuiinanaloga verwendet, bei denen die C-Termini der B-Ketten verkürzt und in Position B26 modifiziert sind. Die Verbrückung der Insulinmonomere kann durch zur Verknüpfung von Proteinen geeigneter Substanzen erfolgen. Solche Substanzen und Verfahren zur Verknüpfung von Proteinen sind seit langem bekannt. Insbesondere besitzen die neuen Insulinanaloga eine Brücke, die bevorzugt zwischen den N-terminalen Aminogruppen der B-Ketten der beiden Insulinmonomere lokalisiert ist, und die besonders bevorzugt aus einem linearen oder verzweigten bifunktionellen Carbonsäurerest der Form (CRR')n(CO-)2 gebildet wird, bei dem n, R, R' wie unten bei Formel I ausgeführt, definiert sind. Beispiele für tierische Insuline sind die Insuline vom Schwein, Affen, Rind, und Huhn. Insulinderivate sind Derivate von den genannten Insulinen, welche sich durch Substitution und/oder Deletion wenigstens eines natürlich auftretenden Aminosäurerests und/oder Addition wenigstens eines Aminosäurerests und/oder organischen Rests von dem entsprechenden, ansonsten gleichen natürlich vorkommenden Insulin unterscheiden. Ein Beispiel für ein Insulinderivatmonomer ist Gly(A21 ), Arg (B31 ), Arg (B32) Humaninsulin, ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes dimeres Insulinanalogon ist B1 ,B1-Sub-[D-AlaB26]-Des-(B27- B30)-insuiin-B26-amid Insulindimer. Insbesondere lassen sich die Insulinanaloga mit der aligemeinen Formel I beschreiben:
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wobei
X unabhängig voneinander eine verzweigte oder unverzweigte Ci-Cio- Alkylgruppe, einfach oder mehrfach substituierte Arylgruppe, C1-C10- Alkylgruppe, einfach oder mehrfach substituierte oder unsubstituierte O- Arylgruppe, eine Aminosäure oder ein Derivat davon, oder eine Gruppe der Formel NRR' ist;
R, R' H, NH2, ein verzweigter oder unverzweigter Cι-Cι0-Alkylrest oder ein einfach oder mehrfach substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe ist;
n 0,1 , 2 16 ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Insuiinanaloga der Formel I, wie oben beschrieben, wobei X ein Aminosäurederivat ist, bei welchem die Carbonsäuregruppe amidiert ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Insulinanaloga der Formel I, wie oben beschrieben, wobei X die Aminosäure Sarcosin ist, deren Carbonsäuregruppe amidiert ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Insulinanaloga der Formel I, wie oben beschrieben, wobei die X -Reste in den beiden B-Ketten voneinander verschieden sind.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Insulinanaloga der Formel I, wie oben beschrieben, wobei X eine Aminogruppe ist.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Arzeimittel enthaltend solche Insulinanaloga, ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes sowie ein Verfahren zur Herstellung der Insulinanaloga.
Die Insulinanaloga werden in bekannter Weise durch Verbrücken von zwei gegebenenfalls partiell geschützten monomeren Molekülen mit der voraktivierten Dicarbonsäure hergestellt (A. Schüttler, D. Brandenburg, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, S. 317-330). Die monomeren Analoga lassen sich mittels enzymkatalysierter Semisynthese oder mit gentechnischen Methoden gewinnen (siehe Erfindungsbeispiele).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung der Insulinanaloga wie oben beschrieben, wobei
(a) die monomeren Insuiinanaloga mittels enzymkatalysierter Semisynthese oder mittels gentechnischer Methoden gewonnen werden, (b) die monomeren Insulinanaloga aus Schritt (a) optional durch Schutzgruppen partiell geschützt werden; (c) die geschützten monomeren Insuiinanaloga aus Schritt (b) und/oder die monomeren Insulinanaloga aus Schritt (a) mit einer voraktivierten Dicarbonsäure umgesetz werden, und (d) die in Schritt (c) erhaltenen Insulinanaloga aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.
Verglichen mit Humaninsulin und monomeren Insulinanaloga zeichnen sich die erfindungsgemäßen Dimeren durch besonders hohe Affinität zu Insulinrezeptoren und Superpotenz in vitro aus, letztere bis zum zwanzigfachen der Insulinwirkung.
Im Gegensatz zu den bisher bekannten kovalenten Insulindimeren weisen die neuartigen Dimere sehr hohe Bioaktivitäten auf. Das Verhältnis von Bioaktivität zu Rezeptorbindung ist mindestens 2, teilweise sogar 4 bis 5. Sie sind damit biologisch wesentlich effektiver. Vergleicht man diese Quotienten mit denen des in der Literatur beschriebenen B1 ,B1'-Suberoyl-Dimeren, ergibt sich mindestens ein Faktor von 11 (0,18 : 2), und maximal von 28.
Die mit den erfindungsgemäßen Insulindimeren erzielten Vorteile bestehen vor allem darin, daß 1. gegenüber Insulin und allen zur Zeit therapeutisch eingesetzten Analoga mit einer relativen Hepatoselektivität und damit einer physiologischeren Wirkungsweise (primärer Wirkort Leber und nicht Peripherie) zu rechnen ist,
2. gegenüber bisher bekannten Insulindimeren erstmalig eine wesentlich verbesserte biologische Effektivität vorhanden ist,
3. die im Vergleich zu Insulin und monomeren Analoga wesentlich erhöhte biologische Aktivität sich bei der Anwendung sehr vorteilhaft erweisen kann, da ein äquivalenter Effekt mit deutlich geringeren Mengen an Wirkstoff zu erreichen wäre.
Erfindungsbeispiele
Abkürzungen
Ac Acetat (CH3COO-)
Äq. Äquivalente
Alox Aluminiumoxid (Al203)
AS Aminosäure
CZE Kapillarzonenelektrophorese
DIPEA N,N-Diisopropylethylamin
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DOI Desoktapeptidinsulin
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt 1 -Hydroxybenzotriazol
HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie
MALDI Matrix-assisted laser desorption / ionization
MPLC Mitteldruckflüssigchromatographie
Msc Methylsulfonylethoxycarbonyl
MW Molekulargewicht
NaOH Natriumhydroxid
NMM N-Methylmorpholin RP reversed phase
ONSu N-Oxysuccinimid-ester
Sar Sarcosin
Sub Suberoyl
TBTU 2-(1 H-Benzotriazol-1-yl)-1 ,1 ,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat
TEA Triethylamin
TFA Trifluoressigsäure
TOF time of flight
TPCK Tosyl-L-phenylalanyi-chlormethylketon
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Erfindungsbeispiel 1 Synthese von
B1 ,B1 '-Sub-[SarB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer
Synthese des Tetrapeptids Gly-Phe-Phe-Sar-NH2
Die Peptidsynthese erfolgte an einem 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)- phenoxy Harz unter Verwendung der Fmoc-Schutzgruppentaktik. Die zur Kupplung verwendeten Fmoc-Aminosäureester wurden nach der TBTU/HOBt-Methode gebildet und im 3-molaren Überschuß, bezogen auf die nominale Harzbeladung, eingesetzt. Die Peptidsynthese erfolgte nach folgendem Syntheseprotokoll: Reagenzien / Zeitdauer Wiederholungen
Nr. Operation Lösungsmittel
1 Anschwellen des DMF 1 min. einmal Harzes
2 Abspaltung der 20% Piperidin 6 min. dreimal Fmoc-Gruppe in DMF
3 Waschen DMF 0,5 min. dreimal
4 Waschen 2-Propanol 0,5 min. zweimal
5 Kaiser Test*
6 Anschwellen des DMF 1 min. einmal Harzes
7 Kupplung der AS 3 Äq. Fmoc-AS, 45 min. einmal jeweils 3 Äq. TBTU, HOBt und 4,5 Äq. NMM in 5 ml DMF
8 Waschen DMF 0,5 min. dreimal
9 Waschen 2-Propanol 0,5 min. zweimal
10 Kaiser Test**
11 Anschwellen des DMF 1 min. einmal Harzes
12 Blockierung nicht 400 μl Ac2O und einmal umgesetzter 200 μl DIPEA in 10 min.
Amino-Endgruppen 5 ml DMF
13 Waschen DMF 0,5 min.
14 Waschen 2-Propanol 0,5 min.
*) fahre fort, wenn der Test positiv ist
**) fahre fort, wenn der Test negativ ist. Ist das Testergebnis allerdings positiv, wiederhole dann die Schritte 6-9.
Die Abspaltung des Peptids vom Harz erfolgte acidolytisch durch Zugabe von 10 ml der Abspaltungslösung aus 95% TFA, 4% H20 und 1% Triethylsilan als Kationen- fänger. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das Harz abfiltriert und gründlich mit Dichlormethan gewaschen. Das Filtrat wurde bis zur Trockene eingeengt. Die weitere Reinigung des Peptids erfolgte mittels RP-MPLC Säulenchromatographie mit einem lineraen 2-Propanol Gradienten (0-40% 2-Propanol in jeweils 400 ml 0,07% TFA Start- und Zulaufpuffer). Als stationäre Phase diente Nucleosil 20- Cι8. Die Flußrate betrug 180-200 ml/h (82,6% Ausbeute).
Semisynthese von [SarB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid
Das Insulin mit verkürztem C-Terminus der B-Kette wurde durch enzymatische Kupplung des Tetrapeptids an NαA1-Msc-Des-(B23-B30)-insulin synthetisiert. Dazu mußte zunächst natives Insulin enzymatisch zu DOI abgebaut werden, welches anschließend partiell mit einer Schutzgruppe versehen wurde.
Synthese von Des-(B23-B30)-insulin
300 mg (51 ,66 μmol) Insulin werden in 60 ml Reaktionspuffer (0,05 M Tris, 1 mmol CaCI2) aufgenommen. Nach Einstellen des pH Werts auf 9,5 mit festem Tris wird der proteolytische Abbau durch Zugabe von 16 mg TPCK-behandeitem Trypsin gestartet. Es werden ca. 6 h bei 37°C im Wasserbad inkubiert, wobei die Reaktion mittels RP-HPLC kontrolliert wird. Die Reaktion wird durch Zugabe von 4 ml Eisessig gestoppt und der Reaktionsansatz am Rotationsverdampfer eingeengt. Die Aufarbeitung erfolgt zunächst über eine Sephadex G-25f- und anschließend über «ine Sephadex G-50f-Gelfiltration. Das Produkt wird lyophilisiert (73,3% Ausbeute). MW: 4865
Synthese von NαA1-(Msc)-Des-(B23-B30)-insulin
300 mg (61 ,66 μmol) Des-(B23-B30)-insulin werden unter Zusatz von 225 μl TEA in 22,5 ml DMSO gelöst. Unter leichtem Rühren wird eine Lösung von 18 mg (67,86 μmol) Msc-ONSu in 5 ml DMSO hinzugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 20 min. wird die Reaktion durch Zugabe von 750 μl Eisessig gestoppt und die Reaktionslösung 16 h bei 4°C gegen entmineralisertes Wasser dialysiert. Das Retentat wird gefriergetrocknet. Zur weiteren Reinigung werden eine lonenaustausch-Chromatographie an SP-Sepharose (pH 3; 350 ml Startpuffer, 350 ml 0,09 M NaCI-Zulaufpuffer) und Entsalzung über Sephadex G-25f durch- geführt. Das Produkt wird lyophilisiert (30,8% Ausbeute). MW: 5015,16
Tryptische Kupplung von Gly-Phe-Phe-Sar-NH an NctA -(Msc)-Des- (B23-B30)-insulin 132,75 mg (300 μmol) Gly-Phe-Phe-Sar-NH2 und 150,45 mg (30 μmol) N^-Msc- Des-(B23-B30)-insulin werden in 2 ml DMF (über Alox gerührt), 2 ml 1 ,4-Butandiol und 400 μl 0,05 M Ca(CH3COO)2-Lösung gelöst bzw. suspendiert. Mit NMM wird der apparente pH auf 6,7-7,0 eingestellt. Anschließend werden 23 mg TPCK- behandeltes Trypsin, gelöst in 100 μl 0,05 M Ca(CH3COO)2-Lösung, dem Reaktions- gemisch zugefügt. Während der Reaktionszeit wird der Verlauf der Reaktion mittels RP-HPLC verfolgt und der pH-Wert überprüft und gegebenfalls mit NMM nachgestellt. In 4,5 h läßt sich ein Umsatz von knapp 90% erzielen. Die Reaktion wird durch Zugabe vom 4,5 ml 30%iger Essigsäure gestoppt. Das Enzym, das Peptid und weitere niedermolekulare Substanzen werden mittels einer Sephadex G-50f Gelchromatographie abgetrennt. Nicht umgesetztes Peptid wird anschließend über RP-MPLC gereinigt und wieder zurückgewonnen. Die weitere Reinigung des Insulinderivats erfolgt über präparative RP-HPLC über eine Nucleosil 100-10C8 (2,0 cm Durchmesser, 25,0 cm Länge mit einer Vorsäule von 5,0 cm (48,6% Ausbeute). MW: 5290,2 Synthese von B1 ,B1'-Sub-[SarB261-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer 100 mg (18,9 μmol) NαA1-Msc-[Sarß26]-des-(B27-B30)-insulin-B26-amid werden unter Zusatz von 5,5 Äquivalenten HOBt in 400 μl DMSO, 8,7 μl DMF und 9,5 μl NMM gelöst. Nach 30 min. wird mit 0,6 Äquivalenten Korksäure-bis-ONSu-ester in fester Form versetzt und 8-30 h gerührt. Der gesamte Reaktionsansatz wird unter Zugabe von 300 μl Eisessig in 1,5 ml 10%ige Essigsäure aufgenommen und über Sephadex G-50f chromatographiert. Die Dimerfraktion wird lyophilisiert. Zur Abspaltung der Msc-Gruppen werden 100 mg Msc-geschütztes Protein in 5 ml eines Dioxan/Wasser- Gemisches (2/1 , v/v) gelöst und auf 0°C gekühlt. Es wird mit 514 μl 2 N NaOH versetzt und 120 s bei 0°C gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2,2 ml Eisessig gestoppt. Der Reaktionsansatz wird über Sephadex G-25f gelchromato- graphiert und lyophilisiert (11 ,9% Ausbeute).
Die Charakterisierung der Zwischenprodukte und des Endprodukts erfolgte mittels RP-HPLC, saurer CZE sowie MALDI-TOF Massenspektrometrie (Tabelle 1 ).
Tab. 1: Ausbeuten, Reinheiten nach RP-HPLC sowie CZE und Massen bei der Synthese von B1 ,B1'-Sub-[SarB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer
Figure imgf000014_0001
Addukt mit Natrium (M = 23) Erfindungsbeispiel 2
Synthese von
B1 ,B1 '-Sub-[D-AlaB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer
Die Synthese dieses verkürzte Insulindimer erfolgte analog zur der bei Erfindungsbeispiel 1 beschriebenen Synthese mit der Ausnahme, daß das synthetische Tetrapeptid Gly-Phe-Phe-D-Ala-NH2 verwendet wurde. In Tabelle 2 sind die entsprechenden Ausbeuten, Reinheiten und Massen wiedergegeben.
Tab. 2: Ausbeuten, Reinheiten nach RP-HPLC sowie CZE und Massen bei der Synthese von B1 ,B1 '-Sub-[D-AlaB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer
Figure imgf000015_0001
Addukt mit Natrium
Erfindungsbeispiel 3
Synthese von
B1 ,B1 '-Sub-[GluB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer
Die Synthese dieses verkürzte Insulindimer erfolgte analog zur der bei Erfindungsbeispiel 1 beschriebenen Synthese mit der Ausnahme, daß das synthetische Tetrapeptid Gly-Phe-Phe-Glu-NH2 verwendet wurde. Tabelle 3 zeigt die entsprechenden Ausbeuten, Reinheiten und Massen.
Tab. 3: Ausbeuten, Reinheiten nach RP-HPLC sowie CZE und Massen bei der Synthese von B1 ,Br-Sub-[GluB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer
Figure imgf000016_0001
Erfindungsbeispiel 4 Biologische Eigenschaften zu den Erflndungsbeispielen 1-3
Die biologischen Eigenschaften der in den Erfindungsbeispielen 1-3 beschriebenen Dimere B1 ,B1'-Sub-[Sar, D-Ala oder GluB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Dimer wurden einerseits, anhand der Rezeptorbindung andererseits anhand der Bioaktivität in vitro ermittelt. Die Bestimmung der Rezeptorbindung erfolgte mittels Verdrängungsstudien an IM-9 Lymphozyten. Die relative biologische Aktivität wurde an kultivierten 3T3-L1 Adipo- zyten in Form des Glukosetransports bestimmt. In Tabelle 4 sind die Bindungsaffinitäten sowie die relativen biologischen Aktivitäten der synthetisierten Insulindimere wiedergegeben.
Tab. 4: Relative Rezeptorbindung (bestimmt an IM-9 Lymphozyten) sowie relative biologische Aktivitäten (bestimmt an kultivierten 3T3-L1 Adipozyten) sämtlicher Insulindimere im Vergleich zu nativem Insulin.
Dimer Rel. Rezeptor-bindung Rel. biol. Aktivität [%] [%]
B1 ,B1 ,-Sub-[SarB26]-Des-(B27-B30)- 412 ± 94,8 1957 ± 575 insulin-B26-amid Insulindimer
B1 ,B1 '-Sub-[D-AlaB26]-Des-(B27- 357 ± 53,6 814 ± 184
B30)-insuiin-B26-amid Insulindimer
B1 ,B1 '-Sub-[GluB26]-Des-(B27-B30)- 176 ± 45,8 817,5 ± 224 insulin-B26-amid Insulindimer
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Claims

Patentansprüche:
1. Insulinanaloga, bestehend aus zwei gleichen oder verschiedenen Insulinmonomeren, die über eine Brücke kovalent miteinander verknüpft sind, wobei die Insulinmonomere ausgewählt werden aus einer Gruppe enthaltend Humaninsulin, tierische Insuline und Derivate von Humaninsulin und tierischen Insulinen, und wobei in einem Insulinanalogon wenigstens ein Derivat von Humaninsulin oder einem tierischen Insulin enthalten ist; und physiologisch akzeptable Salze davon.
2. Insulinanaloga gemäß Anspruch I, gekennzeichnet durch die Formel I,
Figure imgf000020_0001
wobei
X unabhängig voneinander eine verzweigte oder unverzweigte C1-C10- Alkylgruppe, einfach oder mehrfach substituierte Arylgruppe, Ci-Cio- Alkylgruppe, einfach oder mehrfach substituierte oder unsubstituierte O- Arylgruppe, eine Aminosäure oder ein Derivat davon, oder eine Gruppe der
Formel NRR' ist;
R, R' H, NH2, ein verzweigter oder unverzweigter Cι-Cι0-Alkylrest oder ein einfach oder mehrfach substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe ist;
n 0,1 , 2, 16 ist.
3. Insulinanaloga gemäß Anspruch 2, wobei X eine Aminosäure ist, bei welcher die Carbonsäuregruppe amidiert ist.
4. Insulinanaloga gemäß Anspruch 3, wobei X die Aminosäure Sarcosin ist.
5. Insulinanaloga gemäß einem oder mehreren der Anspruch 2 oder 3, wobei die X Reste in den beiden B-Ketten voneinander verschieden sind.
6. Insuiinanaloga gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 2 oder 3, wobei X eine Aminogruppe ist.
7. B1,B1-Sub-[SarB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer.
8. B1 ,B1-Sub-[D-AlaB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer.
9. B1,B1-Sub-[GluB26]-Des-(B27-B30)-insulin-B26-amid Insulindimer.
10. Pharmazeutische Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein
Insulinanalogon nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-9 und Zusätze ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Zinksalze, Phenol, m-Kresol, Glycerin und Puffersubstanzen, enthalten.
11. Ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes enthaltend ein Insulinanalogon nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-9.
12. Insulinanaloga nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-9 zur Verwendung als Arzneimittel.
13. Diagnosekit enthaltend ein oder mehrere Insulinanaloga nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-9.
14. Verfahren zur Herstellung der Insulinanaloga gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, wobei (a) die monomeren Insulinanaloga mittels enzymkatalysierter Semisynthese oder mittels gentechnischer Methoden gewonnen werden,
(b) die monomeren Insulinanaloga aus Schritt (a) optional durch Schutzgruppen partiell geschützt werden;
(c) die geschützten monomeren Insulinanaloga aus Schritt (b) und/oder die monomeren Insuiinanaloga aus Schritt (a) mit einer voraktivierten Dicarbonsäure umgesetz werden, und
(d) die in Schritt (c) erhaltenen Insulinanaloga aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.
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