WO2000054049A2 - Chemosensitivitätsmessung über caspase-aktivität - Google Patents

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    • G01N33/57595—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving intracellular compounds
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the chemosensitivity of cells towards at least one substance by measuring the apoptosis triggered by the at least one substance.
  • the treatment and healing success of tumor diseases has increased significantly since the introduction of chemotherapy.
  • ALL childhood acute lymphoblastic leukemia
  • the drugs so-called cytostatics, are administered alone or in combination with other active substances according to certain therapy plans.
  • cytostatics are administered alone or in combination with other active substances according to certain therapy plans.
  • the main criterion for an improved therapy plan is a better survival rate (clinical outcome). This criterion applies to the majority of patients. However, each individual has a different set of cells with different properties. This is particularly true of the Properties of tumor cells too.
  • chemosensitivity assays are based at least in part on the agar tumor culture assay developed by Salmon (Salmon et al. Science, 197, 461-463 (1977)). These tests measure cell proliferation.
  • a second type of chemosensitivity test involves the exclusion of (fluorescence) dyes or the release of the radioactive chromium isotope 51 Cr, which measures the destruction of the cell membrane by direct or indirect cytostatic effects.
  • a modification of the previous dye exclusion test is the so-called DiSC assay (Weisenthal, Kern Oncology 5: 92-103 (1991)), which additionally differentiates between normal and tumor cells by a second staining process.
  • the third type of chemosensitivity test determines parameters of cellular metabolism as a measure of the damage caused by cytostatics.
  • This type of test includes the BACTEC radiometric test (from Hoff D., Forseth B., Warfei L., in Salmon Trent (Eds.) Human tumor cloning, pp. 656-657, Greene & Stratton, Orlando (1984)) MTT test (Freund A. et al. European Journal of Cancer 34: 895-901 (1998), Kaspers GJL Blood 92: 259-266 (1998), Pieters R. et al. Leukemia 12, 1344-1348 (1998) , Klumper E. et al.
  • agar culture assays The major disadvantage of agar culture assays is that far from all tumor cells grow in the agar cultures. This is particularly true for lymphocytic leukaemias and lymphomas (Veerman A.J.P., Pieters R. British Journal of Haematology 74: 381-384 (1990)).
  • lymphocytic leukaemias and lymphomas the major disadvantage of agar culture assays.
  • the clonogenic assay the percentage of evaluable cell populations is only 30-40%. The cells have to grow for a very long time (10-20 days) before the evaluation takes place. The workload is also immense.
  • the dye exclusion tests as well as the 51 Cr release test determine the proportion of cells with a defective cell membrane. These tests often include fixation and subsequent microscopic evaluation of the cells or measurement of radioactivity in the supernatant. Such tests are unspecific due to the measurement of a rather rough parameter, the cell membrane integrity, and cannot differentiate between a specific anti-tumor effect of a substance or a physical or, for example, cell damage caused by a substance due to severe burns or oxidation. Tests of this type are therefore also positive for substances that generally damage all cells and are therefore not suitable as an anti-tumor drug. Probably the most meaningful test of the dye exclusion type is the DiSC test.
  • radiometric tests such as the 51 Cr release test:
  • radioactive isotopes in diagnostic tests is increasingly being avoided these days due to the hazard potential and disposal problems.
  • fluorescence and luminescence techniques can now achieve the same sensitivity with a frequently shorter overall test duration.
  • the MTT test is based on the conversion of 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide into a blue formazan product. The reaction is catalyzed by dehydrogenases, which are only active in living cells.
  • the MTT test depends on a constitutive basic activity of the cells examined. However, it has been found that some cell types, for example particularly frequently some FAB subtypes of acute myeloid leukemia, have a greatly reduced dehydrogenase activity (Santini V. et al. Hematological Oncology 7: 287-293 (1989)). The chemosensitivity of these tumor cells can therefore not be assessed using an MTT test. Another problem is the resulting water-insoluble formazan crystals. These must be dissolved by adding organic solvents such as dimethyl sulfoxide or isopropanol. Experience has shown that this creates problems with the reproducibility of the test.
  • Apoptosis is a cell death programmed by the cell itself, which can be induced by physiological factors in the organism or triggered by chemicals such as cytostatics. The programmed cell death plays an extremely large role in the cytostasis eg of the immune system.
  • T- Cells that are directed against the body's own structures are removed from the organism by apoptosis. Otherwise there may be symptoms of an autoimmune disease, such as lupus erythematosus, arthritic diseases or the disease caused by a T cell tumor. Substances like the tumor necrosis factor alpha synthesized by macrophages are natural inducers of apoptosis.
  • Apoptosis follows a programmed, uniform scheme in which, among other things, certain cysteine-containing proteases (caspases) are activated (Cohen G.M. Biochem. J. 326: 1-16 (1997)).
  • caspases cysteine-containing proteases
  • the activation of caspases occurs exclusively through apoptosis and is therefore a specific parameter for the quantification of apoptosis.
  • the cell membranes are still intact and impermeable to DNA-binding fluorescent dyes such as e.g. Propidium iodide. Therefore, caspase activity is a parameter for the action of cytostatics, which occurs significantly earlier than the cell membrane disintegration hours later.
  • Medenica (US 5736129) determines the extent of cell damage by cytostatics by staining the cells with propidium iodide and then counting the stained cells in the FACS (fluorescence activated cell sorter).
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • Caspase activity tests are particularly suitable for the specific detection of apoptosis because necrotic damage, which is not meaningful for cytostatic effects, is not recorded (see Table 1).
  • the methods used for measuring caspase activity in recent years include gel electrophoretic separation of specific protein substrates, and chromogenic and fluorogenic tests in which colored products are formed by the caspases (see, for example, Cohen GM Biochem. J. 326: 1-16 (1997), Stennicke HR, Salvesen GSJ Biol. Chem. 41: 25719-25723 (1997)).
  • WO-A-99/18856 relates to a method for the chemosensitivity measurement of cells against substances, using cell-compatible fluorogenic substrates.
  • the disadvantage of this is that only special substrates can be used.
  • Fulda, S. et.al. discloses a method for measuring apoptosis inducing doxorubizin, cisplatin and VP-16 using flow cytometry. This means that no cell lysates can be measured.
  • Flow cytometry is also a comparatively complex method.
  • WO-A-98/13517 relates to a method for estimating the extent of apoptosis in cells.
  • the cells are loaded with a substrate for proteases from the ICE / Ced-3 family and the conversion of the substrate by the protease is followed by flow cytometry.
  • no lysates can be measured with this.
  • flow cytometry is relatively expensive.
  • the loading of the cells also requires a permeabilization of the cells. This can lead to complications.
  • the cells are often not sufficiently authentic due to the permeabilization treatment, but rather correspond to an artificial system.
  • Apoptosis and thus the development of caspase activity is a dynamic process in which the cell changes into so-called secondary necrosis after a certain time.
  • the caspases of these destroyed cells are therefore removed during the washing process.
  • the object of the present invention is to overcome the disadvantages of the prior art mentioned.
  • the object is achieved by a method for determining the chemosensitivity of cells against at least one substance by measuring the apoptosis triggered by the at least one substance, the apoptosis being determined by the accumulated caspase activity of a sample with cells and a medium, by using the sample with of the at least one substance is added and incubated and after the destruction of the cells without prior separation of the cells the accumulated caspase activity in the sample is measured.
  • the method according to the invention allows in particular the use of substrates which are difficult or non-cell-compatible.
  • the measurement of the accumulated caspase activity is essential.
  • cells eg tumor cells of a patient
  • at least one substance eg cytostatics
  • a substrate in a lysis buffer is added, and after cell lysis has been carried out, the total - accumulated - caspase activity of the cell suspension is measured.
  • caspases activated by cytostatics remain active even after secondary necrosis of apoptotic cells, which accumulated Caspase activity increases with the incubation period and remains at a high level from the point at which secondary necrosis takes place.
  • the caspase activity determined conventionally (with washing step) increases in step with the accumulated caspase activity, but decreases with the onset of secondary necrosis (see FIG. 1).
  • the principle of measuring the accumulated caspase activity thus makes it possible to determine the effect of substances on the cells by means of a single caspase activity measurement. This test has a low cell requirement and can be carried out as a routine test by laboratory technicians or technical staff in a short time. Due to the ease of automation, the personnel expenditure for carrying out the test is low.
  • test can be carried out on ELISA readers available everywhere, no device investments are required. Miniaturization is possible to further reduce material consumption. It could be shown that cells in less than 10 ⁇ l medium can be kept in culture for a few days. By reducing the number of cells per sample chamber to 100 to 1000 per test, highly parallel analyzes of samples with extremely few patient cells, such as from fine needle biopsies, are made possible. The low cell requirement also enables high throughput screening (HTS) of unknown substances for anti-tumor effects.
  • HTS high throughput screening
  • chemosensitivity of cells of pathological tissue is tested via caspase activity, it is advantageous to test healthy cells of the tissue as well as the same cells without added substances as a reference. In particular, it makes sense to test a permanent Zeil line, whose chemosensitivity is known, as a control in order to document the functionality of the test and to recognize errors in the test execution.
  • the following substances are suitable as substances:
  • PNA Peptide Nucleic Acids
  • the caspase activity can be achieved both by substrate conversion of fluorogenic or chromogenic substrates or by binding specific markers, for example antibodies, F ab fragments, single chain antibodies, aptamers (structure-binding nucleic acids) and / or other proteins with binding sites for either unchanged (educts) or converted caspase substrates (products) are measured.
  • the use of aminocoumarin-DEVD as a fluorogenic substrate is particularly suitable.
  • Marker molecules that can specifically bind either educts or products of caspase reactions can either be one Dye content, a colloidal metal (eg silver, gold), a radioactive isotope and / or rare earth metal chelates.
  • the accumulated caspase activity is measured, in particular, at the earliest 10 h (in particular 24 to 48 h) after the sample has been mixed with the at least one substance, since only then slowly acting cytostatics have triggered apoptosis. Since apoptosis is a very early marker for the effectiveness of cytostatics, the test described is significantly faster than e.g. the MTT test with an incubation period of 4 days.
  • the method according to the invention is particularly suitable for stratification of tumor diseases.
  • a classification of the tumor diseases is made possible according to the invention, which shows which existing standard protocol is suitable for chemotherapy.
  • the test according to the invention makes it possible to determine relatively quickly whether a certain tumor cell line responds to a chemotherapeutic agent.
  • the development of new protocols for chemotherapy of tumor diseases is possible by using the method according to the invention for the cumulative measurement of the caspase activity as an indicator for the death of tumor cells.
  • the method according to the invention allows also, the optimization of individual chemotherapy against tumor diseases, in which patient tumor tissues are treated with chemotherapeutic agents and their response to these chemotherapeutic agents is determined according to the invention by apoptosis of the tumor cells.
  • a strong-acting cytostatic that immediately stops the growth of the cells and converts all cells into apoptosis can, due to the small number of cells, have significantly less apoptosis than in the case of a weaker-acting cytostatic, in which the cells can first multiply, only then later go into apoptosis to a small extent. Only normalization takes apoptosis into account in relation to the total number of cells and correctly evaluates the more potent cytostatic.
  • the chemosensitivity test of cells can be carried out particularly advantageously with a kit.
  • This kit contains a sample holder with several sample chambers, whereby one sample chamber contains at least one substance.
  • a standardized solution of a reagent for measuring caspase activity is also included per kit.
  • the caspase substrate is in particular aminocoumarin DEVD in a lysis buffer.
  • a caspase activity standard can also be included.
  • the sample carrier can be, for example, a commercially available microtiter plate.
  • the substances to be tested depend on the application and can be prefabricated in the chambers of the sample holder either in solution or in dried form. The substances can be used either as dry matter, in solution or in the presence of matrix substances such as salts, buffers, carbohydrates, carboxylic acids, pyrimidines, inorganic or organic nanoparticles up to 1 ⁇ m in diameter.
  • Figure 3 shows the chemosensitivity of U937 cells against various cytostatics.
  • Figure 4 shows the chemosensitivity of HL60 cells against various cytostatics.
  • Figure 5 shows the chemosensitivity of PBMNC to daunorubicin.
  • Figure 6 shows the chemosensitivity of PBMNC to Ara-C.
  • the caspase activities of 250,000 Jurkat cells in 100 ⁇ l medium were determined after various incubation times with 1 ⁇ g / ml actinomycin D conventionally and according to the inventive method of the accumulated caspase activity.
  • 100 ⁇ l Jurkat cells (2.5 ⁇ 10 6 / ml) were incubated in the presence of actinomycin D at 5% CO 2 and 37 ° C. in RPMI medium with 10% FCS + pen strep. After the incubation, the cells were centrifuged according to the conventional method and washed with PBS. The pellet was in 200 ul Resuspended lysis buffer, incubated on ice for 10 min and frozen at -20 ° C.
  • the accumulated caspase activity was determined by mixing 100 ⁇ l of the cells incubated with actinomycin D directly in suspension with 100 ⁇ l 2x lysis buffer. The lysate was also frozen at -20 ° C. All lysates were thawed together and treated with aminocoumarin DEVD. At room temperature, the release of fluorescent aminocoumarin by the caspase was checked every 5 min. followed over a period of 2 hours. The slope was calculated from the linear signal rise as a measure of the caspase activity.
  • the spontaneous caspase activities of the Jurkat cells in the absence of actinomycin D not shown in the figure, increase over time, but remain less than 4 min "1 .
  • the caspase activity of Jurkat and U-937 cells was determined after different incubation times with actinomycin D.
  • actinomycin D 0.5 ⁇ 10 6 cells were incubated in 1 ml RPMI 1640 medium with 10% FCS and pen / strep between 30 minutes and 16 hours with 1 ⁇ g / ml actinomycin D on cell culture plates (48 well). The cells were then transferred to Eppendorf cups and washed twice with medium. Then the pellet was resuspended in lysis buffer. After 10 minutes on ice, 50 ⁇ M aminocoumarin-DEVD substrate were added and the caspase activity was monitored here at 37 ° C. every 5 minutes over a period of 2 hours. The fluorescence was excited at 355 nm and the emission measured at 460 nm. The increase in fluorescence emission versus the incubation time with actinomycin D is plotted.
  • Fig. 2 the chemosensitivity of promyeloid HL60 cells is shown in Fig. 2.
  • Actinomycin D and daunorubicin also induce greater caspase activities than Ara-C and prednisolone.
  • Prednisolone shows a maximum in caspase activity at approx. 700 ng / ml. At higher concentrations, the apoptosis signal drops again.
  • Ara-C does not appear to have reached the maximum caspase inducible by this cytostatic at the highest measured concentration.
  • peripheral blood or bone marrow test isolated peripheral blood cells (PBMNC) were first tested by voluntary, healthy volunteers, with emphasis being placed on the fact that an acute infection, such as occurs more frequently in the autumn / winter months, was excluded could be.
  • Figures 5 and 6 show the results of the tests with two cytostatics.
  • FIG. 5 shows the effect of daunorubicin on the mononuclear cells of eight test subjects (NP), the mean value ⁇ standard deviation from three independent experiments being shown in each case.
  • Caspase activity can be induced by> 50 ng / ml daunorubicin, a plateau, i.e. however, a caspase activity which is constant at the maximum is not achieved in the case of persons NP1 and NP5 to NP8 and only partially in the case of persons NP2 to NP4.
  • the PBMNC react later to daunorubicin.
  • FIG. 6 shows the effect of Ara-C on the mononuclear cells of the subjects NP5 to NP8; the mean ⁇ standard deviation from three independent experiments is shown.
  • Caspase activity can be induced by> 200 ng / ml Ara-C, a plateau, i.e. however, the caspase activity remains at a maximum in none of the PBMNCs tested.

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung der Chemosensitivität von Zellen gegen mindestens eine Substanz durch Messung der durch die mindestens eine Substanz ausgelösten Apoptose, wobei die Apoptose durch kumulierte Caspase-Aktivität in einer Probe mit Zellen und einem Medium bestimmt wird, indem die Probe mit der mindestens einen Substanz versetzt und inkubiert wird und nach Zerstörung der Zellen ohne vorherige Abtrennung der Zellen die kumulierte Caspase-Aktivität in der Probe gemessen wird.

Description

Chemosensitivϊtätsmessung über Caspase-Aktivität
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Chemosensitivität von Zellen gegenüber mindestens einer Substanz durch Messung der durch die mindestens eine Substanz ausgelösten Apoptose.
Chemosensitivitätstests
Die Behandlungs- und Heilungserfolge von Tumorerkrankungen haben seit der Einführung der Chemotherapie stark zugenommen. Beispielsweise lag die Uberlebensrate bei kindlicher akuter lymphatischer Leukämie (ALL) Mitte der 60er Jahre bei weniger als 10%. Heutzutage liegt die Heilungschance bei über 70%. Die Medikamente, sog. Zytostatika, werden nach bestimmten Therapieplänen allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen verabreicht. Mittlerweile gibt es eine unüberschaubare Anzahl verschiedener Therapiepläne, die empirisch ermittelt und ständig weiterentwickelt werden. Das Hauptkriterium für einen verbesserten Therapieplan ist eine bessere Uberlebensrate (clinical outcome). Dieses Kriterium trifft für die Mehrheit der Patienten zu. Jedes Individuum besitzt aber eine unterschiedliche Ausstattung an Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften. Dies trifft insbesondere auf die Eigenschaften von Tumorzellen zu. In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Therapie für eine Subpopulation extrem gut wirkt, während sie für andere Patienten aufgrund von medikamentresistenten Tumoren wenig oder überhaupt nicht wirksam ist. (Lacombe et al., Blood, 84, 716-723 (1994), Smit et al. International Journal of Cancer 51, 72-78 (1992)). Dabei konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wirksamkeit verschiedener Medikamente, sondern auch die wirksame Dosis eines Medikamentes individuell unterschiedlich sein kann. Die Ermittlung der individuellen Dosierung eines Medikamentes ist für den Patienten von Bedeutung, damit er einerseits soviel an Medikamenten bekommt, wie für seine Heilung notwendig ist, und damit andererseits die toxischen Auswirkungen der Therapie und die Wahrscheinlichkeit einer durch die Chemotherapie induzierten sekundären Krebserkrankung so gering wie möglich gehalten wird. So gut die aktuell gebräuchlichen Therapiepläne auch sind, die Fortschritte der letzten Jahre stagnieren hinsichtlich der mittleren Uberlebensrate. Eine weitere deutliche Verbesserung der Chemotherapie sollte durch die Erstellung individuell angepasster Therapiepläne möglich sein.
Um diese Problematik anzugehen haben einige Forscher versucht, die individuelle Sensitivität von Patiententumoren gegenüber Zytostatika in vitro zu messen. Die meisten Chemosensitivitätstests, die gegenwärtig verwendet werden, basieren wenigstens teilweise auf dem von Salmon (Salmon et al. Science, 197, 461-463 (1977)) entwickelten Agar- Tumorkultur-Test. Diese Tests messen die Zeilproliferation.
Ein zweiter Typ von Chemosensitivitätstests umfasst den Ausschluss von (Fluoreszenz)-Farbstoffen oder die Freisetzung des radioaktiven Chromisotops 51Cr, mit dem die Zerstörung der Zellmembran durch direkte oder indirekte Zytostatika Wirkung gemessen wird. Eine Modifikation des früheren Farbstoffausschluss-Tests ist der sogenannte DiSC-Assay (Weisenthal, Kern Oncology 5: 92-103 (1991)), der durch einen zweiten Färbevorgang zusätzlich zwischen normalen und Tumorzellen differenziert.
Der dritte Typ von Chemosensitivitätstests bestimmt Parameter des zellulären Metabolismus als Maß für die Schädigung durch Zytostatika. Dieser Testtyp umfasst den radiometrischen BACTEC-Test (von Hoff D., Forseth B., Warfei L., in Salmon Trent(Eds.) Human tumor cloning, pp. 656-657, Grüne & Stratton, Orlando (1984)) , den MTT-Test (Freund A. et al. European Journal of Cancer 34:895-901 (1998), Kaspers G.J.L. Blood 92:259-266 (1998), Pieters R. et al. Leukemia 12, 1344-1348 (1998), Klumper E. et al. British Journal of Haematology 93:903-910 (1996), Hwang W.S. et al. Leukemia Research 17:685-688 (1993)) und seinen Variationen, den ATP-Test (Kangas L., Gronroos M., Nieminen A., Medical Biology 62: 338-343 (1984)) und den sogenannten FCA-Test (Meitner P., Oncology 5: 75-81, (1991), Rotman B, Teplitz C, Dickinson K., Cozzolino J., Cellular and Developmental Biology 24: fll37-1146 (1988)).
Agar- Kultur- Assays haben den großen Nachteil, dass bei weitem nicht alle Tumorzellen in den Agar-Kulturen wachsen. Dies gilt insbesondere für lymphatische Leukämien und Lymphome (Veerman A.J.P., Pieters R. British Journal of Haematology 74:381-384 (1990)). Beim bekanntesten Vertreter dieses Assay-Typs, dem Clonogenen Assay, liegt der Prozentsatz von auswertbaren Zellpopulationen nur bei 30-40%. Die Zellen müssen sehr lange (10-20 Tage) wachsen, bevor die Auswertung erfolgt. Außerdem ist der Arbeitsaufwand immens.
Die Farbstoff-Ausschluss-Tests wie auch der 51Cr-Freisetzungstest bestimmen den Anteil von Zellen mit defekter Zellmembran. Diese Tests beinhalten häufig eine Fixierung und anschließende mikroskopische Auswertung der Zellen bzw. die Messung der Radioaktivität im Überstand. Solche Tests sind aufgrund der Messung eines recht groben Parameters, der Zellmembranintegrität, unspezifisch und können nicht zwischen einer spezifischen Anti-Tumor-Wirkung einer Substanz oder einer physikalischen oder z.B. durch eine starke Verätzung oder Oxidation verursachten Zellschädigung durch eine Substanz unterscheiden. Tests dieses Typs sind folglich auch bei Substanzen positiv, die generell alle Zellen schädigen und damit nicht als Antitumor- Medikament geeignet sind. Der wohl aussagekräftigste Test des Farbstoff-Ausschluss-Typs ist der DiSC-Test. Durch zweifache Anfärbung kann er im Gegensatz zu anderen Farbstoff-Ausschlusstests zwischen der Zellschädigung von Tumorzellen und normalen Zellen unterscheiden. Die Zweifach-Färbung und die anschließende mikroskopische Auswertung sind aber extrem zeitaufwendig. Außerdem variieren die Ergebnisse abhängig von der Person, die die Auswertung durchführt, und dem Bildausschnitt, der unter dem Mikroskop untersucht wird.
Für den radiometrische Tests wie z.B. den 51Cr-Freisetzungstest gelten ganz generell: Der Einsatz von radioaktiven Isotopen in diagnostischen Tests wird heutzutage wegen des Gefährdungspotentials und der Entsorgungsproblematik zunehmend vermieden. Hinzu kommt, dass inzwischen Fluoreszenz- und Luminiszenztechniken gleiche Sensi- tivitäten erreichen können bei häufig kürzerer Gesamttestdauer.
Von den Chemosensitivitäts-Tests, die den Metabolismus einer Zelle als Maß für die Proliferation verwenden, wird am häufigsten der MTT-Test und seine Variationen verwendet. Der MTT-Test hat nach einer 4- tägigen Inkubation der Zellen mit diversen Zytostatika eine relativ kurze Testdauer von etwa 4 Stunden. Außerdem können 96 Proben parallel in einer Mikrotiterplatte mittels eines ELISA-Auslesegerätes ausgewertet werden. Dadurch wird ein passabler Durchsatz bei relativ geringem Personalaufwand gewährleistet. Der MTT-Test basiert auf der Umsetzung von 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium- bromid in ein blaues Formazan-Produkt. Die Umsetzung wird durch Dehydrogenasen katalysiert, die nur in lebenden Zellen aktiv sind. Der MTT-Test ist abhängig von einer konstitutiven Basisaktivität der untersuchten Zellen. Es hat sich aber herausgestellt, dass einige Zelltypen, z.B. besonders häufig einige FAB-Subtypen von akuter myeloischer Leukämie, eine stark verringerte Dehydrogenaseaktivität besitzen (Santini V. et al. Hematological Oncology 7:287-293 (1989)). Die Chemosensitivität dieser Tumorzellen kann daher nicht mit einem MTT-Test bewertet werden. Ein weiteres Problem sind die entstehenden wasserunlöslichen Formazankristalle. Diese müssen durch Zusatz von organischen Lösungsmitteln z.B. Dimethylsulfoxid oder Isopropanol in Lösung gebracht werden. Die Erfahrung hat gezeigt, dass dadurch Probleme bei der Reproduzierbarkeit des Tests auftreten.
Apoptose
Durch Arbeiten diverser Forschergruppen (z.B. Sen, S. et al. FEBS Lett. 307: 122-127, Darzynkiewicz et al. Cytometry 13: 795-808 (1992), Fulda S., Los M., Friesen C, Debatin K.M. Int. J. Cancer 76: 105-114 (1998)) erscheint es wahrscheinlich, dass durch Zytostatika verursachter Zelltod generell über den Mechanismus der Apoptose verläuft. Die Apoptose stellt einen von der Zelle selbst programmierten Zelltod dar, der durch physiologische Faktoren im Organismus induziert werden kann oder durch Chemikalien wie Zytostatika ausgelöst werden kann. Der programmierte Zelltod spielt eine außerordentlich große Rolle bei der Zytostase z.B. des Immunsystems. So werden beispielsweise T- Zellen, die gegen körpereigene Strukturen gerichtet sind, durch die Apoptose aus dem Organismus entfernt. Ansonsten kann es zu Symptomen einer Autoimmunerkrankung kommen, z.B. Lupus Erythematodes, arthritische Erkrankungen oder der Erkrankung durch einen T-Zell Tumor. Substanzen wie der von Makrophagen synthetisierte Tumornekrosefaktor alpha sind natürliche Induktoren der Apoptose.
Apoptose verläuft nach einem programmierten, einheitlichen Schema, bei dem u.a. bestimmte cysteinhaltige Proteasen (Caspasen) aktiviert werden (Cohen G.M. Biochem. J. 326: 1-16 (1997)). Die Aktivierung von Caspasen geschieht ausschließlich durch Apoptose und ist daher ein spezifischer Parameter für die Quantifizierung von Apoptose. Bis zu diesem Zeitpunkt sind die Zellmembranen noch intakt und undurchlässig für DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Propidiumiodid. Daher ist die Caspaseaktivität ein Parameter für die Wirkung von Zytostatika, der deutlich früher auftritt, als die Stunden später erfolgende Auflösung der Zellmembran.
Neben dem Zelltod durch Apoptose existiert eine andere Form von Zelltod, die z.B. physikalisch, durch osmotischen Schock, Verätzung oder Oxidation ausgelöste Nekrose. Diese äußert sich durch stark degenerative Schäden an der Zelle.
Medenica (US 5736129) bestimmt das Ausmaß der Zellschädigung durch Zytostatika, indem er die Zellen mit Propidiumiodid anfärbt und anschließend die angefärbten Zellen im FACS (fluorescence activated cell sorter) auszählt. Dieser Ansatz hat aber den großen Nachteil, nicht genau zwischen Apoptose und Nekrose zu unterscheiden, und kann demzufolge den spezifischen Wirkmechanismus von Zytostatika nicht erfassen. Außerdem ist der Zellbedarf für eine aussagekräftige Analyse sehr hoch.
Caspase-Aktivititätstests sind zur spezifischen Detektion von Apoptose bestens geeignet, weil nekrotische Schädigungen, die für zytostatische Wirkungen nicht aussagekräftig sind, nicht erfaßt werden (siehe Tabelle 1). Die in den letzten Jahren verwandten Methoden zur Caspaseaktivitätsmessung umfassen die gelelektrophoretische Auftrennung von spezifischen Proteinsubstraten, sowie chromogene und fluorogene Tests, bei denen durch die Caspasen farbige Produkte gebildet werden (s. z.B. Cohen G.M. Biochem. J. 326: 1-16 (1997), Stennicke H.R., Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 41 :25719-25723 (1997)). Diese Tests sind alle dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Induktion zunächst sedimentiert und mit Puffer gewaschen werden und anschließend durch einen Lysepuffer zerstört werden, damit die Caspasen, die sich bis dahin im Zellinnern befunden haben, das zugegebene Substrat umsetzen können.
So beschreibt ein Katalog der Firma Clontech, Palo Alto, California, Katalog 98/99, Seiten 71 - 72 (1998) ein Verfahren zur Bestimmung der Apoptose von Zellen als Antwort auf die Einwirkung von Substanzen. Auch in dieser Versuchsanordnung wird gemäß den einschlägigen Arbeitsvorschriften Waschschritte durchgeführt.
WO-A-99/18856 betrifft ein Verfahren zur Chemosensitivitätsmessung von Zellen gegen Substanzen, wobei zellgängige fluorogene Substrate eingesetzt werden. Nachteilig daran ist, dass nur spezielle Substrate eingesetzt werden können. Fulda, S. et.al. offenbart eine Methode zur Messung von Apoptose induzierendem Doxorubizin, Cisplatin und VP-16 mittels Durchflusscytometrie. Damit sind keine Zelllysate messbar. Außerdem ist die Durchflusscytometrie eine vergleichsweise aufwendige Methode.
WO-A-98/13517 betrifft eine Methode zur Abschätzung des Ausmaßes der Apoptose in Zellen. Dabei werden die Zellen mit einem Substrat für Proteasen der ICE/Ced-3-Familie beladen und die Umsetzung des Substrates durch die Protease mittels Durchflusscytometrie verfolgt. Damit sind jedoch keine Lysate messbar. Wie angeführt, ist die Durchflusscytometrie verhältnismäßig aufwendig. Die Beladung der Zellen setzt darüber hinaus eine Permeabilisierung der Zellen voraus. Dies kann zu Komplikationen führen. Die Zellen sind durch die Permeabilisierungsbehandlung oft nicht hinreichend authentisch, sondern entsprechen eher einem artifiziellen System.
Aus dem Waschvorgang ergibt sich aber hinsichtlich einer einfachen, schnellen Testdurchführung mit geringem Zellmaterialbedarf folgendes Problem:
Die Apoptose und damit die Entwicklung der Caspaseaktivität ist ein dynamischer Prozess, bei dem die Zelle nach einer gewissen Zeit in die sogenannte sekundäre Nekrose übergeht. Beim Waschvorgang werden daher die Caspasen dieser zerstörten Zellen entfernt.
Dadurch erhält man ein Signal für aktuell in Apoptose befindliche Zellen, deren Zahl irgendwann durch sekundäre Nekrose abnimmt. Es ist bekannt, dass das Maximum der Zahl apoptotischer Zellen sowohl vom untersuchten Zytostatikum, als auch vom Zelltyp abhängt. A priori ist nicht bekannt, zu welchem Zeitpunkt die Caspase-Aktivität und damit das Ausmaß der Apoptose gemessen werden muss. Daraus folgt, dass im Prinzip für jeden Patienten mehrere Proben mit z.B. Tumorzellen unterschiedlichen Inkubationszeiten hinsichtlich der Chemosensitivität bestimmt werden müssen. Der Bedarf an primären Patientenzellen wäre dann derartig hoch, dass nur noch die Chemosensitivität eines oder weniger Zytostatika getestet werden könnte. Außerdem wäre der Zeit- und Personalaufwand für die Chemosensitivitätstestung eines einzelnen Patienten extrem hoch.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die genannten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung der Chemosensitivität von Zellen gegen mindestens eine Substanz durch Messung der durch die mindestens eine Substanz ausgelösten Apoptose, wobei die Apoptose durch kumulierte Caspase-Aktivität einer Probe mit Zellen und einem Medium bestimmt wird, indem die Probe mit der mindestens einen Substanz versetzt und inkubiert wird und nach Zerstörung der Zellen ohne vorherige Abtrennung der Zellen die kumulierte Caspase-Aktivität in der Probe gemessen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt insbesondere die Verwendung von schwer- oder nichtzellgängigen Substraten.
Wesentlich ist die Messung der kumulierten Caspaseaktivität. Bei diesem Ansatz werden Zellen, z.B. Tumorzellen eines Patienten, mit mindestens einer Substanz (z.B. Zytostatika) einen längeren Zeitraum inkubiert, so dass alle, auch die langsam wirkenden, wirksamen Pharmaka Zeit genug hatten, Apoptose auszulösen. Anschließend wird beispielsweise ein in einem Lysepuffer befindliches Substrat zugegeben und nach erfolgter Zell-Lyse die gesamte entstandene - kumulierte - Caspaseaktivität der Zellsuspension gemessen. Es wurde gefunden, dass durch Zytostatika aktivierte Caspasen auch nach sekundärer Nekrose apoptotischer Zellen aktiv bleiben, die kumulierte Caspaseaktität mit der Inkubationszeit steigt und ab dem Zeitpunkt, wo zunehmend sekundäre Nekrose stattfindet, auf einem hohen Level bleibt. Die herkömmlich (mit Waschschritt) bestimmte Caspaseaktivität steigt im Gleichschritt mit der kumulierten Caspaseaktivität, nimmt aber mit beginnender sekundärer Nekrose ab (siehe Figur 1). Das Prinzip der Messung der kumulierten Caspaseaktivität ermöglicht es somit, durch eine einzige Caspaseaktivitätsmessung die Wirkung von Substanzen auf die Zellen zu bestimmen . Dieser Test hat einen geringen Zellbedarf und kann in kurzer Zeit als Routinetest von Laboranten oder technischen Mitarbeitern durchgeführt werden. Durch die leichte Automatisierbarkeit ist der Personalaufwand für die Durchführung des Tests gering. Da der Test auf überall vorhandenen ELISA-Auslesegeräten durchgeführt werden kann, sind keine Geräteinvestitionen erforderlich. Um den Materialverbrauch weiter zu senken, ist eine Miniaturisierung möglich. Es konnte gezeigt werden, dass Zellen in weniger als 10 μl Medium einige Tage in Kultur gehalten werden können. Durch die Senkung der Zellzahl pro Probenkammer auf 100 bis 1000 pro Test werden hochparallele Analysen von Proben mit äußerst wenig Patientenzellen, wie z.B. aus Feinnadelbiopsien, ermöglicht. Der geringe Zellbedarf ermöglicht auch die Hochdurchsatztestung (High Throughput Screening /HTS) von unbekannten Substanzen auf anti-Tumorwirkung.
Wenn die Chemosensitivität von Zellen pathologischer Gewebe über Caspaseaktivität getestet wird, ist es von Vorteil, als Referenz gesunde Zellen des Gewebes sowie dieselben Zellen ohne Substanzzusatz mitzutesten. Insbesondere ist es sinnvoll als Kontrolle eine permanente Zeil-Linie, deren Chemosensitivität bekannt ist, mitzutesten, um die Funktionalität des Tests zu dokumentieren und Fehler bei der Testdurchführung zu erkennen. Als Substanzen kommen z.B. folgende Substanzen in Frage:
A) Zytostatika
Abrin, Amethopterin, Acivin, Aclacinomycin A, Alanin-Mustard, Altretamin, Aminoglutethimid, Aminopterin, Amsacrin (mAMSA), div. anabolische Steroide, Anthrapyrazol, L-Asparaginase, 5-Axacytidin, Bazillus Calmette-Guerin, Bisantren, Buserelin, Busulfan, Butyryloxyethylglyoxal-dithiosemicarbazon, Camptothecin, Carbamat- ester, Carzinophyllin, CCNU, Chlorambucil, Chlorethylmethylcyclohexyl- nitrosoharnstoff, Chlorethylcyclohexylnitrosoharnstoff, Chlorodeoxyade- nosin, Corticotropin, Cyproteronacetat, Chlorotrianisen, Chlorozotozin, Chromomycin-A, Cytosinarabinosid (Ara-C), BCNU, Bleomycin, Cis- Platin, Carbo-Platin, Cladribine, Cyclophosphamid, Dactinomycin, Daunomycin, Daunorubicin, Decarbacin, Doxorubicin, DTIC, Dehydro- emitin, 4-Demethoxydaunorubicin, Demothydoxorubicin, Deoxydoxo- rubicin, Dexamethason, Dibromodulcitol, Dichloromethotrexat, Diethyl- stilbestrol, Bis-(2-chloropropyl)- DL-Serin, Doxifluridin, Elliptinium- acetat, 4 -Epidoxorubicin, Epirubicin, Epoetin alpha, Erythropoeitin, Esorubicin, Estradiol, Etoposid, Fluoxymesteron, Flutamid, Folsäure, Fotemustin, Ftorafur, 4-FU, Fludarabine-Phosphat, 5-FU, Floxuridin, Galactitol, Galliumnitrat, Goserelin, G-CSF, GM-CSF, Hydrea, Hexamethylmelamin (HMM), Hydrocortison, Hydroxyprogesteron, 4- Hydroperoxycyclophosphamid, ICRf 159, Idamycin, Ifosfamid, Immun- globulin IGIV, Interferon, Kobalt-Proporphyrinkomplex, Leucovorin Calcium, Leuprolid, Levadopa, Levothyroxin, Lindan, Liothyronin, Liotrix, Lomustin, Levamisole, Masoprocol, Maytansin, Menogaril, 6- Mercaptopurin, Methosalen, Methylesteron, Methyl-Iomustin, Mithracin, Mithramycin, Mitotan, Mitoxantron, Methotrexat (MTX), 6 MP, Mechlorethamin-Hydrochlorid, Medroxyprogesteron, Megestrolacetat, Melphalan, Mesna, Mitomycin-C, Nandrolon, Natriumphosphat P32, Navelbin, Neocarzinostatin, Nitrofururazon, nHuIFNa, nHuIFNb, nHuIFNp, Octreotidacetat, Ondansetrone Hydrochlorid, Dinatrium- Pamidronat, Pentamethylmelamin (PMM), Pentostatin, Peptiochemio, Plicamycin, Prednimustin, Probroman, Procarbazin, Profiromycin, Paraplatin, Prednisolon, Prednison, RazoxanrIFNa-2a, Rubidazon, rlFNa- 2b, rlFNb-lb, rlFNt-lb, rIL-2, rTNF, Semustin, SPG 827 (Podophyllinderivat), Spirogermanium, Streptonigrin, Somatostatin, Streptozocin, Tamoxifen, Taxol, Thio-TEPA, 6-Thioguanin, Tenoposid, Testolacton, Testosteron, 3-TGDR, rTNF, Thyroglobulin, Thyrotropin, Trilostan, Uracil-Mustard, VP-16, Vincristin (VCR), Vinblastin (VBL), Verapamil, Vindesin, Vinzelidin, Vitamin A-Säure, Vitamin A-Analoga, Zinostatin.
B) Peptide und Peptoide
C) Nukleinsäuren und -Derivate
D) Peptidnukleinsäuren (PNA's)
E) Hybride aus RNA's, DNA's, PNA's u. Derivate
Die Caspase-Aktivität kann sowohl durch Substratumsatz von fluorogenen oder chromogenen Substraten oder durch Bindung von spezifischen Markern z.B. Antikörper, Fab-Fragmente, Single chain Antikörper, Aptamere (Strukturen bindende Nukleinsäuren) und/oder sonstige Proteine mit Bindungsstellen für entweder unveränderte (Edukte) oder umgesetzte Caspase-Substrate (Produkte) gemessen werden. Insbesondere ist die Verwendung von Aminocoumarin-DEVD als fluorogenes Substrat geeignet.
Markermoleküle, die spezifisch entweder Edukte oder Produkte von Caspasereaktionen binden können, können entweder einen Farbstoffanteil, ein kolloidales Metall (z.B. Silber, Gold), ein radioaktives Isotop und/oder Seltenerdenmetallchelate aufweisen.
Die kumulierte Caspaseaktivität wird insbesondere frühestens 10 h (insbesondere 24 bis 48 h) nach dem Versetzen der Probe mit der mindestens einen Substanz gemessen, da erst dann auch langsam wirkende Zytostatika Apoptose ausgelöst haben. Da Apoptose ein sehr früher Marker für die Wirksamkeit von Zytostatika ist, ist der beschriebene Test deutlich schneller als z.B. der MTT-Test mit 4 Tagen Inkubationsdauer.
Es ist wichtig, die Caspaseaktivität gleicher Zellzahlen nach Apoptose zu vergleichen. Es empfiehlt sich daher, das Ausmaß der Apoptose auf die Gesamtzahl der untersuchten Zellen zu normieren. Dies kann z.B. durch Messung der Lichtabsorption, Streulicht, Leitfähigkeitsmessung oder mikroskopisches Auszählen geschehen. Die Normierung ist notwendig, um das Ausmaß der Zellschädigung durch verschiedene Zytostatika vergleichen zu können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Stratifizierung von Tumorerkrankungen. Eine Klassifizierung der Tumorerkrankungen wird erfindungsgemäß ermöglicht, aus der sich ergibt, welches bestehende Standardprotokoll für eine Chemotherapie geeignet ist. Der erfindungsgemäße Test erlaubt es relativ schnell festzustellen, ob eine bestimmte Tumorzelllinie auf ein Chemotherapeutikum anspricht. In entsprechender Weise ist die Entwicklung von neuen Protokollen für die Chemotherapie von Tumorerkrankungen möglich, indem das erfindungsgemäße Verfahren zur kumulierten Messung der Caspase-Aktivität als Indikator für das Absterben von Tumorzellen verwendet wird. Schließlich erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren auch, die Optimierung einer individuellen Chemotherapie gegen Tumorerkrankungen, in dem Patiententumorgewebe mit Chemotherapeutika behandelt werden und deren Ansprechen auf diese Chemotherapeutika durch Apoptose der Tumorzellen erfindungsgemäß bestimmt wird.
Beispiel:
Ein stark wirkendes Zytostatikum, das das Wachstum der Zellen unmittelbar stoppt und alle Zellen in Apoptose überführt, kann aufgrund der geringen Zellzahl deutlich weniger Apoptose aufweisen, als im Falle eines schwächer wirkenden Zytostatikums, bei dem sich die Zellen zunächst noch vermehren können, um dann erst später zu einem geringen Teil in Apoptose zu gehen. Erst die Normierung berücksichtigt die Apoptose in Bezug auf die Gesamtzellzahl und bewertet das stärker wirkende Zytostatikum richtig.
Die Chemosensitivitätstestung von Zellen lässt sich besonders vorteilhaft mit einem Kit durchführen. Dieser Kit beinhaltet einen Probenträger mit mehreren Probenkammern, wobei eine Probenkammer mindestens eine Substanz enthält. Pro Kit ist außerdem eine standardisierte Lösung eines Reagenz zur Messung der Caspase- Aktivität enthalten. Das Caspasesubstrat ist insbesondere Aminocoumarin-DEVD in einem Lysepuffer. Es kann auch ein Caspase- Aktivitäts-Standard, enthalten sein. Bei dem Probenträger kann es sich z.B. um eine handelsübliche Mikrotiterplatte handeln. Die zu testenden Substanzen hängen von der Applikation ab und können vorgefertigt in den Kammern des Probenträgers entweder in Lösung oder eingetrocknet vorliegen. Die Substanzen können dabei entweder als Trockensubstanz, in Lösung oder in Gegenwart von Matrixsubstanzen wie z.B. Salzen, Puffer, Kohlenhydraten, Carbonsäuren, Pyrimidinen, anorganischen oder organischen Nanopartikeln bis 1 μm Durchmesser vorliegen.
Fig. 1 zeigt die kumulierte und konventionell gemessene Caspaseaktivität von Jurkat-Zellen, die 4 h mit Actinomycin D induziert wurden.
Fig. 2 zeigt die unterschiedlichen Zeitverläufe der Apoptose in Jurkat- und U937-Zellen nach Induktion durch Actinomycin D.
Figur 3 zeigt die Chemosensitivität von U937-Zellen gegen verschiedene Zytostatika.
Figur 4 zeigt die Chemosensitivität von HL60-Zellen gegen verschiedene Zytostatika.
Figur 5 zeigt die Chemosensitivität von PBMNC gegenüber Daunorubicin.
Figur 6 zeigt die Chemosensitivität von PBMNC gegenüber Ara-C.
Beispiele
Beispiel 1
Die Caspaseaktivitäten von 250000 Jurkat-Zellen in 100 μl Medium wurden nach verschiedenen Inkubationszeiten mit 1 μg/ml Actinomycin D konventionell und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der kumulierten Caspaseaktivität bestimmt. Dazu wurden 100 μl Jurkat- Zellen (2.5xl06/ml) in Gegenwart von Actinomycin D bei 5 % C02 und 37°C in RPMI-Medium mit 10 % FCS + Pen-Strep inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen nach konventioneller Methode zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde in 200 μl Lysepuffer resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und bei -20°C eingefroren. Die kumulierte Caspaseaktivität wurde bestimmt, indem 100 μl der mit Actinomycin D inkubierten Zellen direkt in Suspension mit 100 μl 2x Lysepuffer gemischt werden. Das Lysat wurde ebenfalls bei - 20°C eingefroren. Alle Lysate wurden gemeinsam aufgetaut und mit Aminocoumarin-DEVD versetzt. Bei Raumtemperatur wurde die Freisetzung von fluoreszentem Aminocoumarin durch die Caspase alle 5 min. über eine Dauer von 2 h verfolgt. Aus dem linearen Signalanstieg wurde die Steigung als Maß für die Caspaseaktivität berechnet. Die in der Figur nicht gezeigten spontanen Caspase-Aktivitäten der Jurkat- Zellen in Abwesenheit von Actinomycin D nehmen mit der Zeit zu, bleiben aber kleiner als 4 min"1.
Beispiel 2
Die Caspaseaktivität von Jurkat- und U-937-Zellen wurde nach unterschiedlichen Inkubationszeiten mit Actinomycin D bestimmt. Dazu wurden je 0.5xl06 Zellen in 1 ml RPMI 1640 Medium mit 10 % FCS und Pen/Strep zwischen 30 Minuten und 16 Stunden mit 1 μg/ml Actinomycin D auf Zellkulturplatten (48 well) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in Eppendorf-Cups überführt und zweimal mit Medium gewaschen. Dann wurde das Pellet in Lysepuffer resuspendiert. Nach 10 Minuten auf Eis wurden 50 μM Aminocoumarin-DEVD-Substrat zugegeben und die Caspaseaktivität hier bei 37°C alle 5 min über einen Zeitraum von 2 Stunden verfolgt. Die Fluoreszenz wurde bei 355 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen. Aufgetragen ist der zeitliche Anstieg der Fluoreszenzemission gegen die Inkubationszeit mit Actinomycin D. Beispiel 3
Chemosensitivität von Tumorzell-Linien
Die Chemosensitivitäten von U937- und HL60-Zellen gegen die in den Figuren 3 und 4 bezeichneten Zytostatika wurden in den angegebenen Konzentrationsbereichen getestet. Aus den Figuren wird deutlich, dass die beiden Tumorzell-Linien unterschiedlich stark auf Zytostatika ansprechen, wie es auch im Fall von primären Patientenzellen zu erwarten wäre.
Es wurde die Wirkung von 4 Zytostatika auf die Zeil-Linie U937 getestet. Jeder Datenpunkt repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten. Mit steigender Konzentration steigt die Wirksamkeit von Actinomycin D, Daunorubicin und Ära C, während Prednisolon keine oder nur eine geringe Apoptoseinduktion verursacht. Die maximal induzierbare Caspaseaktivität ist bei Ara-C relativ niedrig, während sie bei Daunorubicin deutlich höher und am größten bei Actinomycin D ist.
Zum Vergleich ist die Chemosensitivität von promyeloischen HL60- Zellen in Abb. 2 gezeigt. Auch hier induzieren Actinomycin D und Daunorubicin größere Caspaseaktivitäten, als Ara-C und Prednisolon. Prednisolon zeigt ein Maximum in der Caspaseaktivität bei ca. 700 ng/ml. Bei höheren Konzentrationen sinkt das Apoptosesignal wieder ab. Ara-C scheint bei der höchsten gemessenen Konzentration noch nicht die maximal durch dieses Zytostatikum induzierbare Caspaseaktivität erreicht zu haben. Beispiel 4
Chemosensitivität von PBMNC
Zur Etablierung des Tests für peripheres Blut bzw. Knochenmark wurde zuerst isolierte Zellen des peripheren Blutes (PBMNC) von freiwilligen, gesunden Probanden getestet, wobei Wert darauf gelegt wurde, dass eine akute Infektion, wie sie in den Herbst-/Wintermonaten verstärkt auftritt, ausgeschlossen werden konnte. Die Figuren 5 und 6 stellen die Ergebnisse der Untersuchungen mit zwei Zytostatika dar.
In Figur 5 ist die Wirkung von Daunorubicin auf die mononukleären Zellen von acht Probanden (NP) zu sehen, wobei jeweils der Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten gezeigt ist. Eine Caspaseaktivität ist durch >50 ng/ml Daunorubicin induzierbar, ein Plateau, d.h. eine auf dem Maximum gleichbleibende Caspaseaktivität wird jedoch bei den Personen NP1 und NP5 bis NP8 nicht und bei den Personen NP2 bis NP4 nur ansatzweise erreicht. Im Vergleich zu getesteten Leukämie-Zellinien, reagieren die PBMNC später auf Daunorubicin.
Figur 6 zeigt ist die Wirkung von Ara-C auf die mononukleären Zellen der Probanden NP5 bis NP8; dargestellt ist jeweils der Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten. Eine Caspaseaktivität ist durch >200 ng/ml Ara-C induzierbar, ein Plateau, d.h. eine auf dem Maximum gleichbleibende Caspaseaktivität wird jedoch bei keinen der getesteten PBMNC erreicht.
Im Vergleich zu den Daten der Zelllinien HL60 und U937 (Beispiel 3) wird erkennbar, dass die maximal induzierbare Caspaseaktivität bei den zwei Zelllinien niedriger ist.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der Chemosensitivität von Zellen gegen mindestens eine Substanz durch Messung der durch die mindestens eine Substanz ausgelösten Apoptose, wobei die Apoptose durch kumulierte Caspase-Aktivität in einer Probe mit Zellen und einem Medium bestimmt wird, indem die Probe mit der mindestens einen Substanz versetzt und inkubiert wird und nach Zerstörung der Zellen ohne vorherige Abtrennung der Zellen die kumulierte Caspase-Aktivität in der Probe gemessen wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen tierische oder humane Zellen sind, insbesondere Leukämiezellen, Zellen solider Tumore, Zellen pathologischer Organe und/oder Referenzzellen wie beispielsweise Zellen aus anderen als den pathologischen Organen oder Zellen aus gesunden Bereichen pathologischer Organe.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Substanzen pharmazeutische Wirksubstanzen, Chemotherapeutika, Umweltschadstoffe, Peptide, Nukleinsäuren oder Derivate hiervon, PNAs und/oder Nukleinsäurehybride eingesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Caspase- Aktivität durch Substratumsatz von fluorogenen oder chromogenen Substraten oder durch Bindung von spezifischen Markern wie Antikörpern, Fa -Fragmenten, Single chain Antikörpern, Aptameren (Strukturen bindende Nukleinsäuren) und/oder sonstige Proteinen mit Bindungsstellen für entweder unveränderte (Edukte) oder umgesetzte Caspase-Substrate (Produkte) gemessen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker einen Farbstoff an teil, ein kolloidales Edelmetall, ein radioaktives Isotop und/oder Seltenerdenmetallchelate aufweist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die kumulierte Caspase-Aktivität frühestens 10 h, insbesondere 24 bis 48 h nach dem Versetzen der Probe mit der mindestens einen Substanz gemessen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gemessene Caspase-Aktivität auf die Gesamtzellzahl normiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Messung der Caspase-Aktivität zur Stratifizierung von Tumorerkrankungen, zur Entwicklung von neuen Chemotherapien von Tumorerkrankungen und/oder Optimierung einer individuellen Chemotherapie gegen Tumorerkrankungen eingesetzt wird.
9. Kit enthaltend einen Probenträger mit Probenkammern, wobei die Probenkammern mindestens eine Substanz enthalten sowie eine standardisierte Lösung eines Reagenz zur Messung der Caspase- Aktivität.
10. Kit nach Anspruch 9, wobei die Substanzen als Trockensubstanz, in Lösung oder in Gegenwart von Matrixsubstanzen vorliegen.
11. Kit nach einem der Ansprüche 9 und/oder 10, wobei die Matrixsubstanzen Salze, Puffer, Kohlenhydrate, Carbonsäuren, Pyrimidine, anorganische oder organische Nanopartikel bis 1 μm Durchmesser sein können.
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