WO2000052201A2 - Testsystem zum nachweis einer spleissreaktion, sowie dessen verwendung - Google Patents

Testsystem zum nachweis einer spleissreaktion, sowie dessen verwendung Download PDF

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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a test system containing
  • Genome interrupted by one or more sequences (introns) not coding for the protein.
  • these non-coding areas are transferred to the primary transcript.
  • this precursor mRNA in order to generate a correct form of the mRNA, this precursor mRNA (pre-mRNA) must be processed.
  • the pre-mRNA is processed by removing the introns and fusing the coding regions (exons). Only then can a continuously read nucleotide strand be made available for translation in the cytoplasm.
  • the formation of mRNA in eukaryotes therefore requires a so-called splicing process in which the non-coding gene regions (introns) are removed from the primary gene transcript.
  • the splicing takes place in the core before the mRNA is transported out of the core. It is generally carried out in a two-step mechanism, in each of which a transesterification step is involved (Moore, JM et al., (1993) Splicing of precursors to messenger RNAs by the Spliceosome. In The RNA world, Edited by Gesteland RF , Gesteland, JF, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 303-358). The first step generates a free 5 ' exon and a so-called lariat structure of the intron, which is still connected to the 3 ' exon.
  • the lariat structure contains a branched RNA, which is esterified by esterifying the 5 ' end of the intron with a 2 ' hydroxyl group of a ribose in an adenosine, which is approximately 20-40 nucleotides upstream of the 3 ' end of the Introns is created.
  • the second catalytic step leads to ligation of the exons and the release of the
  • the second class consists of so far little characterized proteins, which are not firmly bound to the snRNPs and are therefore called non-snRNP splice factors (Lamm, GM & Lamond, AJ (1993) Biochim. Biophys. Acoph. 1173, 247; Beggs , JD (1995), Yeast splicing factors and genetic strategies for their analysis, In: Lamond, Al (ed) PremRNA Processing Austin, RG Company, Texas, pp. 79-95. Krämer, A. (1995), The biochemistry of pre-mRNA splicing. In: Lamond, Al (ed), Pre-mRNA Processing. Austin, pp. 35-64).
  • composition of the snRNPs is best examined in HeLa cells (Will, C.L. et al., (1995) Nuclear pre-mRNA splicing. In: Eckstein, F. and Lilley, D.M.J.
  • the snRNPs lie in a 12S U1 snRNP, a 17S U2 snRNP and a 25S [U4 / U6.U5] tri- snRNP complex.
  • the tri-snRNP complex dissociates into a 20S U5 and a 12S U4 / U6 particle.
  • the U4 and U6 RNAs are base-paired in the U4 / U6 snRNP via two intermolecular helices (Bringmann, P. et al. (1984) EMBO J., 3, 1357;; Hashimoto, C. & Steitz, JA (1984) Nucleic Acids Res., 12, 3283; Rinke, J. et al., (1985) J. Mol. Biol., 185, 721; Brow,
  • the snRNPs consist of two groups of proteins.
  • the group of general proteins (B / B ⁇ D1, D2, D3, E, F and G) is contained in all snRNPs.
  • each snRNP contains specific proteins that are only contained in this.
  • the U1 snRNP contains three additional proteins (70K, A and C) and the U2 snRNP contains eleven additional proteins.
  • the 20S U5 snRNP carries nine additional proteins with a molecular weight of 15, 40, 52, 100, 102, 110, 116, 200 and 220 kDa, while the 12S U4 / U6 snRNP carries two additional proteins with a molecular weight of contains approx.
  • the 25S tri-snRNP [U4 / U6.U5] contains five additional proteins with a molecular weight of approx. 15.5, 20, 27, 61 and 63 kDa.
  • the individual components pre-mRNA, snRNPs and non-snRNP proteins
  • spliceosome the individual components (pre-mRNA, snRNPs and non-snRNP proteins) are brought together in a step-by-step process. This is achieved not only through interactions of the pre-mRNA with the protein-containing components, but also through numerous interactions between the protein-containing components themselves
  • the sequence of the pre-mRNA carries specific recognition sequences for the different splice components.
  • the U1 snRNP binds to the 5 ' splice via these recognition sequences. Region of the intron of the pre-mRNA.
  • an as yet undetermined number of various other factors eg SF2 / ASF, U2AF, SC35, SF1 attach to this complex and cooperate with the snRNAs in the further formation of the pre-spliceosome.
  • the U2 snRNP particle interacts with the so-called branch site in the intron area (Krämer, A. & Utans, U. (1991) EMBO J., 10,
  • the [U4 / U6.U5] tri-snRNP and a number of previously unspecified proteins interact with the pre-spliceosome to form the mature spliceosome (Moore, JM et al., (1993) supra).
  • Pre-mRNA, snRNAs and sn-RNP solved and new ones formed. It is known, for example, that before or during the first catalytic step of the splice reaction in the interacting structures of U4 and U6, two helices are separated from one another and base pairings are formed between U2 and U6 RNAs through new interactions (Datta, B. & Weiner, AM (1991) Nature, 352, 821;; Wu, JA & Manley, JL (1991)
  • different mature mRNAs can be formed from one and the same primary transcript, which code for different proteins.
  • This alternative splicing is regulated in many cases.
  • This mechanism can e.g. can be used to switch from a non-functional to a functional protein (e.g. transposase in Drosophila).
  • a functional protein e.g. transposase in Drosophila
  • alternative splicing is carried out in a tissue-specific manner.
  • the tyrosine kinase encoded by the src proto-oncogene in nerve cells by alternative
  • the NS1 protein which is encoded by the genome of the influenza virus, can also interfere with the splicing by binding to the U6 snRNA.
  • the protein binds to nucleotides 27-46 and 83-101 of human U6 snRNA and thus prevents U6 from interacting with partners U2 and U4 during the splicing process (Fortes, P. et al. (1994) EMBO J. , 13, 704; Qiu, Y. & Krug, RM (1995) J. Virol., 68, 2425.
  • the NS1 protein also appears to be exported from the nucleus via binding to the poly-A tail of the mRNA formed (Fortes, P. et al.
  • splicing can also be inhibited by generating anti-sense RNA which bind to the intron sequences of the mRNA to be spliced (Volloch, V. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm ., 179, 1600). Hodges and Crooke were able to show that in the case of weakly recognized splice sites, the binding of oligonucleotides is sufficient to successfully prevent splicing. If, on the other hand, recognized splicing sites are preferably incorporated into the constructs, oligonucleotides are required which can additionally activate RNase H (Hodges, D. & Crooke ST (1995) Mol.
  • an mRNA is generally first produced by in vitro transcription. Genetic constructs from viruses, e.g. B. adenoviruses, or cellular structural genes. Such mRNAs contain all the important structural elements that are necessary for the recognition of the mRNA by the spliceosome and the splicing process.
  • the mRNA is radiolabelled so that, after separation on a denaturing urea-polyacrylamide gel, the characteristic band patterns can be used to assess whether a splicing reaction has occurred or in which reaction step a disturbance has occurred.
  • test systems of this type are very time-consuming and labor-intensive and are therefore not suitable for the systematic detection of substances which can modulate the splicing.
  • test system with a gel-free detection system is suitable for detecting a splicing reaction, to overcome the disadvantages of the conventional test system described above and is therefore suitable for high-through put screening, for example in a robot system.
  • the present invention therefore relates to a test system comprising (a) one or more, identical or different immobilized nucleic acid (s) with at least one splicable nucleic acid,
  • the nucleic acid to be examined must be immobilized on a solid phase.
  • the nucleic acid can be immobilized, for example, covalently, by introducing certain structural elements, for example aptamers, into the nucleic acid to be spliced and using binding partners for these structural elements, or by hybridization.
  • This probe can be, for example, an oligonucleotide used for hybridization to the nucleic acid to be examined or a binding partner that binds to structural elements introduced into the nucleic acid to be examined.
  • the gel-free detection system therefore preferably contains at least one probe.
  • the probe is a nucleic acid which is complementary to the splicable nucleic acid, a low molecular compound which binds the splicable nucleic acid and / or a peptide or protein which binds the splicable nucleic acid.
  • the splicable nucleic acid contains at least two exons which are separated by at least one intron.
  • the complementary nucleic acid is complementary to at least one intron, to at least one exon and / or to at least one transition point from one exon and one intron and / or to the exon / exon boundary that resulted after the fusion of the two exons.
  • the complementary nucleic acid serves as a probe for the detection of a splice reaction.
  • the intron released during the splicing reaction can be detected by means of the gel-free detection system, from which it can be concluded that both sub-steps of the splicing reaction have been completed.
  • a suitable detection system for example a nucleic acid complementary to a transition point between an exon and an intron, can be used to determine whether the exon has been detached from the intron during the splicing process, which can provide information about whether the first splicing reaction on 5 ' -End of the intron and / or the second splice reaction took place at the 3'-end of the intron.
  • a suitable detection system for example a nucleic acid complementary to a transition point between an exon and an intron, can be used to determine whether the exon has been detached from the intron during the splicing process, which can provide information about whether the first splicing reaction on 5 ' -End of the intron and / or the second splice reaction took place at the 3'-end of the intron.
  • the probe is a low molecular weight compound, for example theophylline, xanthine or an aminoglycoside such as tobramycin.
  • the splicable nucleic acid or a nucleic acid of the gel-free detection system that is complementary to the splicable nucleic acid contains a so-called aptamer structure, ie. H. a binding sequence for such binding partners (see e.g. Jenison, RD et al. (1994) Science 263, 1425-1429, Hamasaki, K. et al. (1998) Biochem. 37, 656-663 or Kiga, D. et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26 (7), 1755 - 1760), the splicing process can be detected particularly easily via the binding partner.
  • the binding partner can be a nucleic acid binding protein, in particular an "Iran Responsive Element Binding Protein” (IBP), which recognizes a recognition sequence for a nucleic acid binding protein, in particular an "Iran Responsive Element” (IRE) .
  • IBP Iran Responsive Element Binding Protein
  • IRE Iran Responsive Element
  • binding partner and structural element in the nucleic acid are also suitable for immobilizing the splicable nucleic acid to be investigated on a solid phase.
  • the binding partner must be anchored to the solid phase in a suitable manner.
  • the binding partner can be covalently bound to the solid phase.
  • the coupling of biotin to the nucleic acid and the use of (strept) avidin bound to the solid phase are suitable for anchoring the nucleic acid. This anchoring can also be achieved, for example, by using antibody / antigen interactions.
  • the probe contains a label, for example a radioactive label, a label with fluorescent dyes, with biotin, with digoxigenin and / or with antibodies.
  • the label is preferably attached to the ligand, for example to the complementary nucleic acid, to the low molecular weight compound or to the nucleic acid binding protein.
  • fluorescent dyes it can be determined in a simple and rapid manner in automated systems whether, for example, by removing the binding partner of the probe in the nucleic acid during the splicing process, a splicing reaction, for example in the presence of at least one substance to be investigated, can proceed undisturbed.
  • the splicable nucleic acid and the probe-binding nucleic acid are linked to one another.
  • the probe-binding nucleic acid is preferably a nucleic acid that can bind a low-molecular compound, for example a so-called aptamer, and / or a nucleic acid binding protein.
  • probe-binding nucleic acid is abbreviated with "SE” for structural element in the following preferred constructs, where "3 ' region” means a nucleic acid section at the 3 ' end of the nucleic acid :
  • SE structural element introduced in the 5'-exon: - T7 promoter— SE— Exoni— Intron - Exon2— 3'Region—
  • the constructs for 1. are used in particular to demonstrate whether the exoni could be separated from the intron sequence during the splicing process.
  • the construct for 2. is used for the direct detection of a separated intron sequence.
  • Constructs under 3. are used to demonstrate whether Exon2 was successfully separated from the intron sequence.
  • a combination of the constructs according to FIG. 4. serves to prove the individual intermediate and end products during the splicing process.
  • Exoni generally represents a 5 'from the intron and exon 2 generally represents a 3' from the intron.
  • the constructs under 5 contain various additional recognition sequences which, on the one hand, can affect different detection systems and, on the other hand, can enable the nucleic acid to be bound to a solid phase via their binding partners.
  • a probe-binding nucleic acid can be introduced for immobilization in the 3 ′ region, and at the same time another probe-binding nucleic acid can be introduced in the exoni to demonstrate the splicing process
  • nucleic acids for example, three different nucleic acids can be introduced, which serve on the one hand to immobilize the entire nucleic acid and on the other hand to detect the removed intron and to demonstrate the linkage of exoni to the rest of the nucleic acid (see 5th, second construct).
  • the location of the individual probe-binding nucleic acids listed under 5 by way of example can vary according to the constructs described above under 1-4. In addition, the exact location of the individual probe-binding nucleic acids is variable.
  • the nucleic acid preferably the splicable nucleic acid, in particular a nucleic acid according to one of the above-described embodiments, is therefore directly covalently or indirectly bound to a solid phase via a structural element and binding partner to the structural element or by means of hybridization.
  • Direct covalent binding can take place, for example, via the 3 ' terminal cis-diol group of the ribose backbone of the nucleic acid.
  • an RNA can be bound to hydrazine groups of the solid phase after periodate oxidation of the vicinal 2 ' , 3 ' hydroxyl groups of the 3 ' -terminal ribose.
  • Suitable linkers such as, for example, biotin or dicarboxylic acid linkers, are also suitable for indirect binding.
  • the nucleic acid can also be bound via a binding partner, for example via theophylline or xanthine or an aminoglycoside such as tobramycin and / or via a nucleic acid binding protein such as IBP.
  • a binding partner for example via theophylline or xanthine or an aminoglycoside such as tobramycin and / or via a nucleic acid binding protein such as IBP.
  • the sequences of the two aptamers are preferably:
  • the solid phase here is, for example, ceramic, metal, in particular noble metal, glass, plastic or polysaccharides, e.g. an agarose polymer.
  • Probe-binding nucleic acids are also suitable for binding labeled probes.
  • the aptamer-containing nucleic acid can be detected and also quantified.
  • tobramycin can be reacted with commercially available, NH 2 -reactive fluorescent dyes (Wang, Y. et al. (1996) Biochemistry 35, 12338 - 12346).
  • NH 2 -reactive fluorescent dyes Wang, Y. et al. (1996) Biochemistry 35, 12338 - 12346.
  • a 1-aminoalkyl or 1-thioalkyl derivative of 3-methylxanthine is preferably produced, which can bind to the aptamer (Jenison, RD et al. (1994), supra).
  • the splicable nucleic acid is any amino acid sequence having the same or different amino acids.
  • Nucleic acid that can be spliced preferably an RNA, for example in the form of a so-called pre-mRNA or in the form of a DNA that contains RNA sections.
  • the RNA is to contain additional probe-binding sequences, as already described in more detail above, it is advantageous if these have at least approximately 25 nucleotides from the respective splice site on both exon sides the intron side is at least about 17 nucleotides from the branch point and / or at least about 7 nucleotides from the 5 'splice site. This generally ensures that the additional probe binding sequences cannot interfere with the splicing reactions.
  • a further probe-binding nucleic acid suitable for detection or immobilization, as already described above, can preferably be introduced into the MINX-encoding DNA, the restriction enzyme interface preferably being retained.
  • a further identical or different probe-binding nucleic acid can be incorporated for detection or for immobilization, in order to be able to amplify the fluorescence signals or to strengthen the binding to the solid phase.
  • the aptamers Th or To are inserted at the 3 'end of the exon2 of the pre-mRNA and the corresponding binding partner is covalently bound to the solid phase.
  • the corresponding coding nucleic acid sequences are shown in FIGS. 1A and 1B.
  • the corresponding aptamer sequence is inserted as DNA oligonucleotide into the BamHI site of the encoding Minx DNA, ie. H. between positions 219 and 220 of the corresponding Minx pre-mRNA.
  • probe-binding nucleic acids can also be inserted into the intron structure of the pre-mRNA, this being released by the splicing and thus missing in the immobilized mRNA, for example.
  • Such constructs are therefore suitable for the detection of an inhibition of splicing in the first step, ie. H. Opening the mRNA and lariatization, or in the second step, d. H.
  • nucleic acid constructs are in the form of their coding
  • the corresponding aptamer sequence is, for example,
  • Oligonucleotide into the PstI site of the Minx coding DNA i.e. H. between positions 88 and 89 of the corresponding pre-mRNA.
  • connection between Exoni and Intron is in the first splicing step through the spliceosome at the 5 'splice point of the
  • Introns open. Only in the second splicing step is there a covalent link between Exoni and Exon2. The exoni is therefore no longer connected to the mRNA during the first step of the splicing reaction and can therefore be removed from the splicing reaction.
  • a statement can therefore be made as to whether, for example, inhibition has taken place in the first splicing step. If, for example, two different aptamers, which recognize different probes, are installed at the 5 'end of the exoni and in the intron of the pre-mRNA, both the first splicing step and the second splicing step can be followed in a test system. Examples of suitable nucleic acid constructs are in the form of their coding
  • the corresponding aptamer sequence is inserted as a DNA oligonucleotide into the EcoRI site of the coding Minx DNA, ie. H. between positions 9 and 10 of the corresponding Minx pre-mRNA.
  • RNA, 2: 1079-93 For investigations in the yeast system, one can, for example, start from the pre-mRNA for U3 of the yeast (Mougin, A. et al., (1996), RNA, 2: 1079-93) and, for example, suitable aptamers such as e.g. B. incorporate the theophylline or tobramycin aptamers described above.
  • suitable nucleic acid constructs are shown in the form of their coding sequences in FIGS. 4A to 4C.
  • a suitable aptamer as DNA oligonucleotide is inserted into the SacII site of the coding U3 DNA, ie between positions 22 and 23 of the pre-U3 RNA.
  • a suitable aptamer as a DNA oligonucleotide is inserted into the BstNI site of the coding U3 DNA, ie. H. between positions 105 and 106 of the pre-U3RNA.
  • the nucleic acid sequence according to FIG. 5A represents an example of a nucleic acid sequence with an "Iran Responsive Element” (IRE), which is used for investigations in
  • the IRE is inserted at the 3 'end of the Exon2 analogous to the aptamers described above.
  • an IRE element can be inserted, for example, at the 3 'end of exon2 of the pre-U3RNA, as shown in FIG. 5B:
  • Another object of the present invention is therefore a splicable nucleic acid, as exemplified above, and its use for the production of a test system.
  • a composition containing the individual splicing components preferably "small nuclear ribonoprotein particles (snRNP) components and non-snRNP components, is usually used.
  • the snRNP components contain U1, U2, U4, U5 and / or U6 proteins.
  • the cell extracts from animal cells in particular mammalian cells, especially Heia Cells, in particular from cell nucleus extracts from He-La cells or cell extracts from fungi, in particular yeasts, can be obtained by processes which are well known to the person skilled in the art (see examples) generally contain all the important factors for performing splicing in vitro.
  • the present invention therefore also relates to a method for producing a test system, in which at least one splicable and immobilized nucleic acid and at least one gel-free detection system as well as optionally at least one composition containing splicing components and optionally further aids are put together.
  • Preferred embodiments of the individual components have already been described in more detail above.
  • Another object of the present invention is a method for finding an active substance, wherein a) one or more identical or different immobilized nucleic acid (s) with at least one splicable nucleic acid sequence in the presence of at least one substance to be examined and at least one composition containing splice components and if necessary, further aids are incubated under suitable conditions, and b) the splice product which may be formed is detected by means of a gel-free detection system.
  • the active substance can be a pharmaceutically active compound
  • Fungicide a herbicide, a pesticide and / or an insecticide, preferably it is an antibiotic.
  • the substance to be examined is generally a natural one occurring, a naturally occurring and chemically modified and / or a synthetic substance.
  • so-called combinatorial substance libraries can be searched particularly easily and quickly with the methods according to the invention.
  • the present invention is therefore also suitable for diagnosing a disease.
  • Another object of the present invention is therefore a method for
  • Diagnosis of a disease in which a) one or more, identical or different immobilized nucleic acid (s) with at least one splicable nucleic acid sequence are incubated in the presence of at least one composition containing splicing components and, if appropriate, further auxiliaries under suitable conditions, and b) that possibly formed Splice product is detected using a gel-free detection system.
  • the diseases to be diagnosed are preferably hereditary diseases,
  • composition containing splice components can be, for example, a treated or untreated tissue sample from the patient.
  • 1A shows the coding nucleic acid sequence in which a Th aptamer was inserted at the 3 'end of the exon2 of a pre-mRNA coding for Minx.
  • 1B shows the coding nucleic acid sequence in which a To aptamer was inserted at the 3 'end of the exon2 of a pre-mRNA coding for Minx.
  • FIG. 2A shows the coding nucleic acid sequence in which a Th aptamer was inserted into the intron of a pre-mRNA coding for Minx.
  • 2B shows the coding nucleic acid sequence in which a to-aptamer was inserted into the intron of a pre-mRNA coding for Minx.
  • FIG. 3A shows the coding nucleic acid sequence in which a Th aptamer was inserted at the 5 ′ end of the exoni of a pre-mRNA coding for Minx.
  • 3B shows the sequence of an RNA in which a Th aptamer was inserted at the 5 'end of the exoni of a pre-mRNA coding for Minx.
  • 4A shows the coding nucleic acid sequence which codes for a U3 pre-mRNA.
  • Exoni is an insert for a Th or To aptamer.
  • 4B shows the coding nucleic acid sequence which codes for a U3 pre-mRNA.
  • An insertion point for a Th or To aptamer is marked in the intron.
  • 4C shows the coding nucleic acid sequence which codes for a U3 pre-mRNA.
  • An insert for a Th or To aptamer is identified at the 3 'end of the Exon2.
  • Figure 5A shows the coding nucleic acid sequence coding for a Minx pre-mRNA.
  • the sequence for IRE is inserted at the 3 'end of exon2.
  • 5B shows the coding nucleic acid sequence which codes for one of the U3 pre-mRNA.
  • the sequence for IRE is inserted at the 3 'end of exon2.
  • FIG. 6 shows the temporal course of the splicing of MINX and MINX-IRE pre mRNA by HeLa core extract.
  • the mRNA to be spliced consists of at least two exons that are separated by an intron.
  • sequences are included which are suitable for enabling specific recognition by means of RNA binding proteins or low molecular weight compounds.
  • the mRNA is selectively bound to the matrix by coupling these binding proteins or compounds to a matrix.
  • the mRNA is also coupled covalently to the matrix via 3 ' OH groups of the ribose.
  • the sediment is dissolved in 3 ml buffer B (20 mM HEPES, 25% (v / v) glycerin, 0.42 M NaCl, 1, 5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA, 0.5 mM phenylmethysisulfonyl fluoride (PMSF),
  • yeast cells are made in a very similar manner. Yeast cells of a protease-deficient strain (BJ926, EJ101 or similar strains) are sedimented in the logarithmic growth phase by centrifugation (1500 x g, 5 min., 4 ° C.). The cells are ice-cold in two to four times the volume
  • zymolyase buffer 50 mM Tris HCL, 10 mM MgCl 2 , 1 M sorbitol, 30 mM DTT, pH 7.5
  • the cells are centrifuged off (1,500 xg, 5 min., 4 ° C.), taken up in three times the volume of zymolyase buffer with 2 mg (200 U) of Zymolyase 100 T and in for 40 minutes at 30 ° C. on a shaker (50 RPM) - cubed.
  • the spheroblasts formed are centrifuged off (1,500 xg, 5 min.,
  • EDTA 10% (v / v) glycerin, 100 mM KCI, 1 mM DTT, Proteae Inhibitors, 1 mM PMSF, pH 7.5) dialyzed.
  • the dialysate is centrifuged at 10,000 xg (4 ° C.) and the supernatant is stored in liquid nitrogen (Dünn, B. & Wobbe, CR (1994) Preparation of protein extracts from yeast, In: Ausubel, FM, et al. ( eds.) Current proto- cols in Molecular Biology, 2nd Volume, John Wiley and Sons, Inc., USA pp 13.13.1. -
  • RNA sequence arises at the border of the two now connected exons, which is not present in the unspliced pre-mRNA (new sequence).
  • This sequence is used to generate complementary nucleotide sequences that selectively only bind to this new sequence.
  • the splicing carried out is indirectly detected by covalent binding of fluorescent dyes, biotin, digoxigenin or similar molecules or by radioactive labeling.
  • the assay is evaluated in a suitable evaluation device (ELISA reader, fluorescence measuring device, etc.). All experiments described were carried out according to standard methods as described in (Eperon,
  • the construct described in FIG. 5A was transcribed from the plasmid coding for it into the corresponding mRNA by means of in vitro transcription.
  • the corresponding construct without the IRE sequence was also used in the experiments for control and later comparison.
  • the constructs had previously been cloned into the vector pGEM-3Zf (Pharmacia) and propagated in E. coli.
  • the plasmids were purified using standard technologies and adjusted to the desired concentration. Before use in vitro
  • the transcription, the plasmids were linearized using restriction enzymes.
  • 5 ⁇ l 5 x transcription buffer 200 mM Tris-HCl pH 7.9, 30 mM MgCl 2 , 10 mM spermidine, 50 mM NaCI) 1 ⁇ l BSA (1 mg / ml)
  • RNAsin 2.5 ⁇ l DTT 100 mM
  • NTP 's ATP, GTP, CTP with 2.5 mM and UTP with 1.25 mM
  • the transcription batch was incubated for 2 h at 37 ° C. and then cleaned using a preparative gel using standard methods. To find the marked An X-ray film was placed on the RNA for 1 minute and the band by means of an
  • the reactions were then ended by adding 400 ⁇ l Proteinase K buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5, mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% SDS, 0.1 mg proteinase K) .
  • the samples were extracted with 400 ⁇ l phenol / chloroform and the aqueous phase was precipitated with 2.5 volumes of ethanol and 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.2) at -20 ° C.
  • the RNA was centrifuged off and washed with 70-80% ethanol. After centrifugation again, the RNA was dried.
  • RNA was dissolved in 5 ⁇ l sample buffer (0.5 x TBE, 80% (v / v) formamide,
  • RNA was detected by means of autoradiography (see FIG. 6).
  • Lanes 1-5 of FIG. 6 show the time course (0, 10, 20, 30, 40 minutes) of the splice reaction of the MINX pre-mRNA without IRE at the 3 ' OH end. The figure shows that after about 20 minutes a large part of the pre-mRNA has been converted into the mature mRNA. Lanes 6-10 show the same experiment with the pre-mRNA modified by IRE at the 3 ' OH end. Here too, a clear splicing reaction can be seen after 20 minutes of incubation.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem enthaltend: (a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleissfähigen Nukleinsäure, (b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleissreaktion, gegebenenfalls, (c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleisskomponenten, und vorzugsweise, (d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls, (e) weitere Hilfsmittel.

Description

Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem enthaltend
(a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
(b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls (c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise
(d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls
(e) weitere Hilfsmittel
Die meisten für Proteine kodierenden Gene in Eukaryonten werden in ihrer Form im
Genom durch eine oder mehrere nicht für das Protein kodierende Sequenzen (Introns) unterbrochen. Bei der Transkription der genomischen DNA in die Boten- RNA (messenger RNA = mRNA) werden diese nicht-codierenden Bereiche (Introns) in das primäre Transkript übernommen. Um eine korrekte Form der mRNA zu gene- rieren, muß diese Vorläufer-mRNA (Prä-mRNA) prozessiert werden.
Die Prozessierung der Prä-mRNA geschieht durch Entfernen der Introns und Fusion der kodierenden Bereiche (Exons). Erst dann kann ein ununterbrochen zu lesender Nukleotidstrang für die Translation im Zytoplasma zur Verfügung gestellt werden. Die Bildung von mRNA in Eukaryonten erfordert daher einen sogenannten Spleiß- prozess, in dem die nicht kodierenden Genbereiche (Introns) aus dem primären Gentranskript entfernt werden.
Das Spleißen findet im Kern statt, bevor die mRNA aus dem Kern transportiert wird. Es wird im allgemeinen in einem Zwei-Stufen-Mechanismus durchgeführt, in dem jeweils ein Transesterifizierungsschritt beteiligt ist (Moore, J.M. et al., (1993) Splicing of precursors to messenger RNAs by the Spliceosome. In The RNA world, Edited by Gesteland R.F., Gesteland, J.F., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 303-358). Der erste Schritt generiert ein freies 5'-Exon und eine sogenannte Lariat-Struktur des Introns, welches immer noch mit dem 3'-Exon verbunden ist. Die Lariat-Struktur enthält eine verzweigte RNA, die durch eine Veresterung des 5'-Endes des Introns mit einer 2'-Hydroxyl-Gruppe einer Ribose in einem Adenosin, das ca. 20 - 40 Nu- kleotide stromaufwärts des 3 '-Endes des Introns gelegen ist, entsteht. Der zweite katalytische Schritt führt zu einer Ligation der Exons und der Freisetzung des
Introns. Obwohl keine Nukleotide während dieser Reaktionen eingebaut werden, ist eine Energiequelle, beispielsweise ATP, für diese Katalyse notwendig (Guthrie, C.
(1991 ) Science, 253, 157).
An dem Vorgang des mRNA-Spleißens sind mehrere Faktoren beteiligt. Zwei Klassen von Spleiß-Faktoren werden zur Zeit unterschieden. Die erste Klasse besteht aus vier in der Evolution stark konservierten Protein-RNA-Partikeln (small nuclear ribonucleoprotein particles = snRNPs): U1 , U2, U4/U6 und U5, die entweder eine (U1 , U2, U5) oder zwei (U4/U6) snRNA Komponenten enthalten (Moore, J.M. et al., (1993) supra; Guthrie, (1991 ) supra; Green, M.R. (1991 ). Annu. Rev. Cell Bio.., 7,
559). Die zweite Klasse besteht aus bisher wenig charakterisierten Proteinen, die nicht fest an die snRNPs gebunden sind und daher nicht-snRNP Spleiß-Faktoren genannt werden (Lamm, G.M. & Lamond, A.J. (1993) Biochim. Biophys. Acta, 1173, 247; Beggs, J.D. (1995), Yeast splicing factors and genetic strategies for their analysis, In: Lamond, A.l. (ed) Pre- mRNA Processing Landes, R.G. Company, Texas, pp. 79-95. Krämer, A. (1995), The biochemistry of pre-mRNA splicing. In: Lamond, A.l. (ed), Pre-mRNA Processing. Landes, R.G. Company, Texas, pp. 35-64).
Die Zusammensetzung der snRNPs ist am besten in HeLa-Zellen untersucht (Will, C.L. et al., (1995) Nuclear pre-mRNA splicing. In: Eckstein, F. and Lilley, D.M.J.
(eds). Nucleic Acids and Molecular Biology. Springer Verlag, Berlin, pp. 342-372). Bei relativ geringen Salzkonzentrationen, bei denen Kern-Extrakte aus HeLa-Zellen das Spleißen von Prä-mRNA in vitro bewirken können, liegen die snRNPs in einem 12S U1 snRNP, einem 17S U2 snRNP und einem 25S [U4/U6.U5] tri-snRNP Kom- plex vor. Bei höheren Salzkonzentrationen (ca. 350-450 mM) dissoziiert der tri- snRNP-Komplex in einen 20S U5- und einen 12S U4/U6-Partikel. Die U4 und U6 RNAs liegen im U4/U6 snRNP über zwei intermolekulare Helices basengepaart vor (Bringmann, P. et al. (1984) EMBO J., 3, 1357; ; Hashimoto, C. & Steitz, J.A. (1984) Nucleic Acids Res., 12, 3283; Rinke, J. et al., (1985) J. Mol. Biol., 185, 721; Brow,
D.A. & Guthrie, C. (1988) Nature, 334, 213).
Die snRNPs bestehen aus zwei Gruppen von Proteinen. In allen snRNPs ist die Gruppe der allgemeinen Proteine (B/B\ D1 , D2, D3, E, F und G) enthalten. Zusätzlich enthält jeder snRNP spezifische Proteine, die nur in diesem enthalten sind. So enthält nach dem bisherigen Stand der Forschung der U1 snRNP drei zusätzliche Proteine (70K, A und C) und der U2 snRNP elf weitere Proteine. Der 20S U5 snRNP trägt nach bisherigem Kenntnisstand neun weitere Proteine mit einem Molekularge- wicht von 15, 40, 52, 100, 102, 110, 116, 200 und 220 kDa, während der 12S U4/U6 snRNP zwei zusätzliche Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 60 und 90 kDa enthält. Der 25S tri-snRNP [U4/U6.U5] enthält fünf zusätzliche Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 15.5, 20, 27, 61 und 63 kDa. (Behrens, S.E. & Lührmann, R. (1991 ) Genes Dev., 5, 1439; Utans, U. et al., (1992) Genes Dev., 6, 631 ; Lauber, J. et al., (1996) EMBO J., 15, 4001 ; Will, C.L. et al. (1995), supra, Will, C.L & Lührmann, R. (1997) Curr. Opin. Cell Biol., 9, 320-328).
Die Zusammensetzung der Spleiß-Komponenten bei Saccharomyces cerevisiae sind noch nicht im Detail untersucht. Biochemische und genetische Untersuchungen deuten jedoch darauf hin, daß die Sequenzen sowohl der snRNAs als auch der snRNP-Proteine in der Evolution hoch konserviert sind (Fabrizio, P. et al., (1994) Science, 264, 261 ; Lauber, J. et al., (1996), supra, Neubauer, G. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 385; Krämer, A. (1995), supra; Beggs, J.D. (1995); supra, Gottschalk, A. et al. (1998) RNA, 4, 374-393).
Um einen funktioneilen Spleiß-Komplex (Spliceosom) zu bilden, werden die einzelnen Komponenten (prä-mRNA, snRNPs und nicht-snRNP-Proteine) in einem stufenweisen Prozeß zusammengeführt. Dies wird nicht nur durch Interaktionen der prä-mRNA mit den Protein-haltigen Komponenten, sondern auch durch zahlreiche Wechselwirkungen zwischen den Protein-haltigen Komponenten selbst erreicht
(Moore, J.M. (1993) supra; Madhani, H.D. & Guthrie, C. (1994) Annu. Rev. Genetics, 28, 1 ; Nilsen, T.W. (1994) Cell, 65, 115). Die Prä-mRNA trägt in ihrer Sequenz spezifische Erkennungssequenzen für die unterschiedlichen Spleißkomponenten. Zunächst bindet das U1 snRNP über diese Erkennungssequenzen an die 5'-Spleiß- Region des Introns der prä-mRNA. Gleichzeitig lagern sich eine noch nicht genau bestimmte Anzahl verschiedener weiterer Faktoren (z.B. SF2/ASF, U2AF, SC35, SF1 ) an diesen Komplex an und kooperieren mit den snRNAs in der weiteren Formierung des Prä-Spliceosoms. Das U2 snRNP-Partikel interagiert mit der soge- nannten Branch-Site im Intron-Bereich (Krämer, A. & Utans, U. (1991) EMBO J., 10,
1503; Fu, X.D. & Maniatis, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89, 1725; Krämer, A. (1992) Mol. Cell Biol., 12, 4545; Zamore, P.D. et al. (1992) Nature, 355, 609; Eperon, J.C. et al. (1993) EMBO J., 12, 3607; Zuo, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91 , 3363; Hodges, P.E. & Beggs, J.D. (1994) Curr. Biol. 4, 264; Reed, R. (1996) Curr. Op. Gen. Dev., 6, 215). In einem letzten Schritt der Bildung des Spli- ceosoms interagiert der [U4/U6.U5] tri-snRNP und eine Anzahl bisher nicht genauer charakterisierter Proteine mit dem Prä-Spliceosom, um das reife Spliceosom zu bilden (Moore, J.M. et al., (1993) supra).
Für den Vorgang des Spleißens werden verschiedene Wechselwirkungen zwischen
Prä-mRNA, snRNAs und sn-RNP gelöst und neue gebildet. So ist bekannt, daß vor oder während des ersten katalytischen Schritts der Spleißreaktion in den interagie- renden Strukturen von U4 und U6 zwei Helices voneinander getrennt und durch neue Interaktionen Basenpaarungen zwischen U2- und U6-RNAs gebildet werden (Datta, B. & Weiner, A.M. (1991 ) Nature, 352, 821 ; ; Wu, J.A. & Manley, J.L (1991)
Nature, 352, 818; Madhani, H.D. & Guthrie, C. (1992) Cell, 71 , 803; Sun, J.S. & Manley, J.L. (1995) Genes Dev., 9, 843; . Gleichzeitig wird die Bindung von U1 an die 5 'Spleißstelle gelöst und die prä mRNA bindet sich an die Erkennungssequenz ACAGAG der U6 snRNA (Fabrizio, P. & Abelson, J. (1990) Science, 250, 404; Sa- wa, H. & Abelson, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 11269; Kandels-Lewis,
S. & Seraphin, B. (1993) Science, 262, 2035; Lesser, C.F. & Guthrie, C. (1993) Science, 262, 1982; Sontheimer, E.J. & Steitz, J.A. (1993) Science, 262, 1989; . Das U5 snRNP interagiert über seinen konservierten Loop 1 mit Exon-Sequenzen, die nahe an den 5'- und 3'-Spleißstellen gelegen sind. Dieser Vorgang scheint sequen- ziell abzulaufen, während der gesamte Spleiß-Prozess von Stufe 1 zu Stufe 2 fortschreitet (M. McKeown, (1992) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 8: 133-155 Newman, A. & Norman, C. (1991) Cell, 65, 115; Wyatt, J.R. et al., (1992) Genes Dev., 6, 2542; Cortes, J.J. et al. (1993) EMBO J., 12, 5181 ; Sontheimer, E.J. & Steits, (1993) su- pra). Nach der Beendigung der Spleiß-Reaktion wird die reife mRNA freigesetzt und das Spliceosom dissoziiert (Moore, J. M. et al., (1993) supra).
Durch alternatives Spleißen können aus ein und demselben Primärtranskript ver- schiedene reife mRNAs gebildet werden, die für verschiedene Proteine kodieren.
Dieses alternative Spleißen ist in vielen Fällen reguliert. So kann dieser Mechanismus z.B. dazu genutzt werden, von einem nicht funktioneilen zu einem funktionellen Protein umzuschalten (z. B. Transposase bei Drosophila). Weiterhin ist bekannt, daß alternatives Spleißen gewebespezifisch durchgeführt wird. So wird z.B. die Tyrosin- Kinase, die vom src-Proto-Oncogen codiert wird, in Nervenzellen durch alternatives
Spleißen in einer speziellen Form synthetisiert.
Fehlerhaft reguliertes oder ausgeführtes alternatives Spleißen kann zu verschiedenen Krankheitsbildern führen. Bei Patienten, die an der Grave's Krankheit leiden, ist gezeigt worden, daß durch fehlerhaftes Spleißen ein entscheidendes Enzym (Thyro- peroxidase) in einer inaktiven Form entsteht (Zanelli, E. (1990) Biochem Biophys. Res. Comm., 170, 725). Untersuchungen für die Krankheit Spinale Muskelatrophy weisen darauf hin, daß ein defektes Genprodukt des Gens SMN (Survival of motor neurons) zu einer erheblichen Störung der Bildung der snRNPs führt. Durch die Inhi- bierung des Spleißapparates der Muskelneuronen, kommt es zu einer Paralyse der
Nervenzellen und zu einem Abbau des Muskelgewebes (Fischer, U. et al., (1997), Cell, 90: 1023-9; Liu, Q. et al. (1997), Cell, 90: 1013-21 ; Lefebvre, S. et al, (1997) Nat. Genet., 16, 265). Bei der Metastasierung von Krebszellen scheinen unter anderem bestimmte alternative Spleißvarianten von dem membranständigen Molekül CD44 eine entscheidende Rolle zu spielen. Das CD44-Gen enthält mehrere Exons, von denen 10 nebeneinanderliegende Exons in unterschiedlicher Anordnung bei der mRNA-Generierung aus der prä-mRNA gespleißt werden. Bei Ratten Karzinoma- zellen wurde nachgewiesen, daß metastasierende Varianten die Exons 4 bis 7 oder 6 bis 7 tragen. Mit Hilfe von Antikörpern gegen den von Exon 6 kodierten Teil des Proteins konnte die Metastasierung wirksam unterdrückt werden (Sherman, L., et al.,
(1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213: 249-269). Fehlerhaftes Spleißen kann zu stark ausgeprägten Phänotypen des betroffenen Organismus führen. So ist bekannt, daß eine Punktmutation in einem Intron des ß- Globin zu einer ß+-Thalassaemie führen kann. Durch die Punktmutation entsteht ein falscher Spleißort, der zu einem veränderten Leseraster und zu einer vorzeitigen Termination der Peptidkette führt (Weatherall, D . & Clegg, J.B. (1982) Cell, 29, 7;
Fukumaki, Y. et al. (1982) Cell, 28, 585). Bei Arabidopsis thaliana Mutanten führt z. B. eine Punktmutation an der 5' Spleißstelle des Phytochrom B Gens zu einer fehlerhaften Expression des Gens. Durch diese Veränderung kann ein Intron nicht entfernt werden, welches ein Stopcodon in seiner Sequenz enthält. Die Entwicklung der Pflanzen ist gestört, da das Gen an der Phytomorphogenese beteiligt ist (Bradley,
J.M. et al. (1995) Plant Mol. Biol, 27, 1133).
Bisher sind nur wenige Arbeiten bekannt geworden, in denen eine Beeinflussung von Spleißvorgängen in der Zelle beschrieben worden sind. So kann mit Hilfe von Antiseren oder monoklonalen Antikörpern gegen Komponenten des Spleißapparates die Generierung von reifer mRNA verhindert werden (Padgett, R.A. et al. (1983) Cell, 35, 10; Gattoni, R. et al. (1996) Nucleic Acid Res., 24, 2535).
Das NS1-Protein, das durch das Genom des Influenza Virus codiert wird, kann ebenfalls durch Bindung an die U6 snRNA in das Spleißen eingreifen. Das Protein bindet an die Nukleotide 27-46 und 83-101 der humanen U6 snRNA und verhindert so, daß U6 während des Ablaufs des Spleißvorganges mit den Partnern U2 und U4 interagieren kann (Fortes, P. et al. (1994) EMBO J., 13, 704; Qiu, Y. & Krug, R.M. (1995) J. Virol., 68, 2425. Darüberhinaus scheint das NS1 Protein auch über Bin- düng an den poly-A-Schwanz der gebildeten mRNA einen Export aus dem Kern zu verhindern (Fortes, P. et al. (1994), supra; Qiu, Y. & Krug, R.M. (1994), supra). Ähnliche Wirkungen werden von einem Genprodukt des Herpes Simplex Virus Typ 1 Genoms beschrieben. Das Protein ICP27 konnte in in vitro Experimenten das Spleißen von einer Modell-RNA (ß-Globin-Prä-mRNA) wirkungsvoll verhindern (Hardy, W.R. & Sandri-Goldin, R.M. (1994) J. Virol., 68, 7790). Außerdem scheinen Peptide, die aus der C-terminalen Domäne der großen Untereinheit der RNA Polymerase II generiert wurden, ebenfalls in die Spleiß-Vorgänge eingreifen zu können (Yurvey, A. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 93, 6975; ; WO97/20031). Der Einbau von künstlichen Nukleotidanaloga (5-Fluor-, 5-Chlor- oder 5-Bromuridin) in die zu spleißende mRNA kann ebenfalls zu einer Inhibierung des Spleißvorganges in vitro führen (Sierakowska, H. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264, 19185; Wu, X.P. & Dolnick, B. (1993) Mol. Pharmacol., 44, 22).
Eine Anzahl von weiteren Untersuchungen betrifft die Wirkung von Anti-Sense- Oligonukleotiden auf das Spleißen. So scheint das Verhältnis von zwei unterschiedlichen Spleißprodukten der c-erb-Onkogen-mRNA (c-erbA-alpha 1 und 2) der Ratte durch eine weitere mRNA, rev-ErbA-alpha, reguliert zu werden. Rev-ErbA-alpha ist eine natürlich vorkommende anti-Sense-RNA, die mit der c-erbA-alpha 2 mRNA aber nicht mit der c-erbA-alpha 1 mRNA paart. Das Spleißen der c-erbA-alpha prä- mRNA zur c-erbA-alpha 2 mRNA konnte durch einen Überschuß an rev-ErbA-alpha mRNA-Konstrukten, die komplementär zur 3 '-Spleißstelle waren, wirkungsvoll inhi- biert werden (Munroe, S.H. & Lazar, M.A., (1991) J. Biol. Chem., 266(33), 22083).
Weiterhin konnte gezeigt werden, daß durch Generierung von anti-sense-RNA, die an die Intron-Sequenzen der zu spleißenden mRNA binden, ebenfalls Spleißen inhibiert werden kann (Volloch, V.et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, 1600). Hodges und Crooke konnten zeigen, daß bei schwach erkannten Spleißstel- len die Bindung von Oligonukleotiden ausreicht, um erfolgreich das Spleißen zu unterbinden. Werden dagegen bevorzugt erkannte Spleißstellen in die Konstrukte eingebaut, werden Oligonukleotide benötigt, die zusätzliche eine Aktivierung der RNase H bedingen können (Hodges, D. & Crooke S.T. (1995) Mol. Pharmacol., 48, 905). Eine genauere Analyse der für das Spleißen benötigten Sequenzen der prä-mRNA zeigte, daß 19 Nukleotide stromaufwärts vom Branch-Point Adenosin und 25 Nu- kleotide um die 3'- und 5 '-Spleiß-Stelle geeignete Sequenzen zur Generierung von Antisense RNAs sind (Dominski, Z. & Kole, R. (1994) Mol. Cell Biol., 14, 7445). Insbesondere für die Hemmung von Viren wurden Untersuchungen mit Antisense Molekülen gemacht. Viren, die höhere Organismen befallen, tragen oft Intron-enthaltende Gene in ihrem Genom. So konnte gezeigt werden, das Antisense Oligonukleotide gegen die 3'-Spleißstelle des immediate early Prä-mRNA 4/5 Gens des Herpes Simplex Virus in Vero-Zellen die Replikation des Virus hemmen konnte (Iwatani, W. et al. (1996) Drug Delivery Syst., 11 , 427). Zur Untersuchung des Spleiß-Mechanismus wird im allgemeinen zunächst eine mRNA durch in vitro Transkription hergestellt. Hierzu werden genetische Konstrukte aus Viren, z. B. Adenoviren, oder zellulärer Strukturgene verwendet. Derartige mRNAs enthalten alle wichtigen Strukturelemente, die für die Erkennung der mRNA durch das Spliceosom und den Ablauf des Spleißens notwendig sind. Im allgemeinen wird die mRNA radioaktiv markiert, damit man nach der Auftrennung auf einem denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgel aufgrund der charakteristischen Bandenmuster beurteilen kann, ob eine Spleißreaktion stattgefunden hat, bzw. bei welchem Reaktionsschritt eine Störung stattgefunden hat. Derartige Testsysteme sind jedoch sehr zeit- und arbeitsaufwendig und daher nicht für das systematische Auffinden von Substanzen, die das Spleißen modulieren können, geeignet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Testsystem zu finden, mit dem auf einfache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung beim Spleißen von Nukleinsäuren untersucht werden können (sog. High Through-Put Scree- ning).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein Testsystem mit einem gel- freien Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion geeignet ist, die oben beschriebenen Nachteile des gängigen Testsystems zu überwinden und somit für das High Through-Put Screening beispielsweise in einer Roboteranlage geeignet ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Testsystem enthaltend (a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
(b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
(c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vor- zugsweise
(d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls (e) weitere Hilfsmittel.
Für die Bereitstellung eines gelfreien Testsystems für die Untersuchung von Spleißvorgängen ist die zu untersuchende Nukleinsäure an einer Festphase zu immobili- sieren. Die Immobilisierung der Nukleinsäure kann beispielsweise kovalent, durch die Einführung von bestimmten Strukturelementen, beispielsweise Aptameren, in die zu spleißende Nukleinsäure und Verwendung von Bindungspartnern für diese Strukturelemente oder durch eine Hybridisierung erfolgen.
Für das gelfreie Testsystem ist zudem vorteilhafterweise eine geeignete Sonde zu generieren, die den Nachweis des erfolgten Spleißens bzw. des nicht erfolgten Spleißens ermöglicht. Diese Sonde kann beispielsweise ein zur Hybridisierung an die zu untersuchende Nukleinsäure verwendetes Oligonukleotid oder ein Bindungspartner, der an in die zu untersuchende Nukleinsäure eingeführte Strukturelemente bindet, sein.
Das gelfreie Nachweissystem enthält daher vorzugsweise mindestens eine Sonde. Insbesondere ist die Sonde eine zu der spleißfähigen Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, eine die spleißfähige Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Ver- bindung und/oder ein die spleißfähige Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die spleißfähige Nukleinsäure mindestens zwei Exons, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.
Beispielsweise ist die komplementäre Nukleinsäure zu mindestens einem Intron, zu mindestens einem Exon und/oder zu mindestens einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron und/oder zu der nach der Fusion der beiden Exons enstan- denen Exon/Exon-Grenze komplementär. Die komplementäre Nukleinsäure dient hierbei als Sonde zum Nachweis einer Spleißreaktion. So kann beispielsweise das während der Spleißreaktion freigesetzte Intron mittels des gelfreien Nachweissystems nachgewiesen werden, woraus gefolgert werden kann, daß beide Teilschritte der Spleißreaktion vollständig abgelaufen sind. Alternativ kann anhand eines geeigneten Nachweissystems, beispielsweise einer zu einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron komplementären Nukleinsäure festgestellt werden, ob während des Spleißvorganges das Exon von dem Intron gelöst worden ist, was einen Aufschluß darüber geben kann, ob die erste Spleißreaktion am 5'-Ende des Introns und/oder die zweite Spleißreaktion am 3'-Ende des Introns erfolgte. Andere Nachweisformen sind unten im Detail erläutert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Sonde eine niedermolekulare Verbindung, beispielsweise Theophyllin, Xanthin oder ein Aminoglycosid wie Tobramycin. Enthält beispielsweise die spleißfähige Nukleinsäure oder eine zur spleißfähigen Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure des gelfreien Nachweissy- stems eine sog. Aptamer-Struktur, d. h. eine Bindesequenz für derartige Bindungspartner (siehe z. B. Jenison, R.D. et al. (1994) Science 263, 1425 - 1429, Hamasaki, K. et al. (1998) Biochem. 37, 656 - 663 oder Kiga, D. et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26 (7), 1755 - 1760), so kann der Spleißvorgang besonders einfach über den Bindungspartner nachgewiesen werden.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform kann der Bindungspartner ein Nukleinsäure-Bindeprotein, insbesondere ein "Iran Responsive Element Bin- ding Protein" (IBP) sein, welches eine Erkennungssequenz für ein Nukleinsäure- Bindeprotein, insbesondere ein "Iran Responsive Element" (IRE) erkennt. Der Nachweis eines gegebenenfalls erfolgten Spleißvorganges erfolgt hierbei über das
Nukleinsäure-Bindeprotein.
Die beschriebenen Wechselwirkungen zwischen Bindungspartner und Strukturelement in der Nukleinsäure (niedermolekulare Verbindung und Aptamer, IBP und IRE, Oligonukleotid und Sequenz in der Nukleinsäure) sind ebenfalls geeignet die zu untersuchende spleißfähige Nukleinsäure an einer Festphase zu immobilisieren. Hierzu muß der Bindungspartner in geeigneter Weise an der Festphase verankert werden. Dabei kann beispielsweise der Bindungspartner kovalent an die Festphase gebunden werden. Desweiteren eignen sich die Kopplung von Biotin an die Nukleinsäure und die Verwendung von an der Festphase gebundenem (Strept-)Avidin für eine Verankerung der Nukleinsäure. Diese Verankerung kann beispielsweise auch durch Verwendung von Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen erreicht werden.
Im allgemeinen enthält die Sonde eine Markierung, beispielsweise eine radioaktive Markierung, eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, mit Biotin, mit Digoxigenin und/oder mit Antikörpern. Vorzugsweise ist die Markierung an dem Liganden, bei- spielsweise an der komplementären Nukleinsäure, an der niedermolekularen Verbindung oder an dem Nukleinsäure-Bindeprotein angebracht. Insbesondere mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen kann auf einfache und in automatisierten Systemen schnelle Art und Weise festgestellt werden, ob beispielsweise durch Entfernung des Bindungspartners der Sonde in der Nukleinsäure während des Spleißvorganges eine Spleißreaktion beispielsweise in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz ungestört ablaufen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die spleißfähige Nukleinsäure und die Sonden-bindende Nukleinsäure miteinander verbunden. Dies hat den Vor- teil, daß die Spleißreaktion direkt beispielsweise über die Freisetzung der Sondenbindenden Nukleinsäure nachgewiesen werden kann. Bei dieser Ausführungsform ist die Sonden-bindende Nukleinsäure vorzugsweise eine Nukleinsäure, die eine niedermolekulare Verbindung, beispielsweise ein sogenanntes Aptamer, und/oder ein Nukleinsäure-Bindeprotein binden kann. Da für die Bindung derartiger Sonden im allgemeinen bestimmte Strukturelemente der Nukleinsäuren verantwortlich sind, wird die Sonden-bindende Nukleinsäure bei den folgenden bevorzugten Konstrukten mit "SE" für Strukturelement abgekürzt, wobei "3'Region" einen Nukleinsäureabschnitt am 3'-Ende der Nukleinsäure bedeutet:
1. Konstrukte mit im 5'-Exon eingeführten Strukturelement (SE): — T7-Promotor— SE— Exoni— Intron — Exon2— 3'Region—
— T7-Promotor— Exoni— SE— Exoni --Intron— Exon2— 3'Region—
2. Konstrukt mit im Intron eingeführten Strukturelement:
— T7-Promotor— Exoni— Intron— SE— Intron— Exon2— 3'Region-
3. Konstrukte mit im 3'-Exon eingeführten Strukturelement:
— T7-Promotor — Exoni — Intron — Exon2 — SE — Exon2 — 3'Region —
— T7-Promotor— Exoni— Intron — Exon2— SE— 3'Region — — T7-Promotor— Exoni— Intron — Exon2— 3'Region— SE— 3'Region— — T7-Promotor — Exoni — Intron — Exon2 — 3'Region — SE —
4. Konstrukte mit Kombinationen aus den in 1. - 3. aufgeführten Konstrukten.
5. Konstrukte mit verschiedenen Strukturelementen:
— T7-Promotor— Exoni— SE1— Intron — Exon2— SE2— 3'Region — T7-Promotor— Exoni— SE1— Exoni— Intron — SE2— Intron— Exon2— SE3—
3'Region —
Die Konstrukte zu 1. dienen hierbei insbesondere zum Nachweis, ob das Exoni von der Intronsequenz während des Spleißvorganges abgetrennt werden konnte. Das Konstrukt zu 2. dient zum direkten Nachweis einer abgetrennten Intronsequenz. Die
Konstrukte unter 3. dienen zum Nachweis, ob das Exon2 erfolgreich von der Intronsequenz abgetrennt werden konnte. Eine Kombination der Konstrukte gemäß 4. dient zum Nachweis der einzelnen Zwischen- und Endprodukte während des Spleißvorganges. Exoni steht im allgemeinen für ein 5' vom Intron gelegenes Exon und Exon 2 steht im allgemeinen für ein 3' vom Intron gelegenes Exon.
Die Konstrukte unter 5. enthalten verschiedene zusätzliche Erkennungssequenzen, die zum einen verschiedene Nachweissysteme betreffen können und die zum anderen über deren Bindungspartner die Bindung der Nukleinsäure an eine feste Phase ermöglichen können. So kann beispielsweise zum Immobilisieren in der 3'Region eine Sonden-bindende Nukleinsäure eingeführt werden, und gleichzeitig zum Nach- weis des Spleißvorganges eine andere Sonden-bindende Nukleinsäure im Exoni
(siehe zu 5., erstes Konstrukt). Darüber hinaus können beispielsweise drei verschiedene Nukleinsäuren eingeführt werden, die zum einen zur Immobilisierung der gesamten Nukleinsäure und zum anderen zum Nachweis des entfernten Introns und zum Nachweis der Verknüpfung von Exoni an die restliche Nukleinsäure dient (sie- he zu 5., zweites Konstrukt). Die Lokalisation der einzelnen unter 5. beispielhaft aufgeführten Sonden-bindenden Nukleinsäuren kann gemäß den oben beschriebenen Konstrukten unter 1. - 4. variieren. Zudem ist die genaue Lokalisation der einzelnen Sonden-bindenden Nukleinsäuren variabel.
In einer weiteren Ausführungsform ist daher die Nukleinsäure, vorzugsweise die spleißfähige Nukleinsäure, insbesondere eine Nukleinsäure gemäß einer der oben beschriebenen Ausführungsformen, direkt kovalent oder indirekt über ein Strukturelement und Bindungspartner zum Strukturelement oder mittels Hybridisierung an eine feste Phase gebunden.
Die direkte kovalente Bindung kann beispielsweise über die 3'-terminale cis-diol- Gruppe des Riboserückgrates der Nukleinsäure erfolgen. Beispielsweise kann eine RNA an Hydrazingruppen der festen Phase nach Perjodatoxidation der vicinalen 2', 3' Hydroxylgruppen der 3'-terminalen Ribose gebunden werden. Für eine indirekte Bindung eignen sich auch geeignete Linker, wie beispielsweise Biotin- oder Dicar- bonsäure-Linker. Die Bindung der Nukleinsäure kann jedoch auch, wie oben bereits ausgeführt, über einen Bindungspartner, beispielsweise über Theophyllin, Xanthin oder ein Aminoglycosid wie Tobramycin und/oder über ein Nukleinsäure- Bindeprotein, wie beispielswiese IBP, erfolgen.
Für die Immobilisierung einer Nukleinsäure an einen Träger-gebundenen Liganden eignet sich beispielsweise im Falle von Theophyllin als Träger-gebundenen Bindungspartner das Theophyllin-Aptamer Th (Kd = 0,9 μM) (siehe z. B. Jenison, R.G. et al. (1994) supra) oder im Falle von Tobramycin als Träger-gebundenen Bindungspartner die Minimalversion des Tobramycin-Aptamers To (K = 0,2 μM) (Hamasaki, K. et al. (1998) supra). Die Sequenzen der beiden Aptamere sind vorzugsweise:
Th: AAGUGAUACC AGCAUCGUCU UGAUGCCCUU GGCAGCACUU (40mer) To: GGCUUAGUAU AGCGAGGUUU AGCUACACUC GUGCUGAGCC (40mer)
Die feste Phase ist hierbei beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Glas, Kunststoff oder Polysaccharide, z.B. ein Agarosepolymer.
Sonden-bindende Nukleinsäuren, beispielsweise Aptamere, sind aber auch geeignet, um markierte Sonden zu binden, wodurch z. B. die Aptamer-enthaltende Nukleinsäure nachgewiesen und auch quantifiziert werden kann. Beispielsweise kann Tobramycin mit käuflichen, NH2-reaktiven Fluoreszenz-Farbstoffen umgesetzt werden (Wang, Y. et al. (1996) Biochemistry 35, 12338 - 12346). Bei Theophyllin wird vorzugsweise ein 1-Aminoalkyl- oder 1-Thioalkyl-Derivat des 3-Methylxanthins hergestellt, das an das Aptamer binden kann (Jenison, R. D. et al. (1994), supra).
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die spleißfähige Nukleinsäure jede beliebige
Nukleinsäure, die gespleißt werden kann, vorzugsweise eine RNA, beispielsweise in Form einer sogenannten Prä-mRNA oder in Form einer DNA, die RNA-Abschnitte enthält. Für den Fall, daß die RNA zusätzliche Sonden-bindende Sequenzen, wie oben bereits näher beschrieben, enthalten soll, ist es vorteilhaft, wenn diese auf bei- den Exon-Seiten mindestens ca. 25 Nucleotide von der jeweiligen Spleißstelle, auf der Intronseite mindestens ca. 17 Nucleotide vom Branchpoint und/oder mindestens ca. 7 Nucleotide von der 5'Spleißstelle entfernt sind. Hierdurch wird im allgemeinen gewährleistet, daß die zusätzlichen Sonden-bindenden Sequenzen die Spleißreaktionen nicht stören können.
Eine für das Spleißen im Humansystem geeignete spleißfähige Nukleinsäure ist beispielsweise die MINX-Modell-prä-mRNA (MINX = miniature wildtype Substrate; Zillmann, M., Zapp, M.L, Berget, S.M., (1988), Mol. Cell. Biol., 8:814-21 ). In die MINX- kodierende DNA kann vorzugsweise eine zum Nachweis oder zur Immobilisierung geeignete weitere Sonden-bindende Nukleinsäure, wie oben bereits beschrieben, eingeführt werden, wobei vorzugsweise die Restriktionsenzymschnittstelle erhalten bleiben soll. Hierdurch kann man bei Bedarf in einem weiteren Klonierungsschritt eine weitere gleiche oder verschiedene Sonden-bindende Nukleinsäure für den Nachweis bzw. zur Immobilisierung einbauen, um dadurch die Fluoreszenzsignale verstärken oder die Bindung an die feste Phase festigen zu können.
Zur Immobilisierung von Prä-mRNA werden beispielsweise die Aptamere Th oder To am 3'-Ende des Exon2 der Prä-mRNA eingefügt und der entsprechende Bindungspartner an der Festphase kovalent gebunden. Die entsprechenden kodierenden Nu- kleinsäuresequenzen sind in Fig. 1A und 1B dargestellt.
Hierbei wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA- Oligonucleotid in die BamHI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 219 und 220 der korrespondierenden Minx-prä-mRNA, inseriert.
Wie bereits oben erwähnt, können auch Sonden-bindende Nukleinsäuren in die Intron-Struktur der prä-mRNA eingefügt werden, wobei diese durch das Spleißen freigesetzt und somit in der beispielsweise immobilisierten mRNA fehlt. Derartige Konstrukte eignen sich daher zum Nachweis einer Inhibierung des Spleißens im er- sten Schritt, d. h. Öffnen der mRNA und Lariatbildung, oder im zweiten Schritt, d. h.
Entfernung des Lariats. Im Falle einer Inhibierung des Spleißprozesses würden die Sonden-bindenden Nukleinsäuren nicht aus der prä-mRNA entfernt werden und könnten daher beispielsweise nach Immobilisierung der prä-mRNA nachgewiesen werden. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden
Sequenzen in Fig. 2A und 2B dargestellt.
Hierzu wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA-
Oligonucleotid in die Pstl-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 88 und 89 der korrespondierenden prä-mRNA, inseriert.
Wie bereits oben näher beschrieben, wird die Verbindung zwischen Exoni und Intron im ersten Spleißschritt durch das Spliceosom an der 5'-Spleißstelle des
Introns geöffnet. Erst im zweiten Spleißschritt erfolgt eine kovalente Verknüpfung von Exoni und Exon2. Das Exoni ist folglich während des ersten Schrittes der Spleißreaktion nicht mehr mit der mRNA verbunden und somit aus der Spleißreaktion entfernbar. In Verbindung mit Konstrukten, die beispielsweise eine Aptamer- Struktur im Intron haben, kann daher eine Aussage darüber gemacht werden, ob im ersten Spleißschritt beispielsweise eine Inhibierung stattgefunden hat. Werden beispielsweise zwei verschiedenen Aptamere, die verschiedene Sonden erkennen, am 5'-Ende des Exoni und im Intron der prä-mRNA eingebaut, so kann sowohl der erste Spleißschritt, wie auch der zweite Spleißschritt in einem Testsystem verfolgt werden. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden
Sequenzen in Fig. 3A und 3B dargestellt.
Hierzu wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA- Oligonucleotid in die EcoRI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 9 und 10 der korrespondierenden Minx-prä-mRNA, inseriert.
Für Untersuchungen im Hefesystem kann man beispielsweise von der prä-mRNA für U3 der Hefe ausgehen (Mougin, A. et al., (1996), RNA, 2: 1079-93) und beispielsweise geeignete Aptamere, wie z. B. die oben beschriebenen Theophyllin- oder Tobramycin-Aptamere, einbauen. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden Sequenzen in Fig. 4A bis 4C dargestellt. Zur Herstellung des Nukleinsäurekonstruktes gemäß Fig. 4A wird beispielsweise ein geeignetes Aptamer als DNA-Oligonucleotid in die Sacll-Schnittstelle der kodierenden U3-DNA, d. h. zwischen Position 22 und 23 der prä-U3 RNA, inseriert.
Zur Herstellung des Nucleinsäurekonstruktes gemäß Fig. 4B wird beispielsweise ein geeignetes Aptamer als DNA-Oligonucleotid in die BstNI-Schnittstelle der kodierenden U3-DNA, d. h. zwischen Position 105 und 106 der prä-U3RNA, inseriert.
Die Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 5A stellt ein Beispiel einer Nukleinsäurese- quenz mit einem "Iran Responsive Element" (IRE) dar, das für Untersuchungen im
Humansystem geeignet ist. Das IRE ist hierbei an dem 3'-Ende des Exon2 analog den oben beschriebenen Aptameren eingefügt.
Für Untersuchungen im Hefesystem kann ein IRE-Element beispielsweise an dem 3'-Ende des Exon2 der prä-U3RNA, wie in Fig. 5B dargestellt, eingefügt werden:
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine spleißfähige Nukleinsäure, wie oben beispielhaft dargestellt, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Testsystems.
Zur Durchführung der Untersuchungen der einzelnen Spleißreaktionen mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Testsystems wird üblicherweise eine Zusammensetzung enthaltend die einzelnen Spleißkomponenten, vorzugsweise "Small Nuclear Ribo- nucleoprotein Particles (snRNP)-Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten ver- wendet. Insbesondere enthalten die snRNP-Komponenten U1-, U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn man entsprechende Zellextrakte, insbesondere eukaryotische Zellextrakte für die Untersuchungen verwendet. Beispielsweise können die Zellextrakte aus tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, vor allem Heia-Zellen, insbesondere aus Zellkernextrakten von He- La-Zellen oder Zellextrakte von Pilzen, insbesondere Hefen, nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren gewonnen werden (siehe Beispiele). Die Zellextrakte enthalten im allgemeinen alle wichtigen Faktoren, um ein Spleißen in vitro durchführen zu können.
Zur Durchführung der Untersuchungen ist es essentiell, weitere Hilfsmittel, wie z. B. Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente, insbesondere ATP, einzusetzen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf eine Verfahren zur Herstellung eines Testsystems, bei dem mindestens eine spleißfähige und immobilisierte Nukleinsäure und mindestens ein gelfreies Nachweissystem sowie gegebenenfalls mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weitere Hilfsmittel zusammengestellt werden. Bevorzugte Ausführungsformen der einzelnen Komponenten sind bereits oben näher beschrieben worden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz, wobei a) eine oder mehrere gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und mindestens einer Zusammen- setzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
Bevorzugte einzelne Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind oben bereits näher beschrieben.
Die wirksame Substanz kann hierbei eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein
Fungizid, ein Herbizid, ein Pestizid und/oder ein Insektizid sein, vorzugsweise ist es ein Antibiotikum. Die zu untersuchende Substanz ist im allgemeinen eine natürlich vorkommende, eine natürlich vorkommende und chemisch modifizierte und/oder eine synthetische Substanz. Insbesondere können mit den erfindungsgemäßen Verfahren besonders einfach und schnell sogenannte kombinatorische Substanzbibliotheken durchsucht werden.
In der Beschreibungseinleitung wurde bereits darauf hingewiesen, daß verschiedene Erkrankungen auf eine Störung des Spleißmechanismus zurückzuführen sind. Daher eignet sich die vorliegende Erfindung auch zur Diagnose einer Erkrankung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Diagnose einer Erkrankung, wobei a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und ge- gebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und b) daß sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
Die zu diagnostizierenden Erkrankungen sind hierbei vorzugsweise Erbkrankheiten,
Krebserkrankungen und/oder virale Erkrankungen, insbesondere Grave's Krankheit, spinale Muskelatrophie, ß'-Thalassaemie, Krebserkrankungen in bezug auf das c- Erb-Onkogen, Hepatitis-C Infektionen und/oder Herpes Simplex Virus Infektionen. Die Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten kann in diesem Fall bei- spielsweise eine behandelte oder unbehandelte Gewebeprobe des Patienten sein.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu beschränken. Dargestellt sind die Konstrukte in DNA-Sequenzen. Die spleißfähigen RNAs können durch in vitro-Transkription, wie sie weiter unten beschrieben ist, generiert werden. Beschreibung der Figuren
Fig. 1A zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, in der an das 3'-Ende des Exon2 einer für Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 1 B zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, in der an das 3'-Ende des Exon2 einer für Minx codierenden prä-mRNA ein To-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 2A zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, in der in das Intron einer für Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 2B zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, in der in das Intron einer für Minx codierenden prä-mRNA ein To-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 3A zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, in der an das 5'-Ende des Exoni einer für Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 3B zeigt die Sequenz einer RNA in der an das 5'-Ende des Exoni einer für Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 4A zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Am 5'-Ende des Exoni ist eine Einfügesteile für ein Th- oder To- Aptamer gekennzeichnet.
Fig. 4B zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, die für eine U3-prä-mRNA ko- diert. Im Intron ist eine Einfügestelle für ein Th- oder To-Aptamer gekennzeichnet. Fig. 4C zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Am 3'-Ende des Exon2 ist eine Einfügesteile für ein Th- oder To- Aptamer gekennzeichnet .
Fig. 5A zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, die für eine Minx-prä-mRNA kodiert. Am 3'-Ende des Exon2 ist ein die Sequenz für IRE eingefügt.
Fig. 5B zeigt die kodierende Nukleinsauresequenz, die für eine der U3-prä-mRNA kodiert. Am 3'-Ende des Exon2 ist ein die Sequenz für IRE eingefügt.
Fig. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf des Spleißens von MINX- und MINX-IRE-prä mRNA durch HeLa Kernextrakt.
In vitro transcribierte MINX (Spuren 1-5) und MINX-IRE (Spuren 6-10) prä- mRNAs wurden mit HeLa Kernextrakt für den in der Abbildung angegebenen Zeitraum inkubiert. Anschließend wurden die Proben mittels Polyacryla- mid/Harnstoff-Gelektrophorese aufgetrennt und die 32P-markierte RNA mit Hilfe von Autoradiographie nachgewiesen. Mehrfache Banden bei der IRE enthaltenden RNA (Spuren 6-10) sind durch unvollständige Denaturierung des IRE zu erklären.
Beispiele
1. Das RNA-Konstrukt:
Die zu spleißende mRNA besteht aus mindestens zwei Exons, die durch ein Intron getrennt sind. Zusätzlich zu diesen Sequenzen sind Sequenzen enthalten, die geeignet sind, eine spezifische Erkennung durch RNA-Bindeproteine oder niedermolekulare Verbindungen zu ermöglichen. Über die Kopplung dieser Bindeproteine oder Verbindungen an eine Matrix wird die mRNA selektiv an die Matrix gebunden. Alternativ erfolgt die Kopplung der mRNA auch kovalent über 3'-OH-Gruppen der Ribose direkt an die Matrix. Präparation der Kernextrakte:
2.1 Kernextrakte aus Säugetierzellen
Für das Herstellen von Kernextrakte aus Säugetierzellen werden Zellkulturen mit Heia-Zellen herangezogen. Hierzu werden die Zellen durch Zentrifugation (1000 x g,
10 Min.) aus dem Kulturmedium sedimentiert und mit Phosphatpuffer gewaschen. Anschließend wird das Zellsediment in fünffachem Volumen Puffer A (10 mM HEPES, 1 ,5 mM MgCI2, 10 mM KCI, 0,5 mM DTT, pH 7,9, 4°C) aufgenommen und 10 Minuten inkubiert. Die Zellen werden erneut sedimentiert und in zweifachem Vo- lumen Puffer A aufgenommen. Diese Suspension wird mit einem Dounce Homogenisator (Pistill B) aufgeschlossen (10-faches Auf- und Abbewegen des Pistills). Die Kerne werden durch Zentrifugation sedimentiert. Abschließend werden die Kerne erneut in Puffer A aufgenommen und für 20 Minuten bei 25.000 x g zentrifuguiert. Das Sediment wird in 3 ml Puffer B (20 mM HEPES, 25% (v/v) Glycerin, 0,42 M NaCI, 1 ,5 mM MgCI2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethyisulfonylfluorid (PMSF),
0,5 mM DTT, pH 7,9) aufgenommen und erneut mit dem Dounce Homogenisator aufgeschlossen. Die entstehende Suspension wird 30 Minuten auf einem Magne- trührer inkubiert und anschließend bei 25.000 x g für 30 Minuten zentrifugiert. Erneut schließt sich eine Zentrifugation bei 25.000 x g (30 Min.) an. Der klare Überstand wird gegen das 50-fache Volumen Puffer C (20 mM HEPES, 20% (v/v) Glycerin, 0,1
M KCI, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT, pH 7,9) dialysiert. Das Dialysat wird zentrifugiert (25.000 x g, 20 Min.) und der resultierende Überstand kann als Kernextrakt in flüssigem Stickstoff gelagert werden (Dignam; J.D. et al. (1983) Nucleic Acid Res., 11 , 1475).
2.2 Zellextrakte aus Hefezellen
Zellextrakte aus Hefezellen werden auf sehr ähnliche Weise hergestellt. Hefezellen eines Protease-defizienten Stammes (BJ926, EJ101 oder ähnliche Stämme) werden in der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugation (1500 x g, 5 Min., 4°C) sedimentiert. Die Zellen werden in dem zwei- bis vierfachen Volumen eiskaltem
Wasser resuspendiert und erneut bei 1.500 x g (5 Min, 4°C) zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in dem einfachen Volumen Zymolyasepuffer (50 mM Tris HCL, 10 mM MgCI2, 1 M Sorbitol, 30 mM DTT, pH 7,5) aufgenommen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden abzentrifugiert (1.500 x g, 5 Min., 4°C), in dem dreifachen Volumen Zymolyasepuffer mit 2 mg (200 U) Zymolya- se 100 T aufgenommen und 40 Minuten bei 30°C auf einem Schüttler (50 RPM) in- kubiert. Die enstandenen Sphäroblasten werden abzentrifugiert (1.500 x g, 5 Min.,
4°C) und einmal in 2 ml eiskaltem Zymolyasepuffer gewaschen. Das Sediment wird mit zwei Volumen Lysepuffer (50 mM Tris HCI, 10 mM MgSO4, 1 mM EDTA, 10 mM Kalium Acetat, 1 mM DTT, Protease Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) gewaschen und schließlich in einem Volumen Lysepuffer aufgenommen. Die Sphäroblasten werden anschließend in einem Dounce Homogenisator durch 15- bis 20-maliges
Auf- und Abbewegen des Pistills (Abstand 1-2 μm) lysiert. Das Lysat wird mit dem gleichen Volumen Extraktionspuffer (Lysepuffer + 0,8 M Ammoniumsulfat, 20 % (v/v) Glycerin) versetzt und 15 - 30 Minuten auf einem Überkopfschüttler inkubiert (4°C). Anschließend wird 90 Minuten bei 100.000 x g zentrifugiert (4°C). Der Überstand wird gegen das hundertfache Volumen Lagerungspuffer (20 mM Tris HCI, 0,1 mM
EDTA, 10% (v/v) Glycerin, 100 mM KCI, 1 mM DTT, Proteae Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) dialysiert. Das Dialysat wird bei 10.000 x g abzentrifugiert (4°C) und der Überstand in flüssigem Stickstoff gelagert (Dünn, B. & Wobbe, C.R. (1994) Pre- paration of protein extracts from yeast, In: Ausubel, F.M., et al. (eds.) Current Proto- cols in Molecular Biology, 2nd Volume, John Wiley and Sons, Inc., USA pp. 13.13.1 -
13.13.9).
3. In vitro Spleißen von Konstrukten mit IRE in einem Testsystem
Durch das Ausschneiden des Introns aus der RNA-Sequenz entsteht an der Grenze der beiden nun verbundenen Exons eine Nukleotidsequenz, die in der ungespleißten prä-mRNA nicht vorhanden ist (Neosequenz). Diese Sequenz wird zur Generierung von komplementären Nukleotidsequenzen genutzt, die selektiv nur an diese Neosequenz binden. Durch kovalente Bindung von Fluoreszensfarbstoffen, Biotin, Digoxi- genin oder ähnlichen Molekülen bzw. durch radioaktive Markierung, wird indirekt das durchgeführte Spleißen nachgewiesen. Die Auswertung des Assays erfolgt in einem geeigneten Auswertegerät (ELISA-Reader, Fluoreszensmeßgerät etc.). Alle beschriebenen Versuche wurden nach Standardmethoden, wie sie in (Eperon,
I.C., and Krainer, A.R. (1994) Splicing of mRNA precursors in mammalian cells. In
RNA Processing, vol. I - A Practical Approach (B.D. Harnes and S.J. Higgins, eds.)
Oxford: IRL Press, pp. 57-101) beschrieben sind, durchgeführt.
3.1. Durchführung der in vitro Transkription
Das in Fig. 5A beschriebene Konstrukt wurde von dem dafür kodierenden Plasmid mittels in vitro Transkription in die korrespondierende mRNA umgeschrieben. Zur Kontrolle und späteren Vergleich wurde ebenfalls das entsprechende Konstrukt ohne die IRE-Sequenz in den Experimenten eingesetzt.
Zuvor wurden die Konstrukte in den Vektor pGEM-3Zf (Pharmacia) einkloniert und in E. coli vermehrt. Mit Hilfe von Standardtechnoiogien wurden die Plasmide gerei- nigt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Vor dem Einsatz in der in vitro
Transkription wurden die Plasmide mit Hilfe von Restriktionsenzymen linearisiert.
Die Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
5 μl 5 x Transkriptionspuffer (200 mM Tris-HCI pH 7.9, 30 mM MgCI2, 10 mM Sper- midin, 50 mM NaCI) 1 μl BSA (1 mg/ml)
1 μl RNAsin 2,5 μl DTT (100 mM) 1 μl NTP's (ATP, GTP ,CTP mit 2,5 mM und UTP mit 1 ,25 mM)
2 μl 32P-UTP (3000 Ci/mM)
2 μl MINX Plasmid linearisiert (1 mg/ml) 2,5 μl GpppG-Cap (1 mM) 2 μl SP6 Polymerase ad 25 μl mit H2O
Der Transkriptionsansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert und anschließend über ein präparatives Gel nach Standardmethoden gereingt. Zum Auffinden der markierten RNA wurde für 1 Minute ein Röntgenfilm aufgelegt und die Bande mittels eines
Skalpells ausgeschnitten. Das Gelfragment wurde zerschnitten und über Nacht bei 4°C mit Elutionspuffer (500 mM Na-Acetat pH 5, 1 mM EDTA pH 8, 2,5% Phenol/Chloroform) die RNA aus dem Gel extrahiert.
3.2 Durchführung der Spleißreaktion
7 μl Kernextrakt von HeLa-Zellen (=35 % v/v) wurden mit 3,25 mM MgCI2, 35 mM KCI, 2 mM ATP, 20 mM Phosphocreatine, 1 U/μl RNAsin und 30.000 - 50.000 cpm MINX-prä-mRNA (Zillmann et al., 1988, Molecular and Cellular Biology, 8: 814) in einem Reaktionsvolumen von 20 μl für 0, 10, 20, 30 und 40 Minuten bei 30°C inkubiert. Zum Vergleich wurde prä-mRNA eingesetzt, die das IRE nicht enthielt. Anschließend wurden die Reaktionen durch Zugabe von 400 μl Proteinase K-Puffer (100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 12,5, mM EDTA, 150 mM NaCI, 1 % SDS, 0,1 mg Pro- teinase K) beendet. Die Proben wurden mit 400 μl Phenol/Chloroform extrahiert und die wässrige Phase mit 2,5 Volumina Ethanol und 1/10 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,2) bei -20°C gefällt. Die RNA wurde abzentrifugiert und mit 70 - 80% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde die RNA getrocknet.
Die getrocknete RNA wurde in 5 μl Probenpuffer (0,5 x TBE, 80% (v/v) Formamid,
0,1 % (w/v) Xylencyanol und 0,1 % (w/v) Bromphenolblau) aufgenommen, für 10 Minuten bei 65°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und anschließend mittels eines 8%-igen Polyacrylamidgels aufgetrennt. Die aufgetrennte RNA wurde mittels Autoradiogra- phie nachgewiesen (siehe Fig. 6).
In den Spuren 1-5 der Fig. 6 ist der zeitliche Verlauf (0, 10, 20, 30, 40 Minuten) der Spleißreaktion der MINX prä-mRNA ohne IRE am 3'-OH Ende gezeigt. Auf der Abbildung ist zu erkennen, daß nach ca. 20 Minuten ein Großteil der Prä-mRNA in die reife mRNA überführt worden ist. In den Spuren 6-10 ist das gleiche Experiment mit der durch IRE am 3'-OH Ende modifizierten prä-mRNA gezeigt. Auch hier ist eine deutliche Spleißreaktion nach 20 Minuten Inkubationszeit zu erkennen.

Claims

Patentansprüche
1. Testsystem enthaltend
(a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
(b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
(c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise (d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls
(e) weitere Hilfsmittel.
2. Testsystem nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure mindestens zwei Exons enthält, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.
3. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das gelfreie Nachweissystem mindestens eine Sonde enthält.
4. Testsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine zu der spleißfähigen Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, eine die spleißfähige Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung und/oder ein die spleißfähige Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein ist.
5. Testsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die niedermolekulare
Verbindung ausgewählt ist aus Theophyllin, Xanthin oder einem Aminoglycosid, vorzugsweise Tobramycin, und das Nukleinsäure- bindende Peptid oder Protein ein "iron responsive element binding protein" IBP) ist.
6. Testsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die komplementäre Nukleinsäure komplementär zu mindestens einem Intron, zu mindestens einem Exon und/oder zu mindestens einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron ist.
7. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-6, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure oder die komplementäre Nukleinsäure des gelfreien Nachweissystems eine Erkennungssequenz für eine Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung und/oder für ein Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein enthält.
8. Testsystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenz für eine Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung eine Aptamersequenz ist.
9. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß das gelfreie Nachweissystem eine Markierung enthält.
10. Testsystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive Markierung, eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, mit Biotin, mit Digoxigenin und/oder mit Antikörper ist.
11. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-8, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure und die Sonden-bindende Nukleinsauresequenz miteinander verbunden sind.
12. Testsystem nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei verschiedene Sonden-bindende Nukleinsäuresequenzen mit einer spleißfähigen Nukleinsäure verbunden sind.
13. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure direkt kovalent oder indirekt über ein Strukturelement und einen Bindungspartner zum Strukturelement oder mittels Hybridisierung an eine feste Phase gebunden ist.
14. Testsystem nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die direkte kovalen- te Bindung über die vicinalen 2',3'-Hydroxylgruppe des Riboserückgrades der Nukleinsäure erfolgt.
15. Testsystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das
Strukturelement ein Biotin- oder Dicarbonsäure-Linker ist
16. Testsystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner Theophyllin, Xanthin oder einem Aminogiycosid, vorzugsweise
Tobramycin, und/oder ein Nukleinsäure-Bindeprotein, insbesondere IBP, ist.
17. Testsystem nach einem der Ansprüche 13-16, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase ausgewählt ist aus Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Glas oder Kunststoff.
18. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure eine RNA ist.
19. Testsystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die RNA von einer
Nukleinsäure abgeleitet ist, ausgewählt aus einer Sequenz der Formel
T CTTGGATCGG AAACCCGTCG GCCTCCGAAC GGTAAGAGCC TAGCATGTAG AACTGGTTAC CTGCAGCCCA AGCTTGCTGC ACGTCTAGGG CGCAGTAGTC CAGGGTTTCC
TTGATGATGT CATACTTATC CTGTCCCTTT TTTTTCCACA GCTCGCGGTT GAGGACAAAC TCTTCGCGGT CTTTCCAGTG GGGATCCAAG TGATACCAGC ATCGTCTTGA TGCCCTTGGC AGCACTTGGA TCC,
CACTCTTGGA TCGGAAACCC GTCGGCCTCC GAACGGTAAG AGCCTAGCAT GTAGAACTGG TTACCTGCAG CCCAAGCTTG CTGCACGTCT AGGGCGCAGT AGTCCAGGGT TTCCTTGATG ATGTCATACT TATCCTGTCC CTTTTTTTTC CACAGCTCGC GGTTGAGGAC AAACTCTTCG CGGTCTTTCC AGTGGGGATC GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC GTGCTGAGCC GGATCC
CACTCTTGGA TCGGAAACCC GTCGGCCTCC GAACGGTAAG AGCCTAGCAT
GTAGAACTGG TTACCTGCAA AGUGAUACCA GCAÜCGUCUU GAUGCCCUÜG GCAGCACUUC TGCAGCCCAA GCTTGCTGCA CGTCTAGGGC GCAGTAGTCC
AGGGTTTCCT TGATGATGTC ATACTTATCC TGTCCCTTTT TTTTCCACAG
CTCGCGGTTG AGGACAAACT CTTCGCGGTC TTTCCAGTGG GGATCC
CCACTCTTGG ATCGGAAACC CGTCGGCCTC CGAACGGTAA GAGCCTAGCA TGTAGAACTG GTTACCTGCA GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC
GTGCTGAGCC CTGCAGCCCA AGCTTGCTGC ACGTCTAGGG CGCAGTAGTC
CAGGGTTTCC TTGATGATGT CATACTTATC CTGTCCCTTT TTTTTCCACA
GCTCGCGGTT GAGGACAAAC TCTTCGCGGT CTTTCCAGTG GGGATCC AAGTGATACC AGCATCGTCT TGATGCCCTT GGCAGCACTT GAATTCGAGC TCGCCCACTC TTGGATCGGA AACCCGTCGG CCTCCGAACG GTAAGAGCCT AGCATGTAGA ACTGGTTACC TGCAGCCCAA GCTTGCTGCA CGTCTAGGGC GCAGTAGTCC AGGGTTTCCT TGATGATGTC ATACTTATCC TGTCCCTTTT
TTTTCCACAG CTCGCGGTTG AGGACAAACT CTTCGCGGTC TTTCCAGTGG GGATCC
GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC GTGCTGAGCC GAATTCGAGC TCGCCCACTC TTGGATCGGA AACCCGTCGG CCTCCGAACG GTAAGAGCCT
AGCATGTAGA ACTGGTTACC TGCAGCCCAA GCTTGCTGCA CGTCTAGGGC GCAGTAGTCC AGGGTTTCCT TGATGATGTC ATACTTATCC TGTCCCTTTT TTTTCCACAG CTCGCGGTTG AGGACAAACT CTTCGCGGTC TTTCCAGTGG GGATCC
(Th/To)-5'-verbunden mit einer Sequenz der Formel CCGCGGTGGC GGCCGCTCTA GAACTAGTGG ATCCGTCGAC TGACTTCAGT ATGTAATATA CCCCAAACAT TTTACCCACA AAAAACCAGG ATTTGAAACT ATAGCATCTA AAAGTCTTAG GTACTAGAGT TTTCATTTCG GAGCAGGCTT TTTGAAAAAT TTAATTCAAC CATTGCAGCA GCTTTTGACT AACACATTCT
ACAGTAGGAT CATTTCTATA GGAATCGTCA CTCTTTGACT CTTCAAAAGA GCCACTGAAT CCAACTTGGT TGATGAGTCC CATAACCTTT GTACCCCAGA GTGAGAAACC GAAATTGAAT CTAAATTAGC TTGGTCCGCA ATCCTTAGCG TTCGGCCATC TATAATTTTG AATAAAAATT TTGCTTTGCC GTTGCATTTG TAGTTTTTTC CTTTGGAAGT AATTACAATA TTTTATGGCG CGATGATTCT
TGACCCATCC TATGTACTTC TTTTTTGAAG GGATAGGGCT CTATGGGTGG GTACAAATGG CAGTCTGACA AGTT,
TCCGTCGACT GACTTCAGTA TGTAATATAC CCCAAACATT TTACCCACAA
AAAACCA-3'-(Th/To)
CCAGGATTTG AAACTATAGC ATCTAAAAGT CTTAGGTACT AGAGTTTTCA TTTCGGAGCA GGCTTTTTGA AAAATTTAAT TCAACCATTG CAGCAGCTTT TGACTAACAC ATTCTACAGT AGGATCATTT CTATAGGAAT CGTCACTCTT TGACTCTTCA AAAGAGCCAC TGAATCCAAC TTGGTTGATG AGTCCCATAA
CCTTTGTACC CCAGAGTGAG AAACCGAAAT TGAATCTAAA TTAGCTTGGT CCGCAATCCT TAGCGTTCGG CCATCTATAA TTTTGAATAA AAATTTTGCT TTGCCGTTGC ATTTGTAGTT TTTTCCTTTG GAAGTAATTA CAATATTTTA TGGCGCGATG ATTCTTGACC CATCCTATGT ACTTCTTTTT TGAAGGGATA GGGCTCTATG GGTGGGTACA AATGGCAGTC TGACAAGTT,
GTCGACTGAC TTCAGTATGT AATATACCCC AAACATTTTA CCCACAAAAA ACCAGGATTT GAAACTATAG CATCTAAAAG TCTTAGGTAC TAGAGTTTTC ATTTCGGAGC AGGCTTTTTG AAAAATTTAA TTCAACCATT GCAGCAGCTT
TTGACTAACA CATTCTACAG TAGGATCATT TCTATAGGAA TCGTCACTCT TTGACTCTTC AAAAGAGCCA CTGAATCCAA CTTGGTTGAT GAGTCCCATA ACCTTTGTAC CCCAGAGTGA GAAACCGAAA TTGAATCTAA ATTAGCTTGG TCCGCAATCC TTAGCGTTCG GCCATCTATA ATTTTGAATA AAAATTTTGC TTTGCCGTTG CATTTGTAGT TTTTTCCTTT GGAAGTAATT ACAATATTTT
ATGGCGCGAT GATTCTTGAC CCATCCTATG TACTTCTTTT TTGAAGGGAT AGGGCTCTAT GGGTGGGTAC AAATGGCAGT CTGACAAGTT-3'-(Th/Tθ) CACTCTTGGA TCGGAAACCC GTCGGCCTCC GAACGGTAAG AGCCTAGCAT GTAGAACTGG TTACCTGCAG CCCAAGCTTG CTGCACGTCT AGGGCGCAGT AGTCCAGGGT TTCCTTGATG ATGTCATACT TATCCTGTCC CTTTTTTTTC CACAGCTCGC GGTTGAGGAC AAACTCTTCG CGGTCTTTCC AGTGGGGATC GGGGATCCTG CTTCAACAGT GCTTGGACGG ATCCTCTAGA c oder
TCCGTCGACT GACTTCAGTA TGTAATATAC CCCAAACATT TTACCCACAA AAAACCAGGA TTTGAAACTA TAGCATCTAA AAGTCTTAGG TACTAGAGTT
TTCATTTCGG AGCAGGCTTT TTGAAAAATT TAATTCAACC ATTGCAGCAG
CTTTTGACTA ACACATTCTA CAGTAGGATC ATTTCTATAG GAATCGTCAC
TCTTTGACTC TTCAAAAGAG CCACTGAATC CAACTTGGTT GATGAGTCCC
ATAACCTTTG TACCCCAGAG TGAGAAACCG AAATTGAATC TAAATTAGCT TGGTCCGCAA TCCTTAGCGT TCGGCCATCT ATAATTTTGA ATAAAAATTT
TGCTTTGCCG TTGCATTTGT AGTTTTTTCC TTTGGAAGTA ATTACAATAT
TTTATGGCGC GATGATTCTT GACCCATCCT ATGTACTTCT TTTTTGAAGG
GATAGGGCTC TATGGGTGGG TACAAATGGC AGTCTGACA AGTTGGGGATC
CTGCTTCAAC AGTGCTTGGA CGGATCCTCT AGAC,
wobei (Th/To) eine Sequenz ausgewählt aus
AAGTGATACC AGCATCGTCT TGATGCCCTT GGCAGCACTT GAATT (Th), oder
GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC GTGCTGAGCC GAATT (To) bedeutet.
20. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) "small nuclear ribonucleoprotein parti- des" (snRNP)-Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten enthalten.
21. Testsystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die snRNP- Komponenten U1-, U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine enthalten.
22. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-21 , dadurch gekennzeichnet, daß die
Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) ein Zellextrakt, insbesondere ein eukaryotischer Zeil- oder Zellkemextrakt ist.
23. Testsystem nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkemextrakt aus tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, oder von Pilzen, insbesondere Hefen gewonnen ist.
24. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-23, dadurch gekennzeichnet, daß die weiteren Hilfsmittel gemäß Merkmal (d) ausgewählt sind aus Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalenten, insbesondere ATP.
25. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 1-24, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine spleißfähige Nukleinsäure gemäß Merkmal (a) und mindestens ein gelfreies Nachweissystem gemäß Merkmal (b) sowie gegebenenfalls mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Splice- komponenten gemäß Merkmal (c) und gegebenenfalls weitere Hilfsmitteln zusammengestellt werden.
26. Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsauresequenz in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und mindestens einer
Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
(b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Substanz eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein Fungizid, ein Herbizid, ein Pestizid und/oder ein Insektizid ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutisch wirksame Substanz ein Antibiotikum ist.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26-28, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden, natürlich vorkommenden und chemisch modifizierten und/oder synthetischen
Substanz.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz in Form einer kombinatorischen Substanzbibliothek eingesetzt wird.
31. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsauresequenz in Anwesenheit von mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
(b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung eine Erbkrankheit, eine Krebserkrankung und/oder eine virale Erkrankung ist.
33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung ausgewählt ist aus Grave's Krankheit, spinale Muskelatrophy, ß'- Thalassaemie, Krebserkrankungen in bezug auf das c-erb-Onkogen, Hepatitis C Infektion und/oder Herpes Simplex Virus Infektion.
34. Spleißfähige Nukleinsäuren ausgewählt aus einer RNA, die von einer Nukleinsäure abgeleitet ist, ausgewählt aus einer Sequenz der Formel
T CTTGGATCGG
AAACCCGTCG GCCTCCGAAC GGTAAGAGCC TAGCATGTAG AACTGGTTAC CTGCAGCCCA AGCTTGCTGC ACGTCTAGGG CGCAGTAGTC CAGGGTTTCC TTGATGATGT CATACTTATC CTGTCCCTTT TTTTTCCACA GCTCGCGGTT GAGGACAAAC TCTTCGCGGT CTTTCCAGTG GGGATCCAAG TGATACCAGC ATCGTCTTGA TGCCCTTGGC AGCACTTGGA TCC,
CACT CTTGGATCGG AAACCCGTCG GCCTCCGAAC GGTAAGAGCC TAGCATGTAG AACTGGTTAC
CTGCAGCCCA AGCTTGCTGC ACGTCTAGGG CGCAGTAGTC CAGGGTTTCC TTGATGATGT CATACTTATC CTGTCCCTTT TTTTTCCACA GCTCGCGGTT GAGGACAAAC TCTTCGCGGT CTTTCCAGTG GGGATCGGCT TAGTATAGCG AGGTTTAGCT ACACTCGTGC TGAGCCGGAT CC, CACT CTTGGATCGG AAACCCGTCG GCCTCCGAAC GGTAAGAGCC TAGCATGTAG AACTGGTTAC CTGCAAAGTG ATACCAGCAT CGTCTTGATG CCCTTGGCAG CACTTCTGCA GCCCAAGCTT GCTGCACGTC TAGGGCGCAG TAGTCCAGGG TTTCCTTGAT GATGTCATAC TTATCCTGTC CCTTTTTTTT CCACAGCTCG CGGTTGAGGA CAAACTCTTC GCGGTCTTTC CAGTGGGGAT CC,
CCACT CTTGGATCGG AAACCCGTCG GCCTCCGAAC GGTAAGAGCC TAGCATGTAG AACTGGTTAC CTGCAGGCTT AGTATAGCGA GGTTTAGCTA CACTCGTGCT GAGCCCTGCA GCCCAAGCTT GCTGCACGTC TAGGGCGCAG TAGTCCAGGG TTTCCTTGAT
GATGTCATAC TTATCCTGTC CCTTTTTTTT CCACAGCTCG CGGTTGAGGA CAAACTCTTC GCGGTCTTTC CAGTGGGGAT CC,
AAGT GATACCAGCA TCGTCTTGAT
GCCCTTGGCA GCACTTGAAT TCGAGCTCGC CCACTCTTGG ATCGGAAACC CGTCGGCCTC CGAACGGTAA GAGCCTAGCA TGTAGAACTG GTTACCTGCA GCCCAAGCTT GCTGCACGTC TAGGGCGCAG TAGTCCAGGG TTTCCTTGAT GATGTCATAC TTATCCTGTC CCTTTTTTTT CCACAGCTCG CGGTTGAGGA CAAACTCTTC GCGGTCTTTC CAGTGGGGAT CC,
GGCT TAGTATAGCG AGGTTTAGCT ACACTCGTGC TGAGCCGAAT TCGAGCTCGC CCACTCTTGG ATCGGAAACC CGTCGGCCTC CGAACGGTAA GAGCCTAGCA TGTAGAACTG GTTACCTGCA
GCCCAAGCTT GCTGCACGTC TAGGGCGCAG TAGTCCAGGG TTTCCTTGAT GATGTCATAC TTATCCTGTC CCTTTTTTTT CCACAGCTCG CGGTTGAGGA CAAACTCTTC GCGGTCTTTC CAGTGGGGAT CC,
(Th/To)-5 '-verbunden mit einer Sequenz der Formel
CCGCGGTGGC GGCCGCTCTA GAACTAGTGG ATCCGTCGAC TGACTTCAGT ATGTAATATA CCCCAAACAT TTTACCCACA AAAAACCAGG ATTTGAAACT ATAGCATCTA AAAGTCTTAG GTACTAGAGT TTTCATTTCG GAGCAGGCTT TTTGAAAAAT TTAATTCAAC CATTGCAGCA GCTTTTGACT AACACATTCT
ACAGTAGGAT CATTTCTATA GGAATCGTCA CTCTTTGACT CTTCAAAAGA GCCACTGAAT CCAACTTGGT TGATGAGTCC CATAACCTTT GTACCCCAGA GTGAGAAACC GAAATTGAAT CTAAATTAGC TTGGTCCGCA ATCCTTAGCG TTCGGCCATC TATAATTTTG AATAAAAATT TTGCTTTGCC GTTGCATTTG TAGTTTTTTC CTTTGGAAGT AATTACAATA TTTTATGGCG CGATGATTCT
TGACCCATCC TATGTACTTC TTTTTTGAAG GGATAGGGCT CTATGGGTGG GTACAAATGG CAGTCTGACA AGTT, TCCGTCGACT GACTTCAGTA TGTAATATAC CCCAAACATT TTACCCACAA AAAACCA-3'-(Th/To)
CCAGGATTTG AAACTATAGC ATCTAAAAGT CTTAGGTACT AGAGTTTTCA TTTCGGAGCA GGCTTTTTGA AAAATTTAAT TCAACCATTG CAGCAGCTTT TGACTAACAC ATTCTACAGT AGGATCATTT CTATAGGAAT CGTCACTCTT
TGACTCTTCA AAAGAGCCAC TGAATCCAAC TTGGTTGATG AGTCCCATAA CCTTTGTACC CCAGAGTGAG AAACCGAAAT TGAATCTAAA TTAGCTTGGT CCGCAATCCT TAGCGTTCGG CCATCTATAA TTTTGAATAA AAATTTTGCT TTGCCGTTGC ATTTGTAGTT TTTTCCTTTG GAAGTAATTA CAATATTTTA TGGCGCGATG ATTCTTGACC CATCCTATGT ACTTCTTTTT TGAAGGGATA
GGGCTCTATG GGTGGGTACA AATGGCAGTC TGACAAGTT,
GTCGACTGAC TTCAGTATGT AATATACCCC AAACATTTTA CCCACAAAAA ACCAGGATTT GAAACTATAG CATCTAAAAG TCTTAGGTAC TAGAGTTTTC ATTTCGGAGC AGGCTTTTTG AAAAATTTAA TTCAACCATT GCAGCAGCTT
TTGACTAACA CATTCTACAG TAGGATCATT TCTATAGGAA TCGTCACTCT TTGACTCTTC AAAAGAGCCA CTGAATCCAA CTTGGTTGAT GAGTCCCATA ACCTTTGTAC CCCAGAGTGA GAAACCGAAA TTGAATCTAA ATTAGCTTGG TCCGCAATCC TTAGCGTTCG GCCATCTATA ATTTTGAATA AAAATTTTGC TTTGCCGTTG CATTTGTAGT TTTTTCCTTT GGAAGTAATT ACAATATTTT
ATGGCGCGAT GATTCTTGAC CCATCCTATG TACTTCTTTT TTGAAGGGAT AGGGCTCTAT GGGTGGGTAC AAATGGCAGT CTGACAAGTT-3'-(Th/Tθ)
CACTCTTGGA TCGGAAACCC GTCGGCCTCC GAACGGTAAG AGCCTAGCAT
GTAGAACTGG TTACCTGCAG CCCAAGCTTG CTGCACGTCT AGGGCGCAGT AGTCCAGGGT TTCCTTGATG ATGTCATACT TATCCTGTCC CTTTTTTTTC CACAGCTCGC GGTTGAGGAC AAACTCTTCG CGGTCTTTCC AGTGGGGATC GGGGATCCTG CTTCAACAGT GCTTGGACGG ATCCTCTAGA c oder
TCCGTCGACT GACTTCAGTA TGTAATATAC CCCAAACATT TTACCCACAA AAAACCAGGA TTTGAAACTA TAGCATCTAA AAGTCTTAGG TACTAGAGTT TTCATTTCGG AGCAGGCTTT TTGAAAAATT TAATTCAACC ATTGCAGCAG CTTTTGACTA ACACATTCTA CAGTAGGATC ATTTCTATAG GAATCGTCAC
TCTTTGACTC TTCAAAAGAG CCACTGAATC CAACTTGGTT GATGAGTCCC ATAACCTTTG TACCCCAGAG TGAGAAACCG AAATTGAATC TAAATTAGCT TGGTCCGCAA TCCTTAGCGT TCGGCCATCT ATAATTTTGA ATAAAAATTT TGCTTTGCCG TTGCATTTGT AGTTTTTTCC TTTGGAAGTA ATTACAATAT TTTATGGCGC GATGATTCTT GACCCATCCT ATGTACTTCT TTTTTGAAGG
GATAGGGCTC TATGGGTGGG TACAAATGGC AGTCTGACA AGTTGGGGATC CTGCTTCAAC AGTGCTTGGA CGGATCCTCT AGAC,
wobei (Th/To) eine Sequenz ausgewählt aus
AAGTGATACC AGCATCGTCT TGATGCCCTT GGCAGCACTT GAATT (Th), Oder GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC GTGCTGAGCC GAATT (To) bedeutet.
5. Verwendung einer spleißfähigen Nukleinsäure gemäß Anspruch 34 zur
Herstellung eines Testsystems.
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