WO2000052174A1 - Gene de synthase de sakuranetine - Google Patents

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WO2000052174A1
WO2000052174A1 PCT/JP2000/001306 JP0001306W WO0052174A1 WO 2000052174 A1 WO2000052174 A1 WO 2000052174A1 JP 0001306 W JP0001306 W JP 0001306W WO 0052174 A1 WO0052174 A1 WO 0052174A1
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nomt
rice
protein
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Osamu Kodama
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Japan Science and Technology Corp
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Definitions

  • the present invention relates to rice-derived sakuranetin synthase (naringenin 7-0-methyltransferase (NOMT)) geno ADNA and a region of the promoter of the genomic DNA.
  • rice-derived sakuranetin synthase naringenin 7-0-methyltransferase (NOMT)
  • Plants have resistance to invasion of pathogenic bacteria and the like, such as production of phytoalexin.
  • Flavonoids are generally considered to have a function to protect plants from stress such as ultraviolet irradiation.
  • O-methyltransferase an enzyme involved in the biosynthesis of flavonoids, has been isolated and purified from many plant tissues and cultured cells (Pakusch AE et al., Arch. Biochem. Biophys. 271: 488-494 (198 9); Wanek W et al., Planta. 197: 427-434 (1995)).
  • O-methyltransferase is involved in the biosynthesis of sakuranetin, and the 7-hydroxyl group of naringenin (5,7,4, -trihydroxyflavanone), which is a flavanone by naringenin 7-O-methyltransferase.
  • Sakuranetin is synthesized by methylation. Since naringenin is present in many plants, introduction of DNA capable of expressing naringenin 7-O-methyltransferase into a plant can induce sakuranetin from naringenin in the plant, thereby allowing plant It is considered that excellent antibacterial properties can be imparted.
  • An object of the present invention is to provide a DNA capable of expressing naringenin 7- ⁇ methyltransferase when introduced into a plant. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that naringenin 7-dimethyl isolated and purified from rice plants subjected to stress such as ultraviolet irradiation, jasmonic acid treatment, and copper chloride treatment.
  • the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) and the C-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of transferase (hereinafter referred to as “NOMT”) were successfully determined.
  • the present invention provides the following (1) to (12).
  • DNA comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, which is introduced into rice or other plant cells.
  • DNA that can express a protein having naringenin 7- ⁇ -methyltransferase activity when it is used.
  • a DNA comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 13, which is rice or other plants, animals, fungi, or bacteria DNA capable of expressing a protein having naringenin 7-O-methyltransferase activity when introduced into cells of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing the positions of introns and exons in rice NOMT genomic DNA (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 3.
  • FIG. 2 is a view showing predicted binding positions of primers F2 and R2 in rice NOMT genomic DNA (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 3.
  • FIG. 3 is a diagram showing positions of exons in the rice NOMT genome DNA (SEQ ID NO: 6) obtained in Example 4.
  • FIG. 4 is a view showing a protein coding region in the rice NOMT genome DNA (SEQ ID NO: 6) obtained in Example 4.
  • FIG. 5 shows a comparison between the amino acid sequence deduced from the genome sequence (SEQ ID NO: 3) and the partial amino acid sequence (SEQ ID NOs: 4 and 5) obtained from the primary structure of the purified protein.
  • FIG. 6 is a diagram showing a process for determining the sequence of rice NOMT genome DNA (SEQ ID NO: 6). Brief description of the sequence listing
  • SEQ ID NO: 8 Synthetic primer for PCR
  • SEQ ID NO: 9 Synthetic primer for PCR
  • SEQ ID NO: 10 Synthetic primer for PCR
  • SEQ ID NO: 11 Synthetic primer for PCR
  • the first (hereinafter referred to as "first invention") of the present invention is a DNA shown in the following (a) or (b).
  • DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 can be obtained, for example, by the following steps (1) to (3).
  • the rice genome DNA library can be prepared according to a conventional method.
  • the most efficient rice genome DNA library is the BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library of the rice genome.
  • the BAC library of the rice genome includes, for example, the Research Institute for Bioresources, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries An example of a BAC library covering seven rice (Shimokita) genomes in the laboratory can be shown.
  • the BAC library of rice (Shimokita) genome is organized as about 20,000 clones, and the target clone can be easily and efficiently extracted.
  • a clone containing rice NOMT genomic DNA can be selected, for example, by screening a BAC library of rice genome according to a conventional method.
  • Methods for selecting clones containing rice NOMT genomic DNA from a rice BAC library include colony hybridization using a probe consisting of a nucleotide sequence that can specifically hybridize to rice NOMT genome DNA, plaque A hybridization method can be exemplified.
  • the nucleotide sequence of the probe used at that time can be determined based on the amino acid sequence of rice NOMT (SEQ ID NO: 3). Can be synthesized.
  • the selected BAC clone fragment digested with the appropriate restriction enzymes was subjected to Southern analysis using the above probe, and the rice NOMT genomic DNA fragment in the clone was identified.Then, the clone was cloned again into an appropriate vector, and Maxam's Gilbert
  • the nucleotide sequence can be determined using the method, the Sanger method, or an automated modification thereof. At this time, if a large-capacity binary vector, PBIGRZ, is used, a large fragment containing the promoter region can be stably retained, and a plant can be directly transformed using this vector.
  • a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 in which one or more nucleotides have been deleted, substituted or added, and when introduced into rice cells, naringenin 7-O-methyltransfection DNA capable of expressing a protein having an elastase activity can be obtained by a technique commonly used at the time of filing the present application, for example, by site-directed mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982). Can be.
  • the rice NOMT genomic DNA is made into a single-stranded state, an oligonucleotide designed to introduce a mutation is annealed to the single-stranded state, and then double-stranded by polymerase or the like, and then the strand into which the mutation is introduced.
  • the desired DNA can be obtained.
  • the number and position of bases to be deleted, substituted or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 are not particularly limited as long as they can express a protein having NOMT activity when introduced into rice cells.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 6 includes a promoter region and a NOMT coding region.
  • the promoter region corresponds to the region (SEQ ID NO: 2) represented by nucleotides 1 to 1428 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 obtained in Example 3 below
  • the NOMT coding region corresponds to the sequence It corresponds to the region represented by bases 1429 to 1859 and 3607 to 4279 in the salt S sequence described in No. 1 (FIG. 1).
  • the amino acid sequence of NOMT encoded by the NOMT coding region is as described in SEQ ID NO: 3. Therefore, “deletion, substitution or addition” in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 includes “deletion, substitution or addition” in the motor region and NOMT coding region.
  • the number and position of bases deleted, substituted or added in the promoter region are not particularly limited as long as the promoter activity of the promoter region is not lost. Further, the number and position of bases deleted, substituted or added in the NOMT coding region are not particularly limited as long as they encode a protein having NOMT activity.
  • the protein having NOMT activity in addition to the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, or added. Includes proteins consisting of amino acid sequences and having NOMT activity.
  • the host cell can be prepared by inserting the DNA of the first invention into an appropriate vector and introducing it into an appropriate host cell. In this, a protein having NOMT activity can be efficiently expressed.
  • the vector into which the DNA of the first invention is incorporated is not particularly limited.
  • pUC18, pUC19, pBluescript, pBR322, pBI121, pBIGRZ, TAC and the like can be used.
  • a suitable gene or reporter gene may be inserted into the vector.
  • the marker gene include resistance genes of antibiotics such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, neomycin, hygromycin, and spectinomycin.
  • reporter genes include: genes encoding 3-dalcuronidase (GUS), luciferase (LUX), green fluorescent protein (GFP), and the like.
  • the host cell into which the vector is introduced is not particularly limited as long as it is compatible with the vector incorporating the DNA of the first invention and can be transformed.
  • Various cells such as recombinant cells can be used.
  • plant cells eg, rice, cucumber, tomato, oats, potato, Corn
  • animal cells eg, mouse, rat, chick
  • insect cells eg, silkworm
  • filamentous fungi eg, Aspergillus
  • bacteria eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis
  • yeast and the like
  • the introduction of the vector into a host cell can be performed using a known method. For example, a protoplast method, a lithium method, an electroporation method, a calcium chloride method, or a modified method thereof can be used.
  • the plant cell After introducing the vector incorporating the DNA of the first invention into a plant cell, the plant cell is differentiated, whereby a recombinant plant having the DNA of the first invention in each cell can be obtained.
  • a method for introducing a gene into a plant cell for example, a method using an agrobacterium, an electrolysis method, a polyethylene glycol method, a microinjection method, a minute object collision method, and the like can be used.
  • the method is not limited to these as long as the method can introduce the gene into the target plant cell.
  • the host plant species is not particularly limited as long as it is a plant species that can be transformed by being compatible with the vector incorporating the DNA of the first invention.
  • a plant species that can be transformed by being compatible with the vector incorporating the DNA of the first invention for example, in dicotyledonous plants, cucumber, tomato, Chinese cabbage, potato, Cabbage, soybean, rape, etc. can be used, and rice, corn, corn, wheat, etc. can be used for monocotyledonous plants.
  • the differentiation of the plant cell into which the vector incorporating the DNA of the first invention has been introduced can be performed according to a conventional method.
  • a leaf disk method is used as a method for introducing genes into plant cells
  • a leaf disk collected from aseptic leaves of a plant that has been aseptically cultured is immersed in a culture solution of Agrobacterium ummefaciens EHA101, and then the foliage fraction is removed. Cultivation and growth in a culturing medium.
  • a foliage differentiation medium for example, a medium obtained by adding a plant hormone (eg, 2,4-D, NAA, potato-inetin) to a known medium such as an MS medium can be used. Thereafter, callus is selected using a foliage differentiation medium for selection.
  • a plant hormone eg, 2,4-D, NAA, potato-inetin
  • the selection medium a medium obtained by adding kanamycin, cefotaxime, or the like to a foliage differentiation medium can be used.
  • the plant cells can be further differentiated. Thereafter, the rooted seedlings are transferred to soil and cultivated to obtain plantlets.
  • the protein having NOMT activity expressed by introducing the DNA of the first invention into a host cell can methylate the hydroxyl group at the 7-position of naringenin and synthesize sakuranetin from naringenin. And Sakuranetin can function as a phytolexin. Therefore, it is considered that by introducing the DNA of the first invention into a plant, sakuranetin can be derived from naringenin in the plant, thereby imparting the antibacterial property of the plant.
  • the second (hereinafter referred to as “second invention”) of the present invention is a DNA shown in the following (a) or (b).
  • a DNA comprising a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 12, and when introduced into rice cells, naringenin 7-0 —DNA capable of expressing a protein having methyltransferase activity.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is a rice NOMT cDNA.
  • DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 can be prepared using oligo dT latex beads or magnetic beads as described in, for example, Plant Molecular Biology Manual D51-13 (edited by Gelvin, ST et al., 1994).
  • RNA fraction was prepared from rice green leaves that had been stressed by CuCl 2 or UV irradiation, and then the above mRNA was made into type I, oligo dT was used as a primer, and, for example, Current Protocols in Molecular Biology; It can be synthesized with a reverse transcriptase using a known method as described in Section 5.5 (published by John Wiley & Sons).
  • primers to set up primers to create double-stranded DNA to be cloned into an appropriate vector, and to enable cloning of double-stranded cDNA, use a single-stranded oligo DNA adapter It may be ligated at the 5 'end.
  • the cDNA synthesized by reverse transcription is amplified as a double strand with appropriate primers, ligated to the vector, and placed in a competent E. coli cell. It is introduced by troporation etc. to construct a cDNA library.
  • a nylon membrane on which colonies were blotted was hybridized with a set of F2 and R2 primers and a probe amplified by PCR using rice genomic DNA as template. And can be detected as positive clones.
  • a DNA comprising a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 12, and when introduced into rice or other cells, naringenin 7-0-methyl DNA capable of expressing a protein having a transferase activity can be obtained by a technique commonly used at the time of filing the present application, for example, site-directed mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982). Can be done.
  • the rice NOMT genomic DNA is made into a single-stranded state, an oligonucleotide designed to introduce the mutation is annealed to the single-stranded state, and then double-stranded by a polymerase or the like.
  • the target DNA can be obtained by sorting.
  • the number and position of bases deleted, substituted or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 are not particularly limited as long as they can express a protein having NOMT activity when introduced into rice or other cells. Not done.
  • the number and position of bases deleted, substituted or added in the NOMT coding region are not particularly limited as long as they encode a protein having NOMT activity.
  • the protein having NOMT activity includes, in addition to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added. And proteins having NOMT activity.
  • the DNA of the second invention contains a region encoding a protein having NOMT activity
  • the DNA of the second invention is inserted into an appropriate vector to obtain an appropriate host cell.
  • a protein having NOMT activity can be efficiently expressed in host cells.
  • a regulatory sequence such as a mouth motor, an enhancer or the like that enables efficient expression thereof can be appropriately used, and those skilled in the art can easily select and use these.
  • the vector incorporating the DNA of the second invention is not particularly limited, and for example, pUC18, pUC19, pBluescript, pBR322, pBI121, pBIGRZ, TAC, pET156 and the like can be used.
  • an appropriate gene or reporter gene may be inserted into the vector.
  • genes include resistance genes for antibiotics such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, neomycin, hygromycin, and spectinomycin.
  • reporter genes include genes encoding ⁇ -dalcuronidase (GUS), luciferase (LUX), green fluorescent protein (GFP), and the like.
  • the host cell into which the vector is introduced is not particularly limited as long as it can be transformed by being compatible with the vector into which the DNA of the second invention has been incorporated.
  • Various cells such as recombinant cells, can be used.
  • plant cells eg, rice, cucumber, tomato, barley, potato, corn
  • animal cells eg, mouse, rat, chick
  • insect cells eg, silkworm
  • filamentous fungi eg, Aspergillus
  • bacteria eg, For example, Escherichia coli, Bacillus subtilis
  • yeast and the like can be used.
  • the introduction of the vector into a host cell can be performed using a known method.
  • a protoplast method, a lithium method, an electroporation method, a calcium chloride method, or a modified method thereof can be used.
  • the plant cell After introducing the vector incorporating the DNA of the second invention into a plant cell, the plant cell is differentiated, whereby a recombinant plant having the DNA of the second invention in each cell can be obtained.
  • a method for introducing a gene into a plant cell for example, a method using an agrobacterium
  • the electrophoresis method, the electrolysis method, the polyethylene glycol method, the microinjection method, the microparticle collision method, and the like can be used, but are not limited thereto as long as the gene can be introduced into a target plant cell.
  • the host plant species is not particularly limited as long as it is a plant species that can be transformed by being compatible with the vector incorporating the DNA of the second invention.
  • a plant species that can be transformed by being compatible with the vector incorporating the DNA of the second invention for example, in dicotyledonous plants, cucumber, tomato, Chinese cabbage, potato, Cabbage, soybean, rape, etc. can be used, and rice, corn, corn, wheat, etc. can be used for monocotyledonous plants.
  • the differentiation of the plant cell into which the vector incorporating the DNA of the second invention has been introduced can be performed according to a conventional method.
  • a leaf disk method is used as a method for introducing genes into plant cells
  • a leaf disk collected from aseptic leaves of a plant that has been aseptically cultured is immersed in a culture solution of Agrobacterium hummefaciens EHA101, and then the foliage is separated. Cultivation and growth in a culturing medium.
  • a foliage differentiation medium for example, a medium obtained by adding a plant hormone (eg, 2,4-D, NAA, potato-inetin) to a known medium such as an MS medium can be used. Thereafter, callus is selected using a foliage differentiation medium for selection.
  • a plant hormone eg, 2,4-D, NAA, potato-inetin
  • a medium obtained by adding kanamycin, cefotaxime, or the like to a foliage differentiation medium can be used.
  • plant cells can be further differentiated by culturing using a root differentiation medium obtained by adding kanamycin, cefotaxime, etc. to a known medium such as an MS medium. Thereafter, the rooted seedlings are transferred to soil and cultivated to obtain plantlets.
  • the protein having NOMT activity which is expressed by introducing the DNA of the second invention into a host cell, can methylate the hydroxyl group at the 7-position of naringenin and synthesize sakuranetin from naringenin.
  • Sakuranetin can function as a phytolexin. Therefore, it is considered that by introducing the DNA of the second invention into a plant, sakuranetin can be induced from naringenin in the plant, thereby imparting an excellent antibacterial property to the plant.
  • this DNA does not have an intron, it can be expressed in prokaryotes such as bacteria to express a large amount of a protein having enzymatic activity.
  • the third of the present invention (hereinafter referred to as “third invention”) is a DNA shown in the following (a) or (b).
  • DNA containing a nucleotide sequence can be obtained by specifying a promoter region from the nucleotide sequence of rice NOMT genome DNA (SEQ ID NO: 1) and isolating one region of the promoter.
  • Rice NOMT genomic DNA can be obtained as described above, and its promoter region can be identified by a conventional method.
  • the promoter region can be specified by a method of comparing the nucleotide sequence of the gene obtained from the cDNA library with the nucleotide sequence of the gene obtained from the genomic DNA library.
  • Isolation of the promoter region can be performed by using an appropriate restriction enzyme.
  • a DNA fragment containing a promoter region can be isolated by partially degrading rice NOMT genomic DNA with restriction enzymes HindIII, EcoRI, SaulII AI and the like.
  • the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is rice genomic DNA, and the primer comprises a nucleotide sequence complementary to the 5 'end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 Can be obtained by performing PCR using a primer having the same nucleotide sequence as that of the 3 ′ end.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 a DNA containing a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, or added, and having a promoter activity is commonly used at the time of filing the present application. Techniques, for example, site-directed mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982).
  • the number and position of the bases deleted, substituted or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 cause the loss of the promoter activity of the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. Unless otherwise specified, there is no particular limitation.
  • the DNA of the second invention has a promoter activity. Therefore, the target gene can be expressed by introducing the vector containing the DNA of the second invention and the target gene linked downstream thereof into the host cell.
  • the gene of interest means a gene whose expression is intended to express a gene product encoded by the gene (eg, protein, rRNA, antisense RNA, etc.).
  • the target gene linked downstream of the DNA of the present invention is not particularly limited, and may be any gene.
  • examples of such a gene include a chitinase gene, a / 3-1,3-glucanase gene, and a PAL (phenylalanine ammonia lyase) gene.
  • the vector incorporating the DNA of the second invention is not particularly limited, and for example, pUC18, pUC19, pBluescript, pBR322, ⁇ 21, pBlGRZ, TAC and the like can be used.
  • an appropriate marker gene or reporter gene may be inserted downstream of the DM of the second invention.
  • the marker gene include resistance genes of antibiotics such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, neomycin, hygromycin, and spectinomycin.
  • examples of the reporter gene include genes encoding / 3-Darctic nidase (GUS), luciferase (LUX), green fluorescent protein (GFP), and the like.
  • the host cell into which the vector is introduced is not particularly limited as long as it can be transformed by being compatible with the vector into which the DNA of the second invention has been incorporated, and commonly used natural cells and artificially established cells can be used.
  • Various cells such as a recombinant cell, can be used.
  • plant cells eg, rice, cucumber, tomato, potato, tobacco
  • animal cells eg, mouse, rat, chick
  • insect cells eg, silkworm
  • yeast and the like
  • Introduction of the vector into a host cell can be performed using a known method.
  • the protoplast method, the lithium method, the electoral poration method, the calcium chloride method, or a modification thereof can be used. You.
  • a fourth aspect of the present invention (hereinafter, referred to as a "fourth invention") is a protein shown in the following (a) or (b).
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 corresponds to the amino acid sequence of rice NOMT protein.
  • the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 is, for example, a vector containing a suitable promoter for expressing cDNA such as cDNA (SEQ ID NO: 12), and pET156 (Novagen, Madison, WI). Transformation can be obtained by overexpressing cDNA in E. coli.
  • the NOMT enzyme activity of the protein expressed in Escherichia coli can be confirmed by the method described in XZHe et al. (Plant Molecular Biology 36: 43-54, 1998).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and a protein having naringenin 7-0 monomethyltransferase activity is It can be obtained by modifying the cDNA structure by a technique commonly used at the time of filing the application of the present application, for example, a site-directed mutagenesis method as described in the above-mentioned gene modification.
  • the number and position of amino acids to be deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are not particularly limited as long as a protein having NOMT activity can be expressed.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • Construction of a genomic DNA library using a BAC (bacterial artificial chromosome) vector from rice japonica variety Shimokita was performed according to the method described in Molecular General Genetics (1997) Vol. 254, p611-620.
  • the BAC library of rice genome constructed in this way has an average insert size of about 155kbp and covers about 7 genomes of rice, and 3072 cells corresponding to about 1 genome in one microplate size membrane Clones are listed.
  • the BAG library of the rice genome stores and organizes the clones, the desired positive clones are screened by colony hybridization of several membranes using an appropriate probe. can do.
  • UV-irradiated rice (lg) was mixed with 4 ml of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 14 mM mercaptoethanol, 5 mM EDTA, 10% (w / v) glycerol and 10% (w / w) polyvinylpolypyrrolidone, and Grinded in a mortar in the presence of 0.05 g of sea sand.
  • the triturated solution was centrifuged at 18,500 X g for 5 minutes, and the centrifuged supernatant was filtered through a 50-m membrane, buffer B (10% glycerol, ImEDTA-2Na and 14 mM 2-mercaptoethanol).
  • buffer B 10% glycerol, ImEDTA-2Na and 14 mM 2-mercaptoethanol.
  • an adenosine-agarose column equilibrated with buffer B was prepared as follows. After washing 5 ml of 5'-AMP-agarose with distilled water, 800 units of cattle dissolved in 1 ml of a buffer for bovine small intestine alkaline phosphatase (500 mM Tris-HCl (pH 9.0)) The gel was incubated with small intestinal alkaline phosphatase (total volume 10 ml) and the gel was dephosphorylated. Incubation was performed by placing the gel in a vial and rotating the vial continuously at 3 TC for 24 hours.
  • the resulting gel was packed in a column, washed first with distilled water, then with 10 ml of buffer B containing 2M NaCl, and finally equilibrated with 100 ml of buffer B. In this way, with buffer B An equilibrated adenosine-agarose column was prepared.
  • the column was washed with 50 ml of buffer B at a flow rate of 18 ml / h, followed by washing with 50 ml of buffer B containing 0.2 M KC1.
  • NOMT was selectively eluted with 25 ml of buffer B containing 4 mM S-adenosyl-L-methionine (SAM) and 0.2 M KCl, and the eluate was collected in 1.75 ml portions.
  • SAM S-adenosyl-L-methionine
  • the NOMT activity of each of the obtained fractions was measured as follows.
  • the fractions having NOMT activity among the fractions were collected, added to a Super Deluxe 75 gel filtration chromatography column (3 ⁇ 30 cm) (Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer B, and added to buffer B (flow rate 18 ml). / h) was used to elute NOMT, 3.5 ml of each fraction was collected, and the NOMT activity of each fraction was measured in the same manner as described above. As a result, purified NOMT was obtained.
  • the resulting purified NOMT was concentrated using Centricon-30 (Amicon, Beverly, USA), desalted (2 ⁇ 500 Z 1 mm Q purified water), and then dried by a centrifugal drying concentrator.
  • Dried NOMT (about 10 g) was dissolved in 200 ⁇ l of 70% formic acid containing 1% cyanogen bromide, incubated in the dark for 20 hours, and dried in the same manner as above.
  • the dried product was subjected to TRICINE SDS-PAGE (16.5% ⁇ , 3% C gel) (Schagger H et al., Anal. Biochem. 166: 368-379 (1987)), and then subjected to a PVDF membrane (Fluorotrans, Pal 1, Tokyo, Japan).
  • the stained peptide was cut off from the membrane, directly set on a cartridge for sequencing, and the amino acid sequence was determined using an ABI494 protein sequencer.
  • N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) and the C-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of NOMT could be determined.
  • a DNA primer was designed based on the amino acid sequence of NOMT determined in Example 2 (SEQ ID NOS: 4 and 5). That is, based on the partial amino acid sequence of the purified NOMT, two N-terminal and two C-terminal portions with less duplication of the genetic code were selected, and based on that, primers F1 and F2 of the sense strand and primers of the antisense strand were selected. R1 and R2 were designed.
  • the nucleotide sequences of primers F1, F2, R1 and R2 are as follows.
  • Primer F1 atgaa (c / t) ca (a / g) ga (c / t) aa (a / g) gtictiatgga (a / g) ag (SEQ ID NO: 8)
  • Primer F2 tt (g / c) aa (c / t) aa (a / g) gcita (c / t) ggiatgacigcitt (SEQ ID NO: 9)
  • Primer R1 tcict (a / g) ca (a / g) tc (a / g) tgiagiat (a / g) ca (c / t) ttcat (SEQ ID NO: 10)
  • Primer R2 agcatiatcat (a / g) tciac (a / g) tg (a / g) aaiac (a / g) cc (SEQ ID NO: 11)
  • i means inosine.
  • G / c), (c / t), and (a / g) mean that the base at that position is guanine or cytosine, cytosine or thymine, and adenine or guanine, respectively.
  • Rice whole genome DNA was designated as type I, and PCR was performed using the DNA primer designed as described above.
  • composition of the PCR reaction solution is as follows.
  • PCR consists of one cycle of heat denaturation (3 min at 94 ° C), heat denaturation (1 min at 94 ° C), annealing (2 min at 65 ° C), and extension reaction (2 min at 72 ° C).
  • One cycle of the extension reaction (5 minutes at 72 ° C) was performed for 29 cycles, and then stored at 4 ° C.
  • FIG. 2 shows the binding positions of primers F2 and R2 in rice NOMT genome DNA (SEQ ID NO: 1).
  • the amplified fragment obtained by PCR was sequenced and confirmed to be identical with the amino acid sequence of NOMT, the amplified fragment was labeled with ECL (Amersham). Next, using this labeled fragment as an ECL probe, colony hybridization was performed on the rice genomic BAC library constructed in Example 1, and as a result, six positive clones were obtained.
  • This clone was cultured, and the obtained BAC plasmid was digested with a restriction enzyme HindIII, followed by Southern hybridization. As a result, about 15 kbp positive band having a strong signal was detected in three clones (25-4C, 7-4D, 58-1A). Therefore, this positive band (about 8 kb) was excised from the 25-4C clone with Spel and introduced into a large-capacity binary single vector pBI GRZ. Since the pBIGRZ vector has a low copy number, it can stably maintain an insert of lOkbp or more in Escherichia coli, agrobacterium, etc. It can be directly introduced by the pattermim method, and by using an appropriate primer, direct sequencing can be performed from anywhere in the reinsert.
  • the obtained clone is cloned using primers designed based on the sequence of the fragment amplified by PCR with the primers F2 and R2 previously prepared, and primers on both sides of the cloning site.
  • the sequence was determined from both sides of the site and the portion corresponding to the PCR amplified fragment, and a new primer was synthesized based on the data to extend the sequence so as to fill the gap.
  • the sequence of the full length of the NOMT coding region including the open reading frame and the intron and a promoter region of about 1.4 kbp, from the 5 'end to 4371 bases, could be read mainly in one direction.
  • the nucleotide sequence of the rice NOMT genomic DNA obtained is shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of rice NOMT deduced from the nucleotide sequence of rice NOMT genomic DNA.
  • Fig. 1 shows the relationship between the amino acid sequence of the purified NOMT and the nucleotide sequence of the rice NOMT genomic DNA, which was isolated in Example 2.
  • the isolated and identified DNA was the rice NOMT genomic DNA. It was clear that there was no mistake.
  • the black portions are the portions corresponding to the amino acid sequence of NOMT isolated and purified in Example 2.
  • Example 1 reading was performed mainly in only one direction, so for the purpose of reading the structure of this gene from both directions, the above insert was partially digested with the 4-base recognition enzyme Saufflal to obtain 0.5-2 k
  • the 4-base recognition enzyme Saufflal was partially digested with the 4-base recognition enzyme Saufflal to obtain 0.5-2 k
  • cloning part B into plasmid pBSK and reading them randomly using primers at both ends of the plasmid cloning site, a considerable region could be read efficiently.
  • some gears remained, so we set a new primer for that part and changed the arrangement. I read it.
  • the gene could be read with sufficient margin up to 5026 in both directions, up to 524 residues in one direction, and the 3 'side of the gene (SEQ ID NO: 6).
  • SEQ ID NO: 6 There were 12 differences from the sequence (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 3 above, but no difference in the amino acid sequence of the protein.
  • nucleotide sequence of the rice NOMT genome DNA obtained as described above (SEQ ID NO: 6), the region represented by nucleotides 1430 to 1860 and nucleotides 3605 to 4277 is exon, as compared with the amino acid sequence. It has been found.
  • RNA was fractionated using oligo dT latex beads (Roche) as described in the manual to obtain mRNA.
  • cDNA was synthesized with reverse transcriptase using oligo dT as a primer.
  • the single-stranded (ss) cDNA was ligated to a single-stranded DNA adapter using T4 RNA ligase, and PCR was performed using oligo dT and the adapter as primers.
  • the cDNA is then blunt-ended; ligated into LZAP, transformed into competent E. coli, and the cDNA library Lee built.
  • c The N0MT clone was hybridized to a nylon membrane on which a colony of the DNA library was blotted using the primer set of F2 and R2 and the PCR-amplified product as a probe using the rice genomic DNA as type ⁇ . Was detected.
  • the purified clone was inserted by extending the sequence using primers from the vector-cloning site adjacent to the insert. The sequence of the cDNA was determined. '
  • the present invention provides rice NOMT genomic DNA and DNA having substantially the function of the DNA (that is, the function of expressing a protein having NOMT activity when introduced into rice cells). Since many plants have naringenin, which is a substrate of NOMT, introduction of the DNA of the present invention into plants makes it possible to derive sakuranetin from naringenin in plants, thereby providing excellent antibacterial activity to plants. Can be provided. In addition, since cDNA can be used for large-scale synthesis in Escherichia coli, sakuranetin can be synthesized from naringenin, which can be obtained relatively easily.
  • the present invention also provides a DNA having a promoter activity. Since the DNA of the present invention has a promoter activity, it can be used as a promoter when a foreign gene is introduced into a host.

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Description

明 細 書 サクラネチン合成酵素遺伝子 技術分野
本発明は、 イネ由来のサクラネチン合成酵素 （ナリンゲニン 7— 0—メチルト ランスフェラ一ゼ （NOMT) ) ゲノ ADN A及び該ゲノム DNAのプロモータ 一領域に関する。 背景技術
植物は病原菌等の侵入に対してフアイ トァレキシン産生等の誘導抵抗性を有し ている。
このフアイ トァレキシンは低分子の抗菌性物質であり、 病原菌の侵入に対して ばかりでなく、 化学的ストレスや物理的ストレスによっても生成、 蓄積される。 例えば、 イネ （ sativa) においては、 病原体感染、 紫外線照射、 塩化銅 (CuCl2) やジャスモン酸処理等のストレスに対して、 イネの主要なファイ トァ レキシンの一つであり、 抗菌活性の高いサクラネチン （ 5， 4'—ジヒドロキシー 7—メ トキシフラバノン） が生成、 蓄積される。
ド類の 1種であり、 フラボノイド類は一般にフアイ して作用し、 紫外線照射等のストレスから植物を保護する機能を 有していると考えられている。 そして、 このフラボノイド類の生合成に関与する 酵素である O—メチルトランスフェラ一ゼが多くの植物組織や培養細胞から単 離 .精製されている (Pakusch AEら， Arch. Biochem.Biophys.271 :488-494 (198 9) ； Wanek Wら， Planta.197:427-434 (1995) ) 。
サクラネチンの生合成においても O—メチルトランスフェラーゼが関与してお リ、 ナリンゲニン 7— O—メチルトランスフェラ一ゼによってフラバノンである ナリンゲニン （5， 7 , 4， —トリヒドロキシフラバノン） の 7位の水酸基がメ チル化されてサクラネチンが合成される。 ナリンゲニンは多くの植物に存在するので、 ナリンゲニン 7—O-メチルトラ ンスフェラ一ゼを発現し得る DN Aを植物に導入すれば、 植物内のナリンゲニン からサクラネチンを誘導することができ、 これによつて植物に優れた抗菌性を付 与することができるものと考えられる。
しかし、 植物に導入した場合にナリンゲニン 7—〇—メチルトランスフェラー ゼを発現し得る DN Aは未だ単離 · 同定されていない。
そこで、 植物に導入した場合にナリンゲニン 7—0—メチルトランスフェラ一 ゼを発現し得る DNAの単離 · 同定が望まれている。
本発明は、 植物に導入した場合にナリンゲニン 7—〇一メチルトランスフェラ —ゼを発現し得る DN Aを提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 紫外線照射、 ジャスモン酸処理、 塩化銅処理等のストレスを与えたイネから単離 ·精製したナ リンゲニン 7—〇一メチルトランスフェラーゼ （以下、 「NOMT」 という） の N末端側のァミノ酸配列 （配列番号 4 ) 及び C末端側のアミノ酸配列 （配列番号 5) を決定することに成功した。 そして、 上記 NOMTのアミノ酸配列に基づい て設計した DN Aプライマーを使用し、 イネの全ゲノム DN Aを錄型として PC Rを行い、 該 P C Rによって得られた増幅断片をプローブとしてイネゲノムの B AC (バクテリア人工染色体） ライブラリ一をスクリーニングすることにより、 イネ NOMTゲノム DNA (配列番号 6) を単離 · 同定することに成功し、 本発 明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 以下の （ 1 ) 〜 （ 1 2) を提供する。
( 1 ) 以下の （ a) 又は （b) に示す DNA。
(a) 配列番号 6記載の塩基配列を含む DNA、
(b) 配列番号 6記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又 は付加された塩基配列を含む D N Aであって、 イネまたは他の植物細胞に導入し た場合にナリンゲニン 7—〇一メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク 質を発現し得る DNA。
(2) 上記 （ 1 ) 記載の DNAを含む組換えベクター。
(3) 上記 （2) に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
(4) 上記 （2) に記載の組換えベクターを導入した細胞の分化によって得られ る形質転換体。
( 5 ) 以下の （ a) 又は （b) に示す DNA。
(a) 配列番号 1 3記載の塩基配列を含む DNA、
(b) 配列番号 1 3記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換 又は付加された塩基配列を含む DNAであって、 イネもしくはその他の植物、 動 物、 菌類、 またはバクテリアの細胞に導入した場合にナリンゲニン 7—O—メチ ルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質を発現し得る DNA。
(6) 上記 （5) 記載の DNAを含む組換えべクタ一。
(7) 上記 （6) に記載の組換えべクタ一によって形質転換された宿主細胞。
(8) 上記 （6) に記載の組換えべクタ一を導入した細胞の分化によって得られ る形質転換体。
(9) 以下の （ a) 又は （b) に示す DNA。
(a) 配列番号 2記載の塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 2記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又 は付加された塩基配列を含む DN Aであって、 プロモーター活性を有する DNA。
( 1 0) 上記 （9) 記載の DNAを含む組換えベクター。
( 1 1 ) 上記 （ 1 0) に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
( 1 2) 以下の （ a) 又は （b) に示すタンパク質。
( a ) 配列番号 3記載のァミノ酸配列からなるタンパク質、
(b) 配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1又は複数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、 ナリンゲニン 7— 0—メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願平成 1 1年第 57748 号の明細書及びノまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 3で得られたイネ NOMTゲノム DNA (配列番号 1 ) におけ るイントロン及びェクソンの位置を表す図である。
図 2は、 実施例 3で得られたイネ NOMTゲノム DNA (配列番号 1 ) におけ るプライマ一 F2及び R2の予想結合位置を表す図である。
図 3は、 実施例 4で得られたイネ NOMTゲノム DN A (配列番号 6) におけ るェクソンの位置を表す図である。
図 4は、 実施例 4で得られたイネ NOMTゲノム DN A (配列番号 6 ) におけ るタンパク質コード領域を表す図である。
図 5は、 ゲノム配列から推定されるアミノ酸配列 （配列番号 3) と精製タンパ ク質の一次構造から得られた部分アミノ酸配列 （配列番号 4及び 5) を比較した 図である。
図 6は、 イネ NOMTゲノム DN A (配列番号 6 ) の配列決定プロセスを示す 図である。 配列表の簡単な説明
配列番号 8 ： PCRのための合成プライマー
配列番号 9 ： P C Rのための合成プライマー
配列番号 1 0 ： PC Rのための合成プライマー
配列番号 1 1 ： P C Rのための合成プライマ一
発明を実施するための形態 以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の第一 （以下、 「第一発明」 という） は、 以下の （ a) 又は （b) に示 す DNAである。
(a) 配列番号 6記載の塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 6記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又 は付加された塩基配列を含む D N Aであって、 イネまたは他の植物細胞に導入し た場合にナリンゲニン 7— 0—メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク 質を発現し得る DNA
配列番号 6記載の塩基配列を含む DNAは、 例えば、 以下の工程 （ 1 ) 〜 (3) によって得ることができる。
( 1 ) イネゲノム D N Aライブラリ一の作製
イネゲノム DN Aライブラリ一は、 常法に従って作製することができる。 イネ ゲノム DN Aライブラリ一としては、 イネゲノムの BAC (バクテリア人工染色 体） ライブラリーを用いるのが最も高能率であり、 イネゲノムの BACライブラ リーとしては、 例えば、 農林水産省生物資源研究所耐病性研究室で保有している イネ （シモキタ） ゲノムの 7ゲノム分をカバーする BACライブラリ一を例示す ることができる。 このイネ （シモキタ） ゲノムの BACライブラリ一は、 約 2万 個のクローンとして整理されており、 目的のクローンを容易かつ効率的に取り出 せるようになっている。
(2) イネ NOMTゲノム DNAを含むクローンの選抜
イネ NOMTゲノム DNAを含むクローンは、 例えば、 イネゲノムの BACラ ィブラリーを常法に従ってスクリ一二ングすることにより選抜することができる。 イネゲノムの BACライブラリ一からイネ NOMTゲノム DNAを含むクローン を選抜する方法としては、 イネ NOMTゲノム DN Aに特異的にハイプリダイズ し得る塩基配列からなるプローブを用いたコロニ一ハイプリダイゼーシヨン法や プラークハイプリダイゼ一ション法を例示することができる。 その際に使用する プローブの塩基配列は、 イネ NOMTのアミノ酸配列 （配列番号 3) に基づいて 決定することができ、 そのような塩基配列からなるプローブは常法に従って化学 合成することができる。
(3) イネ NOMTゲノム DNAの単離 . 同定
適当な制限酵素で消化した選択 B ACクローン断片に対して上記プローブを用 いたサザン分析を行い、 クローン中のイネ NOMTゲノム DNA断片を同定した 後、 適当なベクタ一に再度クローニングし、 マクサム ' ギルバート法、 サンガー 法、 又はこれらの自動化された変法等を用いてその塩基配列を決定することがで きる。 この際、 大容量バイナリ一ベクタ一 PBIGRZを用いれば、 プロモーター領域 を含む大きな断片を安定して保持できるとともに、 このべクタ一を用いて直接植 物を形質転換できる。
配列番号 6記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又は付 加された塩基配列を含む DN Aであって、 イネ細胞に導入した場合にナリンゲニ ン 7—O—メチルトランスフエラ一ゼ活性を有するタンパク質を発現し得る DN Aは、 本願の出願時において常用される技術、 例えば、 部位特異的変異誘発法（N ucleic Acids Res.10, 6487 - 6500, 1982)によって得ることができる。 すなわち、 イネ NOMTゲノム DNAを一本鎖の状態とし、 これに変異を導入するように設 計されたオリゴヌクレオチドをァニーリングさせ、 ポリメラ一ゼ等によって 2本 鎖とした後、 変異が導入された鎖のみを選別することにより目的の DNAを得る ことができる。
配列番号 6記載の塩基配列において欠失、 置換又は付加される塩基の個数及び 位置は、 イネ細胞に導入した場合に NOMT活性を有するタンパク質を発現し得 る限り特に'限定されない。
また、 配列番号 1または 6記載の塩基配列には、 プロモーター領域及び NOM Tコード領域が含まれる。 プロモータ一領域は、 下記の実施例 3で得られた配列 番号 1記載の塩基配列のうち 1〜 1428番目の塩基によって表される領域 （配列番 号 2) に相当し、 NOMTコード領域は、 配列番号 1記載の塩 S配列のうち 1429 〜1859番目及び 3607〜4279番目の塩基によって表される領域に相当する （図 1 ) 。 なお、 NOMTコード領域によってコードされる NOMTのアミノ酸配列は、 配 列番号 3に記載する通りである。 従って、 配列番号 6記載の塩基配列における 「欠失、 置換又は付加」 には、 プ 口モータ一領域及び NOMTコード領域における 「欠失、 置換又は付加」 が含ま れる。
プロモーター領域において欠失、 置換又は付加される塩基の個数及び位置は、 プロモータ—領域のプロモーター活性を失わせない限り特に限定されない。 また、 NOMTコード領域おいて欠失、 置換又は付加される塩基の個数及び位 置は、 NOMT活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されない。 こ こで、 NOMT活性を有するタンパク質には、 配列番号 3記載のアミノ酸配列か らなるタンパク質の他、 配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1又は複数個 のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ NOMT活 性を有するタンパク質が含まれる。
第一発明の DNAには、 プロモータ領域及び NOMT活性を有するタンパク質 をコードする領域が含まれるので、 第一発明の D N Aを適当なベクターに組み込 んで適当な宿主細胞に導入することにより、 宿主細胞内において効率よく NOM T活性を有するタンパク質を発現させることができる。
第一発明の DN Aを組み込むベクタ一は特に限定されず、 例えば、 pUC18、 pUC 19、 pBluescript, pBR322、 pBI121、 pBIGRZ、 TAC等を使用することができる。 ベクタ一を導入した形質転換体の検出を容易にするために、 ベクター中に適当 なマ一力一遺伝子やレポ一ター遺伝子を挿入しておいてもよい。 マーカ一遺伝子 としては、 例えば、 テトラサイクリン、 アンピシリン、 カナマイシン、 ネオマイ シン、 ハイグロマイシン、 スぺクチノマイシン等の抗生物質の耐性遺伝子を例示 できる。 また、 レポ一ター遺伝子としては、 ；3 -ダルクロニダーゼ （GUS) 、 ルシ フェラ一ゼ （LUX) 、 緑色蛍光タンパク質 （GFP) 等をコードする遺伝子を例示で きる。
ベクタ一を導入する宿主細胞は、 第一発明の DN Aを組み込んだベクタ一と適 合し形質転換され得るものである限り特に限定されず、 一般的に使用される天然 細胞、 人工的に樹立された組換え細胞などの種々の細胞を使用することができる < 例えば、 植物細胞 （例えば、 イネ、 キユウリ、 トマト、 ォォムギ、 ジャガイモ、 トウモロコシ） 、 動物細胞 （例えば、 マウス、 ラット、 ニヮトリ） 、 昆虫細胞 (例えば、 カイコ） 、 糸状菌 （例えば、 コウジカビ） 、 細菌 （例えば、 大腸菌、 枯草菌） 、 酵母等を使用することができる。 ベクタ一の宿主細胞への導入は、 公 知の方法を用いて行なうことができる。 例えば、 プロトプラスト法、 リチウム法、 エレクトロポレーシヨン法、 塩化カルシウム法又はこれらの変法を使用すること ができる。
第一発明の D N Aを組み込んだベクタ一を植物細胞に導入した後、 該植物細胞 を分化させることにより、 第一発明の D N Aを各細胞中に有する組換え植物を得 ることができる。
植物細胞への遺伝子導入法としては、 例えば、 ァグロパクテリゥムを用いる方 法、 エレクトロボレ一シヨン法、 ポリエチレングリコ一ル法、 マイクロインジェ クシヨン法、 微小物衝突法等を使用することができるが、 目的の植物細胞に遺伝 子を導入できる方法である限りこれらには限定されない。
宿主となる植物種は、 第一発明の D N Aを組み込んだベクターと適合し形質転 換され得る植物種である限り特に限定されず、 例えば、 双子葉植物では、 キユウ リ、 トマト、 ハクサイ、 ジャガイモ、 キャベツ、 ダイズ、 ナタネ等を使用するこ とができ、 単子葉植物では、 イネ、 ォォムギ、 トウモロコシ、 コムギ等を使用す ることができる。
第一発明の D N Aを組み込んだベクターを導入した植物細胞の分化は、 常法に 従って行うことができる。 例えば、 植物細胞への遺伝子導入法としてリーフディ スク法を使用する場合、 無菌培養した植物の無菌葉から採取したリーフディスク をァグロパクテリゥム · ッメファシエンス EHA101の培養液に浸潰した後、 茎葉分 化培地で培養してカルスを形成し増殖させる。 茎葉分化培地としては、 例えば MS 培地等の公知の培地に植物ホルモン （例えば、 2, 4- D、 NAA、力イネチン） を添加 したものを使用することができる。 その後に選択用の茎葉分化培地を用いてカル スの選択を行う。 選択用培地としては、 茎葉分化培地に例えばカナマイシン、 セ フォタキシム等を加えたものを使用することができる。 さらに MS培地等の公知の 培地にカナマイシン、 セフォタキシム等を加えた根分化培地を用いて培養するこ とにより、 植物細胞をさらに分化させることができる。 その後、 発根した幼植物 体を土壌に移して栽培することによリ植物体とすることができる。
第一発明の DN Aを宿主細胞に導入することにより発現される NOMT活性を 有するタンパク質は、 ナリンゲニンの 7位の水酸基をメチル化し、 ナリンゲニン からサクラネチンを合成することができる。 そして、 サクラネチンはファイ トァ レキシンとして機能し得る。 従って、 第一発明の DNAを植物に導入することに より、 植物内においてナリンゲニンからサクラネチンを誘導することができ、 こ れによって植物に侵れた抗菌性を付与することができるものと考えられる。 本発明の第二 （以下、 「第二発明」 という） は、 以下の （ a) 又は （b) に示 す DN Aである。
( a) 配列番号 1 2記載の塩基配列を含む DNA、
(b) 配列番号 1 2記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換 又は付加された塩基配列を含む DN Aであって、 イネ細胞に導入した場合にナリ ンゲニン 7— 0—メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質を発現し得 る DNA。
配列番号 1 2記載の塩基配列は、 イネ NOMTの c DNAである。 配列番号 1 2記載の塩基配列を含む DN Aは、 例えば、 Plant Molecular Biology Manual D5 1-13 (Gelvin，S.T.ら編， 1994) に記載のように、 オリゴ dTラテックスビー ズまたは磁気ビーズを使用して、 まず CuCl2または UV照射によってストレスを かけたイネ緑葉から mRNA画分を調製し、 次いで、 上記 mRNAを铸型とし、 オリゴ dTをプライマ一として、 伃 !jえば Current Protocols in Molecular Biolo gy; 5.5節 （John Wiley&Sons出版） に記載のような公知の方法を用い、 逆転写 酵素によって合成することができる。 適当なベクター中にクロ一ニングする二本 鎖 DNAを作成するプライマーを設定し、 二本鎖 c DN Aをクローニングするこ とを可能とするために、 一本鎖のオリゴ DNAアダプタ一を mRNAの 5' 末端 にライゲートしても良い。 逆転写により合成された c DN Aを適当なプライマー で二本鎖として増幅後、 ベクタ一に結合し、 コンビテント大腸菌細胞中にエレク トロポレーシヨン等によって導入し、 c DNAライブラリ一を構築する。 c DN Aライブラリーから NOMTクローンを検出するためには、 コロニ一をブロット したナイロン膜を、 F 2及び R 2プライマ一セット、 及びイネゲノム DNAを錡 型として用いて P C R増幅したプローブとハイプリダイズさせ、 ポジティブクロ ーンとして検出することができる。
下記実施例においては、 このようにして 2つの c DNAクローンの長い断片が 得られた。 この 2クローンは中心部の長い範囲にわたって重複しており、 またお 互いにそれぞれで欠けている 5' 及び 3' 末端領域を補い合う関係にあった。 配列番号 1 2記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又は 付加された塩基配列を含む D N Aであって、 イネまたは他の細胞に導入した場合 にナリンゲニン 7—0—メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質を発 現し得る DN Aは、 本願の出願時において常用される技術、 例えば、 部位特異的 変異誘発法（Nucleic Acids Res.10， 6487 - 6500, 1982)によって得ることができ る。 すなわち、 イネ NOMTゲノム DNAを一本鎖の状態とし、 これに変異を導 入するように設計されたオリゴヌクレオチドをァニーリングさせ、 ポリメラーゼ 等によって 2本鎖とした後、 変異が導入された鎖のみを選別することにより目的 の DNAを得ることができる。
配列番号 1 2記載の塩基配列において欠失、 置換又は付加される塩基の個数及 び位置は、 イネまたは他の細胞に導入した場合に N 0 M T活性を有するタンパク 質を発現し得る限り特に限定されない。
また、 NOMTコード領域において欠失、 置換又は付加される塩基の個数及び 位置は、 NOMT活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されない。 ここで、 NOMT活性を有するタンパク質には、 配列番号 3記載のアミノ酸配列 からなるタンパク質の他、 配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1又は複数 個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ NOMT 活性を有するタンパク質が含まれる。
第二発明の DN Aには、 NOMT活性を有するタンパク質をコードする領域が 含まれるので、 第二発明の DNAを適当なベクタ一に組み込んで適当な宿主細胞 に導入することにより、 宿主細胞内において効率よく N O M T活性を有するタン パク質を発現させることができる。 この場合、 その効率的な発現を可能とするプ 口モータ一、 ェンハンサ一等の調節配列を適宜利用することができ、 当業者には これらの選択及び使用は容易に行うことができる。
第二発明の D N Aを組み込むベクタ一は特に限定されず、 例えば、 pUC18、 pUC 19、 pB l uescri pt, pBR322、 pBI 121、 pBI GRZ、 TAC、 pET156等を使用することがで さる。
ベクタ一を導入した形質転換体の検出を容易にするために、 ベクタ一中に適当 なマ一力一遺伝子やレポ一ター遺伝子を揷入しておいてもよい。 マ一力一遺伝子 としては、 例えば、 テトラサイクリン、 アンピシリン、 カナマイシン、 ネオマイ シン、 ハイグロマイシン、 スぺクチノマイシン等の抗生物質の耐性遺伝子を例示 できる。 また、 レポ一ター遺伝子としては、 ^ -ダルクロニダーゼ （GUS) 、 ルシ フェラーゼ （LUX) 、 緑色蛍光タンパク質 （GFP) 等をコードする遺伝子を例示で さる。
ベクタ一を導入する宿主細胞は、 第二発明の D N Aを組み込んだベクターと適 合し形質転換され得るものである限り特に限定されず、 一般的に使用される天然 細胞、 人工的に樹立された組換え細胞などの種々の細胞を使用することができる。 例えば、 植物細胞 （例えば、 イネ、 キユウリ、 トマト、 ォォムギ、 ジャガイモ、 トウモロコシ） 、 動物細胞 （例えば、 マウス、 ラット、 ニヮトリ） 、 昆虫細胞 (例えば、 カイコ） 、 糸状菌 （例えば、 コウジカビ） 、 細菌 （例えば、 大腸菌、 枯草菌） 、 酵母等を使用することができる。 ベクタ一の宿主細胞への導入は、 公 知の方法を用いて行なうことができる。 例えば、 プロトプラスト法、 リチウム法、 エレクトロポレーシヨン法、 塩化カルシウム法又はこれらの変法を使用すること ができる。
第二発明の D N Aを組み込んだベクタ一を植物細胞に導入した後、 該植物細胞 を分化させることにより、 第二発明の D N Aを各細胞中に有する組換え植物を得 ることができる。
植物細胞への遺伝子導入法としては、 例えば、 ァグロパクテリゥムを用いる方 法、 エレクトロボレ一シヨン法、 ポリエチレングリコール法、 マイクロインジェ クシヨン法、 微小物衝突法等を使用することができるが、 目的の植物細胞に遺伝 子を導入できる方法である限りこれらには限定されない。
宿主となる植物種は、 第二発明の D N Aを組み込んだベクターと適合し形質転 換され得る植物種である限り特に限定されず、 例えば、 双子葉植物では、 キユウ リ、 トマト、 ハクサイ、 ジャガイモ、 キャベツ、 ダイズ、 ナタネ等を使用するこ とができ、 単子葉植物では、 イネ、 ォォムギ、 トウモロコシ、 コムギ等を使用す ることができる。
第二発明の D N Aを組み込んだベクタ一を導入した植物細胞の分化は、 常法に 従って行うことができる。 例えば、 植物細胞への遺伝子導入法としてリーフディ スク法を使用する場合、 無菌培養した植物の無菌葉から採取したリーフディスク をァグロパクテリゥム · ッメファシエンス EHA101の培養液に浸潰した後、 茎葉分 化培地で培養してカルスを形成し増殖させる。 茎葉分化培地としては、 例えば MS 培地等の公知の培地に植物ホルモン （例えば、 2，4- D、 NAA、力イネチン） を添加 したものを使用することができる。 その後に選択用の茎葉分化培地を用いてカル スの選択を行う。 選択用培地としては、 茎葉分化培地に例えばカナマイシン、 セ フォタキシム等を加えたものを使用することができる。 さらに MS培地等の公知の 培地にカナマイシン、 セフォタキシム等を加えた根分化培地を用いて培養するこ とにより、 植物細胞をさらに分化させることができる。 その後、 発根した幼植物 体を土壌に移して栽培することによリ植物体とすることができる。
第二発明の D N Aを宿主細胞に導入することにより発現される N O M T活性を 有するタンパク質は、 ナリンゲニンの 7位の水酸基をメチル化し、 ナリンゲニン からサクラネチンを合成することができる。 そして、 サクラネチンはファイ トァ レキシンとして機能し得る。 従って、 第二発明の D N Aを植物に導入することに より、 植物内においてナリンゲニンからサクラネチンを誘導することができ、 こ れによって植物に優れた抗菌性を付与することができるものと考えられる。 また、 この D N Aにはィントロンがないので、 バクテリァ等の原核生物でも発現させ、 酵素活性のあるタンパク質を大量に発現することも可能と考えられる。 本発明の第三 （以下、 「第三発明」 という） は、 以下の （a) 又は （b) に示 す DNAである。
( a) 配列番号 2記載の塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 2記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又 は付加された塩基配列を含む DN Aであって、 プロモータ一活性を有する DN A 配列番号 2記載の塩基配列を含む DNAは、 イネ NOMTゲノム DN Aの塩基 配列 （配列番号 1 ) からプロモーター領域を特定し、 該プロモータ一領域を単離 することにより得ることができる。
イネ NOMTゲノム DNAは上記のようにして得ることができ、 そのプロモ一 タ一領域は常法に従って特定することができる。 例えば、 c DN Aライブラリー から得られた遺伝子の塩基配列とゲノム D N Aライブラリーから得られた遺伝子 の塩基配列とを比較する方法等を用いてプロモーター領域を特定することができ る。
プロモーター領域の単離は適当な制限酵素を用いることによって行なうことが できる。 例えば、 イネ NOMTゲノム DNAを制限酵素 HindIII、 EcoRI、 Saul II AI等で部分分解することによりプロモーター領域を含む DN A断片を単離するこ とができる。
配列番号 2記載の塩基配列を含む DNAは、 イネゲノム DNAを錡型とし、 配 列番号 2記載の塩基配列の 5'末端と相補的な塩基配列からなるプライマ一及び配 列番号 2記載の塩基配列の 3'末端と同一の塩基配列からなるプライマーを用いて PCRを行うことにより得ることもできる。
配列番号 2記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又は付 加された塩基配列を含む DN Aであって、 プロモータ一活性を有する DN Aは、 本願の出願時において常用される技術、 例えば、 部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res.10, 6487 - 6500， 1982)により得ることができる。
配列番号 2記載の塩基配列において欠失、 置換又は付加される塩基の個数及び 位置は、 配列番号 2記載の塩基配列からなる DNAのプロモータ一活性を失わせ ない限り、 特に限定されない。
第二発明の D N Aは、 プロモータ一活性を有する。 従って、 第二発明の D N A 及びその下流に連結した目的の遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入すること により、 目的の遺伝子を発現させることができる。
ここで、 目的の遺伝子とは、 それにコードされている遺伝子産物 （例えば、 タ ンパク質、 r R N A、 アンチセンス R N A等） の発現を目的とする遺伝子を意味 する。
本発明の D N Aの下流に連結する目的の遺伝子は、 特に限定されず、 いかなる 遺伝子であってもよい。 このような遺伝子としては、 例えば、 キチナ一ゼ遺伝子、 /3 - 1， 3グルカナ一ゼ遺伝子、 PAL (フエ二ルァラニンアンモニアリア一ゼ） 遺伝 子等を例示できる。
第二発明の D N Aを組み込むベクタ一は特に限定されず、 例えば、 pUC18、 pUC 19、 pBluescr i pt, pBR322、 ρΒΠ21、 pBlGRZ、 TAC等を使用することができる。 ベクタ一を導入した形質転換体の検出を容易にするために、 第二発明の DMの 下流に適当なマーカー遺伝子やレポーター遺伝子を揷入しておいてもよい。 マ一 カー遺伝子としては、 例えば、 テトラサイクリン、 アンピシリン、 カナマイシン、 ネオマイシン、 ハイグロマイシン、 スぺクチノマイシン等の抗生物質の耐性遺伝 子を例示できる。 また、 レポーター遺伝子としては、 /3 -ダルク口ニダ一ゼ （GU S) 、 ルシフェラーゼ （LUX) 、 緑色蛍光タンパク質 （GFP) 等をコードする遺伝 子を例示できる。
ベクターを導入する宿主細胞は、 第二発明の D N Aを組み込んだベクターと適 合し形質転換され得るものである限り特に限定されず、 一般的に使用される天然 細胞、 人工的に樹立された組換え細胞などの種々の細胞を使用することができる。 例えば、 植物細胞 （例えば、 イネ、 キユウリ、 トマト、 ジャガイモ、 タバコ） 、 動物細胞 （例えば、 マウス、 ラット、 ニヮトリ） 、 昆虫細胞 （例えば、 カイコ） 、 酵母等を使用することができる。 ベクタ一の宿主細胞への導入は、 公知の方法を 用いて行なうことができる。 例えば、 プロトプラスト法、 リチウム法、 エレクト 口ポレーシヨン法、 塩化カルシウム法、 又はこれらの変法を使用することができ る。 本発明の第四 （以下、 「第四発明」 という） は、 以下の （a) 又は （b) に示 すタンパク質である。
( a) 配列番号 3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b) 配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1又は複数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列を含 タンパク質であって、 ナリンゲニン 7— O—メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号 3記載のアミノ酸配列は、 イネ NOMTタンパク質のアミノ酸配列に 相当する。 配列番号 3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、 例えば、 c D NA (配列番号 1 2) 、 及び例えば pET156 (Novagen, Madison, WI) 等の c D N Aを発現させるための適当なプロモーターを含むベクターで形質転換すること によって、 大腸菌において c DNAを過剰発現させることによって得ることがで きる。 大腸菌で発現したタンパク質は、 XZ Heら （Plant Molecular Biology 3 6:43-54, 1998) に記載のような方法で N O M T酵素活性を確かめることができ る。
配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1又は複数個のアミノ酸が欠失、 置 換又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、 ナリンゲニン 7—0 一メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質は、 本願の出願時において 常用される技術、 例えば、 上記の遺伝子の修飾において記載したように、 部位特 異的突然変異誘導法等によって c DN Α構造を修飾することによって得ることが できる。
配列番号 3記載のアミノ酸配列において欠失、 置換又は付加されるアミノ酸の 個数及び位置は、 NOMT活性を有するタンパク質を発現し得る限り特に限定さ れない。 実施例
〔実施例 1〕 イネゲノムの B AC (バクテリア人工染色体） ライブラリーの構築 イネの japonica品種シモキタからの B AC (バクテリア人工染色体） ベクタ一 によるゲノム DN Aライブラリ一の作製は、 Molecular General Genetics (199 7) Vol.254, p611- 620に記載された方法に従って行った。
このようにして構築したイネゲノムの B A Cライブラリ一は、 平均インサート サイズ約 155kbp、 イネの約 7ゲノム相当をカバーするものであり、 1枚のマイク 口プレートサイズのメンブレンに約 1ゲノムに相当する 3072個のクローンが載つ ている。 また、 このイネゲノムの BAGライブラリ一は、 クロ一ンを整理して保 存してあるので、 数枚のメンブレンを適当なプローブを用いてコロニ一ハイブリ ダイゼ一シヨンすることにより目的のポジティブクローンをスクリーニングする ことができる。
〔実施例 2〕 イネ NOMTのアミノ酸配列の決定
イネ （ヒトメボレ） を児玉らの方法 （Phytochemi stry， 31： 3807- 3809 (199 2) ) に従って栽培した後、 紫外線を照射した。 紫外線照射イネ （lg) を、 14mM メルカプトエタノール、 5mM EDTA、 10% (w/v)グリセロール及び 10% (w/w)ポリビ ニルポリピロリ ドンを含む 0.2M Tris-HCl緩衝液 （pH7.8) 4ml並びに海砂 0.05gの 存在下で、 乳鉢中で磨砕した。
磨砕液を 18， 500 X gで 5分間遠心分離し、 遠心上清液を 50 ; mナイ口ン膜で濾過 し、 緩衝液 B (10%グリセロール、 Im EDTA- 2Na及び 14mM 2-メルカプトエタノ ールを含む 0.02M Tris-HCl (pH7.8) ) で平衡化したアデノシン-ァガロースカラ ム (0.7xl5cm) に添加した。
ここで、 緩衝液 Bで平衡化したアデノシン-ァガロースカラムは次のように作 製した。 5' -AMP-ァガロース 5ml (Sigma社） を蒸留水で洗浄した後、 1mlの牛小 腸アルカリホスファタ一ゼ用緩衝液 （500mM Tris-HCl (pH9.0) ) に溶解した 800 単位の牛小腸アルカリホスファタ一ゼとともに （全量 10ml) インキュベーション し、 ゲルを脱リン酸化した。 インキュベーションはゲルをバイアル瓶に入れ、 3 TCで 24時間バイァル瓶を連続的に回転させながら行った。 得られたゲルをカラ ムにつめ、 最初は蒸留水により洗浄し、 次いで 2M NaClを含む 10mlの緩衝液 Bで 洗浄し、 最後に 100mlの緩衝液 Bで平衡化させた。 このようにして、 緩衝液 Bで 平衡化させたアデノシン-ァガロースカラムを作製した。
緩衝液 B 50mlを用いて 18ml/hの流速でカラムを洗浄し、 続いて 0.2M KC1を含 む緩衝液 B 50mlを用いいて洗浄した。 NOMTを 4mM S-アデノシル -L-メチォ二 ン （SAM) 及び 0.2M KClを含む緩衝液 B 25mlにより選択的に溶出させ、 溶出液を 1.75mlずつ分取した。
得られた各画分の NOMT活性を以下のように測定した。
酵素溶液 40μ1、 375 ζΜナリンゲニン： 5mM DTT及び 1 mM EDTAを含む 0.1Mグリ シン -水酸化ナトリウム緩衝液 （PH9.5) と 92.5Bq/ l S- [14C]アデノシルメチ ォニンとを混合し （容量 160 1) 、 27°Cで 20分間反応させた。 反応終了時に 6N塩 酸 25μ1を加えた後、 0.4% PP0を含むトルエンシンチレ一タ一 1 mlを加えてよく 攪拌し、 液体シンチレーシヨンカウンタ一で生成したサクラネチンの放射活性を 測定することにより NOMT活性を測定した。
各画分のうち NOMT活性を有する画分を集めて、 緩衝液 Bで平衡化したスー パーデラックス 75ゲル濾過クロマトカラム （3x30cm) (Pharmacia Biotech社 製） に添加して、 緩衝液 B (流速 18ml/h) を用いて NOMTを溶出し、 1画分 3. 5mlずつ回収し、 上記と同様にして各画分の NOMT活性を測定した。 これによ つて精製 NOMTを得ることができた。
得られた精製 NOMTをセントリコン- 30 (Amicon, Beverly, USA) を用いて濃 縮した後、 脱塩し （2X500 Z 1ミリ Q精製水） 、 次いで遠心乾燥濃縮器によって 乾燥させた。 乾燥 NOMT (約 10 g) を 1%シァノゲンブロマイ ドを含む 70%ギ 酸 200μ 1に溶解し、 暗所にて 20時間インキュベーションした後、 上記と同様にし て乾燥させた。 この乾燥物を TRICINE SDS-PAGE (16.5% Τ、 3% Cゲル） （Schag ger Hら， Anal. Biochem.166： 368- 379 (1987) ) に供した後、 PVDFメンブラン (Fluorotrans, Pal 1, Tokyo, Japan) にブロッテイングした。 染色したペプチドを メンブランから切り取り、 直接シークェンス用カートリッジにセットし、 ABI494 プロティンシークェンサ一によりアミノ酸配列を決定した。
このようにして NOMTの N末端側のアミノ酸配列 （配列番号 4) 及び C末端 側のアミノ酸配列 （配列番号 5) を決定することができた。 〔実施例 3〕 イネ NOMTゲノム DNAを含むクロ一ンの選抜
実施例 2で決定した NOMTのアミノ酸配列 （配列番号 4及び 5) に基づいて、 DNAプライマ一を設計した。 すなわち、 精製 NOMTの部分アミノ酸配列から、 遺伝子暗号の重複の少ない N末端側 2ケ所と C末端側 2ケ所とを選び、 それに基 づいてセンス鎖のプライマ一 F1及び F2とアンチセンス鎖のプライマ一 R1及び R2を 設計した。 プライマ一 Fl、 F2、 R1及び R2の塩基配列は以下に示す通りである。 プライマ一 F1 ： atgaa(c/t)ca(a/g)ga(c/t)aa(a/g)gtictiatgga(a/g)ag (配列番 号 8)
プライマ一 F2： tt(g/c)aa(c/t)aa(a/g)gcita(c/t)ggiatgacigcitt (配列番号 9)
プライマ一 R1： tcict(a/g)ca(a/g)tc(a/g)tgiagiat(a/g)ca(c/t)ttcat (配列番 号 1 0 )
プライマー R2： agcatiatcat(a/g)tciac(a/g)tg(a/g)aaiac(a/g)cc (配列番号 1 1 ) なお、 上記塩基配列中、 「i」 はイノシンを意味する。 （g/c)、 （c/t)、 及び（a/ g)は、 その位置における塩基がそれぞれグァニンまたはシトシン、 シトシンまた はチミン、 及びアデニンまたはグァニンであることを意味する。
イネの全ゲノム DN Aを錡型とし、 上記のように設計した DN Aプライマーを 用いて P C Rを行った。
P C R反応液の組成は以下の通りである。
Takara Ex Taq (5U/ M 1) 0.125^ 1 (0.625U)
lOxbuffer 2.5^ 1
2.5ra dNTP 2 1
Primer (20/iM) 2.5 1
Template 125ng
H20 Total 25 1
P C Rは、 熱変性 （94°Cで 3分） を 1サイクル、 熱変性 （94°Cで 1分） 、 ァニー リング （65°Cで 2分） 及び伸長反応 （72°Cで 2分） を 29サイクル、 伸長反応 （72°C で 5分） を 1サイクル行い、 その後 4°Cで保存した。
P C Rによってプライマー F2と R2の組み合わせによって増幅されたものと予想 される長さのシングルバンドが得られ 。 なお、 イネ N O M Tゲノム D N A (配 列番号 1 ) におけるプライマ一 F2及び R2の結合位置を図 2に示す。
P C Rによって得られた増幅断片をシークェンスして N O M Tのアミノ酸配列 と一致していることを確認した後、 該増幅断片を ECL (Amersham社） で標識した。 次いで、 この標識断片を ECLプローブとして用いて、 実施例 1で構築したイネゲ ノムの B A Cライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼ一ションを行った結 果、 6個のポジティブクローンが得られた。
このクローンを培養し、 得られた B A Cプラスミ ドを制限酵素 Hindl l lで消化 した後、 サザンハイブリダィゼ一シヨンを行った。 その結果、 3個のクローン（2 5-4C、 7-4D、 58- 1A)において強いシグナルを持つ約 15kbpのポジティブバンドが 検出された。 そこで、 このポジティブバンド （約 8kb) を 25- 4Cクローンから Spel で切り出して大容量バイナリ一ベクター pBI GRZに導入した。 この pBIGRZベクター は、 低コピー数であるため lOkbp以上のィンサ一トを大腸菌及びァグロパクテリ ゥム等の中に安定して保持できるとともに、 そのィンサ一ト部分をイネを含む多 くの植物にァグロパクテリゥム法により直接導入することができ、 さらに適当な プライマ一を用いることによリインサートのどこからもダイレクトシ一クエンス が可能である。
得られたクローンに対して、 まず先に作製したプライマ一 F 2及び R 2により P C R増幅された断片の配列をもとに設計されたプライマ一、 及びクローニング サイトの両側プライマーとを用いてクロ一ニングサイ トの両側及び P C R増幅断 片相当部分から配列の決定を行い、 そのデータに基づいて新たなプライマ一を合 成することにより、 ギャップを埋めるようにシークェンスを延ばした。 こうして オープンリーディングフレーム及びィントロンを含む NOMTコーディング領域 の全長と約 1.4kbpのプロモータ一領域とのシークェンス、 5， 末端から 4371塩基 までを主に一方向に読み取ることができた。 この結果得られたイネ NOMTゲノ ム DN Aの塩基配列を配列番号 1に示す。 配列番号 1に示すイネ NOMTゲノム DNAの塩基配列のうち、 1429〜 1859番目及び 3607~4282番目の塩基によって表 される領域がェクソンであリ、 1860〜3606番目の塩基によって表される領域がィ ントロンであると考えられた （図 1 ) 。，イネ NOMTゲノム DNAの塩基配列か ら推定されるイネ NOMTのアミノ酸配列を配列番号 3に示す。
なお、 上記のようにして得られたイネ NOMTゲノム DNAの予想塩基配列
(配列番号 1 ) から推定される NOMTのアミノ酸配列 （配列番号 3) と、 実施 例 2で紫外線照射イネから単離 ·精製して決定した NOMTの部分アミノ酸配列
(配列番号 4及び 5) とを比較した結果、 大部分は一致するが、 一部は異なって いた。 この差は、 トリブトファン （W) 、 システィン （C) 、 メチォニン （M) 等のアミノ酸の性質に起因するタンパク質配列決定の際の実験誤差、 誘導体のピ —クが接近していること、 そして実施例 2において単離 ·精製された NOMTが 微量であることから生じると考えられる。 図 1は、 実施例 2で単離 .精製した N O M Tのァミノ酸配列とイネ NOMTゲノム DN Aの塩基配列との対応関係を示 し、 単離■同定された DNAがイネ NOMTゲノム DNAであることに間違いな いことが明らかとなった。 図 1において、 黒塗りの部分が、 実施例 2で単離 '精 製された NOMTのアミノ酸配列に対応する部分である。
〔実施例 4〕 イネ NOMTゲノム DN A配列の決定
実施例 1では主に片方向からしか読まれなかったので、 本遺伝子の構造を双方 向から読みとることを目的として、 上記のィンサ一トを 4塩基認識酵素 Saufflal で部分分解して、 0.5-2k Bの部分をプラスミ ド pBSKにクローニングし、 それら をプラスミ ドのクローニング部位両端のプライマ一を用いてランダムに読むこと により、 かなりの領域を効率良く読むことができた。 しかし、 いくつかのギヤッ プが残ったので、 その部分については新たにプライマ一を設定し直して、 配列を 読むようにした。 これにより、 双方向で 5026まで、 片方向も含めると 524 1残基まで、 遺伝子の 3' 側も十分な余裕を持って読むことができた （配列番号 6) 。 上記実施例 3で得られた配列 （配列番号 1 ) とは、 1 2力所の差違があつ たが、 タンパク質のアミノ酸配列における違いはなかった。
酵素タンパク質の 1次構造の分析から決められた配列 （N側 （配列番号 4) 、 C側 （配列番号 5) )と遺伝子から予想される配列 （配列番号 3) では、 図 5で 示すような異同があるが、 タンパク質から W (トリブトファン）、 C (システィ ン） 、 M (メチォニン） 等を決定することは困難であり、 大半はこの種の原因に よる差である。 その他の差では 9残基の異同が認められるが、 I ZV、 YZF、 AZEも見誤りやすい。 残る 6塩基の異同はタンパク質の量が少ないことによる 読み違いと思われ、 今回取られた遺伝子はサクラネチン合成酵素遺伝子そのもの と考えられる。 また、 サザン分析、 及び B ACによるゲノム分析でも、 本遺伝子 がシンダルコピーであることが示されており、 この 6残基分だけが異なる遺伝子 が別に存在することは考えにくい。
上記のようにして得られたイネ NOMTゲノム DN Aの塩基配列 （配列番号 6) において、 アミノ酸配列との比較から、 1430〜1860番目及び3605〜4277番目 の塩基によって表される領域がェクソンであることが判明した。
〔実施例 5〕 イネ NOMT c DNA配列の決定
イネ （二ツボンバレ） 緑色葉から界面活性剤を使用して核酸を抽出し、 タンパ ク質をフエノール抽出によって除去した後、 1容量の 5M L i C lを添加して RNAを沈殿させてから 70 %E t OHですすいだ。 再溶解した RNAをオリゴ dTラテックスビーズ （Roche) を用いてマニュアルに記載のようにして分画し て mRNAを得た。 上記 mRNAを錡型とし、 オリゴ d Tをプライマーとして逆 転写酵素により c DN Aを合成した。 一本鎖 （ss) c DNAを T4RNAリガ一 ゼを用いて一本鎖 DNAアダプターにライゲートし、 オリゴ d T及びアダプター をプライマ一として PCR増幅した。 次いで c DNAを平滑末端としてから； L Z APにライゲートして、 コンビテント大腸菌に形質転換して、 c DNAライブラ リーを構築した。 c DNAライブラリ一のコロニーをブロットしたナイロン膜に、 F 2及び R 2のプライマ一セット及びイネゲノム DN Aを錡型として用いて PC R増幅した産物をプローブとして用いてハイブリダイズさせて N 0 M Tクローン を検出した。 陽性プラークの増幅とハイプリダイゼ一シヨンによる精製を数回行 つた後、 精製クローンについて、 インサートに隣接するべクタ一のクロ一ニング 部位からプライマ一を用いて配列を伸長することによって、 揷入された c DNA の配列を決定した。 '
その結果、 2本の長い c DN Aクローン配列である c DNA#5- 37及び c DN A#7が得られた。 これらは中心部の長い範囲 （配列番号 6の 1597-4210) にわた つて重複しておリ、 また一方のクローンで欠けている 5' -または 3' -末端領域をそ れぞれ補い合うものであった。 こうした手順に従って、 c DNAの塩基配列を決 定した （配列番号 1 2) 。 産業上の利用可能性
本発明によって、 イネ NOMTゲノム DNA及び該 DNAの機能 （すなわち、 ィネ細胞に導入した場合に N 0 M T活性を有するタンパク質を発現し得る機能） を実質的に有する DNAが提供される。 多くの植物は NOMTの基質であるナリ ンゲニンを有するので、 本発明の DNAを植物に導入すれば、 植物内においてナ リンゲニンからサクラネチンを誘導することができ、 これによつて植物に優れた 抗菌性を付与することができる。 また、 c DNAにより大腸菌での大量合成が可 能と考えられることから、 比較的容易に得られるナリンゲニンからサクラネチン を合成することも可能となる。
また、 本発明によってプロモーター活性を有する DNAが提供される。 本発明 の DNAは、 プロモーター活性を有するので宿主に外来遺伝子を導入する際のプ ロモ—ターとして使用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとリ入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の （a) 又は （b) に示す DNA。
(a) 配列番号 6記載の塩基配列を含む DNA、
(b) 配列番号 6記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又 は付加された塩基配列を含む D N Aであって、 イネまたは他の植物細胞に導入し た場合にナリンゲニン 7— O—メチルトランスフエラーゼ活性を有するタンパク 質を発現し得る DNA。
2. 請求項 1記載の DNAを含む組換えべクタ一。
3. 請求項 2に記載の組換えべクタ一によって形質転換された宿主細胞。
4. 請求項 2に記載の組換えベクターを導入した細胞の分化によって得られる形 質転換体。
5. 以下の （a) 又は （b) に示す DNA。
(a) 配列番号 1 2記載の塩基配列を含む DNA、
(b) 配列番号 1 2記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換 又は付加された塩基配列を含む D N Aであって、 イネまたは他の細胞に導入した 場合にナリンゲニン 7— 0—メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質 を発現し得る DNA。
6. 請求項 5記載の DNAを含む組換えべクタ一。
7. 請求頃 6に記載の組換えべクタ一によって形質転換された宿主細胞。
8. 請求項 6に記載の組換えべクタ一を導入した細胞の分化によって得られる形 質転換体。
9. 以下の （a) 又は （b) に示す DNA。
(a) 配列番号 2記載の塩基配列を含む DNA、
(b) 配列番号 2記載の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、 置換又 は付加された塩基配列を含む D N Aであって、 プロモ一ター活性を有する D N A。
1 0. 請求項 9記載の DNAを含む組換えベクター。
1 1. 請求項 1 0に記載の組換えベクターによって形質転換された宿主細胞。
1 2. 以下の （a) 又は （b) に示すタンパク質。
(a) 配列番号 3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b) 配列番号 3記載のアミノ酸配列において、 1又は複数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、 ナリンゲニン 7— 0—メチルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質。
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